PL181667B1 - Sposób wykrywania obecnosci katalitycznie aktywneji katalitycznie nieaktywnej fosforylazy metylotioadenozynowej (MTAzy), wyizolowany polinukleotyd oraz zrekombinowany wektor ekspresyjny PL - Google Patents

Abstract

1. Sposób wykrywania obecnosci katalitycznie aktywnej i katalitycznie nieaktywnej fosforylazy metylotioadenozynowej (MTAzy) w komórkach ssaków, znamienny tym, ze przygotowuje sie próbke komórek przypuszczalnie pozbawionych MTAzy, po czym dodaje sie wykrywalnie znakowane sondy oligonukleotydowe pochodzace z kwasu nu- kleinowego przedstawionego Sekwencja nr 1 i specyficznie hybrydyzujace z kazdym obecnym w próbce kwasem nukleinowym kodujacym MTAze, a nastepnie wykrywa sie hybrydyzacje sond z obecnym w próbce kwasem nukleinowym kodujacym MTAze stwierdzajac obecnosc kwasu nukleinowego w próbce. PL

Description

Przedmiotem wynalazku jest sposób wykrywania obecności katalitycznie aktywnej i katalitycznie nieaktywnej fosforylazy metylotioadenozynowej (MTAzy), wyizolowany polinukleotyd oraz zrekombinowany wektor ekspresyjny. Sposób wykrywania obecności katalitycznie aktywnej i katalitycznie nieaktywnej fosforylazy metylotioadenozynowej pozwala na określenie złośliwości komórek ssaków. Wykrycie komórek nie posiadających tego enzymu umożliwia poddanie tych komórek chemioterapii wykorzystującej niezdolność komórek do przekształcania metylotioadenozyny w metioninę. Wyizolowany polinukleotyd koduje MTAzę, a zrekombinowany wektor ekspresyjny zawiera polinukleotyd kodujący MTAzę.

181 667

Aminokwas metionina (MET) jest konieczny do wzrostu komórek normalnych i złośliwych. Dla pewnych komórek złośliwych wymaganie to jest bezwzględne, tj. bez dostatecznego dostarczenia MET komórki umierają. ,

W komórkach ssaków MET uzyskiwana jest z trzech źródeł. Może ona pochodzić z diety lub syntezy biochemicznej MET z L-homocysteiny (homocysteiny) bądź metylotioadenozyny (MTA). (produkt szlaku biosyntetycznego poliamin). W tym ostatnim przypadku, MTA jest przekształcana w MET przez fosforylazę metylotioadenozynową(MTAzę; EC 2.4.2.28).

W ubiegłej dekadzie badacze zidentyfikowali wiele linii komórek złośliwych, które nie posiadają MTAzy i z tej przyczyny nie mogą przekształcać MTA w MET. Na przykład, Katamari i in., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 78: 1219-1223 (1981) podali, że 23% z 3 linii ludzkich złośliwych komórek nowotworowych nie posiada wykrywalnej MTAzy, podczas gdy aktywność MTAzy była obecna w każdej z 16 badanych linii komórek niezłośliwych. Niedobór MTAzy podawano również jako charakterystyczną cechę nie-drobnokomórkowych raków płuc (patrz Nobori i in., Cancer Res. 53: 1098-1101 (1991)), 6 linii komórek chłoniaka i białaczki (tamże), linii komórek guza mózgu i pierwotnych próbek tkanki guza mózgu (tamże) i innych nowotworów złośliwych (patrz np. Kries i in., Cancer Res. 33: 1866-1869 (1973), Kries i in., Cancer Trmt. Rpts. 63: 1069-1072 (1979) i Rangione i in., Biochem J. 281. 533-538). Komórki ujemne pod względem MTAzy pokrywają swoje zapotrzebowanie na MET przez przekształcanie homocysteiny. Jednakże, jeżeli homocysteina nie jest dostępna, komórki na ogół umierają.

Wiadomo, że L-deamino-g-merkaptometano-liaza L-metioniny (ED 4.4.1.11; METaza) degraduje nie tylko MET, ale również homocysteinę. Dlatego też, teoretycznie można głodzić komórki złośliwe, które nie posiadają MTAzy (tj. komórki ujemne pod względem MTAzy) przez degradację METaząMET i homocysteiny osocza. Przypuszcza się, że komórki normalne, dodatnie pod względem MTAzy, będą mogły pokrywać swoje zapotrzebowanie ma MET przez ciągłe przekształcanie MTA w MET.

Jedną z przeszkód w opracowaniu uwieńczonego powodzeniem podejścia do głodzenia pod względem MET komórek złośliwych była konieczność stwierdzenia, które nowotwory złośliwe są odpowiednimi celami terapii, tj. które nowotwory złośliwe są ujemne pod względem MTAzy. W tym celu opracowano oznaczenie przewidujące czy nowotwór złośliwy jest ujemny pod względem MTAzy przez określenie, czy w hodowli komórkowej występuje jakaś aktywność katalityczna (Seidenfeld i in., Biochem. Biophys. Res. Commun., 95: 1861-1866, 1980). Jednakże, z powodu niedostępności w handlu substratu radiochemicznego koniecznego do oznaczenia, jako wykorzystanie w rutynowych badaniach nie jest obecnie wykonalne. Ponadto, to oznaczenie aktywności nie uwzględnia niestabilności katalitycznej MTAzy in vitro przez wykrywanie, czy jakiś enzym jest obecny w hodowli komórkowej, niezaleznie od tego, czy jest katalitycznie aktywny w czasie przeprowadzania oznaczenia.

Tego ograniczenia oznaczenia aktywności można uniknąć przez opracowanie oznaczenia immunologicznego, które jest dostatecznie czułe do wykrywania stosunkowo małych ilości enzymu. Jednak okazało się, że oczyszczenie z naturalnego źródła enzymu MTAzy w celu otrzymania przeciwciał do stosowania do immunologicznego wykrywania MTAzy jest procesem pracochłonnym i dającym stosunkowo niską wydajność (Rangione i in., J Biol Chem, 261: 12324-12329, 1986).

Brak prostego, skutecznego sposobu identyfikowania komórek nie posiadających MTAzy w części przyczynił się do ciągłej niedostępności skutecznego podejścia terapeutycznego do specyficznego głodzenia pod względem MET in vivo komórek złośliwych nie posiadających MTAzy. Niniejszy wynalazek zaspokaja to zapotrzebowanie przez dostarczenie sposobu wykrywania obecności lub nieobecności w próbce genu kodującego MTAzę i przez zapewnienie źródła rekombinowanej MTAzy.

Przedmiotem wynalazku jest sposób wykrywania obecności katalitycznie aktywnej i katalitycznie nieaktywnej fosforylazy metylotioadenozynowej (MTAzy) w komórkach ssaków, obejmujący etapy, w których przygotowuje się próbkę komórek przypuszczalnie pozbawionych MTAzy, po czym dodaje się wykrywalnie znakowane sondy oligonukleotydowe pochodzące z kwasu nukleinowego przedstawionego Sekwencją nr 1 i specyficznie hybrydy4

181 667 żujące z każdym obecnym w próbce kwasem nukleinowym kodującym MTAzę, a następnie wykrywa się hybrydyzację sond z obecnym w próbce kwasem nukleinowym kodującym MTAzę stwierdzając obecność kwasu nukleinowego w próbce.

Korzystnie, przed dodaniem wykrywalnie znakowanych sond oligonukleotydowych poddaje się próbkę warunkom sprzyjającym selektywnej amplifikacji kwasu nukleinowego kodującego MTAzę i selektywnie amplifikuje się każdy kwas nukleinowy kodujący MTAzę obecny w próbce. Korzystnie, stosuje się warunki obejmujące reakcję łańcuchową polimerazy.

Korzystnie, przygotowuje się próbkę komórek pochodzących ze znanego nowotworu złośliwego i nowotwór złośliwy oznacza się również na aktywność katalityczną MTAzy.

Przedmiotem wynalazku jest również wyizolowany polinukleotyd kodujący MTAzę przedstawiony Sekwencją nr 1.

Korzystnie, wyizolowany polinukleotyd zawiera tylko eksony kwasu nukleinowego przedstawionego Sekwencją nr 1.

Wynalazek dotyczy również zrekombinowanego wektora ekspresyjnego zawierającego polinukleotyd przedstawiony Sekwencją nr 1.

Korzystnie, zrekombinowany wektor ekspresyjny zawiera fragmenty polinukleotydu przedstawionego Sekwencją nr 1 kodujące peptydy przedstawione Sekwencjami nr 2, 3 lub 4.

Korzystnie, zrekombinowany wektor ekspresyjny zawiera polinukleotyd zawierający tylko eksony kwasu nukleinowego przedstawionego Sekwencją nr 1.

Kolejną odmianą wynalazku jest zrekombinowany wektor ekspresyjny zawierający kwas nukleinowy kodujący MTAzę stransformowanej E. coli wybranej spośród szczepów zdeponowanych pod numerami ATTC 55536, 55537, 55538, 55539 i 55540

W sposobie wykrywania komórek nie posiadających MTAzy według wynalazku za komórki takie uważać się będzie te komórki, w których białko MTAzy nie jest obecne w wykrywalnych ilościach w postaci katalitycznie aktywnej lub katalitycznie nieaktywnej. Sposób według wynalazku oparty jest na założeniu, że brak MTAzy jest spowodowany delecją genu kodującego MTAzę z genomu ssaka, który posiada nowotwór złośliwy ujemny pod względem MTAzy. Dlatego tez, sposób według wynalazku jest ukierunkowany na wykrywanie polinukleotydu wewnątrz kodującej białko MTAzy domeny genomu ssaka, która jeśli jest obecna, to koduje MTAzę, ale jeśli jest nieobecna, to powoduje powstanie komórek pozbawionych MTAzy.

Polinukleotyd według wynalazku umożliwia syntezę zrekombinowanej MTAzy przez ekspresję MTAzy przez odpowiedni wektor. Dostępność zrekombinowanej MTAzy umożliwia wytwarzanie materiału o wysokiej czystości z większą łatwością i w większych ilościach, niż można było otrzymać stosując metodę Rangione (opisaną powyżej) izolowania i oczyszczania natywnej MTAzy.

Sposób amplifikacji jakiejkolwiek MTAzy obecnej w próbce komórek

Jak stwierdzono powyżej, założeniem wynalazku jest, że brak MTAzy w komórkach jest wynikiem delecji genu, który normalnie kodowałby MTAzę, z genomu ssaka. Ponieważ wynalazek jest ukierunkowany na wykrywanie obecności lub nieobecności tego genu w próbce komórek, które podejrzewa się że są ujemne pod względem MTAzy, kwas nukleinowy z próbki będzie się amplifikować dla zwiększenia czułości sposobu wykrywania. Amplifikację tę korzystnie przeprowadza się przez wykorzystanie reakcji łańcuchowej polimerazy, chociaż użycie reakcji łańcuchowej w etapie polimeryzacji nie jest bezwzględnie konieczne.

Do stosowania w sposobach według wynalazku, otrzymuje się próbkę biologiczną, którą podejrzewa się o zawieranie komórek pozbawionych MTAzy. Na przykład, próbka może obejmować płyn ustrojowy lub komórki z np. linii komórkowej, tkanki lub nowotworu. Próbki takie otrzymuje się stosując znane metody kliniczne, np. komórki nowotworowe można pobrać przez biopsję lub wycięcie chirurgiczne. Korzystnie, komórki są zasadniczo wolne od „zanieczyszczeń”, tj. komórek, białek lub podobnych składników, które prawdopodobnie będą fałszować wyniki sposobu według wynalazku. Na przykład, gdy jako źródło genomowego DNA MTAzy stosuje się nowotwory lite, normalne komórki niezłośliwe oraz MTAza, która może ulegać uwolnieniu z tych komórek podczas procedury stosowanej do otrzymania próbki biologicznej, będzie uważać się za zanieczyszczenia.

181 667

Kwas nukleinowy, który ma ulegać amplifikacji w próbce, będzie składał się z DNA genomowego lub typu dzikiego, który, jak można oczekiwać, normalnie obejmuje MTAzę. Ten mający ulegać amplifikacji DNA (dalej w niniejszym opisie „docelowy DNA”) można otrzymać z organizmu eukariotycznego, korzystnie ssaka. Korzystniej, genomowy DNA otrzymuje się z organizmu człowieka.

Genomowy DNA izoluje się zgodnie z metodami znanymi w nauce, np. metodą opisaną przez Maniatisa i in. (Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1982). W niniejszym opisie dostarczono roboczy przykład izolowania genomowego klonu ludzkiej MTAzy, w którym kosmidową bibliotekę genową przeszukuje się stosując sondę cDNA genu MTAzy, którą opisano dalej poniżej. Jednakże, specjaliści w tej dziedzinie będą wiedzieć, że można zastosować inne odpowiednie sposoby otrzymywania DNA według wynalazku.

Pełnej długości sekwencję nukleotydową genomowego klonu MTAzy podano w dołączonej do niniejszego opisu Liście Sekwencji jako sekwencję o numerze identyfikacyjnym 1; eksony tej sekwencji przedstawiono na mapie przedstawionej na fig. 1. Szczep E. coli zawierający pełnej długości genomowy DNA MTAzy szczura zdeponowano w American Type Culture Collection, Rockville, MD, 30 grudnia 1993 pod numerami dostępu 55536 (ekson „TC3”, nukleotydy 254-421 genu MTAzy); 55538 (ekson „1.1”, nukleotydy 254-421 genu MTAzy); 55537, 55539 i 55540 (odpowiednio „IX-7”, „4-3” i „7-2”; łącznie reszta genu MTAzy). Gospodarzem każdego depozytu jest E coli. Nie uczyniono ani zamierzano uczynić założenia, że depozyt ten jest konieczny dla umożliwienia komuś praktycznego stosowania wynalazku. Depozyt będzie jednak utrzymywany w postaci zdolnej do życia przez każdy okres jaki jest lub może być wymagany przez prawo patentowe odnoszące się do tego wynalazku.

Po otrzymaniu genomowego DNA, zawierającą go próbkę poddaje się warunkom sprzyjającym selektywnej amplifikacji kwasu nukleinowego. Korzystnie, docelowy kwas nukleinowy będzie polinukleotydową częścią genu kodującego MTAzę (tj. „docelowym polinukleotydem”). Preferowanym sposobem amplifikacji docelowego polinukleotydu jest PCR. PCR jest metodą enzymatycznej syntezy in vitro specyficznych sekwencji DNA lub RNA z wykorzystaniem starterów oligonukleotydowych, które hybrydyzują ze specyficznymi sekwencjami kwasu nukleinowego i flankują region będący przedmiotem zainteresowania w docelowym kwasie nukleinowym. Powtarzane serie cykli denaturacji matrycy, przyłączania starterów i enzymatycznego wydłużania przyłączonych starterów prowadzą do wykładniczej akumulacji specyficznego fragmentu kwasu nukleinowego o końcach określonych przez końce 5' starterów. Otrzymane produkty (produkty PCR) zsyntetyzowane w jednym cyklu działająjako matryce w następnym, liczba kopii docelowego kwasu nukleinowego w przybliżeniu podlega podwojeniu w każdym cyklu.

Podstawowe techniki PCR opisano w opisach patentowych Stanów Zjednoczonych Ameryki o numerach 4 683 195 i 4 683 202 Mullisa i in., których ujawnienia włączono tu jako przykłady konwencjonalnych technik przeprowadzania PCR. Jednakże, nie jest zamiarem, aby wynalazek był ograniczony przez wykorzystanie technik PCR omówionych w opisie patentowym numer ‘202 Mullisa i in. Od opracowania techniki Mullisa i in. opracowano wiele oznaczeń opartych na PCR, które wykorzystują modyfikacje tej techniki. Modyfikacje te są dobrze znane w nauce i dlatego też nie będą tu szczegółowo opisywane. Jednakże, w celu zilustrowania możliwości w tym zakresie, poniżej opisano kilka tych modyfikacji.

Technikę PCR, w której dostarcza się wewnętrzny standard amplifikacji stosując współzawodniczą matrycę, która różni się od docelowego kwasu nukleinowego sekwencją i wielkością opisano w Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1990) 87: 2725-2729 (autorzy: Gilliand i in.). Inną technikę przeprowadzania „współzawodniczej” PCR, która wykorzystuje matryce różniące się sekwencją, ale nie wielkością, opisano w Nuc. Acids Res. 21: 3469-3472 (1993) (autorzy: Kohsaka i in.). Technika ta jest techniką szczególnie korzystną do wykorzystywania w enzymatycznym oznaczeniu immunosorbcyjnym (ELISA) do analizowania /.amplifikowanego kwasu(ów) nukleinowego. Niewspółzawodniczą technikę PCR, wykorzystującą specyficzne wobec miejsca oligonukleotydy do wykrywania mutacji lub polimorfizmu genów, którą również można stosować w sposobie według wynalazku, opisano w Proc:. Natl. Acad. Sci.

181 667

USA (1989) 86: 6230-6734 (autorzy: Saiki in.). Zaletą każdej z tych technik jest wykorzystywanie sond hybrydyzacyjnych, które pomagają, w eliminowaniu fałszywie dodatnich wyników wynikających z jakiejkolwiek niespecyficznej amplifikacji, która może wystąpić podczas PCR.

W celu uzyskania dalszych informacji, specjaliści w tej dziedzinie mogą skierować się do Innis i in., „Optimization of PCR’s, PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications (Acad. Press, 1990). Publikacja ta podsumowuje techniki wpływające na specyficzność, dokładność i wydajność pożądanych produktów PCR.

Wybiera się startery oligonukleotydowe (co najmniej jedną parę starterów), które będą specyficznie hybrydyzować z małym odcinkiem par zasad po każdej ze stron (tj. 5' i 3') docelowego polinukleotydu MTAzy (tj. „sekwencjami flankującymi”). Specjaliści w tej dziedzinie z łatwością wybiorą odpowiednie startery bez nadmiernych prac eksperymentalnych, w oparciu o informację o sekwencji polinukleotydowej podaną w dołączonej do niniejszego opisu Liście Sekwencji jako sekwencję o numerze identyfikacyjnym: 1 i na fig. 1.

Przy projektowaniu starterów ważne jest, aby startery nie zawierały komplementarnych zasad, tak aby nie mogły hybrydyzować ze sobą. Dla wyeliminowania amplifikacji jakiegokolwiek materiału zanieczyszczającego, który może być obecny w próbce, korzystnie startery projektuje się tak, aby obejmowały eksony (które dla genu MTAzy przedstawiono na fig. 1.

Jak stwierdzono powyżej, na tym etapie polimeryzacji może nie być konieczne wykorzystanie reakcji łańcuchowej w celu właściwego zamplifikowania kwasów nukleinowych w próbce. Na przykład, jeśli wykorzystuje się technikę opisaną przez Kohsaka i in., powyżej, tak że etap polimeryzacji przeprowadza się na fazie stałego nośnika, po którym następuje hybrydyzacja z sondami specyficznymi dla docelowego polinukleotydu, czułość oznaczenia będzie taka, że pojedyncza polimeryzacja docelowego polinukleotydu może być wszystkim, co jest konieczne.

Po zakończeniu etapu amplifikacji, oznacza się produkty PCR dla określenia, czy gen kodujący MTAzę jest obecny w próbie. Korzystnie, w celu wykrycia genu, dwuniciowe produkty PCR będzie się wiązać z fazą stałją tak że ich nici można rozdzielić przez denaturację, w ten sposób umożliwiając hybrydyzację sond specyficznych wobec sekwencji ze związaną antysensowną nicią produktu PCR, zasadniczo jak opisano w Kohsaka i in., powyżej. Alternatywnie, produkty PCR będzie się usuwać ze środowiska reakcyjnego i wydzielać z mieszaniny amplifikacyjnej przed dodaniem sond do hybrydyzacji z dwuniciowymi produktami PCR. Przy tym ostatnim podejściu produkty PCR wydziela się z mieszaniny amplifikacyjnej zgodnie z metodami znanymi w nauce, z uwzględnieniem konkretnej metody wybranej do detekcji; np. przez wypieranie na żelu, elektroforezę lub chromatografię powinowactwa.

Wykrycie zamplifikowanego produktu można osiągnąć przez wykorzystanie sond hybrydyzacyjnych, które są trwale związane z wykrywalnym znacznikiem. Znacznikiem jest substancja, którą można kowalencyjnie związać lub silnie połączyć z sondą kwasu nukleinowego, czego wynikiem będzie możliwość wykrywania sondy. Na przykład, znacznikiem może być izotop promieniotwórczy, substrat lub inhibitor enzymu, enzym, substancja nieprzepuszczalna dla promieniowania (włącznie z metalami koloidalnymi), substancje fluorescencyjne, cząsteczka chemiluminescencyjna, liposomy zawierające którykolwiek z powyższych znaczników lub składnik specyficznie wiążących się par. Odpowiedni znacznik nie będzie tracił właściwości odpowiedzialnej za wykrywalność podczas amplifikacji.

Specjaliści w diagnostyce będą zorientowani co do odpowiednich wykrywalnych znaczników do stosowania w oznaczeniach wykrywania in vitro. Na przykład, odpowiednie izotopy promieniotwórcze obejmują ³H, ¹²⁵J, ¹³¹J, ³²P, ¹⁴C, ³⁵S. Zamplifikowane fragmenty wyznakowane izotopami promieniotwórczymi można wykrywać bezpośrednio stosując licznik promieniowania gamma lub densytometrię autoradiogramów, techniką blotingu Southema zamplifikowanych fragmentów w połączeniu z densytometrią. Przykładami odpowiednich cząsteczek chemiluminescencyjnych są akrydyny lub luminol. Sekwencje docelowe zhybrydyzowane z sondami przeprowadzonymi w pochodne estrem akrydyniowym są chronione przed hydrolizą przez interkalację. Przykładami odpowiednich substancji fluoroscencyjnych są fluorosceina, fikobiliproteina, chelaty pierwiastków ziem rzadkich, dansyl lub rodamina.

181 667

Przykładami odpowiednich substratów lub inhibitorów enzymów są związki, które specyficznie wiążą się z peroksydazą chrzanu, oksydazą glukozową, dehydrogenazą glukozo-6fosforanową. b-galaktozyciazip kinazą pirogronianową lub fosfatazą alkaliczną, esterazą acetylocholinową. Przykładami substancji nierozpuszczalnych dla promieniowania są złoto koloidalne lub proszek ferromagnetyczny.

Specyficznie wiążąca się para obejmuje dwie różne cząsteczki, gdzie jedna z cząsteczek posiada obszar na swojej powierzchni lub w zagłębieniu, który specyficznie wiąże się z konkretną przestrzenną lub polarną strukturą drugiej cząsteczki. Składniki specyficznie wiążącej się pary są często określane jako ligand i receptor lub ligand i antyligand. Na przykład, jeśli receptorem jest przeciwciało, ligandem jest odpowiadający antygen. Inne specyficznie wiążące się pary obejmują pary hormon-receptor, pary enzym-substrat, pary biotyna-awidyna i pary glikoproteina-receptor. Obejmują one fragmenty lub części specyficznie wiążących się par, które zachowują specyficzność wiązania, takie jak fragmenty immunoglobulin, włącznie z fragmentami Fab i podobnymi. Przeciwciała mogą być monoklonalne lub poliklonalne. Jeśli składnik specyficznie wiążącej się pary stosuje się jako znacznik, to korzystna procedura rozdziału będzie obejmować chromatografię powinowactwu.

Jeśli w opisanym powyżej oznaczeniu nie można wykryć zamplifikowanego produktu, wskazuje to na brak MTAzy w komórkach obecnych w próbce. Ponieważ oczekuje się, że komórki normalne (niezłośliwe) zawsze będą miały MTAzę obecną w wykrywalnych ilościach, stwierdzenie braku MTAzy wskazuje, że analizowany genomowy DNA otrzymano z komórek złośliwych. Oznaczenie według wynalazku jest szczególnie odpowiednie do celów diagnostycznych, np. do diagnozy braku MTAzy towarzyszącej nowotworom, zwłaszcza nowotworom złośliwym.

Jeśli jest to pożądane, próbkę można wstępnie przeszukać pod kątem aktywności katalitycznej MTAzy, stosując metodę opisaną przez Seidenfelda i in., Biochem. Biophys. Res. Commun., 95: 1861-1866, (1980); patrz także Przykład I, poniżej). Oznaczenie według wynalazku będzie się następnie stosować do określenia, czy gen kodujący MTAzę występuje w komórkach w próbce. Próbkę można także testować pod kątem obecności katalitycznie aktywnego lub nieaktywnego białka w celu wyszukania zanieczyszczeń, tj. komórek niezłośliwych w próbce. Odpowiednie pod tym względem oznaczenie immunologiczne opisano wNonori i in., Cancer Res. 53: 1098-1101 (1991) i w równoległym zgłoszeniu patentowym Stanów Zjednoczonych Ameryki numer kolejny 08/176 413, złożonym 29 grudnia 1993.

Wytwarzanie syntetycznych lub zrekombinowanych polinukleotydów i peptdów MTAzy

Innym celem niniejszego wynalazku jest dostarczenie polinukleotydów (zwłaszcza oligonukleotydów), które umożliwiają amplifikację specyficznej sekwencji kwasu nukleinowego MTAzy. Strategia projektowania takich oligonukleotydów uwzględniać będzie wspomniane powyżej aspekty. Takie oligonukleotydy są szczególnie uzyteczne do diagnozy braku MTAzy towarzyszącego złośliwości.

Wynalazek dostarcza także syntetyczną lub zrekombinowaną MTAzę oraz peptyd MTAzy, jak również polinukleotydy, które kodują MTAzę lub peptydy MTAzy. W znaczeniu tu stosowanym, „polinukleotyd” odnosi się do polimeru deoksyrybonukleotydów lub rybonukleotydów, w postaci oddzielnego fragmentu lub jako składnika większej konstrukcji. DNA kodujący MTAzę lub fragment MTAzy według wynalazku można składać z fragmentów cDNA lub z oligonukleotydów, które zapewniają syntetyczny gen zdolny do ulegania ekspresji w zrekombinowanej jednostce transkrypcyjnej. Sekwencje polinukleotydowe według wynalazku obejmują sekwencje DNA, RNA i cDNA. Sekwencje polinukleotydowe można przewidywać na podstawie kodu genetycznego, należy jednak brać pod uwagę degenerację kodu genetycznego. Polinukleotydy według wynalazku obejmują sekwencje, które są zdegenerowane w wyniku degeneracji kodu genetycznego.

Peptydy i polinukleotydy obejmują funkcjonalne pochodne MTAzy, peptydów MTAzy i kodujących je nukleotydów. Przez „funkcjonalną pochodną” rozumie się „fragmenty”, „warianty”, „analogi” lub „pochodne chemiczne” cząsteczki. „Fragment” cząsteczki, taki jak którykolwiek z polinukleotydów według niniejszego wynalazku, obejmuje każdy podzestaw nukleotydów cząsteczki. „Wariant” takiej cząsteczki odnosi się do naturalnie występującej czą8

181 667 steczki, zasadniczo podobnej do albo całej cząsteczki, albo jej fragmentu. „Analog” cząsteczki odnosi się do nienaturalnej cząsteczki zasadniczo podobnej do albo całej cząsteczki, albo jej fragmentu.

O cząsteczcemócei się, żejęst„zesadniczO podobna” do innej czasjeczki, eeśli sekwencja aminokwasowa lub, w przypadku paljpukleotydów, nukleoayeawa obu cząsteczek jest zasadniczo taka sama. Zasadniczo podobne cząsteczki aminokwasowe będą posiadać podobną aktywność biologiczną. A zatem, o ile dwie cząsteczki wykazują podobną aktywność, uważa się je za warianty w stosowanym tu znaczeniu tego terminu, nawet jeśli jedna z cząsteczek zawiera dodatkowe reszty aminokwasowe nie występujące w drugiej lub jeśli sekwencja reszt amipakwasawych nie jest identyczna.

W znaczeniu tu stosowanym, o cząsteczce mówi się, że jest „chemiczną pochadpą” innej cząsteczki, jeśli zawiera ona dodatkowe reszty chemiczne nie będące normalnie częścią cząsteczki. Reszty takie mogą poprawiać rozpuszczalność, absorpcję, biologiczny okres półtrwania cząsteczki itp. Alternatywnie, reszty mogą obniżać toksyczność cząsteczki, eliminować lub osłabiać jakiekolwiek niepożądane wpływy uboczne cząsteczki itp. Reszty zdolne do wywierania takich wpływów ujawniono, na przykład, w Remington' Pharmaceutical Sciences, wyd. 16, Mark Publishing Co., Easton, Penn. (1980).

Niewielkie modyfikacje pierwotnej sekwencji aminokwasowej MTAzy mogą dać w wyniku białka, które mają aktywność zasadniczo równoważną w porównaniu z opisanymi tu enzymem MTAzą i peptydami. Modyfikacji takich można dokonywać w zamierzony sposób, jak przez ukierunkowaną mutagenezę lub mogą być one spontaniczne. Wszystkie białka i peptydy utworzone w wyniku tych modyfikacji wchodzą w zakres ninjejsóego opisu, tak długo jak nadal wykazują aktywność biologiczną MTAzy. Ponadto, wynikiem delecji jednego lub więcej aminokwasów także może być modyfikacja struktury otrzymanej cząsteczki bez znaczącej zmiany jej aktywności biologicznej. Może to prowadzić do stworzenia mniejszej aktywnej cząsteczki, która będzie mieć szerszą użyteczność. Na przykład, można usunąć aminokwasy amino- lub karboksylowe, które mogą nie być wymagane do wykazywania pożądanej aktywności katalitycznej lub antygenowej enzymu.

Termin „konserwatywne zróżnicowanie” w znaczeniu tu stosowanym oznacza zastąpienie reszty aminokwasowej inną, biologicznie podobną resztą. Przykłady konserwatywnego zróżnicowania obejmują podstawienie jednej reszty hydrofobowej, takiej jak izoleucyna, walina, leucyna lub metionina, inną, takie jak podstawienie argininy w miejsce lizyny, kwasu glutaminowego w miejsce kwasu asparaginowego lub glutaminy w miejsce asparaginy i podobne. Termin „konserwatywne zróżnicowanie” obejmuje także stosowanie podstawionego aminokwasu w miejsce niepadstawianego aminokwasu, pod warunkiem, że przeciwciała wywołane wobec podstawionego polipeptydu wykazują reaktywność immunologiczną również wobec niepodstawianego polipeptydu.

Sekwencje DNA do stosowania w wytwarzaniu MTAzy i peptydów MTAzy można także otrzymać kilkoma metodami. Na przykład, można wyizolować DNa stosując procedury hybrydyzacyjne, które są dobrze znane w nauce. Obejmują one, ale nie ograniczają się do: 1) hybrydyzacji sond z bibliotekami genomowymi lub cDNA w celu wykrycia wspólnych sekwencji nukleatydowych; 2) przeszukiwania przeciwciałami bibliotek ekspresyjnych w celu wykrycia wspólnych cech strukturalnych i 3) syntezy przez reakcję łańcuchową polimerazy (PCR).

Procedury hybrydyzacyjne są użyteczne do przeszukiwania zrekombinowanych klonów przy użyciu sond złożonych ze znakowanych mieszanych aligonukleatydów syntetycznych, gdzie każda sonda jest potencjalnie w pełni komplementarna ze specyficzną sekwencją DNA w hybryeyzawapej próbce, która obejmuje heterogenną mieszaninę zd„naturowapych dwupiciowych DNA. W celu takiego przeszukiwania, hybrydyzację przeprowadza się albo jeeponiciowym DNA, albo ódenaaurawanym dwupjciowym DNA. Hybrydyzacja jest szczególnie użyteczna w wykrywaniu klonów cDNA pochodzących ze źródeł, w których obecne są skrajnie niskie ilości sekwencji mRNA dotyczącego palip„ptydu będącego przedmiotem zainteresowania. Innymi słowy, stosując surowe warunki hybrydyzacji mające na celu uniknięcie niespecyficznego wiązania, możliwe jest na przykład umożliwienie autaradjografjcópej wizuali181 667 zacji klonu specyficznego cDNA przez hybrydyzację docelowego DNA z tą pojedynczą sondą w mieszaninie.

Zawierającą MTAzę bibliotekę cDNA można przeszukiwać przez wstrzykiwanie różnych mRNA otrzymanych z cDNA do oocytów, zapewnienie wystarczającego czasu do wystąpienia ekspresji produktów genu cDNA i testowanie pod kątem obecności pożądanego produktu ekspresji cDNA, na przykład przez użycie sond na powtarzalne motywy i właściwego dla MTAzy wzoru ekspresji tkankowej. Alternatywnie, bibliotekę cDNA można przeszukać pośrednio pod kątem peptydów MTAzy posiadających przynajmniej jeden epitop, stosując przeciwciała specyficzne wobec polipeptydów. Jak opisano poniżej w części C, przeciwciała takie mogą być albo pochodzenia poliklonalnego, albo monoklonalnego i można je stosować do wykrywania produktu ekspresji wykazującego obecność cDNA MTAzy.

Procedury przeszukiwania, które podlegają hybrydyzacji kwasów nukleinowych, umożliwiają wyizolowanie sekwencji każdego genu z każdego organizmu, pod warunkiem, że dostępna jest odpowiednia sonda. Sondy oligonukleotydowe, które odpowiadają części sekwencji kodującej omawiane białko, można zsyntetyzować chemicznie. Wymaga to znajomości krótkich oligopeptydowych odcinków sekwencji aminokwasowej. Sekwencję DNA kodującą białko można przewidzieć na podstawie kodu genetycznego, należy jednak brać pod uwagę degenerację kodu genetycznego. Gdy sekwencja jest zdegenerowana, możliwe jest przeprowadzenie mieszanej reakcji przyłączania. Dotyczy ona heterogenną mieszaninę zdenaturowanego dwuniciowego DNA. W celu takiego przeszukiwania, hybrydyzację korzystnie przeprowadza się z albo jednoniciowym, albo zdenaturowanym dwuniciowym DNA.

Utworzenie specyficznych sekwencji DNA kodujących MTAzę lub jej fragmenty można także uzyskać przez: 1) wyizolowanie sekwencji dwuniciowych DNA z genomowego DNA; 2) chemiczne wytworzenie sekwencji DNA w celu zapewnienia koniecznych kodonów polipeptydu będącego przedmiotem zainteresowania; i 3) syntezę in vitro sekwencji dwuniciowego DNA przez odwrotną transkrypcję mRNA wyizolowanego z komórki eukariotycznego dawcy. W tym ostatnim przypadku, tworzy się ewentualnie dwuniciowy DNA komplementarny do mRNA, który na ogół określa się jako cDNA.

W niniejszym wynalazku polinukleotyd i jakiekolwiek jego warianty kodujące MTAzę można wstawić do zrekombinowanego wektora ekspresyjnego. Termin „zrekombinowany wektor ekspresyjny” odnosi się do plazmidu, wirusa lub innego nośnika znanego w nauce, który poddano manipulacji przez wstawienie lub inkorporację odpowiednich sekwencji genetycznych. Takie wektory ekspresyjne zawierają sekwencję promotorową, która umożliwia wydajną transkrypcję wstawionej sekwencji genetycznej gospodarza.

Transformację komórki gospodarza zrekombinowanym DNA można także przeprowadzić technikami konwencjonalnymi, dobrze znanymi specjalistom w tej dziedzinie. Komórki gospodarza mogą być eukariotyczne (takie jak komórki jajnika chomika chińskiego) lub prokariotyczne (takie jak bakterie lub drożdże). Jeśli gospodarz jest prokariotyczny, taki jak E. coli, kompetentne komórki, które są zdolne do pobierania DNA, można przygotować z komórek zebranych po fazie wzrostu wykładniczego, a następnie traktowanych metodą wykorzystującą CaCl2 z zastosowaniem dobrze znanych procedur. Alternatywnie, można uzyć MgCl2 lub RbCl2- Transformację można również przeprowadzić po utworzeniu protoplastów komórek gospodarza lub przez elektroporację.

Specjaliści w tej dziedzinie mogą przeprowadzić izolowanie i oczyszczanie wytworzonej mikrobiologicznie MTAzy lub jej fragmentów dostarczonych przez wynalazek stosując konwencjonalne sposoby obejmujące chromatografię preparatywną i rozdziały immunologiczne wykorzystujące przeciwciała monoklonalne lub poliklonalne.

W oparciu o informację zawartą w sekwencji o numerze identyfikacyjnym 1, łatwo można przewidzieć sekwencję aminokwasową pełnej długości MTAzy. Wykorzystując tą informację można również, bez nadmiernych prac eksperymentalnych, zsyntetyzować MTAzę i peptydy MTAzy powszechnie stosowanymi metodami, takimi jak blokowanie t-BOC lub FMOC grup alfa-aminowych. Obie metody obejmują etapową syntezę, w której na każdym etapie dodaje się jeden aminokwas, począwszy od końca C peptydu (patrz Coligan i in., Current Protocols in Immunology, Wiley Interscience, 991, część 9). Peptydy można syntetyzo10

181 667 wać również różnymi dobrze znanymi metodami syntezy peptydów na fazie stałej, takimi jak te opisane przez Merifielda, J. Am. Chem. Soc, 85: 2149 (1962) oraz Stearta i Younga, Solid Phase Peptides Synthesis (Freeman, San Francisco, 27-62, 1969), stosując kopoli(styrenodiwinylobenzen) zawierający 0,1-1,0 mmoli amin/g polimeru.

W tej ostatniej metodzie, po zakończeniu syntezy chemicznej, peptydy można odblokowywać i odszczepiać od polimeru przez traktowanie płynnym HF-10% anizolem w ciągu około 1/4-1 godziny w temperaturze 0°C. Po odparowaniu odczynników, peptydy ekstrahuje się z polimeru roztworem 1⁰% kwasu octowego, który następnie liofilizuje się otrzymując nieoczyszczony materiał. Można go normalnie oczyszczać takimi technikami, jak sączenie molekularne na Sephadex G-15, jako rozpuszczalnik stosując 5% kwas octowy. Liofilizacja odpowiednich frakcji z kolumny pozwoli otrzymać homogenny peptyd lub pochodne peptydu, które można następnie charakteryzować takimi standardowymi technikami, jak analiza składu aminokwasowego, chromatografia cienkowarstwowa, wysokosprawna chromatografia cieczowa, spektroskopia absorpcyjna w ultrafiolecie, skręcalność molowa, rozpuszczalność i ilościowo oznaczać przez degradację Edmana na fazie stałej.

Wytwarzanie przeciwciał skierowanych przeciw MTAzie

W celu określenia stopnia odpowiedzi wytwarzania przeciwciał zwierzęcia immunizowanego peptydem, antygenowość peptydów MTAzy można określać technikami konwencjonalnymi. Ogólnie rzecz biorąc, peptydami MTAzy, które stosuje się do wywołania przeciwciał skierowanych przeciw MTAzie, powinny ogólnie rzecz biorąc być te, które indukują wytwarzanie wysokich mian przeciwciał o stosunkowo wysokim powinowactwie do MTAzy. Peptydy takie można oczyścić do stosowania jako immunogeny stosując na przykład metodę opisaną w Ragnione i in., (J. Biol. Chem., powyżej) lub opisane powyżej metody otrzymywania peptydów MTAzy.

Po przygotowaniu antygenowych peptydów, przeciwciała skierowane przeciw immunizującemu peptydowi wytwarza się przez wprowadzenie peptydu do ssaka (takiego jak królik, mysz lub szczur). W celu zilustrowania, w dołączonej do niniejszego opisu Liście Sekwencji podano, jako sekwencje o numerach identyfikacyjnych 2 i 3, sekwencje aminokwasowe dwóch antygenowych peptydów MTAzy. Przeciwciała wytworzone przez króliki immunizowane tymi peptydami wykazywały 50% maksymalnej odpowiedzi na oczyszczoną MTA w rozcieńczeniach, odpowiednio, 1:1500 i 1:4000.

Do immunizacji zwierząt antygenowymi peptydami MTAzy korzystne jest stosowanie protokołu immunizacji przez wielokrotne iniekcje (patrz np. Langone i in., red, „Production of Antisera with Smali Doses of Immunogen: Multiple Intradermal Injections”, Methods of Enzymology (Acad. Press, 1981)). Na przykład, dobrą odpowiedź wytwarzania przeciwciał można uzyskać w królikach w wyniku podania śródskómej iniekcji 1 mg antygenowego peptydu MTAzy zemulgowanego w kompletnym adiuwancie Freunda, a następnie kilka tygodni później jednej lub więcej dawek przypominających tego samego antygenu w niekompletnym adiuwancie Freunda.

Jeśli jest to pożądane, peptyd immunizujący można, wykorzystując techniki dobrze znane w tej dziedzinie, sprzęgać z nośnikiem białkowym przez koniugację. Takie powszechnie wykorzystywane nośniki, które sprzęga się chemicznie z peptydem obejmują hemocyjaninę skałoczepa (KLH), tyroglobulinę, albuminę surowicy bydlęcej (BSA) i toksoid tężcowy. Sprzęgnięty peptyd stosuje się następnie do immunizacji zwierzęcia (np. myszy lub królika). Ponieważ obecnie uważa się, że MTAza jest konserwatywna u gatunków ssaków, korzystne jest stosowanie nośnika białkowego do wzmocnienia immunogenności białek MTAzy.

Wytworzone przez immunizowane zwierzęta przeciwciała poliklonalne można następnie oczyszczać, na przykład przez wiązanie i elucję z matriks, z którą związano peptyd, przeciw któremu wywołano przeciwciała. Specjaliści w tej dziedzinie będą znać wiele różnych powszechnych w immunologii technik oczyszczania i/lub zatężania przeciwciał poliklonalnych, jak również przeciwciał monoklonalnych (patrz na przykład Coligan i in., część 9, Current Protocols in Immunology, Wiley Interscience, 1991).

Przeciwciała monoklonalne wytwarza się korzystnie przez immunizację myszy lub szczura. Termin „przeciwciało”, w znaczeniu stosowanym w tym wynalazku, obejmuje za181 667 równo nienaruszone cząsteczki, jak również ich fragmenty, takie jak na przykład Fab i F(ab')2, które są zdolne do wiązania determinanty epitopowej. W tym kontekście, termin „mAb” odnosi się również do przeciwciał monoklonalnych specyficznych wobec MTAzy.

Ogólna metoda stosowana do wytwarzania hybrydom wydzielających przeciwciała monoklonalne („mAb”) jest dobrze znana (Kohler i Milstein, Naturę, 256: 495, 1975). -W skrócie, jak opisali Kohler i Milstein, technika obejmuje izolację limfocytów z regionalnych drenujących węzłów limfatycznych pięciu odrębnych pacjentów chorych na raka, z czerniakiem, potwomiakiem złośliwym, rakiem szyjki macicy, glejakiem lub rakiem płuc. Limfocyty otrzymywano ze skrawków chirurgicznych, zbierano, a następnie poddawano fuzji z SHFP-1. Hybrydomy przeszukiwano pod kątem wytwarzania przeciwciał wiążących się z liniami komórek rakowych.

Potwierdzenie specyficzności mAb wobec przeciwciał MTAzy można uzyskać stosując stosunkowo rutynowe techniki przeszukiwania (takie jak enzymatyczne oznaczenie immunosorpcyjne lub „ELISA”) do określania podstawowego wzoru reakcji mAb będącego przedmiotem zainteresowania.

Możliwa jest także, bez nadmiernych prac eksperymentalnych, ocena mAb określająca, czy posiada ono taką samą specyficzność, co mAb będące przedmiotem zainteresowania, przez określenie, czy testowane mAb zapobiega wiązaniu wymienionego mAb z MTAzą. Jeśli testowane mAb współzawodniczy z przedmiotowego mAb, na co wskazuje obniżenie wiązania przedmiotowego mAb, to jest prawdopodobne, że te dwa przeciwciała monoklonalne wiążą się z tymi samymi lub ściśle zbliżonymi epitopami.

Jeszcze innym sposobem określenia, czy mAb posiada specyficzność przedmiotowego mAb, jest preinkubowanie przedmiotowego mAb z antygenem, wobec którego jest ono normalnie reaktywne i określenie czy testowane mAb ulega hamowaniu pod względem zdolności do wiązania antygenu. Jeśli testowane mAb ulega hamowaniu, to najprawdopodobniej posiada ono taką samą lub ściśle zbliżoną specyficzność epitopowąjak przedmiotowe mAb.

Zestaw do wykrywania MTAzy

Można przygotować zestaw do wykrywania MTAzy do stosowania w warunkach laboratoryjnych i klinicznych, który obejmuje odczynniki użyteczne w opisanych powyżej sposobach. Na przykład, zestaw do stosowania w sposobie według wynalazku, powyżej, powinien korzystnie obejmować startery oligonukleotydowe (wytworzone jak opisano powyżej), wykrywalne wyznakowane sondy hybrydyzacyjne i powleczone reagentem płytki do mikromiareczkowania. Zestaw powinien również obejmować przeciwciała opisane powyżej do stosowania w immunologicznym wykrywaniu białka MTAzy (jak opisano w równoległym zgłoszeniu, numer kolejny US 5 571 510, złożonym 29 grudnia 1993 r.).

Przedmiot wynalazku został przedstawiony na rysunku, na którym fig. 1 mapuje gen MTAzy i wskazuje położenie eksonów w polinukleotydzie. Przypuszczalne eksony podkreślono, przypuszczalne introny wskazano przez jedną lub więcej substytucji „N” dla zasad sekwencji polinukleotydowej. Sekwencja przedstawiona na fig. 1 odpowiada sekwencji zawartej w sekwencji o numerze identyfikacyjnym 1 dołączonej do niniejszego opisu.

Posiadając w pełni opisany wynalazek, poniżej podano przykłady ilustrujące jego praktyczne stosowanie. Przykłady te należy uważać tylko za ilustrujące, a nie ograniczające zakres wynalazku.

W przykładach stosowane są następujące skróty: AS = antysensowny; DTT = ditiotreitol; min = minuty; MTAza = fosforylaza 5 '-deoksy-5 '-metylotioadenozynowa; PCR = reakcja łańcuchowa polimerazy; S = sensowny; SSc = 0,3 M NaCl, 0,03 M dwuwodzian cytrynianu sodowego; v/v = objętość na objętość; SDS = sodowy siarczan dodecylu.

Przykład I. Test katalitycznej aktywności MTAzy w próbce.

Fosforolityczną aktywność MTAzy określano przez pomiar powstawania [metylo-¹⁴C]5-metylotiorybozo-1-fosforanu z [metylo-¹⁴C|-5'-deoksy-5'-metylotioadenozyny (Seidenfeld i in., Biochem, Biophys, Res. Commun: 95, 1861-1866 (1980)). Całkowita objętość 200 mikrolitrów standardowej mieszaniny reakcyjnej zawierała 50 mM bufor fosforanów potasowych, pH 7,4, 0,5 mM [metylo-¹⁴C]-5'-deoksy-5'-metylotioadenozynę (2 x 10⁵ CPM/mmol), 1 mM DTT i wskazane ilości enzymu. Po inkubacji w ciągu 20 minut w temperaturze 37°C reakcję

181 667 zatrzymywano przez dodanie 50 mikrolitrów 3 M kwasu trichlorooctowego i próbki o objętości 200 mikrolitrów nakładano na kolumnę (0,6 x 2 cm) wypełnioną „Dowex” 50-H zrównoważonym wodą. [metylo-^l4C]-5-metylotiorybozo-1-fosforan eluowano bezpośrednio do naczynek scyntylacyjnych zawierających po 2 ml 0,1 M HCl.

Przykład II. Oczyszczanie natywnej MTAzy z wątroby szczura.

MTAzę izolowano z wątroby szczura stosując zmodyfikowaną metodę Rengione i in., (J Biol. Chem 261, 12324-12329, 1986). 50 g świeżej wątroby szczura homogenizowano w mikserze Waringa z 4 objętościami 10 mM buforu fosforanów potasowych, pH 7,4, zawierającego 1 mM DTT (bufor A). Homogenat wirowano (1 godzinę przy 15000 x g), a otrzymany supematant poddano frakcjonowaniu siarczanem amonowym. Frakcję ulegającą wytrąceniu w przedziale 55-75% nasycenia odwirowano (20 minut, przy 15000 x g) i rozpuszczono w minimalnej objętości buforu A. Następnie próbkę dializowano przez noc wobec 100% objętości buforu A stosując trzykrotną zmianę tego samego buforu.

Próbkę sklarowano przez wirowanie w ciągu 30 minut przy 15000 x g i nałożono na kolumnę z DEAE-Sephacryl (1,5 x 18 cm; Pharmiacia) uprzednio zrównoważonym buforem A. Po przemyciu 80 ml buforu do równoważenia, stosowano liniowy gradient (80 ml) 0-0,3 M NaCl w buforze A. Aktywność MTAzy uległa elucji pomiędzy 0,1 M a 0,15 M NaCl. Frakcje o aktywności nie mniejszej niż 0,06 jednostek/mg białka zatężono 20-krotnie przez ultrafiltrację (membrany PM-10 Diaflow, Amicon) i intensywnie dializowano wobec 25 mM buforu fosforanów potasowych zawierającego 1 mM DTT (bufor B). Następnie próbkę nałożono na kolumnę (1x12 cm) z hydroksyapatytem (Bio-Rad). Po wyeluowaniu buforem B białek nie zaadsorbowanych, kolumnę przepłukano około 40 ml 50 mM buforu fosforanów potasowych, pH 7,4, zawierającego 1 mM DTT.

Następnie MTAzę eluowano stosując gradient liniowy (40 ml) 50-250 mM fosforanu potasowego (pH 7,4). Frakcje wykazujące aktywność MTAzy zatężono 30-krotnie przez ultrafiltrację i usunięto z nich ditiotreitol przez powtarzane zatężanie i rozcieńczanie 50 mM buforem fosforanów potasowych, pH 7,4. Częściowo oczyszczony enzym nałożono następnie na kolumnę 0,8 x 3 cm) z rtęcioorganiczną pochodną agarozy (Bio-Rad) zrównoważoną 50 mM buforem fosforanowym, pH 7,4. Elucję kolumny przeprowadzano etapami: a) 50 mM buforem fosforanów potasowych, pH 7,4; b) 50 mM buforem fosforanów potasowych, pH 7,4, 2 M KCl i c) 50 mM buforem fosforanów potasowych, pH 7,4, 2 M KCl, 40 mM 2-merkaptoetanolem. Następnie eluowano enzym 50 mM buforem fosforanów potasowych, pH 7,4, 2 M KCl, 200 mM 2-merkaptoetanolem. Frakcje wykazujące aktywność co najmniej 3 jednostek/mg białka połączono, zatężono przez ultrafiltrację do objętości 1 ml i dializowano w ciągu nocy wobec 1000 objętości 10 mM Tris/HCl, pH 7,4, 1 M DTT (bufor C). Jako ostatni etap oczyszczania, części próbki (1 ml) iniekowano z szybkością przepływu 1 ml/minutę na kolumnę „MONO Q” (Pharmacia), uprzednio zrównoważoną 10 mM Tris/HCl, pH 7,4, zawierającym 1 M DTT i zbierano frakcje o objętości 0,5 ml. Aktywność MTAzy uległa elucji w zakresie 0,08-0,14 M NaCl w buforze C. Frakcje te zatężono przez ultrafiltrację do objętości 0,5 ml i dializowano wobec 1000 objętości buforu B.

Przykład III. Określanie częściowej sekwencji aminokwasowej MTAzy szczura.

Oczyszczoną próbkę zliofilizowano, rozpuszczono w 50 mikrolitrach buforu do nakładania próbek (1% sodowy siarczan dodecylu (SDS), 10% gliceryna, 0,1 M DTT i 0,001% błękit bromofenolowy) i nałożono na żel poliakryloamidowy zawierający 10% SDS o grubości 0,5 mm (aparat „MINIGEL”; Bio-Rad). Po elektroforezie białka poddawano w ciągu 2 godzin elektroblotingowi na nitrocelulozę ( o wielkości porów 0,45 milimetra, Millipore) w układzie do transblotingu Bio-Rad, stosując bufor do przenoszenia (15 mM Tris, 192 mM glicyna i 20% metanol, pH 8,3), jak opisali Towbin i in., (Proc. Nat. Acad. Sci. USA 76, 4340-4345, 1979).

Po transferze białka odwracalnie barwiono za pomocą Ponceau S (Sigma) stosując zmodyfikowaną metodę Salinovicha i Montelaro (Anal. Biochem. 156, 341-347, 1987). Sączek nitrocelulozowy zanurzano na 60 sekund w 0,1% roztworze barwnika Ponseau S w 1% wodnym roztworze kwasu octowego. Nadmiar barwnika usuwano z biotu przez ostrożne mieszanie w 1% roztworze kwasu octowego w ciągu 1-2 minut. Ujawniony przez zabarwienie

181 667 obszar zawierający białko wycięto, przeniesiono do probówki Eppendorfa (1,5 ml), przemywano wodą destylowaną i inkubowano w ciągu 30 minut w temperaturze 37°C w 1,2 ml 0,5% roztworu pirolidonu poliwinylowego (średnia masa cząsteczkowa = 40000, PVP-40, Sigma) w 100 mM kwasie octowym, aby zapobiec adsorpcji proteazy na nitrocelulozie podczas trawienia. Nadmiar PVP-40 usuwano przez intensywne (nie mniej niż pięciokrotne) przemywanie wodą.

Następnie skrawki nitrocelulozy pocięto na drobne kawałki, w przybliżeniu o wymiarach 1 mm x 1 mm i ponownie umieszczono w tej samej probówce. Białko znajdujące się na kawałkach nitrocelulozy strawiono jak opisano uprzednio (Los i in., Science 243, 217-220, 1989). Dodano trypsynę (10 pikomoli) w 100 mikrolitrach mieszaniny 100 mM Tris-HCl (pH 8,2) i acetonitrylu w stosunku 95:5 (v/v) i inkubowano w temperaturze 37°C przez noc. Po trawieniu zawierający peptyd supernatant zakwaszono przez dodanie 30 mikrolitrów 10% kwasu trifluorooctowego, szybko zamieszano na Vortexie i odwirowano przy 15000 g w ciągu 1 minuty. Pobrano supernatant i natychmiast wstrzyknięto na analityczną kolumnę (2,1 x 100 mm) z odwróconymi fazami Brownlee Aquapore Bu-300 połączoną z układem HPLC (Beckman).

Kolumnę płukano w ciągu 5 minut eluentem D, 0,1% wodnym roztworem kwasu trifluorooctowego (czystości do sekwencj onowania, w wodzie) z szybkością przepływu 200 mikrolitrów na minutę, a następnie przepływ obniżono do 100 mikrolitrów na minutę i rozpoczęto gradient eluentu E (0,08-0,095% kwas trifluorooctowy w acetonitrylu/H2O, 70:30 (v/v). Opierając się na absorpcji UV przy fali o długości 215 nm, zawierające peptyd frakcje zbierano manualnie do probówek Eppendorfa. Reprezentatywne frakcje 60 i 77 poddano sekwencjonowaniu aminokwasów (477A Protem Sequencer z 120A Online PTH-AA Analyzer ABI). W ten sposób otrzymano niezależne częściowe sekwencje aminokwasowe MTAzy szczura. Sekwencje aminokwasowe peptydów oznaczonych jako peptyd 1 (frakcja 60) i peptyd 2 (frakcja 77) przedstawiono w sekwencjach o numerach identyfikacyjnych 4 do 5.

Przykła d IV. Amplifikccja fragmentu DNA kodująeeoo część ludzleego genu MTAzy.

W oparciu o częściowe sekwencje aminokwasowe peptydu 1 (sekwencja o numerze identyfikacyjnym 4) i peptydu 2 (sekwencja o numerze identyfikacyjnym 5), dsyntetyzgwano dwa zestawy starterów gliggnukleotydgwych o różnych polamościach. Każdy oliggnuZleoty0 zaprojektowano tak, aby zawierał w swym końcu 5' unikalne miejsce restrykcyjne (EcoRI lub BamHI) w celu ułatwienia późniejszego klonowania zamplifikgwknegg fragmentu DNA. W celu przeprowadzenia amplifikacji techniką PCR całkowity cDNA wyizolowano z 1 miliona jednostek łysinkotwórczych (pfu) biblioteki genów cDNA łożyska ludzkiego (Clontech) stosując zestaw „Lambda-TRAP” (Clontech). Reakcję PCR przeprowadzono w całkowitej objętości 100 mikrolitrów zawierającej 1 mikrogram całkowitego cDNA z biblioteki genów cDNA łożyska ludzkiego, 1 x buforu PCR (10 mM KCl, 10 mM Tris-HCl, pH 8,3, 2,5 mM MgCh), 0,2 mM każdego dNTP, po 100 mg startera sensownego i annysensgwnego i 10 jednostek fragmentu Stoffela polimerazy DNA Tag („AMPLI TAQ”, Perkin Elmer Cetus).

Przeprowadzono czterdzieści cykli ampłifikacji stosując „GENE AMP” PCR System 9600 (Perkin Elmer Cetus), każdy cykl obejmował denaturagę (92°C, 1 minuta), łączenie (55°C, 2 minuty) i wydłużanie (72°C, 2 minuty). Produkt reakcji PCR rozdzielono elektrofgretycdnie w 0,8% żelu agarozowym stosując 1 x bufor TA (40 mM Tris-octan, 20 mM octan sodowy, 2 mM EDTA, pH 7,9) i zamplifikowano fragment DNA o długości 450 bp. Produkt ampłifikacji PCR poddano podwójnemu trawieniu enzymami restrykcyjnymi EcoRI/BamHI, rozdzielono w 0,8% żelu agarozowym w 1 x buforze TA, usunięto z żelu za pomocą zestawu „GENE CLEAN” (Bio101), zsdbklongwkno w wektorze pBluescript SK+ (Stratagene) strawionym EcgRI/BamHI i zsekweecjongwkno metodą terminacji UidegksyndklegtyUami stosując uniwersalny starter sekwencyjny (zestaw do sekwencjonowania DNA „SEQUENASE” wersja 1.0, USB).

Przykład V. Przeszukiwanie biblioteki genów cDNA łożyska ludzkiego.

Analiza sekwencji produktu zamplifikowanego (przykład IV) wykazuje całkowitą zgodność z C-końcową sekwencją amiegkwaskwą peptydu 1 (sekwencja o numerze identyfi14

181 667 kacyjnym 5). Stosując jako sondę hybrydyzacyjną fragment DNA o długości 450 bp przeszukano bibliotekę genów cDNA łożyska ludzkiego (Clontech). W tym celu komórki gospodarza szczepu Y1090 E. coli inkubowano z równoczesnym intensywnym wytrząsaniem przez noc w temperaturze 37°C w podłożu LB (1 litr: 10 g tryptonu, 5 g ekstraktu drożdżowego, 10 g NaCl) zawierającym 0,2% maltozę i 10 mM MgSP. Na każdą płytkę mieszano 0,3 ml hodowli komórek gospodarza z 3 x 10)4 pfu faga i inkubowano w ciągu 20 minut w temperaturze 37°C. Mieszaniny komórek gospodarza z fagiem dodawano do 8 ml 0,7% agarozy zawierającej podłoże LB (górna warstwa agarozy z LB), którą wstępnie ogrzewano do temperatury 48°C i wylewano na 20 płytek agarowych (135 x 15 mm). Łysinki były widoczne już po około 6 do 8 godzinach inkubacji w temperaturze 37°C i płytki schładzano do temperatury 4°C w ciągu 1 godziny. Łysinki przenoszono w ciągu 3 minut na nylonowe membrany do transferu Colony/Plaąue Screen (NEN Research Products, Dupont Boston, MA), a następnie denaturowano (dwukrotnie w 0,5 N NaOH w ciągu 2 minut), renaturowano (dwukrotnie w 1,0 M Tris-HCl, pH 7,5, w ciągu 2 minut) i utrwalono za pomocą suszenia powietrzem. Prehybrydyzację 20 membran przeprowadzono w dwóch plastikowych woreczkach, po 10 membran w każdym, w temperaturze 42°C w ciągu 4 godzin, używając 20 ml buforu do prehybrydyzacji (1% SDS, 2 x SSC, 10% siarczan dekstranu, 50% dejonizowany formamid).

Fragment EcoRI/BamHI MTAzy ludzkiej o długości 450 par zasad wyznakowano [alfa-32P]dATP (3000 Ci/mmol) za pomocą zestawu do translacji z przemieszczaniem pęknięć (Boeringer, Mannheim), oddzielono od niewbudowanego znacznika promieniotwórczego na kolumnie NICK (Pharmacia), zdenaturowano przez ogrzewanie w temperaturze 96°C w ciągu 10 minut, schłodzono na lodzie i dodano do membran w plastikowych woreczkach przy stężeniu sondy wynoszącym 106 dpm/ml. Aktywność właściwa wyznakowanej sondy wynosiła około 10⁸ dpm/mikrogram. Hybrydyzację prowadzono przez noc w temperaturze 42°C. Po hybrydyzacji membrany płukano trzy razy w temperaturze pokojowej w ciągu 5 minut w nadmiarze 2 x SSC, następnie w temperaturze 65°C w ciągu 20 minut w 2 x SSC, 0,1% SDS i raz w temperaturze pokojowej w ciągu 20 minut w 2 x SSC, 0,1% SDS. Odpłukane membrany eksponowano przez noc wobec filmu rentgenograficznego.

Korki agaru zawierające kilka łysinek wokół dodatniego sygnału przenoszono do 1 ml jałowego rozcieńczalnika fagów (50 mM Tris-HCl, pH 7,5, 0,1 M NaCl, 8 mM MgSO4, 0,01% żelatyna) i ponownie przeszukiwano, aż do uzyskania czystych, dodatnich łysinek. W wyniku przeszukania około pół miliona łysinek otrzymano 6 niezależnych dodatnich klonów. Po amplifikacji na płytkach LB, fagowy DNA każdego z dodatnich klonów oczyszczono stosując zestaw „Lambda-TRAP” (Clontech). Oczyszczone DNA fagowe strawiono enzymem EcoRl w celu uzyskania całej wstawki, ale z powodu występowania miejsca EcoRI wewnątrz wstawki, dla wszystkich klonów otrzymano po dwa prążki.

Dwa fragmenty EcoRI wstawki (o długości 850 bp i 1100 bp) reprezentatywnego klonu, nazwanego MTAp-1, zsubklonowano w strawionym EcoRI wektorze pBluescript SK+ (Stratagene). Otrzymane subklony nazwano odpowiednio MTAP-2 (850 bp) i MTAP-3 (1100 bp). Analiza restrykcyjna oraz sekwencjonowanie DNA obu subklonów wykazały, że subklon MTAP-2 zawiera otwartą ramkę odczytu 254 aminokwasów, obejmującą sekwencję aminokwasową odpowiadającą końcowi C peptydu 3 (homologia 90%). Przyjmując masę cząsteczkową ludzkiej MTAzy równą 32 kDa (Rangione i in., J Biol. Chem, 261: 12324-12329, 1986), pokrywa ona 85% całego białka. Brakuje około 50 aminokwasów (co najmniej 150 bp na poziomie DNA).

Przykład VI. Wydłużanie startera dla otrzymania brakującego końca 5' cDNA MTAzy.

Dla otrzymania brakującego 5'-końcowego fragmentu DNA zastosowano metodę RACE (szybkiej amplifikacji końców cDNA) (Loh i in., Science 243: 217-220, 1989; Frohman i in., Proc:. Natl. Acad. Sci, 85: 8998-9002, 1988). Jeden mikrogram RNA poli(A+) z łożyska ludzkiego (Clontech) w 6,25 mikrolitrów H2 O ogrzewano w ciągu 5 minut w temperaturze 65°C, schłodzono na lodzie, dodano do 4 mikrolitrów buforu 5 x RTC (250 mM Tris-HCl, pH 8,15, 30 mM MgCh, 200 mM KCl, 5 mM DTT), 4 mikrolitrów (0,4 g/ml) aktynomycyny D (Boehringer), 1 mikrolitra każdego z dNTP (20 mM), 0,25 mikrolitra (10 jednostek) RNasin (Boeh181 667 ringer), 1 mikraljtra [alfa-³⁵S]”ATP (1433 Ci/mmol), 1 mikrolitra antysensawnega oligonukleotydu 3 AS specyficznego wobec MTAzy ludzkiej oraz 10 jednostek odwrotnej arapskryptazy wirusa ptasiej białaczki mieloblasaycónej (Boehringer). Mieszaninę tę inkubowapo w ciągu 2 godzin w temperaturze 42°C.

Nadmiar startera i dNTP usunięto w następujący sposób: cDNA w objętości 20 mikrolitrów nałożono na kolumnę NICK (Pharmacia) i zbierano dwukroplowe frakcje. Frakcje 5-8 licząc od pierwszego piku wykazującego promieniotwórczość połączono, wytrącono za pomocą 1/10 objętości 7,5 M NHOAc i 2,5 objętości etanolu w ciągu 2 godzin w temperaturze -80°C, wirowano w ciągu 30 minut przy 15000 x g w temperaturze 4°C, przemyto 0,5 ml 80% etanolu, wysuszono pod zmniejszonym ciśnieniem (Speedvac) i rozpuszczono w 20 mikrolitrach H2 O. Aby uzupełnić końce dodano 1,5 mikrolitra (20 mM) dGTP, 2,4 mikrolitra (25 mM) CaCl2, 6 mikrolitrów 5' buforu do uzupełniania końców (1 mM kakodylan potasowy, 125 mM Tris-HCl, pH 6,6, 1,25 mg/ml albuminy surowicy bydlęcej) oraz 0,5 mikrolitra (15 jednostek) terminalnej transferazy deoksynukleotydowej (Boehringer).

Mieszaninę jnkubowapo w ciągu 1 godziny w temperaturze 37°C, ogrzewano w ciągu 15 minut w temperaturze 65°C, ekstrahowano raz taką samą objętością buforu TE (10 mM Tris-HCl, pH 7,5, 0,1 mM EDTA) nasyconego fenolem, a następnie wytrącono etanolem w sposób opisany powyżej. Pulę cDNA z uzupełnionymi końcami rozpuszczono w 20 mikrolitrach H2 O i 1 mikrolitr użyto do reakcji PCR. Do amplifikacji zsyptetyzowana dwa dodatkowe startery. Jednym ze starterów był antysensawny starter specyficzny wobec MTAzy, który lokalizuje się 180 bp przed położeniem oljganukleotydu 3AS. Drugim był starter ”la końca poli(G). Amplifikację prowadzono przez 40 cykli jak opisano powyżej. Każdy cykl obejmował denaturację (92°C, 1 minuta), łączenie (50°C, 2 minuty) i wydłużanie (72°C, 0,5 minuty).

Produkt PCR oddzielono elektraforeaycónje w 0,8% żelu agarozowym. Otrzymany fragment DNA o długości 520 bp uległ specyficznej amnlifikacji. Po oczyszczeniu w 0,8% preparatywnym żelu, fragment DNA o długości 520 bp strawiono Notl i Bell (odpowiednie miejsca restrykcyjne są obecne w regionie zachodzącym na wydłużony fragment DNA i początkowy fragment z subklonu MTAP-2) i ósubklonowana w strawionym Notl/BarnHI wektorze pBluescript SK+ (Stratagene). Analiza sekwencji trzech niezależnych subklonów, nazwanych odpowiednio MTAP-4, MTAP-5 i MTAP-6, ujawniła, że każdy z tych klonów zawiera sekwencję dokładnie odpowiadającą sekwencji aminokwasowej zachodzącego regionu.

Długości cDNA tych trzech subklonów cDNA wydłużonego z zastosowaniem starterów są pieca różne. Sugeruje to, że są one niezależnymi produktami reakcji PCR i że ich sekwencje odzwierciedlą poprawne sekwencje mRNA bez jakichkolwiek zasa” wprowadzonych do wewnątrz z sekwencji podczas amplifikacji PCR. Połączenie nowej sekwencji z kodonem start ATG (kodującym metioninę), leżącej przed sekwencją subklonu MTAP-2 i sekwencji leżącej za nim tworzy otwartą ramkę odczytu kodującą 283 aminokwasy.

Przykład VII. Ekspresja zrekambjpawapej MTAzy ludzkiej w E. coli.

Pełnej długości cDNA MTAzy ludzkiej skonstruowano dołączając wydłużony z wykorzystaniem starterów fragment cDNA z subklonu MTAP-4, który zawiera najdłuższą wstawkę spośród trzech subklonów otrzymanych w Przykładzie VI, do końca 5' wstawki DNA z MTAP-2, wykorzystując wspólne miejsce restrykcyjne Hindll. Fragment DNA Notl/l· Πρ”Π z subk^nu MTAP-4 zmieszano z długim fragmentem Hindll/EcoRI z subklonu MTAP-2 i ósubklanowano w wektorze nBluescript SK+ (Stratagene). Otrzymany subklon zawierający pełnej długości cDNA MTAzy ludzkiej nazwano MTAP-7. W celu sprawdzenia autentyczności tego klonu cDNA, przeprowadzono ekspresję zrekombinowanego białka z zastosowaniem wektora ekspresyjnego E. coli, pKK223-3, posiadającego promotor Taq (Pharmacia).

Do utworzenia nowego miejsca EcoRI w końcu 5' i miejsca PstI w końcu 3' fragmentu cDNA, wykorzystano reakcję PCR z zastosowaniem aljganukleoay”u startera 5'-końcowega zawierającego sekwencję Shine-Dalgamo (SD) i innego startera 3'-końcawego. Przeprowadzono 20 cykli amplifikacji, jak opisano powyżej, a każdy cykl składał się z denaturacji (92°C, 1 minuta), łączenia (55°C, 1 minuta) i wydłużania (72°C, 1 minuta). Produkt reakcji PCR strawiono enzymami restrykcyjnymi EcoRI/PostI, oczyszczano elektroforetycónie w 0,8%

181 667 żelu agarozowym i zsubklonowano w wektorze pBluescript SK+ (Stratagene) strawionym EcoRI/Post!.

Po sprawdzeniu całej sekwencji wstawki subklonu nazwanego MTAP-8, fragment EcoRI/PostI wycięto i zsubklonowano w strawionym EcoRI/Postl wektorze pKK223-3, otrzymując cdNa MTAzy w wektorze ekspresyjnym E. coli. Subklon nazwano MTAP-9 stransformowano nim szczep JM 105 E. coli. Analizowano aktywność enzymatyczną i obraz elektroforetyczny wszystkich białek stransformowanych komórek bez i z indukcją izopropylo-beta-D-tiogalaktopiranozydem (IPTG). Pojedynczą stransformowaną kolonią zaszczepiono ml podłoża LB i inkubowano w temperaturze 37°C w ciągu nocy, 20 mikrolitrów tej całonocnej hodowli dodano do dwóch plastikowych probówek, z których każda zawierała 2 ml świeżego podłoża LB (rozcieńczenie 1/100).

Po inkubacji w temperaturze 37°C w ciągu 1 godziny, do jednej z probówek dodano 20 mikrolitrów 0,1 M IPTG dla indukcji, otrzymując 1 mM stężenie końcowe IPTG i inkubowano w temperaturze 37°C przez kolejne 4 godziny. Po zebraniu komórek przez wirowanie w ciągu 5 minut przy 15000 x g, zawieszono je w 100 mikrolitrach buforu fosforanowego (50 mM fosforan potasowy, pH 7,5, 1 mM DTT), rozbito przez sonikację na lodzie przy zakresie w ciągu 0,5 minuty i przez wirowanie przy 15000 x g w ciągu 10 minut otrzymano nieoczyszczony ekstrakt komórkowy.

Stężenie białka oznaczano metodą Bradford (Protein Assay, Bio-Rad). Takie same ilości preparatów nieindkukowanego i indukowanego IPTG badano pod kątem aktywności enzymatycznej i poddano elektroforezie w 10% żelu poliakryloamidowym w obecności 10% SDS. Nieoczyszczony ekstrakt otrzymany z komórek indukowanych ITPG wykazywał ponad pięciokrotnie większą aktywność MTAzy niż ekstrakt z komórek nieindukowanych. Co więcej, w żelu z SDS stwierdzono obecność nowego prążka indukowanego białka (31 kDa).

P r z y k 1 a d VIII. Klonowanie i częściowa charakterystyka genomowego klonu MTAzy.

Aby uzyskać najbardziej wydajną amplifikację fragmentu DNA za pomocą PCR do celów diagnostycznych, jego długość powinna być mniejsza od 500 bp. Sekwencja cDNA odzwierciedla sumę eksonów, które normalnie rozdzielone są intronami, co czyni trudnym wyszukanie w sekwencji cDNA o odpowiedniej długości. Aby pokonać tę trudność, wyizolowano genomowy klon MTAzy ludzkiej. Kosmidową bibliotekę genową skonstruowaną z DNA łożyska ludzkiego (Clontech) przeszukano stosując sondę genu cDNa MTAzy, fragmentu NotI/EcoRI z subklonu MTAP-7. Stransformowane komórki E. coli z biblioteki wysiewano na płytkach LB z ampicyliną (50 mg/litr) z gęstością kolonii 1-2 x 10⁴/płytkę o wymiarach 135 x 15 mm.

Poniższą procedurę zastosowano jak opisano w Przykładzie IV. Z pół miliona kolonii wyizolowano pojedynczą dodatnią kolonię nazwaną MTAP-10 i częściowo scharakteryzowano ją przez analizę PCR i bezpośrednie sekwencjonowanie. Zsyntetyzowano dwa startery, jeden oligonukleotyd sensowny zlokalizowany 120 bp przed kodonem stop i oligonukleotyd antysensowny zlokalizowany 20 bp przed kodonem stop i użyto ich do analizy PCR. Reakcję PCR prowadzono przez 25 cykli, z których każdy obejmował denaturację (92°C, 1 minuta), łączenie (55°C, 2 minuty) i wydłużanie (72°C, 5 minut). Produkty reakcji PCR rozdzielono w 0,8% żelu agarozowym. Umiejscowienie eksonów w genie MTAzy poznane do dzisiaj przy zastosowaniu opisanej powyzszej techniki przedstawiono na fig. 1.

Przykła d IX. Zsstssowani e olioonkldeotydów o eekwencj i spcyyficznej wobcc MTAzy do wykrywania obecności lub oieobecneści MTAzy w liniach komórek złośliwych.

Do sprawdzenia użyteczności oligonneleotydów zastosowano PCR wobec kilku linii komórkowych, o których wiadomo, że zawierają komórki dodatnie lub ujemne pod względem MTAzy. Genomowe DNA wyizolowano jak opisano w Przykładzie VIII i ich 1 mikrogram używano w reakcji PCR. Amplifikację prowadzono przez 40 cykli, jak opisano powyżej, a każdy cykl obejmował denaturację (92°C, 1 minuta), łączenie (55°C, 1 minuta) i wydłużanie (72°C, 1/2 minuty). Produkty reakcji PCR analizowano w 1,5% żelu agarozowym. Nie wykryto MTAzy w liniach komórkowych, o których wiadomo, że są ujemne pod względem MTAzy, podczas gdy MTAzę wykryto w liniach komórkowych dodatnich pod względem MTAzy.

181 667

Podsumowanie sekwencji

Sekwencja o numerze identyfikacyjnym 1 jest genomowym klonem fosforylazy metylotioadenozynowej (MTAzy).

Sekwencja o numerze identyfikacyjnym 2 jest antygenowym peptydem MTAzy („peptyd 40”).

Sekwencja o numerze identyfikacyjnym 3 jest antygenowym peptydem MTAzy („peptyd 51”).

Sekwencja o numerze identyfikacyjnym 4 jest starterem do amplifikacji PCR genu MTAzy („peptyd 1”).

Sekwencja o numerze identyfikacyjnym 5 jest starterem do amplifikacji PCR genu MTAzy („peptyd 2”).

181 667

LISTA SEKWENCJI (1) INFORMACJA OGÓLNA:

(i) ZGŁASZAJĄCY: THE REGENTS OF THE UNIVERSITY OF CALIFORNIA (ii) TYTUŁ WYNALAZKU: Sposób wykrywania obecności katalitycznie aktywnej i katalitycznie fosforylazy metylotioadenozynowej (MTAzy), nieaktywnej wyizolowany polinukleotyd oraz zrekombinowany wektor ekspresyjny (iii) LICZBA SEKWENCJI: 5 (iv) ADRES DO KORESPONDENCJI:

(A) ADRESAT: Robbins, Berliner & Carson (B) ULICA:: 201 N. Figueroa Street, 5th Floor (C) MIASTO: Los Angeles (D) STAN: California (E) KRAJ: USA (F) KOD POCZTOWY (ZIPP : 90012 (v) POSTAĆ MMZLIWA DO ODCZYTANIA PRZEZ KOMMUUTR:

(A) TY? NOŚNIKA:: elastyczna dyskietka (B) KOMPUTER: kompatybilny do IBM PC (C) SYSTEM OPERACYJNY: PC-DOS/MS-DOS (D) OPROGRAMOWANIE: Patentln Release #1.0, Version #1.25 (vi) DANE DOTYCZĄCE AKTUALNEGO ZGŁOSZENIA:

(A) NUMER ZGŁOSZENIA: US (B) DATA ZGŁOSZENIA:

(C) KLASYFICACJA:

(viii) INFORMACJA O PEŁNOMOCNIKU/PRZEDSTAWICIELU:

(A) NAZWISKO: Berliner, Robert (B) NUMER REJESTRACYJNY: 20.121 (C) NUMER, NA KTÓRY NALEŻY SIĘ POWOŁYWAĆ / NUMER W REJESTRZE: 5555-286 (ix) INFORMACJE TKLEKOMLNIKACYJNE:

(A) TELEFON: 213-977-1001 (B) TELEFAN: 213-977-1003 (2) INFORMACJA O SEKWENCJI O NUMERZE IDENTYFIKACYJNYM 1: (i) CHAAAĆKERRTTYTA PEEK-WENCJ!:

(A) DŁUGOŚĆ: 2763 podstawowych par (B) TYP: kwas nukleinowy (C) ILOŚĆ NICI: jedna (D) TOPOLOGIA:.· liniowa

181 667 (ii) (vii)

RODZAJ CZĄSTECZKI: DNA (genomowy) ŹRÓDŁO POCHODZENIA::

(B) KLON: fosfataza metyloadenozyny (ix)

CECHA:

NAZWA/KLUCZ: CDS (sekwencja kodująca) LOKACJA: 1..2763 (xi) OPIS SEKWENCJI: SEKWENCJA O NUMERZE IDENTYFIKACYJNYM 1

TTTATACAGA GCATGACAGT GGGGTCCTCA CTAGGGTCTG TCTGCCACTC TACATATTTG 60

AAACAGGAGT GGCTTCTCAG AATCCAGTGA ACCTAAATTT TAGTTTTAGT TGCTCACTGG 120

ACTGGGTTCT AGGAGACCCC CTGTGTTAGT CTGTGGTCAT TGCTAGSAGA ATCACTTAAT 180

TTTTTCTAGA CTCTAGGAGA AAACAGTTGG TGGTGTACTC ATCACGGGTT AACAATTTCT 240

TCTCTCCTTC CATAGGCATG GAAGGCAGCA CACCATCATG CCTTCAAAGG TCAACTACCA 300

GGCGAACATC TGGGCTTTGA AGGAAGAGGG CTGTACACAT GTCATAGTGA CCACAGCTTG 360

TGGCTCCTTG AGGGAGGAGA TTCAGCCCGG CGATATTGTC ATTATTGATC AGTTCATTGA 420

CANNMNNNNN NNNNNNNNNN GAGGTCGACG GTATCGATAA GCTTTGTAAA CAATTGTCTT 480

TAGCTTATCC AGAGGAATTG AGTCTGGAGT AAAGACCCAA ATATTGACCT AGATAAAGTT 548

GACTCACCAG CCCTCGGAGG ATGGAAAGAT GGCCTTAAAA TAAAACAAAC AAAAACCTTT 600

TTTGCTTTAT TTTGTAGGAC CACTATGAGA CCTCAGTCCT TCTATGATGG AAGTCATTCT 660

TGTGCCAGAG GAGTGTGCCA TATTCCAATG GCTGAGCCGT TTTGCCCCAA AACGAGAGAG 720

GTGTGTAGTC TTTCTGGAAG GTGTACCAGA ATAAATCATG TGGGCTTGGG GTGGCATCTG 720

GCATTTGGTT AATTGGCAGA CGGAGTGGCC CCATACCCTC ACTCAAGTTT GCTTTGTATT 808

ATGCAAGTTT ATGGAGAGTT ATTTCCTGTT GCTAATAATT TNNNMNNNNN NNNNNNNNNN 900

AAGTGCAGCC TTAAGTTGTG CATGTGCTAG TATGTTTTGA AGTTTCTGGT TTTTCTTTTC 900

TAGGTTCTTA TAGAGACTGC TAAGAAGCTA GGACTCCGGT GCCACTCAAA GGGGACAATG 1000

GTCACAATCG AGGGACCTCG TTTTAGCTCC CGGGCAGAAA GCTTCATGTT CCGCACCTGG 1080

GGGGCGGATG TTATCAACAT GACCACAGTT CCAGAGGTGG TTCTTGCTAA GGAGGCTGGA 1100

ATTTGTTACG CAAGTATCGC CATGGGCACA GATTATGACT GCTGGAAGGA GCACGAGGAA 1000

GCAGTAGGTG GAATTCTTTT CTAAGCACAT ATAGCATGGG TTTCTGGGTG CCAATAGGGT 1260

GTCTTAACTG TTTGTTTCTA TTACGTTAGT TTCAGAAAGT GCCTTTCTAC AAGGTTTTGA 1320

AGTTGTTAAT ATTTTCTGTA GTTCCATTGG AAGGTAAGAA CAAAGATCAA AAGAAAGAAA 1380

GAGACACTTT TACCCAAGGA TCAGTAGTGA AAATAGTACA TTGTAGGCAT GTAGATGTGT 1440

181 667

TGAGAATCAT ACTAAGACTT GGGCCTTANN NNNNNNNNNN NNNNNNNNNN NNTACCCTAC 1500

ATTGAGGATT CGGTTTCAGC AGATAAATTT GAGGGACACA AACATTTAGG CTGTAGCAAG 1500

GCTGGAGCTC AGAAAAATGT TTTATGACAA GCAGTGGAAT TTTAAGTTCT AGTAACCTCC 1600

AGTGCTATTG	TTTCTCTAGG	TTTCGGTGGA	CCGGGTCTTA	AAGACCCTGA	AAGAAAACGC	1600
TAATAAAGCC	AAAAGCTTAC	TGCTCACTAC	CATACCTCAG	ATAGGGTCCA	CAGAATGGTC	1670
AGAAACCCTC	CATAACCTGA	AGGTAAGTGC	AGCCATGGAC	AATCAGGCAT	GTCTGTAGAC	1800
TCTCTATTGT	CTTCTTTTCT	TACTTGCATT	TCACCTTTGG	TCCTCATGTA	TTTTTTGCCA	1860
GCCTAGATGT	TTTCAACAAG	TTTTTGTGAC	ATCTACTACT	ACCATACCAA	CCACTTGTGA	1920
AACTGAGTAG	TCTTATTTTC	TTGGCTGGTA	GTGCAGANNN	NNNNNNNNNN	NNAATAAACA	1980
ATAATCCAGG	CTGGGCTGGT	ATGGCAATAA	GTGATTATCA	GAACAATGCT	CTGAGATAAG	2070
CATTATTAAC	CTCACTTTAC	AGGAAAGGGA	GGTGAGGAAC	CAAGAGTTTA	GAGTACCCGA	2100
AGTTCCACAT	CTGGTTAGTG	AACTTGAAAA	TTTTCTGTAG	AATTTATTTA	AAGTGTATGT	2160
TTCCTGCGTC	CTCACTTTGA	TCTAGAAAAT	CAAAATCTGT	TTTTTTTTTT	AACAAACATC	2220
TCAGTAATTA	CGCCAACATG	TGAATATCAC	TGCCTCCTTT	CTTCCTTTCA	GAATATGGCC	2280
CAGTTTTCTG	TTTTATTACC	AAGACATTAA	AGTAGCATGG	CTGCCCAGGA	GAAAAGAAGA	2370
CATTCTAATT	CCAGTCATTT	TGGGAATTCC	TGCTTAACTT	GAAAAAAATA	TGGGAAAGAC	2700
ATGCAGCTTT	CATGCCCTTG	CCTATCAAAG	AGTATGTTGT	AAGAAAGACA	AGACATTGTG	2460
TGTATAGAGA	CTCCTCAATG	ATTTAGACAA	CTTCAAAATA	CAGAAGAAAA	GCAAATGACT	2500
AGTAACATGT	GGGAAAAAAT	ATTACATTTT	AAGGGGGAAA	AAAAACCCCA	CCATTCTCTT	2500
CTCCCCCTAT	TAAATTTGCA	ACAATAAAGG	GTGGAGGGTA	ATCTCTACTT	TCCTATACTG	2<070
CCAAAGAATG	TGAGGAAGAA	ATGGGACTCT	TTGGTTATTT	ATTGATGCGA	CTGTAAATTG	2700
GTACAGTATT	TCTGGAGGGC	AATTTGGTAA	AATGCATCAA	AAGACTTAAA	AATACGGACG	2700

TAC

0703

181 667 (2)

INFORMACJA O SEKWENCJI O NUMERZE IDENTYFIKACYJNYM 2:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ?: 17 aminokwasów (B) TYP: aminokwas (C) ILOŚĆ NICI: jedna (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: peptyd (vii) ŹRÓDŁO POCHODZENIA:

(B) KLON: peptyLy foseptyzy moSyltadynoeyyy (ix) CECHA:

NAZWA/KLUCZ: peptyd LOKACJA: 1..17 (xi) OPIS SEKWENCJI: SEKWENCJA O NUMERZE IDETYFFIKACJNNMO ::

Ile Gly Ile Ile Gly Gly Thr Gly leu Asp Asp Pro Glu IIe Leu Glu 15 10 15

Gly (2) INFORMACJA O SEKWENCJI O NUMERZE IDENTYFIKACYJNYM 3:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ?: 13 aminokwasów (B) TYP: aminokwas (C) ILOŚĆ NICI: jedna (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: peptyd (Vi) ŹRÓDŁO POCHODZENIA:

(B) KLON: peptKLO :opeptady yosfatadenoztny (ix) ECHHiA:

NAZWA/KLUCZ: peptyd LOKACJA: 1..13 (Xi) OPIS SEKWENCJI: SEKWENCJA O NUMERZE IDENTYFIKACYJNYM 3:

Leu Leu Leu Thr Thr Ile Pro Gin Ile Gil eer eet ell 1 5 10

181 667 (2) INFORMACJA O SEKWENCJI O NUMERZE IDENTYFIKACYJNYM 4: (i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 8 aminokwasów (B) TYP: aminokwas (C) ILOŚĆ NICI: jedna
	(D)	TOPOLOGIA: liniowa
(ii)	RODZAJ	CZĄSTECZKI: peptyd
(vi)	ŹRÓDŁO	POCHODZENAA:
	(B)	KLON: primmy : ssfatazy metyloadyomeyyy
(ix)	CECHA:

NAZWA/KLUCZ: peptyd LOKACJA: 1..8 (xi) OPIS SEKWENCJI: SEKWENCJA O NtMlERZE 4

Tyr Val Asp Thr Pro Phe Gly lys

5 (2) INFORMACJA O SEKWENCJI O NUMERZE IDENTYFIKACYJNYM 5: (i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

	(A)	DŁUGOŚĆ: 9 aminokwasów
	(B)	TYP: aminokwas
	(C)	ILOŚĆ NICI: jedna
	(D)	TOPOLOGIA: liniowa
(ii)	RODZAJE	CZĄSTECZKI: peptyd
(vi)	ŹRÓDŁO	POCHODZENIA:
	(B)	KLON: primery fosfatazy metyloadenozyny
(ix)	CECAA:

NAZWA/KLUCZ: peptyd LOKACJA: 1..9 (Ci) OIIS SEWENCJ^: SEKWENCJA O NUMERZE IDENTYFIKACYJNYM :

Thr Trp Gly Ala Asp Val Ile Aso Het 1 5

181 667

FIG. T(A)

1	TTTATACAGA	GCATGACAGT	GGGGTCCTCA	CTAGGGTCTG	TCTGCCACTC
51	TACATATTTG	AAACAGGAGT	GGCTTCTCAG	AATCCAGTGA	ACCTAAATTT
101	TAGTTTTAGT	TGCTCACTGG	ACTGGGTTCT	AGGAGACCCC	CTGTGTTAGT
151	CTGTGGTCAT	TGCTAGSAGA	ATCACTTAAT	TTTTTCTAGA	CTCTAGGAGA
201	AAACAGTTGG	TGGTGTACTC	ATCACGGGTT	AACAATTTCT	TCTCTCCTTC
251	CATAGGCATG	GAAGGCAGCA	CACCATCATG	CCTTCAAAGG	TCAACTACCA
301	GGCGAACATC	TGGGCTTTGA	AGGAAGAGGG	CTGTACACAT	GTCATAGTGA
351	CCACAGCTTG	TGGCTCCTTG	AGGGAGGAGA	TTCAGCCCGG	CGATATTGTC
401	ATTATTGATC	AGTTCATTGA	CANNNNNNNN	NNNNNNNNNN	GAGGTCGACG
451	GTATCGATAA	GCTTTGTAAA	CAATTGTCTT	TAGCTTATCC	AGAGGAATTG
501	AGTCTGGAGT	AAAGACCCAA	ATATTGACCT	AGATAAAGTT	GACTCACCAG
551	CCCTCGGAGG	ATGGAAAGAT	GGCCTTAAAA	TAAAACAAAC	AAAAACCTTT
601	TTTGCTTTAT	TTTGTAGGAC	CACTATGAGA	CCTCAGTCCT	TCTATGATGG
651	AAGTCATTCT	TGTGCCAGAG	GAGTGTGCCA	TATTCCAATG	GCTGAGCCGT
701	TTTGCCCCAA	AACGAGAGAG	GTGTGTAGTC	TTTCTGGAAG	GTGTACCAGA
751	ATAAATCATG	TGGGCTTGGG	GTGGCATCTG	GCATTTGGTT	AATTGGCAGA
801	CGGAGTGGCC	CCATACCCTC	ACTCAAGTTT	GCTTTGTATT	ATGCAAGTTT
851	ATGGAGAGTT	ATTTCCTGTT	GCTAATAATT	TNNNNNNNNN	NNNNNNNNNN
901	AAGTGCAGCC	TTAAGTTGTG	CATGTGCTAG	TATGTTTTGA	AGTTTCTGGT
951	TTTTCTTTTC	TAGGTTCTTA	TAGAGACTGC	TAAGAAGCTA	GGACTCCGGT
1001	GCCACTCAAA	GGGGACAATG	GTCACAATCG	AGGGACCTCG	TTTTAGCTCC
1051	CGGGCAGAAA	GCTTCATGTT	CCGCACCTGG	GGGGCGGATG	TTATCAACAT
1101	GACCACAGTT	CCAGAGGTGG	TTCTTGCTAA	GGAGGCTGGA	ATTTGTTACG
1151	CAAGTATCGC	CATGGGCACA	GATTATGACT	GCTGGAAGGA	GCACGAGGAA
1201	GCAGTAGGTG	GAATTCTTTT	CTAAGCACAT	ATAGCATGGG	TTTCTGGGTG
1251	CCAATAGGGT	GTCTTAACTG	TTTGTTTCTA	TTACGTTAGT	TTCAGAAAGT
1301	GCCTTTCTAC	AAGGTTTTGA	AGTTGTTAAT	ATTTTCTGTA	GTTCCATTGG
1351	AAGGTAAGAA	CAAAGATCAA	AAGAAAGAAA	GAGACACTTT	TACCCAAGGA
1401	TCAGTAGTGA	AAATAGTACA	TTGTAGGCAT	GTAGATGTGT	TGAGAATCAT

181 667

FIG. 1 (B)

1451	ACTAAGACTT	GGGCCTTANN	NNNNNNNNNN	NNNNNNNNNN	NNTACCCTAC
1501	ATTGAGGATT	CGGTTTCAGC	AGATAAATTT	GAGGGACACA	AACATTTAGG
1551	CTGTAGCAAG	GCTGGAGCTC	AGAAAAATGT	TTTATGACAA	GCAGTGGAAT
1601	TTTAAGTTCT	AGTAACCTCC	AGTGCTATTG	TTTCTCTAGG	TTTCGGTGGA
1651	CCGGGTCTTA	AAGACCCTGA	AAGAAAACGC	TAATAAAGCC	AAAAGCTTAC
1701	TGCTCACTAC	CATACCTCAG	ATAGGGTCCA	CAGAATGGTC	AGAAACCCTC
1751	CATAACCTGA	AGGTAAGTGC	AGCCATGGAC	AATCAGGCAT	GTCTGTAGAC
1801	TCTCTATTGT	CTTCTTTTCT	TACTTGCATT	TCACCTTTGG	TCCTCATGTA
1851	TTTTTTGCCA	GCCTAGATGT	TTTCAACAAG	TTTTTGTGAC	ATCTACTACT
1901	ACCATACCAA	CCACTTGTGA	AACTGAGTAG	TCTTATTTTC	TTGGCTGGTA
1951	GTGCAGANNN	NNNNNNNNNN	NNAATAAACA	ATAATCCAGG	CTGGGCTGGT
2001	ATGGCAATAA	GTGATTATCA	GAACAATGCT	CTGAGATAAG	CATTATTAAC
2051	CTCACTTTAC	AGGAAAGGGA	GGTGAGGAAC	CAAGAGTTTA	GAGTACCCGA
2101	AGTTCCACAT	CTGGTTAGTG	AACTTGAAAA	TTTTCTGTAG	AATTTATTTA
2151	AAGTGTATGT	TTCCTGCGTC	CTCACTTTGA	TCTAGAAAAT	CAAAATCTGT
2201	TTTTTTTTTT	AACAAACATC	TCAGTAATTA	CGCCAACATG	TGAATATCAC
2251	TGCCTCCTTT	CTTCCTTTCA	GAATATGGCC	CAGTTTTCTG	TTTTATTACC
2301	AAGACATTAA	AGTAGCATGG	CTGCCCAGGA	GAAAAGAAGA	CATTCTAATT
2351	CCAGTCATTT	TGGGAATTCC	TGCTTAACTT	GAAAAAAATA	TGGGAAAGAC
2401	ATGCAGCTTT	CATGCCCTTG	CCTATCAAAG	AGTATGTTGT	AAGAAAGACA
2451	AGACATTGTG	TGTATAGAGA	CTCCTCAATG	ATTTAGACAA	CTTCAAAATA
2501	CAGAAGAAAA	GCAAATGACT	AGTAACATGT	GGGAAAAAAT	ATTACATTTT
2551	AAGGGGGAAA	AAAAACCCCA	CCATTCTCTT	CTCCCCCTAT	TAAATTTGCA
2601	ACAATAAAGG	GTGGAGGGTA	ATCTCTACTT	TCCTATACTG	CCAAAGAATG
2651	TGAGGAAGAA	ATGGGACTCT	TTGGTTATTT	ATTGATGCGA	CTGTAAATTG
2701	GTACAGTATT	TCTGGAGGGC	AATTTGGTAA	AATGCATCAA	AAGACTTAAA
2751	AATACGGACG	TAC

FIGURA. SEKWENCJA GENOMOWA GENU MTAP. EKSONY SĄ POKREŚLONE.

Departament Wydawnictw UP RP. Nakład 70 egz. Cena 4,00 zł.

Claims (11)

1. Zastrzeżenia patentowe

   1. Sposób wykrywania obecności katalitycznie aktywnej i katalitycznie nieaktywnej fosforylazy metylotioadenozynowej (MTAzy) w komórkach ssaków, znamienny tym, że przygotowuje się próbkę komórek przypuszczalnie pozbawionych MTAzy, po czym dodaje się wykrywalnie znakowane sondy oligonukleotydowe pochodzące z kwasu nukleinowego przedstawionego Sekwencją nr 1 i specyficznie hybrydyzujące z każdym obecnym w próbce kwasem nukleinowym kodującym MTAzę, a następnie wykrywa się hybrydyzację sond z obecnym w próbce kwasem nukleinowym kodującym MTAzę stwierdzając obecność kwasu nukleinowego w próbce.
2. 2. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że ponadto przed dodaniem wykrywalnie znakowanych sond oligonukleotydowych poddaje się próbkę warunkom sprzyjającym selektywnej amplifikacji kwasu nukleinowego kodującego MTAzę i selektywnie amplifikuje się każdy kwas nukleinowy kodujący MTAzę obecny w próbce.
3. 3. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że przygotowuje się próbkę komórek pochodzących ze znanego nowotworu złośliwego.
4. 4. Sposób według zastrz. 3, znamienny tym, że nowotwór złośliwy oznacza się również na aktywność katalityczną MTAzy.
5. 5. Sposób według zastrz. 2, znamienny tym, że stosuje się warunki obejmujące reakcję łańcuchową polimerazy.
6. 6. Wyizolowany polinukleotyd kodujący MTAzę przedstawiony Sekwencją nr 1.
7. 7. Wyizolowany polinukleotyd według zastrz. 6, znamienny tym, że zawiera tylko eksony kwasu nukleinowego przedstawionego Sekwencją nr 1.
8. 8. Zrekombinowany wektor ekspresyjny, znamienny tym, że zawiera polinukleotyd przedstawiony Sekwencją nr 1.
9. 9. Zrekombinowany wektor ekspresyjny według zastrz. 8, znamienny tym, że zawiera fragmenty polinukleotydu przedstawionego Sekwencją nr 1 kodujące peptydy przedstawione Sekwencjami nr 2, 3 lub 4.
10. 10. Zrekombinowany wektor ekspresyjny według zastrz. 8, znamienny tym, że zawiera polinukleotyd zawierający tylko eksony kwasu nukleinowego przedstawionego Sekwencją nr 1.
11. 11. Zrekombinowany wektor ekspresyjny, znamienny tym, ze zawiera kwas nukleinowy kodujący MTAzę stransformowanej E. coli wybranej spośród szczepów zdeponowanych pod numerami ATTC 55536, 55537, 55538, 55539 i 55540.