HU219544B - Eljárás aminoterminális dipeptid vagy dipeptidek polipeptid előanyagról történő eltávolítására - Google Patents

Abstract

A találmány tárgya eljárás aminoterminális dipeptid vagy dipeptidekpolipeptid-előanyagról történő eltávolítására kész polipeptidelőállítása céljából. A találmány szerinti eljárást az jellemzi, hogya) a Dictyostelium discoideumból származó dipeptidil-aminopeptidázt(dDAP) alkalmas hordozófelszínre kötik; b) a polipeptid-előanyagotérintkezésbe hozzák az immobilizált dDAP-enzimmel olyan körülményekközött, mely lehetővé teszi a dDAP számára, hogy a polipeptid-előanyagról az aminoterminális dipeptidet vagy egymást követően azaminoterminális dipeptideket eltávolítsa; c) kinyerik a készpolipeptidet. ŕ

Description

vagy dipeptidek polipeptid-előanyagról történő eltávolítására

KIVONAT

A találmány tárgya eljárás aminoterminális dipeptid vagy dipeptidek polipeptid-előanyagról történő eltávolítására kész polipeptid előállítása céljából.

A találmány szerinti eljárást az jellemzi, hogy

a) a Dictyostelium discoideumból származó dipeptidil-aminopeptidázt (dDAP) alkalmas hordozófelszínre kötik;

b) a polipeptid-előanyagot érintkezésbe hozzák az immobilizált dDAP-enzimmel olyan körülmények között, mely lehetővé teszi a dDAP számára, hogy a polipeptid-előanyagról az aminoterminális dipeptidet vagy egymást követően az aminoterminális dipeptideket eltávolítsa;

c) kinyerik a kész polipeptidet.

A leírás terjedelme 12 oldal

HU 219 544 B

HU 219 544 Β

A találmány a biotechnológia területére tartozik, és olyan eljárásokkal foglalkozik, melyekben a Dyctiostelium discoideum nyálkagombából nyert, immobilizált dipeptidil-aminopeptidázt használjuk fel. Az eljárás alkalmas olyan fehérjék kialakítására, melyek N-terminálisán eredetileg egy páros számú aminosavból álló nyúlvány van.

A Dyctiostelium discoideum nyálkagombának, közelebbről sejtes nyálkagombának nevezett primitív eukariótamikroorganizmus. A név a mikroorganizmus két, extrém makroszkopikus állapotából eredeztethető. Amikor a D. discoideum aktívan növekszik, egy egyetlen sejtből álló amőbaszerű szervezetet képez. Ebben az állapotában a mikroorganizmusnak nincs sejtfala, ezért mint egy vékony film (vagy nyálka) jelenik meg. Hiányos táplálékellátottságkor a különálló sejtek telepet képeznek a szilárd aljzaton. A telep a soksejtű szervezetek jellegzetes képét mutatja. Ilyen állapotban mint egy „meztelen csiga” vándorol, majd differenciálódik, amennyiben a „csiga” hátsó sejtjei alkotják a lábat, az elülső sejtek képezik a nyelet és a középsők a termőtestet. A mikroorganizmus természetes állapotában a talaj és a trágya felszínén található. A vad típusú amőbaállapotban a mikroorganizmus kizárólag teljes baktériumok bekebelezése (fagocitás) útján táplálkozik, ezért néha „ragadozóként” említik. Izoláltak olyan D. discoideum axén mutánsokat, melyek anélkül is képesek növekedni, hogy „táplálék”-baktériumok lennének a környezetükben. Ezek a mutánsok folyékony táptalajon képesek növekedni. A jelen találmány olyan új dipeptidil-aminopeptidázok (DAP) immobilizálásával és alkalmazásával foglalkozik, melyeket a D. discoideumból izoláltunk.

A dipeptidil-aminopeptidázok olyan enzimek, melyek az aminoterminális utolsó előtti peptidkötést hidrolizálják, dipeptideket választva le a peptidek és a proteinek nem védett aminoterminális végéről. Jelenleg a dipeptidil-aminopeptidázok négy osztályát különböztetik meg DAP-I, DAP-II, DAP-III és DAP-IV néven, melyek fizikai tulajdonságaikban és szubsztrátjaikkal szembeni reakciókészségükben különböznek egymástól. A DAP-I egy viszonylag nem specifikus DAP, ami sokféle dipeptidkombinációt képes leválasztani a peptidek és a proteinek nem védett aminoterminálisáról. A DAP-I nem vagy csak kis aktivitást mutat, ha a „kiálló” dipeptid X-Pro, Arg-X vagy Lys-X összetételű, ahol az X bármelyik aminosavat jelentheti. A DAP-II előnyben részesíti azokat a terminális dipeptideket, melyek összetétele Arg-X vagy Lys-X, kisebb mértékben hat, ha a dipeptid X-Pro. A DAP-II lényegesen alacsonyabb reakciósebességgel hat minden más dipeptid-összetétel esetében. A DAP-III az ArgArg és Lys-Lys dipeptidek lehidrolizálására mutat hajlandóságot. A DAP-IV a legmagasabb hidrolitikus aktivitását az X-Pro összetételű dipeptid esetében fejti ki. A DAP-enzimek - különösen a DAP-I és DAP-IV - alkalmasak kész proteinek kialakítására.

A jelen találmány egy új, a Dyctiostelium discoideumból izolált DAP-pal foglalkozik (dDAP), mely az 5 565,349 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalom tárgyát képezi. Közelebbről, a találmány javított módszerét nyújtja a páros számú aminosavból álló Nterminális nyúlvánnyal rendelkező fehérjék kész fehérjékké való átalakításának. A korábbi módszerekkel egyszer alkalmazható enzimpreparátumot használtak, melyben a dDAP-t hozzáadták a szubsztráthoz, és egy meghatározott ideig hagyták reagálni. Az ezt követő tisztítás megkövetelte a dDAP biztonságos eltávolítását a termékből. Az egyszer használatos enmzimpreparátummal szembeni javított eljárás előnye abból származik, hogy a dDAP-enzimet hozzákötjük egy viszonylag olcsó és kereskedelmi forgalomból beszerezhető kromatográfiás gyantához, egy aktív állapotban lévő, szelektíven megkötött dDAP-enzimet nyerve.

Úgy találtuk, hogy a dDAP meglepő módon erősen kötődik az anioncserélő gyantákhoz savas körülmények között, ahol a legtöbb fehérje vagy nem, vagy csak gyengén kötődik. Savas körülmények között, ahol az anioncserélő gyantákat nem szokták használni, a dDAP stabil és igen aktív bizonyos számításba jöhető szubsztrátokkal szemben. A savas kémhatás hatásosan megakadályozza, hogy a szubsztrát és a termék olyan nagy mértékben kötődjön a gyantához, hogy befolyásolná a hozamot vagy leszorítaná a nem kovalensen kötődő enzimet.

A gyantán megkötött dDAP hatásos koncentrációja elég magas ahhoz, hogy viszonylag gyors reakciókinetikát eredményezzen. A találmány szerinti eljárás lecsökkenti azt az időt, ameddig a reaktánsok és a termékek ki vannak téve az olyan károsító pH- és hőmérsékleti viszonyoknak, ami kedvezőtlen hatással van a reaktáns és a termék stabilitására, hozamára, tisztaságára és szerkezetére. A jelen eljárás megfelelő módszert nyújt a dDAP újbóli felhasználására a további átalakítási reakcióban. A jelen találmány szerinti eljárás előnye tehát, hogy általában csökkenti az egy adott mennyiségű fehérje-előanyag átalakításához szükséges enzimmenynyiséget, és csökkenti azt az időt, mely alatt a reaktánsok és a termékek károsító körülményeknek vannak kitéve.

A találmány tárgya eljárás aminoterminális dipeptidek eltávolítására polipeptid- vagy fehéqe-előanyagokról a kész polipeptidek vagy fehérjék előállítása céljából. Az eljárás azzal kezdődik, hogy a Dyctiostelium discoideumból származó dipeptidil-aminopeptidázt alkalmas szilárd hordozóra kötjük. Az immobilizált dDAP-t ezután a polipeptid-előanyaggal reagáltatjuk olyan körülmények között, melyek az aminoterminális dipeptideknek a polipeptid-előanyagról történő egymás utáni eltávolításához szükséges. Az eljárás a kész polipeptid kinyerésével fejeződik be. Az eljárás egy másik kivitelezési módjánál egyetlen aminoterminális dipeptidet távolítunk csak el a polipeptid-előanyagról, a kész polipeptidhez jutva.

Az alábbiakban ismertetjük a találmány leírásában és igénypontjaiban alkalmazott kifejezések és rövidítések jelentését.

dDAP-Dyctiostelium discoideumból izolált dipeptidil-aminopeptidáz; GFpNA-t használva szubsztrátként, pH-optimuma 3,5; analitikai ultracentrifugával meghatározott natív molekulatömege 225 000 dalton, az alegy2

HU 219 544 Β ség SDS-poliakrilamid gélelektroforézissel (SD-PAGE) meghatározott molekulatömege 66 000 dalton.

Polipeptid-előanyag - olyan polipeptid vagy fehérje, mely a kérdéses kívánt polipeptidnél az aminoterminális végen páros számú aminosavból álló nyúlvánnyal hosszabb.

Kész polipeptid - az a polipeptid vagy protein, melynek N-terminálisáról egy vagy több dipeptidet már eltávolítottak, ezáltal a kívánt kérdéses polipeptidhez jutva.

Hordozófelület - bármely szilárd vagy félszilárd felület vagy mátrix, mely közvetlenül vagy könnyen képezhető származékán vagy aktivált alakján keresztül felhasználható fehérje megkötésére; csekély nem specifikus adszorpciót mutat, fizikailag (mechanikailag) vagy kémiailag stabil; nagy porozitású, hogy kellő ligandhozzáférhetőséget biztosítson; és a felület elhasználódása nélkül regenerálható.

dDAP-ágy - az egyedi vagy összetett hordozófelülethez kötött dDAP bármilyen mennyisége, ami az immobilizált dDAP-nak egy egységes mennyiségét vagy egységét képezi.

MR-KPB-hPI - Met-Arg-humán proinzulinként definiált fehérje, ami az inzulin B-láncának megfelelő rész 28. helyén Lys-t, a 29. helyén pedig Pro-t tartalmaz. Ez a humán inzulinanalóg fehérje-előanyag a következő elnevezéssel is kifejezhető: Met-Arg-humán proinzulinanalóg (B28 Lys, B29 Pro).

KPB-hPI - humán proinzulin, mely az inzulin Bláncának megfelelő részen a 28. helyen Lys-t, a 29. helyen Pro-t tartalmaz. Ez a humán inzulinanalóg kész fehérje kifejezhető a következő elnevezéssel is: humán proinzulinanalóg (B28 Lys, B29 Pro).

GFpNA - Gly-Phe-p-nitro-anilid,

RRBNA - Arg-Arg-p-naftil-amid,

Z-RRBNA - benzil-oxi-karbonil-RRBNA.

Valamennyi használt aminosavrövidítés megfelel az Amerikai Egyesült Államok Szabadalmi és Védjegy Hivatala 37 C. F. R. § 1.822 (b) (2) (1992) szabályának.

A jelen találmány a dDAP fizikai, kémiai és enzimológiai tulajdonságait illetően az 5 565,349 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalomra támaszkodik. A dDAP legjellemzőbb tulajdonságai: dipeptidlehasító képesség az aminoterminális végről; GFpNA-szubsztrát esetén a pH-optimum 3,5; pH=6 felett nincs lényeges enzimatikus aktivitás; a natív molekulasúly 225 000 dalton; az alegység molekulasúlya 66 000 dalton. A dDAPenzim képes a dipeptidet szintetikus szubsztrátról, GFpNA-ról, RRBNA-ról, valamint számos más természetes, szintetikus és rekombináns eljárással előállított polipeptidről eltávolítani. Továbbá a dDAP képes olyan aminoterminális dipeptidet lehasítani, melyben az Nterminális aminosav oxidált metionilcsoport [például Met(O)-Arg-humán proinzulin). A dDAP-enzim nem igényel hozzáadott redukálószert, és teljesen aktív cisztein módosítószerek - például jód-acetát vagy tetrationát - jelenlétében.

A jelen találmány különösen alkalmas polipeptid- és fehérje-előanyagok kész polipeptiddé vagy fehérjévé való hatékony átalakítására. így például ha a kívánt polipeptid a humán növekedési hormon, egyszerűen kiválasztjuk az előanyagát (az egyik esetben a Met-Asphumán növekedési hormont), az előanyagot kitesszük a dDAP aktivitásának, mely következményeként a MetAsp dipeptidet és a kívánt kész polipeptidet, a humán növekedési hormont kapjuk. A kész peptid nem szükségszerűen a „természetes” vad típusú polipeptid, minthogy gyakran az analógok vagy az intermedierek a kívántak. Más, a jelen találmány felhasználásával átalakítható polipeptidprekurzorok: Met-Arg-humán proinzulin és a Met-Arg-humán proinzulinanalóg (B28 Lys, B29 Pro). Az inzulinanalóg (B28 Lys, B29 Pro)-t a 90301224.3 számú európai szabadalmi bejelentés, az inzulinanalóg (B10 Asp, des 28-30)-at a 92305678.2 számú európai szabadalmi bejelentés tárgyalja.

A Met-Arg-humán proinzulin és a Met-Arg-humán proinzulinanalógok DAP-I enzimmel történő feldolgozására Becker és munkatársai az 5 126 249 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalomban adnak kitanítást. A dDAP-enzim lehetőséget ad továbbá arra is, hogy egymást követően egynél több dipeptidet is eltávolítsunk az előanyag polipeptid N-terminális végéről.

A dDAP-enzimmel történő dipeptideltávolítás azért előnyös, mert a dDAP pH-optimuma 3,5 érték körül van, ami lehetővé teszi, hogy a reakciót savas kémhatású tartományban végezzük, ahol sok polipeptid-előanyag oldható. Semleges vagy magasabb pH-értékű tartományban néhány polipeptid-előanyag átalakítása a szubsztrát diszulfiddimerjeinek vagy -polimerjeinek nagyobb mértékű keletkezéséhez vezethet, ami csökkenti a termék hozamát. Ez a jelenség - amit diszulfidos „összerántásnak” nevezünk - különösen zavaró, ha valaki boíjú-DAP-I enzimet használt, minthogy a DAP-I redukálószert is igényel - például β-merkapto-etanolt vagy ciszteint - a reakcióelegyhez. A savas tartományban a metioninrészek oxidációja is kisebb mértékben megy végbe.

A D. discoideum axén AX-3 törzs (ATCC 28368) fermentációja után a fermentlevet centrifugáljuk, anioncserélő gyantán, hidrofób gyantán kromatografáljuk, majd méretkizárásos kromatografálást végzünk, így nagy tisztaságú dDAP-enzim-oldathoz jutunk, ami -20 °C hőmérsékleten tárolható az alábbi közegben: 55% (térfogat) glicerin, 0,025 M ecetsav, 0,25 M nátrium-klorid, pH=3,5 vagy azonnal felhasználható a jelen találmány szerinti eljárás szerint.

Mindenekelőtt az szükséges, hogy a tisztított dDAP-t alkalmas szilárd hordozóhoz vagy mátrixhoz kössük. A szakemberek sok ilyen, a kereskedelemből beszerezhető szilárd hordozót vagy mátrixot ismernek. Nem korlátozva a találmány oltalmi körét, példaként említhető szilárd hordozó lehet egy szervetlen anyag, például porózus szilícium-oxid, kontrollált porozitású üveg, hidroxi-apatit; szintetikus szerves polimer, például poliakrilamid, polimetakrilát vagy polisztirol; továbbá poliszacharidok, például cellulóz, dextrán, Sephadex®, Sepharose® vagy agaróz. Más hordozófelületek, például membránok vagy szálak felhasználása ugyancsak beletartozik a találmány szerinti eljárásba. Kereskedelmi forgalomban lévő ilyen membrán például az Acti-Mod® kvatemer amin (FMC BioProducts).

HU 219 544 Β

Előnyösek azok a hordozófelületek, melyek a már megkötött dDAP-enzimre nincsenek kedvezőtlen hatással. Különösen előnyösek a kereskedelmi forgalomban lévő, különböző méretű poliszacharidgyöngyök, mert porózusak, könnyen kezelhetők és jól ismertek a biokémiai anyagok tisztítási módszereinek területéről. Még inkább előnyösek a kereskedelemből beszerezhető anioncserélő gyanták. A legelőnyösebb hordozó a Q Sepharose® gyanta (Pharmacia) [lásd: „Affinity Chromatography Principles et Methods”, Pharmacia Fine Chemicals (1983); „Biotechnology Product Catalog 1993”, Pharmacia Biotech. Inc. 800 Centennial Ave., Piscataway, NJ 08854, USA].

Az elmúlt évtizedekben a fehérjék immobilizálásának és hordozóhoz való megkötésének széles választékú eljárásait fejlesztették ki. Ami a hordozófelület és a dDAP-enzim közötti kapcsolatot illeti, a dDAP hordozón való immobilizálása történhet kovalens vagy nem kovalens kötéssel.

Az enzimimmobilizáláshoz leginkább szilárd hordozókat alkalmaznak, rendszerint kromatográfiás gyantákat, melyeket módosítanak vagy aktiválnak, hogy olyan funkciós csoportokkal rendelkeznek, melyek lehetővé teszik az enzim kovalens kötődését a gyantához. Általában alifás kötőkarokat alkalmaznak funkciós csoportként. Kereskedelmi forgalomból beszerezhető, kovalens kötéssel immobilizáló gyanta például az aktivált CH Sepharose®4B (Pharmacia). Ez csak egyik típusa azoknak a Pharmacia-termékeknek, melyeknek alaphordozója a Sepharose®4B.

Az aktivált gyanták általában lényegesen költségesebbek, mint az ugyanolyan alapmátrixú anioncserélő gyanták, továbbá nem áll rendelkezésre olyan széles választék az alapmátrixot illetően, mint az ioncserélő kromatográfiás gyanták esetében, és ezért korlátozottabb a felhasználhatóságuk az oszlopra viendő alacsony tisztaságú anyagok és a nagy sebességű mobil fázis esetén.

A találmány szerinti eljárásoknak megfelelő közvetlen fehétjekapcsolódás további példáját nyújtja az a kapcsolási mód, amikor cián-bromidos vagy karbodiimides módszerrel kötjük a fehéijét a poliszacharidhoz, például a Sepharose®-hoz (Pharmacia). A közvetlen kötések általában nem egy jellemző módon irányítottan kötik a fehéijét, noha a közvetlen kötések némelyike képes a fehéijét reprodukálható módon irányultan megkötni a hordozófelületen.

A dDAP-enzim nem kovalensen - például ionos vagy hidrofób kötéssel - is kapcsolódhat a szilárd hordozóhoz. A kereskedelemből az ioncserélő vagy hidrofób kötéssel kötő kromatográfiás gyanták széles választéka beszerezhető; ezek olcsóbbak, mint az aktivált, kovalens kötéssel immobilizáló gyanták.

A nem kovalens immobilizáció lehetséges hátránya, hogy az enzimkötés általában reverzibilis. Mérsékelt sókoncentráció, oldószer, pH-változás vagy még más protein jelenléte is az enzimnek a gyantáról való részleges vagy teljes leválását eredményezheti. A legtöbb esetben nehéz megállapítani azokat a körülményeket, melyek között az enzim nem kovalens kötődése erős, ahol az enzim megőrzi magasfokú aktivitását és stabilitását és ahol az enzimreaktánsok maguk nem kötődnek a gyantához.

A jelen találmányban foglaltak kulcseleme volt az a felismerés, hogy a dDAP-nek és az MR-KPB-hPI-nek erősen ellentétes affinitása van az anioncserélő gyantához savas pH-nál, ahol a dDAP a maximális aktivitású. A kromatográfiás viselkedés és az izoelektromos fokuszálás alapján a dDAP-ről feltételezzük, hogy savas pH-tartományban jelentős negatív töltéssel rendelkezik. Következésképpen úgy véljük, hogy a dDAP erősen kötődik az anioncserélő gyanták kationfunkcionális csoportjához, míg az MR-KPB-hPI vagy a proinzulin még akkor sem kötődik, ha nagy sztöchiometriai feleslegben van jelen.

Azonban a nem kovalens enzimkötés reverzíbilitásának is van előnye a kovalens kötéssel szemben. A nem kovalens kötés általában könnyen és ismételhetően megfordítható. Ha az oszlopot képző gyanta regenerálására van szükség, mert már elvesztette átalakítóképességét vagy megnövekedett az ellenállása, az enzim enyhe körülmények között eltávolítható a gyantáról azt megelőzően, hogy a gyantát erőteljesebb regenerációs körülményeknek tennénk ki - mely körülmények között a gyantán maradt enzim nagy valószínűséggel tönkremenne. Ha már a gyantát regeneráltuk, ismét felhasználható egy új vagy újratisztított enzimpreparátum megkötésére.

Más immobilizációs eljárások úgy irányíthatják a dDAP-enzimet, hogy a katalitikus helye szabadon kitett maradjon. Az egyik ilyen eljárás az enzimen található természetes szénhidrátrészeket használja fel. A szénhidrátrészt először a megfelelő aldehiddé oxidáljuk, majd az aldehidet a hordozó primer aminocsoportjaival reagáltatva, a dDAP-t kedvező irányultságban lehet a gyantához kapcsolni.

A dDAP és a gyantafelület közötti áthidalásoknak sokféle típusa lehet, ideértve azokat a kis molekulájú kapcsolóágenseket, melyek kovalensen kötik a dDAP-t a gyantához. Ezek az úgynevezett távtartó közbetétek („spacerek”) alkalmasak, és előnyösen, az áthidalás kialakítása után nem befolyásolják már a fehérjét.

Az áthidaló megoldásnak egy másik típusát jelentik azok a nagy, multivalens molekulák, melyek a hordozóhoz kapcsolva több dDAP-molekula megkötésére képesek. A kötés más típusát képviselik azok a specifikus immunadszorbensek, melyek nem kovalensen kötik meg a dDAP-t. A dDAP-t orientáltan a hordozóhoz kötő fajlagos immunoadszorbens egyik példája az epitópspecifitású, anti-dDAP, monoklonális antitest. Előállítva egy nagy affinitású, monoklonális antitestet olyan dDAPepitóppal szemben, ami távol van a katalitikus helytől, majd kémiailag hozzákötve az antitestet a hordozó felületéhez és hagyva, hogy a dDAP hozzákötődjön az antitesthez, elérhető, hogy a dDAP kedvező konfigurációban orientálódva helyezkedjen el a hordozón.

A fent tárgyaltak nem korlátozzák a találmány oltalmi körét. A fehérjéknek hordozóhoz történő hozzákötésére számos más módszer is ismert a szakemberek előtt. A hordozó és a dDAP immobilizálási módszereinek megválasztását kényelmi szempontok is befolyásolják,

HU 219 544 Β és függ a műveletet elvégzőnek a különféle hordozók és műveletek irányába kialakult jártasságától és anyagismeretétől. Végül a hordozó és az immobilizációs módszer megválasztását befolyásolja a rendelkezésre álló dDAP mennyisége és a fehéije-előanyagok kész fehérjévé történő átalakításának elérendő célja és a megvalósításnak körülményei.

Ha már a dDAP-t megkötöttük a hordozón, a polipeptid-előanyag kész polipeptiddé való átalakítása különféle alkalmas körülmények között megtörténhet. Előnyös eljárás, ahol egy kromatográfiás oszlopot töltünk meg a hordozóval, melynek felületéhez kötöttük a dDAP-enzimet. Az oszlopot úgy készítjük el, hogy a kérdéses szubsztrátot (fehérje-előanyagot) átengedhessük az immobilizált enzimfelületen, hagyva, hogy a reakció lejátszódjon. Minthogy az enzim a hordozó felületéhez kötve marad, a reakcióelegynek nem képezi fizikai alkotórészét és ezért alkalmas újbóli felhasználásra.

A találmány szerinti eljárás lehetővé teszi, hogy akár többször is megismételjük a szubsztrát és enzim reagálásának lépését, biztosítva ezáltal a protein-előanyag kész proteinné való teljes átalakítását. így a reaktáns/termék elegy újra átvezethető egyszer vagy többször ugyanazon a dDAP-ágy felett vagy egymás után vihető át egymástól különálló dDAP-ágyakon. Előnyös az az eljárás, ahol a protein-előanyagot tartalmazó elegyet kettő vagy több különálló dDAP-ágy felett vezetjük el, a legelőnyösebb az előanyagot tartalmazó áramlást három dDAP-ágy felett elvezetni, melyeknek hordozója a Q Sepharose® gyanta.

Szakemberek számára egyértelmű, hogy az immobilizált dDAP-oszlop működését nyomon kell követni, vizsgálva a szubsztrátnak a kérdéses termékké történő átalakítását. Az oszlop hatékonyságának kis csökkenésén javíthatunk az áramlási sebesség csökkentésével, meghosszabbítva ezáltal az időt, mely alatt az enzimreakció megtörténhet. Ideálisan az áramlási sebesség olyan gyors, amilyen csak lehet, feltéve, hogy a szubsztrát átalakítása eléri a kívánt mértéket és az oszlop ellennyomása nem nagyobb a műveleti nyomásnál. Az oszlop működését befolyásolja a hőmérséklete és a mobil fázis kémhatása, ezért tanácsos ellenőrizni ezeket a paramétereket.

A polipeptid-előanyagot kész polipeptiddé átalakító enzimatikus reakciót vizes közegben hajtjuk végre, mely kellően pufferolt, hogy a kémhatást pH=2,5-5,5 tartományban tartsa. Előnyös pH-tartomány: 3,0-4,5; legelőnyösebb: 3,0-3,5. A pH-optimum kissé változhat a szubsztráttól függően.

Nem kötött dDAP-t használva a GFpNA és a GlyArg-pNA átalakítása leggyorsabban pH 3,5 érték körül zajlik le, míg a Met-Asp-humán növekedési hormon (Met-Asp-hGH) esetében az az érték pH 3,0-3,5 között van. Az RRBNA átalakítása leggyorsabban pH 4,5 értéknél történik. Szakemberek előtt nyilvánvaló, hogy bármelyik konkrét reakció pH-optimumát olyan tényezők határozzák meg, mint az adott előanyag és enzim stabilitása és oldékonysága. Egyes esetekben oldódást elősegítő anyagot - például karbamidot, nátrium-dodecil-szulfátot, guanidint stb. - használhatunk.

A pufferek széles választékát felhasználhatjuk; a fő követelmény, hogy képes legyen a kémhatást a kívánt tartományon belül tartani, és ne oldja le az enzimet a hordozófelületről. Tipikusan alkalmazott puffer például a nátrium-foszfát, nátrium-acetát, nátrium-citrát, glicin stb.; előnyös a nátrium-acetát, nátrium-foszfát és a glicin.

A jelen találmányhoz felhasznált polipeptid-előanyagokat általában rekombináns DNS-technológiával állítják elő. Előállításához a kívánt polipeptid-előanyagot kódoló nukleotidszekvenciát rutin-szintézistechnikával készítik el. Ezek a módszerek általában olyan oligonukleotidokat eredményeznek, melyek a kívánt kódolószekvenciának és kiegészítőszekvenciájának fragmensei. Az oligonukleotidokat úgy tervezik meg, hogy a kódolószekvencia egy fragmense a kiegészítőszekvencia két ffagmensét fogja át és fordítva. Az oligonukleotidokat párosítják és összekapcsolják, előállítva végül a kívánt génszekvenciát.

A szekvenciát egy rekombináns vektorba építik be olyan helyzetben, ami lehetővé teszi a kódolt termék kifejeződését. Az alkalmas vektor az expressziós kontroliszekvenciának legalább egy részét tartalmazza.

Az elmondottak szemléltetésére az alábbiakban példákat adunk meg. A példák kizárólag szemléltető jellegűek és a találmány oltalmi körét nem korlátozzák.

1. példa

A Dictyostelium discoideum tenyészet

Az Amerikai Törzsgyűjteményből (American Type Culture Collection in Rockville, Maryland) ATCC 28368 letéti számon beszerezhető Dictyostelium discoideum ΑΧ-3-axén törzs liofilizált tenyészetét különböző hígításban agarlemezen szélesztjük. Az agarlemez (1,2% Difco Bacto® Agár) pufferolt élesztőkivonat/pepton táptalajt tartalmaz, melynek összetétele literenként 7,15 g Difco élesztőkivonat, 14,3 g Difco Bacto Peptone, 0,51 g dinátrium-hidrogén-foszfát és 0,49 g kálium-dihidrogén-foszfát, melyhez a sterilizálás és a kémhatásnak nátrium-hidroxiddal vagy kénsavval történő végső pH=6,5 (±0,1) értékre való beállítása után aszeptikus körülmények között hozzáadunk literenként 10 g glükózt. Agár nélkül ugyanezt a tápközeget használjuk az egy liternél kevesebb térfogatú folyékony tenyészetek elkészítéséhez. Az agarlemezeket 21-24 °C hőmérsékleten inkubáljuk 3-5 napon át. A spórazsákokat óvatosan összegyűjtjük a lemezről, vigyázva arra, hogy az AX-3 tenyészettel együtt liofilizált „táplálék-baktériumokat” ne szedjük fel, majd beoltunk 3 ml pufferolt élesztőkivonat/pepton táptalajt, és gyenge rázatás mellett inkubálunk 21-24 °C hőmérsékleten. A D. discoideum sejteket megsokszorozzuk folyamatosan nagyobb térfogatú élesztőkivonat/pepton táptalajra átvive a tenyészetet. Mindegyik átviteli lépésnél a hígítás 10-25-szörös, és akkor történik, amikor a sejtsűrűség túllépi a 2xl0⁶/ml értéket. A tenyészeteket 21-24 °C hőmérsékleten inkubáljuk enyhe kevertetés mellett.

A rázott tenyészeteket általában szójapeptonnal (például Phytone Peptone vagy Marcor Soy Peptone) ké5

HU 219 544 Β szült hasonló táptalajon készítjük. Az élesztőkivonat/pepton táptalaj Bacto Peptonját 2-20 g/1 koncentrációban szójapeptonnal helyettesítjük. A glükóz koncentrációját 15 g/1 értékre növeljük. A tenyésztést 10-5000 literes munkatérfogatú fermentorokban végezzük, melyek 1-3 Rushton® turbinakeverővei vannak ellátva; a kevertetés sebessége 40-150 fordulat percenként. A hőmérsékletet 22 °C±1 °C értéken tartjuk, a levegőáram a folyékony tenyészet térfogatának 0,1-0,5-ed része, a visszanyomást 3-5 psi értéken tartjuk. A fermentálást ellenőrzött pH=6,3-6,5 tartományban végezzük kénsavval beállítva, a 40-80%-os oldottoxigén-értéket a kevertetés és/vagy a légáram változtatásával állítjuk be. Vigyázunk rá, hogy a sejtekkel való eljárásoknál és a fermentálásnál minimalizáljuk a nyíróerőt, minthogy a növekedés alatt az amőboid szervezetek sejtfal nélküliek.

A kevertetett D. discoideum AX3 tenyészet 12 és 36 óra között általában a kétszeresére szaporodik. Az oldott oxigén - ha nincs szabályozva — folyamatosan csökken, és egy adott idő után növekedni kezd, miután leáll a sejtsűrűség növekedése. A végső sejtsűrűség 3 χ 10⁶-1 x 10⁸/ml között van.

Időnként mintát veszünk, és meghatározzuk a sejtsűrűséget és a dDAP-aktivitást (lásd 3. példa). 5xl0⁵ sejt/ml felett a sejtsűrűséget Petroff-Hauser-számlálókamra alkalmazásával állapítjuk meg. A GFpNA-t hidrolizáló aktivitás általában növekszik a fermentáció folyamán. A maximális dDAP-aktivitást a maximális sejtsűrűség elérését követő 1-4. napon éljük el. A teljes fermentlevet 4 °C hőmérsékleten vagy -20 °C hőmérsékleten lefagyasztva tároljuk, majd felolvasztjuk és meghatározzuk az aktivitását. A fermentleveket 10 °C hőmérséklet alá hűtjük, és folyamatos áramoltatott centrifúgálással eltávolítjuk a sejteket.

2. példa

A dDAP kinyerése

A) A sejtek eltávolítása és betöményítés

A Dictyostelium discoideum fermentlevéből történő dDAP-tisztítás bevezető lépése a sejtek eltávolítása és a betöményítés. A sejtek eltávolítása folyamatos áramlási centrifúgálással történik. A 20-30-szoros betöményítést tangenciális áramlási ultraszűréssel végezzük, 100 000 molekulasúlyú anyagot kizáró, regenerált Amicon cellulóz-membránon. A visszamaradó anyagot leszívjuk az ultraszűrőből, és a készüléket 50 mM Trisz-pufferrel (pH=7) mossuk, hogy tovább dDAPhez jussunk. A szűrőben visszamaradt anyagot és a mosólevet egyesítjük, kialakítva a végső koncentrátumot. A levet -20 °C hőmérsékleten lefagyasztva tartjuk néhány hónapon át a feldolgozásig.

B) Tisztítás

A lefagyasztott végső koncentrátumot 12-24 óra alatt felolvasztjuk szobahőmérsékleten. Az oszlopkromatografálás előtt a koncentrátumot tisztítjuk, ami centrifúgálásból és az 1 μ-os membránon való átszűrésből áll. A tisztított végső koncentrátum kémhatását pH=7,0 értékre állítjuk be és 4-10 °C hőmérsékleten tartjuk.

C) Anioncserélő kromatografálás

Az anioncserélő kromatografáláshoz Pharmacia Q Sepharose® Fást Flow gyantát használunk. Az oszlopot 50 mM Trisz-pufferrel (pH=7) egyensúlyozzuk ki. A tisztított, sejtmentes koncentrátumot 50 cm/óra lineáris áramlási sebességgel visszük az oszlopra. Egy liter Q Sepharose Fást Flow gyantára körülbelül 600-1000 egység dDAP-aktivitást viszünk. A sejtmentes koncentrátum vezetőképessége 10 mMHOS/cm értéknél kisebb. Amint a feltöltés teljes, a Q Sepharose Fást Flow gyantát kétszeres oszloptérfogatú kiegyensúlyozópufferral mossuk. A dDAP-aktivitást lineáris gradienssel eluáljuk a gyantáról. A lineáris gradienshez 10 oszloptérfogatú 50 mM Trisz-puffert (pH=7) használunk, melyben a nátrium-klorid-koncentráció 0-ról 1 M-ig nő; az áramlási sebesség 50 cm/óra. 0,1-0,2 oszloptérfogatnyi frakciókat gyűjtünk. Az eluenst vezetőképességgel és 280 nm-en mért abszorbanciával vizsgáljuk, és a frakciók dDAPaktivitását a kolometriás GFpNA-szubsztrát hasításával határozzuk meg pH=3,5 kémhatásnál. Az egyesített frakciókból kapott főfrakció az eluált dDAP-összaktivitásnak több, mint 80%-át tartalmazza. A dDAP-aktivitás egy csúcsban jön le az oszlopról. A fofrakció kémhatását 10%-os (térfogat) sósavval pH=3,5 értékre állítjuk be és 4 °C hőmérsékleten tartjuk.

D) Hidrofób kromatografálás

A megsavanyított főfrakciót hidrofób kölcsönhatású kromatografálással (HIC) tisztítjuk tovább Pharmacia Phenyl Sepharose® Fást Flow gyantán. 500-2000 egységnyi aktivitást viszünk 1 liter gyantára. A Q Sepharose® gyantáról kapott főfrakcióhoz literenként hozzáadunk 140 g ammónium-szulfátot, a kémhatást pH=3,5 értékre állítjuk be és a vezetőképesség végső értéke 90 mMHOS/cm. A HIC oszlopot literenként legalább 140 g ammónium-szulfátot tartalmazó 50 mM citrátpufferral, pH=3,5, kiegyenlítjük. Az oszlop feltöltését 40 cm/óra lineáris áramlással végezzük, majd az oszlopot legalább háromszoros oszloptérfogatnyi kiegyenlítőpufferral mossuk. A dDAP-aktivitást lineáris gradienssel eluáljuk az oszlopról. A lineárisgradienselúcióhoz több, mint 10 oszloptérfogatnyi 50 mM citrátpuffert, pH=3,5, használunk, melyben az ammónium-szulfát koncentrációja 140 g/1 értékről nullára csökken; áramlási sebesség 40 cm/óra. 0,1-0,2 oszloptérfogatnyi frakciókat gyűjtünk. Az elúciót a vezetőképesség és a 280 nm-es abszorbancia mérésével követjük nyomon. Az egyes frakciók dDAP-aktivitását a GFpNA hasításával határozzuk meg pH=3,5 kémhatásnál. A frakciók egyesítésével nyert főfrakció a dDAP összaktivitásának több, mint 80%-át tartalmazza. A főfrakció kémhatását 10%-os (térfogat) sósavval vagy 10%-os (vegyes) nátrium-hidroxid-oldattal pH=3,5 értékre állítjuk be. A HIC főfrakciót 4 °C hőmérsékleten tartjuk.

E) Méretkizárásos kromatográfía (SEC)

A HIC főfrakció további tisztítását méretkizárásos kromatografálással folytatjuk Sephacryl®S-200 HR gyantán. A HIC főfrakciót betöményítjük 10 000 molekulasúlyú anyagot kizáró Amicon regenerált cellulózmembránon végzett ultraszűréssel. A visszamaradt anyagot leszívjuk, a készüléket 50 mM citrátpufferrel,

HU 219 544 Β pH=3,5 mossuk, és a mosóvizet az említett visszamaradt anyaggal egyesítjük, a végsó koncentrátumot kialakítva. Ennek kémhatását 10%-os sósavval vagy 10%-os (vegyes) nátrium-hidroxid-oldattal pH=3,5 értékre állítjuk be. A végső koncentrátum térfogata kevesebb, mint a SEC térfogat 2,5%-a. A végső koncentrátum vezetőképessége 30 mMHO/cm. A SEC oszlopot 50 mM ecetsav, 0,5 M nátrium-klorid, pH=3,5, oldattal - melynek vezetőképessége 20-30 mMHO/cm - kiegyensúlyozzuk. A végső koncentrátumot 8 cm/óra lineáris áramlással visszük a SEC oszlopra. A dDAP-aktivitást egy oszloptérfogatnyi kiegyensúlyozópufferral eluáljuk az oszlopról. 0,01 oszloptérfogatnyi frakciókat gyűjtünk. Az elúciót a vezetőképesség és a 280 nm-es abszorbancia mérésével követjük nyomon; a frakciók, a dDAP aktivitását a pH=3,5 kémhatásnál mért GFpNA-hasítással határozzuk meg. A dDAP-összaktivitás több, mint 80%-át képviselő frakciók egyesítésével nyeljük a főfrakciót. A dDAP-aktivitás egy csúcsban eluálódik. A SEC főfrakciót 4 °C hőmérsékleten tartjuk néhány hónapon át.

Az anioncserélő, hidrofób kölcsönhatású és méretkizárásos kromatografálásuk után nyert tisztított anyag egy fősávként mozdul el a SPS-poliamid gélelektroforézisnél (SPS-PAGE). Az elmozduló sáv helye azonos a standard borjúszérum-albumin (66 kD) helyével. A fehérjét ISS Pro-blue festékkel festjük meg. A migrációs képet a 0,1 M ditiotreitolminta elkészítés alatti (100 °C, 5 perc) jelenléte vagy hiánya nem befolyásolja. A DAP-I (botjú)-alegység SDS-PAGE-dzsel meghatározott molekulasúlya 22 000 dalton.

3. példa

A dDAP-aktivitás vizsgálata és jellemzése

1. A GFpNA hasítása

A tisztítási folyamat vagy a tárolás után a dDAP enzimatikus aktivitását rendszerint a kromogén GFpNA-szubsztrát hasításával állapítjuk meg. A vizsgálat tipikus eljárásánál az enzimet legalább tizenegyszeresére hígítjuk 1,0 ml 4 mM GFpNA 0,05 M ecetsavas - kémhatás pH=3,5 értékre beállítva - oldatban. A Gly-Phe dipeptid lehasításának mértékét 37 °C hőmérsékleten vizsgáljuk a 405 nm-en mért abszorbancia növekedésével. Egy egységnyi aktivitás 0,90 OD-változást okoz egy perc alatt a megadott körülmények között. Az egység/ml értéket meghatározhatjuk, ha feltételezzük, hogy a szabad p-nitro-anilid (pNA) extinkciós koefficiense 405 nm-en 9,9 mM¹, cm-¹.

A dDAP GFpNA-szubsztráttal szembeni inhibíciós profilját összehasonlítjuk a boíjúlép-DAP-I inhibíciós profiljával, jód-acetamid és kálium-tetrationát szulfhidrilmódosító ágenseket használva, melyekről ismert, hogy gátolják a borjúlép-DAP-I-et. A dDAP- vagy boíjúlép-DAP-I-mintákat szobahőmérsékleten inkubáljuk 15 percen át 0, 0,5, 5,0 vagy 50 mM inhibitorkoncentrációnál, 100 mM Trisz-pufferben, pH=7 értéken. Az inkubált oldatot 21-szeresére hígítjuk 4 mM GFpNA-oldattal, pH=3,5. A hasítás mértékét a 37 °C hőmérsékleten 405 nm-en mért abszorbancianövekedéssel mérjük. A borjú-DAP-I GFpNA-hasító képessége több, mint 90%-kal csökkent az 5 mM jód-acetamidnak való kitettség következményeként, és 95%-os gátlást okoz az 5 mM kálium-tetrationát. A dDAP esetében jelentős gátlást a jód-acetamid és a kálium-tetrationát egyik vizsgált koncentrációjánál sem állapítottunk meg.

A dDAP GFpNA-hasításának pH-optimumát 0,5 M Trisz-pufferben, foszfátpufferben vagy citrátpufferben állapítjuk meg, a pH-értékeket 3 és 8 érték között 10%-os sósavval vagy 10%-os nátrium-hidroxid-oldattal beállítva. A dDAP-enzimet 20-szorosára hígítjuk 100 mM ciszteamint és 10 mM nátrium-kloridot tartalmazó pufferben. A boíjú DAP-I-enzimet 200-szorosára hígítjuk ugyanebben a pufferben. A GFpNA-szubsztrát-oldatot (4 mM) 2%-os dimetil-foimamidban készítjük el. A mikrotiter lemezen 0,025 ml különböző pH-értékű Trisz/ /foszfát/citrát puffért keverünk össze 0,1 ml hígított enzimmel és 0,1 ml szubsztrátoldattal. A 410 nm-en mért abszorpció növekedésének mértékét 30 perc elmúltával határozzuk meg egy titerlemez-leolvasóval. Az eredmények azt mutatják, hogy a dDAP GFpNA-hasításának pH-optimuma 3,5 és 4,0 között van.

B) Gly-Arg-pNA (GRpNA) hasítása mM GRpNA-oldatot készítünk 50 mM ecetsav/50 Mm glicin pufferben, pH=5. Sósavval és nátrium-hidroxiddal különböző pH-értékeket állítunk be 5,1 és 2,3 között. 180 μΐ fenti pufferolt szubsztráthoz hozzáadunk 5 pl dDAP-t (végső koncentráció: 49 milliegység/ml). Meghatározzuk a 410 nm-en jelentkező abszorbancianövekedést titerlemez-leolvasóval, és az abszorbancianövekedés mértékét vizsgáljuk a reakcióelegy pH-értékének függvényében. Amint a GFpNA esetében a GRpNA-szubsztrátnál is a pH-optimum 3,5 körül van. Az enzimnek kis aktivitása van ezzel a szubsztráttal szemben, pH=2,5 alatt vagy pH=5 felett.

C) RRBNA hasítása

0,25 mM RRBNA- vagy 0,25 mM Z-RRBNA-oldatot készítünk 100 mM ecetsavban, pH=3,5 vagy 100 mM citrátpufferben, pH=5,0. 2 ml szubsztráthoz hozzáadunk dDAP-t vagy boíjú-DAP-I-et (körülbelül 15 milliegység/ml). 340 nm-es megvilágításnál mérve a 410 nm-es fluoreszcencia-növekedést, meghatározzuk a hasítás sebességét. A borjú-DAP-I hatásosan nem hasítja egyik szubsztrátot sem. Meglepő módon a dDAP hatásosan hasítja az RRBNA-szubsztrátot. A dDAP nem hasítja a blokkolt aminocsoportú Z-RRBNA-szubsztrátot, alátámasztva a megfigyelést, hogy a dDAP egy DAPenzim. Az RRBNA hasításának pH-optimumát 50 mM ecetsavat és 50 mM citrátot tartalmazó pufferrendszerben határozzuk meg. A pH-értékeket sósavval és nátrium-hidroxiddal állítjuk be. 1,5 ml pufferhez hozzáadunk 0,5 ml 1 mM RRBNA-törzsoldatot (végső koncentráció 0,25 mM). Körülbelül 15 mM/ml dDAP-enzimet adunk hozzá, és meghatározzuk a hasítás sebességét. Az RRBNA hasítási optimuma 4,5 értéknél van, jelentős aktivitás figyelhető meg a pH=3,5-5,7 tartományban. Ez a meglepő eredmény azt sugallja, hogy a dDAP bizonyos tulajdonságaiban megegyezik a DAP-III-mal.

A szakemberek előtt ismert, hogy a szubsztrát hasításának pH-optimuma nemcsak az enzimtől, hanem a

HU 219 544 Β szubsztráttól is függ, vagyis az eltávolítandó dipeptid összetételeitől, valamint az indikátorcsoporttól magától. így például dDAP-t használva a GRpNA-szubsztrátnál a pH-optimum 3,5 körül van, míg a Gly-Arg-7amido-4-metil-kumarin lehasításának pH-optimuma pH=5, arra vallva, hogy az említett csoport befolyásolhatja a hasítási tulajdonságokat.

4. példa

A dDAP-oszlop elkészítése

Egy 1 ml-es Q-Sepharose® Fást Flow gyantaoszlopot (Pharmacia) (0,5 x 5,0 cm) alakítunk ki, és 10 oszloptérfogatnyi hígított ecetsavval (0,05 M ecetsav, pH=3,5) kiegyensúlyozzuk. A milliliterenként 1 egységet tartalmazó dDAP-oldat elkészítéséhez 0,27 ml dDAP-t (5,5 U/ml, elkészítve az 1. és a 2. példa szerint) felhígítunk 1,22 ml hígított ecetsavban. A dDAP-oldatot 30 cm/óra (0,1 ml/perc) átfolyási sebességgel rávisszük az oszlopra, majd az oszlopot legalább 10 ml további hígított ecetsavval mossuk. Az oszlopátfolyást a dDAP GFpNA-t hasító aktivitásával határozzuk meg. Az oszlopátfolyási frakcióban nem volt kimutatható aktivitás. Ez azt jelzi, hogy a dDAP-enzim közel kvantitatíve megkötődött a gyantán. Az oszlophoz alkalmazott dDAP-aktivitási szint megfelel 1 egység/cm³-nek (vagy 5 egység/cm²-nek).

5. példa

GFpNA átalakítása pNA-vá immobilizált dDAP-enzimtnel

A 4. példában leírtak szerint előállított oszlopra 0,05 M ecetsavban, pH=3,5, ráviszünk 1,0 ml 0,4 mM GFpNA-oldatot 60 cm/óra áramlási sebességgel. Az oszlopról lejövő eluátumot 410 nm-en vizsgáljuk LKB detektorral (Model 2151 Variable Wawelength Monitor, 1,56 AUFS-nál, 10 mm-es átfolyási cellában). Amint az oldat áthalad az oszlopon, színe sárga lesz, és az oszlopot elhagyva érzékeljük az abszorbancia megnövekedését. Mindkét megfigyelés jelzi, hogy a dDAP-oszlop kromogén pNA-termékké alakította a GFpNA-t. 1,0 ml GFpNA-oldat 1 ml-es (0,5 x 5,0 cm) immobilizált dDAP oszlopra való vitelével időközönként ellenőrizzük az aktív dDAP-nek a gyantán való folyamatos jelenlétét.

6. példa

A Met-Arg-humán proinzulinanalóg (B28 Lys, B29 Pro) átalakítása

A 4. példában leírtak szerint elkészített oszlopot újra ekvilibráljuk 10 oszloptérfogatnyi hígított ecetsavval. A rekombináns úton előállított MR-KPB-hPI-ből 20 g/1 koncentrációjú oldatot készítünk, és az oldat kémhatását 10%-os (térfogat) sósavval pH=3,3 értékre állítjuk be. 5,0 ml MR-KPB-hPI oldatot szobahőmérsékleten 60 cm/óra átfolyási sebességgel ráviszünk a dDAPoszlopra. Az eluátumot 1,0 ml-es frakciókba gyűjtjük és 0,05 M ecetsavban készült 4 ml 7 M karbamidoldattal hígítjuk a frakciókat. Az MR-KPB-hPI KPB-hPIvé való átalakítás mértékét fordított fázisú HPLC-vel mutatjuk ki, melyhez Ultrasphere ODS oszlopot (Phenomenex) használunk. A gradienselúcióhoz 0,1 M ammónium-foszfát-oldatban, pH=7, az acetonitril koncentrációját 25%-ról 30%-ra emeljük. A HPLC-analízissel 40%-os átalakítást figyelhetünk meg.

cm/óra átfolyási sebességgel egy második adag 5,0 ml-es MR-KPB-hPI oldatot viszünk a dDAP-oszlopra, és 40%-os átalakítást figyelünk meg a HPLCanalízis segítségével.

cm/óra átfolyási sebességgel egy 50 ml-es, harmadik adag MR-KPB-hPI oldatot viszünk az oszlopra. Az adagot folyamatosan cirkuláltatjuk összesen 250 ml-ig, a HPLC-analízissel megállapított átalakítás végső értéke 75%.

cm/ml átfolyási sebességgel visszük az oszlopra a negyedik, 5,0 ml térfogatú MR-KPB-hPI oldatot; a HPLC-vel megállapított átalakítás 83%-os.

Az ötödik, 60 ml térfogatú MR-KPB-hPI oldatot 12 cm/óra átfolyási sebességgel visszük az oszlopra; a HPLC-analízissel megállapított átalakítás 80%-os.

A hatodik adag 148 ml térfogatú MR-KPB-hPI oldatot 12 cm/óra átfolyási sebességgel visszük az oszlopra; a HPLC-analízissel megállapított átalakítás 84%-os.

A fent leírt vizsgálatok összesen 15 napot vettek igénybe. Amikor az oszlopon nem MR-KPB-hPI oldat volt, szobahőmérsékleten (20 °C) hígított ecetsavval mostuk ki és abban tartottuk. A végső 213 ml térfogatú MR-KPB-hPI oldat alkalmazásakor 8 cm/óra átfolyási sebesség mellett nem lehetett lényeges csökkenést kimutatni az MR-KPB-hPI átalakításban, ami arra utal, hogy további MR-KPB-hPI oldatmennyiség dolgozható fel a gyantán folyamatosan jó hozammal. Alkalmanként az oszlop megnövekedett ellennyomása jelentkezett a kísérletek alatt, azonban az áramlás időleges megfordításával vagy az oszloptöltet felkavarásával megoldható ez a probléma. A dDAP-oszlop körülbelül öt szokásos módon, külön adagokban (batch-mode) elvégzett MR-KPB-hPI átalakítási reakciónak megfelelő MRKPB-hPI mennyiségnek (273 ml vagy 5,5 g MR-KPBhPI) volt kitéve. „Batch” módszernél 50-60 ml vagy 1 g MR-KPB-hPI reagál 1 egység dDAP-vel. Ez a megfigyelés alátámasztja azt az állítást, hogy az ily módon immobilizált dDAP lényegesen javítja a dDAP felhasználhatóságát az MR-KPB-hPI feldolgozásában.

7. példa

Nagyméretű immobilizált dDAP-oszlop elkészítése

1,0x 6,0 cm, 2,2-6,0 cm és 30 χ 10 cm méretű oszlopokat megtöltünk Q Sepharose® Big Bead gyantával (Pharmacia Chemical Company) és 5 oszloptérfogatnyi hígított ecetsavval (0,05 M ecetsav, pH=3,5) kiegyensúlyozzuk. Az 1. és 2. példa szerint elkészített és kinyert tisztított dDAP oldatát (9,5 U/ml) híg ecetsavval 4 U/ml koncentrációra hígítjuk. A dDAP-oldatot egyenként rávisszük az egyes oszlopokra 50 cm/óra átfolyási sebességgel. A dDAP-t 2,5 U/cm² (1,0-6,0 cm), 5,0 U/cm² (1,0-6,0 cm) és 10,0 U/cm² (1,0x6,0 cm, 2,2x6,0 cm és 30x10 cm) aktivitásszinten visszük fel. Mindegyik oszlopot legalább háromszoros oszloptérfogatnyi hígított ecetsavval mossuk. Mindegyik oszlopnál megállapítjuk a dDAP-aktivitás oszlopátfolyását („column flowthrough”) a GFpNA-aktivitási vizsgálatot felhasználva.

HU 219 544 Β

Az oszlopról lejövő oszlopátfolyási frakcióban aktivitás nem volt megállapítható Ez azt jelenti, hogy a dDAPenzim kvantitatíve megkötődött a gyantán.

8. példa

Met-Arg-humán proinzulinanalóg (B28 Lys, B29 Pro) átalakítása

A 7. példában leírtak szerint előállított 1,0 x 6,0 cm méretű dDAP-oszlopot legalább háromszoros oszloptérfogatnyi híg ecetsavval mossuk. A részlegesen tisztított rekombináns MR-KPB-hPI 17 g/1 koncentrációjú oldatának kémhatását pH=3,5 értékre állítjuk be 10%-os (térfogat) sósavval vagy 10%-os (vegyes) nátrium-hidroxid-oldattal. 2000 ml MR-KPB-hPI oldatot viszünk szobahőmérsékleten (20-22 °C) az oszlopra különböző lineáris áramlási sebességgel (8-115 cm/óra). Mindegyik áramlási sebességnél eluátummintákat gyűjtünk miután legalább két oszloptérfogatnyi mennyiség átment az oszlopon. Az MR-KPB-hPI KPB-hPI-vé való átalakulás mértékét fordított fázisú HPLC-analízissel állapítjuk meg Dupont Zorbax® 5 μ, 300 Á oszlopot (15x4,6 cm) használva. Az eluáláshoz morfolin/foszfát/OSA pufferben kialakított acetonitrilgradienst használunk.

Az áramlási sebesség és a hozam közötti összefüggés megállapítása hat különböző áramlási sebességnél nyert átlagértéken alapszik. Az oszlop működőképességét a 76 cm/óra átfolyási sebességnél periodikusan elvégzett hozammeghatározással állapítjuk meg és ez az érték 54% és 61% közöttinek adódott.

napos tárolási idő után egy második futtatást végeztünk az oszlopon, 400 ml MR-KPB-hPI oldatot vive rá. 76 cm/óra átfolyási sebességnél a hozam 55%-os.

nappal az első átalakítás után egy harmadik futtatást végeztünk 600 ml MR-KPB-hPI oldattal. 76 cm/óra átfolyásnál, 2 eluensminta alapján a hozam 46-52%-os volt.

Ha nincs használatban, az oszlopot mossuk és híg ecetsavban, pH=3,5, tartjuk szobahőmérsékleten (körülbelül 20 °C). Az MR-KPB-hPI fentiekben leírt átalakítása alatt az átalakítási százaléknak csak minimális csökkenését észleltük.

A fenti, 8. példában leírt, immobilizált dDAP-oszlopon végzett átalakítási futtatások 7,5 szokásos „batch” módú átalakítással egyenértékűek. Ez megfelel 3000 ml (körülbelül 51 g) MR-KPB-hPI oldat átalakításának. Ezzel szemben 8 egység szabad enzim „batch” módban csak 400 ml (körülbelül 6,8 g) MR-KPB-hPI átalakítására lenne képes az adott időtartamban. Ez a számítás bizonyítja, hogy a jelen találmány szerinti átalakítás sokkal hatásosabban végezhető el, mint „batch” módban.

9. példa

Met-Arg-humán proinzulinanalóg (B28 Lys, B29 Pro) átalakítása különböző koncentrációknál

A 7. példában leírtak szerint elkészített 1,0 χ 6,0 cm méretű dDAP-oszlopot legalább 3 oszloptérfogatnyi híg ecetsavval mossuk. Részlegesen tisztított rekombináns MR-KPB-hPI 17 g/1 koncentrációjú oldatának kémhatását pH=3,5 értékre állítjuk be 10%-os (térfogat) sósavoldattal vagy 10%-os (vegyes) nátrium-hidroxid-oldattal. A 17 g/1 koncentrációjú MR-KPB-hPI oldatot 3,4 mg/ml és 0,85 mg/ml koncentrációjúra hígítjuk híg ecetsavval.

Szobahőmérsékleten (20-22 °C) különböző átfolyási sebességgel (115, 76 és 23 cm/óra) visszük a 17 mg/ml, 3,4 mg/ml és 0,85 mg/ml koncentrációjú oldatokat az oszlopokra. Miután legalább 2 oszloptérfogatnyi eluens átment az oszlopon, minden átfolyási sebességnél mintákat gyűjtünk. Az MR-KPB-hPI KPB-hPI-vé való átalakításának mértékét fordított fázisú HPLC-vel - Dupont Zorbax®, 5 μ. 300 Á oszlop (15x4,6 cm) - határozzuk meg. Az elúcióhoz morfolin/foszfát/OSA pufferrendszerben kialakított acetonitrilgradienst használunk.

A hozam és az átfolyási sebesség közti összefüggés lényegében azonos volt valamennyi szubsztrátkoncentrációnál. (115 cm/óra átfolyási sebességnél a 17, 3,4 és 0,85 g/1 koncentrációjú oldatok hozama 48%, 50%, illetve 50%; a 76 cm/óra koncentrációnál a megfelelő hozamok: 55%, 58%, illetve 58%; 23 cm/óra átfolyási hozamnál ezek az értékek: 83%, 89%, illetve 85%). Ez azt bizonyítja, hogy 10 U/cm² immobilizált dDAP-t hordozó oszlopnál az átalakítás hozamát a szubsztrátkoncentráció nem befolyásolja.

10. példa

Met-Arg-humán proinzulinanalóg (B28 Lys, B29 Pro) átalakítása újra kialakított dDAP-oszlopon

A 8. példában alkalmazott oszlop gyantáját újra felszuszpendáljuk 1 oszloptérfogatnyi híg ecetsavval. Megtöltjük az oszlopot, és legalább 3 oszloptérfogatnyi híg ecetsavval mossuk. Részlegesen tisztított MRKPB-hPI 17 g/1 koncentrációjú oldatának kémhatását pH = 3,5 értékre állítjuk 10%-os (térfogat) sósavval vagy 10%-os (vegyes) nátrium-hidroxid-oldattal.

Az MR-KPB-hPI oldatot szobahőmérsékleten (20-22 °C), különböző lineáris áramlási sebesség mellett (115, 76, 38, 23,10 és 4 cm/óra) visszük az oszlopra. Amint legalább 2 oszloptérfogatnyi eluens átment az oszlopon, mintákat gyűjtünk mindegyik átfolyási sebességnél. Az MR-KPB-hPI KPB-hPI-vé való átalakításának mértékét fordított fázisú HPLC-vel határozzuk meg (Dupont Zorbax®, 5 μ, 300 Á), oszlop 15 x 4,6 cm méretű). Elúcióhoz morfolin/foszfát/OSA pufferben kialakított acetonitrilgradienst alkalmazunk.

A hozam és az áramlási sebesség közötti összefüggés lényegében azonos, mint a felszuszpendálás előtti oszlopnál. 115 cm/óra átfolyási sebességnél a hozam 39%-os, ami összevethető az újraszuszpendálás előtt oszlop 38-41%-ával.

11. példa

Met-Arg-humán proinzulinanalóg (B28 Lys, B29 Pro) nagyméretű átalakítása

A 7. példában leírtak szerint 7 literes (30 χ 10 cm) 10 U/cm² aktivitású immobilizált dDAP-oszlopot készítünk. Az oszlopot legalább 4 oszloptérfogatnyi híg ecetsavval, pH=3,5, mossuk. Részlegesen tisztított MRKPB-hPI-ből (körülbelül 3488 g) 218 liter 16 g/1 koncentrációjú oldatot készítünk, és a kémhatását pH=3,5

HU 219 544 Β értékre állítjuk be 10%-os (térfogat) sósavval vagy 10%-os (vegyes) nátrium-hidroxid-oldattal. Az MRKPB-hPI oldatot 4 °C-ról 21 °C hőmérsékletre melegítjük és a feldolgozás ideje alatt (30-35 óra) 21 °C hőmérsékletet tartunk. Az oldatot 10 cm/óra sebességgel visszük az oszlopra. Kétóránként mintát veszünk az átalakítás nyomon követésére. Miután az MR-KPB-hPI oldat elfogyott, az oszlopot 3 oszloptérfogatnyi híg ecetsavval, pH=3,5, mossuk 10 cm/óra áramlási sebességnél. Az első oszloptérfogatot összegyűjtjük és a KPBhPI eluenssel együtt tároljuk. Az oszlopot híg ecetsavban tartjuk el 21 °C hőmérsékleten.

Az MR-KPB-hPI KPB-hPI-vé való átalakulását fordított fázisú HPLC-vel követjük nyomon (Dupont Zorbax®, 5 μ, 300 Á gyanta; 15x4,6 cm oszlopméret). Az oszlopot izokratikus morfolin/OSA/acetonitril pufferral eluáljuk. Az A puffer (25% acetonitril) és a B puffer (50% acetonitril) elegyét 38-42% acetonitril-koncentráción tartjuk. Az átlagos átalakítás 98%-os.

nap után az oszlopot legalább 3 oszloptérfogatnyi híg ecetsavval öblítjük át 20 °C hőmérsékleten. Az oszlop dDAP-aktivitásra vonatkozó átfolyását GFpNAaktivitási vizsgálattal állapítjuk meg. Az oszlopról lejövő átfolyási frakcióban aktivitás nem állapítható meg, jelezve, hogy nincs jelentős dDAP-aktivitás-szivárgás az oszlop gyantájáról.

242 liter 17,5 g/1 koncentrációjú részlegesen tisztított MR-KPB-hPI oldat kémhatását pH=3,5 értékre állítjuk be 10%-os (térfogat) sósavval vagy 10%-os (vegyes) nátrium-hidroxid-oldattal. Az MR-KPB-hPI oldat hőmérsékletét 2-4 °C-on tartjuk a feldolgozás alatt (30-35 óra). Egy beépített hőcserélővel az MR-KPBhPI oldatot 20-22 °C-ra melegítjük és 10 cm/óra áramlási sebességgel rávisszük az oszlopra.

Az oszlopra vitt anyagból és az eluátumból kétóránként mintát veszünk az átalakítás megállapítására. Amikor az MR-KPB-hPI oldat elfogyott, az oszlopot 3 oszloptérfogatnyi híg ecetsavval mossuk 10 cm/óra átfolyási sebességnél. Az első oszloptérfogatnyi mosófolyadékot összegyűjtjük és a KPB-hPI eluátummal együtt tároljuk; a másik két oszloptérfogatnyi mosófolyadékot, mint hulladékot gyűjtjük össze.

Az MR-KPB-hPI KPB-hPI-vé való átalakulásának mértékét fordított fázisú HPLC-vel állapítjuk meg (Dupont Zorbax® 5 μ, 300 Á; oszlopméret 15 x4,6 cm). Az oszlopot izokratikus morfolin/OSA/acetonitril pufferrel eluáljuk. Az A puffer (25% acetonitril) és a B puffer (50%-os acetonitril) elegyét 38-42%-os acetonitrilkoncentráción tartjuk. Az átalakítási hozam átlagos értéke 92%.

12. példa

A dDAP kovalens immobilizálása és felhasználása a Met-Asp-humán növekedési faktor átalakítása

Egy gramm CH Sepharose®4B (Pharmacia) gyantát 100 mM ecetsavban, pH=5, duzzasztunk. Egy ml duzzasztott gyantán alaposan kimossuk további 100 mM ecetsavval, pH=7,5, 1:1 arányú (térfogat) gyanta és puffer szuszpenzióhoz hozzáadunk 23 mM tisztított dDAP-t (az 1. és 2. példa szerint előállítva). A keveréket átfordítással lassan kevertetjük 4 °C hőmérsékleten 18 órán át. A gyantát szobahőmérsékleten 0,5 x 5 cm méretű oszlopba töltjük (1 ml) (Pharmacia®HR 5&5) és 0,2 ml/perc (16,7 cm/óra) átfolyási sebességnél 2,0 ml 0,5 M Tris®-pufferrel, pH=7, mossuk. A Tris®-pufferrel további 30 percen át inkubáljuk a gyantát, hogy kioltsuk a maradék aktív helyet. Az oszlopot tovább mossuk 2,0 ml 0,05 M ecetsav, pH=3,5; 2 ml 0,5 M Tris®, 0,5 M nátrium-klorid, pH=7 és 4,0 ml 0,05 M ecetsav, pH=3,5 átfolyatásával, hogy előkészítsük és kiegyensúlyozzuk az oszlopot a fehérje-előanyaggal való reagáltatáshoz.

A Met-Asp-hGH oldhatatlan fehérjeként keletkezik az E. coli citoplazmájában. Az oldhatatlan fehérjét oldhatóvá tesszük, megfelelő diszulfídhidakkal párosított, redőzött Met-Asp-hGH-t alakítunk ki és ioncserélő kromatográfiával tisztítjuk. Kicseréljük a preparátum oldószerét, és az oldat kémhatását pH=3,5 értékre állítjuk be. Ezt a fehérjeelőanyag-oldatot használjuk fel szubsztrátként az immobilizált dDAP-oszlophoz. Az oldat 280 nm-en mért elnyelési értékéből számolva, a MetAsp-hGH koncentráció 5 mg/ml körüli.

A Met-Asp-hGH előanyag (5 mg) oldatát 1,25 cm/óra egyenletes áramlási sebességgel visszük az oszlopra. Az oszlop átfolyási frakcióját tízszeresre hígítjuk 100 mM Tris®-pufferben, pH=8, ami 30% acetonitrilt tartalmaz. Fordított fázisú kromatográfrával analizálva, a humán növekedési faktor (hGH) hozama 37%-osnak adódik. A további vizsgálatok azt mutatták, hogy még 60 mg Met-Asp-hGH oldatát képes az oszlop átalakítani átlagosan 33%-os hozammal. Az időnkénti mintavétel azt jelzi, hogy a hGH-hozam állandó értéken van az oszlopon való áthaladás alatt.

Az adagonkénti („batch” módú) reakcióval 390 mU dDAP-re lenne szükség 65 mg Met-Asp-hGH feldolgozásához. A kísérletek bizonyítják, hogy a kovalens kötéssel immobilizált dDAP alkalmazásával többszörösen kevesebb mennyiségű dDAP-enzimre van szükség azonos mennyiségű Met-Asp-hGH-nak hGH-vá való átalakításánál, mint a „batch’módú eljárásnál.

13. példa

Met-Arg-humán proinzulinanalóg (B28 Lys, B29 Pro) átalakítása reciklizált és nem folyamatos módon

A 7. példában leírtak szerint 0,5-5 cm méretű oszlopot készítünk 10 U/cm² dDAP-aktivitással. A részlegesen tisztított rekombináns MR-KPB-hPI oldat (körülbelül 17 g/1 koncentrációjú) kémhatását pH=3,5 értékre állítjuk be 10%-os (térfogat) sósavoldattal vagy 10%-os (vegyes) nátrium-hidroxid-oldattal. Az MR-KPB-hPI oldatot szobahőmérsékleten (20-22 °C) 1000 cm/óra átfolyási sebességgel visszük az oszlopra. Körülbelül 8 oszloptérfogatnyi eluátum után az eluátumot visszavezetjük az oszlopra viendő anyag tartályába, és a tartályból időnként mintákat veszünk.

Az MR-KPB-hBI KPB-hPI-vé való átalakítását fordított fázisú HPLC-vel követjük nyomon. A kromatografáláshoz Dupont Zorbax®, 5 μ 300 Á; 15 x 4,6 cm méretű oszlopot használunk, az elúcióhoz morfolin/foszfát/OSA pufferben kialakított acetonitriles gradienst

HU 219 544 Β használunk. 1, 2 és 3 átmeneti ekvivalens (oszlopon átment össztérfogat osztva az oszlopra viendő anyag anyag tartályában és a vezetékben lévő folyadék össztérfogatával) után a hozam 58, 71, illetve 80%.

Az előzőek szerint elkészített oszlopot legalább 3 oszloptérfogatnyi híg ecetsavval mossuk. Az előzőek szerint elkészített MR-KPB-hPI oldatot szobahőmérsékleten (20-22 °C), 150 és 50 cm/óra áramlási sebesség melett visszük az oszlopra. Az eluátumot összegyűjtjük, és az összeluátumot 2-3-szor ismételten rávisszük az oszlopra. Az ismételt ráviteleket egymástól elkülönített módon végezzük (nem folyamatos módon). Az MR-KPB-hGH KPB-hGH-vá történő átalakításának mérésére az előzőekben ismertetett analitikai eljárást használjuk. Az egyes rávitelek hozama 150 cm/óra áramlási sebességnél 59%, 81%, illetve 85%; 50 cm/óra áramlási sebességnél 75%, 86%, illetve 89%.

Az eredmények azt igazolják, hogy nagyobb egyenletes áramlási sebességnél a kívánt átalakítási hozamot kaphatjuk meg egyetlen oszlopon az eluátum cirkuláltatásával vagy az elkülönített ismételt rávitellel is.

14. példa

A Met-Arg-humán proinzulinanalóg (B28 Lys, B29 Pro) átalakítása sorba kötött immobilizált dDAP-oszlopokon

A 7. példában leírtak szerint elkészítünk három, egyenként 0,5 χ 4,5 cm méretű oszlopot, melyeken a dDAP-aktivitás 10 U/cm². Az oszlopokat sorba kötjük és 3 oszloptérfogatnyi híg ecetsavval mossuk. A részlegesen tisztított rekombináns MR-KPB-hPI oldat (koncentráció: 17 g/1) kémhatását pH=3,5 értékre állítjuk be 10%-os (térfogat) sósavval vagy 10%-os (vegyes) nátrium-hidroxid-oldattal. Az MR-KPB-hPI oldatot szobahőmérsékleten (20-22 °C) 40-50 cm/óra áramlási sebességgel visszük rá az oszlopra.

Az MR-KPB-hPI KPB-hPI-vé történő átalakulását fordított fázisú HPLC-vel követjük nyomon. A kromatografáláshoz Dupont Zorbax®, 5 μ, 300 Á; 15 x 4,6 cm méretű oszlopot használunk, az eluáláshoz morfolin/foszfát/OSA pufferben kialakított acetonitrilgradienst alkalmazunk. A hozam 84-90% közé esik.

Az eredmények azt bizonyítják, hogy a kívánt hozam érhető el nagy áramlási sebességnél, ha több oszlopot sorba kapcsolunk.

15. példa

Met-Arg-(humán proinzulin) átalakítása

A Met-Arg-(humán proinzulin) (Met-Arg-hPI) oldhatatlan fehérjeként keletkezik az E. coli citoplazmájában. Az oldhatatlan fehérjét 7 M karbamidoldatban oldjuk és ioncserélő kromatográfiával tisztítjuk. A MetArg-hPI-t szulfitkezeljük, az oldószert kicseréljük és kialakítjuk a natív diszulfidhíddal kötött párokat és a natív harmadlagos szerkezetet. Az anyagot tovább tisztítjuk fordított fázisú kromatografálással.

Az oxidált metionin Met(O)-Arg-hPI terméket MetArg-hPI-ből állítjuk elő hidrogén-peroxiddal történő oxidálással.

mg/ml koncentrációjú Met-Arg-hPI oldatot készítünk 20 mM glicinpufferben, pH=3,5. 2,4 mg szubsztrátot inkubálunk 0,19 milliegység dDAP-enzimmel pH=3,5 kémhatásnál. A reakciót szobahőmérsékleten hajtjuk végre. Időnként mintát veszünk és 10%-os foszforsavval meghígítjuk. Ezt a hígított mintát közvetlenül semleges, fordított fázisú HPLC-oszlopra visszük, és vizsgáljuk a Met-Arg-hPI vagy Met(O)-Arg-hPI eltűnését és a hPI megjelenését. Emellett olyan hígításokat is végzünk a kivett mintákkal, ami lehetővé teszi a MetArg vagy Met(O)-Arg dipeptidek megjelenésének nyomon követését. 8 óra alatt a Met-Arg-hPI fehérjének körülbelül 60%-a alakult át hPI-vé. A hasítás mértéke mindkét szubsztrátnál hasonló. Ez az eredmény meglepő, mert a borjú-dAP-I-enzim nem képes hasítani a hPI Met(O)X származékát, ahol az X jelentése Arg, Phe vagy Tyr. A fordított fázisú analízis azt mutatja, hogy a Met-ArghPI szubsztrátról Met-Arg dipeptid hasad le, a Met(O)Arg-hPI szubsztrát esetében egy csúcs jelenik meg a Met-Arg dipeptid megjelenési helyén, ami a Met(O)-Arg dipeptiddel lehet azonos. A dDAP oxidált, Met(O)-X szubsztrát hasítóképessége előnyt jelent más enzimekkel szemben, melyek képtelenek ezt a reakciót elvégezni.

Claims (18)

1. SZABADALMI IGÉNYPONTOK

   1. Eljárás aminoterminális dipeptid vagy dipeptidek polipeptid-előanyagról történő eltávolítására kész polipeptid előállítása céljából, azzal jellemezve, hogy

   a) a Dictyostelium discoideumból származó dipeptidilaminopeptidázt (dDAP) alkalmas hordozófelszínre kötjük;

   b) a polipeptid-előanyagot az aminoterminális dipeptid vagy egymást követően az aminoterminális dipeptidek eltávolítására alkalmas körülmények között érintkezésbe hozzuk az immobilizált dDAP-enzimmel; és

   c) kinyerjük a kész polipeptidet.
2. 2. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy polipeptid-előanyagként humán proinzulin, humán proinzulinanalógok vagy humán növekedési hormon előanyagát alkalmazzuk.
3. 3. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy polipeptid-előanyagként Met-Asp-humán növekedési hormont, [Met-Arg-humán proinzulinanalógot (B28 Lys, B29 Pro)] vagy Met-Arg-humán proinzulint alkalmazunk.
4. 4. A 3. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy polipeptid-előanyagként [Met-Arg-humán proinzulinanalógot (B28 Lys, B29 Pro)] alkalmazunk.
5. 5. A 3. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy polipeptid-előanyagként Met-Asp-humán növekedési hormont alkalmazunk.
6. 6. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a dDAP-enzimet nem kovalensen kötjük a hordozófelülethez.
7. 7. A 6. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy polipeptid-előanyagként humán proinzulint, humán proinzulinanalógot vagy humánnövekedésihormon-előanyagot alkalmazunk.

   HU 219 544 Β
8. 8. A 6. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy polipeptid-előanyagként Met-Asp-humán növekedési hormont [Met-Arg-humán proinzulinanalógot (B28 Lys, B29 Pro)] vagy Met-Arg-humán proinzulint alkalmazunk.
9. 9. A 8. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy polipeptid-előanyagként MR-KPB-hPI [Met-Arghumán proinzulinanalógot (B28 Lys, B29 Pro)] alkalmazunk.
10. 10. A 9. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy hordozóként a Q-szefarózt alkalmazzuk.
11. 11. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a dDAP-enzimet kovalens kötéssel kötjük a hordozófelülethez.
12. 12. A 11. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy polipeptid-előanyagként a humán proinzulint, humán proinzulinanalógot vagy a humán növekedési hormon előanyagát alkalmazzuk.
13. 13. All. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy polipeptid-előanyagként Met-Asp-humán növekedési hormont [Met-Arg-humán proinzulinanalógot (B28 Lys, B29 Pro)] vagy Met-Arg-humán proinzulint alkalmazunk.
14. 14. A 13. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy polipeptidként a Met-Asp-humán növekedési hormont alkalmazzuk.
15. 15. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a polipeptid-előanyagot ismételten érintkezésbe hozzuk a dDAP-ággyal.
16. 16. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a polipeptid-előanyagot egyszer vagy többször cirkuláltatjuk ugyanazon dDAP-ágy felett.
17. 17. A 15. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a polipeptid-előanyagot egymást követően két vagy több immobilizált dDAP-ágy felett vezetjük el.
18. 18. A 17. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az immobilizált dDAP-ágy elkészítéséhez Qszefarózt használunk és polipeptid-előanyagként a Met-Arg-humán proinzulinanalógot (B28 Lys, B29 Pro) alkalmazzuk, amit egymást követően három különálló Q-szefaróz dDAP-ágy felett vezetünk el.

    Kiadja a Magyar Szabadalmi Hivatal, Budapest A kiadásért felel: Törőcsik Zsuzsanna főosztályvezető-helyettes Windor Bt., Budapest