DE3787805T2

DE3787805T2 - Serumfreies gewebekulturmedium, das ein polymerzellenschutzmittel enthält.

Info

Publication number: DE3787805T2
Application number: DE87905144T
Authority: DE
Inventors: Peter Gray; Leslie Lazarus; Warwick Marsden
Original assignee: Garvan Institute of Medical Research; University of New South Wales
Current assignee: Garvan Institute of Medical Research; University of New South Wales
Priority date: 1986-08-04
Filing date: 1987-08-04
Publication date: 1994-02-10
Anticipated expiration: 2007-08-05
Also published as: JPH02500946A; WO1988000967A1; JP2520681B2; DE3787805D1; EP0318487B1; EP0318487A4; EP0318487A1

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein verbessertes Kulturmedium zur Verwendung beim Kultivieren von Säugerzellen, die ein Anhaften erfordern, unter Belüftung.
Die vorliegende Erfindung betrifft außerdem ein Verfahren zur Herstellung von Polypeptiden aus Säugerzellinien, in die eine DNA-Kodierung für das gewünschte Polypeptid eingesetzt worden ist.
Fortschritte in der Technologie des Rekombinierens von DNA haben es ermöglicht, DNA-Kodierung für ein gewünschtes Polypeptid in den Chromosomensatz von kontinuierlichen Säugerzellinien einzusetzen. Diese Zellinien haben gegenüber der Verwendung von prokariontischen Wirten wie E. coli bestimmte Vorteile. Diese Vorteile schließen die Fähigkeit, Proteine abzusondern und zu glykosylieren, und die Fähigkeit, genetisches Material in identischer Weise zu der, die in Zellen des Körpers auf tritt, zu verarbeiten, ein. Aufzuwiegen gegenüber diesen Vorteilen ist die Tatsache, daß die Verwendung von rekombinierten Säugerzellen zur Produktion von Proteinen Gewebekulturen in großtechnischem Maßstab, meistens in Antibiotika-freiem Medium, beinhaltet. Gewebekulturen erfordern eine genauere Einstellung der Umgebung und strengere Konstruktion und Betrieb der Gerätschaften, um Verunreinigung zu vermeiden, als die Zellkultur von Prokarionten. Ein weitere Nachteil bei der Verwendung von Säugerzellen ist, daß das zur Kultur dieser Zellen verwendete Medium typischerweise Serum enthält. Die Anwesenheit von Serum trägt sehr zur Komplexizität der Isolierung und Reinigung des gewünschten Polypeptidprodukts aus dem Kulturmedium bei.

Stand der Technik

Es ist möglich, in Gewebekulturen verwendete Zellen in zwei große Kategorien einzuteilen: (1) solche, die frei in Suspensionskultur wachsen, wie Hybridom-Zellen, und (2) solche, die an Oberflächen haftend wachsen. Die ersteren Zellen können frei in Suspensionskultur wachsen, wenn berücksichtigt wird, daß die Zellen keine Zellwände besitzen und daher empfindlich gegenüber Scherkräften sind. Zellen der zweiten Kategorie erfordern eine vergrößerte Oberfläche für das Zellwachstum, um den Produktionsmaßstab zu vergrößern. Verschiedene Vorrichtungen sind in der Literatur beschrieben, um diese vergrößerte Oberfläche zu liefern, einschließlich Vorrichtungen, die Wabenstrukturen aus Glas liefern, Oberflächen, die als Folien gewickelt sind, und Glaskugeln mit mehreren mm Durchmesser. Eine vollständige Rezension dieser verschiedenen in der Literatur beschriebenen Annäherungen ist in dem Schriftstück von Glacken et al, (1983), Trends in Biotechnology, Band 1, 102 bis 108 veröffentlicht.
Eine weitere Annäherung ist, kugelige Teilchen mit kleinerem Durchmesser zu verwenden, die aus einem Bereich von Materialien einschließlich vernetztem Dextran, Polystyrol oder Glas fabriziert sein können. Der Vorteil dieser Teilchen, mitunter als Mikroträger bezeichnet, ist, daß es möglich ist, sehr hohe Oberflächen pro Masseneinheit der Perlen (5 000 cm²/g) mit Teilchen mit Durchmessern in der Größenordnung von 100 bis 200 im zu erreichen. Eine Fortführung dieser Annäherung ist die Verwendung von porösen Mikroträgern, die es den Zellen ermöglichen, innen in den Perlen sowie an den äußeren Oberflächen zu wachsen. Eine weitere Möglichkeit ist, Latexperlen mit noch geringerem Durchmesser zu verwenden (in der Größenordnung von 1 im Durchmesser), um als Keimbildungsstellen für das Anheften von Zellen an diese Perlen und aneinander zu wirken. Unter bestimmten Bedingungen kann es möglich sein, die Zellen dazu zu bringen, aneinander unter Bildung von Zellagglomeraten oder Flocken zu haften. Wenn die Zellen sich erst einmal an Mikroträger oder Perlen oder Flocken geheftet haben, ist es möglich, die Zellen in Suspensionskultur zu züchten. Die Gerätschaften zum Züchten von Zellen in Suspensionskultur sind eine Routineanwendung und die Verwendung dieser Gerätschaften vermeidet das Problem der Entwicklung einer Technologie, die andere Gerätschaften wie Membranvorrichtungen verwendet. Eine der Schwierigkeiten, die allerdings beim Zellwachstum auf Mikroträgern auftreten, ist, daß bei den erreichten Zelldichten sauerstofflimitierend wirken kann. Obwohl eine solche Limitierung unter Verwendung bekannter Belüftungstechniken überwunden werden kann, kann solche Belüftung das Lösen der Zellen von ihrem Trägermedium bewirken, wenn das Kulturmedium Serum-frei ist.

Offenbarung der Erfindung

Die Erfinder haben ein neues Gewebekulturmedium entwickelt, das die Belüftung von Kulturen ermöglicht, die an einem Trägermedium haften, ohne nachfolgendes Lösen der Zellen in Abwesenheit von Serum. Zusätzlich haben die Erfinder neue Verfahren zum Kultivieren von Zellen, die ein Anhaften erfordern, entwickelt.
Die vorliegende Erfindung besteht in einem Verfahren zum Kultivieren von Säugerzellen, die ein Anhaften erfordern, umfassend die folgenden Schritte:
1. Kultivieren der Säugerzellen in einem Serum-enthaltenden Medium in einem Reaktionsgefäß, das mit einem Trägermedium ausgerüstet ist, an das die Zellen anheften werden, bis die Zellen daran anhaften und bis zur gewünschten Zell-Konzentration gezüchtet worden sind;
2. Dekantieren des Serum-enthaltenden Mediums;
3. Ersetzen des dekantierten Mediums mit einem Serum-freien Medium, das in Lösung ein nicht-toxisches Polymer enthält, das in der Lage ist, als Zell-schützendes Mittel zu wirken, indem es die Film-Entwässerung um die Zellen und das Träger-Medium herum reduziert; und
4. direktes Belüften der Kultur.
Ohne sich auf eine wissenschaftliche Theorie festlegen zu wollen, wird angenommen, daß das Polymer, das als Zell-schützendes Mittel wirkt, das Ablösen der Zellen von dem Trägermedium und die Lyse der Zellen verhindert, wenn die Zellen in Abwesenheit von Serum direkt belüftet werden, indem es einen schützenden Film um das Zellen/Träger-Agglomerat bildet. Es wird angenommen, daß dieser schützende Film um das Zellen/Träger-Agglomerat den Film des Kulturmediums, der die Zellen umgibt, daran hindert, durch Entwässerung verlorenzugehen, wenn das Zellen/- Träger-Agglomerat in Kontakt mit Luftblasen kommt. Diese Entwässerung des Kulturmediums wird als Film-Entwässerung bezeichnet.
Es wird auch angenommen, daß dieser Film eine Trennschicht schaffen kann, die die Zellen vor physikalischer Beschädigung, die durch Luftblasen verursacht wird, schützt.
Der Begriff "direkte Belüftung" wird verwendet, um die Belüftung des Kulturmediums zu beschreiben, bei dem die kultivierten Zellen Gasblasen ausgesetzt sind.
Es ist bevorzugt, daß das Polymer nicht-ionisch ist und wenig schäumt.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist das Polymer entweder Polyethylenglykol, Polyvinylpyrrolidon oder ein Polymer, das ein oder mehrere Alkylenoxide enthält. Es ist bevorzugt, daß die Alkylenoxide zwei oder drei Kohlenstoffatome enthalten. Es ist besonders bevorzugt, daß das Polymer ein Copolymer aus Propylenoxid und Ethylenoxid ist.
Gemäß einer weitere Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist das Polymer aus Alkylenoxiden in einer Konzentration von 0,1 bis 1,0% vorhanden.
Gemäß einer weiteren bevorzugte Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist das Gewebekulturmedium im wesentlichen Protein-frei.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird das Reaktionsgefäß mit Hilfe eines Filters, durch welchen Kulturmedium, aber keine Zellen durchgeleitet werden können, in einen Kultur-Bereich und einen Zell-freien Bereich aufgeteilt.
Die Belüftung des Kulturmediums kann durch Hineinperlen eines Gases in den Zell-freien Bereich des Reaktionsgefäßes durchgeführt werden. Dieses Belüftungsverfahren wird dazu führen, daß ein Teil der kultivierten Zellen Gasblasen ausgesetzt sein wird, da ein Teil der Blasen im allgemeinen die Filtereinrichtung passiert. Es wird derzeit allerdings bevorzugt, daß die Belüftung mit Hilfe eines im Reaktionsgefäß vorhandenen Airlifts durchgeführt wird.
Gemäß bevorzugten Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung sind die Säugerzellen eine kontinuierliche Zellinie, insbesondere eine Chinesische Hamster-Ovarzellinie, in die DNA- Kodierung für das gewünschte Polypeptid, insbesondere humanes Wachstumshormon (hGH), eingesetzt worden ist.
Vorzugsweise ist die für das gewünschte Polypeptid kodierende DNA unter Kontrolle eines induzierbaren Promotors, der als eine Komponente des im wesentlichen Serum-freien Mediums eingebracht wird. Außerdem ist gemäß einer bevorzugten Ausführungsform das im wesentlichen Serum-freie Medium im wesentlichen Protein-frei.
Das Durchmischen der Kultur kann unter Verwendung eines Rührgeräts wie eines Rührgeräts vom Ankertyp mit einer Geschwindigkeit, bei der die erzeugten Scherkräfte im allgemeinen niedrig sind, erreicht werden. Es können natürlich auch andere Rührgerätanordnungen verwendet werden, vorausgesetzt, daß die erzeugten Scherkräfte niedrig sind.
Gemäß einer weiteren Ausführungsform wird das im wesentlichen Serum-freie Medium kontinuierlich zugegeben und das gewünschte Polypeptid wird kontinuierlich entfernt.
Um die Beschaffenheit der Erfindung besser zu verstehen, werden deren bevorzugte Ausführungsformen nachher durch Beispiele beschrieben, unter Bezugnahme auf die angefügte Zeichnung, die eine Darstellung eines Reaktorsystems zeigt, bei der die Belüftung mittels eines in dem Reaktionsgefäß vorhandenen Airlifts durchgeführt wird.

Beispiel 1

Eine Chinesische Hamster-Ovarzellinie (CHO) wurde mit DNA- Kodierung für humanes Wachstumshormon transfiziert, der an eine starke regulierbare Promoter/Verstärkersequenz gebunden war. Weitere Einzelheiten der genetischen Konstruktion sind in WO 86/04920 angegeben.
Die Zellen wurden in Ampullen in flüssigem Stickstoff gelagert und durch Züchten in entweder Roux-Kolben oder Walzenflaschen zur ursprünglichen Form zurückgeführt. Die Zellen wurden unter Verwendung von EDTA geerntet, in PBS gewaschen und mit vorbehandelten Mikroträgern kontaktiert. Die Mikroträger basierten entweder auf Dextran (Cytodex 1 und 2, Pharmacia) oder auf Polystyrol (Biosilan, Nunc). Keimbildungsdichten von 6 bis 10 Zellen pro Träger wurden als geeignet befunden und führten dazu, daß die Zellen sich anhefteten und mit minimaler Verzögerung und Verdoppelungszeiten von ungefähr 18 Stunden wuchsen. Das Medium war ein synthetisches Medium, das 5 oder 10% FCS enthielt. Um die notwendige Anzahl von Zellen aufzubauen, um Gefäße im Großmaßstab zu beimpfen, war es möglich, frische Mikroträger zu Populationen von zusammenfließenden Mikroträgern zu geben, und eine Besiedlung der frischen Träger trat auf. Das gewünschte Impfmittel aus Mikroträgern wurde in die in Fig. 1 gezeigte Anordnung des Fermenters überführt.
Dieses Beispiel macht sich das Airlift-Prinzip zunutze, bei dem eine Gasphase verwendet wird, um das Mischen unter niedriger Scherung zu fördern sowie die Gasphase für den Massentransfer zu liefern. Eine Gasphase wird am Boden eines Abschnitts des Reaktors eingeleitet (der Steigrohrabschnitt), der am oberen Ende des Reaktors mit dem Fallrohrabschnitt verbunden ist. Das Einbringen der Gasphase in den Steigrohrabschnitt erniedrigt die Dichte in diesem Abschnitt, was zu der entlüfteten Kultur mit höherer Dichte in dem Fallrohr führt, die die Kultur mit niedriger Dichte ersetzt und so eine gelinde Durchmischung in dem Reaktor fördert. Es ist möglich, die Fallrohr- und Steigrohrabschnitte in mehreren Reaktorkonfigurationen zu verbinden. Eine Konfiguration mit dem Steigrohr als konzentrischem Rohr 14 innen in einem zylindrischen Reaktionsgefäß 15 ist in der Zeichnung gezeigt. Diese Konfiguration ist zuvor zur Züchtung von Hybridom-Zellen verwendet worden. Es ist gezeigt worden, daß es möglich ist, die Anordnung zur Züchtung und Produktbildung durch CHO-Zellen, die an Mikroträger geheftet sind, mit Gasgeschwindigkeiten, die so niedrig wie 0,02 VVM sind, zu verwenden. Die verwendete Gasphase ist hauptsächlich Luft, die unter Verwendung der üblichen Steuerungsverfahren mit Kohlendioxid oder Ammoniak versehen werden kann, um den pH-Wert der Kultur aufrechtzuerhalten. Wenn erforderlich kann der Gasphase auch Sauerstoff zugesetzt werden, um das gewünschte Niveau von gelöstem Sauerstoff aufrechtzuerhalten, ohne übermäßig hohe Begasungsraten zu verwenden. Bei den in dieser Arbeit verwendeten niedrigen Begasungsraten sind die Probleme durch Schaumbildung minimal, wenn allerdings in den Anfangsstadien Schaumbildung auftritt, z. B. wenn die Zellen in Serum-haltigen Medium gezüchtet werden, ist es möglich, dies mit einer abgemessenen Zugabe (unter Verwendung eines Leitfähigkeitssensors oder zeitgesteuerter Zugabe) von Antischaummittel auf Silikonbasis zu regulieren, z. B. antifoam C oder anderen Antischaummitteln, wenn sie das Zellwachstum oder die Produktbildung nicht stören. Wenn die Wachstumsphase erst einmal eingetreten ist und die Mikroträgerperlen zusammenfließend sind, werden die Zellen unter Verwendung eines Siebes aus rostfreiem Stahl, um die Mikroträger zu erhalten, in einem Volumen PBS gewaschen. Der Reaktor wird dann für die Herstellung von humanem Wachstumshormon (hGH) mit im wesentlichen Serum-freien Medium gefüllt, das ein Copolymer aus Propylenoxid und Ethylenoxid (Pluriol PE 6800) enthält. Dieses Medium bestand aus dem folgenden:
Anorganische Salze mg/l
CaCl&sub2; (wasserfrei) 162,15
CuSO&sub4;·5 H&sub2;O 0,0013
Fe(NO&sub3;)&sub3;·9H&sub2;O 0,05
FeSO&sub4;·7 H&sub2;O 0,417
KCl 352,5
KH&sub2;PO&sub4; 30,62
MgCl&sub2; (wasserfrei) 23,33
MgSO&sub4; (wasserfrei) 61,48
NaCl 6958,5
NaHCO&sub3; 1338
NaH&sub2;PO&sub4; (H&sub2;O) 62,5
ZnSO&sub4;·7 H&sub2;O 0,432
Na&sub2;HPO&sub4;·7 H&sub2;O 125
AMINOSÄUREN
L-Alanin 9,0
L-Asparagin·H&sub2;O 15,0
L-Arginin·HCl 253,0
L-Asparaginsäure 13,0
L-Cystein·HCl·H&sub2;O 35,13
L-Cystein·2 HCl 31,29
L-Glutarninsäure 15,00
L-Glutaniin 438,0
Glycin 23,0
L-Histidin·HCl·H&sub2;O 42,0
L-Isoleucin 56,4
L-Leucin 65,6
L-Lysin·HCl 109,5
L-Methionin 19,5
L-Phenylalanin 38,0
L-Prolin 35,0
L-Serin 31,5
L-Threonin 59,4
L-Tryphtophan 10,0
L-Tyrosin (Di-Natriumsalz) 59,83
L-Valin 58,7
VITAMINE
Ascorbinsäure 7,5
Biotin 0,0037
D-Calciumpantothenat 2,119
Cholinchiorid 8,98
Folsäure 2,66
i-Inosit 12,61
Nikotinamid 2,02
Pyridoxal·HCl 2,03
Riboflavin 0,22
Thiamin·HCl 2,169
Vitamin B&sub1;&sub2; 0,68
ANDERE KOMPONENTEN
D-Glukose 3151
HEPES 3570
Natriumpyruvat 110
Hypoxanthin (Di-Natriumsalz) 2,7
Linolsäure 0,045
Putrecin·2 HCl 0,081
Thioctinsäure (Liponsäure) 0,103
Thymidin 0,35
Pluriol PE 6800 2000.
Mit einer Zellenkonzentration von 10&sup7; Zellen/ml war es möglich, den Reaktor kontinuierlich zu betreiben und einen Produktstrom mit einer Verdünnungsrate von 0,15 Std&supmin;¹ und einer hGC-Konzentration von 80 mg/l herzustellen. Der Reaktor kann auch mit chargenweiser Zufuhr oder wiederholter chargenweiser Zufuhr betrieben werden, wobei ein Teil oder der gesamte Inhalt über das Sieb aus rostfreiem Stahl aus dem Reaktor entnommen und durch frisches Medium entweder in chargenweiser oder kontinuierlicher Weise ersetzt werden kann. Unter Verwendung dieser Technik war es möglich, Produktströme mit hGH-Konzentrationen von bis zu 250 mg/l zu erhalten.
In diesem Beispiel ist es möglich, ein Gas direkt in das Kulturmedium zu leiten, da das Medium die ungiftige, wenig schäumende, nicht-ionische Verbindung Pluriol PE 6800 enthält. Diese Verbindung wird durch die Copolymerisation von Propylenoxid und Ethylenoxid erhalten. Die Anwesenheit dieser Verbindung in dem Kulturmedium ermöglicht die Belüftung, ohne zu verursachen, daß die Zellen sich von dem Trägermedium lösen.

Claims

1. Verfahren zum Kultivieren von Säugerzellen, die ein Anhaften erfordern, umfassend die folgenden Schritte:

1. Kultivieren der Säugerzellen in einem Serum-enthaltenden Medium in einem Reaktionsgefäß, das mit einem Trägermedium ausgerüstet ist, an das die Zellen anheften werden, bis die Zellen daran anhaften und bis zur gewünschten Zell-Konzentration gezüchtet worden sind;

2. Dekantieren des Serum-enthaltenden Mediums;

3. Ersetzen des dekantierten Mediums mit einem Serum-freien Medium, das in Lösung ein nicht-toxisches Polymer enthält, das die Film-Entwässerung um die Zellen und das Träger-Medium herum reduziert; und

4. direktes Belüften der Kultur.

2. Verfahren nach Anspruch 1, bei dem das in dem Serum-freien Medium vorhandene nicht-toxische Polymer aus der Gruppe bestehend aus Polyethylenglykol und Polyvinylpyrrolidon ausgewählt ist.

3. Verfahren nach Anspruch 1, bei dem das in dem Serum-freien Medium vorhandene nicht-toxische Polymer ein Polymer ist, das eine oder mehrere Alkylenoxide enthält.

4. Verfahren nach Anspruch 3, bei dem das Alkylenoxid 2 oder 3 Kohlenstoffatome enthält.

5. Verfahren nach Anspruch 4, bei dem das Polymer ein Copolymer aus Propylenoxid und Ethylenoxid ist.

6. Verfahren nach Anspruch 3, bei dem das Polymer der Alkylenoxide im Medium in einer Konzentration von 0,1 bis 1,0 Gew.-% vorhanden ist.

7. Verfahren nach irgendeinem der vorhergehenden Ansprüche, bei dem das Reaktionsgefäß in einen Kultur-Bereich und einen Zell-freien Bereich aufgeteilt wird, wobei der Kultur-Bereich von dem Zell-freien Bereich mit Hilfe eines Filters abgetrennt wird, durch welches Kulturmedium aber keine Zellen durchgeleitet werden kann.

8. Verfahren nach Anspruch 7, bei dem die Belüftung der Kultur durch Hineinperlen eines Gases in den Zell-freien Bereich des Reaktionsgefäßes durchgeführt wird.

9. Verfahren nach irgendeinem der vorhergehenden Ansprüche, bei dem die Belüftung mit Hilfe eines im Reaktionsgefäß vorhandenen Airlifts durchgeführt wird.

10. Verfahren nach irgendeinem der vorhergehenden Ansprüche, bei dem die Säugerzelle gentechnisch verändert wurde, um eine für ein Polypeptid kodierende DNA zu enthalten, damit das Wachstum der Zellen zu einer Produktion des Polypeptids führt.

11. Verfahren nach Anspruch 10, bei dem das Polypeptid aus dem kontinuierlich aus dem Reaktionsgefäß entfernten Kulturmedium gewonnen wird und Serum-freies Medium kontinuierlich dem Reaktionsgefäß zugegeben wird.

12. Verfahren nach Anspruch 10, bei dem, wenn von Anspruch 7

oder Anspruch 8 abhängig, das Polypeptid aus dem Kulturmedium gewonnen und gereinigt wird, das aus dem Zell-freien Bereich des Reaktionsgefäßes entnommen wird.

13. Verfahren nach irgendeinem der Ansprüche 10 bis 12, bei dem die für das Polypeptid kodierende DNA unter Kontrolle eines induzierbaren Promotors ist, wobei der Promotor durch eine Komponente des Serum-freien Mediums induziert wird.

14. Verfahren nach irgendeinem der Ansprüche 10 bis 13, bei dem die Säugerzellen eine kontinuierliche Zellinie sind.

15. Verfahren nach Anspruch 14, bei dem die kontinuierliche Zellinie eine Chinesische Hamster-Ovarzellinie ist.

16. Verfahren nach irgendeinem der Ansprüche 10 bis 15, bei dem das Polypeptid ein humanes Wachstumshormon ist.

17. Verfahren nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 16, bei dem das Serum-freie Medium ferner Protein-frei ist.