HU220196B - Eljárás metil-tio-adenozin-foszforiláz hiányának kimutatására emlős sejtekben - Google Patents

Description

A találmány tárgya eljárás metil-tio-adenozin-foszforiláz hiányának kimutatására emlőssejtekben. A fenti enzim hiánya az érintett sejtekben rosszindulatú folyamatokra utal. A metil-tio-adenozin-foszforiláz-hiányos sejtek detektálása lehetővé teszi, hogy a kemoterápiával kezelni kívánt sejtek esetében kihasználjuk az ilyen sejtek azon tulajdonságát, hogy nem képesek a metil-tio-adenozint metioninná alakítani.

A metionin (Met) a normális és rosszindulatú sejtek növekedéséhez egyaránt szükséges. Bizonyos rosszindulatú sejtekben a metionin jelenléte nélkülözhetetlen, azaz megfelelő metioninellátás nélkül a sejtek elpusztulnak.

Az emlőssejtekben a metionin három forrásból származik; a táplálékból, illetve - biokémiai szintézis útján - L-homociszteinből (homocisztein) vagy metil-tio-adenozinból (MTA: apoliaminbioszintetikus reakcióútterméke). Az utóbbi esetben a metil-tio-adenozint a metiltio-adenozin-foszforiláz (MTA-áz; EC 2.4.2.28) alakítja metioninná.

Az utóbbi évtizedben a kutatók sok rosszindulatú, MTA-áz-hiányos sejtvonalat azonosítottak, amelyek nem képesek az MTA-t metioninná alakítani. Például Katamari és munkatársai (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 78, 1219-1223,1981) leírták, hogy három humán rosszindulatú tumorsejtvonal 23%-ából hiányzott a detektálható MTA-áz, míg a vizsgált 16 nem rosszindulatú sejtvonal mindegyikében jelen volt az MTA-áz-aktivitás. MTA-áz-hiányról számoltak be nem kissejtes tüdőrákok esetében (lásd Nobori és munkatársai, Cancer Rés., 53, 1098-1101, 1991); hat lymphoma- és leukémiasejtvonalban (lásd ugyanott); agytumorsejtvonalakban és primeragytumor-szövetmintákban (lásd ugyanott), illetve más rosszindulatú betegségek esetében (lásd például Kries és munkatársai, Cancer Rés., 33, 1866-1869, 1973; Kries és munkatársai, munkatársai, Cancer Trmt. Rpts., 63, 1069-1072, 1979; és Rangione és munkatársai, Biochem. J., 281, 533-538, 1992). Az MTA-áznegatív sejtek metioninigényüket elsősorban homocisztein átalakításával fedezik, így amennyiben homocisztein nem áll rendelkezésre, a sejtek rendszerint elpusztulnak.

Ismert, hogy az L-metionin-L-dezamino-il-merkapto-etán-liáz (ED 4.4.1.11; MET-áz) nemcsak a metionint bontja le, hanem a homociszteint is. Következésképpen, az MTA-áz-hiányos rosszindulatú sejtek elméletileg a plazma metioninjának és homociszteinjének MET-ázos lebontásával „kiéheztethetők”. A normális MTA-áz-pozitív sejtek metioninigényüket várhatóan az MTA metioninná történő átalakításával elégítik ki.

A rosszindulatú sejtek sikeres metioninéheztetési módszerének kifejlesztését az akadályozta, hogy azonosítani kellett, mely rosszindulatú sejtek képezik a terápia megfelelő célpontjait, vagyis, hogy mely rosszindulatú sejtek MTA-áz-negatívak. E cél érdekében kifejlesztettek egy vizsgálatot, mellyel (a sejttenyészetben katalitikus aktivitás jelenlétét vizsgálva (meghatározható, hogy egy rosszindulatú sejtvonal MTA-áz-negatív-e (Seidenfeld és munkatársai, Biochem. Biophys. Rés. Commun., 95, 1861-1866, 1980). Mivel azonban a vizsgálathoz szükséges radiokémiái szubsztrát nem áll széles körben rendelkezésre, jelenleg nem alkalmazható a rutinvizsgálatokban. Ezenkívül, a vizsgálat nem ad számot az

MTA-áz in vitro katalitikus labilitásáról, mivel az enzim jelenlétét attól függetlenül mutatja ki, hogy az a vizsgálat ideje alatt katalitikusán aktív-e.

Az aktivitási vizsgálat e hátránya olyan immunvizsgálat kifejlesztésével küszöbölhető ki, amely az enzim viszonylag kis mennyiségeinek detektálásához is elegendő mértékben érzékeny. Az MTA-áz immunológiai detektálásához való antitestek kifejlesztéséhez alkalmas MTA-áz természetes forrásokból történő tisztítása azonban nagyon körülményes eljárásnak bizonyult, amely viszonylag gyenge hozamot eredményez (Rangione és munkatársai, J. Bioi. Chem., 261, 12324-12329,1986).

Részben az MTA-áz-hiányos sejtek azonosításához alkalmazható egyszerű és hatásos módszerek hiányának köszönhető, hogy továbbra sem áll rendelkezésre olyan hatásos gyógymód, amellyel megvalósítható az MTA-áz-hiányos rosszindulatú sejtek szelektív in vivő metioninéheztetése. A fenti szükséglet kielégítése érdekében találmányunkban eljárást írunk le egy mintában az MTA-ázt kódoló gén jelenlétének vagy hiányának kimutatására, továbbá rekombináns MTA-áz-forrást bocsátunk rendelkezésre.

A találmány tárgya eljárás MTA-áz-hiányos sejtek kimutatására, melyekben az MTA-áz-protein (katalitikusán aktív vagy inaktív alakban) nincs jelen detektálható mennyiségben. A találmány szerinti eljárás azon a feltételezésen alapul, hogy az MTA-áz-hiány az MTAázt kódoló gén MTA-áz-negatív rosszindulatú betegségben szenvedő emlős genomjának MTA-áz-proteint kódoló doménjén belüli polinukleotid kimutatására irányul, amely - jelen esetben - az MTA-ázt kódolja, hiányában azonban MTA-áz-hiányos sejtek kialakulását eredményezheti.

Közelebből, a találmány tárgya vizsgálati eljárás MTA-áz kimutatására, amelynek során (a) a vizsgálandó sejtekből mintát nyerünk, (b) a mintához az 1. szekvencia szerinti nukleinsavszekvenciából eredő, detektálható módon jelzett oligonukleotid próbákat adunk, amelyek specifikusan hibridizálódnak a mintában jelen levő, MTA-ázt kódoló bármely nukleinsavval, és (c) detektáljuk a próbák hibridizálódását a mintában jelen levő, MTA-ázt kódoló bármely nukleinsavhoz, ahol egy ilyen nukleinsav jelenléte jelzi a katalitikusán aktív vagy inaktív MTA-áz jelenlétét a sejtben.

Az 1. ábrán az MTA-áz génjének térképe látható, melyen feltüntettük az exonok elhelyezkedését. A feltételezett exonokat aláhúzással; a feltételezett intronokat egy vagy több fázis „N” szubsztitúciójával jelöltük. Az ábrán látható szekvencia a szekvencialista 1. számú szekvenciájának felel meg.

A) Eljárás egy sejtmintában jelen lévő bármilyen MTA-áz amplifikálására

Amint fentebb említettük, a találmány kiindulási hipotézise szerint a sejtekben az MTA-áz hiánya annak köszönhető, hogy egy emlős genomjából deléció folytán hiányzik az a gén, amely normális esetben az MTA-ázt kódolja. Mivel találmányunk e gén jelenlétének vagy

HU 220 196 Β hiányának olyan sejtek mintájában történő kimutatására vonatkozik, amelyekről feltételezzük, hogy MTA-áz-negatívak, a mintában lévő nukleinsavakat a kimutatási eljárás érzékenységének fokozása érdekében előnyösen amplifikáljuk. Az amplifikációt előnyösen polimeráz láncreakcióval (PCR) végezzük, bár a polimerizációs lépésben nincs feltétlenül szükség láncreakcióra.

A találmány szerinti eljárásokban való alkalmazáshoz olyan biológiai mintát veszünk, amelyről feltételezzük, hogy MTA-áz-hiányos sejteket tartalmaz. A minta lehet például testfolyadék vagy tartalmazhat egy sejtvonalból, szövetből vagy daganatból származó sejteket. Az ilyen mintákat jól ismert módszerek alkalmazásával kapjuk; a tumorsejteket például biopsziával vagy sebészeti kimetszéssel vehetjük ki. A sejtek előnyösen mentesek a szennyeződésektől, azaz olyan sejtektől, proteinektől és hasonló komponensekből, amelyek valószínűleg meghamisítanák a találmány szerinti eljárás eredményét. Például, olyan esetekben, ahol a genomiális MTA-áz DNS-forrásaként kemény tumorokat használunk, azokat a normális, nem rosszindulatú sejteket és MTA-áz-enzimet tekintjük szennyezésnek, amelyek a biológiai minta kivételekor szabadulnak fel.

A mintában lévő, amplifikálni kívánt nukleinsav genomiális vagy vad típusú DNS; amelyről normális esetben feltételezhető, hogy MTA-ázt tartalmaz. Ez az amplifikálni kívánt DNS (a továbbiakban cél-DNS) eukarióta szervezetből, előnyösen emlős állatból nyerhető. A genomiális DNS-t legelőnyösebben emberből nyeljük.

A genomiális DNS-t jól ismert eljárások szerint izoláljuk (lásd például Maniatis és munkatársai, Molecular Cloning, A Laboratory Manul, Cold Spring Harbor Laboratory, 1982). Egy humán MTA-áz genomiális klón izolálását mutatjuk be példaként, melynek során egy kozmid génkönyvtárat MTA-áz cDNS-génpróbával screenelünk, melyet a későbbiekben írunk le részletesen. A szakemberek számára nyilvánvaló, hogy a találmány szerinti DNS más alkalmas módszerekkel is kinyerhető.

Az MTA-áz genomiális kiónjának teljes hosszúságú nukleotidszekvenciáját és szekvencialista 1. számú szekvenciájaként mutatjuk be; az e szekvenciában lévő exonokat az 1. ábrán látható térképen jelöljük. A patkányMTA-áz teljes hosszúságú genomiális DNS-ét tartalmazó E. coli törzset 1993. december 30-án az American Culture Type Collectionnél helyeztük letétbe, az alábbi deponálási számokon: 55536 („TC3” exon; az MTAáz-gén 616-720. nukleotidjai); 55538 („1.1” exon, az MTA-áz-gén 254-421. nukleotidjai); 55537, 55539 és 55540 („IX-7”, „4-3”, illetve „7-2” exonok, melyek együttesen az MTA-áz-gén fennmaradó részét teszik ki). Valamennyi deponálás esetében E.coli gazdasejtet alkalmaztunk. A deponált anyagok nem feltétlenül szükségesek a találmány gyakorlati megvalósításához, a találmányunkra vonatkozó szabadalmi törvények azonban előírhatják a letétbe helyezett törzs életképes alakban, meghatározott ideig történő fenntartását.

A genomiális DNS megszerzése után a genomiális DNS-t tartalmazó mintát a célnukleinsav szelektív amplifikációjának kedvező körülmények között tartjuk. A célnukleinsav előnyösen a gén MTA-ázt kódoló polinukleotid szakasza (azaz az „cél-polinukleotid”). A cél-polinukleotidot előnyösen PCR alkalmazásával amplifikáljuk. A PCR specifikus DNS- vagy RNS-szekvenciák in vitro enzimatikus szintetizálási eljárása, melyhez specifikus nukleinsavszekvenciákhoz hibridizáló és a célnukleinsav adott régióját szegélyező oligonukleotid primereket alkalmazunk. A PCR során ismétlődő ciklusokban a templát denaturálását, a primerek hibridizálását és a hibridizált primerek enzimatikus lánchosszabbítását végezzük, ami terminálisain a primerek 5 '-végei által meghatározott specifikus nukleinsavfragmentek exponenciális felhalmozódását eredményezi. Az egyik ciklusban képződött termékek (PCR-termékek) a következő ciklusban templátként szolgálnak, következésképpen a célnukleinsav példányszáma minden ciklusban hozzávetőleg kétszeresére nő. Az alap PCRtechnika leírását lásd Mullis és munkatársai, 4,683,195 és 4,683,202 számú egyesült államokbeli szabadalmak, melyek leírását a PCR hagyományos technikájának példájaként hivatkozunk. Találmányunkat azonban nem szándékozzuk a 4,683,202 számú egyesült államokbeli szabadalom Mullis és munkatársai által leírt PCR-technika alkalmazására korlátozni. Mullis és munkatársai technikájának kifejlesztése óta - az eredeti technika módosításaival - számos PCR-alapú vizsgálatot fejlesztettek ki. Ezek a módosítások jól ismertek, ezért részletes bemutatásukra itt nem térünk ki, azonban e módosítások közül néhányat az alábbiakban jellemzünk.

Gilliland és munkatársai (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87, 2725-2729,1990) olyan PCR-technikát írtak le, amely a célnukleinsav szekvenciájától és méretétől eltérő kompetitor templát alkalmazásával belső amplifikációs standardot biztosít. A „kompetetív” PCR megvalósításának egy másik technikáját, melyben eltérő szekvenciájú, de azonos méretű templátokat alkalmaznak, Kohsaka és munkatársai írták le (Nucl. Acids Rés., 21, 3469-3472, 1993). Ez a technika az enzimkötött immunabszorbens vizsgálati technikában (ELISA) való felhasználását tekintve különösen előnyös az amplifikált nukleinsav(ak) vizsgálatában. Saiki és munkatársai (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86, 6230-6234, 1989) olyan (a találmány szerinti eljárásban alkalmazható), nem kompetetív PCR-technikát írtak le, amelyben a gének mutációinak vagy polimorfizmusainak detektálásához helyspecifikus oligonukleotidokat alkalmaztak. E technikák mindegyike rendelkezik a hibridizációs próbák alkalmazásának előnyével, mely próbák segítenek kiküszöbölni a PCR során esetlegesen bekövetkező nem specifikus amplifikációból származó hamis pozitív eredményeket.

A PCR-technikákkal kapcsolatban megemlíthető Innis és munkatársai munkája („Optimizaton of PCR's”, PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications; Acad. Press, 1990), melyben a kívánt PCR-termékek specifitását, pontosságát és hozamát befolyásoló technikákat összegzik.

A PCR-hez olyan oligonukleotid primereket (legalább egy primer párt) választunk ki, amelyek a megcélzott MTA-áz-polinukleotid mindkét végén (5' és 3') specifikusan egy bázispárokból álló, rövid szakaszhoz

HU 220 196 Β hibrizálódnak (szegélyező szekvenciák). A szekvencialistában az 1. számú szekvenciaként, illetve az 1. ábrán bemutatott polinukleotidszekvencia alapján a szakemberek számára nem okoz nehézséget a megfelelő primerek felesleges kísérletezés nélküli kiválasztása.

A primerek tervezését illetően lényeges, hogy ne tartalmazzanak komplementer bázisokat, melyekkel egymáshoz hibrizálódhatnak. A mintában esetlegesen jelen lévő szennyezések amplifikációjának kiküszöbölése érdekében a primereket előnyösen úgy tervezzük, hogy átíveljék az exonokat (melyeket, az MTA-áz-gén esetében, az 1. ábrán mutatunk be).

Amint fentebb említettük, nem feltétlenül szükséges, hogy a polimerizációs lépésben - a mintában lévő nukleinsavak megfelelő amplifikációja érdekében - láncreakciót alkalmazzunk. Például, amennyiben a Kohsaka és munkatársai által leírt (lásd fentebb) technikát úgy alkalmazzuk, hogy a polimerizációs lépést szilárd fázisú hordozón végezzük, majd a cél-polinukleotidra specifikus próbákkal végzünk hibridizációt, a vizsgálat érzékenysége olyan, hogy a cél-polinukleotid csupán egyetlen polimerizációjára van szükség.

Az amplifikációs lépés befejeztével a PCR-termékeket annak érdekében vizsgáljuk, hogy meghatározzuk, vajon az MTA-ázt kódoló gén jelen van-e a mintában. A kétszálú PCR-termékek előnyösen hozzákötődnek a szilárd fázishoz, így szálaik denaturálással elválaszthatók, ami lehetővé teszik, hogy a szekvenciaspecifikus próbák a PCR-termék kötött antitszensz szálához hibridizálódjanak, miáltal kimutatható a gén (lényegében Kohsaka és munkatársai (lásd fentebb) leírása szerint). Más lehetőség szerint, a PCR-termékeket a kétszálú PCR-termékekhez történő hibridizációhoz való próbák hozzáadása előtt távolítjuk el a reakciótérből és különítjük el az amplifikációs elegytől. Ez utóbbi módszer szerint a PCR-termékeket jól ismert (a kiválasztott detektálási módszerhez megfelelő) eljárásokkal különítjük el az amplifikációs elegytől, például gélkizárással, elektroforézissel vagy affinitáskromatográfiával.

Az amplifikált terméket detektálható jelölőanyaggal stabilan kapcsolódó hibridizációs próbák alkalmazásával mutathatjuk ki. A jelölőanyag olyan anyag, amely kovalensen kapcsolódik vagy szilárd kapcsolatban áll egy nukleinsavpróbával, miáltal a próba kimutatható. A jelölőanyag lehet például radioaktív izotóp, enzimszubsztrát vagy inhibitor, enzim, „sugárátlátszatlan” (radiopaque) anyag (beleértve a kolloidális fémeket), fluoreszkáló anyag, kemilumineszcens molekula, a fenti jelölőanyagok valamelyikét tartalmazó liposzóma, vagy specifikus kötésipár tag. Az alkalmas jelölőanyag az amplifikáció során nem veszíti el a detektálhatóságért felelős tulajdonságot.

A diagnosztikában járatos szakemberek számára ismertek az in vitro kimutatási vizsgálatokban alkalmazható detektálható jelölőanyagok. Például, az in vitro alkalmazáshoz megfelelő radioaktív izotópok közé tartozik a ³H, ^l251, ¹³¹1, ³²P, ¹⁴C és³⁵S. A radioaktív izotópokkal jelölt amplifikált fragmentek közvetlenül gamma-számlálóval; denzitometriával vagy autoradiográfiával (az amplifikált fragmentek denzitometriával kombinált

Suthem-blot-analízisével) detektálhatok. Az alkalmas kemilumineszcens molekulák példái az akridinek és a luminol. Az aktridin-észterrel kezelt próbákkal hibridizálódott célszekvenciák védettek a hidrolízistől. Az alkalmas fluoreszkáló anyagok példái a fluoreszcein, a fikobiliprotein, a ritkaföldfém-kelátok, a danzil és a rodamin.

Az alkalmas enzimszubsztrátok vagy inhibitorok példái olyan vegyületek, amelyek specifikusan kötődnek a torma-peroxidázhoz, glükóz-oxidázhoz, glükóz6-foszfát-dehidrogenázhoz, β-galaktozidához, piruvát kinázhoz vagy alkalikus foszfatáz acetil-kolin-észterázhoz. A „sugárátlászatlan” anyagok példái a kolloidális arany vagy a mágneses részecskék.

A specifikus kötési pár két különböző molekulából áll, melyek közül az egyik, felületén vagy egy üregben, olyan területtel rendelkezik, amely a másik molekula adott térbeli és poláris elrendeződéséhez specifikusan kötődik. A specifikus kötési pár tagjait gyakran ligandumnak és receptornak, vagy ligandumnak és antiligandumnak nevezzük. Például, amennyiben a receptor egy antitest, a ligandum az antitestnek megfelelő antigén. Az egyéb specifikus kötési párok közé tartoznak a hormonreceptorpárok, az enzimszubsztrátpárok. Idetartoznak a specifikus kötési párok tagjainak ffagmentjei és részei, melyek megtartják az eredeti kötési specifitást; ilyenek az immunglobulinok ffagmentjei, mint például a Fab-fragmentek és hasonlók. Az antitestek lehetnek monoklonálisak vagy poliklonálisak. Ha jelölőanyagként egy specifikus kötési pár egyik tagját alkalmazzuk, az elválasztáshoz előnyösen affinitáskromatográfiát alkalmazunk.

Amennyiben a fentebb leírt vizsgálatban amplifikált terméket nem sikerül kimutatni, az azt jelenti, hogy a mintában lévő sejtek MTA-áz-hiányosak. Mivel a normális (azaz nem rosszindulatú) sejtekben mindig találhatunk kimutatható mennyiségű MTA-ázt, az MTA-áz hiánya azt jelzi, hogy a vizsgált genomiális DNS rosszindulatú sejtből származik. A találmány szerinti vizsgálat különösen alkalmas diagnosztikai célokra, például a daganatokkal, különösen a rosszindulatú daganatokkal kapcsolatos MTA-áz-hiány diagnózisában.

Kívánt esetben a minta-MTA-áz katalitikus aktivitására - Seidenfeld és munkatársai által leírt (Biochem. Biphys., Rés., Commun., 95, 1861-1866, 1980; lásd még az 1. példát lentebb) eljárás alkalmazásával - előzetes szűrést végezhetünk. A találmány szerinti vizsgálatot ezután annak meghatározása érdekében végezzük, hogy az MTA-ázt kódoló gén jelen van-e a mintában lévő sejtekben. A minta - a szennyezések (például nem rosszindulatú sejtek) kiszűrése érdekében - katalitikusán aktív vagy inaktív protein jelenlétére is tesztelhető. E vonatkozásban alkalmas immunvizsgálat a Nobori és munkatársai által leírt eljárás (Cancer Rés., 53, 1098-1101, 1991; WO 95/17908 számon közrebocsátott nemzetközi szabadalmi bejelentés).

B) Szintetikus vagy rekombináns MTA-áz-polinukleotidok és -peptidek előállítása

A találmány egy másik tárgya olyan polinukleotidok (elsősorban oligonukleotidok), amelyek lehetővé teszik egy MTA-áz-specifikus nukleinsavszekvencia amp4

HU 220 196 Β lifikációját. Az ilyen oligonukleotidok tervezéséhez a fentebb említett szempontokat kell figyelembe venni. Az ilyen oligonukleotidok különösen alkalmasak a rosszindulatú daganatokkal kapcsolatos MTA-áz-hiány diagnosztizálásában.

A találmány további tárgya szintetikus és rekombináns MTA-áz és MTA-áz-peptidek, valamint az MTA-ázt és az MTA-áz-peptideket kódoló polinukleotidok. A „polinukleotid” kifejezés dezoxi-ribonukleotidokból vagy ribonukleotidokból álló polimerekre vonatkozik, melyek elkülönült ffagmentek alakjában vagy egy nagyobb konstrukció komponenseként léteznek. A találmány szerinti, MTA-ázt vagy MTA-áz-peptidet kódoló DNS cDNS-ffagmentekból vagy oligonukleotidokból állítható össze, miáltal olyan szintetikus gént kapunk, amely rekombináns transzkripciós egységben expresszálható. A találmány szerinti polinukleotidszekvenciák közé DNS-, RNS- és cDNS-szekvenciák tartoznak. A genetikai kód alapján leszármaztathatunk egy polinukleotidszekvenciát, azonban figyelembe kell venni a kód degeneráltságát. A találmány szerinti polinukleotidok közé tartoznak a genetikai kód eredményeként degenerált szekvenciák is.

A találmány szerinti peptidek és polinukleotidok közé tartoznak a MTA-áz funkcionális származékai, az MTA-áz-peptidek, valamint az ezeket kódoló nukleotidok. A „funkcionális származékon” egy molekula „fragmentjeit”, „változatait”, „analógjait” vagy „kémiai származékait” értjük. Egy molekula (például a találmány szerinti polinukleotidok bármelyike) „ffagmentje” a molekula valamilyen nukleotid-részhalmazát foglalja magában. Az ilyen molekula „változata” egy természetben előforduló molekulára vonatkozik, amely lényegében hasonló akár a teljes molekulához, akár annak ffagmentjéhez. Egy molekula „analógja” nem természetes molekulát jelent, amely lényegében hasonló akár a teljes molekulához, akár annak fragmentjéhez.

Egy molekuláról akkor mondjuk, hogy „lényegében hasonló” egy másik molekulához, ha a két molekula aminosavszekvenciája (vagy a polinukleotidok esetében nukleinsavszekvenciája) lényegében azonos. A lényegében hasonló aminosavmolekulák hasonló biológiai aktivitással rendelkeznek. Ilyenformán, feltéve, hogy két molekula hasonló aktivitással rendelkezik, az itt használt értelemben változatoknak tekintjük őket, még akkor is, ha az egyik olyan további aminosavakat is tartalmaz, amely a másikban nem található, vagy ha aminosavszekvenciájuk nem azonos.

Ahogy itt használjuk, egy molekula akkor „kémiai származéka” egy másik molekulának, ha olyan további molekularészeket tartalmaz, amelyek normális esetben nem tartoznak a molekulához. Az ilyen további molekularészek javíthatják a molekula oldékonyságát, abszorpcióját, biológiai felezési idejét stb. Más lehetőség szerint, ezek a molekularészek csökkenthetik a molekula toxicitását, megszüntethetik vagy mérsékelhetik a molekula nemkívánatos mellékhatásait stb. Az ilyen hatásokat közvetíteni képes komponensek leírását lásd p. Remington's Pharmaceutical Sciences, 16. kiadás, Mack Publishing Co., Easton, Penn. (1980).

Az MTA-áz primer aminosavszekvenciájának kis módosításai olyan proteineket eredményezhetnek, amelyek a találmányban leírt MTA-áz-enzimmel és -peptidekkel lényegében egyenértékű aktivitással rendelkeznek. Az ilyen módosítások lehetnek szándékosak (például helyre irányuló mutagenezis), de lehetnek spontán változások is. Az ilyen módosítások révén kialakult valamennyi protein és peptid a találmány tárgyát képezi, feltéve, hogy megtartják az MTA-áz biológiai aktivitását. Ezenkívül, a molekulában egy vagy több aminosav deléciója a szerkezetben olyan módosítást eredményezhet, amely nem befolyásolja lényegesen a molekula biológiai aktivitását. Ez kisebb méretű aktív molekula kifejlesztését eredményezheti, amely szélesebb körben alkalmazható. Az enzimből például eltávolítjuk azokat az N- vagy C-terminális aminosavakat, amelyek nem szükségesek a kívánt katalitikus vagy antigénaktivitás kifejtéséhez.

A „konzervatív változat” kifejezés azt jelenti, hogy a molekulában egy aminosavgyököt egy másik, biológiailag hasonló gyökkel helyettesítünk. A konzervatív változatok példái közé tartoznak az olyan változatok, melyekben egy hidrofób aminosavat egy másik hidrofób aminosavval, például izoleucinnal, valinnal, leucinnal vagy metioninnal helyettesíthetünk, vagy amelyekben egy poláris aminosavat egy másik poláris aminosavval (például lizint argininnal vagy aszparaginsavat glutaminsawal) helyettesítünk. A „konzervatív változat” kifejezés magában foglalja azt az esetet is, amikor egy szubsztituálatlan eredeti aminosav helyett szubsztituált aminosavat alkalmazunk, feltéve, hogy a szubsztituált polipeptid elleni antitestek immunológilag reagálnak a szubsztituálatlan polipeptiddel is.

A találmány szerinti MTA-áz és MTA-áz-peptidek előállításában alkalmazható DNS-szekvenciák több módszerrel nyerhetők. Például, a DNS-t jól ismert hibridizációs eljárások alkalmazásával izolálhatjuk. Ezek közé tartoznak (nem kizárólagosan): (1) próbák hibridizálása genomiális vagy cDNS-könyvtárakhoz (a közös nukleotidszekvenciák kimutatása érdekében); (2) expressziós könyvtárak antitestes screenelése a közös szerkezeti sajátosságok kimutatása érdekében; és (3) a polimeráz láncreakcióval (PCR) végzett szintézis.

A hibridizációs eljárások rekombináns kiónok jelölt, kevert szintetikus oligonukleotid próbák alkalmával történő screeneléséhez hasznosak, ahol minden egyes próba potenciálisan a (denaturált kétszálú DNSek heterogén elegyét tartalmazó) hibridizációs mintában lévő egy-egy specifikus DNS-szekvencia komplett komplementere. Az ilyen screeneléshez a hibridizációt előnyösen egyszálú DNS-sel vagy denaturált kétszálú DNS-sel végezzük. A hibridizáció különösen hasznos az olyan forrásokból származó cDNS-klónok kimutatásában, amelyekben a keresett polipeptidre vonatkozó mRNS-szekvenciák nagyon kis mennyiségben vannak jelen. Más szavakkal, a nem specifikus kötődés kiküszöbölése érdekében szigorú hibridizációs feltételek alkalmazásával lehetőség van arra, hogy például a cél-DNS egyetlen próbához való hibridizációja révén egy specifikus kiónt autoradiográfiásan láthatóvá tegyünk.

HU 220 196 Β

Egy MTA-ázt tartalmazó cDNS-könyvtárat úgy screenelhetünk, hogy a cDNS-ekből származó különböző mRNS-eket oocitákba injektáljuk, majd a cDNSgéntermékek expressziójának lejátszódásához megfelelő idő elteltével a kívánt cDNS expressziós termék jelenlétét teszteljük, amihez például MTA-ázra specifikus antitestet vagy az ismétlődő motívumok próbáit, és az MTA-ázra jellemző szöveti expressziós módot alkalmazunk. Más lehetőség szerint, a cDNS-könyvtár közvetve legalább egy epitóppal rendelkező MTA-áz-peptidekre screenelhető az ilyen polipeptidekre specifikus antitestek alkalmazásával. Amint a következő szakaszban lettjük, az ilyen antitestek egyaránt lehetnek poliklonális vagy monoklonális eredetűek, és az MTA-áz cDNS jelenlétére utaló expressziós termékek detektálásához alkalmazhatók.

A nukleinsavhibridizáción alapuló screenelési módszerek alkalmazásával bármilyen szervezettől bármilyen génszekvencia izolálható, feltéve, hogy a megfelelő próba rendelkezésre áll. A kérdéses proteint kódoló szekvencia egy részének megfelelő oligonukleotid próbákat kémiai szintézissel állíthatjuk elő. Ehhez az aminosavszekvencia oligopeptid szakaszainak ismeretére van szükség. A proteint kódoló DNS-szekvenciára a genetikai kód alapján következtethetünk, azonban figyelembe kell venni a kód degeneráltságát. Ha a szekvencia degenerált, kevert addíciós reakciót végezhetünk. Ehhez denaturált kétszálú DNS heterogén elegyét alkalmazzuk. Az ilyen screeneléshez a hibridizációt előnyösen egyszálú DNS-sel vagy denaturált kétszálú DNS-sel végezzük.

Az MTA-ázt vagy fragmentjeit kódoló specifikus DNS-szekvenciák az alábbi módszerekkel is kialakíthatók: 1. a genomiális DNS-ből kétszálú DNS-szekvenciák izolálásával; 2. a kérdéses polipeptidhez szükséges kodonok biztosítása érdekében egy DNS-szekvencia kémiai előállításával; és 3. kétszálú DNS-szekvencia (eukarióta-donorsejtből izolált mRNS reverz transzkripciójával végzett) in vitro szintézisével. Az utóbbi esetben az mRNS kétszálú DNS-komplementere alakul ki, melyet általánosan cDNS-nek nevezünk.

Találmányunkban az MTA-ázt kódoló polinukleotid és mindenféle változata rekombináns expressziós vektorba inszertálható. A „rekombináns expressziós vektor” kifejezés plazmidra, vírusra vagy egyéb ismert hordozóra vonatkozik, amely a megfelelő genetikai szekvenciák inszertálásával vagy beépítésével manipulálható. Az ilyen expressziós vektorok olyan promoter szekvenciát tartalmaznak, amely a gazdasejtben elősegíti az inszertált genetikai szekvencia hatékony transzkripcióját.

A gazdasejtek a szakemberek számára jól ismert, hagyományos technikák alkalmazásával traszformálhatók a rekombináns DNS-sel. A gazdasejtek lehetnek eukarióták (például kínaihörcsög-petefészeksejtek) vagy prokarióták (például baktériumok vagy élesztők). Amennyiben a gazdasejt prokarióta, például E. coli, a DNS felvételére képes kompetens sejtek az exponenciális növekedési fázis után összegyűjtött és a kalcium-kloridos módszerrel (jól ismert eljárások alkalmazásával) kezelt sejtekből nyerhetők. Más lehetőség szerint, a kalcium-klorid helyett magnézium-klorid vagy rubidium-klorid is alkalmazható. A traszformáció protoplaszt kialakításával vagy elektroporációval is elvégezhető.

A mikrobiálisan expresszált, találmány szerinti MTA-áz vagy fragmentjei hagyományos módszerek alkalmazásával izolálhatok, például preparatív kromatográfiával és monoklonális vagy poliklonális antitestek alkalmazásával végzett immunológiai elválasztással.

Az 1. számú szekvencia nyújtotta információk alapján az MTA-áz teljes hosszúságú aminosavszekvenciája könnyen leszármaztatható. Ezen információk alkalmazásával az MTA-áz vagy az MTA-áz-peptidek általánosan alkalmazott módszerekkel (például az alfa-aminocsoportok t-BCO vagy FMOC védésével) felesleges kísérletezés nélkül szintetizálhatok. Mindkét eljárás lépésenkénti szintézist jelent, melyben a peptid C-terminálisától kiindulva lépésenként egy aminosavat adunk az előző aminosavhoz (lásd Coligan és munkatársai, Current Protocols in Immunology, Wiley Interscience, 9. szakasz, 1991). A találmány szerinti peptidek különböző, jól ismert szilárd fázisú peptidszintézises eljárással is előállíthatok, mint például Merrifield (J. Am. Chem. Soc., 85, 2149,1962) és Stewart és Young módszerével (Solid Phase Peptides Synthesis, Freeman, San Francisco, 27-62. oldal, 1969), melyben a polimer tömegére vonatkoztatva 0,1-1,0 mmol/g amint tartalmazó sztirol-divinil-benzol-kopolimert alkalmaznak.

Ez utóbbi eljárásban a kémiai szintézis befejeztével a peptidek védőcsortjainak eltávolítását és a peptidek polimerről történő lehasítását 0 °C-on 1/4-1 óráig folyékony HF és 10% anizol elegyével kezelve végezzük. A reagensek lepárlása után a peptideket 1%-os ecetsavval vonjuk ki a polimerből, és a kapott oldatot a nyerspeptid kinyerése érdekében liofilizáljuk. A nyerspeptidet Sephadex G-15 oszlopon, oldószerként 5%-os ecetsav alkalmazásával gélfiltrációval tisztíthatjuk. Az oszlop megfelelő frakcióinak liofilizálásával a homogén peptidet vagy peptidszármazékokat kapjuk, amelyek standard technikákkal (például aminosavanalízissel, vékonyréteg-kromatográfiával, nagyteljesítményű folyadékkromatográfiával, UV abszorpciós spektroszkópiával, molárisforgatóképesség-analízissel, az oldhatóság vizsgálatával) karakterizálhatók, és mennyiségileg szilárd fázisú Edman-lebontással határozhatók meg.

C) Anti-MTA-áz-antitestek előállítása

Az MTA-áz-peptidek antigén hatását hagyományos technikákkal vizsgálhatjuk, melyekkel meghatározhatjuk egy, a peptiddel immunizált állat antitest-reakciójának nagyságrendjét. Az anti-MTA-áz-antitestek kialakításához általában olyan MTA-áz-peptideket alkalmazunk, amelyek az MTA-ázhoz viszonylag nagy affinitással rendelkező antitestek magas titerű termelődését indukálják. Az ilyen peptidek, immunogénként való alkalmazáshoz, például Rangione és munkatársai (J. Bioi. Chem., lásd fentebb) által leírt eljárással vagy az MTAáz-peptidek kinyeréséhez fentebb leírt módszerekkel tisztíthatok.

Az antigén hatású peptidek előállítása után az immunizáló peptid elleni antitesteket úgy hozzuk létre, hogy

HU 220 196 Β egy emlősbe (például nyúlba, egérbe vagy patkányba) antigén hatású peptidet juttatunk. Szemléltetésként a szekvencialista 2. és 3. számú szekvenciájaként két antigén hatású MTA-áz-peptid aminosavszekvenciáját mutatjuk be. Az e peptidekkel immunizált nyulak által termelt antitestek a tisztított MTA-áz ellen (1:1500, illetve 1:4000 hígításban) 50%-os reakciót mutattak.

Az állatok antigén hatású peptidekkel végzett immunizálásához előnyösen többszörös injektálást alkalmazunk (lásd például Langone és munkatársai [a szerk.j, Production of Antisera with Small Doses of Immunogen: Multiple Intradermal Injections”, Methods of Enzymology, Acad, Press, 1981). Nyulakban jó antitestes reakció érhető el, ha a nyulakat komplett Freund-féle adjuvánsban emuigáit 1 mg antigén hatású MTA-ázzal intradermálisan oltjuk, majd néhány hét elteltével az első antigénnel, nem komplett Freund-féle adjuváns alkalmazásával, egy vagy több emlékeztető oltást adunk.

Kívánt esetben az immunizáló peptid jól ismert technikák alkalmazásával végzett konjugálással hordozóproteinhez kapcsolható. Az ilyen általánosan alkalmazott, a pepiidhez kémiailag kapcsolt hordozók közé tartozik a keyhole limpet hemocianin (KLH), a thyroglobulin, a szarvasmarha-szérumalbumin (BSA) és a tetanusz toxoid. Ilyen esetben a kapcsolt peptidet használjuk az állat (például egér vagy nyúl) immunizálásához. Mivel jelenlegi ismereteink szerint az MTA-áz az emlős fajok között konzervált, az MTA-áz-proteinek immunogenitásának fokozása érdekében előnyösen hordozóproteint alkalmazunk.

Az állatok által termelt poliklonális antitestek (például olyan közeghez történő kapcsolással és elúcióval, amelyhez az antitestek antigénjét képező peptideket kötöttük) tovább tisztíthatok. A szakemberek számára ismertek az immunológiában a poliklonális, valamint a monoklonális antitestek tisztítására és/vagy koncentrálására használatos különböző technikák (lásd például Coligan és munkatársai, Current Protocols in Immunology, Wiley Interscience, 9. szakasz, 1991).

A moniklonális antitestek előállításához előnyösen egeret vagy patkányt immunizálunk. A találmányban alkalmazott „antitest” kifejezésen teljes molekulákat, illetve ezek fragmentjeit értjük [például Fab és F(ab)'_z], melyek képesek az epitóp determinánsokhoz kötődni. E vonatkozásban a „találmány szerinti monoklonális antitestek” kifejezés az MTA-ázra specifikus monoklonális antitestekre vonatkozik.

A monoklonális antitesteket (mAb) szekretáló hibridómák előállításához alkalamazott általános eljárás jól ismert (Kohler és Milstein, Natúré, 256, 495, 1975). Eszerint, öt, melanomában, teratomában, méhnyakrákban, gliomában vagy tüdőrákban szenvedő betegből, testtájéki nyirokcsomók drénezésével limfocitákat izoláltunk, az összegyűjtött limfocitákat összekevertük, majd SHFP-l-gyel fuzionáltuk. A hibridómákat a rákos sejtvonalakhoz kötődő antitestek termelésére vizsgáltuk.

A monoklonális antitestek MTA-áz-specifitását rutinszerű screenelési technikák [például enzimkötött immunszorbens vizsgálat (ELISA)] alkalmazásával igazolhatjuk, miáltal meghatározható a kérdéses monoklonális antitest elemi reagálási módja.

Egy monoklonális antitestről - felesleges kísérletezés nélkül - úgy is megállapíthatjuk, hogy a találmány szerinti monoklonális antitesttel azonos specifitású-e, hogy meghatározzuk, vajon a tesztelt monoklonális antitest megakadályozza-e a találmány szerinti monoklonális antitest fentebb leírtak szerint izolált MTA-ázhoz történő kötődését. Amennyiben a tesztelt antitest kompetitora a találmány szerinti monoklonális antitestnek (amit az mutat, hogy a találmány szerinti mAb kötődése csökken), úgy valószínű, hogy a két mAb azonos vagy igen hasonló epitóphoz kötődik.

Egy másik módszer szerint, annak megállapítása érdekében, hogy egy mAb a találmány szerinti mAb specifitásával rendelkezik-e, a találmány szerinti monoklonális antitestet előzetesen olyan antigénnel inkubáljuk, amellyel normális esetben reaktív, és meghatározzuk, hogy a tesztelt mAb antigénhez való kötődési képessége gátlás alá esik-e. Amennyiben a tesztelt mAb gátolt, úgy minden valószínűség szerint a találmány szerinti monoklonális antitesttel azonos vagy ahhoz nagyon hasonló epitópspecifitással rendelkezik.

D) MTA-áz detektáló készletek

Az MTA-áz detektáló készleteket laboratóriumi vagy klinikai alkalmazásokhoz készíthetjük. Ezek a készletek a fentebb leírt eljárásokban szükséges reagenseket tartalmazzák. Például, a fenti A) szakaszban leírt eljáráshoz alkalmazható készlet előnyösen a B) szakaszban leírtak szerint előállított oligonukleotid primereket, detektálható módon jelölt hibridizációs próbákat és reagenssel bevont mikrotiter lemezeket tartalmaz. A készlet az MTA-áz immunológiai kimutatásához (lásd 08-176,413 számú szabadalmi bejelentés, 1993. december 29.) tartalmazhat antitesteket is (melyeket a C) szakaszban írtunk le).

A találmány gyakorlati megvalósítását az alábbi példák segítségével szemléltetjük. A példákat bemutatási céllal, és semmiképpen nem a találmány tárgykörének korlátozásaként írjuk le.

A példákban az alábbi rövidítéseket alkalmazzuk: AS=antiszensz; DTT=ditio-treitol; MTA-áz=5'-dezoxi-5 '-metil-tio-adenozin-foszforiláz; PCR=polimeráz láncreakció; S=szensz; SSC=0,3 M NaCl, 0,03 M nátrium-citrát-dihidrát; SDS=nátrium-dodecil-szulfát.

1. példa

Az MTA-áz katalitikus aktivitás tesztelése mintában

Az MTA-áz foszforizáló aktivitását a [metiF¹⁴C]-5metil-tio-ribóz-1-foszfát [metil¹⁴C]-5'-dezoxi-5'-metil-tio-adenozinból történő képződésének mérése alapján határoztuk meg (Seidenfeld és munkatársai, Biochem. Biophys. Rés. Commun., 95, 1861-1866,1980). A standard reakcióelegy 200 pl össztérfogatban 50 mM kálium-foszfát-puffert (pH=7,4), 0,5 mM [metil-^I4C]5-dezoxi-5'-metil-tio-adenozint (2xl0⁵ cpm/mmol), 1 mM DTT-t és jelzett mennyiségű enzimet tartalmazott. 37 °C-on 20 percig végzett inkubálás után a reakciót 50 pl 3 M triklór-ecetsav hozzáadásával leállítottuk, és a reakcióelegy 200 pl-es részleteit vízzel ekvi7

HU 220 196 Β '72 librált 0,6 cm(x (2 cm-es Dowex 50-H* oszlopra töltöttük, A [metil-¹⁴C]-5-metil-tio-ribóz-l-foszfátot közvetlenül (2 ml 0,1 M sósavat tartalmazó) szcintillációs fiolákba eluáltuk.

2. példa

Természetes MTA-áz tisztítása patkánymájból

Patkánymájból Rangione és munkatársai eljárásának (J. Bioi. Chem., 261, 12324-12329,1986) módosításával izoláltunk MTA-ázt. 50 friss patkánymájat Waring Blendor-készülékben 1 mM DTT-t tartalmazó négyszeres térfogatnyi 10 mM kálium-foszfát-pufferrel (pH=7,4) („A” puffer) homogenizáltunk. A homogén szuszpenziót egy óra hosszat 15000 x g-vel centrifugáltunk, s a kapott felülúszót amónium-szulfáttal frakcionáltuk. Az 55%-os és 75%-os telítettség közötti koncentrációnál kapott csapadékot centrifugálással (20 percig 150000 xg) összegyűjtöttük, majd minimális térfogatú „A” pufferben feloldottuk. A mintát ezután egy éjszakán keresztül háromszor cserélt, 100-szoros térfogatnyi „A” pufferrel szemben dializáltuk.

A mintát 15000 χ g-vel 30 percig centrifugálva tisztítottuk, majd „A” pufferrel ekvilibrált DEAE-Sephacryl oszlopra 1,5x18 cm Pharmacia) töltöttük. Az ekvilibráló puffer 80 ml-ével végzett mosás után „A” pufferben 0 M -> 0,3 M lineáris gradienssel (80 ml) végzetünk elúciót. Az MTA-áz 0,1 M és 0,15 M NaCl-koncentrációnál eluálódott. A legalább 0,06 egység/mg proteint tartalmazó frakciókat ultrafiltrációval (Amicon PM-10 Diaflow membránokon) 20-szoros töménységűre koncentráltuk, és 1 mM DTT-t tartalmazó 25 mM kálium-foszfát-pufferrel (pH=7,4) („B” puffer) szemben dializáltuk. A mintát ezután hidroxi-apatit oszlopra (1x12 cm; BioRad) töltöttük. A nem abszorbeálódott proteineket „B” pufferrel eluáltuk, majd az oszlopot mM DTT-t tartalmazó 40 ml 50 mM kálium-foszfátpufferrel (pH=7,4) mostuk.

Az MTA-ázt 50 mM-> 250 mM kálium-foszfátpuffer(pH=7,4) lineáris gradiensével (40 ml) eluáltuk. Az MTA-áz-aktivitást tartalmazó frakciókat ultrafiltrálással 30-szoros töménységűre koncentráltuk, és ismételt bekoncentrálással, illetve 50 mM kálium-foszfátpufferes (pH=7,4) hígítással ditio-treitolból felszabadítottuk. A részlegesen tisztított enzimet 50 mM foszfátpufferrel (pH=7,4) ekvilibrált szerves higanyvegyületet tartalmazó agaróz oszlopra (Bio-Rad) töltöttük. Az oszlop eluálását lépésenként végeztük, amihez a) 50 mM kálium-foszfát-puffert (pH=7,4); b) 50 mM káliumfoszfát-puffert (pH=7,4), 2 M KCl-oldatot; és c) 50 mM kálium-foszfát-puffert (pH=7,4); 2 M KCl-oldatot és 40 mM 2-merkapto-etanolt alkalmaztunk. Az enzimet ezután 50 mM kálium-foszfát-puffer (pH=7,4),

M KC1 és 200 mm 2-merkapto-etanol elegyével eluáltuk. A legalább 3 egység/mg proteint tartalmazó frakciókat összeöntöttük, ultrafiltrálással 1 ml-re koncentráltuk, majd 10 mM Tris/HCl (pH=7,4) és 1 M DTT („C” puffer) 1000-szeres térfogatával szemben egy éjszakán keresztül dializáltuk. Utolsó tisztítási lépésként a minta részleteit (1 ml) 1 ml/perc áramlási sebességgel [ImM DTT-t tartalmazó 10 mM Tris/HCl pufferrel (pH=7,4) ekvilibrált] MONO Q oszlopra (Pharmacia) injektáltuk. Az MTA-áz-aktivitás „C” pufferben 0,08 M és 0,14 M NaCl-koncentráció között eluálódott. A frakciókat ultrafiltrációval 0,5 ml-re koncentráltuk és 1000-szeres térfogatú „B” pufferrel szemben dializáltuk.

3. példa

A patkány-MTA-áz részleges aminosavszekvenciájának meghatározása

A tisztított mintát liofilizáltuk, 50 μΐ mintafelvivő pufferben (1% nátrium-dodecil-szulfát [SDS], 10% glicerin, 0,1 M DTT és 0,001% bróm-fenol kék) oldottuk, majd 0,5 mm vastag 10% SDS poliakrilamid-gélre vittük (Bio-Rad MINIGEL készülékben). Elektroforézis után a proteineket Bio-Rad transzbiot rendszerben, átvivőpuffer (15 mM Tris, 192 mM glicin és 20% metanol, pH=8,3) alkalmazásával, két órán keresztül nitrocellulózra (0,45 mm pórusméret, Millipore) elektroblottoltuk (lásd Towbin és munkatársai, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 76, 4340-4345, 1979).

Az átmásolás után a proteineket Ponceau S festékkel (Sigma) reverzibilisen festettük, amihez Salinovich és Montelaro eljárásának (Anal. Biochem., 156, 341 -347, 1987) módosítását alkalmaztuk. Eszerint a nitrocellulóz filtert 60 másodpercre 1%-os vizes ecetsavban készített 0,1 %-os Ponceau S festékoldatba merítettük. A lenyomatról a felesleges festék eltávolítása érdekében a nitrocellulózt 1%-os ecetsavban 1-2 percig óvatosan leöblítettük. A festékkel kimutatott proteintartalmú régiót kivágtuk, Eppendorf-csőbe (1,5 ml) tettük, desztillált vízzel mostuk, majd - az emésztés során a proteáz nitrocellulózhoz történő abszorpciója megelőzése érdekében 37 °C-on 30 percig 100 mM ecetsavban oldott 1,2 ml 0,5%-os poli(vinil-pirrolidon)-nal (átlagos molekulatömeg=40 000 D, DVP-40) inkubáltuk. A felesleges PVP-40-et vízzel végzett erőteljes mosással (legalább ötszöri cserével) távolítottuk el.

A nitrocellulóz csíkokat ezután körülbelül lxl mmes darabokra vágtuk, és visszatettük az Eppendorf-csőbe. A nitrocellulózon lévő proteint Los és munkatársai leírása szerint (Science, 243, 217-220,1989) emésztettük. Eszerint, az Eppendorf-csőbe 100 mM Tris-HCl (pH=8,2)/acetonitril 95:5 (V/V) arányú elegyében tripszint (10 pmól) tettünk, és az elegyet 37 °C-on egy éjszakán át inkubáltuk. Emésztés után a peptidtartalmú felülúszót 30 μΐ 10%-os trifluor-ecetsavval savanyítottuk, votrexeztük, majd 15000 x g-vel egy percig centrifugáltuk. A felülúszót eltávolítottuk, majd azonnal Brownlee Aquapore Bu-300 analitikai oszloppal (2,1 χ 100 mm) felszerelt reverz fázisú HPLC-készülékbe (Beckmann) injektáltuk.

Az oszlopon 200 μΐ/perc átfolyási sebességgel 5 percig 0,1 %-os trifluor-ecetsavat (D eluens) pumpáltunk át, majd az átfolyási sebességet 100 μΐ/percre csökkentettük, és az E eluenssel [acetonitril és víz 70:30 (V/V) arányú elegyében 0,08-0,095% trifluor-ecetsav] eluáltuk. A peptidtartalmú frakciókat 215 nm-nél mért UVabszorpció alapján manuálisan Eppendorf-csövekbe gyűjtöttük. A 60. és TI. jellemző frakciókat aminosavszekvenálásnak vetettük alá (120A Online PTH-AA

HU 220 196 Β

Analyzer-rel felszerelt ABI477A Protein Sequencer alkalmazásával), miáltal a patkány-MTA-áz független részleges aminosavszekvenciáit kaptuk. A peptidek aminosavszekvenciáit (1. peptid - 60. frakció, és 2. peptid - 77. frakció) a 4. és 5. számú szekvenciaként mutatjuk be.

példa

A humán ΜΤΑ-άζ-gén egy részét kódoló DNS-fragment amplifikálása

Az 1. peptid (4. számú szekvencia) és 2. peptid (5. számú szekvencia) részleges aminosavszekvenciája alapján különböző polaritású oligonukleotid primerek két készletét szintetizáltuk. Az amplifikált DNS-fragment klónozásának elősegítése érdekében mindegyik oligonukleotidot úgy terveztük, hogy 5'-végükön egyedi restrikciós helyet (EcoRI vagy BamHl) tartalmazzanak. A PCR amplifikációban való felhasználáshoz LambdaTRAP-készlet (Clontech) alkalmazásával humán méhlepény-cDNS-génkönyvtár egymillió plakk-képző egységéből (pfu; plaque-forming unit) teljes cDNS-t izoláltunk. A PCR-reakciót 100 μΐ össztérfogatú elegyben végeztük, amely humán méhlepény-cDNS-génkönyvtárból származó 1 pg teljes cDNS-t, 1 xPCR puffért (10 mM KC1,10 mM Tris-HCl [pH=8,3], 2,5 mM MgCl₂), mindegyik dNTP-ből 0,2 mM-t, a szensz és antiszensz primerekből 100 mg-ot és 10 egység Taq polimerázt (Stoffel Fragment, „AMPLI TAQ”, Perkin-Elmer Cetus) tartalmazott.

„GENE AMP” PCR System 9600 készülékben (Perkin-Elmer Cetus) 40 ciklust végeztünk; az egyes ciklusok denaturálásból (92 °C, 1 perc), hibridizálásból (55 °C, 2 perc) és lánchosszabbításból (72 °C, 2 perc) álltak. A PCR-terméket 0,8%-os agarózgélen lxTA pufferben (40 mM Tris-acetát, 20 mM Na-acetát, 2 mM EDTA, pH=7,9) végzett elektroforézissel választottuk el, és egy 450 bp-os DNS-fragmentet amplifikáltunk. A PCR amplifíkációs terméket EcoRI és BamHl enzimmel emésztettük, 0,8%-os agarózgélen lxTA pufferben elválasztottuk, „GENE CLEAN” készlet (BiolOl) alkalmazásával kinyertük a gélről, EcoRI-gyel és BamHI-gyel hasított pBluescript SK+ vektorba (Stratagene) szubklónoztuk, majd a didezoxi láncterminációs eljárással, univerzális szekvenáló primer alkalmazásával szekvenáltuk („Sequenase” Version 1.0 DNSszekvenáló készlet, USB).

5. példa

Humán méhlepény-cDNS-génkönyvtár screenelése

A PCR-reakcióval amplifikált termék szekvenciaanalízis eredménye (4. példa) tökéletes egybeesést mutat az 1. peptid (5. számú szekvencia) C-terminális aminosavszekvenciájával. A humán méhlepény-cDNS-génkönyvtárat (Clontech) hibridizációs próbaként a 450 bpos DNS-fragmenttel screeneltük. A screeneléshez Y1090 E. coli sejteket élénk rázatás közben, 0,2% maltózt és 10 mM MgSP-t tartalmazó LB tápközegben (egy liter térfogatban 10 g tripton, 5 g élesztőkivonat és 10 g NaCl) 37 °C-on egy éjszakán keresztül inkubáltunk. Mindegyik tenyésztőlemezhez 0,3 ml gazdasejttenyészetet 3 x1ο⁴ pfu fággal elegyítettünk, és az elegyeket 37 °C-on 20 percig inkubáltuk. A gazdasejt/fág elegyeket 0,7% agarózt tartalmazó, 48 °C-ra melegített LB tápközeghez (LB fedőagar) (8 ml) adtuk, és 20 agarlemezre (135x15 mm) öntöttük. 37 °C-on 6-8 órás inkubálás után a plakkok láthatóvá váltak. A lemezeket egy órára 4 °C-ra hűtöttük, a plakkokat 3 percig Colony/Plaque Screen nylon membránokra (NEN Research Products, Dupont, Boston, MA) másoltuk, denaturáltuk, (0,5 N NAOH-oldatban kétszer 2 percig), majd renaturáltuk (1,0 M Tris-HCl-pufferben [pH=7,5] kétszer 2 percig), végül levegőztetéses szárítással rögzítettük. Két műanyag tasakban (mindegyikben 10 membrán) 20 ml előhibridizáló pufferrel (1% SDS, 2xSSC, 10% dextrán-szulfát, 50% ionmentesített formamid) 42 °Con 4 órán át előhibridizációt végeztünk.

A részleges humán MTA-áz-gén 450 bp-os EcoRIBamH fragmentjét nick transzlációs készlet (Boehringer Mannheim) alkalmazásával [alfa-³²P]-dATP-vel (3000 Ci/mmol) jelöltük, a be nem épült radioaktív anyagtól NICK-oszlopon (Pharmacia) elválasztottuk, 96 °C-on 10 percig denaturáltuk, jégen lehűtöttük, és a műanyag tasakokban lévő membránokhoz adtuk (a próba koncentrációja 106 dpm/ml volt).

A jelölt próba specifikus aktivitása körülbelül 10^{5 * * 8} dpm/pg. A hibridizációt 42 °C-on egy éjszakán keresztül végeztük. A hibridizáció után a membránokat szobahőmérsékleten háromszor öt percig 2xSSC feleslegével, majd 65 °C-on 20 percig 2xSSC és 0,1 SDS elegyével, végül szobahőmérsékleten 20 percig 0,2 χ SSC és 0,1% SDS elegyével mostuk. A mosott membránokat egy éjszakán át röntgenfilmre exponáltuk.

Az agarlemezekből egy pozitív jel körül több plakkot tartalmazó agardugókat vettünk ki, és ezeket 1 ml steril fágdiluensben (50 mM Tris-HCl, pH=7,5, 0,1 M NaCl, 8 mM MgSO₄ 0,01% zselatin) hígítottuk, majd a fentiek szerint ismételten addig screeneltük, míg tiszta pozitív plakkokat nem kaptunk. A screenelés eredményeként hozzávetőleg 500000 plakkot, hat pozitív kiónt kaptunk. LB lemezeken végzett amplifikálás után a pozitív kiónok valamennyi fág-DNS-ét „Lambda-TRAP” készlet alkalmazásával (Clontech) tisztítottuk, hogy teljes inszertet kapjunk, de - mivel az inszert belsejében található egy EcoRI hely - valamennyi kiónból két sávot vágtunk ki.

A reprezentatív fágklónból (MTAP-1) származó két EcoRI inszert fragmentet (850 bp és 1100 bp) EcoRI-gyel hasított pBluescript SK⁺ vektorba (Stratagene) szubklónoztuk. A kapott szubklónokat MTAP-2nek (850 bp), illetve ΜΤΑΡ-3-nak (1100 bp) neveztük el. A két szubklón restrikciós analízise és DNSszekvenálása azt mutatta, hogy az MTAP-2 a 3. peptid C-terminálisának megfelelő (90%-os homológia) szekvenciájú 254 aminosavat kódoló nyitott leolvasási kerettel rendelkezik. A 32 kD-os humán MTA-áz (F. D. Rangione és munkatársai, J. Bioi. Chem., 261, 12324-12329, 1986) molekulatömegéből számítva a 254 aminosav a teljes protein mintegy 85%-át teszi ki - körülbelül 50 aminosav (DNS-szintjén legalább 150 bp) hiányzik.

HU 220 196 Β

6. példa

Az MTA-áz hiányzó 5 '-végének kialakítása érdekében végzett primer hosszabbítás A hiányzó 5 '-terminális DNS-fragment kialakítása érdekében a cDNS-végek gyors amplifikációját (RACE; rapid amlification of cDNA ends) alkalmaztuk (Loh és munkatársai, Science, 243, 217-220, 1989; Frohman és munkatársai, PNAS, 85, 8998-9002, 1988). Humán méhlepényből származó 1 pg poli (A+)RNS-t (Clontech) 65 °C-on 6,25 pl vízben öt percig melegítettünk, jégen lehűtöttük, és 4 pl 5xRTC puffer (250mM Tris-HCl, [pH=8,15], 30 mM MgCl₂, 200 mM KC1, 5 mM DTT), 4 μΐ (0,4 mg/1) aktinomicin D (Boehringer), mindegyik dNTP-ből 1 μΐ (20 mM), 0,25 μΐ (10 egység) RN-ázin (Boehringer), 1 μΐ humán MTAáz-specifikus antiszensz oligonukleotid (3AS) és 10 egység madár mieloblasztozis vírus reverz taszkriptáz (Boehringer) elegyéhez adtuk, majd az elegyet 42 °C-on két óra hosszat inkubáltuk.

A felesleges prímért és a dNTP-ket az alábbiak szerint távolították el: a 20 μΐ cDNS-t NICK oszlopra (Pharmacia) vittük, és kétcseppnyi frakciókat gyűjtöttünk. Az első radioaktivitás-csúcshoz viszonyítva 5-8. frakciókat összeöntöttük, 1/10 térfogatú 7,5 M ammónium-acetáttal és 2,5 térfogat etanollal -80 °C-on kétórás kezeléssel kicsaptuk, 4 °C-on 15000 χ g-vel 30 percig centrifugáltuk, 0,5 ml 80%-os etanollal mostuk, csökkentett nyomáson (Speedvac) szárítottuk, majd 20 μΐ vízben feloldottuk. A farok kialakításához (tailing) az oldathoz 1,5 μΐ dGTP-oldatot (20 mM), 2,4 μΐ CoCl₂-oldatot (25mM) 6 μΐ 5 χ tailing puffért (1 mM kálium-kakodilát, 125 mM Tris-HCl [pH=6,6], 1,25 mg/ml szarvasmarha-szérumalbumin) és 0,5 μΐ (15 egység) terminális dezoxinukleotidil-transzferázt (Boehringer) adtunk.

Az elegyet 37 °C-on egy óra hosszat inkubáltuk, 15 percig 60 °C-on melegítettük, azonos térfogatú TE pufferrel (10 mM Tris-HCl, pH=7,5, 0,1 mM EDTA) extraháltuk, majd a fentiek szerint etanollal kicsaptuk. A farokkal ellátott cDNS-állományt 20 μΐ vízben feloldottuk, és PCR-hez a kapott oldat 1 μΐ-ét alkalmaztuk. Az amplifikációhoz két további prímért szintetizáltunk. Az egyik egy MTA-áz-specifikus antiszensz primer, amely a 3AS oligonukleotid helyétől upstream irányban 180 bp távolságban helyezkedik el, a másik pedig a poli(G) vég prímére. Az amplifikációt a fentebb leírtak szerint 40 ciklusban végeztük. Mindegyik ciklus denaturálásból (92 °C, 1 perc), hibridizálásból (50 °C, 2 perc) és lánchosszabbításból (72 °C, 0,5 perc) állt.

A PCR-terméket 0,8%-os agarózgélen elektroforézissel választottuk el. A kapott 520 bp-os DNS-fragment specifikusan amplifikálódott, 0,8%-os preparatív agarózgélen végzett tisztítás után az 520 bp-os DNSfragmentet Notl-gyel és BclI-gyel emésztettük (a megfelelő restrikciós helyek a meghosszabbított DNS-fragment és az eredeti MTAP-2 szubklón fragment között találhatók), majd Notl-gyel és BamHI-gyel hasított pBluescript SK⁺ vektorba (Stratagene) szubklónoztuk. Három független szubklón (MTAP-4, MTAP-5, illetve MTAP-6) szekvenciaanalízise azt mutatja, hogy ez a három klón az átfedő doménban pontosan párosodott aminosavszekvenciát tartalmaz.

E három, printerrel meghosszabbított cDNS-szubklón hosszúsága némileg különböző. Ez arra utal, hogy ezek független PCR-termékek, és szekvenciájuk a helyes mRNS-szekvenciát tükrözi (a PCR során esetlegesen bekövetkező bázisbeépülések nélkül). A metionint kódoló ATG startkodont tartalmazó új upstream szekvencia és az MTAP-2 szubklónból származó downstream szekvencia 283 aminosavat kódoló nyitott leolvasási keretet képez.

7. példa

Rekombináns humán MTA-áz expressziója E. coliban

A humán MTA-áz teljes hosszúságú cDNS-ének kialakításához az MTP-4 szubklón (amely a 6. példában kapott három szubklón közül a leghosszabb inszertet tartalmazza) printerrel meghosszabbított cDNS-fragmentjét az MTAP-2 szubklón 5'-végéhez kapcsoltuk, amihez a közös Hindii restrikciós helyet használtuk. Az MTAP-4 szubklónból származó Notl/HindlI DNSfragmentet és az MTAP-2 szubklónból származó nagy HindlI/EcoRI fragmentet összekevertük, és Notl-gyel és EcoRI-gyel hasított pBluescreipt SK⁺ vektorba (Stratagene). A humán MTA-áz teljes hosszúságú cDNS-ét tartalmazó, kapott szubklónt ΜΤΑΡ-7-nek neveztük el. E cDNS-klón valódiságának ellenőrzése érdekében a rekombináns proteint Taq promotert tartalmazó pKK223-3 E. coli expressziós vektor (Pharmacia) alkalmazásával expresszáltuk.

Annak érdekében, hogy a cDNS-fragment 5' új EcoRI helyet, 3 '-végén pedig Pstl helyet alakítsunk ki, a Shine-Dalgamo (SD) szekvenciát tartalmazó 5' primer oligonukleotid és egy másik 3' primer alkalmazásával PCR reakciót végeztünk. Az amplifikációt a fentebb leírtak szerint 20 ciklusban végeztük. Mindegyik ciklus denaturálásból (92 °C, 1 perc) hibridizálásból (55 °C, 2 perc) és lánchosszabbításból (72 °C, 1 perc) állt. A PCR-terméket EcoRI-gyel és Pstl-gyel emésztettük, 0,8%-os agarózgélen elektroforézissel tisztítottuk, majd EcoRI-gyel és Pstl-gyel hasított pBluescreipt SK⁺ vektorba (Stratagene) szubklónoztuk.

A kapott, MTAP-8 elnevezésű szubklónban a szóban forgó teljes szekvencia ellenőrzése után az EcoRI/PstI fragmentet kivágtuk, és EcoRI-gyel és Pstlgyel hasított pKK223-3 vektorba szubklónoztuk, miáltal az E. coli expressziós vektorban lévő humán MTAáz-cDNS-t kaptuk. Az MTAP-9 elnevezésű szubklónt JM105 E. coli törzsbe szubklónoztuk. A transzformált sejtek összes proteinjének enzimatikus aktivitását és spektrumát izopropil-B-D-tio-galaktopiranozid (IPTG) indukcióval vagy anélkül vizsgáltuk. Ehhez egyetlen transzformált telepet 2 ml LB tápközegbe oltottunk, egy éjszakán át 37 °C-inkubáltuk, s a tenyészet 20 μΐ-ét két műanyag csőbe tettük (melyek mindegyike 2 ml friss LB tápközeget tartalmazott) (1:100 hígítás).

°C-on egy órás inkubálás után az egyik csőbe az indukció érdekében 20 μΐ 0,1Μ IPTG-t adtunk (1 mM végkoncentráció), és az elegyet 37 °C-on további négy

HU 220 196 Β óra hosszat inkubáltuk. A sejteket 15000xg-vei 5 percig centrifugálva összegyűjtöttük, 100 pl foszfátpufferben (50 mM kálium-foszfát, pH=7,5,1 mM DTT) újraszuszpendáltuk, jégen 30 másodpercig végzett hangkezeléssel feltártuk, és a 15000 xg-vel 10 percig centrifugálva nyers sejtkivonatot kaptunk.

A proteinkoncentrációt a Bradford-eljárás (BioRad, Protein Assay) alkalmazásával határoztuk meg.

Az enzimatikus aktivitásra az IPTG-vel indukált, illetve az indukció nélküli minták azonos mennyiségét vizs- 10 gáltuk, s a mintákat 10%-os SDS poliakrilamid-gélen elektroforizáltuk. Az IPTG-vel indukált sejtekből kapott nyers kivonat ötször magasabb szintű MTA-ázaktivitást mutatott, mint az indukálatlan sejtekből kapott kivonat. Ezenkívül, az SDS-gélen egy új, indukált 15 proteinsávot (31 kD) kaptunk.

8. példa

Az MTA-áz genomiális klón klónozása és részleges karakterizálása

Egy DNS-ffagment leghatékonyabb amplifikációjához (diagnosztikai célból végzett PCR-ral) előnyösen 500 bp-nál rövidebbnek kell lennie. A cDNS-szekvencia az exonok összességét tükrözi, melyek között normális esetben intronok találhatók, ami megnehezíti, hogy a cDNS-szekvencia alapján megfelelő méretű szekvenciát találjunk. E probléma megoldása érdekében humán MTA-áz genomiális kiónt izoláltunk. Humán méhlepény-DNS-ből (Clontech) készített kozmid génkönyvtárat MTA-áz cDNS-próbával (az MTAP-7 szubklón- 30 ból származó Notl/EcoRI ffagmenttel) screeneltünk.

A könyvtárból származó transzformált E. coli sejteket 135 χ 15 mm-es lemezre vonatkoztatva 1-2 χ 10⁴ sejt/lemez mennyiségben 50 mg/1 ampicillint tartalmazó LB lemezekre kentük.

A következő lépéseket a 4. példában leírtak szerint végeztük. 500000 telepből egyetlen pozitív kiónt (MTAP-10) izoláltunk, melyet PCR-analízissel és közvetlen szekvenálással részlegesen karakterizáltunk.

A PCR-analízishez a stopkondontól upstream irányban 120 bp távolságra lévő szensz oligonukleotid prímért, és stopkodontól downstream irányban 20 bp távolságban elhelyezkedő antiszensz oligonukleotid prímért szintetizáltunk. A PCR-reakciót 25 ciklusban végeztük; mindegyik ciklus denaturációból (92 °C, 1 perc), hibri5 dizálásból (55 °C, 2 perc)és lánchosszabbításból (72 °C, 5 perc) állt. A PCR-termékeket 0,8%-os agarózgélen különítettük el.

Az MTA-áz-génben a fentebb leírt technika alkalmazásával ez idáig azonosított exonok elhelyezkedését az 1. ábrán mutatjuk be.

9. példa

Az MTA-áz-szekvenciára specifikus oligonukleotidok alkalmazása rosszindulatú sejtvonalakban az MTA-áz jelenlétének vagy hiányának detektálására Az oligonukleotidok használhatóságának tesztelése érdekében több sejtvonalnál - melyekről ismert, hogy MTA-áz-pozitív vagy -negatív sejteket tartalmaznak PCR-t alkalmaztunk. A 8. példában leírtak szerint geno20 miális DNS-t izoláltunk, és a PCR-hoz a genomiális DNS 1 pg-ját használtuk fel. Az amplifikációt a fentebb leírtak szerint, 40 ciklusban végeztük. A ciklusok mindegyike denaturálásból (92 °C, 1 perc), hibridizálásból (55 °C, 1 perc) és lánchosszabbításból (72 °C, 25 0,5 perc) állt. A PCR-termékeket 1,5%-os agarózgélen vizsgáltuk. Azokban a sejtvonalakban, amelyekről tudtuk, hogy MTA-áz-negatívak, nem detektáltunk MTAázt, míg az MTA-áz-pozitív sejtekben kimutattuk az MTA-áz jelenlétét.

A szekvencialistában az alábbi szekvenciák szerepelnek :

1. számú szekvencia: a metil-tio-adenozin foszforiláz (MTA-áz) genomiális kiónja;

2. számú szekvencia: antigén hatású MTA-áz-pep35 tid („40. peptid”);

3. számú szekvencia: antigén hatású MTA-áz-peptid („51. peptid”);

4. számú szekvencia: az MTA-áz génjének PCRamplifíkálásához való primer („1. peptid”);

5. számú szekvencia: az MTA-áz génjének PCRamplifikálásához való primer (”2. peptid”).

SZEKVENCIALISTA

SZEKVENCIÁK SZÁMA: 5

TUDNIVALÓK AZ 1. SZ. SZEKVENCIÁHOZ (i) SZEKVENCIAJELLEMZŐK:

(A) HOSSZÚSÁG: 2763 bázsipár (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁL: egyszálú (D) ALAK: lineáris (ii) MOLEKULA TÍPUSA: DNS (genomiális) (vii) KÖZVETLEN FORRÁS:

(B) KLÓN: metil-adenozin-foszfatáz (ix) SAJÁTOS JELLEMZŐ:

(A) NÉV/KÓD: kódoló szekvencia/CDS (B) ELHELYEZKEDÉS: 1.. .2763 (xi) SZEKVENCIALEÍRÁS: 2. számú szekvencia

TTTATACAGA GCATGACAGT GGGGTCCTCA CTAGGGTCTG TCTGCCACTC TACATATTTG 60 AAACAGGAGT GGCTTCTCAG AATCCAGTGA ACCTAAATTT TAGTTTTAGT TGCTCACTGG 120

HU 220 196 Β

ACTGGGTTCT AGGAGACCCC CTGTGTTAGT TTTTTCTAGA CTCTAGGAGA AAACAGTTGG TCTCTCCTTC CATAGGCATG GAAGGCAGCA GGCGAACATC TGGGCTTTGA AGGAAGAGGG TGGCTCCTTG AGGGAGGAGA TTCAGCCCGG CANNNNNNNN NNNNNNNNNN GAGGTCGACG TAGCTTATCC AGAGGAATTG AGTCTGGAGT GACTCACCAG CCCTCGGAGG ATGGAAAGAT TTTGCTTTAT TTTGTAGGAC CACTATGAGA TGTGCCAGAG GAGTGTGCCA TATTCCAATG GTGTGTAGTC TTTCTGGAAG GTGTACCAGA GCATTTGGTT AATTGGCAGA CGGAGTGGCC ATGCAAGTTT ATGGAGAGTT ATTTCCTGTT AAGTGCAGCC TTAAGTTGTG CATGTGCTAG TAGGTTCTTA TAGAGACTGC TAAGAAGCTA GTCACAATCG AGGGACCTCG TTTTAGCTCC GGGGCGGATG TTATCAACAT GACCACAGTT ATTTGTTACG CAAGTATCGC CATGGGCACA GCAGTAGGTG GAATTCTTTT CTAAGCACAT GTCTTAACTG TTTGTTTCTA TTACGTTAGT AGTTGTTAAT ATTTTCTGTA GTTCCATTGG GAGACACTTT TACCCAAGGA TCAGTAGTGA TGAGAATCAT ACTAAGACTT GGGCCTTANN ATTGAGGATT CGGTTTCAGC AGATAAATTT GCTGGAGCTC AGAAAAATGT TTTATGACAA AGTGCTATTG TTTCTCTAGG TTTGGGTGGA TAATAAAGCC AAAAGCTTAC TGCTCACTAC AGAAACCCTC CATAACCTGA AGGTAAGTGC TCTCTATTGT CTTCTTTTCT TACTTGCATT GCCTAGATGT TTTCAACAAG TTTTTGTGAC AACTGAGTAG TCTTATTTTC TTGGCTGGTA ATAATCCAGG CTGGGCTGGT ATGGCAATAA CATTATTAAC CTCACTTTAC AGGAAAGGGA AGTTCCACAT CTGGTTAGTG AACTTGAAAA TTCCTGCGTC CTCACTTTGA TCTAGAAAAT TCAGTAATTA CGCCAACATG TGAATATCAC CAGTTTTCTG TTTTATTACC AAGACATTAA CATTCTAATT CCAGTCATTT TGGGAATTCC ATGCAGCTTT CATGCCCTTG CCTATCAAAG TGTATAGAGA CTCCTCAATG ATTTAGACAA AGTAACATGT GGGAAAAAAT ATTAGATTTT CTCCCCCTAT TAAATTTGCA ACAATAAAGG CCAAAGAATG TGAGGAAGAA ATGGGACTCT GTACAGTATT TCTGGAGGGC AATTTGGTAA TAC

CTGTGGTCAT TGCTAGAAGA ATCACTTAAT 180 TGGTGTACTC ATCACGGGTT AACAATTTCT 240 CACCATCATG CCTTCAAAGG TCAACTACCA 300 CTGTACACAT GTCATAGCGA CCACAGCTTG 360 CGATATTGTC ATTATTGATC AGTTCATTGA 420 GTATCGATAA GCTTTGTAAA CAATTGTCTT 480 AAAGACCCAA ATATTGACCT AGATAAAGTT 540 GGCCTTAAAA TAAAACAAAC AAAAACCTTT 600 CCTCAGTCCT TCTATGATGG AAGTCATTCT 660 GCTGAGCCGT TTTGCCCCAA AACGAGAGAG 720 ATAAATCATG TGGGCTTGGG GTGGCATCTG 780 CCATACCCTC ACTCAAGTTT GCTTTGTATT 840 GCTAATAATT TNNNNNNNNN NNNNNNNNNN 900 TATGTTTTGA AGTTTCTGGT TTTTCTTTTC 960 GGACTCCGGT GCCACTCAAA GGGGACAATG 1020 CGGGCAGAAA GCTTCATGTT CCGCACCTGG 1080 CCAGAGGTGG TTCTTGCTAA GGAGGCTGGA 1140 GATTATGACT GCTGGAAGGA GCACGAGGAA 1200 ATAGCATGGG TTTCTGGGTG CCAATAGGGT 1260 TTCAGAAAGT GCCTTTCTAC AAGGTTTTGA 1320 AAGGTAAGAA CAAAGATCAA AAGAAAGAAA 1380 AAATAGTACA TTGTAGGCAT GTAGATGTGT 1440 NNNNNNNNNN NNNNNNNNNN NNTACCCTAC 1500 GAGGGACACA AACATTTAGG CTGTAGCAAG 1560 GCAGTGGAAT TTTAAGTTCT AGTAACCTCC 1620 CCGGGTCTTA AAGACCCTGA AAGAAAACGC 1680 CATACCTCAG ATAGGGTCCA CAGAATGGTC 1740 AGCCATGGAC AATCAGGCAT GTCTGTAGAC 1800 TCACCTTTGG TCCTCATGTA TTTTTTGCCA 1860 ATCTACTACT ACCATACCAA CCACTTGTGA 1920 GTGCAGANNN NNNNNNNNNN NNAATAAACA 1980 GTGATTATCA GAACAATGCT CTGAGATAAG 2040 GGTGAGGAAC CAAGAGTTTA GAGTACCCGA 2100 TTTTCTGTAG AATTTATTTA AAGTGTATGT 2160 CAAAATCTGT _TTTTTTTTTT AACAAACATC 2220 TGCCTCCTTT CTTCCTTTCA GAATATGGCC 2280 AGTAGCATGG CTGCCCAGGA GAAAAGAAGA 2340 TGCTTAACTT GAAAAAAATA TGGGAAAGAC 2400 AGTATGTTGT AAGAAAGACA AGACATTGTG 2460 CTTCAAAATA CAGAAGAAAA GCAAATGACT 2520 AAGGGGGAAA AAAAACCCCA CCATTCTCTT 2580 GTGGAGGGTA ATCTCTACTT TCCTATACTG 2640 TTGGTTATTT ATTGATGCGA CTGTAAATTG 2700 AATGCATCAA AAGACTTAAA AATACGGACG 2760

2763

TUDNIVALÓK A 2. SZ. SZEKVENCIÁHOZ (i) SZEKVENCIAJELLEMZŐK:

(A) HOSSZÚSÁG: 17 aminosaav (B) TÍPUS: aminosav (C) SZÁL: egyszálú (D) ALAK: lineáris (ii) MOLEKULA TÍPUSA: peptid (vii) KÖZVETLEN FORRÁS :

(B) KLÓN: metil-adenozin-foszfatáz peptidek (ix) SAJÁTOS JELLEMZŐ:

(A) NÉV/KÓD: peptid (B) ELHELZEZKEDÉS :1...17

HU 220 196 Β (xi) SZEKVENCIALEÍRÁS: 2. számú szekvencia

Ile Gly Ile Ile Gly Gly Thr Gly Leu Asp Asp Pro Glu I 1 5 10

Glu Gly

TUDNIVALÓK A 3. SZ. SZEKVENCIÁHOZ (i) SZEKVENCIAJELLEMZŐK:

(A) HOSSZÚSÁG: 13 aminosav (B) TÍPUS: aminosav (C) SZÁL: egyszálú (D) ALAK: lineáris (ii) MOLEKULA TÍPUSA: peptid (vii) KÖZVETLEN FORRÁS:

(B) KLÓN: metil-adenozin-foszfatáz peptidek (ix) SAJÁTOS JELLEMZŐ:

(A) NÉV/KÓD: peptid (B) ELHELYEZKEDÉS :1...13 (xi) SZEKVENCIALEÍRÁS: 3. számú szekvencia e Leu 15

Leu Leu Leu Thr Thr 1 5

Ile Pro Gin Ile Gly 10

Ser Me t Glu

TUDNIVALÓK A 4. SZ. SZEKVENCIÁHOZ (i) SZEKVENCIAJELLEMZŐK:

(A) HOSSZÚSÁG: 8 aminosav (B) TÍPUS: aminosav (C) SZÁL: egyszálú (D) ALAK: lineáris (ii) MOLEKULA TÍPUSA: peptid (vii) KÖZVETLEN FORRÁS:

(B) KLÓN: metil-adenozin-foszfatáz primerek (ix) SAJÁTOS JELLEMZŐ:

(A) NÉV/KÓD: peptid (B) ELHELYEZKEDÉS :1...8 (xi) SZEKVENCIALEÍRÁS: 4. számú szekvencia

Tyr Val Asp Thr Pro Phe Gly Lys 1 5

TUDNIVALÓK AZ 5. SZ. SZEKVENCIÁHOZ (i) SZEKVENCIAJELLEMZŐK:

(A) HOSSZÚSÁG: 9 aminosav (B) TÍPUS: aminosav (C) SZÁL: egyszálú (D) ALAK: lineáris (ii) MOLEKULA TÍPUSA: peptid (vii) KÖZVETLEN FORRÁS:

(B) KLÓN: metil-adenozin-foszfatáz peptidek (ix) SAJÁTOS JELLEMZŐ:

(A) NÉV/KÓD: peptid (B) ELHELYEZKEDÉS: 1.. .9 (xi) SZEKVENCIALEÍRÁS: 5. számú szekvencia

Thr Trp Gly Alá Asp Val Ile Asn Met

Claims (5)

1. SZABADALMI IGÉNYPONTOK

   1. Eljárás katalitikusán aktív és katalitikusán inaktív metil-tio-adenozin-foszforiláz (MTA-áz) jelenlétének kimutatására emlőssejtekben, azzal jellemezve, hogy (a) a vizsgálandó sejtekből mintát nyerünk, (b) a mintához az 1. szekvencia szerinti nukleinsavszekvenciából eredő, detektálható módon jelzett oligonukleotid próbákat adunk, amelyek specifikusan hibridizálódnak a mintában jelen levő, MTA-ázt kódoló bármely nukleinsavval, és (c) detektáljuk a próbák hibridizálódását a mintában jelen levő, MTA-ázt kódoló bármely nukleinsavhoz, ahol egy ilyen nukleinsav jelenléte jelzi a katalitikusán aktív vagy inaktív MTA-áz jelenlétét a sejtben.
2. 2. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a mintát olyan körülmények között kezeljük, amelyek az MTA-ázt kódoló nukleinsav amplifikálódását biztosítják, és a mintában jelen levő, MTA-ázt kódoló bármely nukleinsavat amplifikáljuk.
3. 3. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy ismert rosszindulatú daganatból származó sejteket alkalmazunk.
4. 4. A 3. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a rosszindulatú daganatból származó sejteket MTA-áz katalitikus aktivitásra nézve is vizsgáljuk.
5. 5. A 2. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a mintát polimeráz láncreakció körülményei között kezeljük.