HU228478B1 - Erythropoietin conjugates with polyethylenglycol - Google Patents

Erythropoietin conjugates with polyethylenglycol Download PDF

Info

Publication number
HU228478B1
HU228478B1 HU0201971A HUP0201971A HU228478B1 HU 228478 B1 HU228478 B1 HU 228478B1 HU 0201971 A HU0201971 A HU 0201971A HU P0201971 A HUP0201971 A HU P0201971A HU 228478 B1 HU228478 B1 HU 228478B1
Authority
HU
Hungary
Prior art keywords
conjugate
sequence
glycoprotein
erythropoietin
epo
Prior art date
Application number
HU0201971A
Other languages
English (en)
Inventor
Josef Burg
Bernd Hilger
Hans-Peter Josel
Original Assignee
Hoffmann La Roche
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Hoffmann La Roche filed Critical Hoffmann La Roche
Publication of HUP0201971A2 publication Critical patent/HUP0201971A2/hu
Publication of HUP0201971A3 publication Critical patent/HUP0201971A3/hu
Publication of HU228478B1 publication Critical patent/HU228478B1/hu

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/475—Growth factors; Growth regulators
    • C07K14/505—Erythropoietin [EPO]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/56—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule
    • A61K47/59—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes
    • A61K47/60—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes the organic macromolecular compound being a polyoxyalkylene oligomer, polymer or dendrimer, e.g. PEG, PPG, PEO or polyglycerol
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P13/00—Drugs for disorders of the urinary system
    • A61P13/12—Drugs for disorders of the urinary system of the kidneys
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • A61P31/18—Antivirals for RNA viruses for HIV
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A61P7/06—Antianaemics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • AIDS & HIV (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)

Description

Pelfottíén-glíkolkti képezett eritropsietin konjugáiumok
Á itóálmány -tárgyát az EPO PEG-ssstetez&at'Hak új- csoportja képezi. A találmány szerinti fiziológiailag aktív FEG-EPÖ konjagáíamok olyan eritropoieíin gSkoproteint tartólmazscsk, melynek legalább egy szabad aarínocsoportja van és amely rendelkezik a csontvelő sejtek retikalöcita és vörösvértest termelésének növelését kiváltó is vb-'í? biológiai aktivitással és amely -a következői; bármelyike: humán eritropoieíin és olyan analógjai, melyek printer szerkezete megegyezik az 1 -6 gükozilációs hely hozzáadásával vagy legalább egy glikozííáclós hely átrendezésével módositoti humán eriiropoieiia szerkezeiével; a glikoproteis kovalensen hozzá van kötve 1 3 kis szénatontszáínú alkoxi poiiéetiléa-glikoi) csoporthoz, ahol mindegyik poh(elílén--glíktil) csoport a glíköproteiohez kovalensen kötődik egy speciális szerkezetű iinkeren keresztül, Az egyes poh(etilén-glíkol) részegységek átlagos molekulatömege mintegy .20 kilodahooíői mintegy 40 kilodaltomg változik, és a könjugátum mofekulatőmege mintegy 51 kiiodaitontói mintegy 175 kilodaltösig változik.
A találmány tárgyát képezi a találmány szerinti kosjugáíumok alkalmazása, valamint az azokat tartalmazó gyógyászati készítmények is.
Az eriiropoiezis a vörösvértesiek termelésének folyamata, amely a sejtek szétesésének ellensúlyozására szolgák Az eritropoiezis egy szabályozott fiziológiai mechanizmus, amely lehetővé testó kellő számú vörösvértest rendelkezésre Állását a szövetek megfelelő mennyisége oxigénnel való ellátására. A természetes körülmények között előforduló humán eritropoieíin (hEEO) egy 165 aminosavut tartalmazó giikoprtstein, amely a vesében termelődik és ez: az a hamorális plazma faktor., amely serkenti a vörös vértesiek termelődését [Carnot és DeRmtfee: C.R. Acad. Sei, 145 452 < 1906); Erslev: Blotsd 1547 (1955); Reissmamn; Blood 5 372 (1950); Jacobson és mtsai,: Natúré 177 6331 (1957)). A humán EPO stimulálja az elkötelezeti eriboid progeuitor sejtek osztódását és differenciálódását a csontvelőben.. A humán EPO biológiai aktivitását az eritroíd prekarzorokon található receptorokhoz kötődve fejti ki (Krgntz; Blood 77 419 < 1991)1. A természetes körülmények között előforduló humán eritropoíehn egy savas glíkoprotein, amely alacsony koncentrációkban található a plazmában az öregedésük során elvesztett vörösvéríesiek pótlásának serkentésére.
Áz eritropoiethrt már előállították bioszintetikus módszerekkel rekombináns DNS technológiát alkalmazva [Egrié és mtsai,: írnnmnobfoi. 72 213 (1986)] és ez a kínai hörcsög petefészek szövet sejtjeibe (CHO sejtek) beillesztett és ott expresszál! klónozott humán EPO gén tennéke, A természetes körülmények között előforduló hamás EPO először egy 166 aminosavat tartalmazó poíipeptid láncba transziáíödik, amely argmmt tartalmaz a 166. pozícióban. Egy pastó-transzlácíős módosítás során a 166. argmmt karboxipeptldáz hasítja fe. A hexeán EPO (165 amínosav) primer szerkezetét az 1. ábrában mulatjuk be, A humán EPO (166 sminos&v) primer szerkezetét a 2. ábrában mutálják be. Két díszulftd kid található a 'Cys-:f>iCys és a i9Cys-',JCysaminosavak között, A humán EPO poíipeptid lánc molekulatömege a cukor részegységek nélkül IS.236 Da. A teljes EPO molekulában a molekulatömeg mintegy 46 százalékát teszik ki a szénhidrát csoportok [Sasáki és mtsai, : k Bioi Chem, 262 12059(198?)].
Mivel az eritrepofeün létfantosságó a vörösvértsstek kialakulása során, a hormon jói alkalmazható olyan vér rendellenességek kezelésére, amelyekre a vőrösvértestek alacsony színtű vagy hibás termelődése jellemző,
Klmiksil&g az EPO-í példáid anémia kezelésére alkalmazzák krónikus vese elégtelenségben (CRF) szenvedő pácienseken [Esehhach és mtsai.: NEJM 316 73 (1987); Eschbaeh és mtsai,: Ann, Intern. Med, 1.11. 992 (1989);
♦ X *»** ««««
Egrié és mtsai; Kidaey íaö. 33 262 (1988); Lhn és mtsai: Amt. Intem. Med. 110 108 (1989)1, valamint AIDS esetén és kemoterápiás áteső rákbetegek kezelésében JDstms és mtsai.. In; Eíyiropösetín ia Cliaícal Applications - An International Pempeetíve, szerk; Gamiek, 301-324. old., Marsét Dekker. New York, (1990)]. Azonban a jelenleg hozzáférhető terápiás fehérje készítmények - mint például az EEG - biológiai rendelkezésre állása korlátozott ezek rövid plazma fél-életideje miatt és a proteázok lebontó hatása következtében. Ezek a hiányosságok megakadályozzák, hogy az ilyen készítmények elérjék maximális klinikai potenciájukat.
Ennek megfelelően a találmány tárgyát EPÖ FEG-származókaíuak ói csoportja képezi. A találmány szerinti fiziológiailag aktív PEG-EPO konjogátamok: olyan eritropcietia glikoproteiní tartalmaznak, amelynek legalább egy szabad araiuoesoportja van és amely rendelkezik a csontvelő sejtek rehkuiocita és vőrősvértest termelésének növelését kiváltó in viw biológiai aktivitással és amely a kővetkezők bármelyike lehet: humán erifcrapoietb és analógiái, amelyek primer szerkezete megegyezik a humán eritropoictin szerkezetével, l-ő gilkozilációs hely hozzáadásával módosítva; ez, a glikoprotein kovalensen kötődik egy-bárom kis szénatomszámá aikoxi poli{etilén-giiköl) csoporthoz, ahol mindegyik poii(etilén.-giikoi) csoport a glíkoproteiahez kovalensen kötődik egy bakeren kérésziül, amely linker képiem a kővetkező; -C{Ö)-X-S -Y~; ahol a linker C(Ö) csoportja amid kötést alakit ki a fentebb említett amise csoportok egyikével, és ahol az X -{CHjg vagy -CHjCO-CHj’CHíh·' részletet jelöl, amelyben ak értéke 1-iÖ-íg terjedhet, sz Y pedig az 1-lV. képlettel jellemzett moieknlsfészleiek bármelyike lehet.
Π
Az egyes polifeiilén-glikol} részegységek átlagos molekulatömege mintegy 20 kilodaltontói mintegy 40 kílodaitotng változik, és a konjngátum molekulatömege tsimegy 51 kílodaltontől mintegy 175 kdodaitomg változik. A találmány tárgyát képezik még továbbá olyas készítmények, amelyek a találmány szerinti koníngátnmokat tartalmazzák és amelyekben ezeknek a koejtígálumoknak a százalékos mennyisége olyan készítménybe» ahol n az, 1. legalább kilencven szAzaíék,
A módosítatlan EPO-val (azaz olyan EEO-val, amelyhez nincs EEG hozzákapcsolva), és a imgyotnányos * * *·Μ ♦» «*««
-3PEG-EPO ktmjugáhnuokfcal összehasonlítva a. találrnány szerinti fcotjjügátomok rsregítövekedeti 'keringés!, feléletidővel és a plazmában fennmaradási idővel rendelkeznek, csökkeni a kiürülésük és megnövekedett in vfo<? klinikai aktivitást mutatnák. A találmány szerinti konjugásarttak alkalmazási területe megegyezik az EPO alkalmazási terSletével. Közelebbről meghatározva, a találmány szerinti konjagátamok jól alkalmazhatóak páciensek kezelésére a csontvelőben az elkötelezett erítroid progeniíor sejtek osztódásának és dlfűtrenciálódásának: stinsu— látásán keresztül ugyanúgy, mint ahogy az EEO-t alkalmazzék pácfemek kezelésére.
A találmány tárgyát képezi egy eljárás is a vérszegénység kezelésére emberekben. A találmány tárgyál képezi eljárás olyan mtropolerin glikoproteín tecmétó. előállítására, amely során kovalensen reagáltatok, erihopcfeík! fehérje lizin anrinosavának az s-ammocsoportját egy kéífenkciós reagenssel, így egy amid kötést tartalmazó köztes terméket kialakítva. kétftmkeiös reagens egy reagáló csoportot és egy védett tiol csoportot tartalmaz. Az amid-kapcsolt köztes terméket ezután kovalens módon reagáltalak aktivált polietilén-gkkol származékkal, ezzel kialakítva a találmány szerinti entrópiáéira gliköproíein terméket.
Az 1. ábra a humán EPO prijner szerkezetéi, mutatja be (165 aminosav).
A. 2. ábra a humán EPO primer szerkezetét matatja be (166 aminosav).
A 3. ábra a FEG-gel kapcsolt EPO in vívó aktivitást matatja be, amelyet sormocitémiás egér vizsgálati eljárás segítségével határoztunk meg.
Meghatározások;
Az alább kővetkező kifejezések alatt a leírás során az: üt leírtakat értjük;
Az eritropoleíin fehérje, eritropoieím”, ”EPO vagy eritropoietin glikoproteitf kifejezések alatt olyan glikoprofoiut értünk, amely az: 1, ábrán (I. azonosítási számszerűit! szekvenciái vagy a 2. ábrán (2. azonosítást szám szerinti szekvencia) bemutatott: szekvenciával rendelkezik, vagy olyan fehérjét illetve polipepíkfet énünk, amely ezekkel lényegében homológ és amelynek biológiai tulajdonságai a vörösvértest termelés stmmláiásávaí és a csontvelőben az elkötelezett eritrosd progenitor sejtek osztódásának és differenciálódásának stimulálásával összefüggésben vannak. A leírás szerint aa EFO-lehórie kifejezés magába foglal olyan fehérjéket, amelyeket szándékosan módosítottunk - például hely specifikus mutageseslssel - vagy véletlenül módosultak, például mutációk következtében. Esek a kifejezések szintén magtikba foglalják az 1-6 további glikozilációs hellyel rendelkező analógokat, a fehérje karboxi végén legalább egy további amínosavat tartalmazó artalégokat, ahol a további ominesavfetobnosavak) legalább egy glikozilácios helyet íartahnaznak, illetve magukban foglalnak olyan analógokat, amelyek aminosav «szekvenciájában tartalmazzák legalább egy ghkozüációs hely átrendeződését, mint például a 649619 lajstromszámú európai szabadalmi bejelentésben közzétett analógokat. Ezek & kifejezések magukban foglalják mind a természetes úton, mhtd a reikombinans módon előállított humán erihopoferint.
A. lényegében homológ kifejezés alatt azt értjük, hogy az adott tárgyak szekvencia ··· tniat például egy mutáns szekvencia - egy referencia szekvenciától egy’ vagy több szubszíttóciőban, delécióban vagy aádfcsóhs®. tér el, amelyek összhatása nem eredményezi .a referencia és a tárgyalt szekvencia hátrányos fonkcionális különbözőségét. A találmány szerint a nagyobb, mint 95% feomológiáf matató, egyenértékű biológiai tulajdonságokkal rendelkező és egyenértékű expressziós jellemekkel rendelkező szekvenciákat tekinthetjük lényegében hőssélógnak, A homológja meghatározása szempontjából az érett szekvencia. lerövidítését figyelmen kívül hagyjuk, A kisebb mértékű homotógiát mulató, összevethető bfoákíivltása és egyenértékű expressziős jellemzőkkel rendelkező szekvenciákat lényegében egyenértékűnek tekinthetjük.
.* * φ*φ ♦ * «φ ♦ φ « * ΦΦΦ χ * φ φ
ΦΧ« φ
-4* φ φφ
X Φφ « * φ
Az EPO-fehétie fmgötens·1 kiftgeaés- alatt olyan fehérjét vagy polipepodst értüsk, amely EPG-fitóje részének vagy fragmensóttek aminosav szekvenciájával rendelkezik és rendelkezik -az EPO biológiai: aktivitásával, A fragxnans kifejezés magába foglal fehérjék® vagy polipepüdeket, amelyeket az EPÖ-fehérje proteolitikus lebontásával állítottunk elő, vagy amelyeket a technika állása szerint jól ismert eljárások segítségévei kémiai szintézissel állítottunk elő. EPÖ-föhétje vagy annak tiagmense biológiailag aktív, ha a fehérje v&gy fragmess emberbe való beadása a vörősvértestek termelésének stirsniálását ás a csontvelőben az elkötelezett eritroid progenitor sejtek, osztódásának és differenciálódásának stimulálásáí eredményezi. Az EPO-fehérje ilyen biológiai aktivitásának meghatározása elvégezhető hagyományos, a technika állása szerint jól ismert vizsgálatok segítségévei, amelyeket emlősök egy vagy több fajában alkalmaztak ilyen célokra. Egy megfelelő tesztet, amely alkalmazható az ilyen biológiai aktivitás khnntaíására, ismertetünk az alábbiakban.
A terápiásán hatékony mennyiség kifejezés alatt olyíts mennyiségé entropoletin glikoprotein terméket értőnk, amely szükséges a csontvelő sejtek retikuloeha és vörosvértest termelésének megnövelését kiváltó ί» vívó biológiai aktivitáshoz. Az erítropoietin glikoprotein tennék pontos mennyisége a szakember ismeretei szerint kiválasztható, de u következő tényezőktől függ:; a kezelendő pontos körülményektől, a kezelendő páciens állapijától és ugyanőgy a készítmény más összetevőltól is. Az erltropoietm glikoprotein termékeket tartalmazó· gyógyászati készítmények különböző módokon történő beadáshoz megfelelő hatékony erősségben íormuiázhatók vérrel kapcsolatos rendellenességekben szenvedő emberi páciensnek, ahol & problémákat az. alacsony vagy hibás vőrösvértsst termelés jellemzi. Az erhropoietin glíkoprotem termék átlagos terápiásán hatékony mennyiségei változóak lehetnek, és közelebbről meghatározva a szakképzett orvos javaslatai és felírása alapján határozhatóak meg.
A találmány tárgyát erítiopöletis glikoprotein termékek képezik, amelyek rendelkeznek a csontvelő sejtek retiknlocha és vSrösvérlest termelésének megnöveléséi: kiváltó in vivő biológiai aktivitással, ezeket az· alábbi V, képlettel foglalhatjuk össze;
P-íjNB-CO-X-S-Y-iOCHjCHritó-ftRln V. képlet ahol X és Y a fentebb meghatározott mofekularészekeí jelenti. m. értéke 450-900 között lehet, n értéke 1-3 között lehel, R kis szénatomszámá alkii csoportot jelöl és P erhropoíetin glikoproteint jelöl az antinoc.soport vagy aminoesoporiok nélkül amelyek X-szel amidkötésí alkotnak. Amit ezt alább részletesen ismertetjük, az EPO előállítása és tisztítása a technika állása szerint jói ismert. ΈΡΟ rövidítés alatt természetes eredetű vagy rekombináns fehérjét ériünk, előnyösen humán fehérjét, amelyet bármely hagyományos forrásból szereztünk be, mini például szőttetek, fehérje szintézis, természetes eredetit vagy' rekombináns sejt tenyészet. A találmány tárgyút képezi bármely olyan fehérje amely az EPO aktivitásával rendelkezik, mint például mufeinek v&gy másképp módosított fehérjék. Rekombináns EEÖ előállítható -CHO, BHK vagy EsLa sejtvonalak, alkalmazásával töriénö expresszióval, rekonthináns DNS technológiával vagy endogén gén aktiválással, azaz például az erítiopotetín glikoproteint endogén gés aktiválással expresszálhatluk. Az eritropotetin glikoprotein termékek előáltitósára előnyösen alkalmazható -EPO típusok a humán EPO típusok. Még előnyösebben az EPO típusok azok a humán EPO-k, amelyek az 1. ábrán ί 1. azonosítási szám szerinti szekvencia)-vagy -a 2, ábrán (2. azonosítási szám szerinti szekvencia) bemutatott aminosav szekvenciával rendelkeztek, iegelőnyósehbek azok a humán EPO-k, ame- 5 lyek az 1. ábrán (L azonosítási szára saeráú szekvencia) bemutatott aminosav szekvenciával reriáelkezuek.
A humán eritropoietm fehérje ugyanakkor módosítható ágy is, hogy legalább egy további glikozílációs helyet tartalmazzon, például: 1-6 további giikoziláeíós helyet, mint például az alábbi, nea; korlátc-zo értelemben bemutatott aminosav szekvenciák. Az alábbi megjegyzés azt jelzi, hogy az 1. ábrában ismertetett szekvenciát módosítottuk úgy, hogy a felső indexben ategadoít számozott pozícióban található természetes eredetű aiamosavst helyettesítettük a felső indexben -megadott számtól balra álló andnosavval, .Asn'^Tbr'2 1, ábra;
Aí8-:Thr : 1. ábra;
Asn' 'Thr 9 1, ábra;
Asn^ 1, ábra;
Asn®Thr7i Lábra;
Ser^Ása^Tbr7í L ábra;
VaFAst^Tlto5 L ábra;
Ser^Ásn^Tbr5 L ábra;
SerHksn^Gb^Thr*'' L ábra;
Ser -'kAsn^Tttr^Thr·- t. ábra;
Se? WWW0* L ábra;
1. ábra;
Asa^í^VsFAsn^W58 L ábra;
Asn^ie^Th? L ábra;
SAAbW L ábra;
Asn^rte^ L ábra;
W}SThrw I. ábra;
Ih?25 Lábra; és
Pie^Th?^ 1. ábra;
A humán eritroposeths fehérje lehet még olyan analóg ís, amely legalább egy további aminesavvaí rendelkezik a ghkoproíein karhoz! termmálisán, ahol a további amiaosav legalább egy' giikoziláeíós helyet tartalmaz; azaz a glíkoproíein szekvenciája tartalmazza a humán erstropolelin szekvenciáját és egy második szekvenciát a humán erittopoíeim szekvencia karbos! terminálisán, ahol a második szekvencia legalább egy giikoziláeíós helyei: tartalmaz.
A további aminosav tartalmazhat a humán “chortomc1' gonadottopin: karboxi terminális végéről származó peptid ífagmenst is. Előnyösen a glíkoproíein analóg a kővetkezők bármelyike lehet; (a) karboxi terminálisról kiinduló humán eritropoíetíu, amelynek szekvenciája a következő: Ser Ser Ser Ser Lys Alá Pro Pro Pro Ser Len Pro Ser Pro Ser Arg Len Pro Gly Pro Ser Asp Túr Pro He Leu Pro Gin (3. azonosítási szám szerinti szekvencia); fb) az (a) pontban ismertetett szekvencia analógja, amely továbbá tartalmazza a SedíAsti^Thr^ EFO-fehésjét; és (c) ss fal pontban ismertetett szekvencia analógja, amely továbbá tartalmazza az Ástoftrhr?'Vai7Asn8?Th?''
EFÖ-febérjét.
A humán erítt-opoietín fehérje lehet még továbbá olyas analóg ís, amely szekvenciájában legalább egy giikoziláeíós hely átrendeződését tartalmazza. Az átrendeződés magába foglalhatja bármely N-kapcsoli szénáid·a humán
* φ*φ * » ~δ~ rát kötőhely delécióját a honiáxi eritropoletínMl és- egy N-fcapcsdt szénhidrái kötőhely addicioját eritropoietln aminosav szekvenciájának SS, pozíciójában. Előnyösen a giikoprotein analóg a következők bármelyike lehet: Oln^Ser^Asa^Thr EPO; CfeVWV EPO és 0Ιη8?§ε?7Α5«?8Τ1ν?δ EPO,
További ghkozíkteiös helyekkel rendelkező eritropoietin analógokat ismertettek. Elírni ő40ő 19 iajrtromszámó. 1995 március i-«da leközölt európai szabadalmi bejelentésében.
Az V, általános képletben R bármely kis szénatomszámú alkilcsoport lehet, amely alatt 1-6 szénatomot tartalmazó lineáris vagy elágazó alkil csoportot értünk, mist példáit! metil, etil. izopropil, stb. osoportakat Előnyősén alkalmazható alkd csoport a metil csoport.
.Az V. általános képletben az X -(CkL)r vagy-CH2{O-€HrEWr molekularészlct léből, ahol k értéke 1 és mintegy E) között változhat, Előnyösen k értéke t és mintegy 4 között változik, előnyösebben k értéke 1 vagy 2 lehet. Legelőnyösebben az X -csoportot jelöl
Az. V, általános képletben .az Y az I-4V. képletekkel jellemzett csoportok bármelyike leltet
legelőnyösebben Y & IV, képlettel jellemzett csoport.
* * « *
IV
Az V. képletben az ra szóméi, úgy választjuk meg. kegy az eredményül kapott V. képletben feltüntetett konjugáímnnak a módosítatlan EPÖ-val összehasonlítható indológiái aktivitásit legyen, amely tiktivitás jelentheti a módosítatlan BPO megfelelő aktivitásának azonos mértékét, annál többet, vagy annak részét. Az m szám. az etilén-ősid csoportok számát jelenti a PEG egységben. Egyetlen -(OCfPCHj)- PEG alegység molekulatömege mintegy 44 dalton, Ebből következik, hogy a kouingátom otölekttiatömege (nem számítva bele az EPÖ molekulatömegét) az m számtól függ. A molekulatömegaél az egy adott szára „mintegy” értéke kifejezés alatt azt értjük, hogy az értek a szánthoz képest reális tartományon belől, ytra, ahogy art hagyományos analitikai eljárásokkal meghatároztuk, Az m. szám egész szára, amely mintegy 450 és mintegy 901) tartományba esik (ez megfelel egy 20 és 40 kDa közötti tartományt átfegő molekulatömegnek), előnyösen az m szám értéke mintegy 550 és mintegy 800 közé esik (mintegy 24-35 kDa) és legelőnyösebben az m szám értéke mintegy 650 és mintegy 700 közé esik (mintegy 29 és mintegy 31 kDa közötti molekulatömeg tartomány),.
zkz V. képletben az n szám egy erítropoietin fehérje azon hzm araínosavamak számát jelenti, amelyek eammoesoportjai amitikőtéssel kovalens kötésen keresztül kapcsolódnak egy PEG egységhez. A találmány szerinti konjugáium EPO molekulánként egy, kettő vagy hárma PEG egységet tartalmazhat. Az n szám egész szára, amelynek értéke 1 és 3 közé esik, előnyösen a értéke 1. vagy 2, és előnyösebben: n értéke 1.
Előnyősén alkalmazható erítropoietm gljkoprotéln termékek lehetnék a VI. és VH. képletek által reprezentált molekulák.
VI
n ·» r «**« ·*ϊ í
4Φ ahol P, R, X, m és ® értékei a fentebb steghatározort értékek. lehetnek,
A legelőnyösebben ateílmazható eritroposetift gbkoprötein termékek a VJI. képlet által reprezentált molekulák,
•ahol P, R, X, m és n értékel a fentebb meghatározott értékek lehetnek.
További előnyösen alkaltnazíntíó eritropoietin gbkoprotetn termékek lehetnek a Vili és IX, képletek által reprezentált tnoleka Iák, f”
ahol P és n értékei a fentebb megbatározott értékek lehetnek.
Előnyösebben aíkaknazltató erűropeíetín giikoprotein termékek lehelnek a IX. képlet álfel reprezentált molekulák.
IX «·'♦♦* «φφφ »»·«♦♦» »
-9 ahol Ρ és η értékei a fentebb meghatározott értékek lehetnek.
Előnyöseit alkalmazható vegyüleíeknck tekinthetők azok, amelyekben X a -(CHjX- csoportot reprezentálja, közelebbről meghatározva azok, amelyek esetében k értéke as 1-4 tartományba esik, legelőnyösebben alkalmasható vegyületek azok, ahol as X csoport -CH,- csoportot reprezentál.
A találmány tárgyát képezik továbbá olyan fentiek szerinti konjugámmok, amelyelméi m egy 55ö~<Söö közötti tartományba eső egész szám, előnyösen ni egy - $50-700 közötti tartományba eső egész szám.
A találmány szerinti, előnyösen alkalmazható vegyületeknek tekinthetők azok, amelyek esetében u értéke 1 és/vagy E meri! csoportot képvisel.
Továbbá a találmány tárgyát képezik: a lentiek szerinti vegyületek, amelyekben az egye» poii(etilés-gilkol) részegységek átlagos inolekölatönsege· mintegy 24 kilodaltontő: mintegy 35 kilodaltonig terjed, toóg előnyösebben mintegy 30 tólodaltonlg terjed.
Továbbá, a tálahnárty tárgyát képezik olyan vegyületek amelyekben a glikoproteint kovalensen kapcsoltak egy W két kis azéaatomszátnd alkoxi csoporttal lezárt poüteiiién-gllkol) részegységhez, még előnyösebben egy kis széaatomszámú alkoxi csoporttal lezárt poli(etilén-giíkol) részegységhez.
A találmány egy -előnyös· megvalósítást módja szerint eljárva a polííetílén-glikol) részegységeket xnetózi csoporttal zárjak le.
A találmány legelőnyösebb megvalősitási módja szerint eljárva olyan találmány szerinti lentebb ismerteteti vegyületeket hozunk létre, amelyekben az X -CHj- csoportot jelöl, megy 650-700- közé eső egész szám, n értéke 1, R metil csoportot jelöl: és az egyes poií{etílés-g!:ikol) részegységek átlagos molekulatömege mintegy 30 kiiodahon.
A találmány egy további megvalósítási módja szerint eljárva eljárást dolgozunk ki vérszegénység kezelésére emixackbes, amely eljárás során az V, képlet szerinti eritropoietin glikoprotein termek terápiásss hatékony mennyiségét adjuk be a páciensnek.
A találmány egy ínég további megvalósítási módja szerint eljárva módszert dolgozunk ki a csontvelő sejtek retitafccwa és vörösv&test termelésének aöveksöését kiváltó r« wvo biológiai aktivitással rendelkező eritropoíetín glikoproteln- termék elöállftására, amely eljárás a kővetkező lépéseket foglalja magába:
(a) a P-[NH;jja képlettel reprezentált eritropoíetín fehérje Iizin imúnos&vánakc-amino csoportjával kovalensen resgált&úmk egy kétfmikeiős reagenst, amelyet a X-CO-X-S-Q képlet reprezentál, hogy így az alábbi képlettel jellemezhető inoiókötésí tartalmazó köztes terméket hozzuk létre:
?-{NH-CO-X-S-Qjn ahol P az amidkötést kialakító aminoesoport nélküli eritropofelin fehérje, n értéke 1-3 közötti egész szám, Z, egy reaktív csoportok képvisel, mint például karboxil-NílS észter, X -fC.H'2)r vagy -CH2(O-CH2-CH2R- csoportot jelöl, ahol k értéke i és mintegy 1:0 közé eső egész szám és Q védöcsoportot jelent, amilyen például egy alkartól! csoport, mint például aeelil.
(b) az (a) lépésből származó, smlákőtest: tartaltnazö köztes terméket kovalensen magáltatjuk a W[ÖCHsCi-TJs-ÖR képlettel reprezentált aktivált polietilén-glikol szánnazékkah hogy a X. képlettel jellemezhető eritropoietin glikoprotein terméket hozzunk létre,
amely képletben W ez Y csoport szoldtsdril reaktív alakja, m érteke egy mintegy 450 és mintegy 9'ÖÖ 'közötti tartományba eső egész -szám, R kis szénatomszásjú alki? csoportot jelöl és Y az 1-1V. képletekkel jellemezhető csoportok bármelyike lehet.
i
Sí
IV
A találmány -ezen megvaiósitásí módja szerint eljárva kélhmkctős -reagensként előnyösen N-ssukcinimídtlS-acehl-tróprttp:toi;átet vagy N-szukcimmídil-S-acsdl-tíoaeetátot alkalmaznak, Z előnyösen N-bidroxistntkeinmád es a W-JOCHjC^L-ÖR aktivált poíichlén-glikoi származék előnyősön az alábbiak bármelyike lőhet: jődacetil-jnetoxi-PEO, metoxí-PEG-vmil-ssnlion és memxí-PEö-rti&lehniö.
A találmány egy további: megvalósítási módja szerint eljárva olyas konjugátumokst tartalmazó készítményt alkalmazunk, stmdyben mindegyik konjugáram tartalmaz legalább egy szabad amino csoporttal rendelkező eriíropotetirí glíkoproteint, amely rendelkezik a csontvelő sejtek mikölecita és vőrösvértest termelésének megnövelését kiváltó bt rívó biológiai aktivitással és amely a következők bármelyike lehet: humán eritropoíeiit; és analógjai, amelyek a humán eritropoietm 1-6 gHkozrtáeios hely artdtciójával vagy legalább egy glikozilácsős hely átrendezésével módosítok primer síraktúrájávai tcmfelkeznek; amely giikoproteírt kovalensen kapcsolódik egy-hárem kis széaatomssamű alkoxi-(!oi!.(etilén-giik:ol). csoporthoz, ahol mindegyik pök(eűlsn-glikol) csoport kovalensen kötődik a gtikoprotetahez egy -C(O)-X-S-Y- képlettel jellemezhető lískeren keresztül, amelyben a línker 0(0) csoportj a amid kötést alakit ki az egyik etnikait amino csoporttal.;
:···> · » ... ..Ζ
-π»*»
X csoport -(0¾)^ vagy csoportos jelöl,, amelyekben k értéke 1-10 között lehet és Y íí
az -egyes polifeiílén-glikol) részegységek átlagos molekulatömege mintegy 20 kdodaltoaíöl mintegy 40 kiiodahonig változik, és a komugdtum molekulatömege mintegy 51 kilodaltontól mintegy 175 kilodaltonig változik; és a készítményben azon konjugátnmok százalékos mennyisége amelyekben o értéke 1, legalább kilencven százalék, El&nyösen a készítmény a fentiek szerint meghatározott konjugátumokat tartalmazza, ahol azon konjugátnmok százalékos mennyisége, amelyekben s értéke 1, legalább kilencven százalék; még előnyösebben azon korsjugátumok százalékos mennyisége, amelyekben n értéke 1, legalább kilencvenkét százalék, még mindig előnyösebben azon konjugátumok százalékos mennyisége, amelyekben n értéke 1, legalább kilencvenhat százalék és legelőnyösebben azon koíijugátamok százalékos mennyisége, amelyekben n. értéke 1, kilencven százaléktól kilencvenhat százalékig terjedhet
Továbbá, a találmány tárgyát képezi gyógyászati készítmény amely a fentiek szerint meghatározott kosjugátarnot vagy készítményt és egy gyógyászatilag elfogadható excipienst tartalmaz, továbbá a taláhnány tárgyát képezi a tettek szeriül meghatározott köttjngáíiun vagy készítmény alkalmazása gyógyhatású anyagok előállítására vérszegénységgel kapcsolatos betegségek kezelésére vagy profilaxisára krónikus veseelégfelenségben (CEF), ÁlöS-ben szenvedő pátensekben, valamint a kemoterápián áteső rákos betegek kezelésére. Továbbá a találmány tárgyát képezi egy eljárás vérszegénységgel kapcsolatos rendellenességek profdaktikus és/vagy győgyitő kezelésére krónikus veseelágttenséghen {CRFi és AlB8~ben szenvedő páciensek, valamint kemoterápián áteső rákos betegek esetében, amely eljárás során a páciensnek a fentiekben meghatározott készítményt beadjuk,
A találmány tárgyát képezi egy eljárás is a fentiek szerint :megí:utárezoíi konjugáíumok vagy készítmények előállítására, amely eljárás során íiol-csoportokat kovalensen kapcsolunk erhropoíetm gííkoproteinhez és az eredményül kapott aktivált eritropoietin glikoprotoint polifetilén-glikol) (PEG) származékkal kapcsoljuk össze.
Továbbá a találmány tárgyát képezik a fedek szerint meghatározott konjugátnmok és készlterények, amelyeket bármely felébb ismertetett eljárással állítunk elő, és továbbá a taláhrsásy tárgyát képezi a fentiek szerint méghatávozott kmrjngátenok és készítmények alkalmazása vérszegénységgel kapcsolatos betegségek kezelésére krónikus veseelégtelonsegbeu íCRFl és AlDS-ben szenvedő páciensekben, valamint kemoterápián áteső rákos betegek esetében.
Módszerek EPÖ fehérjékenprcssziójátn:
Az eri-ropoierin (EPO) egy hmnáts giikoprotein, amely az crhrnciták kialakulását stimulálja. EIdáiiítását és terápiás alkalmazását részletesen leírták a következő publikációkban; 5,547,933 és 5,621,080 lajstromszámü US szabadalmák; EP-B 0 148 605 lajstromszámó európai szabadalom; fmang és mtsai.; Proe. Natl. Aead. Sei. USA 2708 (1984); EP-B 0 205 564, E?-B 0 209 539 és EP-B 0 411 678 lajsiromszámú európai szabadalmak; valamint La; és mtsai.: 1. Bíol. Chem 261 3116 (1986); Sasakí és mtsai,: J. Bioi. Chem. 262 12059 (1987). Terápiás alkalmazásra az eritropoietin előálilifurtó rekombináns módos [EP-B 0 14§ 605, EP-B 0 209 539 lajstromszámü európai szabadaknak. Egrié és mtsai,: Immunebíol. 72 213 (1986)j. Fehérjék - beleértve az EPO-fehéríéi ís espresszséjs endogén gén aktiválássá! a feóbttíka állása szerint jól ismert, ismertették példássá a következő pttblikációkhsm: 5,733,761, 5,641,670, 5,733,746 hyrtroroszámó US szabadalmakban és a WÖ 93/09222, WO 94/12650, Wö 95/31560, WO 9W11354, WO 91/0666? és WO 91/09955 fejslromszámó nemzetközi szabadalmi bejelentésekben.,
Az eri-rnpoie-ín szérammernes táptalajban történd sxprosszlöjára és előállítására szolgáié ellátásokat ismertettek példán: a követkézé publikációkban: Burg: WO 06035718 lajstromszámé nemzetközi szabadalomban: nyilvánosságra hozva 1996. november 14-én, valamint Koeh: 513 738 lajsíromszánm európai szabadalmi bejelerttt-shen, nyvrianasságra. hozva 19t}2 jumns l?-en
Módszerek: h más EPO fehérjék ttáziiíására:
A 'fenti refterettetékban hivatkozott módszereken kívül ismert, hogy EEG gént tartalmazó rekombináns CHÖ sejtek szérummentes fermentációja is megvalósítható. Ilyen eljárásokat ismertetnek például a kőve-kezö publikációk; EP-A 0 513 738 és EP-A 0 267 678 Injsttomszártní európai szabadalmak; illetve általános formában a kővetkezők: Kawamoto és tntsai.: Anaiytícaí Bioehem, 130 44.5 (1983·; EP-A il 248 Ő5ó lajstromszámü európai szafeadalém; Köw és Franek: Methtxts In Enzymology 421 277 (1086); Savisler: Espcologv 271 45 (1981); EP-A 0 48! 791, EP-A 0 307 247, EP-A 0 343 635 és: Wö 88/00967 laístromszánm. szabadalmi áokníneubnnok.
Aa EP-A 0 26? 678 lajstromszámh xmbadálotnhsm Ismertették a. xzérummeníes tenyészetben előállított EPO dialízis utáni tisztítására szolgáló É-Sephsrosc-sn. végzett ioncserés krotnatoeráftáját, Cs oszlopon végrehajtott preparativ íoréított fázisú HPLC-1 és gélszéréses kromarógráfiát Ebben az összefüggésben a gélszöréses kromatográfiás lépés helyettesíthető Pást 1 iow S-Sepharosc oszlopon végzett ioncserés krotnatográfíáva!, Javasolható továbbá az is, hogy Blue Trisaervl oszlopon végzést festék krotnatográhá· végezzünk az ioncserés kromatögráíia előtt.
Rekorobiaáns EPO siszíhasára szolgáié eljárást ismertettek Nobuo és munkatársai [Nobuo és mtsai.: J, Bioehem. 10? 352 (1990)1. Ezen eljárás során sz EPO-fehérjét a tisztítási lépés előtt a következőké- tartalmazó oldattal kezeljük: Tsveeo® 20, feml-medl-ssttífom) fluorid. eul-maleimid, pepsziatlu A, réz-szulfát és oxámsav.
Több referencia, mint például a Burg: Wö 96/35718 lajstrom;számú nemzetkézi szabadalom; nyilvánosságra hozva 1996. november 14-én, eljárási: ismertet az erttrosoíetm előállítására széntmmaaíes fermentációs eljárással (EPOsf). Az alább következőkben példaképpen ismerteink egy EPO előállítására szolgáld eljárnál: a
PEG-gei végzett kapcsolás küsduló anyagának a létrehozására.
« ♦ *ΧΦ« ♦ X ♦ • ΧΦΦ «♦»» »««“ ί * *·♦
- ΒBiológiai vizsgálati módszer EEÖ és: EEö kosjagátamric specifikus aktivitásának meghatározására:
A találmány szmari EFO vagy EFO-kösjugánmtok specifikus aktivitása meghatározható számos, a technika állása szériát jól ismert eljárás segítségével. a találmány szerinti tisztitoh BPO-leherjék biológiai aktivitása olyan, hogy humán páciensekben az EFO-iéhéije injekcióval történő bejntíatása megnövel! a csontvelő sejtek retíkulocita és vorösvértest termeléséi a nem-injektált vagy kontroll csoporthoz képest. A íalálmáay szerint előállított és tisztított EFO-téfeérjék vagy fragmenseik biológiai aktivitása a következő publikációban ismertetett eljárásokkal tesztelhető: Fh&rm. Enropa Spec. Issoc Erythropeieíin BRP Bio 1997(2).
Az·. EPO-íéhérje aktivitásának meghatározására egy másik biológiai vizsgálati eljárást, a normocitémiás egér vizsgálati eljárást ismertetjük a 4. példában.
Eljárások PF.G-gel kapcsolt EK) előállítására:
Az V. képlettel jellemzett erirtopoietio glikoprotem termékek elöállitására szolgáló eljárások magukban foglalják, tiol csoportok kovalens kötését az EFO-fehérjéhez (aktiválás) és az eredményül kapott aktivált EPOfehé'je összekapcsolását poli(eíihín-ghkol) (EEG) száranazékkai. A találmány szerint eljárva a FEG-geí kapcsolt EPO előállításában az első lépés a tiol csoportok kovalens kötése az: EPO NH; csoportjaihoz. Az EPO ilyetén aktiválását kétiunfccíós reagensekkel végezzük, amelyek védeti tiol csoportot és egy további reaktív csoportot hordoznak, mint ;>éldául aktív észtereket (példán! sznkeimmiáil-észíert.), anhidrideket, szulfonsavak észtereit, karbonsavak és szalíossavak balogenidjeii, sorrendben megfeleltetve. A hol csoportot a technika állása szerint jól ismert csoportokkal védjük, például acetil csoportokkal. Ezek a kéthmkesös reagensek amidköiésí kialakítva reagálni képesek a Ín mninosavak s-atnisocsoporijaival. A reakció első lépése az alábbi ábrán látható reakcióegyenlettel írható ie:
A reakcióegyenletben az EPO, n és X jelölések a fentebb leírtak szerint ériehnezendök; Z égy, a technika állása szerint ismert reaktív csoportot jelöl, például N-hífoOKl-ssnkcinimid (NHS) szubszthuens lehet, amelynek szerkezete s XI. képlettel j ellemezhető:
A találmány egy előnyös megvalósítási ntődjti szerint eljárva az s-ammo lizm csoportok aktiválását sznkeíaimiáil részegységet tartalmazó kétfonkciós reagensekkel végzett reakcióval hozzuk létre. A kétítmkciós reagens különböző távtartó szekvenciákat hordozhat, például -(Cí-lfo- vagy -€Hr(O-CH2-CHr)k’ részegységek, ahol k értéke í és mintegy lő között: lehet, előnyösen 1 és mintegy 10 közöli lehet, még előnyösebben k értéke 1 vagy a
- 54 «<·» *♦* lehet, és legelőnyösebben k értéke l. Ilyen reagensekre például szolgálhatnak a kővetkezők: N-szsfedaánidű-Saeetíl-liopropfonát ÍSÁ'FP; XIS. képlet) és N-szukKtKtódíl-S-scetil-tioacetáí (SA's'A; XIV, képlet)
X.
XH
Aceíílöoalkil-ka3feoxil«NHS«észtef, mint példád
2-{acetílti:o)'-(€toxi)k-eceísav~NHS-^zíer az ábrán k értéke a lentebb megbatározott érték lehet,
A technika állása szerint jől Ismert a kélfattkcio» reagensek előállítása. A 2-(aceí:í5-íio)-(etoxl)k-eeetsavXHS-észterek prekurzorait a I>E-39247Ö5 lajslrömszántú szabadalomban ismerteitek, mig az aeetfl-íto vegyület derivatízálását Mareb ismertette [Marék: zkdvaueed Organie Chemisby, Meöraw-Höl, 1977, 375-376. oldalak], A SATA keteskedeletabeti beszerezhet» (Molecnlar Prőbes, Eugeue, OR, Egyesült Államok valamint Eieree, Rockford, ÍL).
Az .EPO-molekalálroz hozzáadandó tiol csoportok számát a reakcíókörabnények módosításával áffiibaíjnk be, azaz például a fenétje (EPÖ) kötteenimeiő és a fehérje/kétíunkciós reagens arány módosításával Előnyősén az EPO-febérjéí EEQ-moleknlánkém i-S dől csoport kovalens hozzákapcsolásával aktiváljuk, előnyösebbe» EEO-molektslánként 1,5-3 Siói csoport hozzákapcsolásával, Ezek a tartományok a tiol csoportok statisztikus eloszlását tükrözik a teljes EPO-fohérje populációban.
A reakciót elvégezhetjük például vizes alapú puffér oldatban, 6,5-8,0 pH tartományban, mint például a következő oldatban: 10 mM kálium-foszfát, Sö mM HaCl, pH 7,3.. A kéthmkeíös reagenst DMSO oldatban adhatják hozzá. A reakció lezajlása után, előnyösen 30 pere elteltével, a reakciót Íizln hozzáadásával leállítjuk, A io~ iosleges kéifefikisős reagenst & ieclmika állása szerint jói ismert eljárásokká! választhatjuk el, például dialízissel vagy oszlopon történő szűréssel. .Az: EPO-feherjéhez bozzákapesolódott tiol csoportok átlagos számát meghatórázhatjuk például Ibtometríkus eljárásokkal, mini amelyeket például' Grasetti és Murray ismertettek [Graseiti és Muxray:I Appt Bioehem. Bíoleehnol. .1.19 41 (19ő7)j.
A fenti reakciót követheti egy aktivált poberiiés-glikel (PEG) származék kovalens kapcsolása. Megfelelő PEG-származékoknak tekinthetők azon aktivált PEG molekulák, .amelyek átlagos molekslatömege a mintegy 20 és mintegy 4Ö fcöa közötti tartományba esik, előnyösebben a mintegy 24 és mintegy 35 kDa közötti tartományba esik, és legelőnyösebben mintegy 30 kDa.
A technika állása szerint Ismertek aktivált PEG-származékok, például Mosporgo és munkatársai leírásából [Morpurgo és mtsai: 3. Bioconj. Chem. .7 363ff {1976); a PEG-vinilszulibn ismertetései. Lineáris láncú és elágazó lásntó PEG típusok egyaránt megíéielösk az V. képiénél jellemezhető vegyületek előállítására, A reaktív PEG-reagensekre például szolgálhatnak a következők: jódaeetíl-metcxi-PEG· (XVI képlet) és metoxi-PEGvlnllszolfon {XVII. képlet):
Ezeknek a jóddal aktivált vegyűleteknek az alkalmazása a technika állása szerint Ismert és leírásra kerültek például Hertnasson publikáció jábítn ölermanson: Biocönjugate Teehniques, Academic Press, San Dtego, 147148. oldalak (1996)].
Legelőnyösebb módon eljárva a PEG típusokat maleirtódöei aktiváljuk (aLLoxi-PEG-maleimid) olyanok alkalmazásával, mini például a metori-PEG-maieimiá (MWGOOÖO, Shearwsier Polymers, Inc.). Az alkoxi-PEGmaleímíb szerkezete a XVffi. képlettel:
\x-
XVIü vagy a XIX. képlettel jellemezhető :
ahol R és m a fentiek szerint megbatározott molekularészieíekeí illetve értékekei jelöl. A legelőnyösebben alkalmazható származék a XIX. képlettel jellemezhető;
XIX
XIX ahol R és ja a fedek szerint meghatározott snölekulsrészkttekeí illetve értékeket jelöl.
Az aikoxi-FEÖ-msietoítddei végzett kapcsolási reakció a tlol védőesoport ?'s «7» hasítása után történik vizes alapú puffer oldathas, mint példáal a kővetkező oldatban: lö roM kálium-foszfát, 50 nrM .NaCl, 2 t»M Έ17ΪΆ, pH ő,2. A váiiőc.soporí lebasitása elvégezhető például bldroxiíamfostal 25 öC-on HMSO-haa, pH 6,2, a reakció ideje mintegy 90 perc. A EEG ssődosiiásához az aktivált EPO/alkori-EEtj-maíeisád nsólaráaya mintegy 1:3 és mintegy 1:6 között kell legyen, előnyöseit az arány 1:4-hez, A. reakciót leállíthatjuk «risztéin hozzáadásával és a visssttmaradő hol (-SH) csoportok .H-mettl-malehniádei vagy más, díszulftd kötések kialakítására képes vegyítette! történő reagákatásávai, Mivei a maradék aktív tíoi csoportok például N-meíil-maleiínsddel vagy más megfelelő védőcsoporttal reagálni képesek, a találmány szerinti kmjtigáttnnokban az EPO glikoproíeinek tartalmazhatnak ilyen, védöcsoportokaí. Általánosságban az itt ismertetett eljárás segítségével molekulák keveréke állítható elő, amelyben változó száma, különböző számú védőesoporttal védett tioi csoport található attól függően, hogy a glfooproteinen hány aktivált tioi -csoport sm konjugsióáott a PEG-mafemnádel
Míg az N-metil-malennid ugyanolyan típusú kovalens kötést alakit ki amikor a EEG-gel kapcsolt fehérjén a visszamaradó tiol csoportok blokkolására alkalmazzuk, a diszuifid vegyesetek itttennolskuláris szuirld-GiszulSd kicserélődési reakcióval a blokkoló reagens diszutttd hidas kapcsolódásához vezetnek. Az előnyösen alkalmazható blokkoló reagensek az ilyen típusú blokkolási reakcióhoz a kővetkezők lehetnek: oxidált álmádon (GSSG), «risztéin és ciszíeamsö. Míg eisztein alkalmazásával nem juttatunk.be további nettó töltést: s EEG-gel kapcsolt fehérjébe, a GSSG vagy ciszteamm blokkoló reagensek alkalmazása további negatív vagy pozitív töltés bejuttatását jelenti.
Az V.. általános képlettel jellemzett vegyítetek további tisztítása - beleértve a mono-, di- és tti-PEG-gel kapcsolt EPO típusok elválasztását - elvégezhető a technika állása szerint ismert eljárások alkalmazásával, mint például oszlop kromatográfsa segítségével.
<1 yőgyászatí készítmények:
A találmány szerint előállított eritíOpoíetín gükoproteís termékek elkészitfeetöek injekcióban alkalmazható gyógyászati készíimértykéjst gyógyászatilag elfogadható hordozóval vagy vehíknlnmmál a technika állása szerint ismert eljárások segítségével. Például megfelelő készítményeket ismertettek a következő publikációkban: a WO 97,4)9996, Wö 97/40850, WO- 98/58660 és WO 99/07401 Isjsíro.nsxzámú szabadalmakban. A találmány szerinti termékek előállítása során előnyösen alkslmazhstő gyógyászstüag elfogadható hordozók közé tartoznak a következők: humán szérum albumitt, humán plazma fehérjék, stb, A íalálmáay szerinti vegyületek fonnnlázhaiók például JŐ saM koncentrációjú sGttíuisr'káiinm-fezfát. púderben (pH 7), amely í.onerössége-t biztosító ágenst, például 1.82 aM nátrium-kloriáot tartalmaz. Kívánt esetben a gyógyászati készítmény tartalmazhat tartósítószert is. A gyógyászati készítmény különböző mennyiségű erítropoieíim tartalmazhat, például lő- ÍÖ8Ö pg/ml koncentrációjú, azaz 50 pg vagy 400 pg eritropoíetint.
»*·*
- 17Vér rendellenességek kezdése, amelyekre alacsony smtő vagy hibás vörösvértest termelés jellemző:
A találmány szeriad eriiropoteón gltkoprotem termékek beadása emberekben vörősvértest termelést eredményez. Ebből következően az «ritropoietln glikoprotein terénékek beadása pótolja az EPÖ-fehérjéí, amely fontos a verösvértestek termeléséhez. Az erittöpoíeliö gllfcpproíem termékeket tartalmazó gyógyászati készítmények előállfthatóak olyan erősség mellett, amely hatékony egy emberi páciensbe bevitelhez, különböző beadási formák számára, amely páciens olyan vér readelteríességekben szenved, amelyeket alacsony vagy hibás vörösvértest termelés jellemez, akár önálló jelenségként, akár állapot vagy betegség részeként, A gyógyászati készítmények beadhatnak Injekció ólján, mint például sznbkatáa vagy intravénás injekció útján. Áz erltropoieíin glikoprotein termékek átlagos mennyisége változó lehet és elsősorban a szakképzett ötvös javaslatai és előírásai alapján kerül meghatározásra. A konjogáton pontos mennyisége preferencia kérdése, amely fagg olyan körülményektől mint például a kezélendó állapot pontos típusa, a kezelendő páciens állapota és a készítményben megtalálható más összetevők. Például testsúly ki logrammonként 9,91-10 pg mennyiséget, előnyösen testsúly kilogratnmoukést 0,1-1 ug mennyiséget adhatunk be például betonként egyszer.
A szabadalmi leírás sorát! számos publikációra hivatkoztunk. Az ezen publikációkban leközöltek teljes egészükben a kitanitás részének tekintendők annak érdekében, hogy szélesebb körben 'ismertessük a technika állását.
A találmányi leírást az alábbiakban a kővetkező példák segítségével részleteiben is ismertetjük, ezeken kérészéül - nem korlátozó értelemben - a találmány szerinti vegyületek és készítmények előállítását mutatjuk be.
példái
Ha^áa.IFQ.fei^|jlálása ó. tisztítása (a) Oltóanyag elkészítése és fermentáció:
A Woriíing Cell Bank-bői egy ampulla mennyiségű EPO-teoneiö CHO sejtvonalat (alkalmazható az ATCC CRL8695, amely ismertetésre került az £P 411678 lajsteoraszániú európai szabadalomban (Gesetfos Institute)} •emelünk ki & .folyékony nitrogén táraló edény gáz fázisából. A. sejteket üveg rázópsiackokba visszük át és hidrogén-karbonáttal pafféról!: táptalajban, nagy nedvességtartalma CO., inkubátorban tenyésztjük. Az oltóanyag elkészítéséhez és fermentációhoz: alkalmazható úpikus · szérummentes táptalajt ismertettek Koch: 513738 azonosítószámú ««répái szabadalmi bejelentésében (publikálásra került 1992. június 1.3-ée) illetve Burgt WO 96/35718 lajstromszán'iú szabadalmában (publikálásra került 1:996. november 14-én), amelyek például táptalajként DMEM/Fl'2-t (például JRH Bioscimces/llazleton Bíologlcs, Deaver, Egyesült Államok, katalógusszám: 57736) alkalmaznak valamim tartalmazz^ még a kővetkezőkéi: náírlum-lndrogén-karboriát, L+ glötamm, XH glükóz, rekombináns inzulin, aátriam-szelenií, diarnine-buían, hidrokoirtizon, vasíffj-szulíát, aszparagin, aszpsmgmsav, szerin és egy stabilízátort emlős sejtek, számára, mint például poli-vin.il-alk.ohol, snedl-cellulóz, polidestrán, polieEiiés-glikok Pfoioronic P68,, plazma expander pohgeiuj (HEM'ACCEIÁ) vagy poliviuilpirrekdon (WO 96/3.5718 azonosítószámú szabadalmi bejelentés}.
A tenyészeteket mikroszkóp segítségével ellenőrizzük. a szennyező organizmusok távoliétére és meghatározzuk a sejt konceíttrációkat. Ezeket a teszteket -mindegyik szétosztás! lépésnél megismételjük.
Az Iniciális növekedési periódus után a sejtteayészetet: friss táptalajjal a kezded sejt koncentrációra felhígítjuk és újabb növekedési ciklusnak vetjük alá. Est az eljárást addig ismételjük, ameddig üveg rázópalackonfcéat ♦ χ » st « « ♦ * # * ♦ ♦ * » * * *
X « mintegy 2 I tenyészet térfogatot étünkéi, Mintegy 12 duplázódás után 1-5 liter ilyen tenyészet áll rendelkezésre, amelyet ezután oltóanyagként használunkfel a lő1-es oltóanyag fennentesfean.
3-5 nap eltelte után a lő 1-es formemtorban létrejött tenyészet oltóanyagként alknlntazirasó a 100 1-es .oltóanyag femtertförbao,
További 3-5 nap tenyésztés után a 160' 1-es forarentorban létrejött tenyészet oltóanyagként alkalmazható az löOö l-es tennelő íermentorban.
(b) Begyűjtés és a sejtek elválasztása:
Egy sarzsonként történő visszaforgatási eljárást aíkahnaznnk, azaz amikor elérjük a kívánt sejtkoncemrációt, a tenyészet mintegy fe3 százalékát gyűjtjük be. A visszamaradó tenyészetet friss tenyész táptalajjal kiegészítjük, és a kővetkező begyűjtésig tenyésztjük. Egy termelést folyatna!: maximum 10 egymást követő begyűjtést tartalmaz, 9 részleges begyűjtést és 3 teljes begyűjtést a fermentáció legvégén, A begyűjtést 3-4 naponként végezzük.
A meghatározott térfogatú gyűjtött mennyiséget hűtött edénybe visszük át. A sejteket oenfrífugátással vagy szűréssel távol ltjuk el és eldobjuk, A eentrifogálási lépésben kapott EEO-t tartalmazó felülúszót a folyásnál során szűrjük és egy második hűtött edényben összegyűjtjük. Mindegyik begyűjtési külön dolgozzak fel a tisztítás során.
Az EPO feltétje tisztítására egy tipikns eljárási közöltek ie a következő szabadalomban; fínrg: WÖ 96/35718 lajstromszámú szabadalom, publikálásra került 1996. november 14-én. A tisztítás folyamatát az alábbiakban példaként ismertetjük:
(a) Blue Sepharose Eromafográíía;
A Blue Sepharose (Pkarmaela) Sepharose gyöngyökből áll, amelyek felületére Cibacron Blue festéket kötőitek kovalens módotn Mivel az EPO fehérje erősebben kötődik a Blue Sepharose-hoz mini a legtöbb nem fehérje jellegű szennyeződés, néhány fehérje jellegű szermyeződés és a PVA, EPO dúsítható fel ezzel a lépéssel. A Blue Sepharose oszlop elúcióját úgy végezzük, hogy a pfe értéket és a ső koncentrációt is megnöveljük.
Az oszlopot Sfr-lOö 1 Bitté Sepbarose-zal foltjuk fel, amelyet NaOE-áal regeneráhmk és ekvibbrálé pufferrel (nátrÍUtn.'kaieiam-kicadá és sáfoínm-ncetát) hozunk egyensúlyba. Ás oszdopra felvisszük a megsavanyítoti és szűrt fermentor felSlúszöt. A felvitel befejezése után az oszlopot először az ekvilibrálö puíferhez hasonló, magasabb nátriuts-ktortd koncentrációjú puiferrel m®ss«k, majd ezt követően Tris-alapú puffand mossuk. A terméket Tris-alapú pufferrel ehtáljuk és egyetlen frakcióban gyújtjuk a mintaként szolgáló eléciós profil alapján.
(b) Batil-Toyopeari krotnafogníSa:
A Butii-Toyopearl 650 C (TosoHaas) egy poiiszttrol alapú mátrix, amelyhez kovalensen alifás butilesoportokaí kötöttek. Mivel az EPÖ-febesje erősebben kötődik ebhez a gélhez mint a szennyeződések többsége és a PVA, ízopropanolf tartalmazó puffsrrel kell elnáfoi.
Az oszlopot 30-4;) 1 Bulil-Toyope&ri 650 C géllel töltjük meg, NttOE-dal regeneráljuk, Tris-alapú pufferrel mossuk és izopropanolf tartalmazó Tris-alapú pufferrel ekvihhráljuk.
A Blue Sepharose ehsáínmot az oszlop ektdh'brál.ő pufferben. fonrtálió izopropanol köneetúráciöhoz beállítjuk, maid feivisszűk az oszlopra. Ezután az oszlopot az ekvrlforáió pufferrel mossuk növekvő izopropartol koncentráció mellett, A terméket az elúciós pufferrel (Tris-alapú puífer magas isopropanol tartalommal) ehtáljuk és egyetlen frakcióba gyűjtjük a mintaként szolgáló efúeíós profil alapján.
♦ * <
- ;9 fc) Ridrcxiapaíit Ulírogel kromatográfls.·
A hidroxispstlí Vteogel (Bíasepra) a meehaaikaí tulajdonságok javítására agaróz mátrixba beépített hidroxiapatitból áll. Az EPO-fohétje alacsony affinitást mutat a hidroxiapaíittal szemben, őzért tehát alacsonyabb foszfát koneenfráciöksáí ehiálódík. mint a feltétje szennyeződések.
Az oszlopot 30-40 i feidroxstípatlt Ultrogel-íel feltöltjük, tnayd kálmm-foszfát-kafeíum-kloríd puffoméi és nátrium-hidroxiddal regeneráljak majd ezt követően Tris-aiapú pufferrei snossuk. Ezótán kis mennyiségű, isopropattoh és nátrium-kioridet tartalmazó Tris-glapú pufferrei ekvilöóljak.
A Buítl-Toyopearl kromatográfia EPÖ-febérjéí. tartalmazó einátumát visszük fel az oszlopra. Ezután az oszlopot az ekvílíbráló pufferrei és izopropanolí valamint oátrimn-kleriitot nem tartalmazó Tris-aiapá pufferrei mossuk.. A terméket alacsony koneenírációban káhum-foszfátot tartalmazó Tris-aiapú puffctrel ekíáijuk és egyetlen frakcióban gyűjtjük össze a mintaként szolgáló «lóerős grafikon alapján.
(dj Fordított felső HPLC Vydae C4 tztzlopon;
Á Vydac €4 (Vydac) RP-fíFLC anyag szilifcsgél részecskékből áll, amelyek felszínén C4-aIkil láncok helyezkednek el. Az EPO elválasztása a fehérje jellegű szemtyeződésekíöl a hitirofóh kölcsönhatások erősségének különbségein alapul. Az elüciót hígított triíluer-eceísav jefettlóíében acetonitríi gradienssel végezzük,
A prsparaítv HPI.C4 rozsdamentes acél oszlop (amelyet 2,8-3,2 1 Vydac C4 szilikagéllel töltöttünk: fel) alkahaazásával végezzük, A hidroxíapaíit íil.trogel eluárumot biihior-eceísav hozzáadásával m.egsavanyiíiuk: és felvísszük a Vydac C4 oszlopra. Mosásra, és elücíóra seetonitrll gradienst alkalmazunk hígított írifluorecetsavban. A frakciókat begyűjpdk és rögtön semlegesítjük foszfát pufferrei, Az 1PC határokon bellit esó EPO frakciókat ősszeöntjük.
(e): DEAE-Sepharose kromaíográfia:
A DEAE-Sepharose {Fhsnmscía) anyag dietil-anrinoetil (DEAEl-csoportokat tartalmaz, amelyeket kovalessen Sepharose gyöngyök felszínére kötöttek. Az EPO kötődéséi a DEAE csoportokhoz ionos kölcsönhatások bmtosihák, Az acstoínlril és a rriílöör-eeetsav sz oszlopon visszatartás nélkül halad át Miután ezeket az anyagokat lemostuk, a nyomszennyeződéseket az oszlop alacsony pH értéknél, acetát puffomé! történő mosásával távolltjnk eh .Ezután az oszlopot semleges foszfát-ptdferel mossuk és az EPO-i növekvő tonerösségű .pufferrei eluáljnk.
Az oszlopot .DEAE Sepharose Fást Flőw mátrixszal töltjük meg. Az oszlop térfogatát ügy állítjuk be, hogy az EPO mennyisége a 3- lö mg EPOdnl gél tartományban legyeit. Az oszlopot vízzel és ekvihbrálö pufferrei (nátriamíkáimm-feszdát) mossuk. A HPLC eladóira összeonföít frakcióit felvísszük és az oszlopot ekvílíbráló pufferrei mossuk. Ezután az oszlopot a mosó pufferrei (oátrinm-acetát puffer) mossuk, amelyet az ekvílíbráló pufferrei végzett mosás kövek Ezt követően az EPO-t az oszlopról az elüciős pufferrei (nátrium-klorid, nátriumdcáhunt-foszfál) eluáljak és egyetlen Irakdöhas gyűjtjük a mintaként szolgáló elúoíós profil alapján,
Á DEAE-Sepharose oszlop «luáínmái meghatározott vezetőképességre állítjuk he. Az eredményül kapott gyógyszer hatóanyagot sterilen Teflon, palackokba szűrjük és -70 °C-on tároljuk.
2, ymísfe
Tini csoportok kovalens kapcsolása az EPO-hoz
Ebben a példában ismertetjük a reakció körülmények meghatározását hol csoportok EPO-fehérjéhez történő kovalens kapcsolásához, A. körülmények meghatározásához blokkolt tiol csoportot tartalmazó reagens - itt
- 20 SATA vagy SATP (I 9 mgíuU; konceBtrációban DM.SO-bsn. feloiáva) - különböző mennyiségét adtak sz EPO oldathoz - itt 1 ml 5 mg/ml EPÖ oldathoz., amely még -a.következőkettartalmazta: lö utM kálium-foszfát (pfí 7,3), 50 mM NaCl A reakciót mintegy 30 percig kevertettük (25 °C) és I M Hzin oldat Hozzáadásával állítottuk le, 10 otM végső koncentrációig. A SATA és SATP felesleges mennyiségét lö mM kálium-foszfát, 50 mM NaCl és 2 mM EDTA (pH 6,2), oldatával szemben végzett dialízissel távolítottak «1, Mintán a védő aeetil csoportot hídroxikunntnsl eltávolítottak, az: EPO-fehérjéhez kovalensen kapcsolt tiol csoportok számát fotometriában'határozták meg dítl.c-dipiridis segítségével Grasetti és Murrav eljárása alapján (Grasetti és Matray: 1, Appl. Bioche®. Biotechael. 11.9 41 (1967)].
Az EPÖ molekulánként kovalensen kapcsolt Hol csoportok számának alakulása az alábbi táblázatban látható:
raöl&rány
EPÖ: SATAvagy SATP EPO : SATA-· 1 : 3 EPO :: S ATA “1:5 EPÖ: SATA -1:6 EPO; SATP “1:3 EEG : SATP “ I ; 4 EPÖ: SATP -1:6 tiol csoportok moláris meunsusége:'mol EPÖ 13
2.4 3,2 u
2.5 3,7 syríÍy^kEPÖméáósbásametuxi-TEG-mafemnddel (A) EPO aktiválása:
Az 1, példa szerint előállítóit 199 mg. EPÖ-t (190.000 íU'/mg a normocitéraiás egér vizsgálati eljárással meghatározva) a 2, példa szerint SATA-val (EPOCSATA xaóbrány “ 1:5) aktiváltunk. Az eredményül kapott kovalensen kapcsolt blokkolt tiol csoportokat hordozó EPÖ-t („aktivált EPO”) az 1, példában leírtak szériát, dialízissel választottaké! a melléktemiékektői. mint például az, N-mdroxl-szukemimidtŐl vagy az el nem reagált SATA-ióL így végül a következő oldatot kaptak: 4,5 mg/ml aktivált EPÖ lő mM kálimn-íoszíát (pH 6,2), 59 mM NaCl, 2 mM EDTA oldatában.
(δ) Aktivált EPÖ PEG-gel történő kapcsolása:
380 mg tnetoxi-PEG-maieíntiáet - amely a lentebb bemutatott „legelőnyösebb*’ szerkezettel rendelkezik (MW 39,000; Sbearwater Folynrers, )nc„ Hunsíville, Alsbams, Egyesült Államok) - oldottunk 95 tng aktivált EPÖ-t tartalmazó fenti oldatban (4,5 mgtiui EPÖ, 1Ö mM kálintm foszfát (pH 6,2), 50 mM N&C1, 2 mM EDTA öldatábati). Az· oldatban az aktivált EPO és metoxí-PEö-maleímtd igy elért mólaránya 1:4 volt. Az előbbi oldathoz 1 M' vizes hidroxilamin oldat (pH 6,2) 30 mM végső fcmcentrácíőíg történő hozzáadásával az aktivált EPO kovalensen kötött, blokkolt tiol csoportjaúíak a védelmét elíavőbtotmk. Az eredményül kapott aktivált EPO a reakció elegybes szabad tiol (-SH) csoportokat. tartalmazott. A tiol csoportok vádöcsoportjaisak eltávolítást közvetlenül követte a most már szabad tiol (-SH) csoportokat tartalmazó aktivált EPO es a esetoxí-PEG·malemtiá közösít kttpcsolásí reakció, 90 percig, keverés: közben 25 C-on. A kapcsolási reakciót 0,2 M vizes cfezíein oldat hozzáadásával állttottuk le, amit 2 mM végső koncentrációig adagoltok a reakclóelegyhez. 30 ♦ * X perc után az aktivált EPO felesleges szabad bel csoportjait, amelyek sem reagáltak a íuetoxí-PEG-mrieúntáűel, 5 mM végső koncentrációig DMEÖ-ban oldod 0,5 M N-raeíil-rnaieimid hozzáadásával blokkoltuk. 30 perc ütés az eredményül kapott, most már PEG-gel kapcsolt EPO típusokat tartalmazó reakcióelegyet 10 mM káliuKtfoszfáttal (pH 7,5) szemben diabzábuk legalább 15 órás keresztül.
(C) PEG-gel kapcsok EPO típusok tisztítása:
A PEG-gel kapcsolt EFO típusok reakcíóelegytol történő elválasztására a következő tisztítási eljárást alkalmaztuk: 50 tní térfogatú Q-Sepharose Ettst How oszlopot ekvllibráltonk 10 mM kálium-fexfötí&l (pH 7,5), A 8-lépésben kapod reakcióelegyet az oszlopra. felvittük (átfolyási sebesség: 3 oszlop -térfogai, óránként). Á nem reagált tnetoto-lHiG-maleímid reagens eltávolítása céljából az oszlopot:5 eszlop térfogat mennyiségű 10 mM kálium-foszfádai (pH 7,5) mosfetk. A PEG-gel kapcsolt EPG típusokat növekvő sótartalmú gradienssel eluáituk., atnely 5 oszlop térfogai mennyiségű A parfén: (lö mM káliatn-íószíáf, pH 7,5} és 5 oszlop térfogat mennyiségű 8 pufiért (lö saM kálium-foszfát, SÖO mM NaCí, pH. 7,5) tartalmazott, az átfolyási sebesség 3 oszlop térfogat óránként volt. A NaCl gradiens alapján a. PEG-gel kapcsolt EPO típusok '(tó-, dl- és mono-PEG-gel kapcsolt EEG típusok) elnálódsak először, majd ezt a PEG-gel nem kapcsolt EPO típusok követték. A PEG-gel kapcsolt EPO Síposokat (tri-, dí~ és utono-PEG-gel kapcsolt EPO· típusok) tartalmazó eluátum feakeíót összeöníötsuk: és szőttük (steril szűrés 0,2 gro-es szűrövei).
A írt-, ál- és meao-PEG-gel kapcsolt EPO típusok összetételét és tisztaságát Coornassie-festett SDS-PÁA géleken ftasmmíE Natúré 22? 680 (1970)1 vizsgált»!:» míg a. fehérje koncentrációkat 280 nm hullámhossznál mértük a Seer-Iannfeeri. törvényt alkalmazva. Az EPO típusok SDS-PAA eiekíroforézissel meghatározod látszólagos molekalMömege mintegy 68 kí)a (mono-PEG-gel kapcsolt EPO típusok), mintegy 98 kí>a (dt-PEG-gel kapcsolt EPO típusok) és mintegy 128 kDa volt (trl-PEG-get kapcsolt EPO típusok).
A írt-, di- és men.o-PEö-geí kapcsolt EPO típusok további szétválasztása kromatográtíávat végezhető el, például a méret szerinti szétválasztáson alapuló kromatogtáftával (Superdex PG2Ö0, Pharmacia).
A ín-, dl- és mono-PEG-gel kapcsolt EPO típusokat tartalmazó eluátum in vsvo biológiai aktivitásának meghatározását a 4. példában Ismerteted eljárással végeztük.
4, pdfífu
PEG-gel kapcsait EPQ út vfeo ttktívifásu, a normncítétniás egér vizsgálati eljárással meghatározva
A nonuocitémíás egér biológiai vizsgálati eljárás a technika állása szerint ismert. (Pharm. Európa Spec. Issue Erythropoíetm 8RP Bio (1997(21)] továbbá erre szolgáló eljárás található Ph. Eur. SEP eríiropetetin monográőájáb&n. A mintHcsá 8SA-PBS oldattal hígítjuk. Normál, egészséges, 7-15 hetes egereknek s.c. 0,2 ml adunk be a 2. példában leírtak szerinti tri-, di- és ujotrct-PEG-gei kapcsolt EPO-t tartalmazó EPO fmketóból. A beadás utáni 72 órát kővetően 4 napon keresztül vért veszünk a farok vénából és meghlgiíiuk oly módos, hogy 1 pl vér legyen 1 mlÖ,l5 pmol akridin-daraucs festő oldatban. A festési idő 3-10 pere. A retikuiocita számlálásokat míkm-Suorirnetriáva) végezzük áífolyásos chométerben a vörös fluoreszcencia hísztogram analízisével. A retíkuiocíta szátnolásokat abszolút értékben adjuk tseg (30,000 analizált vérsejtre számolva). A bemutatott, adatoknál ntíndegyik csoport naponta 5 egérből állt, és az egerektől csak: egyszer vertünk vért.
A 3. példa szerinti EPO-boz kapcsolt metosi-PEG-maleimideí, módoaítafian EPO-t és pnffer oldatot adtunk be az egereknek. Az eredményeket a 3. ábrán mutatjuk be. Áz eredmények a PEG-gel kapcsolt EPO típusok kíetnélkedően jő aktivitását és hosszabb felezési ideiét mutatják a jelentősen tnegnővekedeö. íetíkulocba mennyi·% ♦ » φ φ « X * » ♦
Φ « Μ « Φ *β cégekkel és a retikoloeóa szám maximumának eltolódásával, mikor egerenként ugyanakkora dózist alkalmaztank.
SZEKVENCIALÍSTA <21ö> a <212> PRT <2a3> Homo sapiens
AIs b* ϊ' O Arg Leu 3 A A . ·^ Cys Aso Ser Aró ·; A Λ· V V 3 u. Lo Glu Arg Tyr 15 .«'S vi
Le u Gxo φ» Ύ 03. Λ Lys •“j /Y Glu Alá Ga.u Aso lle a n ·<- j. .·:· < i. 1 ÜL. Gi V Cys Αϊΐ 30 Glu H-is
Cys S«r Leu 3 Λ A s rí Glu Asn Xie Thr 4 0 Val Pro Asp •n*' K x·i, I ί,Φ.· L y s ,·*. C. •3 Val Asn fc.*' 03
Tyr Alá 50 *?> V*yS •X X. Lys *Arg Mer Glu 55 Val Gly Glo Gin r, λ· wx<a §0 Vá ά Gin Val Trp
Gin Gly Leu Alá Leu s 0 Ser Cin Alá Lou 3 5 Arg T > e Gin < o
ΐ A.V' ,i»6u· V»' Asn Ser Ser SS Gin Fro Trp O .LO Pro 50 Uu r· v Len His Vsa 95 S t—,
r.y a $ * γ V C* Λ» Ser 100 Gly ϋ·3\Λ Arg VA , Otí.í. Leu 105 Thr Less Asu Ara no Ars Leu
Gly AI a f* > vs 5 * £ Lvs em A.:. β 1 is Ser 120 Pro P ro r <? vx ÍT Ara Alá χ *s. íC Ser Alá e.re
Pro Len ?x .L a/ W Arg Thr lle Thr Alá 135 Asp Thr Phe Arg A. y a 14 0 Leu Phe Arg Vei
Tvr 145 Ser Ase Phe Leu Arg* \ A 2). V» vi MÁV Lys Loo. Lys Leu 155 Tyr Thr Gly Glu o /* ,·\ } J
Cys Arg Thr Gly Asp
<211> 1.6€ <212> PRT <213> Koma sapiens <400> 2
165 «hí Ar raví «« ««♦·**♦* ♦*
Φ φ φτ« * * * « φ ♦ * 4 ♦ *'♦·' '♦' *·*
V* •'•e 1 · χ y y
Aj.a
Gla His ;<c V a 1 Asr, Phe
L··,; V GlAlá
Arg
Alá
125
Ser Alá Ali >ne
- 23 Alá ?r© Pro Arg Leu lle Cys Asp Ser Arg Val Leu 1 5 10 le..; uru Alá nys uim Alá G.tu a.azi rla 31.;:' Tr.r SSzy 20 25
Cys Ser Leu Asn Glu Asn lle Thr Val Pro Asp Thr
40 45
Tyr Alá Trp Lys Arg éfet Glu Val Gly Glu Cin Alá Val Glu Val Trp 50 55 50
Sin Gly Leu Alá Leu Leu Ser Gin Alá Val Leu Arg 6 s 70 s.
Len Val Asn Ser .Ser Gla Pro Tru Glu Pro Leu Gin SS ‘ 50
Lys Ara Val Ser Gly Leu Arg Ser Leu Thr Thr Len 100 ' 105
Glv Alá Gin Lys Glu Alá Ile Ser Pro Pro· Asp Alá
Ϊ ' A '5 0 >*''
Ά λ\ kJ .3» 4» M
Pro Leu Arg Thr Ile Thr Alá Asp Thr Phe Arg Lys
130 135 ' 140
Tyr Ser Asn Phe Leu Arg Gly Lys Leu Lys Leu Tyr
145 ISO 155
Cys Arg Thr Gly Asp Arg 165
C ·' ' 0 <212> PRT <2'i3> Hcssao sapiens <400> 3
Ser Ser Ser Ser Lys Alá Pro Pro Pro· Ser Leu Pro.
ε, T g
Leu Pro Gly Pro Ser Asp Thr Pro· Ile Leu Pro Gin 20 25 .•’C?: ·.> 80
Val Asp 55
Az a
Gly Glu Alá ISO
-ra ser Ara

Claims (32)

  1. SZABADALMI IGÉNYPONTOK
    1, Entropoíetj» ghkoproteint tartalmazó korrjtígálum, amelyben az crittopoicíin g.Hkopt»íeia legalább egy szabad aminocsoporttal rendelkezik és csontvelő sejtek retikaíocita és vörösvértest termelésének növeléséi kiváltó óv tévő biológiai aktivitást matat, és amely a következők, bármelyike: humán eritropcíeihl· vagy elvan analógia, iuelynek primer szerkezete megegyezik az 1 -ö glikozílációs hely hozzáadásával vagy legalább egy gíikozdáeiós hely átrendezésével módosított humán eritropcietin szerkezetével; a glikoprotess kovalensen hozzá van kötve 13 Cj-Cs alkoxi poli(eíiién-ghkol) csoporthoz, ahol mindegyik poBfeíüéa-gBkol) csoport a glikoprotemhez kovalensen kötődik egy iinkeren kérésziül, amely llnker általános képlete a következő; -C(Ö)-X~S-Y-: ahol a lisiker C(O) csoportja amid kötést alakít ki as említeti .amino csoportok egyikévek és ahol. X jelentése -(CHjjfc vagy -C.'Hj{O-CR>-Cííλ)α-, ahol k értéke 1-től 10-ig terjedhet,
    Y pedig az I-IV. képlettel jellemzett molekalsrészietek bármelyikét jelöli:
    H
    ÍH as egyes poli(esiién-glikol) részegységek' átlages molekulatömege 20 és 40 kilodallon közötti, és a. konjngátnm ÍHoletelatömege 51 és 175 kilodalton közötti.
  2. 2, Az 1. Igénypont szerinti kenjugátum, amely a következő, V, általános képlettel jellemezhető:
    F-^NH-CaX-S-Y-COCHsCH^-OR]» V.
    ahol X és Y jelentése az 1, igénypont szerinti, m értéke 450-900 közötti, n értéke 1-3 lehet, R CrQ alkilcsoportot, P pedig eritropoietin glikoproíeint jelöl, az X részegységgel anndkötest kialakító atnino csoport vagy amino csoportok nélkül,
  3. 3, Az L vagy 2. igénypont szerinti kopj ugatom, melyttek szerkezete a VI. képlettel jellemezhető :
    *
    9 tt
    999X9 ahol R, R, X, m és a jelentése a 2. igénypont szerinti,
  4. 4. Az 1. vagy 2. igénypont szerinti kosjagátum, melynek szerkezete a VII, képlettel jellemezhető:
    / \.·
    OR vn almi P, R, X, -a és n jelentése a 2. igénypont szerinti.
  5. 5, Az 1-4. igénypontok bármelyike szerinti konjogátem, ahol X jelenése-{CIRk
  6. 6. Az 5, igénypont szerinti korjjogs&m, ahol k értéke 1 -tol 4-ig terjedhet.
  7. 7, Az 1-6, igénypontok bármelyike szerinti konjpgátmn, ahol X jelentése
  8. 8, As 1-7. igénypontok bármelyike szerinti koajögátoa, ahol m értéke egy, sz 550--800 közötti tartományba eső egész szám,
  9. 9. Az 1-8. igénypoatok bármelyike szerinti kospugáínm, ahol m értéke egy, a 650-700 közötti tartományba eső egész szám,
  10. 10. Az 1-9. igénypontok bámrelyike szerinti konjygámm, ahol a értéke L
    1.1. Az 1-10. igénypoatok bármelyike szerinti konjugálása, ahol R jelentése metil csoport.
  11. 12. Az 1-11. igénypontok bármelyike szerintikonprgátmm amelyben az egyes politeiilén-glikol) részegységek átlagos molekulatömege 24 é,s 35 kiioőaiton közötti.
  12. 13. Az 1-12, igénypontok bámelyike szerinti koojngéhtm, amelyben az egyes poliCetiién-glikol) részegységek átlagos molekulatoxnege 30 kiiodaltoa.
  13. 14. Az 1 -13. igénypoatok bármelyike szerinti knnjngásarn, amelyben a glikoprotein kovalens módon kapcsolódik egy vagy két Cí~C<, alkoxi csoporttal fezári pohteíiiés-glikoi} részegységhez.
  14. 15. Az 1-14. igriiypoatok bármelyike szerinti koalagátem.. amelyben a poli(etilén-glikol) részegységeket metoxi csoport zárja leié. Az 1-15. igénypontok bármelyike szerinti konjagáittm, ahol X jelentése -CHr, m értéke egy 650-700 közötti tartományba eső egész szám, n értéke 1, R jelatése metil csoport, és amelyben az egyes p«ii{eíiiésglikol) részegységek átlagos mritekatetömege 30 kilodalkm.
    * fc.
    ÍT. Áz 1-16. igénypontok bármelyike szerinti, kímjugátum, amelyben az eritropoietin glikoprotein humán eritrcpoíeria.
    IS. Az 1-17. igénypontokbármelyike szerinti konjngátum, amelyben az eritropoietin gtbkoprotein endogén gén akti válása útján expresszált eritropoíetm.
  15. 19.. As 1-18. igénypontok bármelyike szerinti koíijngátanp amelyben az eritropoietin glikoprotein szekvenciája az 1, ábrán {1. azottositásl szám szerinti szekvencia.) vagy a 2. ábrán (2. azonosítási szára szerinti szekvencia) bemutatott szekvencia.
    2Ö. A. 19, igénypont szerinti konjugátum, amelyben az eriteopeíeim glikoprotein szekvenciája az 1. ábrán (1. azonosítási szám szerinti szekvencia) bemutatott szekvencia.
  16. 21. Az 1-16.. igénypontok bármelyike szerinti konjugátam, amelyben a glikoprotein szekvenciája az í-6 giíkozilácíös hely addíciójával módosított humán, eribopoíetín szekvenciája.
  17. 22. Az 1-6., 3. vagy 10. igénypontok bármelyike szerinti konjugáium, amelyben a glikoprotein szekvenciája az alább felsorolt módosítások bármelyikével módosított humán eritropoietin szekvenciája:
    ÁsnKW?t
    WW?;
    Asní?Thr2
    AsíÖ7;
    Asri®Thr?5;
    Seri'AstrdWj
    Val^Asa^a98:;
    Ser^AsaV;
    Seri7AsnssThr-;2'hr35 /ksnö9Tsr7 lSers 7 AsKS5Thrw;
    Asrt?''Tiu3'iVá.íí7/\suS3ThrXl;
    AsAeW;
    Ser^A^le^fer^;
    Ásn!36Tbrm;
    Asci3W*!;
    Thri2S; és
    Pro^Th?25.
  18. 23. As 1-22. igénypontok bármelyike szerinti konjagáSum, amelyben a. glikoprotein szekvenciája tartalmazza a humán eritropoíetm szekvenciáját és egy második szekvenciát a humán eritropoietin szekvencia karboxi terminálisán, és almi a második szekvencia legalább egy gliknzílációs helyet tartalmaz.
  19. 24. A 23. igénypont szerinti korsjugátem, amelyben a második szekvencia a humán chorionic gonadoriopin. karboxi terminális szekvenciájából származó- szekvenciái tartalmaz.
  20. 25. A 24. igénypont szerinti konjngáíum, amelyben a glikoprotein szekvenciáin az, alább kővetkezők bármelyike:
    iá) a karhoz! termmálisről kiinduló humán eritropoietin szekvenciáin, amely a következő; Ser .Ser Ser Ser Lys Alá Pro Pro Pro Ser Len Pro Ser Pró Ser Ara Leu Pro Gly Pro Ser Asp Thr Pro He Le» Pro Gin (3, azonosítási szám szerinti szekvencia);
    (b) az (a) pontban ismertetett szekvencia, amely a Se?\As:nShTbri'! amísosavakksl lett módosítva; és (c) az (a) pontban ismertetett szekvencia, amely az ?lsa:?&2'hrÍJ'Valíl''A5aiwThí:’0 amínosavskknl lett módosítóé, Az í-16. igénypontok bártnelyilce szerinti konjugátnm, amelyben & glikcproteiu szekvenciája legalább egy gilkozilációs hely átrendezésével módosított humán erítropcdetm szekvencia,
  21. 27, A 25. igénypont szerinti konjugáttms, ahol a glikszdáciös hely átrendezése a humán entropoieün kikapcsolt szénhidrát helyet közöl bármelyik áeléeíóját, és egy N-kopcsoIt szénhidrát hely hozzáadását jelenti a humán, eritropoietin szekvencia Ό, pozíciójában,
  22. 28. A 14, igénypont szerinti koojugáturn, amelyben a glikoprotein szekvenciája az alábbi módosítások bármelyikével módosított humán eritropoietin szekvencia:
    BPO;
    Qtó^erW’W0 BPO; és Öl^W^sn^Thr*’ BPO.
  23. 29. Készítmény, amely 2-27, igénypontok bármelyike szerinti konjugáíumot tartalmaz, és a készítményben azon konjugáíu«u>k százalékos mennyisége amelyekben n értéke I, legalább kilencven százalék.
  24. 30. A 29, igénypont szerinti készítmény, amelyben, azon. konittgáinmok százalékos mennyisége amelyekben n értéke Ϊ, legalább kilcncvertkét százalék.
  25. 31.. A 29. igénypont szerinti készítmény, amelyben ázmkonjug&umcfe: százalékos mennyiségé amelyekben n értéke 1, legalább kilenc vonhat százalék.
  26. 32. A 29. vagy 31, igénypont szerinti készítmény, amelyben azon koningáttnnok százalékos mennyisége amelyekben n ériéke 1, kilencven és kilencvenhat százalék közötti,
  27. 33. Gyógyászati; készítmény, amely 1-32. igénypontok bármelyike szerinti konjngátuínot vagy készítményt és győgyászatüsg elfogadható exdpícosl tartalmaz.
  28. 34. Az 1 -32, igénypontok bármelyike szerinti tenjugátum vagy készitmény alkalmazása anémiával kapcsolatos betegségek kezelésére megelőzésére, krónikus veseetégteienségben (CRF), AlDS-ben szenvedő betegek vagy kemoterápián áteső rákos betegek kezelésére alkalmas gyógyászati készítmény előállítására.
  29. 35. Eljárás az 1-32., igénypontok bánnelyike szerinti konjtigátom vagy készítmény előállítására, ezss/jeZfaene, hogy túri csoportokat kapcsolunk kovalens módos eritropoietin ghkoproteinhsz és az eredményűi kapott aktivált eritropotetía glikoproíemi poiíietílán-glikol) (PEö) származékhoz kapcsoljuk.
  30. 36. Az 1-32, igénypontok bármelyike szerinti konjugátam vagy készítmény, amely a .36, igénypont szerinti eljárással lett előállítva,
  31. 37. Az 1-32. igénypontok bármelyike szerinti kosíugátam vagy készítmény, anémiával kapcsolatos betegségek kezelésére történő alkalmazása, krónikus veseelégtelssségben (CRP) vagy AlDS-ben szenvedő betegek vagy kemoterápián áteső rákos betegek esetében.
  32. 38. Az új vegyületek, eljárások és módszerek, valamint az ilyen vegyületek alkalmazása az előzőekben leírtakkal lényegében azonos módos.
HU0201971A 1999-07-02 2000-06-28 Erythropoietin conjugates with polyethylenglycol HU228478B1 (en)

Applications Claiming Priority (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US14224399P 1999-07-02 1999-07-02
US14745299P 1999-08-05 1999-08-05
US15145499P 1999-08-30 1999-08-30
PCT/EP2000/006009 WO2001002017A2 (en) 1999-07-02 2000-06-28 Erythropoietin conjugates with polyethylenglycol

Publications (3)

Publication Number Publication Date
HUP0201971A2 HUP0201971A2 (en) 2002-09-28
HUP0201971A3 HUP0201971A3 (en) 2010-01-28
HU228478B1 true HU228478B1 (en) 2013-03-28

Family

ID=27385779

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
HU0201971A HU228478B1 (en) 1999-07-02 2000-06-28 Erythropoietin conjugates with polyethylenglycol

Country Status (33)

Country Link
US (1) US6340742B1 (hu)
EP (1) EP1196443B1 (hu)
JP (1) JP4190184B2 (hu)
KR (1) KR100510624B1 (hu)
CN (1) CN1194014C (hu)
AR (1) AR024879A1 (hu)
AT (1) ATE267840T1 (hu)
AU (1) AU768452B2 (hu)
BR (1) BRPI0012138B8 (hu)
CA (1) CA2378533C (hu)
CO (1) CO5180621A1 (hu)
CZ (1) CZ301833B6 (hu)
DE (1) DE60011087T2 (hu)
DK (1) DK1196443T3 (hu)
ES (1) ES2220501T3 (hu)
GC (1) GC0000196A (hu)
HK (1) HK1047597B (hu)
HR (1) HRP20010966B1 (hu)
HU (1) HU228478B1 (hu)
IL (2) IL146956A0 (hu)
JO (1) JO2291B1 (hu)
MA (1) MA26806A1 (hu)
MX (1) MXPA01012974A (hu)
MY (1) MY126776A (hu)
NO (1) NO20016304L (hu)
NZ (1) NZ516170A (hu)
PE (1) PE20010288A1 (hu)
PL (1) PL201754B1 (hu)
PT (1) PT1196443E (hu)
RS (1) RS50117B (hu)
TR (1) TR200103782T2 (hu)
TW (1) TWI266637B (hu)
WO (1) WO2001002017A2 (hu)

Families Citing this family (207)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
FR2686899B1 (fr) * 1992-01-31 1995-09-01 Rhone Poulenc Rorer Sa Nouveaux polypeptides biologiquement actifs, leur preparation et compositions pharmaceutiques les contenant.
EP1489100B1 (en) 1997-12-08 2016-06-15 Merck Patent GmbH Heterodimeric fusion proteins useful for targeted immune therapy and general immune stimulation
US20030105294A1 (en) * 1998-02-25 2003-06-05 Stephen Gillies Enhancing the circulating half life of antibody-based fusion proteins
HUP0101352A3 (en) * 1998-04-15 2003-08-28 Lexigen Pharmaceuticals Corp L Enhancement of antibody-cytokine fusion protein mediated immune responses by co-administration with angiogenesis inhibitor
US7304150B1 (en) * 1998-10-23 2007-12-04 Amgen Inc. Methods and compositions for the prevention and treatment of anemia
US6958212B1 (en) 1999-02-01 2005-10-25 Eidgenossische Technische Hochschule Zurich Conjugate addition reactions for the controlled delivery of pharmaceutically active compounds
US7744912B1 (en) 1999-02-01 2010-06-29 Eidgenossische Technische Hochschule Zurich Biomaterials formed by nucleophilic addition reaction to conjugated unsaturated groups
US7345019B1 (en) * 1999-04-13 2008-03-18 The Kenneth S. Warren Institute, Inc. Modulation of excitable tissue function by peripherally administered erythropoietin
CZ299516B6 (cs) * 1999-07-02 2008-08-20 F. Hoffmann-La Roche Ag Konjugát erythropoetinového glykoproteinu, zpusobjeho výroby a použití a farmaceutická kompozice sjeho obsahem
SK782002A3 (en) 1999-07-21 2003-08-05 Lexigen Pharm Corp FC fusion proteins for enhancing the immunogenicity of protein and peptide antigens
US7067110B1 (en) 1999-07-21 2006-06-27 Emd Lexigen Research Center Corp. Fc fusion proteins for enhancing the immunogenicity of protein and peptide antigens
JP4793971B2 (ja) * 1999-08-09 2011-10-12 メルク パテント ゲーエムベーハー 複合サイトカイン−抗体複合体
US20050202538A1 (en) * 1999-11-12 2005-09-15 Merck Patent Gmbh Fc-erythropoietin fusion protein with improved pharmacokinetics
CA2391080A1 (en) 1999-11-12 2001-05-25 Merck Patent Gesellschaft Mit Beschraenkter Haftung Erythropoietin forms with improved properties
MXPA02007733A (es) 2000-02-11 2004-09-10 Merck Patent Gmbh Mejoramiento de la vida media circulante de proteinas de fusion basadas en anticuerpos.
US6586398B1 (en) * 2000-04-07 2003-07-01 Amgen, Inc. Chemically modified novel erythropoietin stimulating protein compositions and methods
US20030171267A1 (en) * 2000-04-12 2003-09-11 Rosen Craig A. Albumin fusion proteins
BRPI0110914B8 (pt) * 2000-05-15 2021-05-25 Hoffmann La Roche 'composição farmacêutica líquida, processo para preparação da mesma e uso de uma composicão farmacêutica'
US7291673B2 (en) 2000-06-02 2007-11-06 Eidgenossiche Technische Hochschule Zurich Conjugate addition reactions for the controlled delivery of pharmaceutically active compounds
JP2003535066A (ja) * 2000-06-02 2003-11-25 エイドジェノシスク テクニスク ホクシューレ チューリッヒ 薬学的活性化合物の制御された送達のための共役付加反応
CA2412845C (en) * 2000-06-29 2014-07-22 Lexigen Pharmaceuticals Corp. Enhancement of antibody-cytokine fusion protein mediated immune responses by combined treatment with immunocytokine uptake enhancing agents
AU2001290312A1 (en) 2000-10-16 2002-04-29 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Peg-modified erythropoietin
EP1355965B1 (en) 2000-10-19 2012-09-19 Ecole Polytechnique Fédérale de Lausanne (EPFL) Method of synthesizing block copolymers for multifunctional self-assembled systems
KR101229995B1 (ko) * 2000-12-11 2013-02-06 씨제이 주식회사 생체내 에리스로포이에틴 활성이 증진된 융합단백질
JP3946638B2 (ja) * 2000-12-11 2007-07-18 シージェイ コーポレーション 生体内エリスロポエチン活性が増強された融合蛋白質
DE60144439D1 (de) * 2000-12-20 2011-05-26 Hoffmann La Roche Konjugate von erythropoietin (epo) mit polyethylenglykol (peg)
ES2361824T3 (es) 2000-12-20 2011-06-22 F. Hoffmann-La Roche Ag Conjugados de eritropoyetina (epo) con polietilenglicol (peg).
US7767643B2 (en) 2000-12-29 2010-08-03 The Kenneth S. Warren Institute, Inc. Protection, restoration, and enhancement of erythropoietin-responsive cells, tissues and organs
US20030072737A1 (en) * 2000-12-29 2003-04-17 Michael Brines Tissue protective cytokines for the protection, restoration, and enhancement of responsive cells, tissues and organs
EP1234583A1 (en) 2001-02-23 2002-08-28 F. Hoffmann-La Roche Ag PEG-conjugates of HGF-NK4
US7148321B2 (en) * 2001-03-07 2006-12-12 Emd Lexigen Research Center Corp. Expression technology for proteins containing a hybrid isotype antibody moiety
US6992174B2 (en) * 2001-03-30 2006-01-31 Emd Lexigen Research Center Corp. Reducing the immunogenicity of fusion proteins
US6969517B2 (en) 2001-05-03 2005-11-29 Emd Lexigen Research Center Corp. Recombinant tumor specific antibody and use thereof
AU2002310122A1 (en) * 2001-05-25 2002-12-09 Human Genome Sciences, Inc. Chemokine beta-1 fusion proteins
US6930086B2 (en) 2001-09-25 2005-08-16 Hoffmann-La Roche Inc. Diglycosylated erythropoietin
US7214660B2 (en) * 2001-10-10 2007-05-08 Neose Technologies, Inc. Erythropoietin: remodeling and glycoconjugation of erythropoietin
US7795210B2 (en) 2001-10-10 2010-09-14 Novo Nordisk A/S Protein remodeling methods and proteins/peptides produced by the methods
US7173003B2 (en) 2001-10-10 2007-02-06 Neose Technologies, Inc. Granulocyte colony stimulating factor: remodeling and glycoconjugation of G-CSF
US7157277B2 (en) 2001-11-28 2007-01-02 Neose Technologies, Inc. Factor VIII remodeling and glycoconjugation of Factor VIII
ES2561985T3 (es) * 2001-10-10 2016-03-01 Ratiopharm Gmbh Remodelación y glicoconjugación de anticuerpos
KR100467751B1 (ko) * 2001-12-03 2005-01-24 씨제이 주식회사 생체내 에리스로포이에틴 활성이 증진된 융합단백질
CN100390282C (zh) * 2001-12-04 2008-05-28 默克专利有限公司 具有调节的选择性的il-2融合蛋白
KR100480423B1 (ko) * 2001-12-04 2005-04-06 선바이오(주) 에리트로포이에틴과 폴리에틸렌글리콜 유도체의 배합체
DK1463823T3 (da) * 2001-12-06 2013-06-03 Fibrogen Inc Fremgangsmåder til forhøjelse af endogent erythropoetin (epo)
AU2002364587A1 (en) * 2001-12-21 2003-07-30 Human Genome Sciences, Inc. Albumin fusion proteins
AU2002351746A1 (en) * 2001-12-21 2003-07-15 Maxygen Aps Erythropoietin conjugates
EP1997829A1 (en) * 2001-12-21 2008-12-03 Human Genome Sciences, Inc. Albumin fusion proteins
US7300915B2 (en) 2002-06-05 2007-11-27 The Regents Of The University Of California Use of erythropoietin and erythropoietin mimetics for the treatment of neuropathic pain
KR100630176B1 (ko) * 2002-07-24 2006-10-02 에프. 호프만-라 로슈 아게 페길화 ｔ1249 폴리펩타이드
WO2004013164A1 (en) * 2002-07-24 2004-02-12 F. Hoffmann-La Roche Ag Pegylated t20 polypeptide
CA2493221C (en) * 2002-07-24 2008-11-18 F. Hoffmann-La Roche Ag Polyethylene glycol aldehyde derivatives
US7459435B2 (en) * 2002-08-29 2008-12-02 Hoffmann-La Roche Inc. Treatment of disturbances of iron distribution
EA007812B1 (ru) * 2002-09-09 2007-02-27 Уоррен Фармасьютикалз, Инк. Эритропоэтины длительного действия, которые сохраняют тканезащитную активность эндогенного эритропоэтина
US7459436B2 (en) * 2002-11-22 2008-12-02 Hoffmann-La Roche Inc. Treatment of disturbances of iron distribution
PT1572748E (pt) * 2002-12-17 2010-09-28 Merck Patent Gmbh Anticorpo humanizado (h14.18) do anticorpo 14.18 de rato que se liga ao gd2 e a sua fusão com a il-2
MXPA05006944A (es) * 2002-12-26 2005-12-14 Mountain View Pharmaceuticals Conjugados polimericos de interferon-beta cion potencia biologica aumentada.
TWI364295B (en) * 2002-12-26 2012-05-21 Mountain View Pharmaceuticals Polymer conjugates of cytokines, chemokines, growth factors, polypeptide hormones and antagonists thereof with preserved receptor-binding activity
EP1616003A4 (en) * 2002-12-30 2007-06-20 Gryphon Therapeutics Inc WATER-SOLUBLE THIOESTER AND SELENOESTER COMPOUNDS AND METHOD FOR THE PRODUCTION AND USE THEREOF
AU2003300139B2 (en) 2002-12-31 2008-08-28 Nektar Therapeutics Maleamic acid polymer derivatives and their bioconjugates
US20060104968A1 (en) 2003-03-05 2006-05-18 Halozyme, Inc. Soluble glycosaminoglycanases and methods of preparing and using soluble glycosaminogly ycanases
PL2163643T3 (pl) * 2003-03-05 2015-06-30 Halozyme Inc Rozpuszczalna glikoproteina o aktywności hialuronidazy (sHASEGP), sposób jej wytwarzania, zastosowania oraz zawierające ją kompozycje farmaceutyczne
US7871607B2 (en) * 2003-03-05 2011-01-18 Halozyme, Inc. Soluble glycosaminoglycanases and methods of preparing and using soluble glycosaminoglycanases
US20090123367A1 (en) * 2003-03-05 2009-05-14 Delfmems Soluble Glycosaminoglycanases and Methods of Preparing and Using Soluble Glycosaminoglycanases
US20040180054A1 (en) * 2003-03-13 2004-09-16 Hanmi Pharm. Co., Ltd. Physiologically active polypeptide conjugate having prolonged in vivo half-life
US20050176108A1 (en) * 2003-03-13 2005-08-11 Young-Min Kim Physiologically active polypeptide conjugate having prolonged in vivo half-life
JP2006523211A (ja) 2003-03-14 2006-10-12 ネオス テクノロジーズ インコーポレイテッド 分岐水溶性ポリマーとその複合物
US7610156B2 (en) 2003-03-31 2009-10-27 Xencor, Inc. Methods for rational pegylation of proteins
AU2004227937B2 (en) * 2003-03-31 2007-09-20 Xencor, Inc Methods for rational pegylation of proteins
US7642340B2 (en) 2003-03-31 2010-01-05 Xencor, Inc. PEGylated TNF-α variant proteins
EP2338333B1 (en) 2003-04-09 2017-09-06 ratiopharm GmbH Glycopegylation methods and proteins/peptides produced by the methods
US8791070B2 (en) 2003-04-09 2014-07-29 Novo Nordisk A/S Glycopegylated factor IX
EA010015B1 (ru) * 2003-05-12 2008-06-30 Афимакс, Инк. Новый разделительный фрагмент (спейсер) для модифицированных полиэтиленгликолем соединений на основе пептидов
PL1625156T3 (pl) * 2003-05-12 2013-03-29 Affymax Inc Peptydy wiążące się do receptora erytropoetyny
SG160224A1 (en) * 2003-05-12 2010-04-29 Affymax Inc Novel peptides that bind to the erythropoietin receptor
JP2007530440A (ja) * 2003-05-12 2007-11-01 アフィーマックス・インコーポレイテッド 新規ポリ（エチレングリコール）修飾化合物およびその用途
US7074755B2 (en) * 2003-05-17 2006-07-11 Centocor, Inc. Erythropoietin conjugate compounds with extended half-lives
CN1826131A (zh) 2003-05-30 2006-08-30 森托科尔公司 利用转谷氨酰胺酶形成新的***缀合物
EP1491554A1 (en) * 2003-06-23 2004-12-29 CONARIS research institute AG PEGylated soluble gp130-dimers useful as a medicament
US9005625B2 (en) 2003-07-25 2015-04-14 Novo Nordisk A/S Antibody toxin conjugates
BRPI0409650A (pt) * 2003-09-09 2006-04-25 Warren Pharmaceuticals Inc métodos para regular o nìvel hematócrito e humanos, produtos de eritropoietina artificial, métodos para preparar um produto de eritropoietina e pra tratar anemia em pacientes em risco de dano no tecido, e, composição farmacêutica
MXPA06003234A (es) * 2003-09-29 2006-06-08 Warren Pharmaceuticals Inc Citosinas protectoras de los tejidos para el tratamiento y prevencion de la sepsis y la formacion de adhesiones.
EP1675871A2 (en) 2003-10-10 2006-07-05 Xencor Inc. Protein based tnf-alpha variants for the treatment of tnf-alpha related disorders
EP2239273B1 (en) * 2003-11-13 2013-10-09 Hanmi Science Co., Ltd. A pharmaceutical composition comprosing an immunoglobulin fc as a carrier
US8110665B2 (en) 2003-11-13 2012-02-07 Hanmi Holdings Co., Ltd. Pharmaceutical composition comprising an immunoglobulin FC region as a carrier
US8633157B2 (en) 2003-11-24 2014-01-21 Novo Nordisk A/S Glycopegylated erythropoietin
US20070254834A1 (en) * 2003-11-24 2007-11-01 Defrees Shawn Glycopegylated Erythropoietin
US20080305992A1 (en) 2003-11-24 2008-12-11 Neose Technologies, Inc. Glycopegylated erythropoietin
US20060040856A1 (en) 2003-12-03 2006-02-23 Neose Technologies, Inc. Glycopegylated factor IX
US7956032B2 (en) 2003-12-03 2011-06-07 Novo Nordisk A/S Glycopegylated granulocyte colony stimulating factor
CN1913925A (zh) * 2003-12-10 2007-02-14 尼克塔治疗亚拉巴马公司 含有两组不同聚合物－活性剂缀合物的组合物
ES2460671T3 (es) * 2003-12-19 2014-05-14 F. Hoffmann-La Roche Ag Uso de eritropoyetina en el tratamiento de alteraciones de la distribución del hierro en enfermedades intestinales inflamatorias crónicas
DK2233150T3 (en) 2003-12-30 2016-12-12 Augustinus Bader Erythropoietin for use in the treatment of wounds or transplantation of cells
KR20060124656A (ko) * 2003-12-31 2006-12-05 메르크 파텐트 게엠베하 개선된 약물동태를 가지는 Ｆｃ-에리스로포이에틴 융합단백질
US8361961B2 (en) 2004-01-08 2013-01-29 Biogenerix Ag O-linked glycosylation of peptides
CN1942589A (zh) * 2004-02-02 2007-04-04 Ambrx公司 经修饰的人类生长激素多肽与其用途
US7588745B2 (en) * 2004-04-13 2009-09-15 Si Options, Llc Silicon-containing products
CA2563874A1 (en) * 2004-04-23 2005-11-03 Cambridge Antibody Technology Limited Erythropoietin protein variants
EP1771066A2 (en) 2004-07-13 2007-04-11 Neose Technologies, Inc. Branched peg remodeling and glycosylation of glucagon-like peptide-1 glp-1
WO2006031811A2 (en) 2004-09-10 2006-03-23 Neose Technologies, Inc. Glycopegylated interferon alpha
SI2586456T1 (sl) 2004-10-29 2016-05-31 Ratiopharm Gmbh Preoblikovanje in glikopegliacija fibroblastnega rastnega faktorja (FGF)
MX2007005640A (es) * 2004-11-10 2007-08-14 Aplagen Gmbh Moleculas que promueven la hematopoyesis.
US7589063B2 (en) * 2004-12-14 2009-09-15 Aplagen Gmbh Molecules which promote hematopoiesis
MX2007005777A (es) * 2004-11-11 2007-07-20 Affymax Inc Peptidos novedosos que se unen al receptor de eritropoietina.
WO2006062685A2 (en) * 2004-11-11 2006-06-15 Affymax, Inc. Novel peptides that bind to the erythropoietin receptor
AU2006203792B2 (en) 2005-01-10 2011-11-03 Ratiopharm Gmbh Glycopegylated Granulocyte Colony Stimulating Factor
EP1848461A2 (en) * 2005-02-16 2007-10-31 Nektar Therapeutics Al, Corporation Conjugates of an epo moiety and a polymer
WO2006121569A2 (en) * 2005-04-08 2006-11-16 Neose Technologies, Inc. Compositions and methods for the preparation of protease resistant human growth hormone glycosylation mutants
WO2006119767A2 (en) 2005-05-10 2006-11-16 Elisabeth Bock Neuritogenic peptides
US9988427B2 (en) 2005-05-13 2018-06-05 Charite Universitaetsmedizen-Berlin Erythropoietin variants
EP1888098A2 (en) 2005-05-25 2008-02-20 Neose Technologies, Inc. Glycopegylated erythropoietin formulations
EP2975135A1 (en) 2005-05-25 2016-01-20 Novo Nordisk A/S Glycopegylated factor IX
EP2298829B1 (en) 2005-05-31 2017-09-20 École Polytechnique Fédérale de Lausanne (EPFL) Triblock copolymers for cytoplasmic delivery of gene-based drugs
US7919461B2 (en) 2005-06-03 2011-04-05 Affymax, Inc. Erythropoietin receptor peptide formulations and uses
US7550433B2 (en) * 2005-06-03 2009-06-23 Affymax, Inc. Erythropoietin receptor peptide formulations and uses
US8324159B2 (en) * 2005-06-03 2012-12-04 Affymax, Inc. Erythropoietin receptor peptide formulations and uses
WO2006136450A2 (en) * 2005-06-23 2006-12-28 Aplagen Gmbh Supravalent compounds
US20070105755A1 (en) 2005-10-26 2007-05-10 Neose Technologies, Inc. One pot desialylation and glycopegylation of therapeutic peptides
JP5198747B2 (ja) * 2005-08-31 2013-05-15 株式会社カネカ ネコ由来タンパク質のコード配列を含む外来性遺伝子を含むトランスジェニック鳥類およびその作製法
US20090158449A1 (en) * 2005-08-31 2009-06-18 Kaneka Corporation Transgenic avian which has foreign gene containing sequence encoding feline-derived protein and method for production thereof
AU2006304856A1 (en) * 2005-10-21 2007-04-26 Synageva Biopharma Corp. Glycolated and glycosylated poultry derived therapeutic proteins
US20080171696A1 (en) * 2005-10-21 2008-07-17 Avigenics, Inc. Pharmacodynamically enhanced therapeutic proteins
WO2007056191A2 (en) 2005-11-03 2007-05-18 Neose Technologies, Inc. Nucleotide sugar purification using membranes
US8946155B2 (en) 2006-02-03 2015-02-03 Opko Biologics Ltd. Long-acting polypeptides and methods of producing and administering same
US10221228B2 (en) 2006-02-03 2019-03-05 Opko Biologics Ltd. Long-acting polypeptides and methods of producing and administering same
US9458444B2 (en) 2006-02-03 2016-10-04 Opko Biologics Ltd. Long-acting coagulation factors and methods of producing same
US8476234B2 (en) * 2006-02-03 2013-07-02 Prolor Biotech Inc. Long-acting coagulation factors and methods of producing same
US8450269B2 (en) 2006-02-03 2013-05-28 Prolor Biotech Ltd. Long-acting growth hormone and methods of producing same
US8048848B2 (en) 2006-02-03 2011-11-01 Prolor Biotech Ltd. Long-acting interferons and derivatives thereof and methods thereof
US10351615B2 (en) 2006-02-03 2019-07-16 Opko Biologics Ltd. Methods of treatment with long-acting growth hormone
US8304386B2 (en) * 2006-02-03 2012-11-06 Prolor Biotech, Inc. Long-acting growth hormone and methods of producing same
US7553940B2 (en) 2006-02-03 2009-06-30 Modigene Inc Long-acting EPO polypeptides and derivatives thereof and methods thereof
US8048849B2 (en) 2006-02-03 2011-11-01 Modigene, Inc. Long-acting polypeptides and methods of producing same
US8759292B2 (en) 2006-02-03 2014-06-24 Prolor Biotech, Llc Long-acting coagulation factors and methods of producing same
US20140113860A1 (en) 2006-02-03 2014-04-24 Prolor Biotech Ltd. Long-acting polypeptides and methods of producing and administering same
US20150038413A1 (en) 2006-02-03 2015-02-05 Opko Biologics Ltd. Long-acting polypeptides and methods of producing and administering same
US9249407B2 (en) 2006-02-03 2016-02-02 Opko Biologics Ltd. Long-acting coagulation factors and methods of producing same
CN101062407A (zh) 2006-04-29 2007-10-31 中国科学院上海生命科学研究院 ***在预防或治疗视网膜损伤中的用途
JP2009544327A (ja) 2006-07-21 2009-12-17 ノヴォ ノルディスク アー／エス Ｏ−結合型グリコシル化配列によるペプチドのグリコシル化
CA2659990C (en) 2006-08-04 2016-03-22 Prolong Pharmaceuticals, Inc. Polyethylene glycol erythropoietin conjugates
US20100075375A1 (en) 2006-10-03 2010-03-25 Novo Nordisk A/S Methods for the purification of polypeptide conjugates
EP2068907B1 (en) * 2006-10-04 2017-11-29 Novo Nordisk A/S Glycerol linked pegylated sugars and glycopeptides
US20080083154A1 (en) * 2006-10-05 2008-04-10 Timothy M Gregory Bait retention fish hook
US20080193942A1 (en) * 2006-11-08 2008-08-14 Don Wojchowski System and method for identifying erythropoietin-responsive genes
WO2008058942A2 (en) 2006-11-13 2008-05-22 Charite - Universitätsmedezin Berlin Method of cell culture and method of treatment comprising a vepo protein variant
EP2144923B1 (en) * 2007-04-03 2013-02-13 BioGeneriX AG Methods of treatment using glycopegylated g-csf
US9493499B2 (en) 2007-06-12 2016-11-15 Novo Nordisk A/S Process for the production of purified cytidinemonophosphate-sialic acid-polyalkylene oxide (CMP-SA-PEG) as modified nucleotide sugars via anion exchange chromatography
EP2018835B1 (de) 2007-07-09 2014-03-05 Augustinus Bader Wirkstoff abgebendes Pflaster
CL2008002053A1 (es) 2007-07-17 2009-05-22 Hoffmann La Roche Metodo para la purificacion de una eritropoyetina monopeguilada (epompeg) que consiste en proporcionar una solucion que contiene eritropoyetina mono, poli y no peguilada y hacerla pasar por dos pasos de cromatografia de intercambio cationico y metodo para producir epo mpeg que incluye metodo de purificacion.
CL2008002054A1 (es) 2007-07-17 2009-05-29 Hoffmann La Roche Metodo para la regeneracion de una columna de cromatografia de intercambio cationico despues de la elusion de eritropoyetina monopeguilada y metodo para obtener una eritropoyetina monopeguilada, incorporando el metodo de regeneracion de la columna de intercambio cationico.
AR067584A1 (es) 2007-07-20 2009-10-14 Hoffmann La Roche Un conjugado de un anticuerpo contra la cd4 y peptidos antifusogenicos
US8207112B2 (en) 2007-08-29 2012-06-26 Biogenerix Ag Liquid formulation of G-CSF conjugate
CN101381412B (zh) * 2007-09-30 2012-02-22 深圳赛保尔生物药业有限公司 聚合物/重组人促红素偶联物
CN101455844B (zh) * 2007-12-10 2011-09-14 江苏豪森药业股份有限公司 聚乙二醇化***偶联物和其制备方法与用途
JP5647899B2 (ja) * 2008-01-08 2015-01-07 ラツィオファルム ゲーエムベーハーｒａｔｉｏｐｈａｒｍ ＧｍｂＨ オリゴサッカリルトランスフェラーゼを使用するポリペプチドの複合糖質化
EP2669313B1 (en) 2008-01-11 2016-03-23 Serina Therapeutics, Inc. Multifunctional forms of polyoxazoline copolymers and drug compositions comprising the same
US8101706B2 (en) * 2008-01-11 2012-01-24 Serina Therapeutics, Inc. Multifunctional forms of polyoxazoline copolymers and drug compositions comprising the same
SG188143A1 (en) 2008-02-08 2013-03-28 Ambrx Inc Modified leptin polypeptides and their uses
WO2009108806A1 (en) 2008-02-27 2009-09-03 Novo Nordisk A/S Conjugated factor viii molecules
TWI395593B (zh) 2008-03-06 2013-05-11 Halozyme Inc 可活化的基質降解酵素之活體內暫時性控制
US20100003238A1 (en) 2008-04-14 2010-01-07 Frost Gregory I Modified hyaluronidases and uses in treating hyaluronan-associated diseases and conditions
TWI394580B (zh) 2008-04-28 2013-05-01 Halozyme Inc 超快起作用胰島素組成物
CA2915677C (en) 2008-04-29 2018-06-26 Ascendis Pharma Growth Disorders Division A/S Pegylated recombinant human growth hormone compounds
EP2161031A1 (en) 2008-09-05 2010-03-10 SuppreMol GmbH Fc gamma receptor for the treatment of B cell mediated multiple sclerosis
UA106731C2 (uk) 2008-09-26 2014-10-10 Амбркс, Інк. Модифіковані поліпептиди еритропоетину тварин та їх застосування
EP2356228B1 (en) 2008-11-25 2023-05-03 École Polytechnique Fédérale de Lausanne (EPFL) Block copolymers and uses thereof
NZ593641A (en) 2008-12-09 2013-01-25 Halozyme Inc Extended soluble ph20 polypeptides and uses thereof
GB0922354D0 (en) 2009-12-21 2010-02-03 Polytherics Ltd Novel polymer conjugates
EP2432488A4 (en) 2009-03-20 2014-01-08 Amgen Inc SELECTIVE AND POWERFUL KV1.3 PEPTIDE INHIBITORS
US9663778B2 (en) 2009-07-09 2017-05-30 OPKO Biologies Ltd. Long-acting coagulation factors and methods of producing same
MX2012003282A (es) 2009-09-17 2012-04-30 Baxter Healthcare Sa Co-formulacion estable de hialuronidasa e inmunoglobulina, y metodos de su uso.
EP2590666B1 (en) 2010-07-06 2017-04-26 Augustinus Bader Topical application of erythropoietin for use in the treatment of injuries of the cornea
CA2806058C (en) 2010-07-20 2016-09-13 Halozyme, Inc. Adverse side-effects associated with administration of anti-hyaluronan agents and methods for ameliorating or preventing the side-effects
BR112013005890B1 (pt) 2010-09-14 2022-02-08 F Hoffmann-La Roche Ag Método para purificar eritropoietina peguilada
MX360946B (es) 2010-09-22 2018-10-29 Amgen Inc Star Inmunoglobulinas portadoras y usos de las mismas.
CN102453087B (zh) * 2010-10-22 2013-12-25 广东赛保尔生物医药技术有限公司 一种单取代peg-epo的纯化及制备方法
WO2012109387A1 (en) 2011-02-08 2012-08-16 Halozyme, Inc. Composition and lipid formulation of a hyaluronan-degrading enzyme and the use thereof for treatment of benign prostatic hyperplasia
US9993529B2 (en) 2011-06-17 2018-06-12 Halozyme, Inc. Stable formulations of a hyaluronan-degrading enzyme
EP2720713A2 (en) 2011-06-17 2014-04-23 Halozyme, Inc. Continuous subcutaneous insulin infusion methods with a hyaluronan degrading enzyme
WO2013040501A1 (en) 2011-09-16 2013-03-21 Pharmathene, Inc. Compositions and combinations of organophosphorus bioscavengers and hyaluronan-degrading enzymes, and uses thereof
WO2013063155A2 (en) 2011-10-24 2013-05-02 Halozyme, Inc. Companion diagnostic for anti-hyaluronan agent therapy and methods of use thereof
CN104244968B (zh) 2011-12-30 2017-07-25 哈洛齐梅公司 Ph20多肽变体、配制物及其应用
BR112014024848A2 (pt) 2012-04-04 2017-07-11 Halozyme Inc terapia de combinação com um agente antihialuronano e um taxano direcionamento ao tumor
WO2013157002A1 (en) 2012-04-19 2013-10-24 Prolor Biotech Inc. Long-acting oxyntomodulin variants and methods of producing same
US9278124B2 (en) 2012-10-16 2016-03-08 Halozyme, Inc. Hypoxia and hyaluronan and markers thereof for diagnosis and monitoring of diseases and conditions and related methods
EP3848386A1 (en) 2012-11-20 2021-07-14 OPKO Biologics Ltd. Method of increasing the hydrodynamic volume of polypeptides by attaching to gonadotrophin carboxy terminal peptides
ES2730690T3 (es) 2012-12-07 2019-11-12 Suppremol Gmbh Estratificación y tratamiento de pacientes que padecen púrpura trombocitopénica idiopática
TW201534726A (zh) 2013-07-03 2015-09-16 Halozyme Inc 熱穩定ｐｈ２０玻尿酸酶變異體及其用途
US10711106B2 (en) 2013-07-25 2020-07-14 The University Of Chicago High aspect ratio nanofibril materials
US20150158926A1 (en) 2013-10-21 2015-06-11 Opko Biologics, Ltd. Long-acting polypeptides and methods of producing and administering same
EP3186281B1 (en) 2014-08-28 2019-04-10 Halozyme, Inc. Combination therapy with a hyaluronan-degrading enzyme and an immune checkpoint inhibitor
JP6625627B2 (ja) 2014-10-14 2019-12-25 ハロザイム インコーポレイテッド アデノシンデアミナーゼ−２（ａｄａ２）、その変異体の組成物およびそれを使用する方法
PT3220892T (pt) 2014-11-21 2021-11-05 Ascendis Pharma Endocrinology Div A/S Formas de dosagem de hormona do crescimento de longa ação
US10960058B2 (en) 2015-06-19 2021-03-30 Opko Biologics Ltd. Long-acting coagulation factors and methods of producing same
TWI770010B (zh) 2016-03-07 2022-07-11 南韓商韓美藥品股份有限公司 聚乙二醇衍生物及其用途
CN105820232B (zh) * 2016-04-08 2019-05-17 昂德生物药业有限公司 单修饰聚乙二醇重组人促红素的制备方法及其制品和应用
HUE064463T2 (hu) 2016-07-11 2024-03-28 Opko Biologics Ltd Hosszantartó hatású VII. koagulációs faktor és az elõállítására vonatkozó eljárások
SG11201811553UA (en) * 2016-07-15 2019-01-30 Hoffmann La Roche Method for purifying pegylated erythropoietin
WO2018132768A1 (en) 2017-01-13 2018-07-19 Sanna Pietro P Methods and compositions for treating hpa hyperactivity
KR102268647B1 (ko) 2017-06-12 2021-06-23 한국코러스 주식회사 안정성이 향상된 에리스로포이에틴 조성물 및 이의 제조방법
CA3067851C (en) 2017-06-22 2023-01-31 Catalyst Biosciences, Inc. Modified membrane type serine protease 1 (mtsp-1) polypeptides and methods of use
ES2909454T3 (es) * 2017-12-29 2022-05-06 Hoffmann La Roche Procedimiento para proporcionar una composición de proteína PEGilada
US20190351031A1 (en) 2018-05-16 2019-11-21 Halozyme, Inc. Methods of selecting subjects for combination cancer therapy with a polymer-conjugated soluble ph20
BR112021012601A2 (pt) 2018-12-28 2021-11-30 Catalyst Biosciences Inc Polipeptídeos ativadores de plasminogênio do tipo uroquinase modificados e métodos de uso
US11613744B2 (en) 2018-12-28 2023-03-28 Vertex Pharmaceuticals Incorporated Modified urokinase-type plasminogen activator polypeptides and methods of use
CN111375068B (zh) * 2018-12-29 2024-04-16 江苏豪森药业集团有限公司 聚乙二醇化多肽药物的制备方法
WO2020203626A1 (ja) * 2019-03-29 2020-10-08 日油株式会社 分岐型分解性ポリエチレングリコール結合体
EP4219537A1 (en) * 2020-09-22 2023-08-02 Jecho Laboratories, Inc. Glycosylation-modified erythopoietin and use thereof

Family Cites Families (24)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR850004274A (ko) 1983-12-13 1985-07-11 원본미기재 에리트로포이에틴의 제조방법
US4677195A (en) 1985-01-11 1987-06-30 Genetics Institute, Inc. Method for the purification of erythropoietin and erythropoietin compositions
DE3787805T2 (de) 1986-08-04 1994-02-10 Garvan Inst Med Res Serumfreies gewebekulturmedium, das ein polymerzellenschutzmittel enthält.
US4954437A (en) 1986-09-15 1990-09-04 Integrated Genetics, Inc. Cell encoding recombinant human erythropoietin
EP0343635B1 (en) 1988-05-25 1994-08-24 Teijin Limited Process for continuously culturing adherent animal cells
US6225449B1 (en) * 1991-10-04 2001-05-01 Washington University Hormone analogs with multiple CTP extensions
DE3924705A1 (de) 1989-07-26 1991-01-31 Boehringer Mannheim Gmbh Heterobifunktionelle verbindungen
GB9022545D0 (en) 1990-10-17 1990-11-28 Wellcome Found Culture medium
US5595732A (en) 1991-03-25 1997-01-21 Hoffmann-La Roche Inc. Polyethylene-protein conjugates
US5674534A (en) 1992-06-11 1997-10-07 Alkermes, Inc. Composition for sustained release of non-aggregated erythropoietin
US5382657A (en) 1992-08-26 1995-01-17 Hoffmann-La Roche Inc. Peg-interferon conjugates
NZ250375A (en) * 1992-12-09 1995-07-26 Ortho Pharma Corp Peg hydrazone and peg oxime linkage forming reagents and protein derivatives
US5359030A (en) 1993-05-10 1994-10-25 Protein Delivery, Inc. Conjugation-stabilized polypeptide compositions, therapeutic delivery and diagnostic formulations comprising same, and method of making and using the same
WO1994028024A1 (en) * 1993-06-01 1994-12-08 Enzon, Inc. Carbohydrate-modified polymer conjugates with erythropoietic activity
ZA946122B (en) 1993-08-17 1995-03-20 Amgen Inc Erythropoietin analogs
US5919455A (en) 1993-10-27 1999-07-06 Enzon, Inc. Non-antigenic branched polymer conjugates
US5643575A (en) 1993-10-27 1997-07-01 Enzon, Inc. Non-antigenic branched polymer conjugates
WO1995013090A1 (en) 1993-11-10 1995-05-18 Enzon, Inc. Improved interferon polymer conjugates
DE69534676T2 (de) 1994-02-08 2006-08-17 Amgen Inc., Thousand Oaks Orale Verabreichung von chemisch modifizierten Proteinen
US5919758A (en) * 1994-03-22 1999-07-06 Beth Israel Deaconess Medical Center Modified polypeptides with altered biological activity
US5932462A (en) 1995-01-10 1999-08-03 Shearwater Polymers, Inc. Multiarmed, monofunctional, polymer for coupling to molecules and surfaces
DE741187T1 (de) 1995-05-05 1997-04-30 Hoffmann La Roche Rekombinante Obesitäts-(OB)-Proteine
IL118201A (en) 1995-05-11 2004-12-15 Roche Diagnostics Gmbh Preparation comprising a protein with human erythropoietin activity which is free of serum and non-recombinant mammalian protein and process for the preparation thereof
US6025324A (en) 1996-05-15 2000-02-15 Hoffmann-La Roche Inc. Pegylated obese (ob) protein compositions

Also Published As

Publication number Publication date
CN1194014C (zh) 2005-03-23
MY126776A (en) 2006-10-31
BRPI0012138B1 (pt) 2015-09-15
JP4190184B2 (ja) 2008-12-03
DE60011087T2 (de) 2005-06-16
RS50117B (sr) 2009-03-25
PE20010288A1 (es) 2001-03-07
KR20020026514A (ko) 2002-04-10
HRP20010966A2 (en) 2005-02-28
IL146956A (en) 2006-10-31
NZ516170A (en) 2004-02-27
TR200103782T2 (tr) 2002-05-21
AR024879A1 (es) 2002-10-30
PL356065A1 (en) 2004-06-14
US6340742B1 (en) 2002-01-22
HRP20010966B1 (en) 2006-02-28
AU768452B2 (en) 2003-12-11
CO5180621A1 (es) 2002-07-30
CA2378533C (en) 2006-02-14
JO2291B1 (en) 2005-09-12
HK1047597A1 (en) 2003-02-28
KR100510624B1 (ko) 2005-08-31
TWI266637B (en) 2006-11-21
YU89901A (sh) 2004-05-12
IL146956A0 (en) 2002-08-14
AU6429900A (en) 2001-01-22
BR0012138A (pt) 2002-05-07
EP1196443B1 (en) 2004-05-26
WO2001002017A2 (en) 2001-01-11
CN1359392A (zh) 2002-07-17
BRPI0012138B8 (pt) 2021-05-25
MXPA01012974A (es) 2002-07-30
DK1196443T3 (da) 2004-10-04
WO2001002017A3 (en) 2001-08-09
MA26806A1 (fr) 2004-12-20
DE60011087D1 (de) 2004-07-01
CZ301833B6 (cs) 2010-07-07
GC0000196A (en) 2006-03-29
PT1196443E (pt) 2004-09-30
NO20016304D0 (no) 2001-12-21
JP2003503464A (ja) 2003-01-28
NO20016304L (no) 2002-02-19
PL201754B1 (pl) 2009-05-29
HUP0201971A3 (en) 2010-01-28
EP1196443A2 (en) 2002-04-17
HUP0201971A2 (en) 2002-09-28
ES2220501T3 (es) 2004-12-16
CZ20014682A3 (cs) 2002-11-13
CA2378533A1 (en) 2001-01-11
HK1047597B (zh) 2005-08-12
ATE267840T1 (de) 2004-06-15

Similar Documents

Publication Publication Date Title
HU228478B1 (en) Erythropoietin conjugates with polyethylenglycol
KR100593143B1 (ko) 에리트로포이에틴 컨쥬게이트
AU2002233230B2 (en) Erythropoietin conjugates
CA2460489C (en) Pegylated and diglycosylated erythropoietin
EP1345628B1 (en) Conjugates of erythropoietin (epo) with polyethylene glycol (peg)
EA011390B1 (ru) Мутантные белки (мутеины) фактора роста фибробластов 21
HU230874B1 (hu) Pegilezett humán eritropoietin-fehérjét tartalmazó, szobahőmérsékleten stabil folyékony gyógyászati készítmények
EP0785950B1 (en) Keratinocyte growth factor analogs
BRPI0622128A2 (pt) conjugado de polietileno glicol-g-csf
CN104447981A (zh) 端羟基聚乙二醇化的人胰岛素及其类似物的偶联物
EP0475719A2 (en) Platelet derived growth regulating peptide