CZ289523B6 - Způsob detekce přítomnosti katalyticky aktivní a katalyticky inaktivní methylthioadenosin fosforylázy - Google Patents

Abstract

Zp sob detekce, zda je v bun n m vzorku p° tomna methyladenosin fosfat za (MTAsa) bu v katalyticky aktivn nebo katalyticky inaktivn form . V jednom aspektu spo v zp sob v tom, e se ke vzorku p°idaj oligonukleotidov sondy, schopn specifick hybridizace s jakoukoli nukleovou kyselinou ve vzorku, k duj c MTAsu, za podm nek podporuj c ch hybridizaci. Absence MTAsy ve vzorku se pova uje za indikaci malignity. Jsou pops ny polynukleotidy k duj c MTAsu, MTAsov peptidy a protil tky k MTAse, stejn jako kity pro prov d n zp sobu podle vyn lezu.\

Description

Způsob detekce přítomnosti katalyticky aktivní a katalyticky inaktivní methylthioadenosin fosforylázy

Oblast techniky

Vynález se týká způsobu detekce deficitu methylthioadenosin fosforylázy v savčích buňkách, který je ukazatelem malignity u těchto buněk. Detekce buněk, které jsou na tento enzym deficitní, umožňuje zaměřit na tyto buňky chemoterapii využívající neschopnosti těchto buněk převádět methylthioadenosin na methionin.

Dosavadní stav techniky

Aminokyseliny methionin (MET) je nezbytná pro růst normálních a maligních buněk. U určitých maligních buněk je tato potřeba absolutní, tzn. že bez adekvátní zásoby methioninu buňky hynou.

V savčích buňkách se MET získává ze tří zdrojů. Je možno jej získat z výživy nebo biochemickou syntézou MET z L-homocysteinu (homocystein) nebo methylthioadenosinu (MTA) (produkt biosyntetické dráhy polyaminů). V posledním případě se MTA převádí na MET pomocí methylthioadenosin fosforylázy (MTAsa; EC 2.4.2.28).

V poslední dekádě identifikovali výzkumníci četné maligní buněčné linie, kterým chybí MTAsa a které tudíž nemohou převádět MTA a MET. Například Katamari a d., Proč. Naťl Adac. USA 78:1219-1223 (1981), uvádějí, že u 23% ze 3 studovaných lidských maligních nádorových buněčných linií chyběla detekovatelná MTAsa, zatímco v každé 16 studovaných nemaligních buněčných linií byla aktivita MTAsy přítomna. Deficit MTAsy byl rovněž zaznamenán jako charakteristika nemalobuněčných rakovin plic (viz Nobori a d., Cancer Res. 53:1098— 1101 (1981)), v 6 liniích buněk lymfomů a leukémií (id.), v buněčných liniích mozkového nádoru a tkáňových vzorcích primárního mozkového nádoru (id.) a v dalších maligních (viz například Kries a d., Cancer Res. 33:1866-1869(1973), Kries a d., Cancer Trmt, Rpts. 63:10691072)(1979), a Rangione a d., Biochem. J. 281:533-538(1992)). MTAsa-negativní buňky principiálně uspokojují svou potřebu MET konverzí homocysteinu. Není-li však k dispozici homocystein, buňky obvykle hynou.

Je známo, že L-methionin-L-deamino-y-merkaptomethan lyáza (ED 4.4.111; METsa) degraduje nejen MET, ale také homocystein. Teoreticky je tedy možno zahubit maligní buňky, jimž chybí MTAsa (tj. MTAsa-negativní buňky) degradací plazmového MET a homocysteinu METasou. Lze předpokládat, že normální MTAsa-pozitivní buňky budou uspokojovat svou potřebu MET pokračující přeměnou MTA na MET.

Jednou z překážek vývoje úspěšného přístupu k vyvolávání nedostatku MET u maligních buněk je potřeba identifikovat, které malignity jsou vhodnými cíli terapie, tj. které maligní jsou MTAsa-negativní. Za tímto účelem byl vyvinut test, který zajišťuje, zda je malignita MTAsanegativní, ze stanovení, zda je v buněčné kultuře přítomna katalytická aktivita (Seidenfeld a d., Biochem. Biophys. Res. Commun. 95:1861-1866,1980). Pro komerční nedostupnost radiochemického substrátu, potřebného pro test aktivity, však není dosud schůdné její použití při rutinních hodnoceních. Test aktivity navíc nepočítá s katalytickou labilitou MTAsy in vitro, jestliže detekuje, zdaje v buněčné kultuře přítomen vůbec nějaký enzym bez ohledu na to, zdaje katalyticky aktivní v době provádění testu.

Toto omezení testu aktivity by bylo možno překonat vyvinutím imunoanalýzy, která by byla dostatečně citlivá pro detekci relativně nepatrných množství enzymu. Ukázalo se však, že čištění enzymu MTAsy z přírodních zdrojů za účelem vývinu protilátky pro použití při imunologické

-1 CZ 289523 B6 detekci MTAsy je pracné a poskytuje relativně špatné výtěžky (Rangione a d., J. Biol. Chem. 261:12 324-12 329,1986).

Neexistence jednoduchého účinného prostředku identifikace MTAsa-deficitních buněk částečně přispívá k trvalé nedostupnosti účinného terapeutického přístupu k selektivnímu vyvolávání nedostatku MET in vivo v MTAsa-deficitních maligních buňkách. Tuto potřebu řeší tento vynález pomocí způsobu detekce přítomnosti nebo nepřítomnosti genu, který kóduje MTAsu, ve vzorku a pomocí rekombinantního zdroje MTAsy.

Podstata vynálezu

Cílem vynálezu je nalézt způsob detekce MTAsa-deficitních buněk (za něž se považují buňky, v nichž není detekovatelně přítomen protein MTAsa v katalyticky aktivní ani katalyticky inaktivní formě). Způsob podle vynálezu je založen na předpokladu, že deficit MTAsy je důsledkem delece genu, který kóduje MTAsu, zgenomu savce, který má MTAsa-negativní malignitu. Způsob podle vynálezu je tudíž zaměřen na detekci polynukleotidu uvnitř domény savčího genomu, kódující protein MTAsu, který, je-li přítomen, kóduje MTAsu, avšak je-li nepřítomen, vede k vývoji MTAsa-deficitních buněk.

Konkrétně je předmětem vynálezu způsob detekce MTAsy, spočívající v tom, že

a) se získá analyzovatelný vzorek buněk, u nichž se předpokládá deficit MTAsy,

b) ke vzorku se přidají detekovatelně značené oligonukleotidové sondy odvozené od sekvence nukleové kyseliny znázorněné v připojeném seznamu sekvencí jako SEQ ID NO 1, které specificky hybridizují s jakoukoli nukleovou kyselinou, která kóduje MTAsu, přítomnou ve vzorku, a (c) detekuje se hybridizace sond s jakoukoli nukleovou kyselinou kódující MTAsu přítomnou ve vzorku, přičemž přítomnost uvedené nukleové kyseliny indikuje přítomnost katalyticky aktivní nebo inaktivní MTAsy v buňce.

Výhodně se dále provede selektivní amplifikace jakékoli nukleové kyseliny kódující MTAsu přítomné ve vzorku, přednostně za použití polymerázové řetězové reakce. Buňky jsou výhodně odvozeny od známé malignity. Přednostně se buňky rovněž analyzují na katalytickou aktivitu MTAsy.

A. Způsob amplifikace jakékoli MTAsy přítomné v buněčném vzorku

Jak uvedeno výše, předpokladem vynálezu je, že deficit MTAsy v buňkách je důsledkem delece genu, kteiý normálně kóduje MTAsu, ze savčího genomu. Protože je vynález zaměřen na detekci přítomnosti nebo nepřítomnosti tohoto genu ve vzorku buněk, u nichž je podezření, že jsou MTAsa-negativní, provádí se přednostně amplifikace nukleových kyselin ve vzorku ke zvýšení citlivosti detekční metody. Tato amplifikace se přednostně provádí s použitím polymerázové řetězcové reakce (PCR), i když použití řetězcové reakce v polymeračním stupni není absolutně nutné.

Pro použití při provádění způsobu podle vynálezu se získává biologický vzorek, u něhož je podezření na obsah buněk s deficitem MTAsy. Vzorek může například obsahovat tělesné tekutiny nebo buňky, například z buněčné linie, tkáně nebo tumoru. Tyto vzorky se získávají metodami známými v klinickém oboru, například nádorové buňky je možno získat biopsí nebo chirurgickou resekcí. Přednostně jsou buňky v podstatě prosté „kontaminujících“ příměsí, tj. buněk, proteinů a podobných složek, které by mohly zkreslit výsledek způsobu podle vynálezu. Používají-li se jako zdroj genomové DNA MRTAsy pevné nádory, považují se za

-2CZ 289523 B6 kontaminující příměsi normální nemaligní buňky a MTAsy, která může být z těchto buněk uvolňována během postupu, prováděného při odebírání biologického vzorku.

Nukleová kyselina, která se ve vzorku amplifíkuje, je tvořena genomovou nebo standardní DNA, u níž se normálně předpokládá, že obsahuje MTAsu. Tato DNA (dále „cílová DNA“), která bude amplifikována, může být získána z eukaiyota, přednostně ze savčího organismu. Nej výhodněji se genomová DNA získává z člověka.

Genomová DNA se izoluje známými metodami, například způsobem popsaným v Maniatis a d. (Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1982). Zde je popsán příklad provedení, demonstrující izolaci genomického klonu lidské MTAsy, kde je podrobena csreeningu knihovna kosmidových genů s použitím dále popsané sondy genu cDNA MTAsy. Odborníkovi je však zřejmé, že k získání DNA podle vynálezu je možno použít i jiných vhodných metod.

Plná délka nukleotidové sekvence genomického klonu pro MTAsu je uvedena v připojeném seznamu sekvencí jako SEQ ID NO 1; exony v této sekvenci jsou znázorněny v mapě, uvedené na obr. 1. Kmen E. coli, obsahující plnou délku genomové DNA pro krysí MTAsu, byl uložen 30. prosince 1993 v Američan Type Culture Collection, Rockville, MD, pod přírůstkovým číslem 55536 (exon „TC3“; nukleotidy 616-720 genu MTAsy); 55538 (exon „1.1“; nukleotidy 254-421 genu MTAsy); 55537, 55539 a 55540 („IX-7“, resp. „4-3“, resp. „7-2“; souhrnně zbytek genu MTAsy). Hostitelem pro každý uložený vzorek je E. coli. V současnosti ani v budoucnu se nepřipouští, že uložený vzorek je nezbytný k provedení vynálezu. Vzorek však bude udržován v životaschopné formě po veškerou dobu, vyžadovanou patentovými zákony, vztahujícími se nyní nebo v budoucnu na tento vynález.

Jakmile je získána genomová DNA, vystaví se vzorek, který ji obsahuje, podmínkám, favoritujícím selektivní amplifikaci cílové nukleové kyseliny. Přednostně je cílovou nukleovou kyselinou polynukleotidová část genu, který kóduje MTAsu (tj. „cílový polynukleotid“). Přednostní metodou amplifikace cílového polynukleotidu je PCR. PCR je metoda enzymové syntézy specifických sekvencí DNA nebo RNA in vitro s použitím oligonukleotidových primerů, které hybridizují se specifickými sekvencemi nukleové kyseliny a lemují oblast zájmu v cílové nukleové kyselině. Opakovaná řada cyklů denaturace templátu, teplotní hybridizace primerů a enzymatického prodlužování hybridizovaných primerů vede k exponenciálnímu hromadění specifického fragmentu nukleové kyseliny, definovaného na svých koncích 5'-konci primerů. Výsledné produkty (produkty PCR), syntetizované v jednom cyklu, působí jako templáty pro následující cyklus; počet kopií cílové nukleové kyseliny se tedy v každém cyklu přibližuje zdvojnásobuje.

Základní metody PCR jsou popsány v patentu US 4 683 195 a 4 683 202 Mullise a d., jejichž obsah je zde zahrnut jako příklad konvenčních metod provádění PCR. Vynález však nelze chápat jako omezený na použití metod PCR, které jsou uvedeny v Mullisově patentu 4 683 202. Od vzniku Mullisovy metody byly vyvinuty různé testy na bázi PCR, používající modifikace této metody. Tyto modifikace jsou známy, a tudíž zde nejsou podrobně popisovány. Pro účely osvětlení rozsahu techniky v daném oboru je však dále popsáno několik těchto modifikací.

Metoda PCR, která poskytuje vnitřní amplifikační standard s použitím konkurenčního templátu, jehož sekvence a velikost se liší od cílové nukleové kyseliny, je popsána v Proč. Nati. Acad. Sci. USA (1990), 87:2 725-2 729 (autoři Gilliland a d.). Jiná metoda provádění „kompetitivní“ PCR, při níž se používají templáty s odlišnou sekvencí, ale ne velikostí, je popsána v Nuc. Acids Res. 21:3 469-3 472 (1993, autoři Kohsaka a d.). Tato metoda je zvlášť výhodná, protože k analýze amplifikovaných nukleových kyselin používá metodu enzymové imunoanalýzy ELISA. Nekompetitivní metoda PCR, která používá místně specifické oligonukleotidy k deteci mutací nebo polymorfismů v genech, rovněž použitelná pro způsob podle vynálezu, je popsána v Proč. Nati. Acad. Sci. USA (1989) 86:6 230-6 234 (autoři Saiki a d.). Výhodou všech těchto metod je

-3CZ 289523 B6 použití hybridizačních sond, které napomáhají eliminaci zkreslujících pozitivních výsledků, odvozených od jakékoli nespecifické amplifikace, která se může během PCR vyskytnout.

Další informace může odborník získat v Innis a d., „Optimization of PCR's“, PCR Protocols: AGuide to Methods and Applications (Acad. Press, 1990). Tato publikace shrnuje metody ovlivňování specifity, přednosti a výtěžku požadovaných produktů PCR.

Volí se takové oligonukleotidové primery (alespoň jeden příměrový pár), které specificky hybridizují s malými úseky párů bází po obou stranách (tj. 5'a 3j cílového polynukleotidu MTAsy („lemující sekvence“). Odborník je snadno bez přílišného experimentování vybrat vhodné primery na základě informací o polynukleotidové sekvenci, uvedených jako SEQ ID NO 1 v připojeném seznamu sekvencí a na obr. 1.

Pro konstrukci primerů je důležité, aby primery neobsahovaly komplementární báze, aby mohly hybridizovat samy se sebou. Aby se eliminovala amplifikace veškerého kontaminujícího materiálu, popřípadě přítomného ve vzorku, navrhují se primery přednostně tak, aby překlenovaly interval mezi exony (které jsou pro geny MTAsy znázorněny na obr. 1).

Jak výše uvedeno, k adekvátní amplifikaci nukleových kyselin ve vzorku nemusí být nutno v tomto polymeračním stupni používat řetězovou reakci. Například používá-li se metoda popsaná výše citovaným Kohsakou a d. a polymerační stupeň se provádí na pevném nosiči a po něm následuje hybridizace se sondami, specifickými pro cílový polynukleotid, je citlivost postupu taková, že je nutná pouze polymerace cílového nukleotidu.

Jakmile je dokončen stupeň amplifikace, analyzují se produkty PCR za účelem zjištění, zdaje ve vzorku přítomen gen kódující MTAsu. Přednostně jsou dvouvláknové produkty PCR navázány na pevnou fázi, aby bylo možno dvojité vlákno rozdělit denaturací a umožnit hybridizaci sekvenčně specifických sond k navázanému pozitivnímu řetězci produktu PCR za účelem detekce genu v podstatě způsobem popsaným výše citovaným Kohsakou a d. Alternativně se dvouvláknové produkty PCR před přídavkem sond pro hybridizaci odstraní z reakčního prostředí a oddělí od amplifikační směsi. V tomto posledně uvedeném přístupu se produkty PCR oddělují od amplifikační směsi známými způsoby s ohledem na konkrétní zvolenou metodu detekce, například gelovým vylučováním, elektroforézou nebo afinitní chromatografií.

Detekci amplifikovaného produktu je možno provádět s použitím hybridizačních sond, které jsou stabilně asociovány s detekovatelnou značkou. Značka je látka, která může být kovalentně navázána nebo pevně asociována se sondou nukleové kyseliny, což umožňuje sondu detekovat, značkou může být například radioizotop, enzymový substrát nebo inhibitor, enzym, radioopakní látka (včetně koloidních kovů), fluorescenční látka, chemiluminiscenční molekula, liposomy obsahující kteroukoli z výše uvedených značek nebo člen specifického vazebného páru. Vhodná značka neztrácí během amplifikace vlastnost odpovědnou za detekovatelnost.

Odborníkům v oboru diagnostiky jsou známy vhodné detekovatelné značky pro použití v detekčních analýzách in vitro. Vhodné radioizotopy pro použití in vitro například zahrnují ³H, ¹²⁵I, ¹³¹1, ³²P, ¹⁴C, ³⁵S. Amplifikované fragmenty, značené radioizotopem, mohou být detekovány přímo gama čítačem nebo denzitometrií autoradiogramů, Southemovým blottingem amplifikovaných fragmentů v kombinaci s denzitometrií. Příklady vhodných chemiluminiscenčních molekul jsou akridiny nebo luminol. Cílové sekvence hybridizované se sondami, derivatizovanými akridiumesterem, jsou chráněny před hydrolýzou interkalací. Příklady vhodných fluorescenčních látek jsou fluorescein, fykobiliprotein, cheláty vzácných zemin, dansyl nebo rhodamin.

Příklady vhodných substrátů nebo inhibitorů enzymů jsou sloučeniny, které se specificky vážou na křenovou peroxidázu, glukóza, oxidázu, glukózu-6-fosfát dehydrogenázu, β-galaltosidázu,

-4CZ 289523 B6 puruvát, kinázu nebo acetylchlinesterázu alkalické fosfatázy. Příklady radioopakních látek jsou koloidní zlato nebo magnetické částice.

Specifický vazebný pár zahrnuje dvě různé molekuly, přičemž jedna z nich má na svém povrchu nebo v dutině oblast, která se specificky váže na konkrétní prostorovou a polární organizaci jiné molekuly. Členové specifického vazebného páru se často označují jako ligand a receptor nebo ligand a antiligand. Je-li například receptorem protilátka, je ligandem odpovídající antigen. Další specifické vazebné páry zahrnují dvojice hormon-receptor, enzym-substrát, biotinavidin a glykoprotein-receptor. Zahrnuty jsou rovněž fragmenty a části specifických vazebných párů, které si uchovávají vazebnou specificitu, jako jsou fragmenty imunoglobulinů, včetně fragmentů Fab apod. Protilátky mohou být buď monoklonální nebo polyklonální. Použije-li se jako značka člen specifického vazebného páru, zahrnuje výhodný dělicí postup afinitní chromatografii.

Není-li možno výše popsaným postupem detekovat žádný amplifikovaný produkt, ukazuje to na deficit MTAsy v buňkách přítomných ve vzorku. Protože u normálních (tj. nemaligních) buněk se vždy očekává přítomnost MTAsy v detekovatelném množství, nález deficitu MTAsy indikuje, že analyzovaná genomová DNA byla získána z maligních buněk. Způsob podle vynálezu je zvlášť vhodný pro diagnostické účely, například pro diagnózu deficitu MTAsy, souvisejícího s neoplazmy zejména s maligními neoplazmy.

Podle potřeby může být vzorek předběžně podroben screeningu na katalytickou aktivitu MTAsy metodou popsanou v Seidenfeld a d., Biochem. Biophys. Res. Commun. 95:1 861-1 866 (1980); viz též dále příklad I. Pak je možno použít způsob podle vynálezu ke stanovení, zda je gen kódující MTAsu přítomen v buňkách ve vzorku. Vzorek může být testován rovněž na přítomnost katalyticky aktivního nebo inaktivního proteinu pro účely screeningu kontaminujících příměsí, tj. nemaligních buněk ve vzorku. Vhodná imunoanalýza pro použití v této souvislosti je popsána v Nobori a d., Cances Res. 53:1 098-1 101 (1991) a patentu US 5571510.

B. Produkce syntetických nebo rekombinantních MTAsových polynukleotidů a peptidů

Strategie navrhování polynukleotidů (zejména oligonukleotidů), které umožňují amplifikaci sekvence nukleové kyseliny specifické pro MTAsu, bere v úvahu výše zmíněné aspekty. Takovéto oligonukleotidy jsou zvlášť vhodné pro diagnózu deficitu MTA souvisejícího s malignitou.

Sekvence DNA pro použití při produkci MTAsy a MTAsových peptidů podle vynálezu je rovněž možno získat různými metodami. Například je možno DNA izolovat pomocí známých hybridizačních postupů, které zahrnují, aniž by se na ně omezovaly: 1) hybridizaci sond sgenomovou cDNA nebo s knihovnami cDNA za účelem detekce sdílených nukleotidových sekvencí, 2) protilátkový screening expresních knihoven za účelem detekce sdílených strukturních rysů a 3) syntézu řetězovou reakcí s polymerázou (PCR).

Hybridizační postupy jsou vhodné pro screening rekombinantních klonů s použitím značených smíšených syntetických oligonukleotidových sond, kde každá sonda je potenciálně kompletním komplementem specifické sekvence DNA v hybridizačním vzorku, který zahrnuje heterogenní směs denaturované dvouvláknové DNA. Hybridizace pro takovýto screening se přednostně provádí buď na jednořetězcové DNA nebo denaturované dvouvláknové DNA. Hybridizace je použitelná zejména pro detekci klonů cDNA, odvozených ze zdrojů, kde je přítomno extrémně malé množství sekvencí mRNA, vztahujících se k příslušnému polypeptidu. Jinými slovy je tedy možno při použití příslušných podmínek hybridizace zaměřených na zamezení nespecifické vazby například umožnit autoradiografické zobrazení specifického klonu cDNA hybridizaci cílové DNA s touto jedinou sondou ve směsi.

Knihovna cDNA, obsahující MTAsu, může být podrobena screeningu injekcí různých mRNA, odvozených od cDNA, do oocytů, ponecháním dostatečného času pro expresi genových produktů

-5CZ 289523 B6 cDNA a testováním na přítomnost požadovaného expresního produktu cDNA, například použitím protilátky specifické pro MTAsu nebo použitím sond pro opakující se jednotky a tkáňové expresní vzorce charakteristické pro MTAsu. Alternativně je možno knihovnu cDNA podrobit nepřímo screeningu na MTAsové peptidy, mající alespoň jeden epitop, použitím protilátek specifických pro tyto polypeptidy. Jak je popsáno dále v odstavci C, mohou být takovéto protilátky odvozené buď polyklonálně nebo monoklonálně a mohou být použity k detekci expresního produktu, ukazujícího na přítomnost cDNA MTAsy.

Screeningové postupy, používající hybridizaci nukleových kyselin, umožňují izolovat jakoukoli genovou sekvenci z jakéhokoli organismu, pokud je k dispozici příslušná sonda. Oligonukleovtidové sondy, které odpovídají části sekvence kódující daný protein, mohou být syntetizovány chemicky. K tomu je nutno znát krátké oligopeptidové úseky sekvence aminokyselin. Sekvence DNA kódující protein může být odvozena z genetického kódu, avšak je nutno vzít v úvahu degeneraci kódu. Je-li sekvence degenerovaná, je možno provádět smíšenou adiční reakci. Ta zahrnuje heterogenní směs denaturované dvouvláknové DNA. Hybridizace pro takovýto screening se přednostně provádí buď na jednořetězcové DNA nebo denaturované dvouvláknové DNA.

Vývoj specifických sekvencí DNA kódujících MTAsu nebo její fragmenty je možno rovněž uskutečnit: 1) izolací sekvencí dvouvláknové DNA zgenomové DNA, 2) chemickou výrobou sekvence DNA k získání potřebných kodonů pro daný polypeptid a 3) syntézou sekvence dvouvláknové DNA in vitro reverzní transkripcí mRNA, izolované z eukaryotické donorové buňky. V posledně uvedeném případě se nakonec jako komplement mRNA vytvoří dvouvláknová DNA, která se obvykle označuje cDNA.

Podle vynálezu je možno vložit polynukleotid a jakékoli jeho varianty kódující MTAsu do rekombinantního expresního vektoru. Výraz „rekombinantní expresní vektor“ označuje plazmid, virus nebo jiné známé vehikulum, které bylo podrobeno manipulaci inzerci nebo zabudováním příslušných genetických sekvencí. Takovéto expresní vektory obsahují promotorovou sekvenci, která usnadňuje účinnou transkripci vložené genetické sekvence hostitele.

Transformaci hostitelské buňky pomocí rekombinantní DNA je možno rovněž provádět konvenčními metodami, známými odborníkům. Hostitelské buňky mohou být eukaryotické (jako jsou ovariální buňky čínského křečka) nebo prokaryotické (jako jsou bakterie nebo kvasinky). Je-li hostitel prokaryotický, například E. coli, je možno z buněk získaných po exponenciální fázi růstu připravit kompetentní buňky, které jsou schopny přijmout DNA, a zpracovat je metodou CaCl₂, známými postupy. Alternativně je možno použít MgCl₂ nebo RbCl. Transformaci je možno rovněž provádět po vytvoření protoplazmy k hostitelské buňce nebo elektroporací.

Izolaci a čištění mikrobiálně exprimované MTAsy nebo jejích fragmentů podle vynálezu může odborník provádět běžnými metodami, zahrnujícími preparativní chromatografií a imunologické separační metody s použitím monoklonálních nebo polyklonálních protilátek.

Na základě informací obsažených v SEQ ID NO 1 je možno snadno odvodit sekvenci aminokyselin plné délky MTAsy. S použitím těchto informací je rovněž možno bez přílišného experimentování syntetizovat MTAsu a MTAsové peptidy s použitím běžných metod, jako je ochrana α-aminoskupin pomocí t-BOC nebo FMOC. Obě metody zahrnují postupnou syntézu, při níž se v každém stupni přidává jedna aminokyselina počínaje C-koncem peptidu (viz Coligan a d., Current Protocols in Immunology, Wiley Interscience, 991, unit 9). Peptidy podle vynálezu je možno rovněž syntetizovat různými známými metodami syntézy peptidů v pevné fázi, jak jsou popsány například Merrifíeldem, J. Am. Chem. Soc. 85:2 149 (1962), a Stewartem a Youngem, Solid Phase Peptides Synthesis (Freeman, San Francisco, 27-62, 1969), s použitím kopoly(styren-divinylbenzen) s obsahem 0,1 až 1,0 mmol aminů/g polymeru.

-6CZ 289523 B6

Při této posledně uvedené metodě je možno po dokončení chemické syntézy sejmout z peptidů chránící skupiny a peptidy odštěpit od polymeru působením kapalné HF s 10 % anisolu při 0 °C po dobu asi 1/4 až 1 h. Po odpaření reakčních činidel se peptidy extrahují z polymeru 1 % roztokem kyseliny octové, který se pak lyofílizuje a získá se surový materiál. Ten je možno normálně přečistit metodami, jako je gelová filtrace na Sephadexu G-15 s 5 % kyselinou octovou jako rozpouštědlem. Lyofilizací příslušných frakcí sloupce se získá homogenní peptid nebo deriváty peptidu, které pak mohou být charakterizovány standardními metodami, jako je analýza aminokyselin, tenkovrstvá chromatografíe, vysokoúčinná kapalinová chromatografíe, ultrafialová absorpční spektroskopie, molámí rotace, rozpustnost, a kvantifikovány Edmanovou degradací pevné fáze.

C. Produkce protilátek proti MTAse

Antigenicita MTAsových peptidů může být stanovena konvenčními metodami zjišťování velikostí protilátkové odezvy živočicha, který byl imunizován peptidem. Jako MTAsové peptidy k vyvolání tvorby protilátek proti MTAse se obecně používají takové peptidy, které indukují produkci vysokých titrů protilátky s relativně vysokou afinitou k MTAse. Takovéto peptidy mohou být pro použití jako imunogeny čištěny například metodou popsanou Rangionem a d. (J. Biol. Chem., viz výše) nebo výše popsanými metodami získávaní MTAsových peptidů.

Jakmile jsou připraveny antigenní peptidy, získají se protilátky k imunizujícímu peptidu zavedením peptidu do savce (jako je králík, myš nebo krysa). Pro ilustraci jsou v připojeném seznamu sekvencí uvedeny aminokyselinové sekvence dvou antigenních MTAsových peptidů jako SEQ ID. NO. 2 a 3. Protilátky, produkované králíky, imunizovanými těmito peptidy, vykázaly 50 % maximální odpovědi na čištěnou MTAsu při ředění 1:1 500, resp. 1:4 000.

D. Kity pro detekci MTAsy

Je možno připravit kity pro detekci MTAsy pro použití v laboratorních a klinických stanoveních, zahrnující reakční činidla, použitelná ve výše uvedených metodách. Například kit pro použití metodou podle výše uvedeného odstavce A přednostně obsahuje oligonukleotidové primery (získané podle výše uvedeného odstavce B), detekovatelně značené hybridizační sondy a mikrotitrační destičky s povlakem reakčního činidla. Kit může také obsahovat protilátky, popsané výše v odstavci C, pro použití v imunologické detekci MTAsového proteinu (popsané v patentu US 5571510.

Přehled obrázků na výkresech

Obr. 1 znázorňuje mapu genu pro MTAsu a umístění exonů v polynukleotidu. Předpokládané exony jsou podtrženy; předpokládané introny jsou označeny jednou nebo více náhradami bází v polynukleotidové sekvenci symboly „N“. Sekvence, znázorněná na obr. 1, odpovídá sekvenci, uvedené v připojeném seznamu sekvencí jako SEQ ID NO 1.

Příklady provedení vynálezu

Vynález je blíže osvětlen na příkladech provedení, které však neomezují jeho rozsah.

V příkladech jsou použity tyto zkratky: AS = pozitivní; DTT = dithiothreitol; min = minuta; MTAsa= 5'-deoxy-5'-methylthioadenosin fosforyláza; PCR = polymerázová řetězcová reakce; S = negativní; Ssc = 0,3 M NaCl, 0,3 M natriumcitrát dihydrát; v/v = objem na objemu; SDS = dodecylsulfát sodný.

-7CZ 289523 B6

Příklad I

Test katalytické aktivity MTAsy ve vzorku

Fosforolytická aktivita MTAsy byla stanovena měřením tvorby [methyl-¹⁴C]-5-methylthioribóza-1-fosfátu z [methyl-¹⁴C]-5'-deoxy-5'-methylthioadenosinu (Seidenfeld a d., Biochem. Biophys. Res. Commun. 95, 1 861-1 866, 1980). V celkovém objemu 200 μΐ obsahovala standardní reakční směs 50 mM pufru na bázi fosforečnanu draselného o pH 7,4, 0,5 mM [methyl-¹⁴C]-5'-deoxy-5'-methylthioadenosinu (2.10⁵ CPM/mmol), 1 mM DTT a uvedené množství enzymu. Po 20 min inkubace při 37 °C byla reakce zastavena přídavkem 50 μΐ 3M trichloroctové kyseliny a 200 μΐ alikvoty byly naneseny na sloupec 0,6 x 2 cm „Dowex“ 50-H* ekvilibrovaný s vodou. [Methyl-¹⁴C]-5-methylthioribóza-l-fosfát byl eluován přímo do scintilačních nádobek obsahujících 2 ml 0,1 M HCI.

Příklad Π

Čištění nativní MTAsy z krysích jater

MTAsa byla izolována z krysích jater modifikací metody Rangiona a d. (J. Biol. Chem. 261,12 324-12 329, 1986). 50 g čerstvých krysích jater bylo homogenizováno v mísiči Waring Blendor se 4 objemy lOmM pufru na bázi fosforečnanu draselného o pH 7,4, obsahujícího 1 mM DTT (pufr A). Homogenizát byl odstředěn (1 h při 15 000 g) a vzniklý supematant byl podroben frakcionaci síranem amonným. Precipitát mezi 55 a 75 % nasycení byl shromážděn odstředěním (15 000 g po dobu 20 min) a rozpuštěn v minimálním objemu pufru A. Vzorek pak byl dialyzován přes noc proti třem dávkám 100 objemů téhož pufru.

Vzorek byl vyčiřen odstředěním při 15 000 g po dobu 30 min a pak nanesen na sloupec DEAESephacryl (1,5x18 cm, Pharmacia), předem ekvilibrovaný pufrem A. Po promytí 80 ml ekvilibračního pufru byl aplikován lineární gradient (80 ml) 0 až 0,3 M NaCl v pufru A. MTAsová aktivita byla eluována mezi 0,1 a 0,15 M NaCl. Frakce obsahující alespoň 0,06 jedn./mg proteinu byly 20krát zahuštěny ultrafiltrací (membrány Diaflow Amicon PM-10) a intenzivně dialyzovány proti 25 mM pufru na bázi fosforečnanu draselného o pH 7,4 s obsahem 1 mM DTT (pufr B). Pak byl vzorek nanesen na sloupec hydroxyapatitu (1x12 cm; Bio-Rad). Po eluci nenaabsorbovaných proteinů pufrem B byl sloupec promyt asi 40 ml 50mM fosfátového pufru o pH 7,4 s obsahem 1 mM DTT.

Pak byla eluována MTAsa s použitím lineárního gradientu (40 ml) 50 až 250 mM fosforečnanu draselného, pH 7,4. Frakce obsahující MTAsovou aktivitu byly 30krát zahuštěny ultrafiltrací a zbaveny dithiothreitolu opakovaným koncentrováním a ředěním 50mM fosfátovým pufrem o pH 7,4. Částečně přečištěný enzym pak byl nanesen na sloupec (0,8 x 3 cm) organortuťnaté agarózy (Bio-Rad), ekvilibrované 50mM fosfátovým pufrem o pH7,4. Eluce sloupce byla prováděna postupně a) 50mM fosfátovým pufrem o pH7,4, b) 50mM fosfátovým pufrem o pH 7,4, 2 M Kel, a c) 50mM fosfátovým pufrem o pH 7,4,2 M Kel, 40 mM 2-merkaptoethanolu. Enzym pak byl eluován 50mM fosfátovým pufrem o pH 7,4, 2 M Kel, 200 mM 2-merkaptoethanolu. Frakce obsahující alespoň 3jedn./mg proteinu byly spojeny, zahuštěny ultrafiltrací na 1 ml a dialyzovány přes noc proti 1 000 obj. 10 mM Tris/HCl, pH 7,4, 1 M DTT (pufr C). V posledním stupni čištění byly alikvoty vzorku (1 ml) nastřikovány v množství 1 ml/min do kolony „MONOQ“ (Pharmacia), preekvilibrované lOmM Tris/HCl, pH7,4, s obsahem 1 mM DTT a byly jímány frakce 0,5 ml. MTAsová aktivita byla eluována mezi 0,08 a 0,14 M NaCl v pufru C. Frakce byly ultrafiltrací zahuštěny na 0,5 ml a dialyzovány proti 1 000 objemů pufru B.

-8CZ 289523 B6

Příklad III

Stanovení částečné sekvence aminokyselin pro krysí MTAsu

Přečištěný vzorek byl lyofilizován, rozpuštěn v 50 μΐ nosného pufru (1 % dodecylsulfátu sodného (SDS), 10 % glycerinu, 0,1 M DTT a 0,001 % bromfenolové modře) a nanesen na 0,5 mm tlustý polyakiylamidový gel s 10% SDS (zařízení Bio Rad „MINIGEL“). Po elektroforéze byly proteiny přenášeny elektroblottingem po dobu 2h na nitrocelulózu (velikost pórů 0,45 mm, Millipore) v systému transblot Bio-Rad s použitím přenosového pufru (15 mM Tris, 192 mM glycinu a 20 % methanolu, pH 8,3), popsaného Towbinem a d. (Proč. Naťl Acad. Sci. USA 76, 4 340-4 345,1979).

Po přenosu byly proteiny reverzibilně obarveny pomocí Ponceau S (Sigma) modifikovanou metodou, popsanou Salinovichem a Montelarem (Anal. Biochem. 156, 341-347, 1987). Nitrocelulózový filtr byl ponořen na 60 s do roztoku 0,1 % barviva Poceau S v 1 % vodné kyselině octové. Přebytečné zbarvení bylo odstraněno mírným třepáním po dobu 1 až 2 min v 1 % vodné kyselině octové. Oblast obsahující protein, detekovaná barvením, byla vyříznuta, přenesena do Eppendorfovy zkumavky (1,5 ml), promyta destilovanou vodou a inkubována po dobu 30 min při 37 °C v 1,2 ml 0,5% polyvinylpyrrolidonu (průměrná molekulová hmotnost 40 000, PVP-40, Sigma), rozpuštěného ve 100 mM kyseliny octové, za účelem zabránění absorpci proteázy na nitrocelulózu během digesce. Přebytek PVP-40 byl odstraněn intenzivním promytím vodou (alespoň 5 dávek).

Nitrocelulózové proužky pak byly nařezány na malé kousky o velikosti přibližně 1 mm x 1 mm a vloženy zpět do téže zkumavky. Protein na nitrocelulóze byl digerován dříve popsaným způsobem (Los a d., Science 243:217-220, 1989). Přidá se trypsin (10 pmol) ve 100 μΐ lOOmM Tris-HCl, pH 8,2/acetonitril, 95:5 (v/v) a provede se inkubace přes noc při 37 °C. Po digesci byl supematant obsahující peptid okyselen 30 μΐ 10 % trifluoroctové kyseliny, přemístěn rychle na zařízení Vortex a odstřeďován 1 min při 15 000 g. Supematant byl odebrán a okamžitě nastříknut bna systém HPLC s reverzními fázemi (Beckmann), vybavený analytickou kolonou Brownlee Aguapore Bu-300 (2,1 x 100 mm).

Do kolony byl po dobu 5 min jychlostí 200 μΐ/min čerpán eluent d-0,1 % trifluoroctová kyselina (čistota pro sekvenování, ve vodě), načež byl průtok snížen na 100 μΐ/min a byl započat gradient eluentu E (0,08 až 0,095 % trifluoroctová kyselina v acetonitril/H₂O 70:30 v/v). Frakce, obsahující peptid podle absorpce UV při 215 nm, byly manuálně sebrány do Eppendorfových zkumavek. Reprezentativní frakce 60 a 77 byly podrobeny sekvenční analýze aminokyselin (ABI477A Protein Seguencer s on-line analyzátorem PTH-AA 120A). Tak byly získány nezávislé částečné sekvence aminokyselin krysí MTAsy. Sekvence aminokyselin peptidů označených jako peptid 1 (frakce 60) a peptid 2 (frakce 77) jsou znázorněny jako SEQ ID NO 5 až 6.

Příklad IV

Amplifikace fragmentu DNA kódujícího část lidského genu MTAsy

Na základě částečných sekvencí aminokyselin peptidů 1 (SEQ ID NO 4) a 2 (SEQ ID NO 5) byly syntetizovány dvě sady oligonukleotidových primérů s různými polaritami. Každý oligonukleotid byl navržen tak, aby obsahoval jediné restrikční místo na 5'-konci (EcoRI nebo BamHI) pro usnadnění následného klonování amplifikovaného fragmentu DNA. Pro použití při amplifikaci PCR byla izolována totální cDNA z 1 milionu jednotek tvořících plak (plague forming units, pfu) z genové knihovny cDNA lidské placenty (Clontech) pomocí kitu „Lambda-TRAP“ (Clontech).

-9CZ 289523 B6

PCR reakce byla prováděna v celkovém objemu 100 pl, obsahujícím 1 pg totální cDNA z genové knihovny cDNA lidské placenty, lxPCR pufr (10 mM Kel, 10 mM Tris-HCl, pH 8,3, 2,5mMMgC12), 0,2 mM každého dNTP, po 100 mg negativního a pozitivního primerů a 10 jednotek Tag DNA polymerázy, Stoffel Fragment („AMPLITAQ“, Perkin-Elmer Cetus).

Se systémem „GENE AMP“ PCR Systém 9600 (Perkin-Emmer Cetus) bylo provedeno 40 cyklů, sestávajících vždy zdenaturace (92 °C, 1 min), teplotní hybridizace (55 °C, 2 min) a prodlužování (72 °C, 2 min). PCR produkt byl oddělen elektroforeticky na 0,8 % agarózovém gelu vpufru lxTA(40mM Tris-acetát, 20 mM Na-acetát, 2mM EDTA, pH7,9) a byl amplifikován fragment DNA 450 bp. Produkt amplifikace PCR byl dvakrát digerován s restrikčními enzymy EcoRI/BamHI, rozdělen na 0,8 % agarózovém gelu v pufru 1 x TA, získán z gelu pomocí kitu „GENE CLEAN“ (BiolOl), subklonován do vektoru pBluescript SK⁺ (Stratagene), vyříznutého pomocí EcoRI/BamHI, a sekvenován dideoxyterminační metodou s použitím universálního sekvenčního primerů (kit pro sekvenování DNA „SEQUENASE“ verze 1,0, USB).

Příklad V

Screening genové knihovny cDNA lidské placenty

Sekvenční analýza amplifíkovaného produktu PCR (příklad IV) vykazuje dokonalou shodu s C-terminální sekvencí aminokyselin peptidu 1 (SEQ ID NO ). S použitím fragmentu DNA 450 bp jako hybridizační sondy byla podrobena sereeningu genová knihovna cDNA lidské placenty (Clontech). Za tím účelem byly hostitelské buňky kmene Y1090 E. coli inkubovány při 37 °C přes noc za intenzivního třepání v médiu LB (na litr: 10 g tryptonu, 5g kvasničného extraktu, 10 g NaCl), obsahujícím 0,2 % maltózy a 10 mM MgSP. Pro každou kultivační plotnu bylo 0,3 ml kultury hostitelských buněk smíseno s 3.10⁴ pfu fágů a inkubováno 20 min při 37 °C. Směsi hostitelských buněk a fágů byly přidány k 8 ml média LB, obsahujícího 0,7 % agarózy (LB na agaróze), které bylo předehřáto na 48 °C, a nality na 20 agarových ploten (135 x 15 mm). Po 6 až 8 h inkubace při 37 °C byly viditelné plaky a desky byly po dobu 1 h chlazeny na 4 °C. Plaky byly přeneseny na dobu 3 min na nylonové přenosové membrány Colony/Plague Screen (NEN Research Products, Dupont Boston, MA) a pak denaturovány (dvakrát v 0,5 N NaOH po dobu 2 min), renaturovány (dvakrát v 0,1 M Tris-HCl, pH 7,5 po dobu 2 min) a fixovány sušením na vzduch. Prehybridizace 20 membrán byla provedena po dobu 4 h při 42 °C ve dvou plastových pytlích po 10 membránách s použitím 20 ml prehybridizačního pufru (1 % SDS, 2 x SSC, 10 % dextransulfátu, 50 % deionizovaného formamidu).

Fragment EcoRI-BamHI 450 bp části lidského genu MTAsy byl označen [a-³²P]dATP (3 000 Ci/mmol) s použitím kitu pro posun jednořetězcového zlomu (Boehringer Mannheim), oddělen od nezabudované radioaktivity na koloně NICK (Pharmacia), denaturována zahřátím na 96 °C po dobu 10 min, ochlazen na ledu a přidán k membránám v plastových pytlích s koncentrací sondy 106dpm/ml. Specifická aktivita značené sondy je kolem 10*dpm/pg. Hybridizace byla prováděna přes noc při 42 °C. Po hybridizaci byly membrány promyty třikrát po 5 min při teplotě místnosti přebytkem 2 x SSC, pak 20 min při 65 °C 2 x SSC, 0,1 % SDS a jednou 20 min při teplotě místnosti 0,2 x SSC, 0,1 % SDS. Promyté membrány byly přes noc vystaveny rentgenovému filmu.

Agarové výřezy, obsahující několik plaků kolem pozitivního signálu, byly přeneseny do 1 ml sterilního ředidla fágů (50 mM Tris-HCl, pH 7,5, 0,1 M NaCl, 8 mM MgSO₄, 0,01 % želatiny) a podrobeny znovu sereeningu výše popsaným způsobem do získání čistých pozitivních plaků.Ze sereeningu přibližně půl milionu plaků bylo získáno 6 nezávislých pozitivních klonů. Po amplifikaci na plotnách LB byla každá fágová DNA pozitivních klonů čištěna s použitím kitu „Lambda-TRAP“ (Clontech). Za účelem získání celého inzertu byly čištěné fágové DNA

-10CZ 289523 B6 rozštěpeny enzymem EcoRI, ale v důsledku existence místa EcoRI uvnitř inzertu byly ze všech klonů vyříznuty dva pásy.

Dva fragmenty inzertu EcoRI (850 a 1 100 bp) z reprezentativního fágového klonu, označeného MTAP-1, byly subklonovány do vektoru pBluescript SK⁺ (Stratagene), vyříznutého pomocí EcoRI. Tyto subklony byly označeny MTAP-2 (850 bp) a MTAP-3 (1 100 bp). Restrikční analýzou a sekvenováním DNA těchto dvou subklonů bylo zjištěno, že subklon MTAP-2 má na C-konci otevřený čtecí rámec kódující 254 aminokyselin, obsahujících sekvenci aminokyselin odpovídající peptidu 3 (90 % homologie). Počítáno z molekulové hmotnosti MTAsy 32 kDa (F. D. Rangione a d., J. Biol. Chem. 261:12 324-12 329, 1986), pokrývá 85 % celého proteinu. Chybí asi 50 aminokyselin (alespoň 150 bp na úrovni DNA).

Příklad VI

Prodlužování primerů pro získání chybějícího 5'-konce cDNA MTAsy

K získání chybějícího 5-'terminálního fragmentu byla použita metoda RACE (rapid amplification of cDNA ends;, Loh a d., Science 243:217-220, 1989; Frohman a d., PNAS 85:8 998-9 002, 1988). pg póly A+( RNA z lidské placenty (Clontech) v 6,25 pl H₂O byl 5 min zahříván na 65 °C, zchlazen na ledu a přidán ke 4 pl pufru 5 x RTC (250 mM Tris-HCl, pH 8,15, 30 mM MgCl₂, 200 mM KC1, 5 mM DTT), 4 pl (0,4 mg/ml) aktinomycinu D (Boehringer), po 1 pl každého dNTP (20 mM), 0,25 pl (10 jednotek) Rnasinu (Boehringer), 1 pl [a-³⁵S]dATP (1 443 Ci/mmol), 1 pl pozitivního oligonukleotidu 3 AS, specifického pro lidskou MTAsu, a 10 jednotkám reverzní transkriptázy viru ptačí maeloblastózy (Boehringer). Směs byla inkubována 2 h při 42 °C.

Přebytek primerů a dNTP byl odstraněn tímto způsobem: 20pl pool cDNA byl nanesen na kolonu NICK (Pharmacia) a byly jímány dvoukapkové frakce. Frakce 5 až 8, příslušející prvnímu píku radioaktivity, byly spojeny bylo provedeno srážení po dobu 2 h při -80 °C s 1/10 objemu 7,5M NHOAc a 2,5 objemu ethanolu, odstřeďování po dobu 30 min při 4 °C při 15 000 g, promytí 0,5 ml 80 % ethanolu, sušení za sníženého tlaku (Speedvací) a rozpuštění ve 20 pl H₂O. Pro zakončení bylo přidáno 1,5 pl dGTP (20 mM), 2,4 pl CoCl₂ (25 mM), 6 pl 5 x zakončovacího pufru (1 mM kakodylát draselný, 125 mM Tris-HCl, pH6,6,1,25 mg/ml bovinního sérového albuminu) a 0,5 pl (15 jednotek) terminální deoxynukleotidyltransferázy (Boehringer).

Směs byla inkubovány 1 h při 37 °C, zahřívána 15 min při 65 °C, extrahována jednou stejným objemem pufru TE (10 mM Tris-HCl, pH 7,5, 0,1 mM EDTA), nasyceného fenolem a pak vysrážena výše popsaným způsobem ethanolem. Pool zakončené cDNA rozpuštěn ve 20 pl H°a 1 pl byl použit pro PCR. Pro amplifíkaci byly syntetizovány další dva primery.Jedním byl pozitivní primer specifický pro MTAsu, který je umístěn o 180 bp proti směru exprese od polohy oligonukleotidu 3AS. Druhým byl primer pro konec poly(G). Amplifíkace byla prováděna stejně jako výše popsaným způsobem po dobu 40 cyklů. Každý cyklus sestával z denaturace (1 min, 92 °C), teplotní hybridizace (2 min, 50 °C) a prodlužování (0,5 min, 72 °C).

Produkt PCR byl elektroforeticky rozdělen na 0,8 % agarózovém gelu. Získaný fragment DNA 520 bp byl specificky amplifikóván. Po provedeném čištění na 0,8 % agarózovém preparativním gelu byl fragment DNA 520 bp digerován s Not I a Bel I (příslušná restrikční místa přítomná v překrývající se doméně mezi prodlouženým fragmentem DNA a původním fragmentu subklonu MTAP-2) a subklonován do vektoru pBluescript SK⁺ (Stratagene), vyříznutého pomocí Not I/BamHI. Sekvenční analýza tří nezávislých subklonů, označených MTAP-4, MTAP-5 aMTAP-6, ukázala, že každý z těchto klonů obsahuje v překrývající se doméně přesně souhlasící sekvenci aminokyselin.

-11 CZ 289523 B6

Délky těchto tří subklonů cDNA z prodloužených primerů se mírně liší. Z toho vyplývá, že se jedná o nezávislé produkty PCR a jejich sekvence odrážejí správnou sekvenci mRNA bez začlenění nějaké báze v průběhu amplifikace PCR. Kombinace nové sekvence proti směru exprese se startovacím kodonem ATG (kódujícím methionin) a sekvence po směru exprese ze subklonu MTAP-2 vytváří otevřený čtecí rámec, kódující 283 aminokyselin.

Příklad VII

Exprese rekombinantní lidské MTAsy v E. coli

Plná délka cDNA lidské MTAsy byla konstruována přidáním fragmentu cDNA subklonu MTAP-4, prodlouženého z primerů, který obsahuje největší inzert ze všech tří subklonů, získaných podle příkladu VI, k 5' konci inzertu DNA subklonu MTAP-2 s použitím jejich společného restrikčního místa HindlI. Fragment DNA Not I/HindII ze subklonu MTAP-4 a velký fragment HindlI/EcoRI ze subklonu MTAP-2 byly smíseny a subklonovány do vektoru pBluescript SK⁺ (Stratagene), vyříznutého pomocí Not I/EcoRI. Získaný subklon, obsahující plnou délku cDNA lidské MTAsy, byl označen MTAP-7. Autenticita tohoto klonu cDNA byla zkontrolována expresí rekombinantního proteinu pomocí expresního vektoru E. coli pKK223-3, opatřeného promotorem Tag (Pharmacia).

K vytvoření nového místa EcoRI na 5-konci a místa Pst I na 3'-konci fragmentu cDNA byla použita PCR s použitím 5'-příměrového oligonukleotidů, obsahujícího Shine-Dalgamovu (SD) sekvenci, a dalšího 3 '-primerů. Amplifikace byla prováděna výše uvedeným způsobem po dobu 20 cyklů, sestávajících vždy zdenaturace (1 min, 92 °C), teplotní hybridizace (1 min, 55 °C) a prodlužování (1 min, 72 °C). Produkt PCR byl digerován s restrikčními enzymy EcoRI/Pst I, čištěn elektroforeticky na 0,8 % agarózovém gelu a subklonován do vektoru pBluescript SK⁺ (Stratagene), vyříznutého pomocí EcoRI/Pstl.

Po zkontrolování plné sekvence inzertu v subklonu označeném MTAP-8 byl vyříznut fragment EcoRI/Pst I a subklonován do vektoru pKK223-3, vyříznutého pomocí EcoRI/Pst I, čímž se získala cDNA lidské MTAsy v xpresním vektoru E. coli. Subklon označený MTAP-9 byl transformován do kmene E. coli JMI05. Byla analyzována enzymatická aktivita a spektrum celkových proteinů transformovaných buněk s indukcí a bez indukce izopropyl-p-D-thiogalaktopyranosidu (IPTG). Jedna transformovaná kolonie byla inkubována do 2 ml média LB a inkubována přes noc při 37 °C. 20 μΐ získané kultury bylo přidáno do dvou plastových zkumavek, obsahujících vždy 2 ml čerstvého média LB (zředění 1/100).

Po 1 h inkubace při 37 °C bylo k jedné zkumavce přidáno 20 μΐ 0,1 M IPTG pro indukci na konečnou koncentraci 1 mM IPTG a v inkubaci se pokračovalo 4 h při 37 °C. Po izolaci buněk odstředěním po dobu 5 min při 15 000 g byly buňky resuspendovány ve 100 μΐ fosfátového pufru (50 mM fosforečnan draselný, pH 7,5, 1 mM DTT), ve stupni 3 rozrušeny sonifikací na ledu po dobu 0,5 min a odstředěním po dobu 10 min při 15 000 g byly získány surové buněčné extrakty.

Koncentrace proteinů byla stanovena s použitím Bradfordovy metody (Protein Assay Bio-Rad). Stejná množství vzorků s indukcí a bez indukce IPTG byla analyzována na enzymatickou aktivitu a podrobena elektroforéze na 10 % SDS polyakrylamidovém gelu. Surový extrakt, získaný z IPTG indukovaných buněk, vykazoval aktivitu MTAsy více než pětinásobně vyšší než u neindukovaných buněk. Navíc byl na SDS gelu detekován pás nově indukovaného proteinu (31kDa).

-12CZ 289523 B6

Příklad VIII

Klonování a částečná charakterizace genomového klonu MTAsy

Pro co nejúčinnější amplifikaci fragmentu DNA pomocí PCR pro diagnostické účely by jeho velikost měla přednostně být menší než 500 bp. Sekvence cDNA odráží souhrn exonú, které jsou normálně odděleny introny, což znesnadňuje v sekvenci cDNA nalézt příslušnou sekvenci vhodné velikosti. K překonání tohoto problému byl izolován genomový klon lidské MTAsy. Knihovna kosmidových genů, konstruovaná z DNA lidské placenty (Clontech) byla podrobena screeningu pomocí sondy genu cDNA MTAsy, fragmentu Not I/EcoRI ze subklonu MTAP-7. Transformované buňky E. coli z knihovny se nanesou na plotny LB s obsahem ampicilinu (50 mg/1) s hustotou kolonií 1 až 2.10⁴ na plotnu 135 x 15 mm.

Následující postup byl prováděn způsobem uvedeným v příkladu IV. Z půl milionu kolonií byla izolována jediná pozitivní kolonie s označením MTAP-10 a byla částečně charakterizována analýzou PCR a nepřítomným sekvenováním. Byly syntetizovány dva primery, antikódující oligonukleotid, umístěny 120 bp před stop kodonem, a kódující oligonukleotid umístěný 20 bp za stop kodonem, a použity pro analýzu PCR. PCR byla prováděna po dobu 25 cyklů, sestávajících vždy z denaturace (1 min, 92 °C), teplotní hybridizace (2 min, 55 °C) a prodlužování (5 min, 72 °C). Produkty PCR byly odděleny na 0,8 % agarózovém gelu.

Umístění exonů, dosud identifikovaných v genu MTAsy výše popsanou metodou, je znázorněno na obr. 1.

Příklad IX

Aplikace oligonukleotidů specifických pro sekvenci MTAsy na maligní buněčné linie pro detekci přítomnosti nebo nepřítomnosti MTAsy.

Za účelem zkoumání použitelnosti oligonukleotidů byla PCR aplikována na několik buněčných linií, o nichž je známo, že obsahují buňky pozitivní a negativní na MTAsu. Genomové DNA byly izolovány způsobem popsaným v příkladu VIII a v množství 1 pg použity pro PCR. Amplifikace byla prováděna výše popsaným způsobem po dobu 40 cyklů, sestávajících z denaturace (1 min, 92 °C), teplotní hybridizace (1 min, 55 °C) a prodlužování (1/2 min, 72 °C). Produkty PCR byly analyzovány na 1,5 % agarózovém gelu. V buněčných liniích, o nichž je známo, že jsou negativní na MTAsu, nebyla MTAsa detekována, zatímco v MTAsa-pozitivních buněčných liniích byla MTAsa detekována.

PŘEHLED SEKVENCÍ

SEQ ID NO 1 je genomický klon pro methylthioadenosin fosforylázu (MTAsu).

SEQ ID NO 2 je antigenní MTAsový peptid („peptid 40“).

SEQ ID NO 3 je antigenní MTAsový peptid („peptid 51“).

SEQ ID NO 4 je primer pro PCR amplifikaci genu MTAsy („peptid 1“).

SEQ ID NO 5 je primer pro PCR amplifikaci genu MTAsy („peptid 2“). SEZNAM SEKVENCÍ (1) VŠEOBECNÉ INFORMACE (i) PŘIHLAŠOVATEL: THE REGENTS OF THE UNIVERSITY OF CALIFORNIA

- 13CZ 289523 B6 (ii) NÁZEV VYNÁLEZU: ZPŮSOB DETEKCE DEFICITU METHYLTHIOADENOSIN FOSFORYLÁZY V SAVČÍCH BUŇKÁCH (iii) POČET SEKVENCÍ: 5 (iv) KORESPONDENČNÍ ADRESA:

(A) ADRESÁT: Robbins, Berliner & Carson (B) ULICE: 201 N. Figueroa Street, 5^th Floor (C) MĚSTO: Los Angeles (D) STÁT: Califomia (E) ZEMĚ: USA (F) POŠT. KÓD: 90012 (v) STROJNĚ ČIŠTĚNÁ FORMA:

(A) TYP MÉDIA: Floppy disk (B) POČÍTAČ: kompatibilní s IBM PC (C) OPERAČNÍ SYSTÉM: PC-DOS/MS-DOS (D) SOFTWARE: Patentln Release #1.0, verze #1.25 (vi) ÚDAJE O SOUČASNÉ PŘIHLÁŠCE:

(A) ČÍSLO PŘIHLÁŠKY:

(B) DATUM PODÁNÍ:

(C) KLASIFIKACE:

(viii) INFORMACE O ZÁSTUPCI/AGENTOVI:

(A) JMÉNO: Berliner, Robert (B) REGISTRAČNÍ ČÍSLO: 20,121 (C) ZNAČKA/ČÍSLO SPISU: 5555-287 (ix) TELEKOMUNIKAČNÍ INFORMACE:

(A) TELEFON: 213-977-1001 (B) TELEFAX: 213-977-1003 (2) INFORMACE PRO SEQ ID NO 1:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 2 763 párů bází (B) TYP: nukleová kyselina (C) VLÁKNO: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: DNA (genomová) (vii) OKAMŽITÝ ZDROJ:

(B) KLON: methyladenosin fosfatáza (ix) RYS:

(A) NÁZEV/KLÍČ: CDS (B) POLOHA: 1..2 763 (xi) POPIS SEKVENCE SEQ ID NO 1:

-14CZ 289523 B6

TTTATACAGA	GCATGACAGT	GGGGTCCTCA	CTAGGGTCTG	TCTGCCACTC	TACATATTTG	60
AAACAGGAGT	GGCTTCTCAG	AATCCAGTGA	ACCTAAATTT	TAGTTTTAGT	TGCTCACTGG	120
ACTGGGTTCT	AGGAGACCCC	CTGTGTTAGT	CTGTGGTCAT	TGCTAGSAGA	ATCACTTAAT	180
TTTTTCTAGA	ctctaggaga	AAACAGTTGG	TGGTGTACTC	ATCACGGGTT	AACAATTTCT	240
TCTCTCCTTC	cataggcatg	GAAGGCAGCA	CACCATCATG	CCTTCAAAGG	TCAACTACCA	300
GGCGAACATC	TGGGCTTTGA	AGGAAGAGGG	CTGTACACAT	GTCATAGTGA	CCACAGCTTG	360
TGGCTCCTTG	AGGGAGGAGA	TTCAGCCCGG	CGATATTGTC	ATTATTGATC	AGTTCATTGA	420
CANNNNNNNN	NNNNNNNNNN	GAGGTCGACG	GTATCGATAA	GCTTTGTAAA	CAATTGTCTT	480
TAGCTTATCC	AGAGGAATTG	AGTCTGGAGT	AAAGACCCAA	ATATTGACCT	AGATAAAGTT	540
GACTCACCAG	CCCTCGGAGG	ATGGAAAGAT	GGCCTTAAAA	TAAAACAAAC	AAAAACCTTT	600
TTTGCTTTAT	TTTGTAGGAC	CACTATGAGA	CCTCAGTCCT	TCTATGATGG	AAGTCATTCT	660
TGTGCCAGAG	GAGTGTGCCA	TATTCCAATG	GCTGAGCCGT	TTTGCCCCAA	AACGAGAGAG	720
GTGTGTAGTC	TTTCTGGAAG	GTGTACCAGA	ATAAATCATG	TGGGCTTGGG	GTGGCATCTG	780
GCATTTGGTT	AATTGGCAGA	CGGAGTGGCC	CCATACCCTC	ACTCAAGTTT	GCTTTGTATT	840
ATGCAAGTTT	ATGGAGAGTT	ATTTCCTGTT	GCTAATAATT	TNNNNNNNNM	NNNMMNHNNM	900
AAGTGCAGCC	TTAAGTTGTG	CATGTGCTAG	TATGTTTTGA	AGTTTCTGGT	TT.TTCTTTTC	960
TAGGTTCTTA	TAGAGACTGC	TAAGAAGCTA	GGACTCCGGT	GCCACTCAAA	GGGGACAATG	1020
GTCACAATCG	AGGGACCTCG	TTTTAGCTCC	CGGGCAGAAA	GCTTCATGTT	CCGCACCTGG	1080
GGGGCGGATG	TTATCAACAT	GACCACAGTT	CCAGAGGTGG	TTCTTGCTAA	GGAGGCTGGA	1140
ATTTGTTACG	CAAGTATCGC	CATGGGCACA	GATTATGACT	GCTGGAAGGA	GCACGAGGAA	1200
GCAGTAGGTG	GAATTCTTTT	CTAAGCACAT	ATAGCATGGG	TTTCTGGGTG	CCAATAGGGT	1260
GTCTTAACTG	TTTGTTTCTA	TTACGTTAGT	TTCAGAAAGT	GCCTTTCTAC	AAGGTTTTGA	1320
AGTTGTTAAT	ATTTTCTGTA GTTCCATTGG	AAGGTAAGAA	CAAAGATCAA	AAGAAAGAAA	1380
GAGACACTTT	TACCCAAGGA TCAGTAGTGA	AAATAGTACA	TTGTAGGCAT	GTAGATGTGT	1440
TGAGAATCAT	ACTAAGACTT	GGGCCTTANN	NNNNNNNNNN	NNNNNNNNNN	NNTACCCTAC	1500
ATTGAGGATT	CGGTTTCAGC	AGATAAATTT	GAGGGACACA	AACATTTAGG	CTGTAGCAAG	1560
GCTGGAGCTC	AGAAAAATGT	TTTATGACAA	GCAGTGGAAT	TTTAAGTTCT	AGTAACCTCC	1620

- 15CZ 289523 B6

AGTGCTATTG TTTCTCTAGG TTTCGGTGGA CCGGGTCTTA AAGACCCTGA AAGAAAACGC1680

TAATAAAGCC AAAAGCTTAC TGCTCACTAC CATACCTCAG ATAGGGTCCA CAGAATGGTC1740

AGAAACCCTC CATAACCTGA AGGTAAGTGC AGCCATGGAC AATCAGGCAT GTCTGTAGAC1800

TCTCTATTGT CTTCTTTTCT TACTTGCATT TCACCTTTGG TCCTCATGTA TTTTTTGCCA1860

GCCTAGATGT TTTCAACAAG TTTTTGTGAC ATCTACTACT ACCATACCAA CCACTTGTGA1920

AACTGAGTAG TCTTATTTTC TTGGCTGGTA GTGCAGANNN NNNNNNNNNN RNAATAAACA1980

ATAATCCAGG CTGGGCTGGT ATGGCAATAA GTGATTATCA GAACAATGCT CTGAGATAAG2040

CATTATTAAC CTCACTTTAC AGGAAAGGGA GGTGAGGAAC CAAGAGTTTA GAGTACCCGA2100

AGTTCCACAT CTGGTTAGTG AACTTGAAAA TTTTCTGTAG AATTTATTTA AAGTGTATGT2160

TTCCTGCGTC CTCACTTTGA TCTAGAAAAT CAAAATCTGT TTTTTTTTTT AACAAACATC2220

TCAGTAATTA CGCCAACATG TGAATATCAC TGCCTCCTTT CTTCCTTTCA GAATATGGCC2280

CAGTTTTCTG TTTTATTACC AAGACATTAA AGTAGCATGG CTGCCCAGGA GAAAAGAAGA2340

CATTCTAATT CCAGTCATTT TGGGAATTCC TGCTTAACTT GAAAAAAATA TGGGAAAGAC2400

ATGCAGCTTT CATGCCCTTG CCTATCAAAG AGTATGTTGT AAGAAAGACA AGACATTGTG2460

TGTATAGAGA CTCCTCAATG ATTTAGACAA CTTCAAAATA CAGAAGAAAA GCAAATGACT2520

AGTAACATGT GGGAAAAAAT ATTACATTTT AAGGGGGAAA AAAAACCCCA CCATTCTCTT2580

CTCCCCCTAT TAAATTTGCA ACAATAAAGG GTGGAGGGTA ATCTCTACTT TCCTATACTG2640

CCAAAGAATG TGAGGAAGAA ATGGGACTCT TTGGTTATTT ATTGATGCGA CTGTAAATTG2700

GTACAGTATT TCTGGAGGGC AATTTGGTAA AATGCATCAA AAGACTTAAA AATACGGACG2760

TAC2763 (2) INFORMACE PRO SEQ ID NO 2:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 17 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) VLÁKNO: jednoduché (D) TYPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: peptid (vii) OKAMŽITÝ ZDROJ:

(B) KLON: methyladenosin fosfatázové peptidy (ix) RYS:

(A) NÁZEV/KLÍČ: peptid (B) POLOHA: 1.. 17

-16CZ 289523 B6 (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO 2:

Ile Gly Ile Ile Gly Gly Thr Gly Leu Asp Asp Pro Glu Ile Leu 15 10 15

Glu Gly (2) INFORMACE PRO SEQ ID NO 3:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 13 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) VLÁKNO: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: peptid (vii) OKAMŽITÝ ZDROJ:

(B) KLON: methyladenosin fosfatázové peptidy (ix) RYS:

(A) NÁZEV/KLÍČ: peptid (B) POLOHA: 1. .13 (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO 3:

Leu Leu Leu Thr Thr Ile Pro Gin Ile Gly Ser Met Glu

5 10 (2) INFORMACE PRO SEQ ID NO 4:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 8 aminokyselin (Β) TYP: aminokyselina (C) VLÁKNO: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: peptid (vii) OKAMŽITÝ ZDROJ:

(B) KLON: methyladenosin fosfatázové primery (ix) RYS:

(A) NÁZEV/KLÍČ: peptid (B) POLOHA: 1..8 (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO 4:

Tyr Val Asp Thr Pro Phe Gly Lys

5

-17CZ 289523 B6 (2) INFORMACE PRO SEQ ID NO 5:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 9 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) VLÁKNO: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: peptid (vii) OKAMŽITÝ ZDROJ:

(B) KLON: methyladenosin fosfatázové primery (ix) RYS:

(A) NÁZEV/KLÍČ: peptid (B) POLOHA: 1..9 (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO 5:

Thr Trp Gly Ala Asp Val Ile Asn Met 1 5

Claims (5)

1. Způsob detekce přítomnosti katalyticky aktivní a katalyticky inaktivní methylthioadenosin fosforylázy, MTAsy, v savčích buňkách, vyznačující se tím, že

a) se získá analyzovatelný vzorek buněk, u nichž se předpokládá deficit MTAsy,

b) ke vzorku se přidají detekovatelně značené oligonukleotidové sondy odvozené od sekvence nukleové kyseliny znázorněné v připojeném seznamu sekvencí jako SEQ ID NO 1, které specificky hybridizují s jakoukoli nukleovou kyselinou, která kóduje MTAsu, přítomnou ve vzorku, a (c) detekuje se hybridizace sond s jakoukoli nukleovou kyselinou kódující MTAsu přítomnou ve vzorku, přičemž přítomnost uvedené nukleové kyseliny indikuje přítomnost katalyticky aktivní nebo inaktivní MTAsy v buňce.

2. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, že se dále provede selektivní amplifikace jakékoli nukleové kyseliny kódující MTAsu přítomné ve vzorku.

3. Způsob podle nároku 1,vyznačující se tím, že buňky jsou odvozeny od známé malignity.

4. Způsob podle nároku 3, vyznačující se tím, že buňky se rovněž analyzují na katalytickou aktivitu MTAsy.

-18CZ 289523 B6

5. Způsob podle nároku 2, vyznačující se tím, že použité podmínky zahrnují polymerázovou řetězovou reakci.