JP7171439B2 - ムコ多糖症ii型を処置するための遺伝子療法 - Google Patents
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Description
本発明は、National Institutes of Health(国立衛生研究所)からの助成金番号R01DK54481、P40OD010939、及びP30ES013508の下で政府支援によってなされた。連邦政府はこの発明において、一定の権利を有し得る。
出願人は、ファイル番号「UPN-16-7771PCT_ST.25」で本明細書とともに電子的に提出されている配列表を参照として組み込む。
本発明は、ハンター症候群としても公知のムコ多糖症II型(MPS II)を処置するための遺伝子治療アプローチに関する。
ハンター症候群としても公知のMPS IIは、主に男性、10万人に1人から17万人に1人が罹患する希なX連鎖劣性遺伝病である。この進行性でかつ悲惨な疾患は、IDS遺伝子の変異によって引き起こされ、ヘパラン硫酸及びデルマタン硫酸のリソソーム異化に必要な酵素であるリソソーム酵素、イズロネート-2-スルファターゼの欠乏に至る。GAG(グリコサミノグリカン)と呼ばれるこれらの遍在性多糖類は、MPS II患者の組織及び器官に蓄積し、特徴的な蓄積病変及び多様な疾患の後遺症を生じる。この患者集団では罹患率及び死亡率が高く-重度の表現型(神経認知機能低下を特徴とする)の患者では、平均年齢11.7歳で死亡が報告されており;軽度または弱化した表現型の患者では、21.7歳で死亡が報告されている。
ハンター症候群としても公知のMPS IIと診断された患者(ヒト対象)のCNSにヒトイズロネート-2-スルファターゼ(human iduronate-2-sulfatase)(「hIDS」)遺伝子を送達するための複製欠損アデノ随伴ウイルス(「AAV」)の使用が、本明細書で提供される。hIDS遺伝子を送達するために使用される組換えAAV(「rAAV」)ベクター(「rAAV.hIDS」)は、CNS(例えば、AAV9キャプシドを保有するrAAV)に対して指向性を有するべきであり、hIDS導入遺伝子は、特定の発現制御エレメント、例えば、サイトメガロウイルス(CMV)エンハンサー及びニワトリベータアクチンプロモーター(CB7)のハイブリッドによって制御されるべきである。くも膜下腔内/大槽内投与に適した薬学的組成物は、生理学的に適合性の水性緩衝液、サーファクタント及び任意の賦形剤を含む製剤緩衝液中のrAAV.hIDSベクターの懸濁液を含む。rAAV懸濁液は、さらに以下によって特徴付けられる:
(i)rAAVゲノムコピー(GC)力価が少なくとも1.0×1013GC/ml(+/-20%)である;
(ii)rAAVの空粒子/全粒子比が、SDS-PAGE分析(実施例5D参照)で決定して0.01~0.05である(95%~99%が空のキャプシドなし)か、または他の実施形態では、少なくとも約50%、少なくとも約80%、少なくとも約85%、または少なくとも約90%が空のキャプシドなし;及び/または(iii)少なくとも約2.5×1010GC/gの脳質量~約3.6×1011GC/g脳質量というrAAV懸濁液の用量が力価を有する。
・新生児:約3.8×1012~約1.9×1014GC;
・3~9ヶ月:約6×1012~約3×1014GC;
・9~36ヶ月:約1013~約5×1014GC;
・3~12年:約1.2×1013~約6×1014GC;
・12+歳:約1.4×1013~約7.0×1014GC;
・18+歳(成人):約1.4×1013~約7.0×1014GC。
II小児に投与される用量は:約4.8×1011~約4.8×1014GCの範囲であり;小児及び12+歳の成人に投与される用量は、約5.6×1011~約5.6×1014GCの範囲である。
処置のための良好な候補である。血清Nab>1:5の力価を有するMPS II患者の処置は、rAAV.hIDSベクター送達での処置の前及び/または処置中に、免疫抑制剤を用いた一過性同時処置などの併用療法を必要とする場合がある。必要に応じて、免疫抑制剤併用療法は、AAVベクターキャプシド及び/または製剤の他の成分に対する中和抗体を事前に評価することなく、予防措置として使用してもよい。特定の実施形態では、特にIDS活性のレベルが実質的にない患者において、導入遺伝子産物が「外来」と見なされる可能性のあるhIDS導入遺伝子産物に対する潜在的な有害な免疫反応を予防するために、事前の免疫抑制療法が望ましい場合がある。動物で観察されるのと同様の反応は、ヒト対象には生じない場合があるが、rAAV-hIDSの全てのレシピエントに予防措置の免疫抑制療法が推奨されている。
Intelligence(WASI)(IQ)、Bayley’s Infantile Development Scale、the Hopkins Verbal Learning Test(memory)(ホプキンスの語学学習試験(記憶))、及び/またはTests of Variables of Attention(注意変数の試験)(TOVA)の使用を含む、当該分野で公知の方法を用いて、対象の知性の商(IQ)を評価することによって、測定され得る。別の実施形態において、治療上有効な量のrAAV.hIDSは、尿中及び/または脳脊髄液中、及び/または血清及び/または他の組織中における病原性GAG、ヘパラン硫酸及び/またはヘキソサミニダーゼ濃度を減少させる量である。さらに他の実施形態では、角膜混濁の是正が観察され得、中枢神経系(CNS)における病変の是正が観察されるか、並びに/または血管周囲及び/もしくは髄膜間隙蓄積の逆転が観察される。
al.、Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.87(21):8531-8535(1990)に記載の野性型ヒトイズロネート-2-スルファターゼのアミノ酸配列、配列番号2(550アミノ酸)に再現されたNCBI参照配列NP_000193.1を有する;このプレプロタンパク質は、シグナルペプチド(アミノ酸1~25)、プロペプチド(アミノ酸26~33)、並びにアミノ酸34~455(42kDa鎖)及びアミノ酸456~550(14kDa鎖)から構成される成熟ペプチドを含む。UniProtKB/Swiss-Prot(P22304.1)も参照のこと。
Adeno-Associated Viruses(アデノ随伴ウイルスに対する中和抗体の世界的疫学).Journal of Infectious Diseases、2009.199(3):p381-390に記載されているように測定され得る。
y et al.、「Self-complementary recombinant
adeno-associated virus(scAAV)vectors promote efficient transduction independently of DNA synthesis(自己相補的組み換えアデノ随伴ウイルス(scAAV)ベクターは、DNA合成とは独立して効率的な形質導入を促進する)」Gene Therapy(August 2001)、Vol.8、Number 16、Pages 1248~1254を参照のこと。自己相補的なAAVは、例えば、米国特許第6,596,535号;同第7,125,717号;及び同第7,456,683号に記載されており、その各々は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
られたヌクレアーゼの混合物を含んでもよく、そしてエンドヌクレアーゼであってもエキソヌクレアーゼであってもよい。
al.、Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.、100(10)、6081-6086(2003)及び米国特許出願公開第2013/0045186A1号を参照のこと。
MPS IIと診断された患者(ヒト対象)のCNSにhIDS遺伝子を送達するための複製欠損AAVの使用が提供される。hIDS遺伝子を送達するために使用される組換えAAV(「rAAV」)ベクター(「rAAV.hIDS」)は、CNS(例えば、AAV9キャプシドを有するrAAV)に対する向性を有し、hIDS導入遺伝子は、特定の発現制御エレメント、例えば、サイトメガロウイルス(CMV)エンハンサーとニワトリベータアクチンプロモーター(CB7)とのハイブリッドによって制御される。特定の実施形態では、生理学的に適合する水性緩衝液、サーファクタント及び任意の賦形剤を含む製剤緩衝液中のrAAV.hIDSベクターの懸濁液を含む、くも膜下腔内投与、大槽内投与及び全身投与に適した薬学的組成物が提供される。rAAV懸濁液は、さらに以下によって特徴付けられる:
(i)rAAVゲノムコピー(GC)力価が少なくとも1.0×1013GC/mLである;
(ii)SDS-PAGE分析により測定した場合、rAAVの空粒子/全粒子比は、0.01~0.05(空のキャプシドが95%~99%含まれない)である(実施例5Dを参照のこと);他の実施形態では、本明細書で提供されるrAAV9.hIDSは、空のキャプシドを少なくとも約80%、少なくとも約85%、または少なくとも約90%含まないか;及び/または
(iii)rAAV懸濁液の少なくとも約4×108GC/g脳質量~約4×1011GC/g脳質量の用量が力価を有する。
;109(4):377-81.doi:10.1016/j.ymgme.2013.05.016.Epub 2013 Jun 4を用いて評価してもよい。処置の候補となる患者は、MPS II(ハンター症候群)及び/またはMPS IIに関連する症状を有する小児及び成人患者である。
・新生児:約3.8×1012~約1.9×1014GC;
・3~9ヶ月:約6×1012~約3×1014GC;
・9~36ヶ月:約1013~約5×1014GC;
・3~12年:約1.2×1013~約6×1014GC;
・12+歳:約1.4×1013~約7.0×1014GC;
・18+歳(成人):約1.4×1013~約7.0×1014GC。
達成してもよい。
5.1.1.発現カセット
配列番号1(CCDS14685.1)のヌクレオチド配列を有することを特徴とするhIDS遺伝子を含む発現カセットを含むAAVベクターが提供される。この配列は、Genbank NP000193.1をコードする公表された遺伝子配列であり、また配列番号2としても本明細書中に含まれる。別の実施形態では、この発現カセットは、配列番号1と少なくとも約75%同一であるヌクレオチド配列を有することによって特徴付けられるhIDS遺伝子を含み、かつ機能的なヒトイズロネート-2-スルファターゼをコードする。別の実施形態では、この発現カセットは、配列番号1と少なくとも約80%同一であるヌクレオチド配列を有することによって特徴付られるhIDS遺伝子を含み、かつ機能性ヒトイズロネート-2-スルファターゼをコードする。別の実施形態において、配列は、配列番号1と少なくとも約85%同一であるか、または配列番号1と少なくとも約90%同一であり、かつ機能的ヒトイズロネート-2-スルファターゼをコードする。一実施形態では、配列は、配列番号1と少なくとも約95%同一であるか、配列番号1と少なくとも約97%同一であるか、または配列番号1と少なくとも約99%同一であり、機能的ヒトイズロネート-2-スルファターゼをコードする。一実施形態では、この配列は、配列番号1と少なくとも約77%同一である。別の実施形態では、発現カセットは、配列番号8のnt1177~nt2829のhIDSコード配列を含み、配列番号11のnt1937~nt3589としても示される。別の実施形態では、発現カセットは、配列番号8のnt1177~nt2829(配列番号11のnt1937~nt3589としても示される)と少なくとも約75%、約80%、約85%、約90%、約95%、約97%、約98%または約99%同一のhIDSコード配列を含む。
I参照配列:NP_877437.2をコードする公表された遺伝子配列であり、これもまた配列番号7及び配列番号10として本明細書中に包含される。いくつかの研究によって、IDSなどのスルファターゼの発現が、IDSの翻訳後修飾に必要とされるスルファターゼ改変因子SUMF1の利用可能性によって制限され得ることが示唆された(Fraldi et al.、Biochemical J、2007:403:305-312)。別の実施形態では、発現カセットは、配列番号5のnt3423~nt4547と少なくとも約80%同一であるヌクレオチド配列を有することを特徴とするSUMF1遺伝子を含み、かつ機能的なヒトSUMF1をコードする。別の実施形態において、配列は、配列番号5のnt3423~nt4547と少なくとも約85%同一であるか、または配列番号5のnt3423~nt4547と少なくとも約90%同一であり、かつ機能的ヒトSUMF1をコードする。一実施形態では、配列は、配列番号5のnt3423~nt4547と少なくとも約95%、約97%、または約99%同一であり、かつ機能的なヒトSUMF1をコードする。一実施形態では、この配列は、配列番号5のnt3423~nt4547と少なくとも約76.6%同一である。別の実施形態において、発現カセットは、配列番号8のnt3423~nt4553のhSUMF1コード配列を含む。別の実施形態において、発現カセットは、配列番号8のnt3423~nt4553と少なくとも約75%、約80%、約85%、約90%、約95%、約97%、約98%または約99%同一なhSUMF1コード配列を含む。
/98/NT.(Windows 95/98/NT.用のユーザフレンドリーな生物学的配列アライメントエディタ及び解析プログラム)、Nucl.Acids.Symp.Ser.41:95-98);EMBL-EBIから入手可能なClustal Omega(Sievers、Fabian et al.、「Fast,scalable generation of high-quality protein multiple sequence alignments using Clustal Omega」Molecular systems Biology 7.1(2011):539 and Goujon、Mickael、et al「A new bioinformatics analysis tools framework at EMBL-EBI」Nucleic acids research 38.suppl 2(2010):W695-W699);Wisconsin Sequence Analysis Package、version 9.1(Devereux J.et al.、Nucleic Acids Res.、12:387-395,1984、Genetics Computer Group、Madison、Wis.,USAから入手可能)に組み込んでもよい。プログラムBESTFIT及びGAPは、2つのポリヌクレオチド間の同一性%及び2つのポリペプチド配列間の同一性%を決定するために使用され得る。配列間の同一性及び/または類似性を決定するための他のプログラムとしては、例えば、National Center for Biotechnology Information(NCB),Bethesda,Md.,USAから入手可能で、NCBIのホームページ(www.ncbi.nlm.nih.govhttp://www.ncbi.nlm.nih.gov/)からアクセス可能なBLASTファミリーのプログラム、GCG配列アライメントソフトウェアパッケージの一部であるALIGNプログラム(バージョン2.0)が挙げられる。アミノ酸配列を比較するためにALIGNプログラムを利用する場合、PAM120重量残基表、ギャップ長ペナルティ12、及びギャップペナルティ4を用いてもよい;及びFASTA(Pearson W.R.及びLipman D.J.、Proc.Natl.Acad.Sci.USA、85:2444-2448,1988、Wisconsin Sequence Analysis Packageの一部として入手可能)を用いてもよい。SeqWeb Software(GCG Wisconsin Packageへのウェブベースのインターフェース:Gapプログラム)。
源を利用してもよい。
一実施形態では、AAVキャプシドを有し、かつその発現を制御する調節配列の制御下でAAV逆方向末端反復配列、ヒトイズロネート-2-スルファターゼ(hIDS)遺伝子をその中にパッケージングしている、組換えアデノ随伴ウイルス(rAAV)粒子であって、ここで前記hIDS遺伝子が、機能性ヒトイズロネート-2-スルファターゼをコードする、配列番号1(図1)に示される配列またはそれと少なくとも約95%同一である配列を有する粒子が提供される。一実施形態では、hIDS発現カセットは、AAV5’ITR及びAAV3’ITRに隣接している。別の実施形態では、AAVは一本鎖AAVである。
参照により本明細書に組み込まれる米国特許第7,282,199B2号、米国特許第7,790,449号及び米国特許第8,318,480号に記載されている。多数のそのようなAAVの配列は、上記の米国特許第7,282,199B2号、米国特許第7,790,449号、米国特許第8,318,480号、及び米国特許第7,906,111号に示されているか、及び/またはGenBankから入手可能である。任意のAAVキャプシドの配列は、合成的に、または種々の分子生物学及び遺伝子工学技術を用いて容易に生成され得る。適切な製造技術は、当業者に周知である。例えば、Sambrook et al.、Molecular Cloning:A Laboratory Manual、Cold Spring Harbor Press(Cold Spring Harbor、NY)を参照のこと。あるいは、ペプチド(例えば、CDR)をコードするオリゴヌクレオチドまたはペプチド自体は、例えば周知の固相ペプチド合成法(Merrifield、(1962)J.Am.Chem.Soc.、85:2149;Stewart及びYoung、Solid Phase Peptide Synthesis(Freeman、San Francisco、1969)pp.27-62)によって合成的に生成され得る。これら及び他の適切な製造方法は、当業者の知識の範囲内であり、本発明の限定ではない。
et al.、Molec.Ther.(2003)7:122-128を参照のこと。変性キャプシドを試験するために、この方法は、処理されたAAVストックを、3つのキャプシドタンパク質を分離し得る任意のゲル、例えば、緩衝液中の3~8%トリス-アセテートを含む勾配ゲルからなるSDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動に供すること、次いで試料材料が分離されるまでゲルを泳動すること、ナイロンまたはニトロセルロース膜、好ましくはナイロン上にゲルをブロットすることを包含する。次いで、抗AAVキャプシド抗体を、変性キャプシドタンパク質に結合する一次抗体として、好ましくは抗AAVキャプシドモノクローナル抗体、最も好ましくはB1抗AAV-2モノクローナル抗体を使用する(Wobus et al.、J.Virol.2000)74:9281-9293)。次いで、二次抗体であって、一次抗体に結合し、かつ一次抗体、より好ましくはそれに共有結合した検出分子を含む抗IgG抗体、最も好ましくは西洋ワサビペルオキシダーゼに共有結合したヒツジ抗マウスIgG抗体との結合を検出するための手段を含む二次抗体を使用する。結合を検出する方法を使用して、一次抗体と二次抗体との間の
結合を半定量的に決定し、これは好ましくは、放射性同位体放射、電磁照射、または比色変化を検出し得る検出方法、最も好ましくは化学発光検出キットである。例えば、SDS-PAGEでは、カラム画分由来の試料を採取し、還元剤(例えばDTT)を含有するSDS-PAGEローディング緩衝液中で加熱し、キャプシドタンパク質をプレキャスト勾配ポリアクリルアミドゲル(例えばNovex)で分離した。銀染色は、SilverXpress(Invitrogen、CA)を使用して、製造業者の説明書または他の適切な染色方法、すなわちSYPROルビーまたはクーマシー染色により実施してもよい。一実施形態では、カラム画分中のAAVベクターゲノム(vg)の濃度は、定量的リアルタイムPCR(Q-PCR)によって測定してもよい。試料を希釈し、DNase I(または別の適切なヌクレアーゼ)で消化して、外因性DNAを除去する。ヌクレアーゼの不活性化の後、プライマー及びプライマー間のDNA配列に特異的なTaqMan(商標)蛍光発生プローブを使用して、試料をさらに希釈し、増幅する。Applied Biosystems Prism 7700 Sequence Detection System上の各試料について、定義された蛍光レベル(閾値サイクル、Ct)に達するのに必要なサイクル数を測定する。AAVベクターに含まれるものと同一の配列を含むプラスミドDNAを使用して、Q-PCR反応において標準曲線を生成する。試料から得られたサイクル閾値(Ct)の値を使用して、それをプラスミド標準曲線のCt値に正常化することによってベクターゲノム力価を決定する。デジタルPCRに基づくエンドポイントアッセイも使用してもよい。
Therapy Methods,Hum Gene Ther Methods.2014 Apr;25(2):115-25.doi:10.1089/hgtb.2013.131.Epub 2014 Feb 14を参照のこと。
ラフィーステップについては、ダイアフィルトレーション産物を、AAV2/9血清型を効率的に捕捉するCapture Select(商標)Poros-AAV2/9親和性樹脂(Life Technologies)に適用してもよい。これらのイオン条件下では、有意なパーセンテージの残留細胞DNA及びタンパク質がカラムを通って流れ、一方でAAV粒子が効率的に捕捉される。
rAAV9.hIDS製剤は、生理食塩水、サーファクタント、及び生理学的に適合する塩または塩の混合物を含有する水溶液中に懸濁した有効量のAAV.hIDSベクターを含有する懸濁液である。適切には、製剤は、生理的に許容されるpH、例えばpH6~9、またはpH6.5~7.5、pH7.0~7.7、またはpH7.2~7.8の範囲に調整される。脳脊髄液のpHが、約7.28~約7.32であるので、くも膜下腔内送達のためには、この範囲内のpHが望ましい場合がある;静脈内送達の場合、6.8~約7.2のpHが望ましい場合がある。しかし、最も広い範囲内の他のpH及びこれらの部分的範囲が、他の送達経路のために選択されてもよい。
Therapy Methods、Hum Gene Ther Methods.2014 Apr;25(2):115-25.doi:10.1089/hgtb.2013.131.Epub 2014 Feb 14(これは参照により本明細書に組み込まれる)に記載されているように、oqPCRまたはデジタル液滴PCR(ddPCR)によって測定して、少なくとも約1×109GC/mL~3×1013GC/alの濃度を含んでもよい。
5.2.1標的患者集団
本明細書に記載されるrAAV.hIDSの治療上有効な量を、それを必要とする患者に送達することを包含する、II型ムコ多糖症の処置方法が本明細書に提供される。具体的には、本明細書に記載のrAAV.hIDSの治療上有効な量を、それを必要とする患者に送達することを包含する、MPS IIと診断された患者における神経認知低下を予防、処置及び/または改善するための方法が本明細書において提供される。本明細書に記載のrAAV.hIDSベクターの「治療上有効な量」は、以下の段落のいずれか1つで同定された症状の1つ以上を是正し得る。
発生の遅延は、18~24ヶ月で容易に明らかである。一部の患者は、初年度に聴覚スクリーニング検査を受けられず、サポートされずに座る能力、歩く能力、及び会話を含む他のマイルストーンが遅れる。発達の進行は、3~5歳の間でプラトーになり始め、回帰はほぼ6.5年から始まると報告されている。トイレ訓練を受けたMPS IIの小児の約50%のうち、全てではないにしても大部分が病気の進行とともにこの能力を失う。
学的因子によって説明し得ない場合には、以下のいずれかとして定義されるMPS IIに起因する早期神経認知障害の確認された証拠:-平均よりも少なくとも1標準偏差低いかまたは逐次試験で1標準偏差を超える低下の確認された歴史的証拠であるDQ(BSID-III)。あるいは、尿、血清、CSF、または遺伝子検査におけるGAGの増大を使用してもよい。
・研究者または医療監視者のいずれかの意見で研究結果の解釈を混乱させる可能性がある、MPS IIに起因しない神経認知障害を有する
・治験責任医師の意見で、対象に過度のリスクを与えるか、あるいは治験結果の評価または対象の安全性もしくは治験結果の解釈を妨げるような状態(例えば、病歴、現在の病気の証拠、身体診察時の所見、または臨床検査値の異常など)を有する
・精神神経症状の診断
・蛍光透視撮影に対する禁忌を含む、くも膜下腔内/頭蓋内処置投与に対する禁忌を有する
・MRIに対する禁忌を有する
・登録時に急性水頭症を有する
・スクリーニングの前4週間以内またはその臨床試験で使用された治験薬の5半減期以内のいずれか長い方で治験薬を使用する他の臨床試験に現在登録されている
・造血幹細胞移植(HSCT)を受けている
・スクリーニング前の6ヶ月以内にくも膜下腔内投与によりイデュルスルファーゼを投与されている
・くも膜下腔内イデュルスルファーゼをいつでも受けており、治験責任医師及び/または医療監視者の意見では、対象に過度のリスクを与える、くも膜下腔内投与に関連して重大な副作用(AE)が認められた。
患者への投与に適した薬学的組成物は、生理学的に適合する水性緩衝液、サーファクタント及び任意の賦形剤を含む製剤緩衝液中のrAAV.hIDSベクターの懸濁液を含む。特定の実施形態において、本明細書に記載の薬学的組成物は、くも膜下腔内に投与される。他の実施形態において、本明細書に記載の薬学的組成物は、大槽内に投与される。他の実施形態では、本明細書に記載の薬学的組成物は、静脈内投与される。特定の実施形態では、この薬学的組成物は、末梢静脈を介して20分(±5分)にわたる注入によって送達される。しかし、この時間は、必要に応じてまたは所望の場合調整されてもよい。しかし、さらに別の投与経路を選択してもよい。代替的または追加的に、所望であれば、投与経路を組み合わせてもよい。
・新生児:約3.8×1012~約1.9×1014GC;
・3~9ヶ月:約6×1012~約3×1014GC;
・9~36ヶ月:約1013~約5×1014GC;
・3~12年:約1.2×1013~約6×1014GC;
・12+歳:約1.4×1013~約7.0×1014GC;
・18+歳(成人):約1.4×1013~約7.0×1014GC。
II小児に投与される用量は:約4.8×1011~約4.8×1014GCの範囲であり;小児及び12+歳の成人に投与される用量は、約5.6×1011~約5.6×1014GCの範囲である。
本明細書に記載の処置の有効性は、(a)MPS II(ハンター症候群)患者における神経認知低下の予防;及び(b)CSF、血清及び/または尿中の、及び/または肝臓及び脾臓容積中のGAGレベル及び/または酵素活性などの疾患のバイオマーカーの減少を評価することによって測定され得る。神経認知は、例えば、Bayley’s Infantile Development Scale for Hurlerによって測定した場合、またはWechsler Abbreviated Scale of Intelligence(WASI)for Hurler-Scheie subjectによって測定した場合、知能指数(IQ)を測定することによって決定され得る。他の適切な神経認知発達及び機能の尺度、例えばBayley Scale of Infant Development(BSID-III)を用いた発達指数(DQ)の評価、Hopkins Verbal Learning Test(言語学習試験)を用いた記憶の評価、及び/またはTests of Variables of Attention(注意変数の試験)(TOVA)を用いた評価が利用されてもよい。他の神経心理学的機能、例えば、vineland適応行動スケール、視覚処理、微細運動、コミュニケーション、社会化、日常生活の技能、ならびに情動及び行動的健康がモニターされる。容量測定、拡散テンソル画像(DTI)、及び静止状態データ、超音波検査による正中神経断面積、脊髄圧迫の改善、安全性、肝臓サイズ及び脾臓サイズを獲得するための脳の磁気共鳴イメージング(MRI)も施される。
び炎症のマーカーについて、血清及び/または血漿を評価する。CSFは、IDUA活性、抗IDS抗体、ヘキソサミニダーゼ(hex)活性、及びpGAG(ヘパラン硫酸及びデルマタン硫酸など)について評価される。ベクターに対する中和抗体(例えば、AAV9)の存在及び抗IDS抗体に対する結合抗体の存在は、CSF及び血清中で評価され得る。ベクターキャプシド(例えば、AAV9)またはhIDS導入遺伝子産物に対するT細胞応答は、ELISPOTアッセイによって評価され得る。CSF、血清、及び尿中のIDS発現の薬物動態、ならびにベクター濃度(PCR対AAV9 DNA)もモニターしてもよい。
S IIレベルよりも高いレベルを有する場合、より高い用量、または追加の治療、例えばERTを患者に提供してもよい。
with electrospray tandem mass spectrometry」Plant Physiology and Biochemistry、47(2009):592-598、avail online 28 Feb 2009;MR Hakkinen et al.、「Analysis of underivatized polyamines by reversed phase liquid chromatography with electrospray tandem mass spectrometry」J Pharm Biomec Analysis、44(2007):625-634、定量同位体希釈液体クロマトグラフィー(LC)/質量分析(MS)アッセイ。他の適切なアッセイを使用してもよい。
II患者の運動機能に対する治療剤の影響を評価することによって決定される。いくつかの実施形態において、本明細書に記載の治療剤の有効性は、MPSII患者の成長及び発達のマイルストーンに対する治療剤の効果を評価することによって決定される。
特定の実施形態では、本明細書に記載されるMPS II及び/またはその症状を処置、予防、及び/または改善する方法は、患者の血清、尿及び/または脳脊髄液(CSF)の試料において測定される、GAGレベルの有意な低下をもたらす。
hIDSの全身送達を伴うCNSへのrAAV.hIDSの遺伝子治療送達の組み合わせは、本発明の特定の実施形態によって包含される。全身送達は、ERT(例えば、Elaprase(登録商標)を用いて)、または肝指向性を有するrAAV.hIDS(例えば、AAV8キャプシドを保有するrAAV.hIDS)を用いるさらなる遺伝子治療を用いて達成してもよい。
療法)によって送達される。組換えhIDSを産生する方法は、文献に記載されている。
一実施形態は、本明細書に記載のrAAV.hIDS薬学的組成物の製造を提供する(下記の実施例4)。例示的な製造プロセスを、図10A及び図10Bに示す。rAAV.hIDSベクターは、図10A及び図10Bに示すフロー図に示すように製造してもよい。要するに、細胞は、適切な細胞培養物(例えば、HEK 293)細胞中で製造される。本明細書に記載の遺伝子治療ベクターを製造する方法としては、遺伝子治療ベクターの製造に使用されるプラスミドDNAの生成、ベクターの生成、及びベクターの精製などの当該分野で周知の方法が挙げられる。いくつかの実施形態では、遺伝子治療ベクターは、AAVベクターであり、生成されるプラスミドは、AAVゲノム及び目的の遺伝子をコードするAAVシスプラスミド、AAV rep及びcap遺伝子を含むAAVトランスプラスミド、ならびにアデノウイルスヘルパープラスミドである。ベクター生成プロセスは、細胞培養の開始、細胞の継代、細胞の播種、プラスミドDNAによる細胞のトランスフェクション、無血清培地へのトランスフェクション後の培地交換、ならびにベクター含有細胞及び培養培地の回収などの方法ステップを包含してもよい。収穫されたベクター含有細胞及び培養培地は、本明細書において粗細胞収穫物と呼ばれる。
第62/322,071号及び本明細書において参照によって組み込まれる、2015年12月11日に出願され、「Scalable Purification Method for AAV9」という題の62/226,357号にさらに詳細に記載されている。2016年12月9日に出願されたAAV8の精製方法の国際特許出願第PCT/US2016/065976、及び2016年4月13日出願のその優先権書類、米国特許出願第62/322,098号及び2015年12月11日出願の62/266,341号、及びrh10、2016年12月9日に出願された国際特許出願第PCT/US16/66013及びその優先権書類、2016年4月13日に出願された米国特許出願第62/322,055号、及び「Scalable Purification Method for AAVrh10」と題された62/266,347号(これも2015年12月11日出願)、並びにAAV1については、2016年12月9日出願の、国際特許出願第PCT/US2016/065974号及び2016年4月13日出願の、その優先権書類である米国特許出願第62/322,083号、及び2015年12月11日に出願された「Scalable Purification Method for AAV1」に関する第62/26,351号は、参照により全てが本明細書に組み込まれる。
一態様では、本明細書で提供されるベクターは、このセクションで提供される方法及び/またはデバイスを介してくも膜下腔内投与されてもよく、実施例及び図11にさらに記載されている。あるいは、他のデバイス及び方法が選択されてもよい。この方法は、脊髄針を患者の大槽内に前進させ、ある長さの可撓性チューブを脊髄針の近位ハブに接続し、バルブの出力ポートをこの可撓性チューブの近位端に接続するステップと、前記前進及び接続ステップの後、ならびにチューブに患者の脳脊髄液を自己プライミングさせた後、一定量の等張溶液を含む第1の容器をバルブのフラッシュ入口ポートに接続し、その後、ある量の薬学的組成物を含む第2の容器をバルブのベクター入口ポートに接続するステップとを包含する。第1及び第2の容器をバルブに接続した後、流体流のための通路がバルブのベクター入口ポートと出口ポートとの間に開かれ、薬学的組成物が脊髄針を通して患者に注射され、その薬学的組成物が注射された後、流体の流路がバルブのフラッシュ入口ポート及び出口ポートを介して開かれ、等張溶液が脊髄針に注射されて薬学的組成物を患者にフラッシュする。
よい。例えば、図示された実施形態では、容器12は、ある量の薬学的組成物を含有する別個のシリンジとして提供され、本明細書では「ベクターシリンジ」と呼ばれる。単なる例にすぎないが、容器12は、約10ccの薬学的組成物などを含んでもよい。
ュシリンジ14を用いてストップコック16及び針アセンブリが所望の量の生理食塩水でフラッシュされ得るように、ストップコック16のスイベルロック18が第2の位置に回される。単なる例であるが、1~2ccの生理食塩水を使用してもよい;しかし必要に応じて多い量を使用する場合も、少ない量を使用する場合もある。生理食塩水は、薬学的組成物の全てまたは大部分を、アセンブルされたデバイスを通って患者に強制的に注射して、アセンブルされたデバイス内に薬学的組成物が殆どまたは全く残らないようにする。
成人の腰椎穿刺(LP)キット(施設ごとに提供);
BD(Becton Dickinson)22または25ゲージ×3-7インチの脊髄針(Quincke bevel);
インターベンション医師の裁量で使用される同軸導入針(脊髄針の導入用);
スイベル(スピン)オスルアーロック付き4方向小口径ストップコック;
メスルアーロックアダプター付きのTコネクタ延長セット(チューブ)、およその長さ6.7インチ;
くも膜下腔内投与のためのOmnipaque 180(イオヘキソール);
静脈内(IV)投与のためのヨード化造影剤;
1%リドカイン注射液(成人用LPキットに含まれていない場合);
プレフィルド10ccの生理食塩水(無菌)フラッシュシリンジ;
放射線不透過性マーカー(複数可);
外科用準備器具/シェービング用かみそり;
挿管された対象の適切な位置決めを可能にする枕/支持具;
気管内挿管器具、全身麻酔機及び機械的人工呼吸器;
術中神経生理学的モニタリング(IONM)装置(及び要員);ならびに
ベクター含有の10ccシリンジ;別の薬局マニュアルに従って準備して、CT/手術室(OR)室に移送する。
大槽内の脊髄針の遠位先端の適切な配置を確認することをさらに包含する。特定の実施形態では、確認ステップは、コンピュータ断層撮影(CT)画像を用いて大槽内の脊髄針の遠位先端を視覚化することを包含する。特定の実施形態では、この確認するステップは、脊髄針のハブ内の患者の脳脊髄液の存在を観察するステップを包含する。
実施例1:ヒト対象の処置のためのプロトコール
この実施例は、MPS II、すなわちハンター症候群を有する患者のための遺伝子治療処置に関する。この例では、野生型hIDS酵素をコードする改変hIDS遺伝子を発現する複製欠損アデノ随伴ウイルスベクター9(AAV9)である遺伝子治療ベクターAAV9.CB.hIDSを、MPS II患者の中枢神経系(CNS)に投与する。全身麻酔下で、AAVベクターの用量をCNSに直接注射する。本明細書に記載されているよ
うに、神経認知発達及び/または代用マーカー、例としては、バイオマーカー、例えば、対象のCSFまたは血清中の病原性GAG及び/またはヘパリン硫酸(HS)濃度の低下という臨床尺度を用いて処置の有効性を評価する。
遺伝子治療ベクターは、ヒトイズロネート-2-スルファターゼ(IDS)を発現する血清型9の非複製組換えアデノ随伴ウイルス(AAV)ベクターであり、この実施例ではAAV9.CB.IDSと称する(図1を参照のこと)。AAV9血清型は、IC投与後のCNSにおけるhIDS産物の効率的な発現を可能にする。
一連のベクターを生成した。1つのプラスミドは、コドン最適化IDS配列(配列番号11のnt1177~nt2829)を含む。2つの他のものはCB7プロモーター(CB6)の短いバージョンを使用し、SUMF1と呼ばれる第2のタンパク質を発現した[配列番号7及び配列番号10]。産生されたベクターゲノムAAV.CB7.CI.hIDSco.RBGは、配列番号11のnt2~nt3967の配列を有するが、AAV.CB6.hIDSco.IRES.hSUMF1coは、配列番号8のnt11~nt4964の配列を有する。hIDS配列をコドン最適化及び合成することによってプラスミドを構築し、次いで得られた構築物を、プラスミドpENN.AAV.CB7.CI.RBGまたはpENN.AAV.CB6.CI.RBG、CB7またはCB6を含むAAV2 ITR隣接発現カセット、CI及びRBG発現エレメントにクローニングし、上記ベクターゲノムを得る。
逆方向末端反復(ITR):AAV ITR(GenBank#NC001401)は
、両端で同一であるが反対方向である配列である。AAV2 ITR配列は、AAV及びアデノウイルスヘルパー機能がトランスで提供される場合、ベクターDNA複製の起点及びベクターゲノムのパッケージングシグナルの両方として機能する。このように、ITR配列は、ベクターゲノム複製及びパッケージングに必要とされる唯一のシス配列に相当する。
患者は、患者の2.5×1010~3.6×1011GC/g脳質量に等価である1.0×1013~5.0×1014GC(フラット用量)の範囲内のrAAV9.CB7.hIDSの単一のくも膜下腔内/大槽内投与を受ける。あるいは、以下のフラット用量を、示された年齢群の患者に投与する:
・新生児:約3.8×1012~約1.9×1014GC;
・3~9ヶ月:約6×1012~約3×1014GC;
・9~36ヶ月:約1×1013~約5×1014GC;
・3~12年:約1.2×1013~約6×1014GC;
・12+歳:約1.4×1013~約7.0×1014GC;
・18+歳(成人):約1.4×1013~約7.0×1014GC。
適切な患者としては、以下の年齢の男性または女性対象が挙げられる:
・新生児;
・3~9ヶ月齢;
・9~36ヶ月齢;
・3~12歳;
・12+歳;
・18+歳(成人)。
主要な臨床目的としては、MPS II欠損に関連する神経認知低下を予防及び/または必要に応じて逆転させることが挙げられる。臨床目的は、例えば、Bayley Scales of Infant and Toddler Development(乳児及び幼児発達のBayley Scales),Third Edition,BSID-IIIによって測定されるような神経認知を測定することによって決定され得る。他の適切な尺度は、例えば、Vinantand Adaptive Behavior Scales(適応行動スケール),Second Edition(VABS-II)によって測定される適応行動アセスメント及び例えばInfant Toddler Quality of Life Questionnaire(商標)(ITQOL)によって測定されるクオリティーオブライフの尺度である。
A.脳脊髄液へのAAV9送達により中枢神経系疾患が是正される
ムコ多糖症II型(MPS II)は、骨及び関節の変形、心臓及び呼吸器疾患、及び発達遅延を伴う早期小児期に典型的に現れるX連鎖リソソーム蓄積障害である。欠損酵素であるイズロネート-2-スルファターゼ(IDS)の全身送達は、MPS IIの多くの症状を改善するが、その酵素が血液脳関門を通過しないため、現在、中枢神経系(CNS)疾患の進行を防止する効果的な方法はない。MPS IIのマウスモデルを用いて、IDS遺伝子のAAV血清型9ベクター媒介送達を、CNSにおける連続的なIDS発現を達成する手段として評価した。IDSノックアウトマウスは、3つのベクター用量(低-3×108、中-3×109または高-3×1010ゲノムコピー)のうちの1つの側脳室への単回注射を受け、ベクターの体内分布及びIDS発現の評価のためにベクター投与の3週間後に屠殺するか(n=7~8マウス/群)、またはベクター投与後3ヶ月で屠殺して、疾患進行に対する遺伝子移入の影響を評価した(n=7~8マウス/群)。IDS活性は、脳脊髄液中で検出可能であり、低用量コホートで野生型レベルの15%に達し、最高用量で正常の268%に達した。脳酵素活性は、低用量コホートの正常値の2.7%から高用量コホートの32%までの範囲であった。ガングリオシドGM3の染色による脳蓄積病変の定量化によって、それぞれ低、中、及び高用量コホートにおいて35%、46%、及び86%の減少を伴う、用量依存的な是正が示された。処置されたマウスはまた、新規の物体認識試験において、改善された認知機能を示した。これらの知見によって、
くも膜下腔内AAV媒介性遺伝子伝達が、CNSへの持続的な酵素送達のためのプラットフォームとして機能し、MPS IIを有する患者に対するこの重要な満たされていない必要性に対処することが示される。
IDS遺伝子のエキソン4及び5をネオマイシン耐性遺伝子で置換することにより、MPS IIのノックアウトマウスモデル(IDSノックアウト;IDSy/-)を作製した(Garcia et al.、2007、J Inherit Metab Dis、30:924-34を参照のこと)。このモデルは、検出可能な酵素活性を示さず、MPS II患者に見られるものと同様の組織学的蓄積病変を発症する。IDSノックアウトマウスは、骨格異常を含むMPS IIの多くの臨床的特徴を示す。マウスの神経行動表現型は、広範には評価されていないが、いくつかの研究では異常を示しており(Muenzer et al.、2001、Acta Paediatr Suppl、91(439):99-9)、したがって、MPS IIの処置としてAAV9.CB.hIDSの効果を研究するための関連モデルである。実際、これは、この集団の臨床試験を支援するMPS IIにおける酵素補充療法の効果を評価するために使用されているのと同じノックアウトマウスモデルである。このMPS IIマウスモデルで実施された以下の研究は、処置活性AAV9.CB.hIDSを確立した。
ベクター。ヒトIDUA及びIDS cDNAを、ニワトリベータアクチンプロモーター、CMVエンハンサー、イントロン、及びウサギベータグロビンポリアデニル化配列を含む発現構築物にクローニングした。発現構築物は、AAV2逆方向末端反復に隣接していた。AAV9ベクターは、HEK293細胞の三重トランスフェクション及び以前に記載されているようなイオジキサノール精製(Lock et al.(2010).Hum Gene Ther 21:1259-71)によってこれらの構築物から生成した。
オープンフィールド活動:オープンフィールドにおける自発的活動は、Photobe
am Activity System(PAS)-Open Field(San Diego Instruments)を用いて測定した。マウスを個別に10分間の試行のためにアリーナに配置した。一般的な移動及び飼育活動を評価するために、水平及び垂直のビームブレイクを収集した。
4-メチルウンベリフェリルα-L-イドピラノシイズロン酸2-硫酸塩(Santa
Cruz Biotechnology)の20μL(0.01M酢酸鉛含有)(pH5.0)を10μLの試料と共にインキュベートすることによって測定した。37℃で2時間インキュベートした後、45μLのMcIlvain緩衝液(0.4Mリン酸ナトリウム、0.2Mクエン酸ナトリウム、pH4.5)及び5μLの組換えヒトイズロニダーゼ(Aldurazyme、0.58mg/mL、Genzyme)を、反応混合物に加え37℃で一晩インキュベートした。混合物をグリシン緩衝液(pH 10.9)で希釈し、放出された4-MUを、遊離4-MUの標準希釈と比較した蛍光(励起365nm、発光450nm)によって定量した。
前に記載されたように実施した(Hinderer et al.、2015)、Mol
Ther 23:1298-307)。LIMP2及びGM3について陽性に染色された細胞の数を、盲検のレビューアによって各動物の4つの脳切片において定量化した。
Mini Kitを用いてDNAを組織から単離し、ベクターゲノムを、記載されているようにTaqMan PCRによって定量した(Wang et al.、2011)、Hum.Gene Ther.22:1389-1401)。
・1群:未処置
・第2群:脳室内AAV9.CB.hIDS低用量3×108GC(1.875×109GC/g脳質量)
・第3群:脳室内AAV9.CB.hIDS中用量3×109GC(1.875×1010GC/g脳質量)
・第4群:脳室内AAV9.CB.hIDS高用量3×1010GC(1.875×1011GC/g脳質量)
・第5群:未処置の野生型同腹仔。
2~3月齢の雄性IDSy/-マウスを、サイトメガロウイルスエンハンサー(AAV9.CB.hIDS)を有するニワトリベータアクチンプロモーター由来の、ヒトIDSを発現するAAV9ベクターの脳室内(ICV)注射により処置した。ある最初のコホートでは、3種類のベクター用量[3×108、3×109または3×1010ゲノムコピー(GC)]のうちの1つでマウスを処置し、ベクターの生体内分布及びIDS発現の評価のためにベクター投与の3週間後に屠殺した。未処置のIDSy/-マウス及び野生型のオスの同腹仔が対照として役立った。生体内分布分析のために組織を収穫した。高用量群におけるベクター生体内分布の分析は、効率的な脳標的化を示し、宿主二倍体ゲノムあたり平均して1つのベクターゲノムを有した(図3)。CSFへのAAV送達の以前の研究と一致して、宿主二倍体ゲノムあたり2つ以上のベクターゲノムを有する、周辺へのベ
クター逃避及び効率的な肝標的化も存在した(図3)。脳組織、CSF、及び血清は全て、高用量群において野生型レベルに近づくか、またはそれを上回った、IDS活性の用量依存的増大を示した(図2A~2C)。中及び高用量コホートでは、ヒトIDSに対する抗体がいくつかの動物の血清で検出されたが、これは循環酵素活性に有意に影響しないようであった(図8)。
マウスは、嫌悪刺激を受けた状況を想起することが可能であったが、野生型同腹仔と比較して、フリージング応答の有意な低下が示された。AAV9のIT送達を受けたIDSy/-マウスは、注射していないマウスと同様のフリージング応答を示した。したがって、回復は検出されなかった。長期記憶喪失は、新規物体認識においても見出された。NORでは、IDSy/-マウスは、慣れた物体と比較して新規物体を好まないことが示された。ベクター処理したマウスは、未処置のIDSy/-マウスに見られるNOR欠損の回復を示した。物体判別は、中用量コホートにおいてのみ統計的に有意であったが、ただし群あたり8匹であって、この研究は行動エンドポイントの用量応答を評価するにはあまり強くなかった。2つのタイプの長期記憶の回復に示差的に影響するAAV9のIT送達能力は、各タスクに必要とされる異なる神経基質に起因する可能性がある。文脈恐怖条件付けは、視床周囲皮質を必要とするNORとは対照的な海馬依存性のタスクである[Oliveira、et al、Post-training reversible inactivation of the hippocampus enhances novel object recognition memory(海馬の訓練後の可逆的不活性化は、新規物体認識記憶を増強する)。Learning&memory(Cold
Spring Harbor、NY)2010;17:155-160;Abel et al.、Cell 1997;88:615-626]。
Iと比較してMPS IIにおいていくらか効率が低かった。これは、単に、これらの特定のベクターの発現効率の産物であったが、発現構築物中の制御エレメントは同一であった。いくつかの研究では、IDSのようなスルファターゼの発現が、IDSの翻訳後修飾に必要とされるスルファターゼ改変因子SUMF1の利用可能性によって制限され得ることが示唆された[Fraldi et al.、Biochemical J、2007:403:305-312。しかし、IDS及びSUMF1の同時発現を評価するパイロット実験は、より活性なIDS発現を示さなかった(データは示さず)。それにもかかわらず、蓄積病変の是正は、MPS Iマウスの場合とほぼ同じくらいMPS IIマウスで効率的であり、遺伝子移入は、MPS I及びMPS II患者の両方に対して同様に効果があるはずであることが示されたが、後者の場合、適度に高いベクター用量が、最適な転帰には必須である場合がある。
98-1307;Gurda et al.、Molecular therapy:the journal of the American Society of Gene Therapy 2015;Higuchi et al.、上記引用;Haurigot et al.、J Clin Invest、2013:123:3254-3271;Gray et al.、Gene Therapy、2013:20:450-459]。特に、IT AAVベクター送達後の肝形質導入は種間で実質的に変化するので、ヒトが有意な末梢発現を示すか否かはまだ明らかではない。
成体雄性アカゲザルにおけるAAV9.CB.hIDSの安全性及び効果を評価するために、非ヒト霊長類(NHP)における研究を実施する。この研究の目的は、くも膜下腔内(IT)AAV9.CB.hIDSの局所的、急性及び慢性の毒性を評価すること、ならびにベクターの生体内分布を定義することである。AAV9.CB.hIDS(5.6×1011または1.875×1011GC/g脳質量)の2つの用量のうちの1つまたはビヒクル対照希釈剤でのAAV9.CB.hIDSのIT注射で合計21匹の雄性マカクザルを処置する。低用量は、MPS IIマウス(MED=1.875×109GC/g)のMEDよりも約100倍大きく、MPSIIマウスにおける統計的に有意な組織学的改善及び認知機能を反映すると考えられる神経行動変化を生じる最低用量に対応する。より高い用量(MEDの約300倍)は、ベクターが製剤化され得る最大濃度であり、CSFに安全に投与され得る注射容積(<10%CSF容積)を維持する要件によって制限される。注射処置の間、動物は全身麻酔下に維持される。後頭下腔に脊髄針を入れる;配置は蛍光透視法を介して確認され、用量は1mLの総容積で投与される。注射後0日、3日、7日、14日、21日及び30日ならびにその後毎月に臨床病理評価のために血清及びCSFを収集する。注射後14、90、及び180日目に、各用量群の3匹の雄性マカクザル(各時間点につき合計6匹)を病理学及び生体内分布について屠殺する。ビヒクル処置動物は対照として役立つ。全ての動物由来の組織に対して完全な組織病理学を行い、高用量コホートについてベクターの生体内分布の分析を行う。DNA抽出及び定量的PCRによるベクターゲノムの検出は、以前に記載されたように(Chen et al.、2013、Hum Gene Ther Clin Dev、24(4):154-160を参照のこと)行われる。このアッセイは、1μgのDNAあたり20のベクターゲノムコピーを超える感度を有し、スパイク対照は、個々の試料の反応効率を検証するために含まれる。生体内分布、生化学及び免疫原性データを14日、3ヶ月及び6ヶ月で収集する。
AAV9.CB7.hIDSは、ヒトHEK293 MCB細胞の以下のトリプルプラスミドのトランスフェクションで生成する:(i)hIDSベクターゲノムプラスミド、(ii)AAV rep2及びcap 9野生型遺伝子を含むpAAV29と呼ばれるAAVヘルパープラスミドならびに(iii)pAdΔF6(Kan)と呼ばれるヘルパーアデノウイルスプラスミド。
ットに隣接するAAV2由来のITRを有する一本鎖DNAゲノムである。導入遺伝子カセットからの発現は、サイトメガロウイルス(CMV)早初期エンハンサー(C4)とニワトリベータアクチンプロモーターとの間のハイブリッドであるCB7プロモーターによって駆動されるが、このプロモーターからの転写は、ニワトリベータアクチンイントロン(CI)の存在によって増強される。発現カセットのポリAシグナルは、ウサギベータグロビン(RBG)ポリAである。hIDS配列[配列番号8のnt1177~nt2829、及び配列番号11のnt1937~nt3589]をコドン最適化すること及び合成することによってプラスミドを構築し、得られた構築物を、プラスミドpENN.CBV、CI.RBG(p1044)、CBV、CI及びRBG発現エレメントを含むAAV2
ITRに隣接発現カセットにクローニングしてpAAV.CB7.CI.hIDS.RBGを得た。
p5プロモーターは、この構築物において、キャップの5’末端からrepの3’末端に移されることに留意のこと。この配置は、プロモーターとrep遺伝子(すなわちプラスミド骨格)との間にスペーサーを導入し、repの発現をダウンンレギュレートし、ベクター産生を支持する能力を増大させるのに役立つ。p5E18中のプラスミド骨格は、pBluescript KS由来である。AAV2/9ヘルパープラスミドpAAV29KanRGXRep2は、4つの野生型AAV2 repタンパク質、AAV9由来の3つの野生型AAV VPキャプシドタンパク質、及びカナマイシン耐性をコードする。
Genomic Servicesにより行ったところ、参照配列pAdDeltaF6(Kan)p1707FH-Qの以下の重要な機能的エレメントと100%相同性が示された:E4 ORF6 3692-2808bp;E2A DNA結合タンパク質11784-10194bp;VA RNA領域12426-13378bp。
Transfection SA)を含有するDNA/PEI混合物を調製する。このプラスミド比は、小規模最適化研究におけるAAV産生に最適であると判定された。よく混合した後、溶液を室温で25分間放置する。次いで無血清培地に添加して反応をクエンチさせ、次いでHS-36に添加した。トランスフェクション混合物を、HS-36の全36層の間で等しくし、細胞を5%(±0.5%)CO2雰囲気中で、37℃(±2℃)で5日間インキュベートする。
での長期保存後の安定性を評価するためのさらなる研究が進行中である。
血清型同一性、空の粒子含有量及び導入遺伝子産物の同一性を含む特徴付けアッセイを実施する。アッセイの説明を以下に示す。
ウイルスベクターゲノムDNAを単離し、プライマーウォーキングを用いて2倍の配列決定カバレッジによって配列を決定する。配列アライメントを行い、予想される配列と比較する。
ベクターのAAV2/9血清型の確認は、質量分析(MS)によるVP3キャプシドタンパク質のペプチドの分析に基づくアッセイによって達成される。この方法は、SDS-PAGEゲルから切り出されたVP3タンパク質バンドのマルチ酵素消化(トリプシン、キモトリプシン及びエンドプロテイナーゼGlu-C)、続いてキャプシドタンパク質を配列決定するQ-Exactive Orbitrap質量分析計上のUPLC-MS/MSでの特徴付けを包含する。宿主タンパク質産物の差引き及び質量スペクトルからのキャプシドペプチド配列の導出を可能にする、タンデム質量スペクトル(MS)法が開発された。
oqPCRベースのゲノムコピー力価を、ある範囲の連続希釈にわたって決定し、同族プラスミド標準(pAAV.CB7.CI.hIDS.RBG.KanR)と比較する。oqPCRアッセイは、DNaseI及びプロテイナーゼKを用いた連続消化、続いてキャプシド化ベクターゲノムコピーを測定するためのqPCR分析を利用する。この同じ領域にハイブリダイズする蛍光標識されたプローブと組み合わせて、RBGポリA領域を標的とする配列特異的プライマーを用いてDNA検出を達成する。プラスミドDNA標準曲線との比較によって、PCR後の試料操作を必要とせずに、力価決定が可能になる。多数の標準、バリデーション試料及び対照(バックグラウンド及びDNA混入用)をアッセイに導入した。このアッセイは、感度、検出限界、適格性の範囲ならびに細胞内及び細胞間アッセイの精度を含むアッセイパラメータを確立し、定義することにより、定量される。内部AAV9参照ロットを確立し、資格試験を実施するために使用する。以前の経験から、本明細書に記載の最適化されたqPCRアッセイによって得られた力価は、一般に、前臨床データの生成に使用された本発明者らの標準qPCR技術により達成された力価の2.5倍であることが示唆される。
医薬品の総粒子含有量は、SDS-PAGE分析によって決定される。イオジキサノール勾配で精製された参照ベクター調製物を、様々な方法(分析的非遠心分離、電子顕微鏡及び260/280nmでの吸光度)によって分析して、その調製物が>95%のゲノム含有(完全)粒子を含有することを確立する。この参照物質は、既知のゲノムコピー数(したがって、拡張すれば粒子数)まで連続的に希釈され、各希釈物は、同様の希釈系列の薬物生成物とともにSDS PAGEゲル上で流される。参照物質及び医薬品VP3タンパク質バンドの両方のピーク領域容積をデンシトメトリーによって決定し、参照物質容積を、粒子数に対してプロットする。薬物生成物の全粒子濃度をこの曲線からの外挿により決定し、次いでゲノムコピー(GC)力価を差し引いて空の粒子力価を得る。空の粒子対全粒子の比は、空の粒子力価対GC力価の比である。
感染性単位(IU)アッセイを使用して、RC32細胞(rep2発現HeLa細胞)におけるベクターの生産的取り込み及び複製を決定する。以前に発表されたものと同様に、96ウェルエンドポイントフォーマットが採用されている。簡潔には、RC32細胞を、rAAV9.CB.hIDSの連続希釈と、rAAVの各希釈で12回の反復でのAd5の均一希釈とによって同時感染させる。感染の72時間後、細胞を溶解し、qPCRを行って入力に対するrAAVベクターの増幅を検出する。終点希釈TCID50計算(Spearman-Karber)を実施して、IU/mlとして表される複製力価を決定する。「感染性」値は、細胞と接触する粒子、受容体結合、内在化、核への輸送及びゲノム複製に依存するので、アッセイ形状ならびに使用される細胞系における適切な受容体及び結合後の経路の存在によって影響される。受容体及び結合後の経路は、通常、不死化細胞株において維持されないため、感染性アッセイ力価は、存在する「感染性」粒子の数の絶対的な尺度ではない。しかし、キャプシド化されたGCと「感染性単位」(GC/IU比として記載)との比を、ロット間での製品一貫性の尺度として使用してもよい。
ある試料を、生産プロセス中に潜在的に生じ得る複製コンピテントAAV2/9(rcAAV)の存在について分析する。細胞ベースの増幅及び継代とそれに続くリアルタイムqPCR(キャップ9標的)によるrcAAV DNAの検出からなる3継代アッセイが開発されている。細胞ベースの構成要素は、試験試料及び野生型ヒトアデノウイルスタイプ5(Ad5)の希釈液を用いてHEK293細胞(P1)の単層を接種することからなる。1010GCのベクター産物は、試験した生成物の最大量である。アデノウイルスの存在により、複製コンピテントAAVは、細胞培養において増幅する。2日後、細胞溶解物を生成して、Ad5を熱不活性化する。次いで、清澄化された溶解物を、第2ラウンドの細胞(P2)に継代して(再びAd5の存在下で)感受性を高める。2日後、細胞溶解物を生成して、Ad5を熱不活性化する。次いで、清澄化された溶解物を、細胞の第3ラウンド(P3)に継代して、(再度、Ad5の存在下で)感受性を最大にする。2日後、細胞を溶解してDNAを放出させ、次いでこれをqPCRに供してAAV9キャップ配列を検出する。Ad5依存的な様式でのAAV9キャップ配列の増幅は、rcAAVの存在を示す。AAV2 rep及びAAV9 cap遺伝子を含むAAV2/9代理陽性対照の使用により、アッセイの検出限界(LOD)を決定することが可能になり(0.1、1、10及び100IU)、rAAV9.CB.hIDSベクターの連続希釈(1×1010、1×109、1×108、1×107GC)を使用して、試験試料中に存在するrcAAVの近似レベルを定量してもよい。
qPCRGC力価を遺伝子発現と関連付けるために、1細胞あたり既知の多重度のGCを用いてHEK293(ヒト胎児腎臓)細胞を形質導入し、形質導入の72時間後のIDS活性について上清をアッセイすることによりインビトロバイオアッセイを実施する。IDS活性は、0.1mlの水に希釈した試料を100mmol/lの4MU-イズロニド-2-硫酸の0.1mlと37℃で1~3時間インキュベートすることによって測定する。反応を、2mlのグリシン290mmol/l、180mmol/lのクエン酸ナトリウム、pH10.9の添加により停止させ、遊離した4MUを、蛍光を4MUの標準希釈液と比較することによって定量する。高度に活性な前臨床及びtoxベクター調製物との比較は、生成物活性の解釈を可能にする。
ビシンコニン酸(BCA)アッセイを用いて、ウシ血清アルブミン(BSA)タンパク質標準曲線に対する全タンパク質について、ベクター試料を総タンパク質についてまず定量する。決定は、等量の試料をキットに入っているMicro-BCA試薬と混合することによって行う。同じ手順を、BSA標準の希釈に適用する。混合物を60℃でインキュベートし、吸光度を562nmで測定する。標準曲線は、4パラメータ適合を用いて既知の濃度の標準吸光度から生成される。未知試料は、4パラメータ回帰に従って定量する。
今回の研究では、MPS Iイヌ由来のCSF試料の代謝産物プロファイリングを行い、CSFメタボロームにおける実質的な疾患関連変化が明らかになった。最も顕著な相違は、正常対照と比較してスペルミンレベルの30倍以上の上昇であった。この知見は、MPS I患者試料ならびにMPS Iのネコモデルにおいて確認され、MPS IIにおいても見出されると予想される。スペルミンはHSに結合し、スペルミンの細胞取り込みは、この相互作用に依存する[M.Belting、S.Persson、L.-A.Fransson、Proteoglycan involvement in polyamine uptake(プロテオグリカンは、ポリアミン摂取に関与する)。Biochemical Journal 338、317-323(1999);J.E.Welch、P.Bengtson、K.Svensson、A.Wittrup、G.J.Jenniskens、G.B.Ten Dam、T.H.Van Kuppevelt、M.Belting、Single chain fragment anti-heparan sulfate antibody targets the polyamine transport system and attenuates polyamine-dependent cell proliferation(単鎖フラグメント抗ヘパラン硫酸抗体は、ポリアミン輸送系を標的とし、ポリアミン依存性細胞増殖を減弱させる).International journal of oncol
ogy 32,749-756(2008);オンライン公開EpubApr]。Cell surface proteoglycans such as glypican-1 can bind spermine through their HS moieties, and after endocytosis of the glypican protein, intracellular cleavage of
the HS chain releases bound spermine into the cell(グリピカン-1のような細胞表面プロテオグリカンは、そのHS部分を通じてスペルミンに結合し得、グリピカンタンパク質のエンドサイトーシス後、HS鎖の細胞内切断は、細胞に対して結合したスペルミンを遊離する)(Belting
et al.、K.Ding、S et al.、The Journal of biological Chemistry 276、46779-46791(2001);オンライン公開EpubDec 14)。従って、無傷のHSリサイクリングは、スペルミン摂取にとって必須である。MPS Iでは、細胞外スペルミンの蓄積は、非効率的なHSリサイクリングに起因するこの取り込み機構の阻害を通じて、またはMPSに蓄積する細胞外GAGへのスペルミンの単純な結合を通じて起こり得、スペルミン結合平衡をシフトさせて細胞外分布を促進する。今後の研究は、MPS I CSFにおけるスペルミン蓄積に対するこれらの機構の相対的な貢献に取り組むべきである。
Iにおける神経突起伸長に寄与する唯一のメディエーターではない可能性もある。特に、多くの神経栄養因子がHS修飾受容体を通じて結合し、細胞外マトリックス中のHSとの相互作用は、神経突起伸長に影響を及ぼし得る[D.Van Vactor、D.P.Wall、K.G.Johnson、Heparan sulfate proteoglycans and the emergence of neuronal connectivity(ヘパラン硫酸プロテオグリカン及びニューロン結合の出現).Current opinion in neurobiology16,40-51(2006);オンライン公開EpubFeb(10.1016/j.conb.2006.01.011)]。したがって、スペルミン蓄積は、MPS Iにおける異常な神経突起伸長を促進するいくつかの要因のうちの1つであり得る。
可能性があり、これらの障害に伴う認知機能不全を説明する可能性がある。これらの知見はまた、CSFスペルミンが、MPS Iのための新規なCNS指向性療法の薬力学を評価するための非侵襲的バイオマーカーとして有用であることを示す。
実験的デザイン:この研究は、健康な対照由来の試料と比較して、MPS I患者のCSF試料において有意に異なるレベルで存在する代謝産物を検出するために最初にデザインした。MPS IHの小児及び健康な対照からのCSF試料の利用可能性が限られているため、その後、ヒト試料中の候補バイオマーカーを評価する目的で、より多数が入手可能であったMPS Iイヌ由来のCSF試料を用いて、最初のスクリーニングを行った。個々の未処置のMPS Iイヌからの合計15のCSF試料を分析に利用してもよく、さらに健康な対照から15の試料を得た。有望な代謝産物スクリーニングにおいてMPS IイヌCSFにおけるスペルミン上昇の同定に続いて、遺伝子治療で処置されたMPS Iイヌ及びネコの以前の研究由来のCSF試料ならびに患者試料においてスペルミンをレトロスペクティブに測定した。これらの分析のために各群に含まれた対象の数は、試料の入手可能性によって制限され、統計的考察に基づくものではなかった;したがって、ある場合には、統計的比較のための数は不十分であった。インビトロでの神経突起伸長の研究のために、各条件について定量された細胞の数は、1細胞あたりの分岐長、神経突起数または神経突起枝の20%の差異を検出するために、1条件あたり>30個の細胞が必要であることを示したパイロット実験に基づいた。細胞をプレートし、指定された薬物で処理した後、ウェルをコード化し、細胞画像の獲得及び神経突起の長さ及び分岐の手技的な定量化を、盲検のレビューアによって行った。類似の結果を有する異なる基質[チャンバスライド(Sigma S6815)ではなくポリ-L-リジン(Sigma)コーティングされた組織培養プレート]を用いて野生型マウスとMPSマウスニューロンの比較を繰り返した。スペルミン添加の有無にかかわらず両方の基質を用いて野生型ニューロンの比較を4回行って同様の結果を得た。
処理するまで試料を-80℃で保存した。試料は、MicroLab STAR(登録商標)システム(Hamilton Company)を用いて調製した。QC目的のための抽出プロセスの第1段階の前に、回収標準を加えた。タンパク質を、2分間激しく振盪しながらメタノールで沈殿させた後、遠心分離した。得られた抽出物を、以下の5つの画分に分けた:1つは、陽イオンモードエレクトロスプレーイオン化を伴う逆相(RP)UPLC-MS/MS分析用、1つは、陰イオンモードエレクトロスプレーイオン化を伴うRP/UPLC-MS/MS分析用、1つは、陰イオンモードエレクトロスプレーイオン化を伴う親水性相互作用クロマトグラフィー(HILIC)/UPLC-MS/MSによる分析用、1つは、GC-MSによる分析用、そして1つの試料をバックアップのために確保した。試料をTurboVap(登録商標)(Zymark)上に短時間置いて、有機溶媒を除去した。LCについては、分析準備の前に試料を窒素下で一晩保存した。GCについては、分析の準備の前に各試料を一晩真空下で乾燥させた。
のカラム(Waters UPLC BEHC18-2.1×100mm、1.7μm)を利用した。酸性条件で再構成された抽出物は、0.1%ギ酸を含有する水及びメタノールを用いて勾配溶出した。塩基性抽出物は、メタノール及び水を用いて同様に、ただし6.5mM重炭酸アンモニウムを用いて溶出した。第3のアリコートを、10mMギ酸アンモニウムを含む水及びアセトニトリルからなる勾配を使用して、HILICカラム(Waters UPLC BEH Amide 2.1×150mm、1.7μm)からの溶出後の陰イオン化によって分析した。MS分析は、動的排除を使用して、MSとデータ依存MSnスキャンとの間で交互に行った。走査範囲は、方法によってわずかに異なるが、80-1000m/zをカバーした。
H2O(v/v)であった。溶出条件は、以下のとおりであった:2%Bで0分、2%Bで2分、60%Bで5分、80%Bで10分、98%Bで11分、98%Bで16分、2%Bで17分、2%Bで22分であり、カラム温度は35℃であった。Finnigan
TSQ Quantum Ultra分光計(Thermo Fisher、San Jose、CA)を使用して、陽イオンモードで以下のパラメータでMS/MS分析を行った:4000Vの噴霧電圧、270℃のキャピラリー温度、35任意単位のシースガス圧、2任意単位でのイオン掃引ガス圧力、10任意単位での補助ガス圧力、200℃での気化器温度、50のチューブレンズオフセット、キャピラリーオフセットが35、及びスキマーオフセットが0であった。以下の遷移をモニターした:203.1/112.1(スペルミン);211.1/120.1(スペルミン-d8)、スキャン幅は0.002m/z、スキャン時間は0.15秒であった。
gnal West Pico基質(Thermo Fisher Scientific)を用いてバンドを検出した。デンシトメトリーは、Image Lab 5.1(Bio-Rad)を用いて行った。
st3.0[J.Xia et al.、MetaboAnalyst2.0-メタボロームデータ分析のための包括的なサーバを使用して実施した。Nucleic Acids Research、(2012);オンライン公開EpubMay 2,2012(10.1093/nar/gks374);J.Xia、et al.、MetaboAnalyst:a web server for metabolomic data
analysis and interpretation(メタボロームデータ分析及び解釈のためのウェブサーバ)。Nucleic Acids Research 37、W652-W660(2009);オンライン公開EpubJuly 1、2009(10.1093/nar/gkp356)。J.Xia et al.、MetaboAnalyst 3.0-making metabolomics more meaningful.Nucleic Acids Research、(2015);オンライン公開EpubApril20,2015(10.1093/nar/gkv380)]。代謝産物スクリーニングの検出不可能な値は、データセットで観察された最小値とみなした。生のピークデータを正常試料値の平均値に正常化し、対数変換した。GraphPad Prism 6を用いて、他の全ての統計分析を行った。培養神経枝の長さ、神経突起の数、及び分岐を、ANOVAにより、続いてダネット検定により比較した。CSFスペルミン及び皮質GAP43を、クラスカル・ウォリス検定、続いてダネット検定によって比較した。
1.代謝産物プロファイリングによるCSFスペルミンの上昇の同定
CSF代謝産物の最初のスクリーニングは、MPS Iのイヌモデルを使用して行った。これらの動物は、IDUA遺伝子にスプライス部位突然変異を有し、その結果、酵素発現の完全な消失及びMPS I患者のものに類似した臨床的及び組織学的特徴の発達が生じた[K.P.Menon et al.、Genomics 14、763-768(1992);R.Shull、et al.、The American Journal of Pathology 114、487(1984)]。CSF試料を15匹の正常イヌ及び15匹のMPS Iイヌから採取した。CSF試料を、LC及びGC-MSによる代謝産物の相対量について評価した。全部で281の代謝産物がCSF試料において質量分析によって陽性と特定された。これらのうち47匹(17%)が対照と比較してMPS1イヌで有意に上昇し、88匹(31%)は対照と比較して減少した。群間で最も異なる50種類の代謝産物のヒートマップを、図19Aに示す。代謝産物プロファイリングによって、MPS Iと正常イヌとの間のポリアミン、スフィンゴリピド、アセチル化アミノ酸、及びヌクレオチド代謝における顕著な差異が同定された。ランダムフォレストクラスタリング分析によって、ポリアミンスペルミンがMPS Iと正常イヌとの間の代謝産物の相違の最大寄与因子であることが同定された(図23)。平均して、スペルミンは、試料採取時に1カ月齢未満の1匹のMPS1イヌを除いて、MPS1イヌにおいて30倍を超えて上昇した。CSF中のスペルミンを定量的に測定するために、安定同位体希釈(SID)-LC-MS/MSアッセイが開発された。ハーラー症候群(6~26ヵ月齢)の6人の子供、ならびに2匹の健常対照(36ヵ月及び48ヵ月)から試料をスクリーニングした。両方の健常対照は、アッセイの定量限界(1ng/mL)未満のCSFスペルミンレベルを有したが、MPS I患者のCSF試料は、定量限界より平均10倍高かった(図19B)。MPS IH患者におけるスペルミン上昇は、スペルミン結合及び取り込みにおけるHSの公知の役割と一致するように見えた[M.Belting et
al.、Journal of Biological Chemistry 278、47181-47189(2003);M.Belting et al.、Proteoglycan involvement in polyamine uptake.Biochemical Journal 338、317-323(1999);J.E.Wellch、et al、International journal of
oncology 32、749-756(2008))];増大した合成は、正常イ
ヌ及びMPS Iイヌ脳試料がポリアミン合成経路において転写調節された酵素について同様のmRNA発現レベルを有したので、上昇したCSFスペルミンの原因とは思われなかった(図24)。スペルミン上昇がヘパラン硫酸蓄積疾患の一般的な特性であるかMPS Iに特異的であるかを決定するために、類似の高さを示すMPS VIIのイヌモデル由来のCSF試料においてスペルミンを測定した(図25)。
軸索損傷後のニューロンは、神経突起伸長を促進するポリアミン合成をアップレギュレートする[D.Cai、et al.、Neuron 35、711-719(2002)。オンライン公開EpubAug 15;K.Deng、et al、The Journal of neuroscience:the official journal of the Society for Neuroscience 29、9545-9552(2009);オンライン公開EpubJul 29;Y.Gao、et al.、Neuron 44、609-621(2004)。オンライン公開EpubNov 18;R.C.Schreiber、et al.、Neuroscience 128、741-749(2004)]。したがって、本発明者らは、MPSニューロンに記載されている異常な神経突起過形成表現型におけるスペルミンの役割を評価した[Hocquemiller、S.et al.、Journal of neuroscience research 88、202-213(2010)]。MPS Iマウス由来のE18皮質ニューロンの培養物は、コロニーの野生型マウス由来のニューロンよりも、培養中で4日後により大きい神経突起数、分岐及び総分岐長を示した(図20A~20F)。スペルミン合成の阻害剤であるAPCHAによるMPSニューロンの処置は、神経突起の成長及び分岐を有意に減少させた。この効果は、スペルミンを置換することによって可逆的であった(図20A~20F)。同じAPCHA濃度は、正常なニューロンの増殖に影響しなかった(図26)。インビボで同定されたものと同様の濃度で野生型ニューロン培養物にスペルミンを添加すると、神経突起の成長及び分岐が有意に増大した(図20A~20F)。
神経突起伸長の中心的調節因子であるGAP43は、インビトロ及びインビボの両方でMPS IIIマウスニューロンによって過剰発現され、このことは、ニューロン培養において異常に活性化される同じ神経突起伸長経路がインビボでも活性であることを示唆している。インビボでのGAP43発現及びスペルミン蓄積に対するIDUA欠損の効果を評価するために、本発明者らは、未処置のMPS Iイヌ及びCNS指向性遺伝子治療で処置したイヌにおけるCSFスペルミン及び脳GAP43レベルを測定した。本発明者らは、先に、イヌIDUA導入遺伝子を保有するアデノ随伴ウイルス血清型9ベクターのくも膜下腔内注射によって処置された5匹のMPS1イヌについて記載した[C.Hinderer et al.、Molecular therapy:the journal of the American Society of Gene Therapy 23、1298-1307(2015);オンライン公開Epub Aug]。MPS Iイヌは、正常なIDUA酵素に対する抗体を産生し得るので、2匹のイヌを、肝臓IDUA遺伝子移入を受けた新生児として前処理してこのタンパク質に対する免疫寛容を誘導した。両方の寛容化イヌとも、AAV9処置後、正常よりもはるかに高い脳IDUA活性を示した。3匹の非寛容化イヌは、様々なレベルの発現を示し、1匹の動物が正常よりもレベルに達し、他の2匹が正常に近い発現を示した(図21A)。CSFスペルミン減少は、脳IDUA活性に反比例し、IDUA発現が最も低い2匹のイヌにおける未処置動物と比較して3倍低下し、最も高い発現を有する動物において20倍を超えて低下した(図21A、図21B~21H及び21Kまで)。MPS1イヌの前頭皮質においてGAP43がアップレギュレートされ、発現は全てのベクター処理動物で正常化された(図21I~21J)。
for MPS I in a canine model(新生児寛容の誘導は、イヌのモデルでMPS Iに関する遺伝子治療の正確な評価を可能にする)。Molecular Genetics and Metabolism、dx.doi.org/10.1016/j.ymgme.2016.06.006]..CSFスペルミンを、注射6か月後に評価した(図22A)。CSFスペルミンの減少は、用量依存性であり、中及び高ベクター用量の動物は、正常範囲に達したが、低用量動物ではCSFスペルミンは部分的にしか減少しなかった。IDUA欠損症とCSFのスペルミンの蓄積との間の関係を独立して確認するために、本発明者らは、MPS IのネコモデルにおいてCSFスペルミンのレベルを評価した。以前に報告された遺伝子治療の研究由来のCSF試料を用いて、本発明者らは、未処置のMPS IネコがCSFスペルミンの上昇を示したことを見出した(図22B)[C.Hinderer、P.Bell、B.L.Gurda、Q.Wang、J.P.Louboutin、Y.Zhu、J.Bagel、P.O’Donnell、T.Sikora、T.Ruane、P.Wang、M.E.Haskins、J.M.Wilson、Intrathecal gene therapy corrects CNS pathology in a feline model of
mucopolysaccharidosis I.Molecular therapy(くも膜下腔内遺伝子治療は、ムコ多糖症IのネコモデルにおいてCNS病理を是正する):the journal of the American Society of Gene Therapy22、2018-2027(2014);オンライン公開EpubDec(10.1038/mt.2014.135)]。ネコIDUA正常化CSFスペルミンレベルを発現する高用量のAAV9ベクターのくも膜下腔内投与(図22B)。
今回の研究では、本発明者らは、MPS IイヌからのCSF試料の代謝産物プロファイリングを実施し、これによって、CSFメタボロームにおける実質的な疾患関連変化が明らかになった。最も顕著な相違は、正常対照と比較してスペルミンレベルの30倍以上の上昇であった。この知見は、MPS I患者の試料ならびにMPS Iのネコモデル及びMPS VIIのイヌモデルにおいて確認された。スペルミンは、高い親和性でHSに直接結合し、スペルミンの細胞取り込みは、この相互作用に依存する[M.Belting、S.PERSSON、L.-A.Fransson、Proteoglycaninvolvementinpolyamineuptake(プロテオグリカンは、ポリアミン摂取に関与する)。Biochemical Journal 338、317-323(1999);J.E.Welch、et al、International journal of oncology 32、749-756(2008)]。グリピカン-1のような細胞表面プロテオグリカンは、そのHS部分を通じてスペルミンに結合し得、グリピカンタンパク質のエンドサイトーシス後、HS鎖の細胞内切断は、結合したスペルミンを細胞に放出する[上記のBelting et al.;K.Ding et al.、The Journal of biological chemistry 276、46779-46791(2001);オンライン公開EpubDec 14号]。従って、無傷のHSリサイクリングは、スペルミン摂取にとって必須である。IDUA欠損による非効率的なHS再利用は、このスペルミン取り込み機構を阻害し得、細
胞外スペルミン蓄積を引き起こし得る。あるいは、細胞外GAGは、スペルミンを隔離し、平衡をシフトさせて細胞外分布を促進し得る。この研究におけるLC-MS試料調製に用いたメタノール脱タンパクステップはまた、可溶性HSを沈殿させ、CSF中に検出されたスペルミンは結合していないこと、従ってGAG結合ではなく取り込み阻害が細胞外スペルミン蓄積の原因であることを示唆する[N.Volpi、Journal of chromatography.B、Biomedical applications
685、27-34(1996);オンライン公開EpubOct 11]。機能的ニューラルネットワークの形成及び維持には、神経突起伸長及びシナプス形成の正確な制御が必要である。発達中、CNS環境は、神経突起形成に対してますます阻害的になり、ミエリン関連タンパク質が大人の脳における神経突起伸長を主にブロックする。減少した神経突起伸長へのこの発生的なシフトは、GAP43発現の減少と並行する[S.M.De
la Monte et al.、Developmental Brain Research 46,161-168(1989);オンライン公開Epub4/1/]。MPSニューロンによって示される持続的なGAP43発現及び誇張された神経突起伸長は、阻害及び成長促進シグナルのこの正常なバランスを妨げ、異常な接続性及び認知障害をもたらす。HS蓄積がどのようにしてこの神経成長の増大をもたらすかは確立されていない。多くの研究が、神経突起伸長におけるポリアミンの関与を示唆しており;軸索の損傷後、スペルミン及びその前駆体であるプトレシン及びスペルミジンの合成のための律速酵素が上昇し、ミエリンからの阻害シグナルの存在下でさえ神経突起伸長の増強を可能にする[全て上記で引用される、Cia(2002)、Deng(2009)、Gao(2004)。さらに、プトレシンによるニューロンの処理は、スペルミン合成の阻害剤によってブロックされる効果であって、CSFに直接注射した場合に神経突起伸長を誘導する(上記で引用される、Deng(2009))。ポリアミンが神経突起の成長に及ぼす機構は未知である。潜在的な標的の1つはNMDA受容体であり、その活性化はスペルミン結合によって増強される(J.Lerma、Neuron 8,343-352(1992);オンライン公開Epub2//(http://dx.doi.org/10.1016/0896-6273(92)90300-3))。NMDAシグナル伝達は、神経突起伸長を誘導し、受容体のスペルミン感受性サブユニットは、発生中に高度に発現される[D.Georgiev et al.、Experimental cell research 314,2603-2617(2008);オンライン公開EpubAug 15(10.1016/j.yexcr.2008.06.009);R.G.Kalb、Regulation of motor neuron dendrite growth by NMDA receptor activation(NMDA受容体活性化による運動ニューロンの樹状突起成長の調節).Development 120、3063-3071(1994);J.Zhong、et al.、Journal of neurochemistry 64、531-539(1995)。特に、多くの神経栄養因子が、HS修飾レセプターを介して結合し、細胞外マトリックス中のHSとの相互作用は、神経突起の成長に影響を及ぼし得る(D.Van Vactor et al.、Current opinion in neurobiology 16,40-51(2006);オンライン公開EpubFeb)。したがって、スペルミン蓄積は、MPS Iにおける異常な神経突起伸長を促進するいくつかの要因のうちの1つであり得る。15匹のMPS IイヌCSF試料をスクリーニングしたが、1匹だけが正常範囲のスペルミン濃度に収まった。28日齢で、これは研究に含まれた最も若い動物であった。この知見によって、スペルミンの蓄積が年齢に依存し得ることが示されるが、この研究では、ハーラー症候群の乳児ではスペルミンがすでに6ヶ月齢までに上昇していることが実証されている。将来の研究では、CSFスペルミンのレベルをMPS患者で長軸方向に評価する。スペルミンがMPS患者では年齢とともに増大するのであれば、ほとんどの患者が発達遅延の発症前に1~2年の正常な発達を経験するので、これによって認知低下の動態が説明される。MPSにおける酵素欠損と異常な神経突起伸長表現型との間の新規な関連性にニューロン成長点を変化させる代謝産物の蓄積を誘発することがHS代謝
障害の原因となり、これらの障害に関連する認知機能不全を説明し得る。将来の研究は、MPS IIのような他のMPSにおけるスペルミン上昇を確認する。これらの知見によってまた、CSFスペルミンが、MPSのための新規なCNS指向性療法の薬力学を評価するための非侵襲的バイオマーカーとして有用であることが示される。CNS指向性療法の将来のトライアルは、認知エンドポイントとCSFスペルミンの変化との間の相関を評価する。
A.処置前のスクリーニング評価
1.プロトコール訪問1:スクリーニング
治験責任医師は、対象(または指定された介護者)がインフォームドコンセントに署名した際に十分に情報を得るために、大槽内(IC)手順、投与手順そのもの、及び全ての潜在的な安全リスクに至るスクリーニングプロセスについて説明する。
適格性を審査するのに十分な時間を与えるために、以下の手順を、最初のスクリーニング訪問と研究訪問2(0日目)の1週間前までの間、いつでも実施する:
・ガドリニウムの有無における頭部/頸部磁気共鳴イメージング(MRI)[注:対象はガドリニウムを受けるのに適した候補でなければならない(すなわち、eGFR>30mL/分/1.73m2)]
・頭部/頚部MRIに加えて、研究者は、屈曲/伸長研究による頚部のさらなる評価の必要性を判定する
・MRIプロトコールには、T1、T2、DTI、FLAIR、及びCINEプロトコールのイメージを含む
・施設内プロトコールによる頭部/頸部MRA/MRV(注:内/経頭蓋手術の病歴を有する対象を除外する場合もあるし、またはCSFフローの適切な評価及びCSF腔の間の連絡の潜在的な遮断または欠如の特定を可能にするさらなる試験(例えば、放射性ヌクレオチドの超音波検査)を必要とする場合もある。
・神経放射線科医/神経外科医の対象手続き評価会議:3つのサイトからの代表者は、利用可能な全ての情報(スキャン、病歴、身体検査、臨床検査など)に基づいてIC手順の各対象の適格性について考察する電話会議(またはウェブ会議)を持つ。IC手順または対象をスクリーニングできずに進行することでコンセンサスを達成するための全ての試みを行うべきである(すなわち、各メンバーは、決定を受け入れる準備をすべきである)。・-28日目~1日目までの麻酔の術前評価であって、MPS対象の特別な生理的要件を念頭に置いて、気道、頸部(短縮/肥厚)及び頭部動作範囲(頸部屈曲度)の詳細な評価をともなう。
3. 1日目:コンピュータトモグラフィー室及び投与のためのベクター調製。IC手技に先立って、CT室は以下の機器と薬が存在することを確認する:
・成人の腰椎穿刺(LP)キット(施設ごとに提供)
・BD(Becton Dickinson)22または25ゲージ×3-7インチの脊髄針(Quincke bevel)
・インターベンション医師の裁量で使用される同軸導入針(例えば、18G×3.5インチ)(脊髄針の導入用)
・スイベル(スピン)オスルアーロック付き4方向小口径ストップコック
・メスルアーロックアダプター付きのTコネクタ延長セット(チューブ)、およその長さ6.7インチ
・くも膜下腔内投与のためのOmnipaque 180(イオヘキソール)
・静脈内(IV)投与のためのヨード化造影剤
・1%リドカイン注射液(成人用LPキットに含まれていない場合)
・プレフィルドの10ccの生理食塩水(無菌)フラッシュシリンジ
・放射線不透過性マーカー(複数可)
・手術用準備器具/シェービング用かみそり
・挿管された対象の適切な位置決めを可能にする枕/サポート
・気管内挿管器具、全身麻酔機及び人工呼吸器
・術中神経生理学的モニタリング(IONM)装置(及び要員)
・AAV9.hIDUAベクターを含む10ccシリンジ;個別の薬局マニュアルに従って、CT/手術室(OR)室を準備してそこに移動する。
4. 1日目:対象の準備及び投与
・研究及び手順のインフォームドコンセントは、医療記録及び/または研究ファイル内で確認され、文書化される。放射線科医及び麻酔科医による処置に関する別個の同意は、施設の要件に従って得る。
・研究の対象は、施設ガイドライン(例えば、2つのIVアクセス部位)に従って適切な病院ケアユニット内で静脈内アクセスを行う。静脈内の液体は、麻酔科医の裁量で投与される。
・麻酔科医の裁量で、施設ガイドラインに従って、適切な患者ケアユニット、保留エリアまたは外科/CT処置室で全身麻酔を施行して研究対象を導入し、気管内挿管を行う。
・腰椎穿刺を行い、まず脳脊髄液(CSF)5ccを除去し、その後、大槽の視覚化を助けるためにくも膜下腔内造影剤(Omnipaque 180)を注射する。大槽内への造影剤の拡散を容易にするために、適切な対象の位置決め操作を行う。
・まだ行われていない場合、術中神経生理学的モニタリング(IONM)装置を対象に取り付ける。
・対象は、腹臥位または側臥位でCTスキャナテーブル上に置かれる。
適切と考えられる場合、対象は、術前評価中に安全と判断された程度まで首の屈曲をもたらし、位置決め後に証明された正常な神経生理学的モニター信号があるような方式で位置決めされる。
・次の研究スタッフ及び研究者(複数可)が、現場に存在し特定されることが確認されている。
o手技を行うインターベンション医師/神経外科医
o麻酔科医及び呼吸技師(複数可)
o看護師及び医師の助手
oCT(またはOR)技術者
o神経生理学技術者
o現場研究コーディネーター
・頭蓋骨の下の対象の皮膚を適切に剃る。
・CTスカウト画像を実行した後、目標位置を特定し、血管系を画像化するために介入主任者が必要と考える場合には、IV造影剤による処置前計画CTを続ける。
・一旦、標的部位(大槽)が同定され、針の軌道が計画されれば、施設ガイドラインに従って無菌技術を用いて皮膚を準備し、ドレープする。
・放射線不透過性マーカーを、インターベンション医師が指示するように、標的皮膚の位置に配置する。
・マーカーの下の皮膚を、1%リドカインを用いる浸潤によって麻酔する。
・22Gまたは25Gの脊髄針を大槽に向かって前進させ、必要に応じて同軸導入針を使用する。
・針の前進後、CT画像は、施設機器(理想的には2.5mm以下)を使用して実現可能な最も薄いCTスライス厚を使用して取得する。連続CT画像は、針及び関連する軟部組織(例えば、傍脊髄筋、骨、脳幹、及び脊髄)の適切な視覚化を可能にする、可能な最低
線量を使用すべきである。
・正確な針の配置は、針ハブ内のCSFの観察及び大槽内の針先の可視化によって確認される。
・インターベンション医師は、ベクターを含むシリンジが滅菌野の近くにあるが、滅菌野の外に位置していることを確認する。ベクターを取り扱うか投与する前に、滅菌野内で処置を手助けするスタッフによって手袋、マスク、及び目の保護具が着用されていることを確認する(滅菌野の外にいる他のスタッフはこれらの処置を受ける必要はない)。
・短い(~6インチ)延長チューブを挿入された脊髄針に取り付け、次に4方向ストップコックに取り付ける。一旦、この装置が対象のCSFで「自己プライミング」されると、10ccのプレフィルド生理食塩水フラッシュシリンジを4方向ストップコックに取り付ける。
・ベクターを含むシリンジをインターベンション医師に渡し、4方向ストップコックのポートに取り付ける。
・一旦、ベクターを含むシリンジへのストップコックポートを開けたら、注射中にプランジャーに過度の力を加えないよう注意しながら、シリンジの内容物をゆっくりと注射する(約1~2分以上)。
・一旦、AAV9.hIDUAを含むシリンジの内容物を注射したら、ストップコックを回して、取り付けられたプレフィルドシリンジを使用して、1~2ccの生理食塩水でストップコックと針のアセンブリをフラッシュしてもよい。
・準備ができたら、インターベンション医師はスタッフに装置を対象から取り外すように警告する。
・一回の動きで、針、延長チューブ、ストップコック、及びシリンジを対象からゆっくりと取り外し、バイオハザード廃棄レセプタクルまたは硬い容器(針用)に廃棄するために外科用トレイに置く。
・針挿入部位を出血またはCSF漏出の徴候について検査し、研究者の指示に従って処置する。サイトは、示されているように、ガーゼ、外科用テープ及び/またはTegaderm包帯を使用して手当する。
・対象をCTスキャナから出させて、ストレッチャー上に仰臥位で置く。
・麻酔を中止して、麻酔後のケアのための施設のガイドラインに従って対象をケアする。神経生理学的モニターを、研究対象から外してもよい。
・対象が横たわるストレッチャーの頭部は、回復中にわずかに(約30度)持ち上げるべきである。
・対象は、施設のガイドラインに従って適切な麻酔後ケアユニットに移送される。
・対象は、意識を十分に回復し、安定した状態になった後、プロトコールに基づくアセスメントのために適切なフロア/ユニットに入室する。・プロトコールに従って神経学的アセスメントを行い、治験責任者は病院及び研究のスタッフと協力して対象のケアを監督する。
この研究の目的は、脳室内(ICV)注射、及び腰椎穿刺による注射を含む、CSFへのより慣用的な投与方法を評価することであった。要するに、この研究では、ICV及びIC AAV投与をイヌで比較した。ベクターの投与は、非ヒト霊長類の腰椎穿刺によって評価し、動物の一部は、ベクターの頭蓋内分布を改善することが示唆された操作である、注射後、トレンデレンブルグ位に置いた。イヌの研究では、ICV及びICベクター投与は、脳及び脊髄全体にわたって同様に効率的な形質導入をもたらした。しかし、ICVコホートの動物は、導入遺伝子産物に対する重度のT細胞応答に明らかに起因して、脳炎を発症した。ICVコホートにおいてのみ、この導入遺伝子特異的免疫応答の発生は、導入遺伝子発現部位における注射手順からの局在性炎症の存在に関連すると疑われる。非ヒト霊長類(NHP)の研究では、非常に大きな注射量(全CSF量の約40%)を用いることにより、腰部槽へのベクター投与後の形質導入効率が以前の研究と比較して改善され
た。しかし、このアプローチはやはり、IC管理ほどは効率的ではなかった。注射後にトレンデレンブルグに動物を配置することは、さらなる利益をもたらさなかった。しかし、大きな注射量はベクターの頭蓋内分布を改善し得ることが判明した。
1.ベクター生成:GFPベクターは、ニワトリベータアクチンプロモーターとともに、サイトメガロウイルス早初期エンハンサー、人工イントロン、増強緑色蛍光タンパク質cDNA、ウッドチャック型肝炎ウイルス転写後調節エレメント、及びウサギベータグロビンポリアデニル化配列を含む発現カセットを保持するAAV血清型9キャプシドから構成された。GUSBベクターは、ニワトリベータアクチンプロモーターとともにサイトメガロウイルス早初期エンハンサー、人工イントロン、イヌGUSB cDNA、及びウサギベータグロビンポリアデニル化配列を含む発現カセットを保持するAAV血清型9キャプシドから構成された。ベクターは、HEK293細胞の三重トランスフェクションによって産生され、以前に記載されたように[Lock et al.、Human gene therapy.Oct 2010;21(10):1259-1271]]イオジキサノール勾配で精製された。
Genetic Disease of the School of Veterinary Medicine(獣医学部のヒト遺伝病動物モデルの国立紹介センター)(NIH OD P40-010939)で、National Institutes of Health(国立衛生研究所)及びUSDAの実験動物の飼育及び使用に関するガイドラインに従って飼育した。
注射は、以前に記載されているように行った[Hinderer,Molecular Therapy-Methods & Clinical Development.12/10/オンライン 2014;1]。くも膜下腔内空間への正確な注射は、蛍光透視法によって確認した。トレンデレンブルグ群の動物では、注射直後にベッドの頭部を10分間30度下げた。安楽死及び組織収集は、以前に記載されているように実施した[Hinderer,Molecular Therapy-Methods & Clinical Development.12/10/online 2014;1]。
VIIイヌを含んだ。注射座標を計画するために、ベースラインMRIを、全てのICV処置イヌで行った。大槽内注射は、以前に記載されているように実施した[Hinderer et al.、Molecular therapy:the journal
of the American Society of Gene Therapy.Aug 2015;23(8):1298-1307]。ICV注射のために、イヌを静脈内プロポフォールで麻酔し、気管内挿管し、イソフルランで麻酔下に維持し、定位フレームに置いた。皮膚を無菌的に準備し、注射部位に切開を施した。単一の穿頭孔を注射部位に穿孔し、そこを通して26ゲージの針を所定の深さまで前進させた。配置はCSFの戻りによって確認された。ベクター(1mL中1.8×1013GC)を1~2分間かけてゆっくりと注入した。安楽死及び組織収集は、以前に記載されているように行った[Hinderer et al.、Molecular therapy:the journal of the American Society of Gene Therapy.Aug 2015;23(8):1298-1307]。
2011;22(11):1389-1401]。
1.イヌにおける脳室内及び大槽内ベクター送達の比較
リソソーム蓄積症ムコ多糖症I型(MPS I)のイヌモデルを用いた本発明者らの以前の研究は、大槽内へのAAV9注射が脳及び脊髄全体を効果的に標的し得ることを実証した[Hinderer et al.、Molecular therapy:journal of the American Society of Gene Therapy.Aug 2015;23(8):1298-1307]。この研究では、成体MPS Iイヌの大槽または側脳室に投与したGFPレポーター遺伝子を発現するAAV9ベクターの分布を、本発明者らは、比較した。3匹のイヌを、1mLのベクター(1.8×1013ゲノムコピー)を大槽に1回注射して処置した。3匹の追加のイヌが、同じベクターを側脳室に1回だけベクター注射した。ICV注射によって処置されたイヌでは、注射のためのより大きな側脳室を選択し、標的座標を規定するためにベースラインMRIを実施した。指定された心室を正確に標的とするために、定位固定フレームを用いて注射を行った。
レンブルグ位の影響
本発明者らは、以前に、NHPの大槽または腰部槽へのAAV9注射を比較したところ、腰椎経路は脊髄を標的化するのに効果が10倍少なく、脳を標的化するためには効果が100倍少ないことが分かった[C.Hinderer、et al、Molecular Therapy-Methods & Clinical Development.12/10/オンライン 2014;1]。それ以来、他の研究者らは、腰椎穿刺によるAAV9投与を用いたより良好な形質導入を実証しており、ベクターの脳の分布の改善は、注射後にトレンデレンブルグ位に動物を置くことによって達成した[Myer et
al.、Molecular Therapy:the journal of the American Society of Gene Therapy.Oct 31 2014]。このアプローチでは、ベクターを、過剰容積の造影剤に希釈して、溶液の密度を高め、トレンデレンブルグで重力駆動分布を促進した。6匹の成体カニクイザルを、L3-4隙間にGFPを発現するAAV9(2×1013ゲノムコピー)の単回注射で処置した。そのベクターは、Iohexol 180造影剤で5mLの最終容積まで希釈した。4匹の動物を、注射直後に処置台の頭部を-30°の角度で10分間配置した。10分後、透視画像を捕捉してCSFの造影剤分布を確認した。注目すべきことに、この大きな注射容積(動物の総CSF容積の約40%)[Reiselbach et al.、New England Journal of Medicine.1962;267(25):1273-1278]の造影剤は、トレンデレンブルグ位に配置されていない動物においてさえも、脊髄くも膜下腔全体に沿って、及び基底槽に迅速に分布した(図16A及び16B)。PCR(図17)及びGFP発現(図18A~18H)によるベクターゲノム分布の分析は、脳及び脊髄全体の形質導入を実証した。注射後の位置が形質導入細胞の数または分布に及ぼす明らかな影響はなかった。以前に報告されたように、くも膜下腔内AAV投与後の末梢へのベクターの逃避及び肝臓の形質導入があった[Hinderer et al.、Molecular Therapy-Methods&Clinical Development.12/10/オンライン 2014;1;Haurigot et al.、Journal of Clinical Investigation.Aug 2013;123(8):3254-3271]。肝臓の形質導入の程度は、AAV9に対する既存の中和抗体(nAb)の存在に依存していた。6匹の動物のうち4匹は、検出可能なベースラインAAV9 nAb(力価<1:5)を有しておらず、2匹の動物(4051及び07-11)は、AAV9に対する検出可能な既存抗体を1:40の力価で有していた。以前の結果と一致して、既存の抗体は、肝臓の形質導入をブロックし、脾臓へのベクター分布の増大をもたらした[Wang et al,Human gene therapy.Nov 2011;22(11):1389-1401,が、CNS形質導入への影響はなかった;Haurigot et al,Journal of Clinical Investigation.Aug 2013;123(8):3254-3271]。
後頭下穿刺は、臨床診療において寛容的な手順ではないので、本発明者らは、側脳室及び腰部槽を含む、より一般的なCSFアクセス部位を評価した。ここでは、腰椎領域からのベクター分布を頭側で改善するために、より高密度によるベクター溶解及び注射後のトレンデレンブルグ位を使用する方法を評価した。
る。AAVは、導入遺伝子産物に対する免疫を惹起することなく外来導入遺伝子を発現し得ると考えられる。なぜなら、AAVは、先天性免疫系を活性化することなく、それによって、ナイーブリンパ球が新しく発現した抗原に遭遇した場合に、免疫よりむしろ炎症性シグナルを回避し、寛容を促進するからである。外来の導入遺伝子産物が発現されるのと同じ位置で起こる脳実質を貫通する外傷によって引き起こされる局所的な炎症は、導入遺伝子産物に対する免疫応答を誘導するために必要な危険信号を提供し得る。これは、直接脳注射によって送達されるが、IC注射によっては送達されないAAVベクターから発現される酵素に対する細胞媒介性免疫応答を発達させる、MPS Iイヌにおける以前の研究によって裏付けられている[Ciron et al.、Annals of Neurology.Aug 2006;60(2):204-213;Hinderer et al.、Molecular therapy:the journal of the American Society of Gene Therapy.Aug 2015;23(8):1298-1307]。そのような免疫応答の可能性は、注射によって引き起こされる炎症応答が、自己タンパク質に対する寛容を壊さない可能性がある場合でさえ、内因的にも産生されるタンパク質を発現するベクターを送達することに関して、導入遺伝子産物が、外来性と認識されるか否かに依存する。導入遺伝子産物と内因性タンパク質との類似性は、GFPに対して観察されたタイプのT細胞応答の不在の原因である可能性が高いので、MPS VIIイヌにおけるICVベクター送達の研究における結果、この概念が支持される。これは、導入遺伝子産物に類似のタンパク質の産生を可能にするミスセンス突然変異を有する劣性疾患の患者にも当てはまり得る。したがって、免疫の危険性は、患者集団及び導入遺伝子産物に応じて変化し得、場合によっては、導入遺伝子に対する破壊的T細胞応答を予防するために免疫抑制が必要であり得る。今回の知見によって、有害な免疫応答のリスクは、ICV投与経路ではなくICを用いることによって緩和される可能性が高いことが示唆される。
al,Molecular therapy:the journal of the
American Society of Gene Therapy.Oct 31
2014]。
下腔への注射は、大槽への注射部位の近接性を考慮すれば、同様のベクター分布を生じる可能性がある。C1-2アプローチは、後頭下穿刺とは異なり、CSFアクセス、特にくも膜下腔内造影剤投与のために臨床的に広く使用されるというさらなる利点を有する。
ヒト投与に関して最小有効用量(MED)よりも十分な安全マージンを得るために、アカゲザルにおけるヒトIDSをコードするベクターであるAAV2/9.CB7.CI.hIDS.RBGの2つの用量のくも膜下腔内投与の安全性を評価するためにデザインされた研究を行う。
A.材料
試験品-AAV9.CB7.hIDSは、AAV2/9.CB7.CI.hIDS.RBGとしても公知であり、AAV2/9.CB7.CI.hIDS.RBG.KanRとも呼ばれる。これらの名称は同義語であり、互換的に使用してもよい。
試験系選択の正当化:この研究は、CNS疾患の遺伝子治療ベクターのくも膜下腔内(IT)送達を含む。非ヒト霊長類(NHP)におけるCNSの様相は、本発明者らの臨床標的集団の最も代表的なモデルとして機能する。この研究によって、IT注射後のベクターの用量関連毒性に関するデータが得られる。
槽内投与について前記されたのと同様である。
CSF髄液細胞増加症は、CSF中の白血球数として示した場合、高用量処置群(第2群)では3匹中2匹で、低用量投与群(第3群)では3匹中1匹で観察された(図28)。このような髄液細胞増加症は、90日目に高用量処置動物1匹(RA2203)を除く全ての動物において解決された。
アカゲザルにおける、ヒトIDSをコードするベクターであるAAV9.CB7.hIDSの2用量のくも膜下腔内投与の安全性に対する化学誘発免疫抑制(IS)の影響を評価するためにデザインした研究を行う。この研究は、実施例2に記載のとおりであり、下に注記する改変を伴う。
試験品、対照品、その調製は実施例9に記載されている。
Macaca mulatta(アカゲザル)を実施例9に記載したように利用し、維持する。6匹の動物(6匹の雄)のコホートをこの研究に使用する。動物には最低のIDから最高のIDまでの1-6の番号を割り当てる。番号1~6のランダムなリストを、random.orgによって生成し、一旦、無作為化された動物は次のように順番に割り当てる:第1群に3匹の動物を割り当てる。第2群には3匹の動物を割り当てる。
ラパマイシンは、くも膜下腔内投与の少なくとも14日前、及び研究の90日目(それを含む)(+/-3日目)まで、0.5~4mg/kg PO、SIDの用量で投与される。開始用量は1mg/kgである。ラパマイシンの投与量は、試験期間中、可能な限り10~15μg/Lに近い目標トラフレベルを維持するように計算される。目標トラフの薬物レベルが1週間以内に達成されない場合、用量は0.25~2mg/kg用量間隔で滴定される。安定化期間の後、トラフレベルが2回の連続的な採血について低すぎる場合、調整が行われる。トラフレベルが高すぎる場合は、即座に調整を行う。
MMFは、200mg/mLの濃度で市販の経口溶液を用いて試験系に経口投与される。
各ラパマイシン丸剤は、室温または温水のいずれかの希釈剤(必要に応じて温水を使用して溶解を加速する)に入れて、錠剤の外側コーティングを溶解させる。約10mlの水を使用する。丸剤は黄色のコーティングの下は白い。外側のコーティングが溶解したら、各丸剤を乳鉢と乳棒を用いて細かい粉末になるまで粉砕し、均一な溶液を作る。錠剤(複数可)を溶解するために使用される希釈剤の全量を研究の記録に記録する。
I.要約
ハンター症候群、ムコ多糖症II型(MPS II)は、グリコサミノグリカン(GAG)デルマタン及びヘパラン硫酸のリソソーム異化作用に関与する酵素であるイズロネート-2-スルファターゼ(IDS)の欠乏によって引き起こされるX連鎖遺伝性障害である。この欠損は、分解されていないGAGの細胞内蓄積をもたらし、最終的に進行性の重度の臨床表現型に至る。遺伝子治療及び体細胞治療を含む、障害の可能性のある治療戦略を特定するために、過去2~30年で多くの試みがなされてきた。ヒトIDSを発現するAAV9ベクターであるAAV9.CB7.CI.hIDS.rBGの単一の脳室内(ICV)投与の短期間(21日間)の生体内分布、発現及び活性を、MPS IIマウスモデルにおいて評価するために研究を行った。MPS IIのマウスモデルにおいて、3ヶ月の注射後(pi)観察期間を有する単回用量として、ICV経路を通じて投与されたAAV9.CB7.CI.hIDS.rBGの最小有効用量(MED)を決定するために、さらなる研究をデザインして、実施した。この研究にはまた、いくつかの安全性エンドポイント(導入遺伝子及び脳組織病理学に対する体液性免疫応答の評価)も含んでいた。
IIマウスにおいて十分に耐容され、MPS IIのCNS及び末梢パラメータの両方の改善に関連するIDSレベル(発現及び酵素活性)の用量依存的増大をもたらした。投与された最低用量3×108GC(5.2×108GC ddPCR法)が、この試験における最小有効用量であった。
A.AAV9.CB7.CI.hIDS.rBGとして同定された試験品は、qPCRによって測定された1.18×1013GC/mL及びddPCRによって測定された2.057×1013GV/mLの力価を有する透明で無色の液体である。エンドトキシンは1.0EU/mL未満である。純度は、100%である。試験品は≦60℃で保存した。
1.試験品の調製:
試験品を、滅菌リン酸緩衝生理食塩水(PBS)で希釈し、各用量群について適切な濃度にした。希釈したベクターを湿った氷上に保ち、希釈後4時間以内に動物に注射した。
Mus musculus C57BL/6J IDSγ/-(MPS II表現型、N=56雄)及びC57BL/6J IDSγ/+(野生型表現型、N=8雄)を、Jackson Laboratories(ストック番号024744)からもともと得られたストックからTranslational Research Laboratories(TRL)Vivariumで繁殖させた。動物は0日目(投薬日)に2~3ヶ月
齢であった。
1.研究W2356
0日目に、3~5群(16匹の雄/群、W2356及びW2301の研究を合わせた)の全ての動物に、AAV9.CB7.CI.hIDS.rBGをICV投与した。21日目に、3~5群のマウス/群(8匹の雄/群、W2356研究)を安楽死させ、剖検し、脳、心臓、肺、肝臓、及び脾臓を採取して、脳IDS活性及び組織ベクター生体内分布の評価のために、ドライアイス上で急速凍結した。
0日目に、群3~5(16匹の雄/群)の全ての動物に、AAV9.CB7.CI.hIDS.rBGをICV投与した。2~3ヶ月pi:オープンフィールド活動、Y迷路活動、文脈恐怖条件付け、及び新規物体認識を含む一連の神経行動アッセイで、第1群及び2(8匹のマウス/群)の動物を評価して、これらのエンドポイントに対する疾患状態(MPS II遺伝子型)の影響があるか否かを決定した。明らかな疾患の効果が観察された場合、3-5群由来の8匹のマウス/群もそのアッセイで評価して、ベクターによる処置が応答に影響するか否かを判定した。
を安楽死させ、剖検し、脳組織病理学のために試料を収集した;脳リソソーム蓄積(免疫組織化学及び画像分析によって評価);肝臓及び心臓のヘキソサミニダーゼ活性;ならびに肝臓及び心臓のGAG含有量(組織含有量によって評価)。
ICV経路は、侵襲が最小であり、(首の皮膚及び筋肉の切開を必要とする大槽の経路と比較して)マウスで外科手術を必要としないので選択した。この研究には、マウスの活動記録を含むいくつかの神経行動終点が含まれていたため、生存手術を伴わない非侵襲的注射が好まれた。マウス及び大型動物の両方において、AAV9の脳脊髄液(ICVまたは大槽)への単回注射は、CNS全体の中のニューロンを標的とすることが本発明者ら及び他者によって以前に実証された(Dirren at al.、Hum.Gene.Therapy 25、109-120(2014);Snyder et al.、Hum.Gene Ther 22,1129-1135(2011)、Federici et al.、Gene Therapy 19、852-859(2012)、Haurigot et al.J Clin Invest 123,3254-3271(2013)、Bucher et al.Gene Therapy 21,522-528(2014)、Hinderer et al.、Mol Ther:22,2018-2027(2014)及びMol Ther-Methods&Clin Dev 1、14051(2014)]。Haurigot et al.、(2013)によって発表されたデータは、別のリソソーム蓄積症の状況におけるICV注射と大槽内注射と
の間の比較に特に取り組んでおり、2つの投与経路が導入遺伝子の発現及び生体内分布に関して等価であることを示している。
罹患率/死亡率について動物を毎日モニターした。動物は、一般的な外観、毒性の徴候、苦痛及び行動の変化について、毎日のケージ側視覚観察によってモニターした。これらのデータは、この非GLP研究では記録しなかった。
オープンフィールドにおける自発的活動は、Photobeam Activity System(PAS)-オープンフィールド(San Diego Instruments)を用いて測定した。この評価では、マウスを単回の10分間のトライアルのためにアリーナに個別に配置した。一般的な移動及び飼育活動を評価するために、水平及び垂直のビームブレイクを収集した。
Y Maze Spontaneous Alternation(Y迷路自発的交替行動)は、新しい環境を探索するための齧歯類の意欲を測定するための行動試験である。試験は、互いに120°の角度をなす3つの白色の不透明なプラスチックアームを備えたY字型迷路で行われる。迷路の中心に導入された後、動物は3つのアームを自由に探索することが許される。げっ歯類は、典型的には、以前訪れたアームに戻るのではなく、迷路の新しいアームを調べることを好む。複数のアームのエントリーの経過にわたって、対象は、最近あまり訪れられなかったアームに入る傾向を示すはずである。交替行動のパーセ
ンテージを計算するために、アームエントリーの数及びトライアドの数を記録する。エントリーは、アーム内に存在する四肢全てとして定義する。この試験を使用して、マウスのトランスジェニック系統における認知障害を定量化し、認知に対するそれらの影響について新規化学物質を評価する。海馬、中隔、基底前脳及び前頭皮質を含む脳の多くの部分がこのタスクに関与する。この研究では、標準的なY字型迷路(サンディエゴ・インスツルメンツ)を使用し、アームエントリーの順序及び数を8分間のトライアル試験の間に記録した。自発的交替行動(SA)は、前に進入したアームに直ちに戻ることなく、迷路の3つのアーム全てに連続して入るものとして定義した。全アームエントリー(AE)は運動活動の尺度として収集された。自発的交替行動率は%SA=(SA/(AE-2)×100)として計算した。
これらのタスクでは、動物は、嫌な無条件刺激(US)通常はフット・ショックとの時間的関連のために、ある音調のような新しい環境または感情的に中立な条件付け刺激(CS)を恐れることを学習する。同じコンテクストまたは同じCSに曝露された場合、条件付けされた動物はフリージング行動を示す(Abel et al.、Cell 88:615-626,1997)。訓練の日に、マウスは、300秒間、ユニークな条件付けチャンバ(Med Associates Inc)を探索することが可能であった。300秒の期間のうち248~250秒の間に、信号なしの1.5mAの連続フット・ショックが送達された。チャンバ内でさらに30秒後、マウスをそれらのホームケージに戻した。24時間後、訓練が行われた同じチャンバ内で、空間的状況の想起を5分間連続して評価した。フリージング行動をスコアリングするために使用されたソフトウェア(Freezescan、CleverSys Inc)を用いて記憶を評価した。訓練セッションの2.5分の前刺激期(フット・ショックの投与前)におけるフリージング率を、チャンバへの再曝露時のフリージング率と比較する。フリージングの増大は、フット・ショックの想起を示す(すなわち、学習が起こり、動物はチャンバをフット・ショックと関連付ける)。
新規物体認識(NOR)タスクを使用して、CNS障害のげっ歯類モデルにおける認知、特に認知記憶を評価する。この試験は、齧歯動物が慣れた物体よりも新規物体を探索するために多くの時間を費やすという自発的な傾向に基づいている。新しい対象を探究する選択は、学習と認識の記憶の使用を反映している。新規物体認識タスクは、一般に高さ及び容積は一貫しているが、形状及び外観が異なる2つの異なる種類の物体を有するオープンフィールドアリーナにおいて行われる。習慣化の間、動物は、空のアリーナを探索することが許される。慣れてから24時間後、動物は、同じ距離に置かれた2つの同一の物体のある、慣れたアリーナに曝される。翌日、マウスは、長期認識記憶を試験するために、慣れた物体及び新規物体の存在下でオープンフィールドを探索することを可能された。各物体を探索するのに費やされた時間及び識別指数パーセンテージを記録する。この研究では、実験装置は、白い床の灰色の長方形のアリーナ(60cm×50cm×26cm)で構成され、2つの独特の物体は、3.8×3.8×15cmの金属バーと3.2cmの直径×15cm長のPVCパイプであった。5日間の馴化段階の間に、マウスを1日あたり1~2分間取り扱い、空のアリーナを5分間/日で探索することを可能にした。訓練段階の間に、2つの同一の物体をアリーナに入れ、マウスが15分間、その物体を探索することを許可した。想起段階では、マウスを、1つの慣れた物体と1つの新規物体を有するアリーナに戻した。正常マウスは、新規物体を優先的に探索する。全てのセッションが記録され、物体を探索するのに費やされた時間は、オープンソースの画像解析プログラム[Patel et al FrontBehav Neurosci 8:349(2014)]によってスコア付けした。
1.血清及びCSFにおけるIDS活性
血清及びCSF IDS活性のための血液を、注射後約3ヶ月の剖検で収集した。血清を血液から分離し、血清及びCSFをドライアイスで凍結し、分析するまで-80℃で保存した。IDS活性は、10μLの試料を、0.01M酢酸鉛を含む、0.1M酢酸ナトリウムに溶解した1.25mMの4-メチルウンベリフェリル(MU)a-L-イドピラノシイズロン酸2-硫酸塩(Santa Cruz Biotechnology)20μL(pH5.0)と共にインキュベートすることによって測定した。37℃で2時間インキュベートした後、45μLのMcIlvain緩衝液(0.4Mリン酸ナトリウム、0.2Mクエン酸ナトリウム、pH4.5)及び5μLの組換えヒトイズロニダーゼ(Aldurazyme、0.58mg/mL、Genzyme)を反応混合物に添加し、37℃で一晩インキュベートした。混合物をグリシン緩衝液(pH 10.9)中で希釈し、放出された4-MUを、遊離4-MUの標準希釈と比較して蛍光(励起365nm、発光450nm)によって定量した。
心臓穿刺により、研究W2356(21日目)及び研究W2301(約3ヶ月)の終末検体終点で、血清抗hIDS抗体の測定のための血液を採取した。血清を分離し、ドライアイスで凍結し、分析するまで-80℃で保存した。ポリスチレンプレートを、PBSで5μg/mLの組換えヒトIDS(R&D Systems)で一晩コーティングし、pH5.8に滴定した。プレートを洗浄し、中性PBS中の2%ウシ血清アルブミン(BSA)中で1時間ブロックした。次いで、プレートを、PBSで1:1000に希釈した血清試料とともにインキュベートした。結合した抗体を、2%BSAを含むPBS中で1:10,000に希釈した西洋ワサビペルオキシダーゼ(HRP)結合ヤギ抗マウス抗体(Abcam)で検出した。アッセイは、テトラメチルベンジジン基質を用いて発色させ、2N硫酸で停止した後、450nmの吸光度を測定した。力価は、1:10,000の力価で適宜割り当てられた陽性血清試料の連続希釈により生成された標準曲線から決定した。
フォワードプライマー:5V-TTCCCTCTGCCAAAAATTATGG-3V,配列番号16;
リバースプライマー:5V-CCTTTATTAGCCAGAAGTCAGATGCT-3V,配列番号17;
プローブ:6FAM-ACATCATGAAGCCCC-MGBNFQ,配列番号18。
ラフィン包埋吻側脳切片で行った。脳のH&E切片を、有資格の獣医病理学者によって毒性の証拠について評価し、MPS II表現型に関連する所見の範囲を特徴付けた。その後、病理学者は、処置の知識なしにスライドを再検査し、グリア細胞質空胞形成、ニューロンの細胞質腫脹及び両親媒性物質の蓄積を含むMPS II表現型の組織学的発現をスコア付けした。LIMP2及びGM3について陽性に染色された細胞の数を、訓練されたGTP形態学コア要員によるW2356研究の各動物由来の2~4の脳切片において定量した。
オープンフィールドについては、データをExcelに入力し、Graphpad Prismを用いて分析した。Y迷路については、データをExcelに入力し、Graphpad Prismを用いて分析した。CFCの場合、Freezescan、CleverSys Incを使用した。NORの場合、MATLAB実装及びユーザガイド:www.seas.upenn.edu/~molneuro/autotyping.htmlを利用した。
処置されたマウス及び未処置のマウスにおける組織GAG含有量、Hex活性及び脳蓄積病変を、一方向ANOVA、続いてダネットの多重比較試験を用いて比較した。オープンフィールド及びY迷路データを、スチューデントのt検定で分析した。二元配置ANOVA及びダネットのポストホック分析を、恐怖条件付けデータに適用して、トライアル及び遺伝子型の影響を評価した。新規物体の認識試験では、新規物体対慣れた物体を探索する時間を、各グループのt検定を使用して、次に多重比較のためのボンフェローニ補正を
使用して比較した。
死亡は観察されなかった。ベクターによる処置に関連して考慮された臨床的観察はなかった。
期待されるように、新規物体を優先することを示したが、IDSγ/-は、慣れた物体の記憶の欠如(長期間の記憶障害)を示す傾向は示さなかった。くも膜下腔内AAV9遺伝子治療は、IDSγ/-(MPS II)マウスで観察されたNOR欠損の改善をもたらしたが、明確な用量反応はなかった。新規物体に関する優先は、投薬群間の行動障害の相対的救済度を比較するのに研究が十分なほど有効ではなかったが、中用量コホートにおいてのみ統計的に有意であった(図6C)。
最大3×1010GC(5.2×1010GC ddPCR)までのC57BL/6IDSγ/-(MPS II)マウスへのAAV9.CB7.CI.hIDS.rBGのICV投与は、臨床的徴候も死亡もなしで良好な耐容性であり、CNSならびに末梢組織、特に肝臓への分布を生じ、CSFから末梢血へ注射されたウイルス粒子の部分的再分布を示している。
毒性の証拠はなかった。導入遺伝子に対する体液性免疫応答は軽微であり、これらの動物の健康または脳組織病理学に影響を及ぼさずに一部の中及び高用量動物においてのみ観察された。
IIマウスにおいて良好な耐容性を示し、MPS IIのCNS及び末梢パラメータの両方の改善に関連するIDSレベルの用量依存的増大をもたらした。
投与された最低用量3×108GC(5.2×108GC ddPCR)が、この試験における最小有効用量であった。
Claims (17)
- 製剤緩衝液中の複製欠損組換えアデノ随伴ウイルス(rAAV)の懸濁液を含む、ムコ多糖症II(MPS II)又はハンター症候群と診断されたヒト対象を処置するための薬学的組成物であって、
(a)前記rAAVは、AAV9キャプシド及びベクターゲノムを含み、前記ベクターゲノムは、AAV5’逆方向末端反復(ITR)、発現カセット及びAAV3’ITRを含み、前記発現カセットは、それの発現を指示する発現制御配列に作動可能に連結されたヒトイズロネート-2-スルファターゼ(hIDS)をコードする異種核酸を含み、前記発現制御配列は、CB7プロモーター、ニワトリベータアクチンイントロン及びウサギベータグロビンポリアデニル化(ポリA)シグナル配列を含み、前記hIDSをコードする配列は、配列番号1の核酸を有し、そして前記ベクターゲノムはAAV9キャプシドにパッケージされており;
(b)前記製剤緩衝液は、生理学的に適合する水性緩衝液、及びサーファクタント及び賦形剤を含むくも膜下腔内製剤緩衝液であり;かつ
(c)(i)前記組成物が、少なくとも1.0×1013GC/ml(+/-20%)のrAAVのゲノムコピー(GC)力価を含むか;または
(ii)前記rAAVが、少なくとも4.0×108GC/g脳質量~4.0×1011GC/g脳質量の用量でヒト対象に投与される、前記薬学的組成物。 - くも膜下腔内に投与される、請求項1に記載の薬学的組成物。
- 前記懸濁液が、水性懸濁基剤を含む6~9の範囲のpHを有する水性液体懸濁液であり、前記rAAVが、配列番号3のヌクレオチド2~ヌクレオチド3967を含むベクターゲノムを含む、請求項1又は2に記載の薬学的組成物。
- ムコ多糖症II(MPS II)と診断されたヒト対象の処置に用いるための、製剤緩衝液中における4.0×108GC/g脳質量~4.0×1011GC/g脳質量の間の用量の複製欠損組換えアデノ随伴ウイルス(rAAV)の懸濁液であって、前記懸濁液が、それを必要とするヒト対象にくも膜下腔内注射によって投与され:
(a)前記rAAVは、AAV9キャプシド及びベクターゲノムを含み、前記ベクターゲノムは、AAV5’逆方向末端反復(ITR)、発現カセット及びAAV3’ITRを含み、前記発現カセットは、それの発現を指示する発現制御配列に作動可能に連結されたヒトイズロネート-2-スルファターゼ(hIDS)をコードする異種核酸を含み、前記発現制御配列は、CB7プロモーター、ニワトリベータアクチンイントロン及びウサギベータグロビンポリアデニル化(ポリA)シグナル配列を含み、前記hIDSをコードする配列は、配列番号1又は配列番号1の核酸を有し、そして前記ベクターゲノムはAAV9キャプシドにパッケージされており;
(b)前記製剤緩衝液が、生理学的に適合性の水性緩衝液、サーファクタント及び賦形剤を含むくも膜下腔内製剤緩衝液であり;
(c)(i)前記懸濁液が、少なくとも1.0×1013GC/ml(+/-20%)のrAAVのゲノムコピー(GC)力価を含むか;または
(ii)前記rAAVが、少なくとも4.0×108GC/g脳質量~4.0×1011GC/g脳質量の用量でヒト対象に投与される、前記懸濁液。 - 前記ヒト対象が2歳以上であり、重篤なハンター症候群と診断されているか、または、
前記ヒト対象が神経認知障害を有するか、若しくは神経認知障害を発症するリスクがある、
請求項4に記載の懸濁液。 - 前記投与が、Bayley Scales of Infant Developmentを用いて評価したとき、前記対象における神経認知発達指数(DQ)の増大をもたらすか、または、
前記投与が、ハンター症候群の患者における未処置/自然の履歴管理データと比較して、前記対象においてDQの低下が15ポイント以下になるか、または、
前記投与が、前記患者からの血清試料中で測定した場合、機能的hIDSレベルの増大をもたらす、請求項4または5に記載の懸濁液。 - 前記投与が、患者の血清、尿及び/または脳脊髄液(CSF)の試料中で測定したとき、GAGレベルの低下をもたらす、請求項4~6のいずれか1項に記載の懸濁液。
- 肝指向性注射によって前記患者にAAV.hIDSを投与することをさらに包含し、任意に、前記肝指向性AAV.hIDSが、AAV8、AAVrh64R1、AAVrh64R2、rh8、rh10、AAV3BまたはAAVdjから選択されるキャプシドを有する、請求項4~7のいずれか1項に記載の懸濁液。
- 力価がインビトロアッセイによって測定され、任意に、前記インビトロアッセイが、1細胞あたり既知の多重度の前記rAAVGC力価を用いてHEK293細胞を形質導入すること、及び4MU-イズロニド-2-硫酸酵素アッセイを用いて形質導入の72時間後のhIDS活性について上清をアッセイすることを包含する、請求項1に記載の薬学的組成物。
- 前記AAV ITRがAAV9に対して異種であるか、または前記ITRがAAV2由来である、請求項1、2または9のいずれか1項に記載の薬学的組成物。
- 懸濁液が6~9のpHを有し、任意に懸濁液が6.8~7.8のpHを有する、請求項1、2、9~10のいずれか1項に記載の薬学的組成物。
- 前記懸濁液が、くも膜下腔内注射による送達のために製剤化される、請求項1、2、9~11のいずれか1項に記載の薬学的組成物。
- 前記懸濁液が、新生児患者への送達のために製剤化され、3.8×1012ゲノムコピー(GC)~1.9×1014GCを含むか、または、
前記懸濁液が、3ヶ月~9ヶ月齢の患者への送達のために製剤化され、6×1012GC~3×1014GCを含むか、または、
前記懸濁液が、9ヶ月~36ヶ月齢の患者への送達のために製剤化され、1×1013GC~5×1014GCを含むか、または、
前記懸濁液が、3歳~12歳であり、かつ1.2×1013GC~6×1014GCを含む患者への送達のために製剤化されるか、または、
前記懸濁液が、12歳以上の患者に送達するために製剤化され、1.4×1013GC~7×1014GCを含む、
請求項1、2、9~12のいずれか1項に記載の薬学的組成物。 - MPS IIまたはハンター症候群を有するヒト患者を処置する方法に使用するための、hIDS遺伝子を含む組換えアデノ随伴ウイルス(rAAV.hIDS)であって、
ここで、前記hIDS遺伝子は、それの発現を指示する発現制御配列に作動可能に連結され、前記発現制御配列は、CB7プロモーター、ニワトリベータアクチンイントロン及びウサギベータグロビンポリアデニル化(ポリA)シグナル配列を含み、前記hIDS遺伝子は、配列番号1又は機能的hIDSをコードする配列番号1と少なくとも80%同一である配列の核酸を含み、
前記方法は、
(a)導入遺伝子特異的寛容を誘導するのに十分な量のhIDS酵素を、MPS II若しくはハンター症候群を有する患者に投与すること;及び
(b)前記患者にrAAV.hIDSを投与し、rAAV.hIDSは前記患者において治療レベルのhIDSの発現を指示することを含む、
前記rAAV.hIDS。 - 前記(a)のhIDSが組換えタンパク質として投与され、任意に前記患者が乳児である、請求項14に記載のrAAV.hIDS。
- 前記(b)の投与が(a)の投薬後3日~14日で実施される、請求項14に記載のrAAV.hIDS。
- 請求項4~8のいずれか1項に記載の懸濁液を含むくも膜下腔内投与のためのキットであり、任意に前記懸濁液を希釈するのに有用な希釈緩衝液をさらに含む、キット。
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