CN115125180B - 一种利用双途径产乙偶姻的重组运动发酵单胞菌及其构建方法与应用 - Google Patents

一种利用双途径产乙偶姻的重组运动发酵单胞菌及其构建方法与应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种利用双途径产乙偶姻的重组运动发酵单胞菌及其构建方法与应用，在运动发酵单胞菌中建立乙偶姻生产途径。丙酮酸在乙酰乳酸合成酶ALS、α‑乙酰乳酸脱羧酶ALDC的催化下生成乙偶姻，同时乙醛在甲醛裂合酶FLS的作用下合成乙偶姻。通过将上述酶构建至运动发酵单胞菌中，能够简洁快速的实现乙偶姻的生物合成。而且运动发酵单胞菌属于安全微生物，对发酵设备无特殊要求，具有广泛应用前景。

Description

一种利用双途径产乙偶姻的重组运动发酵单胞菌及其构建方 法与应用
技术领域
本发明涉及基因工程和发酵工程领域，更确切的说，本发明涉及异源生物合成乙偶姻的代谢途径，即一种能双途径产乙偶姻的重组运动发酵单胞菌及其构建方法与应用。
背景技术
乙偶姻(acetoin)又名甲基乙酰甲醇，是一种重要的香精香料物质，具有强烈的奶油、脂肪、白脱样香气，高度稀释后会有令人愉悦的奶香气。国家标准GB2760-1986规定为可以使用的食品香料，美国食品香料和FEMA安全号为2008，国内外常将其用作各种食品的香味增强剂以及配置奶香型、肉香型、草莓香型的香精[1]。作为美国能源部30种优先开发利用的平台化合物之一，乙偶姻广泛应用于食品、烟草、化妆品、植物、医药和化工领域[2]。乙偶姻的制备可以通过从含乙偶姻的植物中提取以及化学合成法和酶转化法[3]。由于能源和环境的恶化以及化学合成的乙偶姻作为食品添加剂存在健康隐患，因此化学合成法不能满足人们的需求；而酶催化法和植物提取仍然无法克服成本高昂的缺点，因此也不能应用于工业化生产。
运动发酵单胞菌(Zymomonas mobilis)是一种天然生产乙醇的兼性厌氧革兰氏阴性菌，由Barker和Hmer从变质的苹果酒中分离出来。具有生长速度快，糖利用率高，高酒精耐受性，适应广泛的pH范围(pH3.5-7.5)。作为GRAS微生物，其优良的菌株特性和代谢途径，以及通过对它遗传元件的研究和遗传操作的开发，使其在生物合成上有着广泛的应用，除了生产乙醇外，还用于生产其他高附加值产品，例如异丁醇、2,3-丁二醇、果聚糖、甘油、乙烯、丁二酸和琥珀酸等。目前还没有文献报道以运动发酵单胞菌为底盘菌株生产目标产物乙偶姻，本发明构建了乙偶姻合成途径，实现了在运动发酵单胞菌中高产乙偶姻[4-5]。
参考文献：
[1]Xiao Z,Lu JR.Generation of acetoin and its derivatives in foods.JAgric Food Chem.2014,16；62(28):6487-97.
[2]Gao C,Zhang L J,Xie Y J,etal.Production of(3S)-acetion fromdiacetyl by using stereoselective NADPH-dependent carbonyl reductase andglucose dehydrogenase[J].Bioresour Technol,2013,137:111-115
[3]Ji X J,Xia Z F,Fu N H,et al.Cofactor engineering throughheterologous expression of an NADH oxidase and its impact on metabolic fluxredistribution in Klebsiella pneumonia[J].Biotechnology for biofuels,2013,6(1):7.
[4]Yang S,Mohagheghi A,Franden MA,Chou YC,Chen X,Dowe N,Himmel ME,Zhang M.Metabolic engineering of Zymomonas mobilis for 2,3-butanediolproduction from lignocellulosic biomass sugars.Biotechnol Biofuels.2016Sep2；9(1):189.
[5]Liu Y,Ghosh IN,Martien J,Zhang Y,Amador-Noguez D,LandickR.Regulated redirection of central carbon flux enhances anaerobic productionof bioproducts in Zymomonas mobilis.Metab Eng.2020Sep；61:261-274.
发明内容
为了解决现有技术中存在的问题，本发明提供一种利用双途径产乙偶姻的重组运动发酵单胞菌及其构建方法与应用，解决现有技术中乙偶姻生产存在健康隐患，或者成本高昂不能应用于工业化生产的问题。
本发明的技术方案概述如下：
一种利用双途径产乙偶姻的重组运动发酵单胞菌，同时含有甲醛裂合酶基因L482S和乙酰乳酸合成酶ALS和α-乙酰乳酸脱羧酶ALDC基因的表达载体；宿主菌为运动发酵单胞菌。
所述甲醛裂合酶基因L482S的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO.1所示，乙酰乳酸合成酶ALS和α-乙酰乳酸脱羧酶ALDC基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
所述表达载体为pEZ15Asp、pHW20a、pZA22。
重组运动发酵单胞菌的构建方法，将乙酰乳酸合成酶ALS、α-乙酰乳酸脱羧酶ALDC基因和甲醛裂合酶基因L482S连接至重组表达载体后，转入运动发酵单胞菌宿主细胞，获得重组运动发酵单胞菌；或将乙酰乳酸合成酶ALS、α-乙酰乳酸脱羧酶ALDC基因和甲醛裂合酶基因L482S通过分子生物学技术整合至宿主细胞的基因组，获得重组运动发酵单胞菌。
作为优选，在获得重组发酵单胞菌中敲除生产菌株中的竞争代谢途径乙醇脱氢酶基因adhB、乳酸脱氢酶基因ldhA、丙酮酸甲酸裂解酶基因pfl、葡萄糖-果糖氧化还原酶基因gfo、柠檬酸裂合酶cl和过氧化氢酶cat，获得工程菌株。
所述的重组运动发酵单胞菌在生产乙偶姻中的应用。
一种重组运动发酵单胞菌生产乙偶姻的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)制备权利要求1所述重组运动发酵单胞菌；
(2)发酵培养所述重组运动发酵单胞菌，发酵液中得到乙偶姻。
所述发酵培养是指按照初始接种密度为OD600＝0.05-0.45将工程菌接种于发酵培养基，培养温度为27-33℃，并在100-200rpm的摇床速度下以及10g/L-100g/L葡萄糖浓度下的条件下发酵。
有益效果：本发明选择来源于细菌的外源酶，选用改造过的细菌作为宿主细胞，最终实现了乙偶姻的生产。本发明在运动发酵单胞菌中建立乙偶姻生产途径：乙醛在甲醛裂合酶(L482S)的作用下转化为乙偶姻以及丙酮酸在乙酰乳酸合成酶ALS、α-乙酰乳酸脱羧酶ALDC的催化下生成乙偶姻。通过将上述酶构建至运动发酵单胞菌中，能够简洁快速的实现乙偶姻的生物合成。而且运动发酵单胞菌属于安全微生物，对发酵设备无特殊要求，具有广泛应用前景。本发明选择了催化效率较高的酶在运动发酵单胞菌CP4中表达，人工设计了新的乙偶姻的合成途径，获得重组菌株，优化发酵条件，实现乙偶姻在重组菌株中的生产，为乙偶姻的生物合成提供了新思路。
附图说明
图1双途径中乙偶姻合成代谢图；
图2双途径菌株的乙偶姻生产、糖耗和生长评价；A：乙偶姻生产柱形图；B：糖耗和生长评价曲线图,空心图标为菌株生长，实心图标为对应的葡萄糖消耗；
图3双途径重组菌株CP4Δcl:L482S(pPzwfsPgapc)、Δ4:L482S(pPzwfsPgapc)、CP4Δcl:alssD(pPtufL)和Δ4:alssD(pPtufL)的乙偶姻生产；
图4菌株Δ4:L482S(pPzwfsPgapc)补料发酵生产乙偶姻。
具体实施方式
乙酰乳酸合成酶和α-乙酰乳酸脱羧酶基因：als和aldC基因组成alssD操纵子甲醛裂合酶基因：L482S
大肠杆菌DH5α感受态(博迈德公司)
运动发酵单胞菌(Zymomonas mobilis)
表达载体为：pEZ15Asp(pE)
下面通过实施例来详细阐明本发明。但本发明并不限于以下实施例。
实施例1构建含有alssD途径和乙醛途径的重组质粒
用引物alssD-L482SF如序列表中SEQ ID NO.3、alssD-L482SR如序列表中SEQ IDNO.4，以质粒pE-Ptuf-L482S为模板，使用高保真酶Phanta Max Super-Fidelity DNAPolymerase扩增Ptuf-L482S表达盒。在200μL的PCR管中配制50μL反应体系：25μL的FastPfu DNAPolymerase(全式金)，2μL的上游引物alssD-SLF，2μL的上游引物alssD-SRR，1μL的dNTP Mix，1μL的Phanta Max Super-Fidelity DNAPolymerase，和17μL无菌水。PCR反应热循环程序为95℃预变性3min，95℃变性15s，50℃退火15s，72℃延伸3min，终延伸5min。使用NEB公司的BamH I-HF限制性内切酶酶切pE-Pzwf-als-Pgap-aldC载体获得线性化质粒，电泳后用天根公司的琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒回收目标载体片段。使用即用型无缝克隆试剂盒(生工生物工程公司)将片段和载体连接，在冰盒上按照表1连接体系添加各组分：
表1
将Ptuf-L482S表达盒的DNA片段和线性化的pE-Pzwf-alssD、pE-Ptuf-alssD和pE-Pzwf-als-Pgap-aldC质粒按照2:1的摩尔比进行混合，将装有目的片段和线性化质粒的反应溶液在50℃下反应20min即可完成连接。取5μl反应后的溶液转化至DH5α感受态细胞，复苏1h后，涂布在含有100μg/mL壮观霉素的LB平板上，在37℃的培养箱中放置12-16h。挑取平板上的转化子进行菌落PCR鉴定，在200μL的PCR管中配制15μL反应体系，包括：7.5μL的2×Rapid Taq Master Mix(Vazyme)，0.5μL的上游引物pEZ-F(SEQ ID NO.5)，0.5μL的上游引物pEZ-R(SEQ ID NO.6)和6.5μL无菌水。PCR反应热循环程序为95℃变性30s，50℃退火30s，72℃延伸2min。获得重组质粒pE-Pzwf-alssD-Ptuf-L482S(pPzwfscPtufL)、pE-Ptuf-alssD-Ptuf-L482S(pPtufscPtufL)和pE-Pzwf-als-Pgap-aldC-Ptuf-L482S(pPzwfsPgapcPtufL)质粒送测序。
实施例2敲除副产物基因的乙偶姻合成重组菌的的构建
运动发酵单胞菌通过合成乙偶姻时以丙酮酸作为前体，而在生长代谢过程中丙酮酸也作为其它化合物(乙醇、乙酰辅酶A、乳酸、苹果酸、甲酸等)的前体被利用。这些代谢途径均能够消耗前体物丙酮酸，导致流向目标产物的碳流减少，本研究利用IF-CRISPR基因编辑技术敲除副产物基因，敲除了部分副产物基因，减少副产物的合成，使更多的丙酮酸用于目的产物乙偶姻的合成。分别敲除了编码乳酸脱氢酶基因ldhA以抑制乳酸的合成，敲除编码葡萄糖-果糖氧化还原酶基因gfo以抑制山梨醇的合成，敲除编码丙酮酸甲酸裂解酶基因pfl以抑制甲酸的合成，敲除编码柠檬酸裂合酶基因cl以抑制乙酸的合成，编码乙醇脱氢酶的基因adhB。
利用运动发酵单胞菌内源的IF型CRISPR***敲除ldhA基因。ldhA基因的N32设计在5'-CCC-3'PAM(protospacer adjacent motifs,PAM)之后的32个碱基。合成单链的ldhAN32-F和ldhAN32-R如序列表中SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8。将这含有这两个DNA片段的溶液等体积混合，在PCR仪器中95℃反应5min，然后冷却至室温，即可获得带有粘性末端的N32双链DNA片段。以pEH为出发质粒，使用Bsa I限制性内切酶单切该质粒产生粘性末端，将上述获得带有粘性末端的N32双链DNA片段通过T4 DNA连接酶(Thermo Scientific)连接至该质粒，获得质粒pEH-ldhA。
以CP4基因组为模板，使用引物UF-ldhA-F(SEQ ID NO.9)和UF-ldhA-R(SEQ IDNO.10)扩增ldhA基因ORF框的上游片段作为左同源臂，使用引物DF-ldhA-F(SEQ ID NO.11)和DF-ldhA-R(SEQ ID NO.12)扩增ldhA基因ORF框的下游片段作为右同源臂。以上述构建的pEH质粒为出发质粒，使用限制性内切酶EcoR I和Xba I酶切该质粒，使用即用型无缝克隆试剂盒(生工生物工程公司)将上下游同源臂片段连接至载体pEH-ldhA，获得打靶质粒pET-ldhA。
按照上述构建步骤分别构建adhB、gfo、cat、pfl和cl基因的打靶质粒，获得质粒pET-adhB、pET-gfo、pET-cat、pET-pfl和pET-cl。取5μl pET-ldhA、pET-adhB、pET-gfo、pET-cat、pET-pfl和pET-cl质粒(约150ng)分别与50μl CP4感受态细胞混匀，按照实施例2中的方法进行电穿孔转化，在30℃下静置复苏10h。取200μL菌液涂布到含有壮观霉素(100μg/mL)的平板上，30℃倒置培养直至转化子出现。挑取平板上的转化子进行菌落PCR鉴定，在200μL的PCR管内配制15μL反应体系，包括：7.5μL的2×Rapid Taq Master Mix(Vazyme)，0.5μL的上游引物，0.5μL的下游引物和6.5μL无菌水。鉴定ldhA基因的使用的上游引物为ldhA-F(SEQ ID NO.13)，下游引物为ldhA-R(SEQ ID NO.14)；鉴定gfo基因的上游引物为gfo-F(SEQ ID NO.15)，下游引物为gfo-R(SEQ ID NO.16)；鉴定adhB基因的上游引物为adhB-F(SEQ ID NO.17)，下游引物为adhB-R(SEQ ID NO.18)；鉴定cl基因的上游引物为cl-F(SEQ ID NO.19)，下游引物为cl-R(SEQ ID NO.20)；鉴定cat基因的上游引物为cat-F(SEQID NO.21)，下游引物为cat-R(SEQ ID NO.22)；鉴定pfl基因的上游引物为pfl-F(SEQ IDNO.23)，下游引物为pfl-R(SEQ ID NO.24)；PCR反应热循环程序为95℃变性30s，52℃退火30s，72℃延伸2min。经PCR鉴定获得阳性克隆，获得单基因缺失菌株分别命名为工程菌株CP4ΔldhA、CP4ΔadhB、CP4Δpfl、CP4Δcl、CP4Δgfo和CP4Δcat。
将ldhA基因的打靶质粒pET-ldhA转化至CP4ΔadhB感受态中，按照实施例2中的方法进行电穿孔转化，在30℃下静置复苏10h。取200μL菌液涂布到含有壮观霉素(100μg/mL)的平板上，30℃倒置培养直至转化子出现。挑取平板上的转化子，按照实施例10中所述的单基因缺失菌株鉴定方法进行菌落PCR鉴定。经PCR鉴定获得阳性克隆，获得adhB和ldhA基因共同缺失的菌株命名为工程菌株Δ2。
按照上述方法将打靶质粒pET-gfo转化至Δ2感受态中，获得adhB、ldhA和gfo基因同时缺失的菌株命名为工程菌株Δ3。按照上述方法将打靶质粒pET-cl转化至Δ3感受态中，获得adhB、ldhA、gfo和cl基因共同缺失的菌株命名为工程菌株Δ4。按照上述方法将打靶质粒pET-pfl转化至Δ4感受态中，获得adhB、ldhA、gfo、cl和pfl基因共同缺失的菌株命名为工程菌株Δ5。按照上述方法将打靶质粒pET-cat转化至Δ5感受态中，获得adhB、ldhA、gfo、cl、pfl和cat基因共同缺失的菌株命名为工程菌株Δ6。
实施例3构建含有双途径重组菌株发酵生产乙偶姻
取甘油菌CP4、Δ4和Δ6活化，当生长至OD600＝2.5-2.6按约1/25的体积比转接于40ml RM培养基中，30℃静置培养至OD600＝0.3-0.4。将40ml菌液转移至在4℃遇冷的50ml离心管中，冰浴10min，在4℃下1500g(3555rpm/min)离心10min，倒掉上清，将离心管倒置在灭菌的吸水纸上使管壁上残留的液体流尽。细胞沉淀先用20ml冰浴的无菌水洗涤1次，在4℃下1500g(3555rpm/min)离心10min，倒掉上清。然后用20ml冰浴的10％甘油重悬细胞沉淀两次，离心操作同上。用400μl冰冷的10％甘油重悬细胞，然后按100μl/管分装到遇冷的1.5mlEP管中，用于转化。
取pPzwfscPtufL、pPtufscPtufL和pPzwfsPgapcPtufL质粒5μl(约150ng)分别与50μl运动发酵单胞菌CP4、Δ4和Δ6感受态细胞混匀，转移到4℃(也可以是0-4℃中的任意温度)预冷的电极杯中，冰浴5min，电压1800V，用eppendorf公司的电转仪进行电击，电击5ms，电击后立即加入500μL的30℃预热的RM培养基到电极杯中，混匀。将混合物转移到1.5mL离心管中，在30℃下静置复苏10h。在含有100μg/mL的RM平板上涂200μL(也可以是在100μL-200μL中任一数值)培养后的混合液，30℃倒置培养直至转化子出现。使用引物PEZ-F如序列表中SEQID NO.5、PEZ-R如序列表中SEQ ID NO.6，按照实施例1中的菌落PCR鉴定方法鉴定转化子，获得生产乙偶姻的基因工程菌CP4(pPzwfscPtufL)、CP4(pPzwfsPgapcPtufL)、CP4(pPtufscPtufL)、Δ4(pPzwfscPtufL)、Δ4(pPzwfsPgapcPtufL)、Δ4(pPtufscPtufL)、Δ6(pPzwfscPtufL)、Δ6(pPzwfsPgapcPtufL)、Δ6(pPtufscPtufL)、Δ4(pPzwfsPgapc)。
RM培养基为20g/L葡萄糖，10g/L酵母粉，2g/L磷酸二氢钾，余量为水。
RM固体培养基为20g/L葡萄糖，10g/L酵母粉，2g/L磷酸二氢钾，18g/L琼脂，余量为水。
实施例4双途径重组菌株的乙偶姻发酵
本实施例为锥形瓶发酵法制备乙偶姻。具体方法如下：
①取菌株Δ4(pDZP)和实施例5得到的重组菌株甘油60μl置于3ml含100μg/mL壮观霉素的RM培养基中活化，然后进行预培养。
②将新鲜的种子液浓缩至OD600＝20，取225μl浓缩的菌液接种至含有终浓度为100μg/mL壮观霉素的30ml新鲜RM培养基的250ml锥形瓶中，初始OD600控制在0.15。在150rpm转速下，培养温度为30℃。
③测定色谱条件：使用带保护柱的Aminex HPX-87H分离柱，流动相为4mM硫酸，流速为0.6ml/min，柱温40℃，RID光学单元温度40℃，VWD检测波长为280nm，样品处理时间为25min。
双途径pPzwfscPtufL质粒的过表达菌株Δ4(pPzwfscPtufL)的乙偶姻产量为5.03g/L，CP4(pPzwfscPtufL)和Δ6(pPzwfscPtufL)分别提高了19％和5.5％(图2A)，说明Δ4作为宿主菌时乙偶姻产量比CP4和Δ6高，更适合用作双途径合成途径的底盘菌株。单途径对照菌株Δ4(pPzwfsPgapc)乙偶姻产量在36h时最高为5.13g/L，双途径菌株Δ4(pPzwfscPtufL)在48h时检测到最高产量为5.03g/L(图2A)，乙偶姻产量差异并不显著，双途径菌株产量略低的原因可能是取样检测间隔时间过大，未检测到乙偶姻的最大产量，据报道当葡萄糖被完全利用后，乙偶姻会作为碳源被细胞重新利用，因此当达到最大产量时若不停止发酵，则会导致产量逐渐降低。而Δ4(pPzwfsPgapcPtufL)与Δ4(pPtufscPtufL)的乙偶姻产量与对照比较，分别下降了4.9％和24％(图2A)，最大细胞密度分别降低了2.8％和8.9％，葡萄糖利用率降低了3.9％和25％(图2B)。
实施例5构建乙醛途径至基因组的打靶质粒
按照实施例1中扩增表达盒的PCR反应体系使用高保真酶扩增下述的DNA片段，以实验室前期保存的pT-cm-0270LRarm质粒为模板，使用引物cm-F(SEQ ID NO.25)和cm-R(SEQ ID NO.26)扩增氯霉素基因抗性表达盒(cm)片段。以CP4基因为模板，使用引物clLarmF(SEQ ID NO.27)和clLarmR(SEQ ID NO.28)扩增cl基因的左同源臂片段，引物clRarmF(SEQ ID NO.29)/clRarmR(SEQ ID NO.30)扩增cl基因的右同源臂片段。以pPtufL质粒为模板，使用引物cl-L482S-armF(SEQ ID NO.31)和cl-L482S-armR(SEQ ID NO.32)扩增Ptuf-L482S表达盒片段。Cm和clarmL两DNA片段通过重叠延伸PCR融合，PCR反应条件及反应程序同实施例1。提取pUC19质粒，使用NEB公司的Sph I-HF和BamH I-HF限制性内切酶进行双酶切，取5-10μL酶切产物上样1％浓度的琼脂糖凝胶进行电泳，用琼脂糖凝胶回收试剂盒(货号DP209-03，天根公司)对线性化载体进行回收。使用即用型无缝克隆试剂盒(生工生物工程公司)将片段和载体连接，在冰盒上按照表2连接体系添加各组分：
表2
分别将上述获得的表达盒，左同源臂片段，右同源臂片段和线性化的pL2R-cl质粒按照1:1:1:1的摩尔比进行混合，将装有目的片段和线性化质粒的反应溶液在50℃下反应20min即可完成连接。取5μl反应后的溶液转化至DH5α感受态细胞，复苏1h后，涂布在含有100μg/mL壮观霉素的LB平板上，在37℃的培养箱中放置12-16h。挑取平板上的转化子，按照实施例1中转化子鉴定的PCR反应体系和条件进行菌落PCR鉴定。获得打靶质粒pT-cl:L482S。
实施例6乙醛途径在运动发酵单胞菌基因组上的构建
按照实施例2中的方法制备CP4、Δ3感受态细胞。提取的实施例5中获得的打靶质粒pT-cl:L482S取5μl(约150ng)分别与CP4、Δ3感受态细胞混匀，按照实施例2中的方法进行电穿孔转化，在30℃下静置复苏10h，利用运动发酵单胞菌会内源的RecA同源重组***将目标基因cl替换为L482S基因。取200μL菌液涂布到含有壮观霉素(100μg/mL)的平板上，30℃倒置培养直至转化子出现。并使用引物cl-F如序列表中SEQ ID NO.19、cl-R如序列表中SEQ ID NO.20，按照实施例1中的菌裂解鉴定体系和程序对的转化子进行鉴定。获得生产乙偶姻的基因工程菌CP4Δcl:L482S-cm和Δ4:L482S-cm。
制备CP4Δcl:L482S-cm、Δ4:L482S-cm感受态细胞，使用高纯度小提中量试剂盒(货号：DP107-02，天根公司)提取质粒pBBR1-MCS2-Pgap-FLP[1]，通过醇沉将质粒浓缩至400ng/μL以上，取5μl浓缩后的质粒溶液与50μl的CP4Δcl:L482S-cm、Δ4:L482S-cm感受态轻轻混匀，使用电击法转化并复苏。复苏后涂布于含有310μg/mL卡那霉素的RM平板上，30℃培养72h至长出单菌落。挑取上述筛选平板上长出的转化子做菌落PCR鉴定，使用引物pBBR1-F(SEQ ID NO.33)和pBBR1-R(SEQ ID NO.34)鉴定pBBR1-MCS2-Pgap-FLP质粒被成功导入到单胞菌中。
将上述鉴定正确的转化子接种于无任何抗性的RM液体培养，转接2-3次后，将菌液在无抗生素的RM平板上划线，使用引物cl-F和cl-R进行菌落PCR验证，挑选PCR鉴定正确的菌株分别在RM、含有100μg/mL氯霉素抗性的RM、含有310μg/mL卡那霉素抗性的RM平板上进行点接。选择在氯霉素和卡那霉素抗性平板上均不能生长而在RM平板上能正常生长的转化子，即为最终去掉氯霉素抗性筛选标记和pBBR1-MCS2-Pgap-FLP抗性质粒的菌株，命名为Δcl:L482S、Δ4:L482S。
实施例7构建alssD途径至基因组的打靶质粒
按照实施例1中扩增表达盒的PCR反应体系使用高保真酶扩增下述的DNA片段，以实验室前期保存的pT-cm-0270LRarm质粒为模板，使用引物cm-F(SEQ ID NO.25)和cm-R(SEQ ID NO.26)扩增氯霉素基因抗性表达盒(cm)片段。以CP4基因为模板，使用引物adhBLarmF(SEQ ID NO.35)和adhBLarmR(SEQ ID NO.36)扩增adhB基因的左同源臂片段，引物adhBRarmF(SEQ ID NO.37)/adhBRarmR(SEQ ID NO.38)扩增cl基因的右同源臂片段。以pPzwfsPgapc质粒为模板，使用引物adhB-alssD-armF(SEQ ID NO.39)和adhB-alssD-armR(SEQ ID NO.40)扩增PzwfsPgapc表达盒片段。Cm和adhBarmL两DNA片段通过重叠延伸PCR融合，PCR反应条件及反应程序同实施例1。提取pUC19质粒，使用NEB公司的Sph I-HF和BamHI-HF限制性内切酶进行双酶切，取5-10μL酶切产物上样1％浓度的琼脂糖凝胶进行电泳，用琼脂糖凝胶回收试剂盒(货号DP209-03，天根公司)对线性化载体进行回收。使用即用型无缝克隆试剂盒(生工生物工程公司)将片段和载体连接，在冰盒上按照表3连接体系添加各组分：
表3
分别将上述获得的表达盒，左同源臂片段，右同源臂片段和线性化的pL2R-cl质粒按照1:1:1:1的摩尔比进行混合，将装有目的片段和线性化质粒的反应溶液在50℃下反应20min即可完成连接。取5μl反应后的溶液转化至DH5α感受态细胞，复苏1h后，涂布在含有100μg/mL壮观霉素的LB平板上，在37℃的培养箱中放置12-16h。挑取平板上的转化子，按照实施例1中转化子鉴定的PCR反应体系和条件进行菌落PCR鉴定。获得打靶质粒pT-adhB:alssD。
实施例8双途径在运动发酵单胞菌基因组上的构建
按照实施例2中的方法制备CP4Δcl:L482S、Δ4:L482S感受态细胞。提取的实施例7中获得的打靶质粒pT-adhB:alssD取5μl(约150ng)分别CP4Δcl:L482S、Δ4:L482S感受态细胞混匀，按照实施例2中的方法进行电穿孔转化，在30℃下静置复苏10h，利用运动发酵单胞菌会内源的RecA同源重组***将目标基因adhB替换为alssD操纵子基因。取200μL菌液涂布到含有壮观霉素(100μg/mL)的平板上，30℃倒置培养直至转化子出现。并使用引物adhB-F如序列表中SEQ ID NO.41、adhB-R如序列表中SEQ ID NO.42，按照实施例1中的菌裂解鉴定体系和程序对的转化子进行鉴定。获得生产乙偶姻的基因工程菌Δcl:L482SΔadhB:alssD-cm和Δ2Δcl:L482SΔadhB:alssD-cm。
制备Δcl:L482SΔadhB:alssD-cm和Δ2Δcl:L482SΔadhB:alssD-cm感受态细胞，使用高纯度小提中量试剂盒(货号：DP107-02，天根公司)提取质粒pBBR1-MCS2-Pgap-FLP[1]，通过醇沉将质粒浓缩至400ng/μL以上，取5μl浓缩后的质粒溶液与50μl的Δcl:L482SΔadhB:alssD-cm和Δ2Δcl:L482SΔadhB:alssD-cm感受态轻轻混匀，使用电击法转化并复苏。复苏后涂布于含有310μg/mL卡那霉素的RM平板上，30℃培养72h至长出单菌落。挑取上述筛选平板上长出的转化子做菌落PCR鉴定，使用引物pBBR1-F(SEQ ID NO.33)和pBBR1-R(SEQ ID NO.34)鉴定pBBR1-MCS2-Pgap-FLP质粒被成功导入到单胞菌中。
将上述鉴定正确的转化子接种于无任何抗性的RM液体培养，转接2-3次后，将菌液在无抗生素的RM平板上划线，使用引物cl-F和cl-R进行菌落PCR验证，挑选PCR鉴定正确的菌株分别在RM、含有100μg/mL氯霉素抗性的RM、含有310μg/mL卡那霉素抗性的RM平板上进行点接。选择在氯霉素和卡那霉素抗性平板上均不能生长而在RM平板上能正常生长的转化子，即为最终去掉氯霉素抗性筛选标记和pBBR1-MCS2-Pgap-FLP抗性质粒的菌株，命名为Δcl:L482SΔadhB:alssD(简称Δ2:AL)和Δ2Δcl:L482SΔadhB:alssD(简称Δ4:AL)。
按照实施例2中的方法制备Δ2:AL和Δ4:AL感受态细胞，取pPzwfsPgapc质粒5μl(约150ng)分别与50μlΔ2:AL和Δ4:AL感受态细胞混匀，按照实施例2中的方法进行电穿孔转化，同样操作制备CP4Δcl:alssD和Δ4:alssD感受态细胞，取pPtufL质粒5μl(约150ng)分别与50μlΔ2:AL和Δ4:AL感受态细胞混匀，按照实施例2中的方法进行电穿孔转化，将上述电击后的混合物中立即加入500μL的30℃预热的RM培养基，并将混合物转移到1.5mL离心管中，在30℃下静置复苏10h。复苏后取200μL菌液涂布到含有壮观霉素(spc，100μg/mL)的RM平板上，30℃倒置培养直至转化子出现。并使用引物PEZ-F如序列表中SEQ ID NO.5、PEZ-R如序列表中SEQ ID NO.6按照实施例1中的菌裂解鉴定体系和程序对的转化子进行鉴定。从而获得生产乙偶姻的基因工程菌Δ2:AL(pPzwfsPgapc)、Δ4:AL(pPzwfsPgapc)、Δ2:AL(pPtufL)、Δ4:AL(pPtufL)。
实施例9双途径过表达重组菌株发酵生产乙偶姻
本实施例为锥形瓶发酵法制备乙偶姻。具体方法如下：
①取菌株Δ2:AL(pPzwfsPgapc)、Δ4:AL(pPzwfsPgapc)、Δ2:AL(pPtufL)、Δ4:AL(pPtufL)和实施例5得到的重组菌株甘油200μl置于3ml含有壮观霉素(100μg/mL)的RM培养基中活化，然后进行预培养。
②将新鲜的种子液浓缩至OD600＝20，取225μl浓缩的菌液接种至含有终浓度为100μg/mL壮观霉素的30ml新鲜RM培养基的250ml锥形瓶中，初始OD600控制在0.15。在150rpm转速下，培养温度为30℃。
③实施例3所述的色谱条件测定发酵产物。
双途径Δ2:AL(pPzwfsPgapc)、Δ4:AL(pPzwfsPgapc)、Δ2:AL(pPtufL)、Δ4:AL(pPtufL)的乙偶姻产量为6.6-8.6g/L，比野生型对照菌株提高了2.5-3.3倍。菌株Δ4:AL(pPzwfsPgapc)的产量最高为8.6g/L，因此我们将该菌株用于后续的发酵研究。
实施例10双途径菌株Δ4:AL(pPtufL)补料发酵生产乙偶姻
本实施例为锥形瓶发酵法制备乙偶姻。具体方法如下：
(1)取Δ2Δcl:L482SΔadhB:alssD(pPzwfsPgapc)甘油菌200μl置于3ml含有100μg/mL壮观霉素的RM培养基中活化，然后进行预培养。
②将新鲜的种子液浓缩至OD600＝20，取225μl浓缩的菌液接种至含有终浓度为100μg/ml壮观霉素的30ml新鲜RM培养基的250ml锥形瓶中，初始OD600控制在0.15。在150rpm转速下，培养温度为30℃。在发酵30-45h时，补加1.5ml浓度为200g/l的酵母粉溶液，300μl浓度为200g/l的KH2PO4和1ml浓度为600g/l的葡萄糖溶液，补加后发酵液中总的葡萄糖浓度为40g/l。发酵80-95h时进行第二次补料，补加1.5ml浓度为200g/l的酵母粉溶液，300μl浓度为200g/l的KH2PO4和1ml浓度为600g/L的葡萄糖溶液，补加后此时发酵液中总的葡萄糖总浓度为60g/l。当发酵130-145h时进行第三次补料，补加1.5ml浓度为200g/l的酵母粉溶液，300μl浓度为200g/L的KH2PO4和1ml浓度为600g/l的葡萄糖溶液，补加后此时发酵液中总的葡萄糖总浓度为80g/L。当发酵180-195h时进行第四次补料，补加1.5ml浓度为200g/L的酵母粉溶液，300μl浓度为200g/L的KH2PO4和1ml浓度为600g/L的葡萄糖溶液，补加后此时发酵液中总的葡萄糖总浓度为100g/l。分别向锥形瓶中补加1、2、3和4次葡萄糖后，对应发酵液中的葡萄糖总浓度分别为40g/l、60g/l、80g/l和100g/l，分析比较葡萄糖对乙偶姻生产的影响。
③实施例3所述的色谱条件测定发酵产物。
菌株Δ4:AL(pPtufL)在30-45h进行第一次补料后葡萄糖总浓度为40g/l，发酵至96h-120h时产量为14.2-16.6g/l。在80-95h进行第二次补料，发酵至144-168h时产量为26.22-27.7g/l；在130-145h进行第三次补料，发酵至192-116h时产量为32.9-33.4g/l；在180-195h进行第四次补，发酵至230-254h产量为43-45.3g/l。
从以上结果可见，构建的重组菌株Δ4:AL(pPtufL)在优化后的发酵条件下进行四次连续补料发酵时乙偶姻产量最高，此结果说明了将双途径引入运动发酵单胞菌后，利用代谢工程对宿主细胞和乙偶姻合成途径进行优化有利于乙偶姻的生产。
本发明的实施方式并不局限于上述的具体实施例。如果本领域的普通技术人员受其启示，在不脱离本发明宗旨和权利要求所保护范围的情况下，做出其他变化或变型，均属于本发明的保护范围。
序列表
<110> 天津大学
<120> 一种利用双途径产乙偶姻的重组运动发酵单胞菌及其构建方法与应用
<160> 42
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1692
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 1
atggcgatga ttacaggcgg cgaactggtt gttcgcaccc taataaaggc tggggtcgaa 60
catctgttcg gcctgcacgg cattcatatc gatacgattt ttcaagcctg tctcgatcat 120
gatgtgccga tcatcgacac ccgccatgag gccgccgcag ggcatgcggc cgagggctat 180
gcccgcgctg gcgccaagct gggcgtggcg ctggtcacgg cgggcggggg atttaccaat 240
gcggtcacgc ccattgccaa cgctcgtacc gatcgcacgc cggtgctctt cctcaccgga 300
tcgggcgcgc tgcgtgatga tgaaaccaac acgttgcagg cggggattga tcaggtcgcc 360
atggcggcgc ccattaccaa atgggcgcat cgggtgatgg caaccgagca tatcccacgg 420
ctggtgatgc aggcgatccg cgccgcgttg agcgcgccac gcgggccggt gttgctggat 480
ctgccgtggg atattctgat gaaccagatt gatgaggata gcgtcattat ccccgatctg 540
gtcttgtccg cgcatggggc ccatcccgac cctgccgatc tggatcaggc tctcgcgctt 600
ttgcgcaagg cggagcggcc ggtcatcgtg ctcggctcag aagcctcgcg gacagcgcgc 660
aagacggcgc ttagcgcctt cgtggcggcg actggcgtgc cggtgtttgc cgattatgaa 720
gggctaagca tgctctcggg gctgcccgat gctatgcggg gcgggctggt gcaaaacctc 780
tattcttttg ccaaagccga tgccgcgcca gatctcgtgc tgatgctggg ggcgcgcttt 840
ggccttaaca ccgggcatgg atctgggcag ttgatccccc atagcgcgca ggtcattcag 900
gtcgaccctg atgcctgcga gctgggacgc ctgcagggca tcgctctggg cattgtggcc 960
gatgtgggtg ggaccatcga ggctttggcg caggccaccg cgcaagatgc ggcttggccg 1020
gatcgcggcg actggtgcgc caaagtgacg gatctggcgc aagagcgcta tgccagcatc 1080
gctgcgaaat cgagcagcga gcatgcgctc cacccctttc acgcctcgca ggtcattgcc 1140
aaacacgtcg atgcaggggt gacggtggta gcggatggtg gcctgaccta tctctggctg 1200
tccgaagtga tgagccgcgt gaaacccggc ggttttctct gccacggcta tctaaactcg 1260
atgggcgtgg gcttcggcac ggcgctgggc gcgcaagtgg ccgatcttga agcaggccgc 1320
cgcacgatcc ttgtgaccgg cgatggctcg gtgggctata gcatcggtga atttgatacg 1380
ctggtgcgca aacaattgcc gctgatcgtc atcatcatga acaaccaaag ctgggggtgg 1440
acaagtcatt tccagcaatt ggccgtcggc cccaatcgcg tgacgggcac ccgtttggaa 1500
aatggctcct atcacggggt ggccgccgcc tttggcgcgg atggctatca tgtcgacagt 1560
gtggagagct tttctgcggc tctggcccaa gcgctcgccc ataatcgccc cgcctgcatc 1620
aatgtcgcgg tcgcgctcga tccgatcccg cccgaagaac tcattctgat cggcatggac 1680
cccttcgcat ga 1692
<210> 2
<211> 2481
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 2
atgaccaaag ctaccaaaga acagaaatcc ctggttaaaa accgtggtgc tgaactggtt 60
gttgattgcc tggttgaaca gggcgttact catgtgttcg gcatcccggg tgctaaaatc 120
gatgctgttt tcgatgctct gcaggataaa ggtccggaaa tcatcgttgc tcgtcatgaa 180
cagaacgctg ctttcatggc tcaggctgtt ggtcgtctga ccggtaaacc gggtgttgtt 240
ctggttacct ccggtccggg tgcttccaac ctggctaccg gtctgctgac cgctaacacc 300
gaaggtgatc cggttgttgc tctggctggt aacgttatcc gtgctgatcg tctgaaacgt 360
acccatcagt ccctggataa cgctgctctg ttccagccga tcaccaaata ttccgttgaa 420
gttcaggatg ttaaaaacat cccggaagct gttaccaacg ctttccgtat cgcttccgct 480
ggtcaggccg gtgcagcgtt cgtttccttc ccacaggatg ttgttaacga agttaccaac 540
accaaaaacg ttcgtgctgt tgctgctccg aaactgggtc cggctgctga tgatgctatc 600
tccgctgcta tcgctaaaat ccagaccgct aaactgccgg ttgttctggt tggtatgaaa 660
ggtggtcgtc cggaagctat caaagctgtt cgtaaactgc tgaaaaaagt tcagctgccg 720
ttcgttgaaa cctatcaggc tgctggtacc ctgtcccgtg atctggagga ccagtacttc 780
ggacgtatcg gtctgttccg taaccagccg ggtgatctgc tgctggaaca ggctgatgtt 840
gttctgacca tcggttatga tccgatcgaa tatgatccga aattctggaa catcaacggt 900
gatcgtacca tcatccatct ggatgaaatc atcgctgata tcgatcatgc ttatcagccg 960
gatctggaac tgatcggtga tatcccgtcc accatcaacc atatcgaaca tgatgctgtt 1020
aaagttgaat tcgctgaacg tgaacagaaa atcctgtccg atctgaaaca gtatatgcat 1080
gaaggtgaac aggttccggc tgattggaaa tccgatcgtg ctcatccgct ggaaatcgtt 1140
aaagaactgc gtaacgctgt tgatgatcat gttaccgtta cctgcgatat cggttcccat 1200
gctatctgga tgtcccgtta tttccgttcc tatgaaccgc tgaccctgat gatctccaac 1260
ggtatgcaga ccctgggtgt tgctctgccg tgggctatcg gtgcttccct ggttaaaccg 1320
ggtgaaaaag ttgtttccgt ttccggtgat ggtggtttcc tgttctccgc tatggaactg 1380
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gatatggttg ctttccagca gctgaaaaaa tataaccgta cctccgctgt tgatttcggt 1500
aacatcgata tcgttaaata tgctgaatcc ttcggtgcta ccggtctgcg tgttgaatcc 1560
ccggatcagc tggctgatgt tctgcgtcag ggtatgaacg ctgaaggtcc ggttatcatc 1620
gatgttccgg ttgattattc cgataacatc aacctggctt ccgataaact gccgaaagaa 1680
ttcggtgaac tgatgaaaac caaagctctg taaatgaaac gtgaatccaa catccaggtt 1740
ctgtcccgtg gtcagaaaga tcagccggtt tcccagatat accaggtaag caccatgacc 1800
tccctgctgg atggtgttta tgatggtgat ttcgaactgt ccgaaatccc gaaatatggt 1860
gatttcggta tcggtacctt caacaaactg gatggtgaac tgatcggttt cgatggtgaa 1920
ttctatcgtc tgcgttccga tggtaccgct accccggttc agaacggtga tcgttccccg 1980
ttctgctcct tcaccttctt caccccggat atgacccata aaatcgatgc taaaatgacc 2040
cgtgaagatt tcgaaaaaga aatcaactcc atgctgccgt cccgtaacct gttctatgct 2100
atccgtatcg atggtctgtt caaaaaagtt cagacccgta ccgttgaact gcaggaaaaa 2160
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ctggaagatt gcaccgttac catctcccag aaaatgaaca tgaacctgcg tctgccgaac 2400
accgctgatt tcttcaacgc taacctggac aatccggact tcgctaaaga tatagaaacc 2460
accgaaggtt ccccggaata a 2481
<210> 3
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 3
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<212> DNA
<213> 人工序列()
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gtgagccagt gtgacctgca gttattccgg ggaaccttcg g 41
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aattcgttga atcctgcctc 20
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gaacaacatc cctactgcat attcggcaac cgaata 36
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<212> DNA
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<400> 9
ccagctcacc gtctgaattc ttattgggaa gaacgcatt 39
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<212> DNA
<213> 人工序列()
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ggttaattgt cgcttgtcta agacaccctc ttgaaaagtt 40
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aacttttcaa gagggtgtct tagacaagcg acaattaacc 40
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agatctgata tcactctaga gaggtcagtc gacaaatctg 40
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<212> DNA
<213> 人工序列()
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tcactatggt ggtctgaccg gt 22
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<212> DNA
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cgtggagatc ggtatgacat acc 23
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aggtgcatta ttgggacata 20
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tataccagaa gagaaaagcg c 21
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atgcagcgtt tgagacaatt gat 23
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<212> DNA
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<400> 18
gagcgccgca gaaatagaag tc 22
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tgctccacag cttattcatt tctg 24
<210> 20
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<400> 20
ctggatgatg gcgcattata aac 23
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<400> 21
tagaagagcg gtcagagcgt ca 22
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catcataacg gattaagccg ct 22
<210> 23
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gcattaaagc ggtcgcatc 19
<210> 24
<211> 20
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<400> 24
cggacggcct gtcacaataa 20
<210> 25
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 25
acaaggattt taaatactgg cataaaccga 30
<210> 26
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<400> 26
aggttaagtc agaatcatgc gaaggggtcc 30
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<400> 27
accagctcac cgtctgaatt cttgatcaat ggatctccga 40
<210> 28
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 28
tcggtttatg ccagtattta aaatccttgt ttctttctta act 43
<210> 29
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 29
ggaccccttc gcatgattct gacttaacct atttggg 37
<210> 30
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 30
gagatctgat atcactctag aggtaaaagc atgtctgata tga 43
<210> 31
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 31
acaaggattt taaacttgct ttggctga 28
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<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 32
ccccaaatag gttaagtcag aattattccg gggaaccttc 40
<210> 33
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<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 33
tcagccaaag caagtttaaa atccttgttt ctttcttaac t 41
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<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 34
gaaggttccc cggaataatt ctgacttaac ctatttggg 39
<210> 35
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列()
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tcactatagg gcgaattggg cccgacgtca taagaaggtt tcgtcccctc 50
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<211> 43
<212> DNA
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<400> 36
tcggtttatg ccagtattta aaatccttgt ttctttctta act 43
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<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 37
agtataggaa cttcgaagca gctccagcct ttctgactta acctatttgg g 51
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<212> DNA
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<400> 38
tagaatactc aagctatgca tccaaacgcg tcgcttttcc tagtagcatt aaag 54
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<213> 人工序列()
<400> 39
atgtagggtg aggttatagc tttaaacttg ctttggctga atc 43
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gatattcata tggaccatgg ctaattccca tttattccgg ggaaccttcg 50
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<213> 人工序列()
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atgcagcgtt tgagacaatt gat 23
<210> 42
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<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 42
gagcgccgca gaaatagaag tc 22

Claims (7)

1.一种利用双途径产乙偶姻的重组运动发酵单胞菌，其特征在于，宿主菌为运动发酵单胞菌，表达编码甲醛裂合酶的基因L482S、编码乙酰乳酸合成酶ALS的基因和编码α-乙酰乳酸脱羧酶ALDC的基因构建至表达载体，所述编码甲醛裂合酶基因L482S的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO.1所示，编码乙酰乳酸合成酶ALS和α-乙酰乳酸脱羧酶ALDC基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
2.根据权利要求1所述的重组运动发酵单胞菌，其特征在于，所述表达载体为pEZ15Asp、pHW20a或pZA22。
3.根据权利要求1所述的重组运动发酵单胞菌的构建方法，其特征在于，将编码乙酰乳酸合成酶ALS的基因、α-乙酰乳酸脱羧酶ALDC的基因和甲醛裂合酶基因L482S连接至表达载体后，转入运动发酵单胞菌宿主细胞，获得重组运动发酵单胞菌；或将乙酰乳酸合成酶ALS的基因、α-乙酰乳酸脱羧酶ALDC的基因和甲醛裂合酶基因L482S通过分子生物学技术整合至宿主细胞的基因组，获得重组运动发酵单胞菌。
4.根据权利要求3所述的重组运动发酵单胞菌的构建方法，其特征在于，在获得重组发酵单胞菌中敲除生产菌株中的竞争代谢途径乙醇脱氢酶基因adhB、乳酸脱氢酶基因ldhA、葡萄糖-果糖氧化还原酶基因gfo、柠檬酸裂合酶cl，获得工程菌株。
5.根据权利要求1-2任意一项所述的重组运动发酵单胞菌在生产乙偶姻中的应用。
6.一种重组运动发酵单胞菌生产乙偶姻的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)制备权利要求1所述重组运动发酵单胞菌；
(2)发酵培养所述重组运动发酵单胞菌，发酵液中得到乙偶姻。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述发酵培养是指按照初始接种密度为OD600＝0.05-0.45将工程菌接种于发酵培养基，培养温度为27-33℃，并在100-200rpm的摇床速度下以及10g/L-100g/L葡萄糖浓度下的条件下发酵。
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