ES2576650T3 - Translocación y ROS quinasa mutante en el carcinoma pulmonar no microcítico humano - Google Patents

Abstract

Un polinucleótido aislado que comprende una secuencia de nucleótidos al menos 95% idéntica a una secuencia seleccionada del grupo que consiste en: (a) una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido de fusión de CD74-ROS que comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO:1; (b) una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido de fusión de CD74-ROS, y dicha secuencia de nucleótidos comprende la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO:2; (c) una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido de fusión de CD74-ROS que comprende la secuencia de aminoácidos N-terminal de CD74 (restos 1-208 de SEQ ID NO:3) y el dominio quinasa de ROS (restos 1945-2222 of SEQ ID NO:5); (d) una secuencia de nucleótidos que comprende la secuencia de nucleótidos N-terminal de CD74 (nucleótidos 1- 624 de SEQ ID NO:4) y la secuencia de nucleótidos del dominio quinasa de ROS (nucleótidos 6032-6865 de SEQ ID NO:6); y (e) una secuencia de nucleótidos complementaria con cualquiera de las secuencias de nucleótidos de (a)-(d).

Description

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Un polipéptido o polinucleótido de "ROS mutante" significa un polipéptido o polinucleótido de fusión de CD74-ROS según se describe en la presente.

Un "polinucleótido" (o "secuencia de nucleótidos") se refiere a un oligonucleótido, un nucleótido o un polinucleótido, y sus fragmentos o porciones, y a ADN o ARN de origen genómico o sintético, que puede ser monocatenario o bicatenario, y representar la hebra sentido o antisentido.

Un "polipéptido" (o "secuencia de aminoácidos") se refiere a una secuencia de un oligopéptido, un péptido, un polipéptido o una proteína, y sus fragmentos o porciones, y a moléculas naturales o sintéticas. Cuando en la presente se menciona una "secuencia de aminoácidos" para indicar una secuencia de aminoácidos de una molécula de proteína natural, la "secuencia de aminoácidos" y expresiones y términos similares, tales como "polipéptido" o "proteína", no pretenden limitar la secuencia de aminoácidos a la secuencia de aminoácidos nativa completa asociada con la molécula de proteína mencionada.

Un "polinucleótido de fusión de CD74-ROS" se refiere a la secuencia de ácido nucleico de un polinucleótido de fusión o un producto del gen de translocación de CD74-ROS sustancialmente purificado según se describe en la presente, obtenido de cualquier especie, en particular de mamífero, que incluye ganado bovino, ovino, porcino, una especie murina, equina y preferiblemente humana, de cualquier fuente, tanto natural, como sintética, semisintética o recombinante.

Un polipéptido de fusión de CD74-ROS" se refiere a la secuencia de aminoácidos de un polipéptido de fusión de CD74-ROS sustancialmente purificado según se describe en la presente, obtenido de cualquier especie, en particular de mamífero, que incluye ganado bovino, ovino, porcino, una especie murina, equina y preferiblemente humana, de cualquier fuente, tanto natural, como sintética, semisintética o recombinante.

Las expresiones "se une específicamente a" (o "que se une específicamente" o "unión específica"), remitidas a la interacción de un anticuerpo y una proteína o un péptido, significan que la interacción depende de la presencia de una estructura concreta (es decir, el determinante antigénico o epitopo) sobre la proteína; en otras palabras, el anticuerpo reconoce y se une a una estructura de la proteína específica y no a las proteínas en general. La expresión "no se une" con respecto a la unión de un anticuerpo a secuencias o determinantes antigénicos distintos a los que son específicos para él significa que no reacciona sustancialmente con ellos, comparado con la unión del anticuerpo a un determinante antigénico o secuencia para la cual el anticuerpo es específico.

La expresión "condiciones rigurosas" con respecto a las condiciones de hibridación de secuencias o sondas es la "rigurosidad" que se produce dentro de un intervalo de aproximadamente Tm menos 5 °C (5 °C por debajo de la temperatura de fusión (Tm) de la sonda o secuencia) de aproximadamente 20 °C a 25 °C por debajo de la Tm. Las condiciones rigurosas típicas son: una incubación durante la noche a 42 °C en una disolución que comprende: formamida al 50%, SSC 5X (NaCl 750 mM, citrato de trisodio 75 mM), fosfato de sodio 50 mM (pH 7,6), disolución de Denhardt 5X, sulfato de dextrano al 10%, y ADN de esperma de salmón cizallado desnaturalizado 20 microgramos/ml, seguido del lavado de los filtros en SSC 0,1X SSC a aproximadamente 65 °C. Tal como entienden los expertos en la técnica, la rigurosidad de la hibridación puede alterarse para identificar o detectar secuencias polinucleotídicas idénticas o relacionadas.

Un "variante" de un polipéptido de fusión de CD74-ROS se refiere a una secuencia de aminoácidos que se ha alterado en uno o más aminoácidos. El variante puede tener cambios "conservadores", en los que un aminoácido sustituido tiene propiedades estructurales o químicas similares, por ejemplo, la sustitución de leucina por isoleucina. De modo menos común, un variante puede tener cambios "no conservadores", por ejemplo, la sustitución de una glicina por un triptófano. Otras pequeñas variaciones similares pueden incluir deleciones o inserciones de aminoácidos o ambas. Pueden encontrarse indicaciones para determinar cuál resto aminoácido puede sustituirse, insertarse o delecionarse sin abolir la actividad biológica o inmunológica empleando programas informáticos muy conocidos en la técnica, por ejemplo, el software DNASTAR.

A. Identificación de la ROS quinasa mutante en NSCLC humano

La nueva translocación de gen humano descrita en la presente, que se produce entre el cromosoma (5q32) y el cromosoma (6q22) en NSCLC humano y que provoca la expresión de dos proteínas de fusión variantes que combinan el N-terminal (exones 1-6) de CD74 con los dominios transmembrana y quinasa (exones 34-43) de ROS, fue identificada sorprendentemente durante el examen de los perfiles de péptidos fosforilados globales en extractos de un paciente con carcinoma pulmonar no microcítico humano (NSCLC), un subtipo de cáncer de pulmón. Los cromosomas, genes y productos implicados en esta translocación se muestran en la figura 1.

El perfil de fosforilación de esta línea celular se aclaró empleando una técnica recientemente descrita para el aislamiento y la caracterización espectrométrica de masas de péptidos modificados a partir de mezclas complejas (véase la publicación de patente de EEUU n.º 20030044848, Rush et al., "Immunoaffinity Isolation of Modified Peptides from Complex Mixtures" (la técnica "IAP"), tal como se describe más a fondo en el ejemplo 1 de la presente. La aplicación de la técnica IAP empleando un anticuerpo específico de fosfotirosina (CELL SIGNALING TECHNOLOGY, INC., Beverly, MA, 2003/04 n.º de cat. 9411) demostró que un paciente con NSCLC expresa la ROS quinasa (en contraste con la mayoría de los otros pacientes con NSCLC, que no la expresan). La selección

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identificó muchas otras quinasas activadas en este paciente que incluye ROS. Después, el análisis de la secuencia 5' a ROS mediante 5' RACE descubrió que la quinasa estaba fusionada con el N-terminal de CD74 (véase la figura 5).

Tal como se muestra en el panel B de la figura 1, la translocación de CD74-ROS combina el N-terminal de CD74 (aminoácidos 1-208) con los dominios transmembrana y quinasa de ROS (aminoácidos 1853-2347) (véase también SEQ ID NO:1), para producir una fusión (véase el panel C de la figura 1). La translocación conserva el dominio transmembrana más 5' de CD74. Se espera que las proteínas de fusión de CD74-ROS resultantes, que comprenden 703 aminoácidos (véase el panel C de la figura 1 y las figuras 2 (SEQ ID NO:1) conserven la actividad quinasa de ROS.

El perfil de fosfopéptidos global y el análisis FISH de tumores NSCLC humanos indican que un pequeño porcentaje de pacientes de hecho no portan esta mutación (véanse los ejemplos 1 y 3), y estos pacientes pueden beneficiarse de la terapia de inhibidores de ROS.

B. Polinucleótidos aislados

La presente invención proporciona, en parte, polinucleótidos aislados que codifican polipéptidos de fusión de CD74-ROS, sondas de nucleótidos que se hibridan con dichos polinucleótidos, y métodos, vectores y células hospedantes para utilizar dichos polinucleótidos para producir polipéptidos de fusión recombinantes. A menos que se indique lo contrario, todas las secuencias de nucleótidos determinadas mediante la secuenciación de una molécula de ADN en la presente se determinaron empleando un secuenciador de ADN automático (tal como el modelo 373 de Applied Biosystems, Inc.), y todas las secuencias de aminoácidos de los polipéptidos codificados por las moléculas de ADN determinadas en la presente se determinaron utilizando un secuenciador de péptidos automático. Tal como se conoce en la técnica para cualquier secuencia de ADN determinada mediante esta estrategia automática, cualquier secuencia de nucleótidos determinada en la presente puede contener algunos errores. Las secuencias de nucleótidos determinadas mediante un proceso automático generalmente son al menos aproximadamente 90% idénticas, más generalmente de al menos aproximadamente 95% al menos a aproximadamente 99,9% idénticas a la secuencia de nucleótidos real de la molécula de ADN secuenciada. La secuencia real puede determinarse con más precisión mediante otras estrategias, que incluyen métodos de secuenciación de ADN manuales muy conocidos en la técnica. Tal como se conoce también en la técnica, una única inserción o deleción en una secuencia de nucleótidos determinada, comparada con la secuencia real, provocará un desplazamiento de marco en la traducción de la secuencia de nucleótidos, de modo que la secuencia de aminoácidos prevista codificada por una secuencia de nucleótidos determinada será completamente diferente de la secuencia de aminoácidos realmente codificada por la molécula de ADN secuenciada, comenzando en el punto de dicha inserción o deleción. A menos que se indique lo contrario, cada secuencia de nucleótidos indicada en la presente se presenta como una secuencia de desoxirribonucleótidos (abreviados como A, G, C y T). Sin embargo, una "secuencia de nucleótidos" de una molécula de ácido nucleico o polinucleótido significa, para un polinucleótido o molécula de ADN, una secuencia de desoxirribonucleótidos, y para un polinucleótido o molécula de ARN, la correspondiente secuencia de ribonucleótidos (A, G, C y U), en la que cada desoxirribonucleótido de timidina (T) en la secuencia de desoxirribonucleótidos especificada está reemplazada por el ribonucleótido uridina (U). Por ejemplo, la referencia a una molécula de ARN que tenga la secuencia de SEQ ID NO:2 o indicada empleando abreviaturas de desoxirribonucleótidos pretende indicar una molécula de ARN que tiene una secuencia en la que cada desoxirribonucleótido A, G o C de SEQ ID NO:2 ha sido reemplazado por el correspondiente ribonucleótido A, G o C, y cada desoxirribonucleótido T ha sido reemplazado por un ribonucleótido U.

En una realización, la invención proporciona un polinucleótido aislado que comprende una secuencia de nucleótidos al menos 95% idéntica a una secuencia seleccionada del grupo que consiste en: (a) una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido de fusión de CD74-ROS que comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO:1; (b) una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido de fusión de CD74-ROS que comprende la secuencia de aminoácidos N-terminal de CD74 (restos 1-208 de SEQ ID NO:3) y el dominio quinasa de ROS (restos 1945-2222 of SEQ ID NO:5); (c) una secuencia de nucleótidos que comprende la secuencia de nucleótidos N-terminal de CD74 (restos 1-624 de SEQ ID NO:4) y la secuencia de nucleótidos del dominio quinasa de ROS (restos 6032-6865 de SEQ ID NO:6); (d) una secuencia de nucleótidos que comprende al menos seis nucleótidos contiguos que incluyen la zona de unión de la fusión (restos 622-627 de SEQ ID NO:2) de un polinucleótido de fusión de CD74-ROS; (e) una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido que comprende al menos seis aminoácidos contiguos que incluyen la zona de unión de la fusión (restos 208-209 de SEQ ID NO:1) de un polipéptido de fusión de CD74-ROS; y (f) una secuencia de nucleótidos complementaria con cualquiera de las secuencias de nucleótidos de (a)-(e).

Empleando la información proporcionada en la presente, tal como las secuencias de nucleótidos en las figuras 2 (SEQ ID NO:2) puede obtenerse una molécula de ácido nucleico de la presente invención que codifica un polipéptido de ROS mutante de la invención empleando procedimientos de clonación y selección convencionales, tales como los que se emplean para clonar ADNc empleando ARNm como material de partida. El gen de fusión también puede identificarse en bancos de ADNc en otros cánceres o carcinomas de pulmón en los que se produce la translocación de CD74-ROS (Sq32, 6q22), o en los que una deleción o una translocación alternativa provoca la expresión de una ROS quinasa truncada que carece del dominio extracelular de la quinasa de tipo salvaje.

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La presente invención está dirigida también a fragmentos de las moléculas de ácidos nucleicos aisladas descritas en la presente. Un fragmento de un polinucleótido de CD74-ROS o un polinucleótido de ROS truncado de la invención aislados significa fragmentos con una longitud de al menos aproximadamente 15 nucleótidos, y más preferiblemente de al menos aproximadamente 20 nucleótidos, aún más preferiblemente de al menos aproximadamente 30 nucleótidos, y aún más preferiblemente de al menos aproximadamente 40 nucleótidos, que son útiles como cebadores y sondas de diagnóstico según se analiza en la presente. Por supuesto, los fragmentos más grandes con una longitud de aproximadamente 50-1500 nucleótidos también son útiles según la presente invención, así como los fragmentos que se corresponden con la mayor parte, sino toda, de la secuencia de nucleótidos de CD74-ROS del ADNc depositado o tal como se muestra en la figura 2 (SEQ ID NO:2). Un fragmento con una longitud de al menos 20 nucleótidos, por ejemplo, significa fragmentos que incluyen 20 o más bases contiguas de las respectivas secuencias de nucleótidos a partir de las cuales se originan los fragmentos.

La generación de dichos fragmentos de ADN es algo habitual para los expertos en la técnica y puede lograrse, por ejemplo, mediante ruptura con una endonucleasa de restricción o mediante cizallamiento por sonicación de ADN que puede obtenerse del clon de ADNc depositado o sintetizado según la secuencia descrita en la presente. Como alternativa, estos fragmentos pueden generarse directamente de modo sintético.

Las sondas o fragmentos de ácidos nucleicos preferidos de la presente invención incluyen moléculas de ácidos nucleicos que codifican la zona de unión de la fusión de los productos génicos de la translocación de CD74-ROS (véase la figura 1, paneles B y C). Por ejemplo, en ciertas realizaciones preferidas, un polinucleótido aislado de la invención comprende un fragmento/secuencia de nucleótidos que comprende al menos seis nucleótidos contiguos que incluyen la zona de unión de la fusión (restos 622-627 de SEQ ID NO:2) de un polinucleótido de fusión de CD74-ROS. En otra realización preferida, un polinucleótido aislado de la invención comprende un fragmento/secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido que comprende al menos seis nucleótidos contiguos que incluyen la zona de unión de la fusión (restos 208-209 de SEQ ID NO:1) de un polipéptido de fusión de CD74-ROS.

En otro aspecto, la invención proporciona un polinucleótido aislado que se hibrida bajo condiciones de hibridación rigurosas con una porción de un polinucleótido de ROS quinasa mutante de la invención según se describe en la presente. Las "condiciones de hibridación rigurosas" significan una incubación durante toda la noche a 42°C en una disolución que comprende: formamida al 50%, SSC 5X (NaCl 750 mM, citrato de trisodio 75 mM), fosfato de sodio 50 mM (pH 7,6), disolución de Denhardt 5X, sulfato de dextrano al 10%, y ADN de esperma de salmón cizallado desnaturalizado 20 microgramos/ml, seguido del lavado de los filtros en SSC 0,1X SSC a aproximadamente 65 °C.

Un polinucleótido que se hibrida con una "porción" de un polinucleótido significa un polinucleótido (ADN o ARN) que se hibrida con al menos aproximadamente 15 nucleótidos (nt), y más preferiblemente con al menos aproximadamente 20 nt, aún más preferiblemente con al menos aproximadamente 30 nt, y aún más preferiblemente con aproximadamente 30-70 nt del polinucleótido de referencia. Estos son útiles como cebadores y sondas de diagnóstico (por ejemplo, para una PCR) tal como se analizó anteriormente y se analiza con más detalle a continuación.

Por supuesto, los polinucleótidos que se hibridan con una porción más grande del polinucleótido de referencia (por ejemplo, los polinucleótidos de fusión de CD74-ROS maduros descritos en la figura 2 (SEQ ID NO:2), por ejemplo, una porción con una longitud de 50-750 nt, o incluso con la longitud completa del oligonucleótido de referencia, también son útiles como sondas según la presente invención, así como los polinucleótidos que se corresponden con la mayoría, o toda, la secuencia de nucleótidos del ADNc depositado o las secuencias de nucleótidos que aparecen en la figura 2 (SEQ ID NO:2).

Una porción de un polinucleótido con "una longitud de al menos 20 nucleótidos," por ejemplo, significa 20 o más nucleótidos contiguos de la secuencia de nucleótidos del polinucleótido de referencia. Tal como se indica, estas porciones son útiles, desde un punto de vista de diagnóstico, como una sonda según las técnicas de hibridación de ADN convencionales, o como cebadores para la amplificación de una secuencia diana mediante una reacción en cadena de polimerasa (PCR), según se describe, por ejemplo, en MOLECULAR CLONING, A LABORATORY MANUAL, 2ª edición, Sambrook, J., Fritsch, E. F. y Maniatis, T., eds., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989), cuya descripción completa se incorpora en la presente como referencia. Por supuesto, un polinucleótido que se hibrida solo con un tramo de secuencia de poli-A (tal como el tramo de poli(A) 3' terminal de las secuencias de CD74-ROS mostradas en la figura 2 (SEQ ID NO:2) o con un tramo complementario de restos T (o U), no se incluye en un polinucleótido de la invención empleado para hibridarse con una porción de un ácido nucleico de la invención, puesto que dicho polinucleótido se hibrida con cualquier molécula de ácido nucleico que contenga un tramo de poli(A) o con su complemento (por ejemplo, prácticamente cualquier clon de ADNc bicatenario).

Tal como se indicó, las moléculas de ácidos nucleicos de la presente invención, que codifican un polipéptido de ROS quinasa mutante de la invención, pueden incluir, pero no se limitan a las que codifican la secuencia de aminoácidos del polipéptido maduro, por sí solo; la secuencia codificadora del polipéptido maduro y secuencias adicionales, tales como las que codifican la secuencia conductora o secretora, tal como una secuencia de pre-, o pro-o pre-proproteína; la secuencia codificadora del polipéptido maduro, con o sin las secuencias codificadoras adicionales

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mencionadas anteriormente, junto con secuencias no codificadora adicionales, que incluyen, por ejemplo, pero no se limitan a intrones y secuencias 5' y 3' no codificadoras, tales como las secuencias transcritas y no traducidas que desempeñan un papel en la transcripción, el procesamiento del ARNm, que incluye el corte y empalme y las señalas de poliadenilación, por ejemplo, la unión a ribosomas y la estabilidad del ARNm; y una secuencia codificadora adicional que codifica aminoácidos adicionales, tales como los que proporcionan funcionalidades adicionales.

Así, la secuencia que codifica el polipéptido puede condensarse con una secuencia de marcador, tal como una secuencia que codifica un péptido que facilita la purificación del polipéptido fusionado. En ciertas realizaciones preferidas de este aspecto de la invención, la secuencia de aminoácidos del marcador es un péptido de hexahistidina, tal como el marcador proporcionado en un vector pQE (Qiagen, Inc.), entre otros, muchos de los cuales están disponibles en el mercado. Tal como se describe en Gentz et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86:821-824 (1989), por ejemplo, la hexa-histidina proporciona la purificación convencional de la proteína de fusión. El marcador "HA" es otro péptido útil para la purificación que se corresponde con un epitopo derivado de la proteína de hemaglutinina de la gripe, que ha sido descrito por Wilson et al., Cell, 37:767 (1984). Tal como se analiza a continuación, otras proteínas de fusión de este tipo incluyen el propio polipéptido de fusión de CD74-ROS condensado con Fc en el N-o C-terminal.

La presente invención se refiere además a variantes de moléculas de ácidos nucleicos de la presente invención, que codifican porciones, análogos o derivados de un polipéptido de fusión de CD74-ROS o un polipéptido de ROS quinasa truncado descritos en la presente. Pueden producirse variantes de modo natural, tales como un variante alélico natural. Un "variante alélico" es una de varias formas alternativas de ungen que ocupa un locus concreto sobre un cromosoma de un organismo. Véase, por ejemplo, GENES II, Lewin, B., ed., John Wiley & Sons, Nueva York (1985). Pueden producirse otros variantes no naturales empleando técnicas de mutagénesis conocidas en la técnica.

Estos variantes incluyen los producidos por sustituciones, deleciones o adiciones de nucleótidos. Las sustituciones, deleciones o adiciones pueden implicar a uno o más nucleótidos. Los variantes pueden estar alterados en regiones codificadoras, en regiones no codificadoras o en ambas. Las alteraciones en las regiones codificadoras pueden producir sustituciones, deleciones o adiciones de aminoácidos conservadoras o no conservadoras. Entre estas, se prefieren especialmente las sustituciones, adiciones y deleciones silenciosas, que no alteran las propiedades y actividades (por ejemplo, la actividad quinasa) de los polipéptidos de ROS quinasa mutantes descritos en la presente. También se prefieren especialmente, a este respecto, las sustituciones conservadoras.

Otras realizaciones de la invención incluyen polinucleótidos aislados que comprenden una secuencia de nucleótidos al menos 90% idéntica. En algunas realizaciones de la invención, la secuencia de nucleótidos es al menos 95%, 96%, 97%, 98% o 99% idéntica a un polinucleótido de ROS mutante de la invención (por ejemplo, una secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido de fusión de RB-ROS que tiene la secuencia de aminoácidos completa mostrada en la figura 2 (SEQ ID NO:1; o una secuencia de nucleótidos que codifica el N-terminal de CD74 y el dominio quinasa de ROS (véase la figura 1, panel B; y las figuras 3 y 4); o una secuencia de nucleótidos complementaria a dichos ejemplos de secuencias).

Un polinucleótido que tiene una secuencia de nucleótidos al menos, por ejemplo, 95% "idéntica" a una secuencia de nucleótidos de referencia que codifica un polipéptido de ROS quinasa mutante significa que la secuencia de nucleótidos del polinucleótido es idéntica a la secuencia de referencia, excepto que la secuencia polinucleotídica puede incluir hasta cinco mutaciones puntuales por cada 100 nucleótidos de la secuencia de nucleótidos de referencia que codifica el polipéptido de ROS mutante. En otras palabras, para obtener un polinucleótido que tenga una secuencia de nucleótidos al menos 95% idéntica a una secuencia de nucleótidos de referencia, hasta 5% de los nucleótidos en la secuencia de referencia pueden estar delecionados o sustituidos con otro nucleótido, o una serie de nucleótidos hasta 5% de los nucleótidos totales en la secuencia de referencia puede estar insertado en la secuencia de referencia. Estas mutaciones de la secuencia de referencia pueden aparecer en las posiciones 5' terminales de la secuencia de nucleótidos de referencia o en cualquier punto entre estas posiciones terminales, intercaladas de modo individual entre los nucleótidos en la secuencia de referencia o en uno o más grupos contiguos dentro de la secuencia de referencia.

De modo práctico, la determinación de que una molécula de ácido nucleico concreta sea al menos 90%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% idéntica a, por ejemplo, las secuencias de nucleótidos mostradas en la figura 2 (SEQ ID NO:2) o a la secuencia de nucleótidos del clon de ADNc depositado descrito anteriormente puede realizarse de modo convencional empleando programas informáticos conocidos, tales como el programa Bestfit (Wisconsin Sequence Analysis Package, versión 8 para Unix, Genetics Computer Group, University Research Park, 575 Science Drive, Madison, Wis. 53711. El programa Bestfit emplea el algoritmo de homología local de Smith y Waterman, Advances in Applied Mathematics, 2:482-489 (1981), para encontrar el mejor segmento de homología entre dos secuencias. Cuando se emplea Bestfit o cualquier otro programa de alineamiento de secuencias para determinar si una secuencia concreta es, por ejemplo, 95% idéntica a una secuencia de un polinucleótido de fusión de CD74-ROS de referencia según la presente invención, los parámetros se ajustan, por supuesto, de modo que se calcula el porcentaje de identidad a lo largo de la longitud completa de la secuencia de nucleótidos de referencia y se permitan huecos en la homología de hasta 5% del número total de nucleótidos en la secuencia de referencia.

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La presente invención incluye en su alcance moléculas de ácidos nucleicos al menos 90%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% idénticas a las secuencias de ácidos nucleicos mostradas en la figura 2 (SEQ ID NO:2), o a los nucleótidos 625-2172 de SEQ ID NO:2, o a la secuencia de nucleótidos del ADNc depositado, independientemente de que codifiquen un polipéptido que tenga actividad ROS quinasa. Esto es debido a que, incluso si una molécula de ácido nucleico concreta no codifica un polipéptido de fusión que tiene actividad ROS quinasa, los expertos en la técnica aún sabrán cómo emplear la molécula de ácido nucleico, por ejemplo, como una sonda de hibridación o un cebador para la reacción en cadena de polimerasa (PCR). Los usos de las moléculas de ácidos nucleicos de la presente invención que no codifican un polipéptido que tiene actividad quinasa incluyen, entre otros, (1) el aislamiento del gen de translocación de CD74-ROS o sus variantes alélicos en un banco de ADNc; (2) la hibridación in situ (por ejemplo, "FISH") con dispersiones cromosómicas en metafase para proporcionar la localización cromosómica precisa del gen de translocación de CD74-ROS, tal como se describe en Verma et al., HUMAN CHROMOSOMES: A MANUAL OF BASIC TECHNIQUES, Pergamon Press, Nueva York (1988); y un análisis de la transferencia Northern para detectar la expresión del ARNm de la proteína de fusión de CD74-ROS en tejidos específicos.

En la invención también se incluyen moléculas de ácidos nucleicos que tienen secuencias al menos 95% idénticas a un polipéptido de ROS quinasa mutante de la invención o a la secuencia de ácido nucleico del ADNc depositado, que, de hecho, codifican un polipéptido de fusión que tiene actividad ROS quinasa. Esta actividad puede ser similar, pero no necesariamente idéntica, a la actividad de la proteína de fusión de CD74-ROS descrita en la presente (la proteína de longitud completa, la proteína madura o un fragmento de proteína que conserva la actividad quinasa), según se mide en un ensayo biológico concreto. Por ejemplo, la actividad quinasa de ROS puede estudiarse determinando su capacidad para fosforilar uno o más sustratos peptídicos que contienen tirosina, por ejemplo, el "péptido relacionado con Src" (RRLIEDAEYAARG), que es un sustrato para muchas tirosina quinasas de receptores y de no receptores.

Debido a la degeneración del código genético, los expertos en la técnica reconocerán inmediatamente que un gran número de moléculas de ácidos nucleicos que tienen una secuencia al menos 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, o 99% idénticas a la secuencia de ácido nucleico del ADNc depositado o de la secuencia de ácido nucleico mostrada en la figura 2 (SEQ ID NO:2) codificarán un polipéptido de fusión que tenga actividad ROS quinasa. De hecho, puesto que los variantes degenerados de estas secuencias de nucleótidos codifican todos el mismo polipéptido, esto será evidente para los expertos en la técnica incluso si no realizan el ensayo de comparación descrito anteriormente. También se reconoce en la técnica que, para las moléculas de ácidos nucleicos que no son variantes degenerados, un buen número de ellas también codificarán un polipéptido que conserve la actividad ROS quinasa. Esto es debido a que los expertos en la técnica son plenamente conscientes de que es menos probable o no es probable en absoluto que las sustituciones de aminoácidos afecten significativamente a la función de la proteína (por ejemplo, sustituyendo un aminoácido alifático con un segundo aminoácido alifático). Por ejemplo, se proporcionan indicaciones para producir sustituciones de aminoácidos fenotípicamente silenciosas en Bowie et al., "Deciphering the Message in Protein Sequences: Tolerance to Amino Acid Substitutions," Science, 247:1306-1310 (1990), que describe dos estrategias principales para estudiar la tolerancia de una secuencia de aminoácidos a los cambios. Los expertos en la técnica que estén familiarizados con dichas técnicas también apreciarán cuáles son los cambios en los aminoácidos que es posible que puedan realizarse en una posición concreta de la proteína. Por ejemplo, los restos aminoácidos más enterrados requieren cadenas laterales no polares, mientras que, en general, muy pocas características de las cadenas laterales de la superficie se conservan en general. Otras de estas sustituciones fenotípicamente silenciosas se describen en Bowie et al., supra., y en las referencias citadas en esta referencia.

Pueden utilizarse los métodos para la secuenciación del ADN que son muy conocidos y que en general están disponibles en la técnica para poner en práctica cualquiera de las realizaciones de polinucleótidos de la invención. Los métodos pueden emplear enzimas tales como el fragmento de Klenow de la ADN polimerasa I, SEQUENASE® (US Biochemical Corp., Cleveland, Ohio), Taq polimerasa (Perkin Elmer), polimerasa de T7 termoestable (Amersham, Chicago, Ill.), o combinaciones de polimerasas recombinantes y exonucleasas de corrección de lectura, tal como el sistema de amplificación ELONGASE, comercializado por Gibco BRL (Gaithersburg, Md.). Preferiblemente, el proceso es automático y se realiza con máquinas tales como Hamilton Micro Lab 2200 (Hamilton, Reno, Nev.), termociclador Peltier (PTC200, MJ Research, Watertown, Mass.) y los secuenciadores de ADN ABI 377 (Perkin Elmer).

Las secuencias de polinucleótidos que codifican un polipéptido de ROS mutante de la invención pueden extenderse utilizando una secuencia de nucleótidos parcial y empleando diversos métodos conocidos en la técnica para detectar secuencias cadena arriba, tales como promotores y elementos reguladores. Por ejemplo, un método que puede emplearse, la PCR de "sitio de restricción", emplea cebadores universales para recuperar secuencias desconocidas adyacentes a un locus conocido (Sarkar, G., PCR Methods Applic. 2:318-322 (1993)). En particular, el ADN genómico se amplifica primero en presencia de un cebador para la secuencia del conector y un cebador específico para la región conocida. Los ejemplos de cebadores son los que se indican en el ejemplo 4 en la presente. Las secuencias amplificadas después se someten a una segunda ronda de PCR con el mismo cebador del conector y otro cebador específico interno al primero. Los productos de cada ronda de PCR se transcriben con una ARN polimerasa apropiada y se secuencian empleando transcriptasa inversa.

También puede utilizarse una PCR inversa para amplificar o extender secuencias empleando cebadores divergentes basados en una región conocida (Triglia et al., Nucleic Acids Res., 16:8186 (1988)). Los cebadores pueden

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Tal como se indicó, los vectores de expresión incluirán preferiblemente al menos un marcador seleccionable. Estos marcadores incluyen la resistencia a la dihidrofolato reductasa o a la neomicina para un cultivo de células eucariotas, y genes de resistencia a la tetraciclina o la ampicilina para cultivar en E. coli y otras bacterias. Los ejemplos representativos de hospedantes apropiados incluyen, pero no se limitan a células bacterianas, tales como células de

E. coli, Streptomyces y Salmonella typhimurium; células fúngicas, tales como células de levadura; células de insecto, tales como células de Drosophila S2 y Spodoptera Sf9; células animales, tales como células CHO, COS y de melanoma de Bowes; y células vegetales. Los medios de cultivos y las condiciones apropiados para las células hospedantes descritas anteriormente son conocidos en la técnica.

Entre los vectores preferidos para su uso en bacterias se incluyen pQE70, pQE60 y pQE-9, disponibles en Qiagen; vectores pBS, vectores Phagescript, vectores Bluescript, pNH8A, pNH16a, pNH18A, pNH46A, disponibles en Stratagene; y ptrc99a, pKK223-3, pKK233-3, pDR540, pRIT5 disponibles en Pharmacia. Entro los vectores eucariotas preferidos se encuentran pWLNEO, pSV2CAT, pOG44, pXT1 y pSG disponibles en Stratagene; y pSVK3, pBPV, pMSG y pSVL disponibles en Pharmacia. Otros vectores adecuados serán evidentes para los expertos en la técnica.

Entre los promotores bacterianos conocidos adecuados para su uso en la presente invención se incluyen los promotores lacI y lacZ de E. coli, los promotores T3 y T7, el promotor gpt, los promotores lambda PR y PL, y el promotor trp. Los promotores eucariotas adecuados incluyen el promotor temprano inmediato de CMV, el promotor de timidina quinasa de HSV, los promotores temprano y tardío de SV40, los promotores de LTR retrovíricos, tales como el virus del sarcoma de Rous (RSV), y promotores de metalotioneína, tales como el promotor de metalotioneína-I de ratón.

En la levadura Saccharomyces cerevisiae, puede utilizarse una serie de vectores que contienen promotores constitutivos o inducibles, tales como el factor alfa, alcohol oxidasa, y PGH. Para un análisis, véase Ausubel et al. (1989), CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, John Wiley & Sons, Nueva York, N.Y, y Grant et al., Methods Enzymol., 153:516-544 (1997).

La introducción de la construcción en la célula hospedante puede realizarse mediante transfección con fosfato de calcio, transfección mediada por DEAE-dextrano, transfección mediada por lípidos catiónicos, electroporación, transducción, infección u otros métodos. Estos métodos se describen en muchos manuales de laboratorio convencionales, tales como Davis et al., BASIC METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY (1986).

La transcripción del ADN que codifica un polipéptido de fusión de CD74-ROS de la presente invención por eucariotas superiores puede aumentar insertando una secuencia potenciadora en el vector. Los potenciadores son elementos de acción en cis del ADN, que normalmente tienen de aproximadamente 10 a 300 pb que actúan para aumentar la actividad transcripcional de un promotor en un tipo de célula hospedante concreto. Los ejemplos de potenciadores incluyen el potenciador de SV40, que está localizado en el lado tardío del origen de la replicación en las pares de bases 100 a 270, el potenciador del promotor temprano de citomegalovirus, el potenciador de polioma en el lado tardío del origen de la replicación, y los potenciadores de adenovirus.

Para la secreción de la proteína traducida hacia el lumen del retículo endoplásmico, hacia el espacio periplásmico o hacia el entorno extracelular, pueden incorporarse señales de secreción apropiadas en el polipéptido expresado. Las señales pueden ser endógenas al polipéptido o pueden ser señales heterólogas.

El polipéptido puede expresarse en una forma modificada, tal como una proteína de fusión (por ejemplo, una fusión de GST), y puede incluir no solo señales de secreción, sino también regiones funcionales heterólogas adicionales. Por ejemplo, una región de aminoácidos adicionales, en particular aminoácidos cargados, puede añadirse al Nterminal del polipéptido para aumentar la estabilidad y persistencia en la célula hospedante, durante la purificación o durante la posterior manipulación y conservación. Además pueden añadirse restos peptídicos al polipéptido para facilitar la purificación. Estas regiones pueden retirarse antes de la preparación final del polipéptido. La adición de restos peptídicos a los polipéptidos para engendrar la secreción o la excreción, para mejorar la estabilidad y para facilitar la purificación, entre otras cosas, son técnicas familiares y habituales en la técnica. Una proteína de fusión preferida comprende una región heteróloga de una inmunoglobulina que es útil para solubilizar proteínas.

Por ejemplo, el documento EP-A-O 464 533 (homólogo canadiense 2045869) describe proteínas de fusión que comprenden diversas porciones de regiones constantes de moléculas de inmunoglobulina, junto con otra proteína humana o una parte de esta. En muchos casos, la parte Fc en una proteína de fusión es muy ventajosa para su uso en terapia y en diagnóstico, y esto hace que, por ejemplo, imparta unas mejores propiedades farmacocinéticas (documento EP-A 0232 262). Por otra parte, para algunos usos sería deseable poder delecionar la parte Fc después de que la proteína de fusión haya sido expresada, detectada y purificada de la manera ventajosa descrita. Este es el caso en la que la porción Fc demuestra ser un impedimento para su uso en terapia y en diagnóstico, por ejemplo, cuando la proteína de fusión se va a utilizar para inmunizaciones. En el descubrimiento de fármacos, por ejemplo, se han condensado proteínas humanas, tales como hIL5, con porciones Fc para conseguir ensayos de selección de alta capacidad de procesamiento para identificar antagonistas de hIL-5. Véase Bennett et al., Journal of Molecular Recognition, 8:52-58 (1995), y Johanson et al., The Journal of Biological Chemistry, 270 (16): 9459-9471 (1995).

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Los polipéptidos de CD74-ROS pueden recuperarse y purificarse de cultivos de células recombinantes mediante métodos muy conocidos que incluyen precipitación con sulfato de amonio o etanol, extracción con ácidos, cromatografía de intercambio aniónico o catiónico, cromatografía de fosfocelulosa, cromatografía de interacción hidrófoba, cromatografía de afinidad, cromatografía de hidroxilapatito y cromatografía de lectina. Lo más preferiblemente, se emplea la cromatografía líquida de alta resolución ("HPLC") para la purificación. Los polipéptidos de la presente invención incluyen productos naturalmente purificados, productos de procedimientos sintéticos químicos, y productos producidos mediante técnicas recombinantes procedentes de un hospedante procariota o eucariota que incluyen, por ejemplo, células bacterianas, de levadura, de plantas superiores, de insecto y de mamífero. Dependiendo del hospedante empleado en el procedimiento de producción recombinante, los polipéptidos de la presente invención pueden estar glicosilados o no glicosilados. Además, los polipéptidos de la invención también pueden incluir un resto metionina modificado inicial, en algunos casos como resultado de procesos mediados por el hospedante.

Por consiguiente, en una realización, la invención proporciona un método para producir un polipéptido de fusión de CD74-ROS recombinante mediante el cultivo de una célula hospedante recombinante (tal como se describió anteriormente) bajo condiciones adecuadas para la expresión del polipéptido de fusión, y recuperar el polipéptido. Las condiciones de cultivo adecuadas para el crecimiento de células hospedantes y la expresión de polipéptidos recombinantes a partir de dichas células son muy conocidas por los expertos en la técnica. Véase, por ejemplo, CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, Ausubel FM et al., eds., volumen 2, capítulo 16, Wiley Interscience.

D. Polipéptidos aislados

La invención también proporciona, en parte, polipéptidos de fusión de CD74-ROS aislados y sus fragmentos. En una realización, la invención proporciona un polipéptido aislado que comprende una secuencia de aminoácidos al menos 95% a una secuencia seleccionada del grupo que consiste en: (a) una secuencia de aminoácidos que codifica un polipéptido de fusión de CD74-ROS que comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO:1; (b) una secuencia de aminoácidos que codifica un polipéptido de fusión de CD74-ROS que comprende la secuencia de aminoácidos Nterminal de CD74 (restos 1-208 de SEQ ID NO:3) y el dominio quinasa de ROS (restos 1945-2222 of SEQ ID NO:5); y (c) una secuencia de aminoácidos que codifica un polipéptido que comprende al menos seis aminoácidos contiguos que incluyen la zona de unión de la fusión (restos 208-209 de SEQ ID NO:1, o restos 208-209 of SEQ ID NO:3) de un polipéptido de fusión de CD74-ROS.

En una realización preferida, la invención proporciona un polipéptido de fusión de CD74-ROS aislado que tiene la secuencia de aminoácidos codificada por el ADNc depositado descrito anteriormente (ATCC n.º de depósito ***-****). En otra realización preferida, se proporcionan polipéptidos mutantes recombinantes de la invención, que pueden producirse empleando un vector recombinante o una célula hospedante recombinante, tal como se describió anteriormente.

En la técnica se reconoce que algunas secuencias de aminoácidos de un polipéptido de fusión de CD74-ROS pueden varían sin afectar significativamente a la estructura o la función de la proteína mutante. Si se contemplan estas diferencias en la secuencias, no debe olvidarse que existirán áreas críticas sobre la proteína que determinan la actividad (por ejemplo, el dominio quinasa de ROS). En general, es posible reemplazar restos que forman la estructura terciaria, con la condición de que se empleen restos que realicen una función similar. En otros casos, el tipo de resto puede carecer totalmente de importancia si la alteración se produce en una región no crítica de la proteína.

Así, la invención incluye además variaciones de un polipéptido de fusión de CD74-ROS que muestra una actividad ROS quinasa sustancial o que incluye regiones de las proteínas de CD74 y ROS, tal como las porciones de proteínas analizadas a continuación. Estos mutantes incluyen deleciones, inserciones, inversiones, repeticiones, y sustituciones según el tipo (por ejemplo, se sustituye un resto hidrófilo por otro, pero por regla no se sustituye un resto muy hidrófilo por otro muy hidrófobo). Los pequeños cambios o estas sustituciones de aminoácidos "neutras" en general tendrán poco efecto sobre la actividad.

Generalmente se consideran sustituciones conservadoras las sustituciones que se realizan entre los aminoácidos alifáticos Ala, Val, Leu y Ile; el intercambio de los restos hidroxílicos Ser y Thr, el intercambio de los restos ácidos Asp y Glu, la sustitución entre los restos amidícos Asn y Gln, el intercambio de los restos básicos Lys y Arg, y las sustituciones entre los restos aromáticos Phe, Tyr. Los ejemplos de sustituciones de aminoácidos conservadoras conocidas por los expertos en la técnica son: Aromáticos: fenilalanina triptófano tirosina; Hidrófobos: leucina isoleucina valina; Polares: glutamina asparaginas; Básicos: arginina lisina histidina; Ácidos: ácido aspártico ácido glutámico; Pequeños: alanina serina treonina metionina glicina. Tal como se indicó en detalle anteriormente, pueden encontrarse más indicaciones acerca de cuáles son los cambios en los aminoácidos que es probable que sean fenotípicamente silenciosos (es decir, no es probable que tengan un efecto perjudicial sobre una función) en Bowie et al., Science 247, supra.

Los polipéptidos de la presente invención se proporcionan preferiblemente en forma aislada, y preferiblemente están sustancialmente purificados. Una versión producida de modo recombinante de un polipéptido de fusión de CD74

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en la técnica y ha sido descrito. Véase, por ejemplo, la publicación de patente de EEUU n.º 20050214301, Wetzel et al., 29 de septiembre, 2005.

Los anticuerpos específicos del polipéptido de fusión útiles en los métodos de la invención pueden mostrar cierta reactividad cruzada limitada con epitopos de fusión similares en otras proteínas de fusión o con los epitopos en CD74 de tipo salvaje y ROS de tipo salvaje que forman la zona de unión de la fusión. Esto no resulta inesperado, puesto que la mayoría de los anticuerpos muestran un cierto grado de reactividad cruzada, y los anticuerpos antipéptidos a menudo presentan reacción cruzada con epitopos que tengan una alta homología o identidad con el péptido inmunizante. Véase, por ejemplo, Czernik, supra. la reactividad cruzada con otras proteínas de fusión puede caracterizarse con facilidad mediante un análisis de la transferencia Western junto con marcadores de peso molecular conocido. Las secuencias de aminoácidos de las proteínas de reactividad cruzada pueden estudiarse para identificar los sitios altamente homólogos o idénticos a la secuencia del polipéptido de fusión de CD74-ROS con la que se une el anticuerpo. La reactividad cruzada no deseable puede eliminarse mediante una selección negativa realizando la purificación del anticuerpo en columnas de péptidos (por ejemplo, seleccionando los anticuerpos que se unen a CD74 de tipo salvaje y/o ROS de tipo salvaje).

Los anticuerpos específicos del polipéptido de fusión de CD74-ROS de la invención que son útiles para practicar los métodos descritos en la presente son específicos, de modo ideal, para un polipéptido de fusión humano, pero no se limitan a la unión a la especie humana, per se. La invención incluye la producción y el uso de anticuerpos que también se unen a epitopos conservados e idénticos o altamente homólogos en otras especies de mamífero (por ejemplo, ratón, rata, mono). Las secuencias idénticas o altamente homólogas en otras especies pueden identificarse con facilidad mediante comparaciones de secuencias patrón, tal como el empleo de BLAST, con las secuencias del polipéptido de fusión de CD74-ROS humano descritas en la presente (SEQ ID NO:1).

Los anticuerpos empleados en los métodos de la invención también pueden caracterizarse y validarse para su uso en un formato de ensayo concreto, por ejemplo, FC, IHC, y/o ICC. El uso de anticuerpos específicos del polipéptido de fusión de CD74-ROS en estos métodos se describe más a fondo en la siguiente sección F. Los anticuerpos también pueden conjugarse, de forma ventajosa, con tintes fluorescentes (por ejemplo, Alexa488, PE), o marcadores, tales como puntos cuánticos, para su uso en análisis multiparamétricos, junto con otros anticuerpos de transducción de señales (fosfo-AKT, fosfo-Erk 1/2) y/o de marcadores celulares (citoqueratina), tal como se describe más fondo en la siguiente sección F.

En la práctica de los métodos de la invención, la expresión y/o actividad de CD74 de tipo salvaje y/o ROS de tipo salvaje en una muestra biológica concreta también puede estudiarse de modo ventajoso empleando anticuerpos (fosfoespecíficos o totales) para estas proteínas de tipo salvaje. Por ejemplo, están disponibles en el mercado anticuerpos específicos del sitio de fosforilación del receptor CSF (véase CELL SIGNALING TECHNOLOGY, INC., Beverly MA, 2005/06 n.º de catálogo 3151, 3155, y 3154; y Upstate Biotechnology, 2006 n.º de catálogo 06-457). Estos anticuerpos también pueden producirse según métodos convencionales, tal como se describió anteriormente. Las secuencias de aminoácidos de CD74 y ROS humanas están publicadas (véanse las figuras 3 y 4, y los n.os de registro de SwissProt referidos), así como las secuencias de estas proteínas de otras especies.

La detección de la expresión y/o activación de CD74 de tipo salvaje y ROS de tipo salvaje, junto con la expresión del polipéptido de fusión de CD74-ROS, en una muestra biológica (por ejemplo, una muestra de tumor) puede proporcionar información sobre si la proteína de fusión, por sí sola, está dirigiendo al tumor, o si ROS de tipo salvaje también está activada y dirigiendo al tumor. Esta información resulta clínicamente útil para evaluar si es más probable que el transporte dirigido de la proteína de fusión o la proteína o proteínas de tipo salvaje, o ambas, sea más beneficioso para inhibir el avance del tumor, y para seleccionar un producto terapéutico apropiado o una de sus combinaciones. Los anticuerpos específicos para el dominio extracelular de ROS quinasa de tipo salvaje, que no está presente en la ROS quinasa truncada descrita en la presente, puede ser particularmente útil para determinar la presencia/ausencia de la ROS quinasa mutante.

Se entenderá que puede utilizarse más de un anticuerpo en la práctica de los métodos descritos anteriormente. Por ejemplo, uno o más anticuerpos específicos del polipéptido de fusión de CD74-ROS,junto con uno o más anticuerpos específicos para otra quinasa, receptor o sustrato de quinasa que es sospechoso de estar activado, o que potencialmente está activado, en un cáncer en el que se expresa un polipéptido de fusión de CD74-ROS, pueden emplearse simultáneamente para detectar la actividad de estas otras moléculas de señalización en una muestra biológica que comprende células de dicho cáncer.

Los expertos en la técnica apreciarán que los polipéptidos de fusión de CD74-ROS de la presente invención y sus fragmentos que portan epitopos de la zona de unión de la fusión descritos anteriormente pueden combinarse con partes del dominio constante de inmunoglobulinas (IgG), produciendo polipéptidos quiméricos. Estas proteínas de fusión facilitan la purificación y muestran una mayor semivida in vivo. Esto se ha demostrado, por ejemplo, para proteínas quiméricas que consisten en los primeros dos dominios del polipéptido CD4 humano y diversos dominios de las regiones constantes de las cadenas pesada o ligera de inmunoglobulinas humanas (documento EPA 394.827; Traunecker et al., Nature, 331:84-86 (1988)). Las proteínas de fusión que tienen una estructura dimérica unida mediante enlace disulfuro debido a la parte IgG también pueden ser más eficaces para unirse y neutralizar otras

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moléculas aparte de solo el polipéptido de fusión de CD74-ROS monomérico (Fountoulakis et al., J. Biochem., 270:3958-3964 (1995)).

Péptidos marcados con isótopos pesados (péptidos AQUA)

Los reactivos específicos del polipéptido de fusión de CD74-ROS útiles en la práctica de los métodos descritos también pueden comprender péptidos marcados con isótopos pesados adecuados para la cuantificación absoluta del polipéptido de fusión de CD74-ROS expresado en una muestra biológica. Se ha descrito la producción y el uso de péptidos AQUA para la cuantificación absoluta de proteínas (AQUA) en mezclas complejas. Véase el documento WO/03016861, "Absolute Quantification of Proteins and Modified Forms Thereof by Multistage Mass Spectrometry," Gygi et al., y también Gerber et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 100:6940-6945 (2003) (cuyas enseñanzas se incorporan a la presente como referencia en su totalidad).

La metodología AQUA emplea la introducción de una cantidad conocida de al menos un patrón de un péptido marcado con un isótopo pesado (que tiene una firma exclusiva que puede detectarse mediante una cromatografía LC-SRM) en una muestra biológica digerida para determinar, mediante la comparación con el patrón de péptido, la cantidad absoluta de un péptido con la misma secuencia y modificación de proteína en la muestra biológica. Brevemente, la metodología AQUA tiene dos etapas: la selección y validación del patrón interno del péptido, y el desarrollo del método; y la aplicación empleando patrones internos de péptidos validados para detectar y cuantificar una proteína diana en una muestra. El método es una técnica poderosa para detectar y cuantificar un péptido/proteína concreto dentro de una mezcla biológica compleja, tal como un lisado de células, y puede emplearse, por ejemplo, para cuantificar el cambio en la fosforilación de proteínas que resulta del tratamiento con un fármaco, o para cuantificar diferencias en el nivel de una proteína en estados biológicos diferentes.

En general, para desarrollar un patrón interno adecuado, se elige un péptido concreto (o un péptido modificado) dentro de una secuencia de proteína diana basándose en su secuencia de aminoácidos y de la proteasa concreta que se va a utilizar para la digestión. Después se genera el péptido mediante una síntesis peptídica en fase sólida de modo que un resto es reemplazado por el mismo resto que contiene isótopos estables (13C, 15N). El resultado es un péptido que es químicamente idéntico a su homólogo nativo formado por proteólisis, pero que puede distinguirse con facilidad mediante MS a través de un desplazamiento de masas de 7-Da. El péptido de patrón interno AQUA recién sintetizado después se evalúa mediante LC-MS/MS. Este proceso proporciona información cualitativa acerca de la retención del péptido mediante cromatografía de fase inversa, eficacia de ionización, y fragmentación mediante disociación inducida por colisión. Se eligen los fragmentos de iones informativos y abundantes para conjuntos de péptidos de patrón interno y nativos, y después se controlan específicamente en sucesión rápida como una función de la retención cromatográfica para formar un método de control de reacción seleccionado (LC-SRM) basado en el perfil exclusivo del patrón de péptido.

La segunda etapa de la estrategia AQUA es su aplicación para medir la cantidad de una proteína o una proteína modificada en mezclas complejas. Los lisados de células completas generalmente se fraccionan mediante una electroforesis en gel de SDS-PAGE, y las regiones del gel coherentes con la migración de las proteínas se cortan y se retiran. A este proceso le sigue una proteólisis en gel en presencia de los péptidos AQUA y un análisis LC-SRM (véase Gerber et al., supra.) Los péptidos AQUA se siembran en la mezcla de péptidos compleja obtenida mediante la digestión del lisado de células completas con una enzima proteolítica y se someten a una purificación por inmunoafinidad tal como se describió anteriormente. El tiempo de retención y el patrón de fragmentación del péptido nativo formado mediante digestión (por ejemplo, tripsinización) es idéntico al del péptido de patrón interno AQUA determinado previamente; así, un análisis de LC-MS/MS empleando un experimento SRM resulta en una medición muy sensible y específica del patrón interno y del analito directamente a partir de mezclas de péptidos extremadamente complejas.

Puesto que se añade una cantidad absoluta del péptido AQUA (por ejemplo, 250 fmol), la proporción de las áreas bajo la curva puede utilizarse para determinar los niveles de expresión precisos de una proteína o una forma fosforilada de una proteína en el lisado de células original. Además, el patrón interno está presente durante la digestión en gel a medida que se forman los péptidos nativos, de modo que la eficacia de la extracción de los péptidos de los trozos de gel, las pérdidas absolutas durante la manipulación de la muestra (incluyendo la centrifugación al vacío), y la variabilidad durante la introducción en el sistema LC-MS no afecta a la proporción determinada de abundancias del péptido nativo y péptido AQUA.

Se desarrolla un patrón de péptido AQUA para una secuencia conocida previamente identificada mediante el método IAP-LC-MS/MS dentro de una proteína diana. Si el sitio se modifica, puede desarrollarse un péptido AQUA que incorpore la forma modificada del resto concreto dentro del sitio, y puede desarrollarse un segundo péptido AQUA que incorpore la forma no modificada del resto. De esta forma, los dos patrones pueden emplearse para detectar y cuantificar las formas modificadas y no modificadas del sitio en una muestra biológica.

También pueden generarse patrones internos de péptidos estudiando la secuencia de aminoácidos primaria de una proteína y determinando los límites de los péptidos producidos mediante ruptura con proteasas. Como alternativa, una proteína puede digerirse realmente con una proteasa y después puede secuenciarse un fragmento peptídico concreto producido. Las proteasas adecuadas incluyen, pero no se limitan a serina proteasas (por ejemplo, tripsina,

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hepsina), metaloproteasas (por ejemplo, PUMP1), quimotripsina, catepsina, pepsina, termolisina, carboxipeptidasas, etc.

Se selecciona una secuencia peptídica dentro de una proteína diana según uno o más criterios para optimizar el uso del péptido como patrón interno. Preferiblemente, el tamaño del péptido se selecciona para minimizar las probabilidades de que la secuencia peptídica se repita en otro punto en otras proteínas que no son la diana. Así, un péptido tiene preferiblemente al menos aproximadamente 6 aminoácidos. El tamaño del péptido también se optimiza para maximizar la frecuencia de ionización. Así, no se prefieren los péptidos más largos que aproximadamente 20 aminoácidos. El intervalo preferido es de aproximadamente 7 a 15 aminoácidos. También se selecciona la secuencia del péptido que no es probable que sea químicamente reactiva durante la espectrometría de masas, y así se evitan secuencias que comprendan cisteína, triptófano o metionina.

Puede seleccionarse una secuencia peptídica que no incluya una región modificada de la región diana, de modo que el patrón interno de péptido puede utilizarse para determinar la cantidad de todas las formas de la proteína. Como alternativa, un patrón interno de péptido que incluya un aminoácido modificado puede ser deseable para detectar y cuantificar solo la forma modificada de la proteína diana. Los patrones de péptidos para las regiones modificadas y no modificadas pueden utilizarse juntos, para determinar el grado de modificación en una muestra concreta (es decir, para determinar cuál es la fracción de la cantidad total de proteína que está representada por la forma modificada). Por ejemplo, pueden utilizarse patrones de péptidos para la forma fosforilada y no fosforilada de una proteína que se sabe que está fosforilada en un sitio concreto, para cuantificar la cantidad de forma fosforilada en una muestra.

El péptido se marca empleando uno o más aminoácidos marcados (es decir, el marcador es una parte real del péptido) o, menos preferiblemente, los marcadores pueden unirse después de la síntesis según métodos convencionales. Preferiblemente, el marcador es un marcador que altera la masa basándose en las siguientes consideraciones: la masa debe ser exclusiva para las masas de los fragmentos de desplazamiento producidos mediante el análisis MS con regiones del espectro con bajo fondo; el componente de firma de masas iónicas es la porción del resto marcador que preferiblemente muestra una firma de masa iónica exclusiva en el análisis MS; la suma de las masas de los átomos constituyentes del marcador preferiblemente es exclusivamente diferente de los fragmentos de todos los posibles aminoácidos. Como resultado, los péptidos y aminoácidos marcados pueden distinguirse con facilidad de los no marcados por el patrón de iones/masas en el espectro de masas resultante. Preferiblemente, el componente de firma de masas iónicas imparte una masa a un fragmento de proteína que no se corresponde con la masa del resto para ninguno de los 20 aminoácidos naturales.

El marcador debe ser robusto bajo las condiciones de fragmentación de MS y no sufrir una fragmentación desfavorable. La química de marcaje debe ser eficaz bajo una serie de condiciones, en particular condiciones desnaturalizantes, y el marcador marcado preferiblemente permanece soluble en el sistema de tampón de MS elegido. El marcador preferiblemente no suprime la eficacia de ionización de la proteína y no es químicamente reactivo. El marcador puede contener una mezcla de dos o más especies isotópicamente diferenciadas para generar un patrón espectrométrico de masas exclusivo en cada posición del fragmento marcada. Los isótopos estables, tales como 2H, 13C, 15N, 17O, 18O, o 34S, están entre los marcadores preferidos. También pueden prepararse parejas de patrones internos de péptidos que incorporen un marcador de isótopo diferente. Los restos aminoácidos preferidos en los que puede incorporarse un marcador de isótopo pesado incluyen leucina, prolina, valina, y fenilalanina.

Los patrones internos de péptidos se caracterizan según su proporción de masa a carga (m/z) y, preferiblemente, también según su tiempo de retención en una columna cromatográfica (por ejemplo, una columna de HPLC). Los patrones internos que coeluyen con péptidos no marcados de secuencia idéntica se seleccionan como los patrones internos óptimos. El patrón interno después se analiza mediante la fragmentación del péptido por cualquier medio adecuado, por ejemplo, mediante disociación inducida por colisión (CID) empleando, por ejemplo, argón o helio como gas de colisión. Los fragmentos después se analizan, por ejemplo, mediante una espectrometría de masas de múltiples etapas (MSn) para obtener un espectro iónico del fragmento, para obtener una firma de fragmentación del péptido. Preferiblemente, los fragmentos peptídicos tienen diferencias significativas en las proporciones de m/z para que los picos que se corresponden con cada fragmento estén bien separados, y se obtiene una firma que es exclusiva para el péptido diana. Si no se obtiene una firma del fragmento adecuada en la primera etapa se realizan más etapas de la MS hasta que se obtenga una firma exclusiva.

Los iones del fragmento en los espectros de MS/MS y MS3 generalmente son muy específicos para el péptido de interés y, junto con los métodos de LC, permiten un medio muy selectivo para detectar y cuantificar un péptido/proteína diana en una mezcla de proteínas compleja, tal como un lisado de células, que contiene muchos miles o decenas de miles de proteínas. Puede ensayarse cualquier muestra biológica que contenga potencialmente una proteína/péptido diana de interés. Preferiblemente se emplean extractos de células brutos o parcialmente purificados. En general, la muestra contiene al menos 0,01 mg de proteínas, generalmente una concentración de 0,1-10 mg/ml, y puede ajustarse a un pH y concentración del tampón deseados.

Después se añade una cantidad conocida de un patrón interno de péptido marcado, preferiblemente aproximadamente 10 femtomoles, que se corresponde con una proteína diana que va a detectarse/cuantificarse, a una muestra biológica, tal como un lisado de células. La muestra sembrada después se digiere con una o más

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También pueden emplearse ensayos de inmunofluorescencia (IF) para determinar el estado de expresión y/o activación de un polipéptido de fusión de CD74-ROS en un cáncer de mamífero antes, durante y después de un tratamiento con un fármaco dirigido a la inhibición de la actividad ROS quinasa. La IF puede realizarse según técnicas muy conocidas. Véase, por ejemplo, J.M. Polak y S. Van Noorden (1997), INTRODUCTION TO IMMUNOCYTOCHEMISTRY, 2ª ed.; ROYAL MICROSCOPY SOCIETY MICROSCOPY HANDBOOK, 37, BioScientific/Springer-Verlag. Brevemente y como ejemplo, pueden fijarse muestras de pacientes en paraformaldehído, seguido de metanol, bloquearse con disolución de bloqueo, tal como suero de caballo, incubarse con el anticuerpo primario contra el polipéptido de fusión de CD74-ROS, seguido de un anticuerpo secundario marcado con un tinte fluorescente, tal como Alexa 488, y analizarse con un microscopio epifluorescente.

Los anticuerpos empleados en los ensayos descritos anteriormente pueden conjugarse, de forma ventajosa, con tintes fluorescentes (por ejemplo, Alexa488, PE), u otros marcadores, tales como puntos cuánticos, para su uso en análisis multiparamétricos, junto con otros anticuerpos de transducción de señales (EGFR, fosfo-AKT, fosfo-Erk 1/2) y/o de marcadores celulares (citoqueratina).

En la técnica se conoce una diversidad de otros protocolos, que incluyen el ensayo inmunoadsorbente ligado a enzimas (ELISA), radioinmunoensayos (RIA), y clasificación celular activada por fluorescencia (FACS), para medir los polipéptidos de ROS quinasa mutantes, y proporcionan una base para diagnosticar los niveles alterados o anómalos de la expresión del polipéptido de fusión de CD74-ROS. Los valores normales o patrón para la expresión del polipéptido de fusión de CD74-ROS se establecen combinando fluidos corporales o extractos celulares obtenidos de sujetos mamíferos normales, preferiblemente seres humanos, con un anticuerpo contra el polipéptido de fusión de CD74-ROS bajo condiciones adecuadas para la formación de complejos. La cantidad de formación de complejo de patrón puede cuantificarse mediante diversos métodos, pero preferiblemente por medios fotométricos. Las cantidades del polipéptido de fusión de CD74-ROS expresado en muestras del sujeto, control y de enfermedad procedentes de tejido de biopsia se comparan con los valores de los patrones. La desviación entre los valores de los patrones y del sujeto establece los parámetros para diagnosticar la enfermedad.

Ensayos de péptidos y nucleótidos

De modo similar, pueden prepararse péptidos AQUA para la detección/cuantificación del polipéptido de ROS mutante expresado en una muestra biológica que comprende células procedentes de un tumor y emplearse en ensayos AQUA convencionales, tal como se describió en detalle en la anterior sección E. Por consiguiente, en algunas realizaciones preferidas de los métodos de la invención, el reactivo específico del polipéptido de fusión de CD74-ROS comprende un fosfopéptido marcado con un isótopo pesado (péptido AQUA) que se corresponde con una secuencia del péptido que comprende la zona de unión de fusión del polipéptido de fusión de CD74-ROS, según se describió en la anterior sección E.

Los reactivos específicos del polipéptido de ROS quinasa mutante útiles para la práctica de los métodos de la invención también pueden ser sondas de ARNm, de oligonucleótidos o de ADN que se hibridan directamente y detectan las transcripciones de expresión del polipéptido de fusión o truncado en una muestra biológica. Estas sondas se analizaron en detalle en la anterior sección B. Brevemente y como ejemplo, muestras de pacientes introducidas en parafina y fijadas en formaldehído puede sondarse con una sonda de ARN marcada con fluoresceína, seguido de lavados con formamida, SSC y PBS, y de un análisis con un microscopio fluorescente.

También pueden emplearse polinucleótidos que codifican un polipéptido de ROS quinasa mutante para objetivos de diagnóstico. Los polinucleótidos que pueden emplearse incluyen secuencias oligonucleotídicas, moléculas de ADN y ARN antisentido, y PNA. Los polinucleótidos pueden emplearse para detectar y cuantificar la expresión génica en tejidos de biopsia, en los que la expresión de un polipéptido de fusión de CD74-ROS o un polipéptido de ROS truncado puede correlacionarse con una enfermedad. El ensayo de diagnóstico puede emplearse para distinguir entre la ausencia, la presencia y el exceso de expresión del polipéptido de fusión de CD74-ROS, y para controlar la regulación de los niveles del polipéptido de fusión de CD74-ROS durante una intervención terapéutica.

En una realización preferida, la hibridación con sondas de PCR que son capaces de detectar secuencias de polinucleótidos, que incluyen secuencias genómicas, que codifican el polipéptido de fusión de CD74-ROS o el polipéptido de ROS quinasa truncado, o moléculas muy relacionadas, puede emplearse para identificar secuencias de ácidos nucleicos que codifican un polipéptido de ROS mutante. La construcción y el uso de dichas sondas se describió en la anterior sección B. La especificidad de la sonda, tanto si se prepara a partir de una región muy específica, por ejemplo, 10 nucleótidos exclusivos en la zona de unión de la fusión, o una región menos específica, por ejemplo, la región codificadora 3', y la rigurosidad de la hibridación o la amplificación (máxima, alta, intermedia o baja) determinará si la sonda identifica solo secuencias naturales que codifican el polipéptido de ROS quinasa mutante, alelos, o secuencias relacionadas.

Las sondas también pueden emplearse para la detección de secuencias relacionadas, y preferiblemente deben contener al menos 50% de los nucleótidos de cualquiera de las secuencias que codifican el polipéptido de ROS mutante. Las sondas de hibridación de la presente invención pueden ser ADN o ARN y derivarse de las secuencias de nucleótidos de SEQ ID NO:2 , y lo más preferiblemente incluyen la zona de unión de la fusión, o derivarse de la

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secuencia genómica que incluye promotores, elementos de potenciadores, e intrones de los polipéptidos de CD74 y ROS naturales, tal como se describió más a fondo en la anterior sección B.

Puede utilizarse un polinucleótido de fusión de CD74-ROS o un polinucleótido de ROS truncado de la invención en un análisis de la transferencia Southern o Northern, una transferencia de puntos, u otras tecnologías basadas en membranas; en tecnologías de PCR; o en ensayos de inmersión de bastones, varillas, ELISA o chips que utilicen fluidos o tejidos procedentes de biopsias de pacientes para detectar una expresión alterada del polipéptido de ROS quinasa mutante. Estos métodos cualitativos o cuantitativos son muy conocidos en la técnica. En un aspecto concreto, las secuencias de nucleótidos que codifican el polipéptido de ROS mutante pueden ser útiles en ensayos que detectan la activación o la inducción de diversos cánceres, que incluyen cánceres de pulmón, que incluyen NSCLC. Los polinucleótidos de ROS mutante pueden marcarse por métodos convencionales y añadirse a una muestra de fluido o tejido procedente de un paciente bajo condiciones adecuadas para la formación de complejos de hibridación. Después de un periodo de incubación adecuado, la muestra se lava y la señal se cuantifica y se compara con un valor patrón. Si la cantidad de la señal en la muestra de biopsia o extraída se encuentra alterada significativamente con respecto a la de una muestra control comparable, las secuencias de nucleótidos se han hibridado con las secuencias de nucleótidos en la muestra, y la presencia de niveles alterados de secuencias de nucleótidos que codifican el polipéptido de fusión de CD74-ROS o el polipéptido de ROS quinasa truncado en la muestra indica la presencia de la enfermedad asociada. Estos ensayos también pueden utilizarse para evaluar la eficacia de un régimen de tratamiento terapéutico concreto en estudios animales, en ensayos clínicos, o para el control del tratamiento de un paciente individual.

Para proporcionar una base para el diagnóstico de una enfermedad caracterizada por la expresión de un polipéptido de ROS mutante, se establece un perfil normal o patrón para la expresión. Esto puede lograrse combinando fluidos corporales o extractos celulares tomados de sujetos normales, animales o humanos, con una secuencia, o uno de sus fragmentos, que codifica el polipéptido de fusión de CD74-ROS o el polipéptido de ROS quinasa truncado, bajo condiciones adecuadas para la hibridación o la amplificación. La hibridación patrón puede cuantificarse comparando los valores obtenidos de sujetos normales con los de un experimento en el que se emplea una cantidad conocida de un polinucleótido sustancialmente purificado. Los valores patrón obtenidos de las muestras normales pueden compararse con los valores obtenidos de muestras de pacientes que son sintomáticos para la enfermedad. Se emplea la desviación entre los valores patrón y del sujeto para establecer la presencia de enfermedad.

Tras haber establecido la enfermedad e iniciar un protocolo de tratamiento, los ensayos de hibridación pueden repetirse de modo regular para evaluar si el nivel de expresión en el paciente empieza a aproximarse al observado en el paciente normal. Los resultados obtenidos de ensayos sucesivos pueden emplearse para demostrar la eficacia del tratamiento a lo largo de un periodo de varios días a meses.

Otros usos de diagnóstico para los polinucleótidos de ROS mutante de la invención pueden implicar el uso de la reacción en cadena de polimerasa (PCR), otro formato de ensayo preferido que emplean habitualmente los expertos en la técnica. Véase, por ejemplo, MOLECULAR CLONING, A LABORATORY MANUAL, 2ª edición, Sambrook, J., Fritsch, E. F. y Maniatis, T., eds., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989). Los oligómeros de la PCR pueden sintetizarse de modo químico, generarse de modo enzimático, o producirse a partir de una fuente recombinante. Los oligómeros consistirán preferiblemente en dos secuencias de nucleótidos, una con la orientación sentido (5' a 3') y otra con la orientación antisentido (3' a 5'), y se emplean bajo condiciones optimizadas para la identificación de un trastorno o gen específico. Los mismos dos oligómeros, conjuntos anidados de oligómeros, o incluso una agrupación degenerada de oligómeros pueden emplearse bajo condiciones menos rigurosas para la detección y/o cuantificación de secuencias de ADN o ARN muy relacionadas.

Los métodos que también pueden utilizarse para cuantificar la expresión del polipéptido de fusión de CD74-ROS o del polipéptido de ROS quinasa truncado incluyen el marcaje radiactivo o los nucleótidos biotinilados, la coamplificación de un ácido nucleico control, y curvas patrón en las que se interpolan los resultados experimentales (Melby et al., J. Immunol. Methods, 159:235-244 (1993); Duplaa et al., Anal. Biochem., 229-236 (1993)). La velocidad de cuantificación de múltiples muestras puede acelerarse realizando el ensayo en un formato ELISA, en el que el oligómero de interés se presenta en diversas diluciones, y una respuesta espectrofotométrica o colorimétrica proporciona una cuantificación rápida.

En otra realización de la invención, los polinucleótidos de ROS mutantes de la invención pueden utilizarse para generar sondas de hibridación que son útiles para cartografiar la secuencia genómica natural. Las secuencias pueden cartografiarse en un cromosoma concreto o en una región específica del cromosoma empleando técnicas muy conocidas. Estas técnicas incluyen hibridación in situ de fluorescencia (FISH), FACS, o construcciones de cromosomas artificiales, tales como cromosomas artificiales de levadura, cromosomas artificiales bacterianos, construcciones P1 bacterianas o bancos de ADNc de cromosomas individuales, tal como se describe en Price, C. M., Blood Rev., 7:127-134 (1993); y Trask, B. J., Trends Genet., 7:149-154 (1991).

En una realización preferida se emplea FISH (según se describe en Verma et al., HUMAN CHROMOSOMES:A MANUAL OF BASIC TECHNIQUES, Pergamon Press, Nueva York, N.Y. (1988)), y puede correlacionarse con otras técnicas de cartografiado de cromosomas físicas y datos de mapas genéticos. Pueden encontrarse ejemplos de datos de mapas genéticos en the 1994 Genome Issue of Science (265:1981f). La correlación entre la localización del

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productos terapéuticos que actúan directamente sobre la propia ROS quinasa, o sobre proteínas o moléculas que modifican la actividad de ROS, o que actúan indirectamente inhibiendo la expresión de ROS. Estas composiciones también incluyen composiciones que comprenden solo un único compuesto inhibidor de ROS quinasa, así como composiciones que comprenden múltiples productos terapéuticos (que incluyen productos contra otras RTK), que también pueden incluir un agente terapéutico no específico, tal como un agente quimioterapéutico o un inhibidor de la transcripción general.

Inhibidores de molécula pequeña

En algunas realizaciones preferidas, un producto terapéutico inhibidor de ROS útil en la práctica de los métodos de la invención es un inhibidor de molécula pequeña dirigido. Los inhibidores dirigidos de molécula pequeña son una clase de moléculas que generalmente inhiben la actividad de su enzima diana uniéndose de forma específica, y a menudo irreversible, con el sitio catalítico de la enzima y/o uniéndose a una hendidura de unión a ATP u otro sitio de unión dentro de la enzima que evite que la enzima adopte una conformación necesaria para su actividad. Un ejemplo de inhibidor de quinasa dirigido de molécula pequeña es Gleevec® (Imatinib, STI-571), que inhibe CSF1R y BCR-ABL, y sus propiedades han sido bien descritas. Véase, Dewar et al., Blood, 105(8):3127-3132 (2005).

Los inhibidores de molécula pequeña pueden diseñarse de modo lógico empleando la formación de modelos informáticos o cristalográficos de rayos X de la estructura tridimensional de ROS quinasa, o pueden encontrarse a través de una selección de alta capacidad de procesamiento de bancos de compuestos para la inhibición de ROS. Estos métodos son muy conocidos en la técnica y han sido descritos. La especificidad de la inhibición de ROS puede confirmarse, por ejemplo, estudiando la capacidad de dicho compuesto para inhibir la actividad ROS, pero no otra actividad quinasa, en un panel de quinasas, y/o estudiando la inhibición de la actividad ROS en una muestra biológica que comprende células de tumor NSCLC, tal como se describió anteriormente. Estos métodos de selección se describen con más detalle a continuación.

Inhibidores de anticuerpos

Los productos terapéuticos inhibidores de ROS quinasa útiles en los métodos de la invención también pueden ser anticuerpos dirigidos que se unen específicamente a dominios o sitios catalíticos o de unión críticos necesarios para la actividad ROS, e inhiben la quinasa bloqueando el acceso de ligandos, sustratos o moléculas secundarias y/o evitando que la enzima adopte una conformación necesaria para su actividad. La producción, selección y uso terapéutico de anticuerpos específicos de dianas humanizados ha sido bien descrito. Véase, Merluzzi et al., Adv. Clin. Path., 4 (2):77-85 (2000). Están disponibles sistemas y tecnologías comerciales, tales como Morphosys, Inc.'s Human Combinatorial Antibody Library (HuCAL®), para la generación y selección de alta capacidad de procesamiento de anticuerpos inhibidores específicos de diana humanizados.

La producción de diversos anticuerpos dirigidos anti-receptores de quinasas y su uso para inhibir la actividad del receptor diana se ha descrito. Véase, por ejemplo, la publicación de patente de EEUU n.º 20040202655, "Antibodies to IGF-I Receptor for the Treatment of Cancers," 14 de octubre, 2004, Morton et al.; la publicación de patente de EEUU n.º 20040086503, "Human anti-Epidermal Growth Factor Receptor Single-Chain Antibodies," 15 de abril, 2004, Raisch et al.; la publicación de patente de EEUU n.º 20040033543, "Treatment of Renal Carcinoma Using Antibodies Against the EGFr," 19 de febrero, 2004, Schwab et al. En la técnica se conocen métodos estandarizados para producir y utilizar anticuerpos inhibidores de la actividad del receptor de tirosina quinasas. Véase, por ejemplo, la patente europea n.º EP1423428, "Antibodies that Block Receptor Tyrosine Kinase Activation, Methods of Screening for and Uses Thereof," 2 de junio, 2004, Borges et al.

También pueden emplearse estrategias de presentación de fagos para generar inhibidores de anticuerpos específicos de ROS, y se describen protocolos para la construcción de bancos de bacteriófagos y la selección de anticuerpos recombinantes en el texto de referencia bien conocido CURRENT PROTOCOLS IN IMMUNOLOGY, Colligan et al. (eds.), John Wiley & Sons, Inc. (1992-2000), capítulo 17, sección 17.1. Véase también la patente de EEUU n.º 6.319.690, 20 de noviembre, 2001, Little et al.; la patente de EEUU n.º 6.300.064, 9 de octubre, 2001, Knappik et al.; la patente de EEUU n.º 5.840.479, 24 de noviembre, 1998, Little et al.; la publicación de patente de EEUU n.º 20030219839, 27 de noviembre, 2003, Bowdish et al.

Puede producirse un banco de fragmentos de anticuerpos mostrados sobre la superficie de bacteriófagos (véase, por ejemplo, la patente de EEUU 6.300.064, 9 de octubre, 2001, Knappik et al.) y seleccionarse para la unión a una forma dimérica soluble de un receptor de proteína tirosina quinasa (como ROS). Un fragmento de anticuerpo que se une a la forma dimérica soluble de la RTK empleado para la selección se identifica como una molécula candidata para bloquear la activación constitutiva de la RTK diana en una célula. Véase la patente europea n.º EP1423428, Borges et al., supra.

Los anticuerpos dirigidos a la unión a ROS identificados en la selección de bancos de anticuerpos, tal como se describió anteriormente, después pueden seleccionarse para su capacidad para bloquear la actividad de ROS, en un ensayo de quinasas in vitro y en líneas celulares y/o tumores in vivo. La inhibición de ROS puede confirmarse, por ejemplo, estudiando la capacidad de dicho anticuerpo terapéutico para inhibir la actividad ROS quinasa, pero no otra actividad quinasa, en un panel de quinasas, y/o estudiando la inhibición de la actividad ROS en una muestra

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