HU216310B - Eljárás citokinszintézis inhibitorfaktor (CSIF), CSIF-aktivitású polipeptidek és CSIF-antagonisták, valamint ezeket tartalmazó gyógyszerkészítmények előállítására - Google Patents
Eljárás citokinszintézis inhibitorfaktor (CSIF), CSIF-aktivitású polipeptidek és CSIF-antagonisták, valamint ezeket tartalmazó gyógyszerkészítmények előállítására Download PDFInfo
- Publication number
- HU216310B HU216310B HU906705A HU670590A HU216310B HU 216310 B HU216310 B HU 216310B HU 906705 A HU906705 A HU 906705A HU 670590 A HU670590 A HU 670590A HU 216310 B HU216310 B HU 216310B
- Authority
- HU
- Hungary
- Prior art keywords
- priority
- csif
- cytokine synthesis
- polypeptide
- sequence
- Prior art date
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
- C07K16/24—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against cytokines, lymphokines or interferons
- C07K16/244—Interleukins [IL]
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
- A61P37/02—Immunomodulators
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
- C07K14/54—Interleukins [IL]
- C07K14/5428—IL-10
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/70—Vectors or expression systems specially adapted for E. coli
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/10—Cells modified by introduction of foreign genetic material
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Zoology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Immunology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Compounds Of Unknown Constitution (AREA)
- Acyclic And Carbocyclic Compounds In Medicinal Compositions (AREA)
Abstract
A találmány emlős-citőkinszintézist gátló faktőr (CSIF), CSIF-aktivitású pőlipeptidek és CSIF-antagőnisták rekőmbináns útőn történőelőállítására, és az erre szőlgáló DNS-szekvenciák, rekő binánsexpressziós vektőrők és ezeket tartalmazó gazdasejtek előállításáravőnatkőzik. A találmány tárgyát képezi tővábbá a fenti CSIF-aktivitásúpeptideket tartalmazó gyógyszerkészítmények előállítása, melyek MCH-hez kötött, hűmőrális vagy sejt közvetítette, nem megfele őimműnválasszal társűlt betegségek kezelésére szőlgálnak. ŕ
Description
A találmány tárgyát emlős-citokinszintézist gátló faktor (CSIF), CSIF-aktivitású polipeptidek, CSIF-antagonisták előállítására szolgáló rekombináns eljárások képezik. Ezek a fehérjék képesek bizonyos, az immunrendszerben szereplő citokinek szintézisét befolyásolni, és ezáltal alkalmazásukkal terápiás hatás érhető el. A találmány továbbá az immunrendszer kiegyensúlyozatlanságával, főleg a humorális és sejtek által közvetített immunválaszok kiegyensúlyozatlanságával kapcsolatos betegségek kezelésére szolgáló gyógyszerkészítmények előállítására is vonatkozik, amelyek a találmány szerinti CSIF-fehéqéket tartalmazzák.
Az antigénekre adott immunválaszokat úgy osztályozzák, hogy lehetnek sejtek által közvetített immunválaszok, ilyen például a késleltetett típusú hiperszenzitivitás (DTH), vagy humorális sejtválaszok, ilyen például az antitestek termelése. A sejtek által közvetített immunitás kiemelkedő fontosságú a daganatok kivetésében, valamint számos, vírusok, baktériumok, egysejtűek és gombák által okozott fertőzésből való felgyógyulásban. Ezzel szemben a humorális immunválasz az immunitás leghatékonyabb formája a mérgező anyagoknak és a betörő mikroorganizmusoknak az eltávolítására a keringésből. Megfigyelték, hogy különböző antigének esetében az említett kétféle válasz közül az egyik gyakran túlsúlyban van, egymást kölcsönösen kizáró módon, és bizonyos betegségek súlyossága, például a lepráé, a leishmaniázisé és bizonyos fajta autoimmun betegségeké, annak a következménye lehet, hogy az egyik fajta válasz nem megfelelő módon domináns a másikkal szemben [Mosmann et al., Immunoi. Today, 8, 223-227 (1987)]; Mosmann et al., Ann. Rév. Immunoi., 7, 145-173 (1989); Parish, Transplant Rév., 13, 35-66 (1972); és Liew, Immunoi. Today, 10, 40-45 (1989)]. Azt is megfigyelték még, hogy a citokinek csoportjai elkülönülten kapcsolódnak a DTH-reakciókhoz és a humorális immunválaszokhoz [Cher et al., J. Immunoi., 138, 3688-3694 (1987); Mosmann et al., Immunoi. Today, 8, 223-227 (1987); Mosmann et al., Ann. Rév. Immunoi., 7, 145-173 (1989)], és az a vélemény, hogy az ezekhez a válaszokhoz kapcsolódó betegségeket a kapcsolódó citokinek nem megfelelő termelődése okozza.
Nagyon sok bizonyíték van arra, hogy a gamma-interferon (gamma-IFN) túltermelése a felelős a nagy hisztokompatibilitási komplexhez kapcsolódó autoimmun betegségekért [Hooks et al., New England J. Med., 301, 5-8 (1979) (az IFN-gamma megemelkedett szérumszintje és az autoimmunitás kapcsolata); Basham et al., J. Immunoi., 130, 1492-1494 (1983) (az IFN-gamma képes fokozni az MHC-géntermék expresszióját); Battazzo et al., Láncét, 1115-1119 (11/12/83) (aberráns MHC-géntermék expresszié és az autoimmunitás néhány formájának korrelációja); Hooks et al., Ann. N. Y. Acad. Sci., 301, 21-32 (1980) (A magasabb IFNgamma-szintek korrelációja az SLE-betegek súlyosabb állapotával, és az interferonnövelő hatása a hisztamin felszabadulásra gátolható antiinterferonszérumokkal); Iwatani et al., J. Clin. Endocrin. and Métából., 63, 695-708 (1986) (anti-IFN-gamma monoklonális antitestek eliminálják a leukoagglutinin által stimulált Tsejteknek azt a képességét, hogy a HLA-DR expressziót indukálják)]. Azt tételezik fel, hogy a fölöslegben levő IFN-gamma okozza az MHC-géntermékek helytelen expresszióját, amelyek azután okozzák az autoimmun reakciót azokkal a szövetekkel szemben, amelyeknek a sejtjei nem megfelelő módon expresszálják az MHCtermékeket, és a termékek összefüggésben autoantigéneket mutatnak.
A klinikai parazitológia területén az utóbbi időkben figyelték meg, hogy az IFN-gamma és az IL-2 szintje fontos faktor az egysejtűek által okozott fertőzés, leishmaniázis kifejlődésében és/vagy visszafejlődésében. Pontosabban, a megfelelő szintű IFN-gamma jelenléte szükségesnek tűnik ahhoz, hogy a fertőzött makrofágokat aktiválják, hogy ezzel eliminálják az intracelluláris amasztigótákat [Mauel and Behin, in Cohen et al., eds., Immunology of Parasitic Infections (Blackwell, London, 1982)]. Emellett a betegség rágcsálómodelljében kimutatták, hogy az IFN-gamma magas szintje és az IL-4 alacsony szintje a visszafejlődéshez kötődik, míg az IFN-gamma alacsony szintje és az IL-4 magas szintje a leishmaniázis kifejlődésével állnak kapcsolatban [Heinzel et al., J. Exp. Med. Vol., 169, 59-72 (1989)].
A fentiek alapján előnyös lenne, ha olyan hatóanyaggal rendelkeznénk, amely az egyik immunválasz túlsúlyát el tudja tolni a másik irányába, pontosabban, amelyik képes az IFN-gamma vagy más citokinek szintézisét elnyomni vagy fokozni, amint az a terápiához szükséges. Az ilyen hatóanyagok nagyon előnyösek az elégtelen vagy nem megfelelő immunválasszal kapcsolódó betegségek kezelésében, például a szövetek kilökődésében, a leishmaniázisban és más parazita betegségekben, valamint az MHC-hez kapcsolódó immunológiai rendellenességekhez, beleértve a reumatoid artritiszt, a szisztémás lupus erythematosust (SLE), a myasthenia gravist, az inzulinfüggő cukorbetegséget, a tiroiditiszt és hasonlókat.
A találmány tárgya eljárás emlős-citokinszintézist gátló faktor (CSIF), CSIF-peptidek és CSIF-antagonisták előállítására. Ide tartoznak a CSIF-aktivitást mutató polipeptideket kódoló nukleinsavak, valamint a polipeptidek, agonista és/vagy antagonista analógjaik előállítására szolgáló eljárások, valamint alkalmazási módszerük a citokinegyensúly felborulásával kapcsolatos rendellenességek kezelésében, főleg azoknak a rendellenességeknek a kezelésében, amelyek a nem megfelelő fajta immunválaszhoz vezetnek. A találmány tárgya továbbá a CSIF vagy antagonistái alkalmazása, egyedül vagy vakcina adjuvánsaként, arra a célra, hogy szelektíven indukáljanak egy főleg sejtek által közvetített immunválaszt vagy egy főleg humorális immun választ. A CSIF antagonistái előnyösen olyan monoklonális antitestekből származnak, amelyek képesek blokkolni a CSIF biológiai aktivitását. A találmány szerinti nukleinsavakat úgy határozzuk meg, hogy (1) mennyiben homológok vagy mennyire képesek kimutatható hibrideket képezni az ismertetett klónozott komplementer DNS-szekvenciáival, és (2) a nukleinsavak által kódolt polipeptidekre alkalmazott CSIF-aktivitás funkcionális vizsgálata alapján.
A továbbiakban a „CSIF-aktivitás” szakkifejezést olyan fehéqére vagy polipeptidre használjuk, amely képes gátolni vagy jelentősen csökkenteni az alábbi citokinek közül legalább egynek a termelési szintjét, az alábbiakban ismertetett vizsgálatokban: IFN-gamma, interleukin-2 (IL-2), limfotoxin, interleukin-3 (IL—3), vagy granulocita-makrofág kolónia stimuláló faktor (GM-CSF).
A találmány egy előnyös megvalósítási formája egy nyitott leolvasási keret által meghatározott, érett, humán CSIF, amelyet az alábbi aminosavszekvenciával lehet leírni:
MHSSALLCCLVLLTGVRASPGOGTQSENSCTHFPGNLPNM
LRDLRDAFSRVKTFFQMKDQLDNLLLKESLLEDFKGYLGC
QALSEMIQFYLEEVMPQAENQDPDIKAHVNSLGENLKTLR
LRLRRCHRFLPCENKSKAVEQVKNAFNKLQEKGIYKAMSE
FDIFINYIEAYMTMKIRN, ahol az L-aminosavak egybetűs kódját (lásd az alábbiakban) soroljuk fel, balról jobbra az N-terminális metionintól kezdve. Még előnyösebben az érett humán CSIFet az alábbi aminosavszekvenciával határozzuk meg, amely azonos a fenti szekvenciával, de hiányzik az Nterminálisról egy 18 tagú szignálpeptid:
SPGQGTQSENSCTHFPGNLPNMLRDLRDAFSRVKTFFQMK
DQLDNLLLKESLLEDFKGYLGCQALSEMIQFYLEEVMPQA
ENQDPDIKAHVNSLGENLKTLRLRLRRCHRFLPCENKSKA
VEQVKNAFNKLQEKGIYKAMS EFDIFINYIEAYMTMKIRN.
Ezekben a szekvenciákban a standard egybetűs kódot használjuk, ahol az egyes betűk az alább megadott aminosavmaradékokat jelzik:
A | Alá | Alanin | M | Met | Metionin |
C | Cys | Cisztein | N | Asn | Aszparagin |
D | Asp | Aszparaginsav | P | Pro | Prolin |
E | Glu | Glutaminsav | Q | Gin | Glutamin |
F | Phe | Fenilalanin | R | Arg | Arginin |
G | Gly | Glicin | S | Ser | Szerin |
H | His | Hisztidin | T | Thr | Treonin |
I | Ile | Izoleucin | V | Val | Valin |
K | Lys | Lizin | w | Trp | Triptofán |
L | Leu | Leucin | Y | Tyr | Tirozin |
A találmány részben azoknak a cDNS-eknek a kinyerésén és klónozásán alapul, amelyek képesek a CSIFaktivitással rendelkező fehéijéket expresszálni. Ennek megfelelően, számos ilyen kiónt, jelük pcD(SRa)F115 (az egér CSIF-génjét hordozza) és pH5C, illetve pH15C (mindegyik a humán CSIF-gént tartalmazza), helyeztünk letétbe az American Type Culture Collectionnál (ATCC Rockville, MD), 68 027, 68 191 és 68 192 letéti számon.
Az ábrák rövid leírása
Az 1. ábrán egy dózis-hatás összefüggés látható különböző mennyiségű CSIF-fel kezelt egér T-sejtekben az IFN-gamma-szintézis gátlásában.
A 2. ábra egy diagram, amely a pH5C és a pH15C emlős expressziós vektorok fő tulajdonságait ábrázolja.
A 3. ábrán a TAC-RBS-hCSIF-plazmid polilinkerrégióját mutatjuk be.
A 4. ábrán a pH15C cDNS inszert nukleotidszekvenciáját mutatjuk be. (A jelölt 1-178 aminosavszekvencia azonos az leírásban egybetűs kódokkal megadott aminosavszekvenciával.)
A találmány tárgyai a pH5C, pH15C és a pcD(SRa)F115 plazmidok cDNS-inszertjeinek legnagyobb nyílt leolvasási kereteiről és a megfelelő homológ cDNS-ekről szintetizálódó érett polipeptidek vagy fehéqék, valamint ezek antagonistái. A szekretált fehéijék esetében egy nyitott leolvasási keret általában egy olyan polipeptidet kódol, amely egy érett vagy szekretált polipeptidet tartalmaz, az N-terminálisánál egy szignálpeptidhez kötve. A szignálpeptid az érett vagy aktív polipeptid szekréciója előtt lehasad. A hasítási hely nagy pontossággal megjósolható gyakorlati szabályok alapján [von Heijne, Nucleic Acids Research, 14, 4683-4690 (1986)], és a szignálpeptid pontos aminosavszekvenciája nem tűnik kritikusnak a funkció szempontjából [Randall et al., Science, 243, 1156-1159 (1989); Kaiser et al., Science, 235, 312-317 (1987)]. Ennek következtében az érett fehérjék könnyen expresszálódnak olyan vektorokkal, amelyek a pH5C, pH15C és pcD(SRa)-Fl 15 vektorok cDNSinszertjeinek nyitott leolvasási kerete által kódolttól eltérő szignálpeptidet kódolnak.
I. CSIF cDNS készítése és expresszálása
A „megfelelő mértékben homológ” szakkifejezést a továbbiakban olyan nukleotidszekvenciára alkalmazzuk, amelyet a találmány szerinti cDNS-klónból származó hibridizációs próbával ki lehet mutatni. A CSIF-aktivitást kódoló nukleinsavak kimutatásához szükséges homológia pontos, számszerű mértéke számos faktortól függ:
1) a kiválasztott nukleinsavhoz kapcsolódó, nem CSIF-kódoló szekvenciákkal való homológia;
2) a hibridizáció körülményei mennyire szigorúak;
3) egyszálú vagy kétszálú próbákat használunk;
4) RNS- vagy DNS-próbákat használunk;
5) milyen intézkedéseket tettünk a próba aspecifikus kötődésének megakadályozására;
6) a próba jelzésére használt módszer természete;
7) a quanidin- és citozinbázisok aránya a próbában;
8) a próba és a kiválasztott nukleinsav közötti eltérések eloszlása;
9) a próba mérete; és hasonlók.
Egy megfelelő mértékben homológ nukleinsavszekvencia előnyösen legalább 90%-ban homológ a találmány szerinti cDNS-sel. Pontosabban, megfelelő mértékben homológ szekvenciáról akkor beszélhetünk, ha a cDNS-ét a pcD(SRa)-F115, pH5C, pH15C, vagy ezek ekvivalenseinek megfelelő cDNS-inszertről készült próbával lehet izolálni, a példákban ismertetett hibridizációs eljárásokat alkalmazva, csak néhány, azaz nem több, mint száz hibás pozitív jelet kapva. Igen sok irodalmi hivatkozás foglalkozik azzal, hogy az ilyen körülmények kiválasztásához irányt mutasson [Hames et al., Nucleic Acids Hybridization: A Practical Approach (IRL Press, Washington, D. C., 1985); Gray et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 80, 5842-5846 (1983); Kafatos et al., Nucleic Acids Research, 7, 1541-1552 (1979);
HU 216 310 Β
Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd edition (Cold Spring Harbor Laboratory, New York, 1989); Beltz et al., Meth. in Enzymol, 100, 266-285 (1983)], csak hogy néhányat megnevezzünk.
A homológiát mint szakkifejezést a továbbiakban két nukleotid- (vagy aminosav-) szekvencia közötti hasonlóság mértékének meghatározására használjuk. A homológiát az egyező bázisok (vagy aminosavak) töredékében vagy százalékában fejezzük ki, miután két szekvenciát (valószínűleg nem egyforma hosszúak) egymás mellé illesztettünk. Az egymás mellé illesztés szakkifejezést abban az értelemben használjuk, ahogy azt Sankoff és Kruskal meghatározták a Time Warps, String Edits and Macromolecules: The Theory and Practice of Sequence Comparison (Addison Wesley, Reading, MA, 1983) első fejezetében. Röviden, két szekvenciát úgy teszünk egymás mellé, hogy maximalizáljuk az egyező bázisok (vagy aminosavak) számát a két szekvenciában, minimális számú „üres” vagy „null”-bázis beszúrásával akármelyik szekvenciába, hogy a maximális átfedést biztosítsuk. Adott két szekvencia esetén a számításhoz használható algoritmusok hozzáférhetők [Needleham and Wunsch, J. Mól. Bioi., 48, 443-453 (1970); Sankoff and Kruskal, Time Warps, String Edits and Macromolecules: The Theory and Practice of Sequence Comparison (Addison Wesley, Reading, MA, 1983)]. Ezenkívül fizetett szolgáltatások és szoftvercsomagok kaphatók ilyen összehasonlítások végzéséhez, például Intelligenetics, Inc., (Palo Alto, CA) és University of Wisconsin Genetics Computer Group (Madison, Wisconsin).
A találmány szerinti cDNS-eket hordozó vektorok restrikciós endonukleázos emésztéssel kapott fragmentjeit használjuk próbák készítésére (standard módszerek, például nick-transzláció alkalmazásával) [Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd edition (Cold Spring Harbor Laboratory, New York, 1989)], hogy gyenge hibridizációs körülmények között vizsgáljunk át genomiális vagy cDNS-könyvtárakat (ismét standard technikák alkalmazásával, amelyek olyan sejtekből származnak, amelyekről feltételezhető, hogy CSIF-et termelnek. Standard vizsgálati eljárásokat alkalmazunk [Grunstein et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 72, 3961 -3965 (1975); vagy Benton et al., Science, 196, 180-183 (1977); vagy Woo, Methods in Enzymology, 68, 389-396 (1979)]. Egy másik megoldás szerint a könyvtárakat jelzett oligonukleotid-próbákkal vizsgáljuk át, amelyeknek a szekvenciáját a pcD(SRct)-Fl 15, pH5C és pH15C cDNS-inszertek nukleotidszekvenciája alapján határozzuk meg. Ezeket a próbákat kereskedelmi forgalomban levő DNS-szintetizátorokkal (például Applied Biosystems 381A modell) állíthatjuk elő, standard módszerekkel [Gait, Oligonucleotide Synthesis: A Practical Approach (IRL Press, Washington D. C. (1984)]. Minden esetben az az előnyös, ha a próba legalább 18-30 bázis hosszú. Még előnyösebb, ha a próba legalább 50-200 bázis méretű. A hibridizációs próbákat arra is használhatjuk, hogy a CSIF mRNS feltételezett forrásait átvizsgáljuk a könyvtár készítése előtt.
Sok különböző egysejtes és többsejtes expressziós rendszert (azaz gazdaszervezet-expressziós vektor kombinációt) használhatunk a találmány szerinti fehérjék előállítására. A lehetséges gazdasejttípusok közé tartoznak, de nem korlátozzuk magunkat ezekre, a bakteriális élesztő-, rovar-, emlőssejtek és hasonlók. Számos összefoglaló készült, azzal a céllal, hogy eligazítsanak a specifikus expressziós rendszerek kiválasztásában és/vagy módosításában (de Boer and Shepard, „Strategies fór Optimizing Foreign Gene Expression in Escherichia coli, 205-247. oldal, in Kroon, ed., Genes: Structure and Expression” (John Wiley & Sons, New York (1983)]; összefoglalja az Escherichia coli expressziós rendszereket, [Kucherlapati et al., Critical Reviews in Biochemistry, 16 (4), 349-379 (1984), és Banerji et al., Genetic Engineering, 5, 19-31 (1983)] az emlőssejtek transzfektálásáról és transzformálásáról készített összefoglalót; [Reznikoff and Gold, eds., Maximizing Gene Expression (Butterworths, Boston, 1986)] összefoglalja az Escherichia coliban, élesztőben és emlőssejtekben való génexpresszió válogatott fejezeteit; és [Thilly, Mammalian Cell Technology (Butterworths, Boston, 1968)] az emlős expressziós rendszereket foglalja össze. Hasonlóképpen, számos összefoglaló található, amely leírja a specifikus cDNS-ek és kontrollszekvenciák kapcsolódásának és/vagy manipulálásának technikáit és körülményeit, amelyek alkalmasak a találmány szerinti megfelelő expressziós vektorok készítésére és/vagy módosítására [Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd edition (Cold Spring Harbor Laboratory, New York, 1989)].
Egy Escherichia coli expressziós rendszert Riggs ír le (4431739 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírás), amelyre a továbbiakban hivatkozunk. Az Escherichia coliban egy különösen jól használható prokarióta promoter a magas szintű expresszióhoz a tac promoter; ezt Boer írja le a 4551433 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírásban, amelyre a továbbiakban hivatkozunk. A szekréciós expressziós vektorok szintén elérhetők az Escherichia coli rendszerben. Különösen hasznosak a pIN-III-ompA vektorok [Ghrayeb et al., EMBO J., 3, 2437-2442 (1984)], amelyekben az átírandó cDNS-t az Escherichia coli ompA génjének az ompA szignálpeptidet kódoló részéhez íúzionáltatják, ami azzal az eredménnyel jár, hogy az érett fehéije szekretálódik a baktérium periplazmatikus terébe. A 4336336 és 4338397 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírások is ismertetnek prokariótákban működő szekréciós expressziós vektorokat. Ennek megfelelően ezeket a hivatkozásokat is említjük a továbbiakban.
Számos baktériumtörzs lehet megfelelő gazdaszervezet a prokarióta expressziós vektorokhoz, beleértve az Escherichia coli törzseket, például a W3110-et (ATCC 27 325), JA221-et, C600-at, ED767-et, LE392t, HBlOl-et, X1776-ot (ATCC 31 244), X2282-t, RR1et (ATCC 31 343) és az MRCI-t; a Bacillus substilis törzseit és más enterobaktériumokat, úgymint a Salmonella typhimurium vagy Serratia marcescens törzseket és a Pseudomonas különböző fajait.
A baktériumtörzsek, beleértve az Escherichia coli K12 X1776-ot, előállításának általános módszereit Curtis III írja le a 4190495 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírásban. Ennek megfelelően erre a szabadalomra is hivatkozunk a továbbiakban.
A prokarióta és eukarióta mikroorganizmusok mellett a többsejtű szervezetekből származó sejteket tartalmazó expressziós rendszereket is használhatjuk a találmány szerinti fehérjék előállításában. Különösen érdekesek az emlős expressziós rendszerek, mivel poszttranszlációs bioszintézisútjuktól nagyobb valószínűséggel várható el, hogy biológiailag aktív emlősfehérjét termelnek. Számos DNS-tumorvírust használtak emlős gazdaszervezetekben működő vektorként. Különösen fontosak azok a vektorok (sokan vannak), amelyek SV40 replikációs, transzkripciós szabványozószekvenciát tartalmaznak, bakteriális, replikációs és vagy transzlációs szabályozószekvenciát tartalmaznak, bakteriális, replikációs kontrollszekvenciához kapcsolva, ilyenek például az Okayama és Berg által kifejlesztett pcD vektorok [Mól. Cell. Bioi., 2, 161-170 (1982); és Mól. Cell. Bioi., 3, 280-289 (1983)], amelyeket Takebe és munkatársai fejlesztettek tovább [Mól. Cell. Bioi., 8, 466-472 (1988)]. Ezekre a közleményekre is hivatkozunk a továbbiakban. Más SV40-alapú emlős expressziós vektorok azok, amelyeket Kaufinan és Sharp ír le [Mól. Cell. Bioi., 2, 1304-1319 (1982)], valamint azok, amelyeket Clark és munkatársai írnak le [4675285 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírás], ezekre is hivatkozunk a továbbiakban. A fenti vektoroknak általában a majomsejtek az előnyös gazdaszervezetei. Az ilyen, az SV40 őri szekvenciáját és egy érintetlen A gént tartalmazó vektorok képesek önállóan szaporodni a majomsejtekben (így magasabb a kópiaszám és stabilabb, mint az önálló replikációra nem képes plazmidok esetében). Emellett az SV40 őri szekvenciát, egy érintetlen A gén nélkül, tartalmazó vektorok képesek önállóan szaporodni (de nem stabilan) COS7 majomsejtekben [Gluzman, Cell, 23, 175-182 (1981)], és hozzáférhetők az ATCC-nél (CRL 1615). A fenti SV40-alapú vektorok képesek más emlőssejteket is transzformálni, például a majom L-sejteket, oly módon, hogy integrálódnak a gazdaszervezet DNS-ébe.
Többsejtes szervezetek is lehetnek a CSIF-termelés gazdaszervezetei, például a rovarlárvák [Maeda et al., Natúré, 315, 592-594 (1985); Ann. Rév. Entomol., 351-372 (1989)] és a transzgenikus állatok [Janisch, Science, 240, 1468-1474(1988)].
II. A CSIF in vitro vizsgálata
A CSIF-aktivitás azt a tulajdonságot jelenti, hogy az IFN-gamma, limfotoxin, IL-2, IL-3 és GM-CSF csoportba tartozó citokinek közül legalább egynek a szintézisét gátolja egy T-helper sejtpopulációban, amelyet az említett citokinek közül egynek vagy többnek a szintézisére indukálunk szingenikus antigénbemutató sejteknek (APC) és antigénnek kitéve a sejteket. Az APC-ket előnyösen úgy kezelik, hogy nem képesek szaporodni, de az antigénprocesszáló mechanizmusuk működőképes marad. Ezt szokásosan úgy lehet elérni, hogy az APC-ket például körülbelül 1500-3000 R-rel (gammavagy röntgensugárzás) sugározzuk be, mielőtt összekeverjük a T-sejtekkel.
Egy másik módszer szerint a citokinek gátlását primer, vagy előnyösen szekunder, kevert limfocitareakciókban (MLR) lehet vizsgálni, amely esetben szingenikus APC-ket nem kell használni. Az MLR-ek jól ismertek a szakirodalomban [Bradley, 162-166, Mishell et al., eds., Methods in Cellular Immunology, (Freeman, San Francisco, 1980); valamint Battisto et al., Meth. in Enzymol, 150, 83-91 (1987)]. Röviden, az allogén limfoid sejtek két populációját összekeverjük, a keverés előtt az egyik populációt úgy kezeljük, hogy megakadályozzuk a szaporodást, például besugárzással. A sejtpopulációkat előnyösen körülbelül 2χ 106 sejt/ml koncentrációban készítjük el, kiegészített táptalajban, például RPMI 1640-ben, 10% borjúmagzatszérummal kiegészítve. Mind a kontrollok, mind a vizsgálandó tenyészetek vizsgálatához 0,5-0,5 ml-t kell összekeverni az egyes populációkból. A szekunder MLR-hez a primer MLR-ben 7 nap után megmaradó sejteket újraserkentjük frissen előállított, besugárzott stimulátorsejtekkel. A mintát, amelyről feltételezzük, hogy CSIF-et tartalmaz, hozzáadhatjuk a vizsgált tenyészetekhez a keverés időpontjában, és mind a kontroll-, mind a vizsgált tenyészetekben vizsgálhatjuk a citokintermelést a keverés utáni 1 -3 napon belül.
A CSIF-vizsgálatokhoz a T-sejt populációk és/vagy APC-populációk előállítása olyan, a szakterületen jól ismert technikákat alkalmaz, amelyeket DiSabato és munkatársai részletesen leírtak [Meth. in Enzymol., 108 (1984)]. Az előnyös CSIF-hez az APC-k perifériális vérmonociták. Ezeket standard technikák alkalmazásával kapjuk [Boyum, Meth. in Enzymol., 108, 88-102 (1984); Magé, Meth. in Enzymol., 108, 298-302 (1984); Stevenson, Meth. in Enzymol., 108, 148-153 (1984); Romain et al., Meth. in Enzymol., 108, 148-153 (1984)], amely publikációkra a továbbiakban is hivatkozunk. Előnyösen helper T-sejteket használunk a CSIFvizsgálatokban, amelyeket úgy kapunk, hogy először elválasztjuk a limfocitákat a perifériális vértől, majd szelektáljuk, például mosással vagy áramlási citometriával, a helpersejtek kereskedelmi forgalomban levő antiCD4 antitestet használnak, például a 4 381 295 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírásban közölt OKT4-et, amely az Ortho Pharmaceutical Corp. terméke. A szükséges technikákat részletesen ismertetik [Boyum, Scand. J. Clin. Láb. Invest., 21 (Suppl. 97), 77 (1986); Boyum, Meth. in Enzymol., 108, 88-102 (1984); Magé, Meth. in Enzymol., 108, 298-302 (1984); Bram et al., Meth. in Enzymology, 121, Τ3Ί-Ί4& (1986). A PBL-eket általában friss vérből kapjuk Ficoll-Hypaque sűrűséggradiens-centrifugálással.
A vizsgálatban különböző antigének használhatók, például fúrócsiga-hemocianin (KLH), baromfi-gammaglobulin vagy hasonlók. Még előnyösebb, ha az antigén helyett a helper T-sejteket anti-CD3 monoklonális antitesttel, például 0KT3-mal serkentjük [4361549 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírás] a vizsgálatban.
A kontroll- és vizsgálati mintákban a citokinkoncentrációt standard biológiai és/vagy immunokémiai módszerekkel mérjük. A specifikus citokinekre vonatkozó immunokémiai vizsgálatok összeállítása jól ismert a szakirodalomban [Campbell, Monoclonal Antibody
Technology (Elsevier, Amsterdam, 1984); Tijssen, Practice and Theory of Enzyme Immunoassays (Elsevier, Amsterdam, 1985); és a 4486530 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírás]. Az említett publikációk csak kiragadott példák a tárgyra vonatkozó hatalmas irodalomból. A humán IL-2, humán IL-3 és a humán GM-CSF ELISA-kitjei kereskedelmi forgalomban vannak [Genzyme Corp., Boston, MA); a humán IFN-gamma ELISA-kitjét az Endogén, Inc. árulja (Boston, MA). A humán limfotoxinra specifikus poliklonális antitesteket a Genzyme Corp. árulja, ezeket a humán limfotoxin radioimmunesszéjében lehet használni [Chard, An Introductíon to Radioimmunassay and Related Techniques (Elsevier, Amsterdam, 1982)].
A fentiekben felsorolt citokinek biológiai vizsgálatát lehet a CSIF-aktivitás meghatározására használni. A humán limfotoxin biológiai vizsgálatát leírják [Aggarwal, Meth. in Enzymology, 116, 441-447 (1985); Matthews et al., 221-225. oldal, in Clemens et al., eds., Lymphokines and Interferons: A Practical Approach (IRL Press, Washington, D. C., 1987)]. A humán IL-2-t és CM-CSIF-et a CTLL-2 és KG-1 faktordependens sejtvonalakkal lehet vizsgálni (ATCC ΤΠ3 214 és ATCC CCL 246). A humán IL-3-at annak a tulajdonságának az alapján lehet vizsgálni, hogy serkenti sok különböző vérképző sejttelep működését lágyagartenyészetekben [Metcalf, The Hemopoietic Colony Stimulating Factors (Elsevier, Amsterdam, 1984)] Az IFN-gammát antivírusvizsgálatokkal lehet mérni [Meager, 129-147. old., in Clemens et al., eds., Lymphokines and Interferons: A Practical Approach (IRL Press, Washington, D. C., 1987)].
A citokintermelést mRNS-elemzéssel is meg lehet határozni. A citokin mRNS-eket citoplazmatikus ponthibridizálással lehet mérni [White et al., J. Bioi. Chem., 257, 8569-8572 (1982); Gillespie et al., 4483920 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírás]. Ezekre a publikációkra hivatkozunk a továbbiakban is. Egy másik megközelítés szerint tisztított mRNS-sel végzünk ponthibridizálást [lásd 6. fejezet, Hames et al., eds., Nucleic Acids Hybridization A Practical Approach (IRL Press, Washington, D. C., 1985)]. A citoplazmatikus ponthibridizálás általában azt jelenti, hogy egy sejtből vagy szövetmintából származó mRNS-t egy szilárd hordozóra rögzítjük, például nitro-cellulózra, DNS-próbát hibridizálunk a rögzített mRNS-hez, majd eltávolítjuk a próba szekvenciának azt a részét, amely aspecifikusan kötődik a szilárd hordozóhoz vagy helytelenül illeszkedő hibrideket képez az mRNS-sel, úgy, hogy csak a cél-mRNS-ekkel lényegében tökéletes hibrideket képező próbaszekvenciák maradjanak meg. A megmaradó DNS-próba mennyiségét a jelölés által keltett jel alapján határozzuk meg. Számos standard módszer ismert egyszálú és kétszálú nukleinsavfragmensek jelzésére. Ide tartozik a radioaktív jelölés beépítése [Harper et al., Chromosoma, 83, 431-439 (1984); fluoreszcenciajelzések közvetlen kapcsolása [Smith et al., Nucleic Acids Research, 13, 2399-2412 (1985); Connolly et al., Nucleic Acids Research, 13, 4485-4502 (1984); valamint a nukleinsavfragmensek különböző kémiai módosítása, amely immunokémiai vagy egyéb affinitási módszerekkel kimutathatóvá teszi őket [Tehén et al., Proceedings of the National Academy of Sciences, USA, 81, 3466-3470 (1984); Richardson et al., Nucleic Acids Research, 13, 2399-2412 (1985); Langer et al., Proceedings of the National Academy of Sciences, USA, 78, 6633-6637 (1981); Brigati et al., Vírology, 126, 32-50 (1983); Bróker et al., Nucleic Acids Research, 5, 363-384 (1978); Bayer et al., Methods of Biochemical Analysis, 26. 1-45 (1980)].
A T-sejtekből származó mRNS-t a következő módszerrel rögzítjük a próbával való hibridizálás céljából. Az izolált T-sejteket lizáljuk egy lízispufferben való szuszpendálással [apuffer összetétele: 0,14 M nátrium-klorid, 1,5 mM magnézium-klorid, 10 mM TRIS-HCL, pH=8,6; 0,5% Nonidet P-40 (egy nemionos detergens, például a SIGMA-tól) 4 °C-on, 1 xlO8 sejt/ml végkoncentrácíóban. A szuszpenziót 10 másodpercig vortexeljük, majd a sejtmagokat kiülepítjük (13 000 g; 2,5 perc). A kapott citoplazmatikus lizátumokat ezután steril Eppendorf-csőbe visszük át, amely 0,3 térfogat 20 χ SSC-t tartalmaz (1 xSSC=0,15 M nátrium-klorid, 0,015 M trinátrium-cítrát (standard citrátsó), valamint 37% (tömeg/tömeg) formaldehidet. Az elegyet ezután 60 °C-on inkubáljuk 15 percig, majd alikvotokban -70 °C-on tároljuk. Elemzés céljából az egyes mintákból 15 ml-t titrálunk háromszoros sorozathígításokat alkalmazva 15 xSSC-ben, 96 lyukas, lapos fenekű mikrotiterlemezeken (Falcon, Beckton Dickinson, Oxnard, CA), a lyukakba 0,1 ml-t rakva. Mindegyik hígítást a lyukból kiszíva Nytran lapra visszük fel (a Nytran egy módosított nejlonhordozó, Schleicher and Schüll, Keene, NH; 0,45 mm a pórusátmérője), amelyet egy szűrőpapír tart (Whatman 3MMChr, Whatman Inc., Cliflon, NJ), a kiszíváshoz egy 96 helyes Minifold berendezést alkalmazva (Schleicher and Schüll). A Nytran papírt ezután megsütjük (80 °C, 2 óra), majd prehibridizációs oldattal kezeljük. Összetétele: 50% formamid (BRL, Gaithersburg, MD), 6xSSC, 50 mg/ml Escherichia coli tRNS (SIGMA), 0,2 tömeg/térfogat% ficoll (móltömeg=400 000), illetve polivinil-pirrolidon, és szarvasmaiha-szérumalbumin (BSA). A próbát körülbelül 50 mg próba/ml koncentrációban visszük fel a Nytran hordozóra a prehibridizálóoldatban. A hibridizálást követően a hordozót kétszer 15 percig mossuk szobahőmérsékleten 2xSSC-ben, majd kétszer mossuk 60 °C-on 2xSSC/0,5% SDS összetételű oldatban. A hordozót ezután filmre tesszük, erősítőfóliát használunk, és a mennyiségi kiértékelést lézer-denzitométerrel letapogatva végezzük (például Ultroscan XL, LKB Instruments Inc., Gaithersburg, MD). Ha a citoplazmatikus ponthibridizációnak nem elég az érzékenysége, akkor előnyös, ha az RNS-t a blottolás előtt extraháljuk a PBL-ekből. Az RNS-t például a guanidin-tiocianát-módszerrel lehet kivonni [Chirgwin et al., Biochemistry 18, 5294-5299 (1979)].
Néhány esetben a CSIF-aktivitásra vizsgálandó mintákat elő kell kezelni, hogy eltávolítsuk az előre meghatározott citokineket, amelyek zavarhatják a vizsgálatot. Az IL-2 például megnöveli az IFN-gamma termelését néhány sejtben. Tehát a vizsgálatban használt helper T-sejtektől függően az IL-2-t el kell távolítani a
HU 216 310 Β vizsgálandó mintából. Az ilyen eltávolítások egyszerűen úgy végezhetők el, hogy a mintát egy standard anticitokin affinitásoszlopon bocsátjuk át.
III. A CSIF-re specifikus monoklonális antitestek és antagonisták
A találmány szerinti antagonisták előnyösen a humán CSIF-re specifikus antitestekből származnak. Még előnyösebben, a találmány szerinti antagonisták a humán CSIF-re specifikus fragmenseket vagy kötőkompozíciókat tartalmaznak. Az antitestek több polipeptidláncból állnak, amelyeket diszulfidhidak tartanak össze. A két fő polipeptidlánc, amelyeket könnyűlánc és nehézlánc néven emlegetünk, alkotja az antitestek összes fő szerkezeti osztályát (izotípus). Mind a nehéz- mind a könnyűláncot tovább bonthatjuk alrégiókra, amelyeket variábilis régiók és konstans régiók néven ismerünk. A nehézlánc egyetlen variábilis régióból és három különböző konstans régióból áll, a könnyűláncok egyetlen variábilis régiót tartalmaznak (ez eltér attól, ami a nehézláncban található), valamint egyetlen konstans régiót (ez eltér azoktól, amelyek a nehézláncban találhatók). A nehézlánc és a könnyűlánc variábilis régiói a felelősek az antitest kötési specifitásáért.
A továbbiakban a „nehézlánc variábilis régió” szakkifejezés egy olyan polipeptidet jelent, amely
1) 110-125 aminosav hosszúságú, és
2) amelynek az aminosav-összetétele megfelel egy, a találmány szerinti monoklonális antitest aminosavösszetételének a nehézlánc N-terminális aminosavától kezdődően. Hasonlóképpen, a „könnyűlánc variábilis régió” szakkifejezés olyan polipeptidet jelent, amely
1) 95 -110 aminosav hosszúságú, és
2) amelynek az aminosavszekvenciáj a megfelel egy, a találmány szerinti monoklonális antitest aminosavszekvenciájának, a könnyűlánc N-terminális aminosavától kezdődően.
A továbbiakban a „monoklonális antitest” szakkifejezés immunoglobulinok olyan homológ populációját jelenti, amelyek képesek specifikusan kötődni a humán CSIF-hez.
A továbbiakban a „kötőkészítmény” olyan készítményt jelent, amely
1) két olyan polipeptidből áll, amelyeket ha működésileg egyesítenek, akkor a humán CSIF-hez nagy kötőaffinitással rendelkező konformációt vesznek fel, és
2) a humán CSIF-re specifikus antitestet termelő hibridómából származnak. A „működésileg egyesített” szakkifejezés azt jelenti, hogy a két polipeptidláncot egymáshoz viszonyítva úgy lehet elhelyezni, hogy különböző módokon kötődjenek, beleértve egy természetes antitestfragmensben, például Fab-ban vagy Fav-ban való asszociációt, vagy a karboxiterminálison génsebészeti úton bejuttatott, ciszteintartalmú peptidlinkereken keresztül. A két polipeptidlánc általában megfelel egy humán CSIF-re specifikus monoklonális antitest könnyűlánca és nehézlánca variábilis régiójának. A találmány szerinti antagonisták előnyösen a humán CSIF-re specifikus monoklonális antitestekből származnak. A CSIF-et blokkolni vagy neutralizálni képes monoklonális antitesteket azon az alapon választjuk ki, hogy gátolják a CSIFfel indukált hatásokat a standard CSIF biológiai vizsgálatokban, például az IFN-gamma-szintézis gátlásában.
A találmány szerinti hibridómákat jól ismert technikákkal állítjuk elő. Az eljárás általában abból áll, hogy egy halhatatlanságot biztosító sejtvonalat füzionáltatnak egy B-limfocitával, amely a kívánt antitestet termeli. Egy másik módszer szerint nemfuziós technikák is léteznek örök életű antitesttermelő sejtvonalak előállítására, és ezek a találmány tárgykörébe tartoznak, ilyen például a vírussal indukált transzformáció [Casali et al., Humán Monoclonals from Antigen-Specific Selection of B Lymphocytes and Transformation by EBV, Science, 234, 476-479 (1986)]. Az örök életet biztosító sejtvonalak általában transzformált emlőssejtek, főleg rágcsáló-, szarvasmarha- vagy humán eredetű mielómasejtek. A leggyakrabban a patkány vagy az egér mielómasejtjeit használják a hozzáférhetőség és a kényelem miatt. Azok a technikák jól ismertek, amelyekkel a célantigénnel beinjekciózott emlősökből a megfelelő limfocitákat elő lehet állítani. Általában perifériális vérlimfocitákat (PBL-ek) használnak, ha humán eredetű sejtekre van szükség, illetve lépsejteket vagy nyirokcsomósejteket használnak, ha nemhumán eredetű emlős kiindulási anyagra van szükség. Egy gazdaszervezetként használt emlőst a tisztított antigén ismételt dózisával injekciózunk, majd hagyjuk, hogy az emlősben megtermelődjenek a keresett antitestet termelő sejtek, mielőtt ezeket kinyerjük, hogy az örök életet biztosító sejtekkel fuzionáltassuk őket. A fúziós technikák jól ismertek a szakirodalomban, általában abból állnak, hogy a sejteket egy füzionálóanyaggal, például polietilén-glikollal keverik össze. A hibridómákat standard módszerekkel, például HAT-szelekcióval választjuk ki. Ezek közül a hibridómák közül azokat szelektáljuk, amelyek a keresett, például a humán CSIF-re specifikus antitestet választják ki, oly módon, hogy a tenyészfolyadékukat standard immunesszé módszerekkel, például Westemblottal, ELISA-val, RIA-val, CSIF-neutralizáló tulajdonság alapján vagy hasonló eljárásokkal választjuk ki. Az antitesteket standard fehérjetisztítási eljárásokkal nyeljük ki a tenyészfolyadékból [Tijssen, Practice and Teory of Enzyme Immunoassays (Elsevier, Amsterdam, 1985)]. Számos szakirodalmi hivatkozás ismert a fenti technikák alkalmazására [Kohler et al., Hibridoma Techniques (Cold Spring Harbor Laboratory, New York, 1980); Tijssen, Practice and Theory of Enzyme Immunoassays (Elsevier, Amsterdam, 1985); Campbell, Monoclonal Antibody Technology (Elsevier, Amsterdam, 1984); Hurrell, Monoclonal Hibridoma Antibodies: Techniques and Applications (CRC Press, Boca Raton, FL, 1982); és hasonlók]. A humán CSIF-re specifikus monoklonális antitesteket termelő hibridómákat ezután egy második szűrővizsgálatnak vetjük alá, a fentiekben ismertetett CSIF-vizsgálatokat alkalmazva, hogy azokat szelektáljuk, amelyek képesek blokkolni vagy semlegesíteni a CSIF biológiai aktivitását.
Az antitestek fragmenseinek készítése és előállítása is jól ismert, például a Fab fragmensekre [Tijssen, Practice and Theory of Enzyme Immunoassays (Elsevier, Amsterdam, 1985)] és az Fv fragmensekre [Hochman et al., Biochemistry, 12, 1130-1135 (1973); Sharon et al., Biochemistry, 75, 1591-1594 (1976); Ehrlich et al., 4355023 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírás], és a fél antitestmolekulákra [AuditoreHargreaves, 4470925 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírás].
A találmány szerinti hibridómákra jellemző antitesteket és antitestfragmenseket rekombináns eszközökkel is elő lehet állítani oly módon, hogy a hírvivő RNS-t extraháljuk, cDNS-könyvtárat készítünk, majd azokat a kiónokat szelektáljuk, amelyek az antitestmolekula részeit kódolják [Wall et al., Nucleic Acids Research, 5, 3113-3128 (1978); Zakut et al., Nucleic Acids Research, 8, 3591-3601 (1980); Cabilly et al., Proceedings of the National Academy of Sciences, USA, 81, 3273-3277 (1988); Boss et al., Nucleic Acids Research, 72, 3791-3806 (1984); Amster et al., Nucleic Acids Research, 8, 2055-2065 (1980); Moore et al., 4642334 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírás; Skerra et al., Science, 246, 1275-1281 (1989)]. Pontosabban, ezek a technikák alkalmazhatók interspecifikus monoklonális antitestek előállítására, amelyekben az egyik faj kötőrégióját egy másik faj antitestjének nemkötő régiójával kombináljuk, hogy csökkentsük az immunogenitást [Liu et al., Proceedings of the National Academy of Sciences, USA, 84, 3439-3443 (1987)].
IV. Tisztítás és gyógyászati készítmények
Ha a találmány szerinti polipeptideket oldható formában expresszáljuk, például transzformált élesztővagy emlőssejt szekretált termékeként, akkor a szakterületen ismert standard eljárásokkal lehet tisztítani őket, beleértve az ammónium-szulfátos kicsapást, ioncserélő kromatográfiát, gélszűrést, elektroforézist, affinitáskromatográfiát, és/vagy a hasonló módszereket [„Enzyme Purification and Related Techniques”, Methods in Enzymology, 22, 233-577 (1977); Scopes, R., Protein Purification: Principles and Practice (Springer-Verlag, New York (1982)]. Hasonlóképpen, ha a találmány szerinti polipeptideket oldhatatlan, például aggregátumok, zárványok és hasonlók formájában expresszáljuk, akkor is a szakterületen ismert standard eljárásokkal tisztíthatok, beleértve a zárványoknak a feltárt sejtekből centrifugálással való elkülönítését, a zárványok oldatba vitelét kaotrop és redukálóanyagokkal, az oldott elegy hígítását és a kaotrop, valamint redukálóágens koncentrációjának csökkentését, hogy a polipeptid felvegye a biológiailag aktív konformációját. Ez utóbbi eljárást a következő irodalmi hivatkozásokban közük [Winkler et al., Biochemistry, 25, 4041-4045 (1986); Winkler et al., Biotechnology, 3, 992-998 (1985); Koths et al., 4569790 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírás],
A továbbiakban a „hatásos mennyiség” olyan mennyiséget jelöl, amely egy autoimmun állapot tüneteit enyhíti. Egy adott beteg esetében a hatásos mennyiség változhat, olyan tényezők függvényében, mint a kezelendő autoimmun állapot, a beteg általános egészségi állapota, az adagolás módszere, a mellékhatások súlyossága, és hasonlók. A CSIF-et általában gyógyászati készítmény formájában adják be, amely a CSIF hatásos mennyiségét és egy gyógyászati hordozót tartalmaz. A gyógyászati hordozó bármely kompatíbilis, nem toxikus anyag lehet, amely alkalmas arra, hogy a találmány szerinti készítményeket a betegbe bejuttassák vele. Általában azok a készítmények, amelyek alkalmasak az ilyen hatóanyagok parenterális adagolására, azok jól ismertek [Remington’s Pharmaceutical Science, 15th Ed. (Mack Publishing Company, Easton, PA 1980)]. Egy másik módszer szerint a találmány szerinti készítményeket implantálható vagy injektálható hatóanyag-bejuttatási módszerrel is be lehet juttatni a beteg testébe [Urquhart et al., Ann. Rév. Pharmacol. Toxicol., 24, 199-236 (1984); Lewis, ed. Controlled Release of Pesticides and Pharmaceuticals (Plenum Press, New York, 1981); 3773919 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírás; 3270960 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírás; és hasonlók].
Ha parenterálisan adagolják, akkor a CSIF-et injektálható formájú egységdózisban szerelik ki (oldat, szuszpenzió, emulzió), egy gyógyászati hordozóval együtt. Az ilyen hordozóra példa lehet normál sóoldat, Ringeroldat, szőlőcukoroldat és Hank-féle oldat. A nemvizes hordozók, például a rögzített olajok és az etil-oleát is használhatók. Az előnyös oldat az 5%-os szőlőcukor/só oldat. A hordozó tartalmazhat kis mennyiségű adalékanyagokat, például az izotonicitást és kémiai stabilitást növelő anyagokat, például puffereket és konzerválóanyagokat. A CSIF-et előnyösen tisztított formában, aggregátumoktól és más fehérjéktől mentesen formulázzuk, körülbelül 5-20 μg/ml koncentrációban. A CSIF-et előnyösen folyamatos infúzióban adagoljuk úgy, hogy körülbelül 50-800 μg-ot adunk be naponta (azaz körülbelül 1-16 pg/kg/nap). A napi infúzió sebessége változhat a mellékhatások és a vérsejtszámok követése fényében.
A CSIF-et olyan emlőssejtvonalak tenyészetének felülúszójából tisztíthatjuk, amelyek ideiglenesen transzfektálva vagy stabilan transzformálva vannak egy CSIFgént hordozó expressziós vektorral. A CSIF-et előnyösen a pCD expressziós vektorral tranziens módon transzformáit COS 7 sejtek felülúszójából állítjuk elő. A COS 7 sejtek pCD expressziós vektorral való transzfekcióját az alábbiak szerint végezzük: A transzfekció előtt egy nappal körülbelül 106 COS 7 majomsejtet oltunk 100 mm-es lemezekben levő Dulbecco-féle módosított Eagle táptalajban (DME), amely 10% boqúmagzatszérumot és 2 mM glutamint tartalmaz. A transzfekció végrehajtásához mindegyik lemezről leszívjuk a táptalajt, és 4 ml olyan DME táptalajjal helyettesítjük, amely 50 mM TRIS-HCl-t (pH=7,4), 400 mg/ml DEAE-Dextránt és 50 μg plazmid-DNS-t tartalmaz, a lemezeket ezután négy óra hosszat 37 °C-on inkubáljuk, majd a DNS-t tartalmazó táptalajt eltávolítjuk, és a lemezeket kétszer mossuk 5-5 ml szérummentes DME táptalajjal. A DME táptalajt ezután visszatesszük a lemezekre, majd további három óra hosszat 37 °C-on inkubáljuk. A lemezeket egyszer mossuk DME táptalajjal, majd 4% boíjúmagzatszérumot, 2 mM glutamint, 100 egység/ml penicillint és 100 μg/ml streptomicint tartalmazó DME táptalajt adunk hozzájuk.
HU 216 310 Β
A sejteket ezután 37 °C-on inkubáljuk 72 óra hosszat, majd a tenyészlevet összegyűjtjük, és ebből izoláljuk a CSIF-et. Egy másik módszer szerint a transzfekciót a példákban leírt módon, elektroporációval végezhetjük, a transzfekcióhoz a plazmid-DNS-t úgy állítjuk elő, hogy a pcD(SRa) plazmidot, amely a CSIF cDNS-inszertet tartalmazza, Escherichia coli MCI061 törzsben szaporítjuk [Casadaban and Cohen, J. Mól. Biok, 138, 179-207 (1980)], vagy hasonló mikroorganizmusban. A plazmidDNS-t standard technikákkal izoláljuk a tenyészetekből [Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory, New York, 1982)].
Ha a találmány szerinti antagonisták antitestekből származnak, akkor beadhatjuk azokat parenterálisan, előnyösen intravénásán. Mivel az ilyen fehérje- vagy peptidantagonisták immunogének lehetnek, ezért előnyösen lassan adjuk be őket, vagy a szokványos i. v. adagolási úton, egy bőr alatti depóból, amint azt Tomasi és munkatársai közlik a 4732863 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírásban. Ha parenterálisan adjuk be őket, akkor az antitesteket és/vagy fragmenseket injektálható egységdózisokban formulázzák, egy gyógyászati hordozóval együtt, amint az előzőkben ismertettük. Az antitesteket előnyösen tisztított formában, lényegében aggregátumoktól, más fehérjéktől, endotoxinoktól mentesen szereljük ki, körülbelül 5-30 mg/ml koncentrációban, előnyösen 10-20 mg/ml koncentrációban. Az endotoxinszint előnyösen kisebb 2,5 EU/ml szintnél.
Egy antagonista adagolási tartományának megválasztása számos faktortól függ, beleértve az antagonista szérumban való lebomlási idejét, a kezelendő betegséggel együtt járó CSIF szérumszintjétől, az antagonista immunogenitásától, a cél-CSIF hozzáférhetőségétől, (például ha nemszérum CSIF-et kell blokkolni), a CSIF és a receptorok affinitása, valamint a CSIF és az antagonista affinitása közötti aránytól, és hasonlóktól. Előnyösen, egy adagolási tartomány maximalizálja a betegbe bejuttatott antagonista mennyiségét, az elfogadható mellékhatásokkal összhangban. Ennek megfelelően a bejuttatott antagonista mennyisége részben az adott antagonistától, részben a kezelendő állapot súlyosságától függ. A megfelelő dózisok kiválasztásához az antitestek gyógyászati felhasználásáról szóló szakirodalom nyújt segítséget [Bach et ah, 22. fejezet, in Ferrone et ah, eds., Handbook of Monoclonal Antibodies (Noges Publications, Park Ridge, NJ, 1985); Russell, 303-357. old.; Smith et ah, 365-389. old., in Haber et ah, eds., Antibodies in Humán Diagnosis and Therapy (Raven Press, New York, 1972)]. Előnyösen, ha az antagonista monoklonális antitesteket vagy Fab méretű fragmenseket tartalmaz (beleértve a kötőkészítményeket), ekkor a dózis körülbelül 1 -20 mg/kg/nap tartományban van. Még előnyösebben a dózis a körülbelül 1-10 mg/kg/nap tartományban van.
V. Génsebészeti úton megváltoztatott mutáns CSIF
Ha egyszer a nukleinsavszekvencia- és/vagy az aminosavszekvencia-információ ismert a natív fehérjére, akkor számos módszer ismert arra, hogy lényegében bármilyen mutációt előállítsunk a természetes szekvenciában [Shortle, Science, 229, 1193-1201 (1985); Zoller and Smith, Methods in Enzymology, 229, 1193-1201, 100, 468-500 (1983); Mark et ah; 4158584 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírás; Wells et ah, Gene, 34, 315-323 (1985); Esteli et ah, Science, 233, 659-663 (1986); Mullenbach et ah, J. Bioi. Chem., 261, 719-722 (1986); Feretti et ah, Proceedings of the National Academy of Sciences, USA, 83, 597-603 (1986). Ennek megfelelően, a továbbiakban hivatkozunk az említett publikációkra.
Egyes esetekben a természetes polipeptid mutánsaira lehet szükség. Például a nemkívánt mellékhatásokat lehet csökkenteni bizonyos mutánsokkal, főleg akkor, ha a mellékhatás-aktivitás a polipeptidnek azzal a részével van kapcsolatban, amelynek nincs köze a kívánt aktivitáshoz. Néhány expressziós rendszerben a természetes polipeptidet proteázok lebonthatják. Ezekben az esetekben az aminosavak kiválasztott szubsztitúciói és/vagy deléciói, amelyek megváltoztatják az érzékeny szekvenciákat, lényegesen megnövelhetik a kitermelést [2173-804-A számú angol szabadalmi bejelentés, amelynél a humán szöveti plazminogén aktivátor 275ös pozíciójában levő Arg aminosavat Gly vagy Glu helyettesíti. A mutánsok megnövelhetik a termelési szintet a tisztítási eljárások során is, és/vagy megnövelik fehérjék tárolhatóságát is, eliminálva azokat az aminosavakat, amelyek érzékenyek az oxidációra, acilezésre, alkilezésre vagy más kémiai módosításra. A metioninok például könnyen oxidálódnak, szulfoxidokat képeznek, amelyek számos fehérjében a biológiai aktivitás elvesztésével járnak [Brot and Weissbach, Arch. Biochem. Biophys., 223, 271 (1983)]. A metioninokat gyakran helyettesíteni lehet semlegesebb aminosavakkal, biológiai aktivitásuk minimális csökkenésével vagy anélkül [AU-A-52451/86 számú ausztrál szabadalmi bejelentés]. A bakteriális expressziós rendszerekben a kitermelést gyakran fokozni lehet, oly módon, hogy a konformáció szempontjából lényegtelen ciszteincsoportokat más csoportokkal helyettesítjük, vagy kihagyjuk őket [Mark et ah 4518584 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírás].
Előnyösen kazettamutagenezist használunk mutáns fehérjék előállítására. Egy szintetikus gént állítunk elő olyan restrikciós enzim felismerési helyekkel, amelyek körülbelül egyenlő távolságban helyezkednek el a gén mentén; ezeket a restrikciós enzimes hasítási helyeket úgy határozzuk meg, hogy csak egyszer forduljanak elő, akkor is, ha a gént egy megfelelő vektorba illesztjük bele. Az egy példányban előforduló restrikciós hasítási helyek lehetővé teszik, hogy a gén egyes részeit kényelmesen ki lehessen vágni, és szintetikus oligonukleotidokkal (azaz a „kazettákkal”) helyettesíteni lehessen, amelyek a kívánt mutációkat kódolják. Az egy példányban előforduló restrikciós hasítási helyek számának és eloszlásának meghatározása számos tényező megfontolásával jár együtt:
1) az expresszióban alkalmazott vektorban levő restrikciós hasítási helyek;
2) fajspecifikus vagy nemzetségspecifikus kodonhasznosításra van-e szükség;
3) a különböző, a vektorba nem vágó restrikciós endonukleázok száma (és multiplicitásuk a szintetikus génen belül); és
4) az egyes egyszeres hasítási helyek között található szekvenciák szintetizálásának és/vagy szekvenálásának egyszerűsége és megbízhatósága.
A fenti technika egy kényelmes módja annak, hogy konzervatív aminosavcseréket és hasonlókat hajtsunk végre a természetes fehérjeszekvenciában. A „konzervatív” szakkifejezés jelentése a továbbiakban a következő:
i) a változások a konformáció szempontjából amennyire lehet, semlegesek, azaz úgy tervezzük őket, hogy a natív feltétjéhez viszonyítva minimális változást okozzanak a mutáns polipeptidek tercier struktúrájában, és ii) a változások az antigenitás szempontjából amennyire lehet, semlegesek, azaz úgy tervezzük őket, hogy a természetes feltétjéhez viszonyítva minimális változást okozzanak a mutáns polipeptidek antigéndeterminánsaiban. A konformációs semlegesség a biológiai aktivitás megőrzéséhez szükséges, az antigénsemlegesség pedig ahhoz, hogy elkerüljük a kezelt betegekben vagy állatokban az immunválasz keltését a találmány szerinti vegyülettel való kezelés hatására. Jóllehet az nehéz, hogy abszolút biztonsággal kiválasszuk azokat az alternatívákat, amelyek a konformáció és az antigenitás szempontjából semlegesek, de léteznek szabályok, amelyek a szakterületen jártas szakembert irányítják abban, hogy milyen változások lehetnek a konformáció és az antigenitás szempontjából semlegesek [Anfísen, im., Berzofsky, Science, 229, 932-940 (1985); Bowie et al., Science, 247, 1306-1310 (1990)]. Néhány a legfontosabb szabályok közül:
1) a hidrofób csoportok helyettesítése valószínűleg nem okoz változást az antigenitásban, mivel valószínűleg a fehéije belsejében találhatók [Berzofsky, Science, 229, 932-940 (1985); Bowie et al., Science, 247, 1306-1310(1990)];
2) a fizikai-kémiailag hasonló, azaz szinonim csoporttal való helyettesítés valószínűleg nem okoz konformációs változást, mivel a helyettesítő aminosav ugyanazt a szerkezeti szerepet töltheti be, mint a helyettesített aminosav; és
3) az evolúció során megőrződött szekvencia megváltoztatása valószínűleg végzetes konformációs változást okoz, mivel az evolúció során való megőrződés azt jelenti, hogy a szekvenciák fontosak lehetnek a funkció szempontjából. A mutáns fehérjeszekvenciák kiválasztásának említett alapszabályai mellett léteznek vizsgálatok, amelyekkel a megváltoztatott molekulák biológiai aktivitását és konformációját le lehet ellenőrizni. A találmány szerinti polipeptidek biológiai vizsgálatát az előzőekben részletesen leírtuk. A konformáció változását legalább két jól ismert módszerrel lehet vizsgálni: az egyik a mikrokomplement fixálás [Wasserman et al., J. Immunoi., 87, 290-295 (1961); Levine et al., Methods in Enzymology, 11, 928-936 (1967)], amelyet széles körűen alkalmaznak a fehérjék tercier szerkezete evolúciós vizsgálataiban; a másik a konformáció specifikus monoklonális antitestekhez való affinitás vizsgálata [Lewis et al., Biochemistry, 22, 948-954 (1983)].
VI. A humán CSIF-peptidantitestei
A találmány tárgyai a humán CSIF-ből származó peptidek, valamint immunogének, amelyek hordozóanyagok és a találmány szerinti peptidek közötti konjugátumokat tartalmaznak. Az „immunogén” szakkifejezés olyan anyagra vonatkozik, amely képes immunválasz kiváltására. A „hordozó” szakkifejezés az alábbiakban bármely olyan anyagra vonatkozik, amelyet ha kémiailag kötünk egy, a találmány szerinti pepiidhez, akkor lehetővé teszi a gazdaszervezet immunizálását a keletkező konjugátummal, és így keletkeznek a konjugált peptidre specifikus antitestek. A hordozók közé tartoznak a vörösvérsejtek, bakteriofágok, fehérjék és szintetikus részecskék, például az agarózgyöngyök. A hordozók előnyösen fehéijék, például szérumalbumin, gamma-globulin, furócsiga-hemocianin, tiroglobulin, fibrinogén vagy hasonlók.
A találmány szerinti peptideket standard módszerekkel szintetizáljuk [Stewart and Young, Solid Phase Peptide Synthesis, 2nd Ed. (Pierce Chemical Company, Rockford, IL, 184)]. Előnyösen egy kereskedelmi forgalomban levő peptidszintetizátort használunk, például az Applied Biosystems, Inc. (Foster City, CA) 430A jelű modelljét. A találmány szerinti peptideket szilárd fázisú szintézissel építjük fel térhálósított polisztirolhordozón, a karboxiterminális aminosawal kezdve, és az aminosavakat lépésben adva a lánchoz, amíg a teljes peptid elkészül. Az alábbi referenciák az alkalmazott kémiára vonatkoznak [Merrifield, J. Amer. Chem. Soc., 85, 2149 (1963); Kent et al., 185. oldal, in Peptides 1984, Ragnarsson, Ed. (Almquist and Weksell, Stockholm, 1984); Kent et al., 217. oldal, in Peptide Chemistry 84, Izumiya, Ed. (Protein Research Foundation, Β. H. Osaka, 1985); Merrifield, Science, 232, 341-347 (1986); Kent, Ann. Rév. Biochem., 57, 957-989 (1988); valamint az utolsó két cikkben idézett publikációk].
A szilárd fázisú szintézisben az a legfontosabb, hogy a szintézis melléktermékeit elimináljuk, amelyek főleg terminációs, deléciós vagy modifikációs peptidek. A legtöbb mellékreakció elkerülhető vagy minimalizálható tiszta, jól jellemezett gyanták, tiszta aminosavszármazékok, tiszta oldószerek használatával, valamint az alkalmas kapcsolási és hasítási módszerek és reakciókörülmények megválasztásával [Bárány and Merrifield, The Peptides, Cross and Melienhofer, Ed., 2, 1-284 (Academic Press, New York, 1979)]. Fontos, hogy kövessük a kapcsolási reakciókat, hogy meghatározzuk, vajon teljesen lejátszódnak-e, hogy ezzel a deléciós peptideket, amelyekből egy vagy több csoport hiányzik, elkerüljük. Erre a célra a kvantitatív ninhidrinreakció alkalmas [Sárin et al., Anal. Biochem., 117, 147 (1981)]. A Na-t-butil-oxi-karbonil (t-BOC) aminosavakat használjuk megfelelő oldalláncvédő csoportokkal, amelyek stabilak a lánc összeállításának körülményei között, de erős savakra elbomlanak. Miután a védett peptidláncot összeállítottuk, a védőcsoportokat eltávolítjuk, és a pepiidet lehorgonyzó kötést elhasítjuk alacsony, majd magas koncentrációjú vízmentes hidrogén-fluorid alkalmazásával, tioészter lekötőanyag jelen10 létében [Tam et al., J. Amer. Chem. Soc., 105, 6442 (1983)]. Az alkalmas oldalláncvédő csoportokat a kérdéses aminosav hárombetűs kódjával jelöljük, utána zárójelbe téve a védőcsoportot: Asp(OBzl), Glu(OBzl), Ser(OBzl), Thr(Bzl), Lys(Cl-Z), Tyr(Br-Z), Arg(NGTos), Cys(4-MeBzl), és His(ImDNP). (Bzl=benzil; Tos=p-toluolszulfonil; DNP=dinitrofenil; Im=imidazol; Z=benzil-oxi-karbonil). A többi aminosavnak nincs oldalláncot védő csoportja. Minden egyes ciklusban a (t-Boc-Na)-val védett peptidgyantát 65 százalékos trifluor-ecetsav (Eastman Kodak) hatásának tesszük ki (használat előtt ledesztilláljuk), amelyet metiléndikloridban (diklór-metán; DCM) (Mallenckrodt) oldottunk: először 1 percre, majd 13 percre, hogy a Navédőcsoportot eltávolítsuk. A peptidgyantát DCM-mel mossuk, majd kétszer semlegesítjük 10 százalékos diizopropil-etil-amin (DIEA, Aldrich) dimetil-formamidos (DMF) oldatában (Applied Biosystems), minden egyes alkalommal 1 percig. A semlegesítést DMFes mosás követi. A kapcsolást az aminosav szimmetrikus anhidridjével végezzük 16 percig, DMF-ben. A szimmetrikus anhidridet a szintetizátorral állítjuk elő, oly módon, hogy 2 mmol aminosavat oldunk 6 ml DCM-ben, majd 1 mmol diciklohexil-karbodiimidet adunk hozzá (Aldrich) 2 ml DCM-ben. 5 perc elteltével az aktivált aminosavat átvisszük egy másik reakcióedénybe, és a DCM-et lepároljuk, állandó nitrogénáramot alkalmazva. A DCM-et DMF-fel helyettesítjük (6 ml össztérfogat), a lepárolás különböző fázisaiban. Az első kapcsolás után a peptidgyantát DCM-mel mossuk (10 százalék DIEA DCM-ben oldva), majd tiszta DCM-mel. Az újrakapcsoláshoz ugyanazt az amínosavat és aktiválóanyagot (diciklohexil-karbodiimid) visszük egymás után a reakcióelegybe. Miután a helyben való aktiválást és kapcsolást 10 perc alatt hagyjuk lejátszódni, annyi DMF-et adunk hozzá, hogy 50 százalékos DMF-DCM elegyet kapjunk, majd a kapcsolást további 15 percig folytatjuk. Az arginint hidroxi-benztriazol-észter formájában (Aldrich) kapcsoljuk DMFben 60 percig, majd ugyanúgy végezzük az újrakapcsolást, mint a többi aminosavnál. Az aszparagint és a glutamint kétszer kapcsoljuk hidroxi-benztriazol-észter formájában DMF-oldatban, az egyes kapcsolásokat 40 percig végezve. Mindegyik csoportnál a gyantát a második kapcsolás után mossuk, és automatikusan mintát veszünk annak ellenőrzésére, hogy mennyi kapcsolaton α-amin maradt, a kvantitatív ninhidrin-reakciót használva [Sárin et al., Anal. Biochem. 117, 147 (1981)].
A szintetikus peptidek egy hordozóhoz való kapcsolásának általános technikáját számos közleményben ismertetik [Walter and Doolittle, „Antibodies Against Synthetic Peptides”, in Setlow et al., Genetic Engineering, 5, 61-91 (Plenum Press, NY, 1983); Green et al., Cell, 28, 477-487 (1982); Lemer et al., Proceedings of the National Academy of Sciences, USA, 78, 3403-3407 (1981); Shimizu et al., 4474754 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi bejelentés; Ganfield et al., 4311639 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi bejelentés]. Emellett a hapténeknek hordozókhoz való kapcsolására használt technikák lényegében ugyanazok, mint amelyeket az előzőkben ismertetett publikációkban alkalmaznak [például a 20. fejezet, Tijsseu-féle Practice and Theoiy of Enzyme Immunassays (Elsevier, New York, 1985)]. A négy leggyakrabban használt séma egy pepiidnek hordozóhoz való kapcsolására az alábbi:
1) glutáraldehid az aminokapcsoláshoz [Kagan and Glick, in Jaffe and Behrman, eds., Methods of Hormoné Radioimmunassay, 328-329 (Academic Press, NY, 1979); Walter et al., Proceedings of the National Academy of Sciences, USA, 77, 5197-5200 (1980)];
2) vízoldható karbodiimidek a karboxilcsoportnak aminocsoporthoz való kapcsolására [Hoare et al., J. Bioi. Chem., 242, 2447-2453 (1967)];
3) bisz-diazobenzidin (BDB) a tirozinnak tirozin oldallánchoz való kapcsolásához [Bassiri et al., 46-47. oldal, in Jaffe and Behrman, eds., Methods of Hormoné Radioimmunassay, 328-329 (Academic Press, NY, 1979); Walter et al., Proceedings of the National Academy of Sciences, USA, 77, 5197-5200 (1980)]; és
4) maleimido-benzoil-N-hidroxi-szukcinimid-észter (MBS) a cisztein (vagy más szulíhidrilek) aminocsoportokhoz való kapcsolására [Kitagawa et al., J. Biochem., (Tokyo), 79, 233 - 239 (1976); Lemer et al., Proceedings of the National Academy of Sciences, USA, 78, 3403 -3407 (1981)]. Egy általános szabály egy adott fehérjének egy fehéijehordozóhoz való kapcsolásának az alkalmas módszere az alábbiakban foglalható össze: a kapcsolásban szereplő csoport csak egyszer fordulhat elő a szekvenciában, előnyösen a szegment megfelelő végén. Például a BDB-t nem szabad használni, ha a potenciálisan antigén karaktere miatt kiválasztott szekvencia fő részében egy tirozincsoport előfordul. Hasonlóképpen, a centrálisán elhelyezkedő lizinek kizárják a glutáraldehid-módszert, és az aszparaginsav, valamint a glutaminsav gyakori előfordulása kizárja a karbodiimid-megközelítést. Másrészről, megfelelő csoportokat helyezhetünk el a kiválasztott szekvencia valamelyik végén mint kapcsolási helyeket, függetlenül attól, hogy előfordulnak-e a természetes fehérjeszekvenciában. A belső szegmentek, az amino- vagy karboxiterminálistól eltérően, lényegesen különböznek a „kapcsolatlan végnél” ugyanattól a szekvenciától, ami megtalálható a természetes fehérjében, ahol a polipeptidgerinc folyamatos. A probléma orvosolható bizonyos fokig, ha az α-aminocsoportot acetilezzük, majd a pepiidet a karboxiterminálisán keresztül kapcsoljuk. A hordozófehérjéhez való kapcsolási hatékonyságot kényelmesen radioaktívan jelzett peptid alkalmazásával mérjük, amelyet vagy úgy állítunk elő, hogy a szintézis egyik lépésében egy radioaktív aminosavat használunk, vagy úgy, hogy a komplett peptidet a tirozincsoport jódozásával jelezzük. A tirozin jelenléte a peptidben lehetővé teszi, hogy érzékeny radioimmunesszét készítsünk, ha szükséges. Ennélfogva, a tirozint be lehet juttatni terminális csoportként, ha nem része a természetes polipeptid aminosavszekvenciáj ának.
Az előnyös hordozók lehetnek fehérjék, az előnyös fehérjehordozók lehetnek szarvasmarha-szérumalbu11 min, mioglobulin, ovalbumin (ÓVA), fürócsiga-hemocianin (KLH), és hasonlók. A peptideket a KLH-hoz ciszteineken keresztül lehet kapcsolni MBS-sel, amint azt Liu és munkatársai közölték [Biochemistry, 18, 690-697 (1979)]. A peptideket foszfáttal pufferolt sóoldatban (pH=7,5), 0,1 mólos nátrium-borát-pufferben (pH=9,0), majd 1,0 mólos nátrium-acetát-pufferben (pH=4,0) oldjuk. A peptid feloldásának a pH-ját úgy választjuk meg, hogy optimalizáljuk a peptid oldhatóságát. Az oldható peptidek szabad ciszteintartalmát Ellman módszerével határozzuk meg [Ellman, Arch. Biochem. Biophys., 82, 7077 (1959)]. Minden egyes peptid esetében 4 mg KLH 0,25 ml 10 mmólos nátrium-acetát-puffer (pH=7,2) oldatában készült oldatát reagáltatunk 0,7 mg MBS-sel (dimetil-formamidban oldva), majd 30 percig szobahőmérsékleten kevertetjük. Az MBS-t cseppenként adjuk hozzá, hogy biztosítsuk azt, hogy a formamid lokális koncentrációja ne legyen túl nagy, mivel a KLH oldhatatlan, ha a formamid koncentrációja 30%-nál magasabb. A reakcióterméket, a KLH-MBS-t ezután 50 mmol nátriumfoszfátpufferrel (pH=6,0) egyensúlyba hozott Sephadex G-25 oszlopon bocsátjuk át, hogy a szabad MBS-t eltávolítsuk. A KLH kinyerése az oszlop csúcsfrakcióiból (az OD280 alapján követve) 80%-ra becsülhető. A KLH-MBS-t ezután 5 mg, 1 ml választott pufferben oldott peptiddel reagáltatjuk. A pH-t ezután 7-7,5-re állítjuk, majd a reakcióelegyet 3 óra hosszat kevertetjük szobahőmérsékleten. A kapcsolás hatékonyságát radioaktív peptiddel követjük, oly módon, hogy a konjugátumot foszfáttal pufferolt sóoldattal szemben dializáljuk (8-60% között változik). Ha a peptidhordozó konjugátum elkészült, akkor poliklonális vagy monoklonális antitesteket készíthetünk standard módszerekkel [Campbell, Monoclonal Antibody Technology (Elsevier, Amsterdam, 1984); Hurrell, Monoclonal Hibridoma Antibodies: Techniques and Applications (CRC Press, Boca Ration, FL, 1982); Schreier et al., Hybridoma Techniques (Cold Spring Harbor Laboratory, New York, 1980); 4562003 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírás; vagy hasonlók). A továbbiakban főleg a 4362003 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírásra hivatkozunk.
Mind a poliklonális, mind a monoklonális antitesteket vizsgálhatjuk ELISA-val. Csakúgy, mint más szilárd fázisú immunesszékben, a vizsgálat azon alapul, hogy a makromolekulák hajlamosak aspecifíkusan a műanyagra adszorbeálódni. Ennek a reakciónak az irreverzibilitása, az immunológiai aktivitás csökkenése nélkül, lehetővé teszi az antigén-antitest komplexek képződését, az ilyen komplexek és a megkötetlen anyagok egyszerű elválasztásával. Az antipeptidszérum titrálásához a peptidet egy olyan hordozóhoz konjugálva, amely eltér attól, amelyet az immunizálásban alkalmaztak, adszorbeáljuk egy 96 lyukas mikrotiterlemez lyukaiba. Az adszorbeált antigént ezután hagyjuk reagálni a lyukakban az immunizált állat IgG-jére specifikus antitesttel. Ezt a második antitestet konjugáljuk egy enzimmel, például alkalikus foszfatázzal. Az enzimszubsztrát hozzáadásakor keletkező, látható színanyag jelzi, hogy melyik lyuk tartalmaz kötött antipeptidantitestet. A spektrofotométeres leolvasás alkalmazása lehetővé teszi, hogy a peptidspecifikus kötött antitest mennyiségét pontosabban meghatározzuk. A magas titerű antiszérumok lineáris titrálási görbét eredményeznek a 10 3-10 5-ös hígításban.
Példák
Az alábbi példák a találmány jobb megértését szolgálják. A vektorok és gazdaszervezet, valamint a reagensek koncentrációjának, a hőmérsékletnek és más változók értékeinek a megválasztása csak azt a célt szolgálja, hogy példát mutasson a jelen találmány megvalósítására vonatkozóan, és nem tekinthetők a találmány oltalmi köre korlátozásának.
1. példa
Az egér-CSIF biológiai aktivitásai
A különböző T-sejt-klónokból származó egér CSIF-et tartalmazó felülúszókat úgy állítjuk elő, hogy a T-sejtklónokat (5xl06 sejt/ml) szérummentes táptalajban (RPMI 1640, amelyből hiányzik a fenolvörös, és 0,05 mM 2-merkapto-etanolt, valamint 20 mM HEPES-t tartalmaz) inkubáljuk konkanavalin A jelenlétében (5 pg/ml) 24 óra hosszat. A kiónok közé tartozik a D9 sejtvonal (4613459 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírás), a D10 sejtvonal (leírása az alábbiakban), az MB2-1 sejtvonal [Mosmann et al., J. Immunoi. 136, 2348-2357 (1986)], valamint az M411-2 és M411-6 sejtvonalak. A T-sejt felülúszókat abból a szempontból vizsgáljuk, hogy képesek-e elnyomni az IFN-gamma szintézisét a HDK-1 sejtvonalban [Cherwinski et al., J. Exp. Med., 166, 1229-1244 (1987)]. Az egyes T-sejt-klónokból származó mintákból kétszeres sorozathígítást készítünk 96 lyukas, lapos fenekű mikrotitertálcákon 0,05 ml térfogatban. HDK-1 sejteket (őxlO4 sejt per lyuk), besugárzott (2500 R) szingenikus APC-kkel (lépsejtek 5 χ 105 sejt per lyuk mennyiségben) és antigénnel (fürócsiga-hemocianin 150 pg/ml koncentrációban) együtt alkalmazunk 0,115 ml térfogatban. 1 IBI 1 anti-IL-4 antitestet (10 pg/ml) [Ohara et al., Natúré, 315, 333-336 (1985)] adunk azokhoz a mintákhoz, amelyekről feltételezzük, hogy IL-4-et tartalmaznak. 24 óra hosszat inkubáljuk 37 °C-on, majd a felülúszókat összegyűjtjük, és 4 °C-on tartjuk (egy hétnél rövidebb ideig), illetve -80 °C-on tartjuk, hosszabb ideig. Az IFN-gamma szintjét kéthelyes szendvics ELISA-val vizsgáljuk, XMG1.2 patkány anti-egér IFN-gamma monoklonális antitesteket és affinitástisztított nyúl antiegér IFN-gamma antitestet használva. Az 1. ábrán az IFN-gamma szintézise gátlásának mértéke látható, a kontrollszintek százalékában.
A D10 sejtek által termelt CSIF-et részlegesen tisztítjuk, majd két különböző T-sejt-klónra használjuk, hogy vizsgáljuk a citokinszintézis gátlását a CSIF-koncentráció függvényében. A részlegesen tisztított CSIF-et az alábbiak szerint állítjuk elő: 1-2,5 liter konkanavalin A-val indukált D10 felülúszót körülbelül tízszeresre töményítünk Amicon YM membránokkal (Amicon Corp., Danvers, MA), 5 ml térfogatú mannózkonjugált agarózoszlopon bocsátjuk át (E-Y Laboratories, San Mateo, CA), majd tovább töményítjük 3-5-szörösére, a töményítés végleges mértéke 30-50-szeres. Ezt az anyagot tisztítjuk tovább két lépésben, nagynyomású folyadékkromatográfia alkalmazásával: először egy hidroxilapatit-alapú oszlopon (Bio-Gel HPHT, BioRad Laboratories, Richmond, CA), majd egy gélszűrő oszlopon (TSK-G 3000 SW, 60 cm hosszú, LKB Instruments, Gaithersburg, MD). Egy ilyen részlegesen tisztított CSIF-sarzsot alikvot részekben -80 °C-on tartunk, ezt használjuk a CSIF-aktivitás standardjaként. Amikor először vizsgáltuk, akkor ez a preparátum körülbelül 50%ban gátolta az IFN-gamma termelődését kétszázszoros hígításban, 0,2 ml térfogatban, ezért a standard egységet úgy határoztuk meg, hogy a standard CSIF-preparátumhoz 1000 E/ml értéket rendeltünk. Mindegyik alábbi vizsgálatban az ismeretlen mintákban levő CSIF-aktivitás mennyiségét úgy határoztuk meg, hogy összehasonlítottuk az IFN-gamma-szintézis gátlásának mértékét a standardéval. A citokinszintézis szempontjából vizsgálat T-sejt-klónok HDK-1 [Cherwinski et al., J. Exp. Med., 166, 1229-1244 (1987)], illetve az MD13-10 jelűek voltak [Cell. Immunoi., 97, 357 (1986)]. Az IL-3 és GM-CSF szintek vizsgálatához a részlegesen tisztított CSIF-et tovább kezeltük, anti-IL-3 és anti-GM-CSF affinitási oszlopokon bocsátva át. A 0,1 M NaCl, 0,1 M HEPES és 0,08 M CaCl2 összetételű oldatban antitesteket Affi-Gel- 10-hez kapcsoljuk (BioRad) 4 °C-on 4 óra hosszat enyhén rázatva. Mindegyik 1 -2 ml-es oszlop körülbelül 10-20 mg kapcsolt antitestet tartalmazott.
Amint az alábbi 1. táblázatban látható, az IFN-gamma-termelés mindkét kiónban gátlódott. A többi citokin, az IL-2, limfotoxin, IL-3 és GM-CSF szintézise kevésbé, vagy egyáltalán nem gátlódott az MD13-10 sejtekben.
1. táblázat
Sejtvonal | Citokin | A szintézisszint %-os kontrollja | ||
14 E/ml | 42 E/ml | 125 E/ml | ||
HDK-1 | IFN-gamma | 47,6 | 29,1 | 18,6 |
IL-2 | 71,7 | 59,6 | 40,4 | |
limfotoxin | 41,9 | 45,1 | 42,8 | |
IL-3 | 63,9 | 52,6 | 38,4 | |
GM-CSF | 86,9 | 79,1 | 66,8 |
Sejtvonal | Citokin | A szintézisszint %-os kontrollja | ||
14 E/ml | 42 E/ml | 125 E/ml | ||
MD13-10 | IFN-gamma | 36,0 | 27,5 | 23,2 |
IL-2 | 88,2 | 109,3 | 96,0 | |
IL-3 | 60,2 | 63,0 | 51,0 | |
GM-CSF | 109,0 | 119,9 | 97,6 |
2. példa cDNS-könyvtár készítése D10 sejtekből, és a pcD(SRa)-F115 klón izolálása
A pcD(SRa) vektorban D10 sejtekből kivont mRNS-ből [Kaye et al., Exp. Med., 158, 836 (1983)] Okayama és Berg módszerével [Mól. Cell. Bioi., 2, 161-170 (1982); Mól. Cell. Bioi., 3, 280-289 (1983); 4695542 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírás] cDNS-könyvtárat készítünk. A cDNS20 inszerteket tartalmazó pcD(SRa) vektorokat Escherichia coliban amplifikáljuk. A plazmid-DNS-t ezekből a véletlenszerűen kiválasztott kiónokból izoláljuk, majd arra használjuk, hogy COS 7 majomsejteket transzfektáljunk velük az alábbiak szerint. Ezután a COS 7 te25 nyészetek felülúszójában vizsgáljuk meg a CSIF-aktivitást. A COS-sejteket az alábbiak szerint transzfektáljuk: a transzfekció előtt egy nappal körülbelül 1,5 χ 106 COS 7 majomsejtet oltunk le 5% borjúmagzatszérumot (FCS) és 2 mM glutamint tartalmazó Dulbecco-féle módosított Eagle táptalajra (DME), 100 mm átmérőjű lemezeken. A transzfekció végrehajtásához a COS 7 sejteket tripszines inkubálással eltávolítjuk a csészékből, kétszer mossuk szérummentes DME-ben, majd 107 sejt/ml koncentrációban szérummentes DME-ben szuszpendáljuk. Egy 0,75 ml-es alikvot részt összekeverünk 20 pg DNS-sel, és steril 0,4 cm-es elektroporációs küvettába tesszük át. 10 perc elteltével a sejteken 200 volt, 960 pF-os impulzust bocsátunk át egy BioRad Gene Pulser Unitban. Újabb 10 perc elteltével a sejteket eltávolítjuk a küvettából, és 20 ml, 5% FCS-t, 2 mM glutamint, penicillint, sztreptomicint és gentamicint tartalmazó DME táptalajt adunk hozzá. Az elegyet négy 100 mm-es szövettenyésztő csészében osztjuk szét. 12-24 óra hosszat tartjuk 37 °C-on 5%-os
CO2-atmoszférában a csészéket, ezután a tápközegeket összegyűjtjük, és vizsgáljuk a CSIF-aktivitásukat. Ezt követően a pcD(SRcc) cDNS-inszert legnagyobb nyitott leolvasási keretét határozzuk meg. Ennek szekvenciája a következő:
5'- ATGCCTGGCT CAGCACTGCT ATGCTGCCTG CCTTTACTGA CTGGCATGAG
GATCAGCAGG GGCCAGTACA GCCGGGAAGA CAATAACTGC ACCCACTTCC
CAGTCGGCCA GAGCCACATG CTCCTAGAGC TGCGGACTGC CTTCAGCCAG
GTGAAGACTT TCTTTCAAAC AAAGOACCAG CTGGACAACA TACTGCTAAC
CGACTCCTTA ATGTAGGACT TTAAGGGTTA CTTGGGTTGC CAAGCCTTAT
CGGAAATGAT CCAGTTTTAC CTGGTAGAAG TGATGCCCCA GGCAGAGAAG
HU 216 310 Β
CATGGCCCAG AAATCAAGGA GCATTTGAAT TCCCTGGGTG AGAAGCTGAA GACCCTCAGG ATGCGGCTGA GGCGCTGTCA TCGATTTCTC CCCTGTGAAA ATAAGAGCAA GGCAGTGGAG CAGGTGAAGA GTGATTTTAA TAAGCTCCAA GACCAAGGTG TCTACAAGGC CATGAATGAA TTTGACATCT TCATCAACTG CATAGAAGCA TACATGATGA TCAAAATGAA AAGCTAA -3'
Az érett egér CSIF-fehérje aminosavszekvenciája az 10 alábbi, a Heijne-algoritmus szerint meghatározva:
QYSREDNNCT HFPVGQSHML LELRTAFSQV KTFFQTKDQL DNILLTDSLM QDFKGYLGCQ ALSEMIQFYL VEVMPQAEKH GPEIKEHLNS LGEKLKTLRM RLRRCHRHLP CRNKSKAVEQ VKSDFNKLQD QGVYKAMNEF DIFINCIEAY MMIKMKS.
3. példa cDNS-könyvtárak átvizsgálása CSIF után, a pcD(SRa)-! 15-ből származó próbákkal: a pPH5C és a pPH15C izolálása
Egy humán T-sejt klónból extrahált mRNS-ből pcD(SRa)-ban készített cDNS-könyvtárat 70 tagú oligomerek keverékével vizsgálunk át, amelyeknek a szekvenciája komplementer az érett CSIF-et kódoló egér CSIFgén fragmense nemkódoló szálával. A standard hibridizációs kísérleti leírást alkalmazzuk, azaz a 150 mm-es Petri-csészéken növesztett baktériumtenyészeteket GeneScreen membránra visszük át, a radioaktívan jelzett oligonukleotid-próbákkal kezeljük, mossuk, majd rönt5' ATGCACAGCT CAGCACTGCT
GGCCAGCCCA GGCCAGGGCA
CAGGCAACCT TCTTTCAAAT
GTGAAGACTT TCTTTCAAAT
GGAGTCCTTG CTGGAGGACT
CTGAGATGAT CCAGTTTTAC
CAAGACCCAG ACATCAAGGC
GACCCTCAGG CTGAGGCTAC
ACAAGCGCAA GGCCGTGGAG
GAGAAAGGCA TCTACAAAGC
CATAGAAGCC TACATGACAA genfilmre exponáljuk. A próbákat gyenge hibridizációs körülmények között hibridizáljuk, a próbák hossza miatt: a prehibridizáció abból áll, hogy a kiválasztott nukleinsavakat 5xSET [20xSET: 3 M NaCl+0,4 M TRIS-HC1 (pH=7,8)+20 mM EDTA] pufferben inkubáljuk 60 °C25 on, majd ugyanilyen körülmények között hibridizáljuk, és 5 x SET-ben mossuk 50 °C-on. Két plazmidot azonosítunk, amelyek a pH5C és pH 15C jelzést kapják. Mindkét plazmid expresszál fehérjéket a COS 7 sejtekben, amelyek képesek az IFN-gamma-szintézis gátlására PHA-val serkentett humán PBL-ekben. A pH15C cDNS inszertjét a 4. ábrán mutatjuk be, és a legnagyobb nyitott leolvasási keret szekvenciáját az alábbiakban adjuk meg:
CTGTTGCCTG GTCCTCCTGA CTGGGGTGAG
CCCAGTCTGA GAACAGCTGC ACCCACTTCC
GAAGGATCAG CTGGACAACT TGTTGTTAAA
GAAGGATCAG CTGGACAACT TGTTGTTAAA
TTAAGGGTTA CCTGGGTTGC CAAGCCTTGT
CTGGAGGAGG TGATGCCCCA AGCTGAGAAC
GCATGTGAAC TCCCTGGGGG AGAACCTGAA
GGCGCTGTCA TCGATTTCTT CCCTGTGAAA
CAGGTGAAGA ATGCCTTTAA TAAGCTCCAA
CATGAGTGAG TTTGACATCT TCATCAACTA
TGAAGATACG AAACTGA -3'
4. példa
CSIF-re specifikus monoklonális antitestek Hím Lewis patkányt immunizálunk COS 7 sejtekben expresszált, félig tisztított humán CSIF-fel. A patkányt először körülbelül 50 pg humán CSIF Freund-féle komplett adjuvánssal készült oldatával immunizáljuk, majd kétszer ugyanazt a mennyiségű anyagot adjuk be Freund-féle inkomplett adjuvánssal. Vérmintákat veszünk. Az állatnak emlékeztető oltást adunk 25 pg, foszfáttal pufferolt sóoldatban oldott anyaggal, majd négy nappal később a lépet a sejtfúzióhoz kivesszük.
Körülbelül 3xl08 patkánylépsejtet fuzionáltatunk 55 azonos mennyiségű P3X63-AG8.653 egér-mielómasejttel (ATTCC, CRL 1580 letéti szám). 3840 mikrotiterlemez-lyukat oltunk be, lyukanként 5,7xl07 szülői mielómasejttel. A fúziós kísérletek, és azt követően a hibridek tenyésztésének standard körülményeit az alábbi publikációban közük [Chretien et al., J. Immunoi. Meth.,
HU 216 310 Β
117, 67-81 (1989)]. A fúzió után 12 nappal összegyűjtjük a felülúszókat, és indirekt ELISA-val vizsgáljuk át, COS 7 sejtekben termelt humán CSIF-fel borított PVClemezeken. A JES3-19F1 hibridómát ily módon azonosítjuk, majd az American Type Culture Collectionnél letétbe helyezzük.
Az elsőként átvizsgált hibridómák közül azokat szelektáljuk, amelyek blokkolóantitesteket termelnek, hogy olyan antitesteket állítsunk elő, amelyek kölcsönhatásba lépnek az IFN-gamma-szintézis CSIF-fel való gátlásával PHA-val serkentett humán PBL-ekben.
5. példa
A humán CSIF expressziója bakteriális gazdaszervezetben
Egy szintetikus humán CSIF-gént állítunk össze több kémiailag szintetizált kétszálú DNS-fragmensből, így kapjuk a TAC-RBS-hCSIF expressziós vektort. A klónozást és az expressziót standard bakteriális rendszerben végezzük, például Escherichia coli KI2 JM101, JM103, vagy hasonló törzsben [Vieira and Messing, Gene, 19, 259-268 (1982)]. A restrikciós endonukleázos emésztéseket és a ligálási reakciókat standard leírások alapján végezzük [Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory, New York, 1982)].
A lúgos módszert [Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory, New York, 1982)] használjuk kis mennyiségű plazmidpreparátum előállítására. Nagy mennyiségű plazmid előállításához a lúgos módszer módosítását használjuk, mikor is azonos térfogatú izopropanolt használunk arra, hogy a tisztított lizátumból kicsapjuk a nukleinsavat. A hideg 2,5 M ammónium-acetáttal végzett kicsapást használjuk arra, hogy az RNS-t eltávolítsuk a cézium-klorid egyensúlyi centrifugálás és etídium-bromiddal való kimutatás előtt.
A hibridizáláshoz Whatman 540 szűrőlapokat használunk arra, hogy átvigyük a telepeket, amelyeket azután 0,5 M NaOH, 1,5 M NaCl; 1 M TRIS-HC1 (pH=8,0) 1,5 M NaCl (2-2 percig) és 80 °C-ra való melegítés (30 perc) egymás után való alkalmazásával lizálunk és fixálunk. A hibridizálást a következő körülmények között végezzük: 6x SSPE, 20% formamid, 0,1% nátriumdodecil-szulfát (SDS), 100 mg/ml Escherichia coli tRNS, 100 mg/ml Coomassie Brilliant Blue G-250 (BioRad), 42 °C, 6 óra hosszat, 32P-vel jelzett (kinázolt) szintetikus DNS-t használva. (A 20 χ SSPE-t úgy állítjuk elő, hogy 174 g NaCl-t, 7,4 g EDTA-t és 27,6 g NaH2PO4 χ 9H2O-t oldunk 800 ml vízben; a pH-t ezután NaOH-val 7,4-re állítjuk, a térfogatot egy literre egészítjük ki, majd az oldatot autoklávozással sterilezzük). A szűrőket kétszer mossuk (15 perc, szobahőmérsékleten) lxSSPE, 0,1% SDS összetételű oldatban. Autoradiográfia után (Fuji RX film) a pozitív telepeket azonosítjuk, oly módon, hogy az újranőtt telepeket fedésbe hozzuk a szűrőn levő, kék színű telepekkel. A DNS-t a didezoxiszekvenálási módszerrel szekvenáljuk [Sanger et al., Proceedings of the National Academy of Sciences, USA, 74, 5463 (1977)]. A didezoxireakcióhoz alkalmas templátokat vagy a megfelelő régiók egyszálú DNS-eit M13mp vektorokban klónozva alkalmazzuk [Messing et al., Nucleic Acids Research, 9, 309 (1981)], vagy kétszálú DNS-t használunk, amelyet a mini lúgos hidrolízismódszerrel állítunk elő, és 0,2 M NaOH-val (5 perc, szobahőmérséklet) denaturálunk, és 0,2 M NaOH és 1,34 M ammónium-acetát-tartalmú elegyből csapunk ki 2 térfogat etanol hozzáadásával. A DNS-t foszforamidites módszerrel szintetizáljuk Applied Biosystems 380A szintetizátort alkalmazva. A szintézist, a védőcsoportok eltávolítását és a tisztítást (7 M karbamid PAGE, elúció, DEAE-cellulóz-kromatográfia) lényegében a 380A szintetizátor kézikönyvében leírt módszerekkel végezzük.
A klónozandó szintetikus DNS-eket (mindegyik 400 ng) összekeverjük, majd polinukleotid kinázzal foszforilezzük 50 ml reakció-térfogatban. Ezt a DNS-t Egáljuk 1 mg vektor DNS-sel, amelyet a megfelelő restrikciós enzimekkel emésztettünk, 50 ml térfogatban, 4-12 óra hosszat. A foszforilezés, restrikciós enzimes emésztés, polimerázreakciók és a ligálás körülményeit már leírták [Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory, New York, 1982)]. A telepeket a lacZ+ tulajdonság alapján vizsgáljuk (ha szükséges) oly módon, hogy ampicillinnel, izopropil-1-tio-béta-D-galaktoziddal (IPTG, 0,4 mM) és 5bróm-4-klór-3-indolil-béta-D-galaktopiranoziddal (x-gal, 40 mg/ml) kiegészített L agar táptalajra szélesztjük.
A TAC-RBS vektort úgy készítjük, hogy a tacP-t hordozó pDR540 plazmid (Pharmacia) egyetlen BamHI hasítási helyét DNS-polimerázzal feltöltjük. Ezt azután foszforilezetlen szintetikus oligonukleotidokhoz (Pharmacia) Egáljuk, amelyek kétszálú fragmenst képeznek, és a konszenzus-riboszomáliskötőhelyet kódolják (RBS, GTAAGGAGGTTTAAC). A ligálás után az elegyet foszforilezzük, és az ATGAGCTCAT SstI linkénél újra Egáljuk. Ezt a komplexet azután SStI és EcoRI restrikciós endonukleázokkal hasítjuk, és a 173 bp méretű fragmenst poliakrilamid-gélelektroforézissel izoláljuk, és az EcoRISstl restrikciós enzimekkel emésztett pUC19 vektorba (Pharmacia) klónozzuk (az előzőek szerint). A végső konstrukció RBS-ATG-polilinkenégióinak (jele TACRBS) szekvenciáját a 3. ábrán mutatjuk be.
A szintetikus CSIF-gént nyolc lépésben építjük be a pUC19 plazmidba. Minden egyes lépésnél delécióktól és/vagy inszercióktól mentes inszerteket tudunk detektálni a klónozás után, oly módon, hogy a pUC19 lacZ(a) génjét leolvasási fázisban tartjuk az 1. lépésben bevitt ATG kodonnal. A deléciós és/vagy inszerciós változásokat tartalmazó telepeket ki lehet szűrni, x-gal-t és IPTG-t tartalmazó L-ampicillin-telepeken kiválasztva a kék telepeket. Egy másik módszer szerint, minden egyes lépésnél az inszertek szekvenciáját könnyen ellenőrizhetjük, univerzális szekvenáló indítómolekula alkalmazásával kis mennyiségű plazmidpreparátumokon, (Boehringer Mannheim).
Az 1. lépésben a TAC-RBS vektort SstI restrikciós enzimmel emésztjük, T4 DNS-polimerázzal kezeljük (amelynek a 3’-exonukleáz-aktivitása leemészti az SstI hasítások 3’-túlnyúló végeit, így hoz létre tompa végű
HU 216 310 Β fragmenseket), majd a T4 DNS-polimeráz dezaktiválása után EcoRI restrikciós enzimmel kezeljük, így kapunk egy 173 bp méretű fragmenst, amely a TAC-RBS régiót tartalmazza, az ATG startkodonnál tompa a vége, a másik vége pedig EcoRI enzimmel emésztett vég. Végül izoláljuk a 173 bp méretű TAC-RBS fragmenst.
A 2. lépésben az 1. lépésben izolált TAC-RBS fragmenst RcoRI/KpnI restrikciós enzimmel emésztett pUC19 plazmiddal, valamint az 1A/B szintetikus fragmenssel keverjük össze, amely az alábbiakban bemutatva az 5’-végén tompa véggel rendelkezik, és egy, a KpnI hasításnak megfelelő tapadós véggel a 3'-terminuson. Ez a KpnI hasítási hely a 3'-irányban szomszédos a BstEII hasítási hellyel. A fragmenseket a 2. lépés pUC19 vektorával ligáljuk össze.
A 3. lépésben a 2A/B és 3A/B szintetikus fragmenst (lásd alább) keverjük össze BstEII/Smal restrikciós enzimekkel emésztett pUC19 vektorral (2. lépés) (amplifikálás és tisztítás után), majd összeligálva kapjuk a 3. lépés pUC19 vektorát. Meg kell jegyezni, hogy a 3A/B fragmens 3’-vége extra bázisokat tartalmaz, amelyek a SamI tompa véget képezik. Az extra bázisokat a 4. lépésben hasítjuk le. A 2A/B és 3A/B fragmensek is rendelkeznek 9 tagból álló, egyszálú végekkel, amelyek az összekeverés után egymáshoz illeszkednek, szabadon hagyva a 2A/B 5'-végén levő BstEII hasítási helyet és a 3A/B 3'-végén levő tompa véget, hogy ezekkel lehessen ligálni a pUC 19-be.
A 4. lépésben az AflII/Xbal restrikciós enzimekkel emésztett pUC19 vektort (3. lépés, amplifikálás és tisztítás után) újra tisztítjuk, összekeverjük a 4A/B szintetikus fragmenssel (lásd az alábbiakban), majd összeligáljuk, így kapjuk a 4. lépés pUC19 plazmidját.
Az 5. lépésben a 4. lépésből származó, Xbal/Sall restrikciós enzimmel emésztett pUC19 plazmidot (amplifikálás tisztítás után) az 5A/B szintetikus fragmenssel (lásd alább) keverjük össze, majd ligáljuk, így kapjuk az 5. lépés pUC19 plazmidját. Meg kell jegyezni, hogy az 5A/B fragmens Sáli tapadós végét a 6.
lépésben Hpal enzimes emésztéssel elimináljuk.
A 6. lépésben az 5. lépésből származó, Hpal/PstI restrikciós enzimekkel emésztett pUC19 plazmidot (amplifikálás és tisztítás után) a 6A/B szintetikus fragmenssel keverjük össze (lásd alább), majd ligáljuk, így kapjuk a 6. lépés pUC 19 fragmensét.
A 7. lépésben a 6. lépésből származó, Clal/Sphl restrikciós enzimekkel emésztett pUC19 plazmidot (amplifikálás és tisztítás után) a 7A/B szintetikus fragmenssel (lásd alább) keverjük össze, majd ligáljuk, így kapjuk a 7. lépés pUC 19 plazmidját.
A 8. lépésben a 7. lépésből származó, MluI/HindlII restrikciós enzimekkel emésztett pUC19 plazmidot (amplifikálás és tisztítás után) a 8A/B és a 9A/B szintetikus fragmensekkel keverjük össze, majd ligáljuk, így kapjuk a végső konstrukciót. Ezt a végső konstrukciót standard technikával bejuttatjuk az Escherichia coli K-12 JM101 törzsbe (ATCC-száma 33 876). A tenyésztés után a fehérjét extraháljuk a JM101 sejtekből, és a kivonatok hígításainak vizsgáljuk a biológiai akti30 vitását.
AGCCCAGGCC AGGGCACCCA GTCTGAGAAC AGCTGCACCC ACTTCTCGGGTCCGG TCCCGTGGGT CAGACTGTTG TCGACGTGGG TGAAGCCAGGtAACC ggtac
GGTCCaTTGG
Az 1A/B fragmens
GtAACCTGCC TAACATGCTT CGAGATCTCC GAGATGCCTT CAGCAGACGG ATTGTACGAA GCTCTAGAGG CTCTACGGAA GTCGTGAGTGAAGAC TTTCTTT
CTCACTTC
A 2A/B fragmens
CAAATGAAGG ATCAGCTGGA CAACTTGTTc TtAAG
TGAAAGAAA GTTTACTTCC TAGTCGACCT GTTGAACAAg AaTTC A 3A/B fragmens
GAGTCCTTGC TGGAGGACTT TAAGGGTTAC CTGGGTTGCC AAGCCCTCAGGAACG ACCTCCTGAA ATTCCCAATG GACCCAACGG TTCGGTTGTCTGAGA TGATCCAGTT TTAt
AACAGACTCT ACTAGGTCAA AATaGAtC
HU 216 310 Β
A 4A/B fragmens
CTaGAGGAGG TGATGCCCCA AGCTGAGAAC CAAGACCCAG ACATCGAtCTCCTCC ACTACGGGGT TCGACTCTTG GTTCTGGGTC TGTAGAAGGCGCATG TtAACg TTCCGCGTAC AaTTGcagct
A 5A/B fragmens
AACTCCCTGG GGGAGAACCT GAAGACCCTC AGGCTGAGGC TACGGTTGAGGGACC CCCTCTTGGA CTTCTGGGAG TCCGACTCCG ATGCCCGCTGTCATC GATctgca GCGACAGTAG CTAg
A 6A/B fragmens
CGATTTCTTC CCTGTCAAAA CAAGAGCAAG GCCGTGGAGC AGGTGTAAAGAAG GGACAGTTTT GTTCTCGTTC CGGCACCTCG TCCACAAGAAcGCgT gcatg TTCTTgCGcA C
A 7A/B fragmens
CGCGTTTAAT AATAAGCTCC AAGACAAAGG CATCTACAAA GCCATAAATTA TTATTCGAGG TTCTGTTTCC GTAGATGTTT CGGTAGAGTGAGTTT GAC
CTCA
A 8A/B fragmens
ATCTTCATCA ACTACATAGA AGCCTACATG ACAATCTCAAACTG TAGAAGTAGT TGATGTATCT TCGGATGTAC TGTTAGAAGATACGA AACTGA
CTTCTATGCT TTGACTtcga
A 9A/B fragmens (A kisbetűk azt jelzik, hogy az adott bázis eltér a természetes szekvenciában ugyanazon a helyen található bázistól.)
6. példa
A CENKSKA VE pepiidre specifikus antitestek 50 mg ovalbumint (ÓVA) és 50 mg mioglobulint (MYO) (például a SIGMA-tól kaphatók) oldunk 1 ΟΙ 0 ml 0,1 M nátrium-hidrogén-karbonát-oldatban, majd 1 ml 0,12 M jód-acetamid-oldattal reagáltatjuk (88 mg jód-acetamid oldva 4 ml 0,1 M nátrium-hidrogén-karbonát-oldatban) 1 óra hosszat szobahőmérsékleten 15 ml-es Falcon csőben (Falcon Plastics, Oxnard, CA) vagy más hasonlóban. Mindegyik reakcióelegyet éjszakán át 4 liter 0,1 M nátrium-hidrogén-karbonát-oldattal szemben dializáljuk 4RC-vel. Eközben 10 mg CENKSKA VE-t oldunk 2 ml 0,1 M DTT- (ditio-treitol) oldatban (50 mM TRIS-HCl-t és 2,5 mM EDTA-t tartalmaz, pH=8) egy 4 ml-es csőben, majd éjszakán át 37 °C-on inkubáljuk; ezután egy GF05 gélszűrő oszlopra visszük (1,5x26,5 cm) (LKB, Bromma, Svédország), majd egy peptideluáló pufferrel eluáljuk (összetétele : 0,015 M ecetsav és 0,005 M B-merkapto-etanol). Három, körülbelül 3,5 ml-es frakciót azonosítunk a
HU 216 310 Β
206 nm-en mért optikai denzitás alapján, amelyek tartalmazzák a redukált peptideket, ezeket összegyűjtjük, és szárazjégen megfagyasztjuk, majd lioftlezzük. Ezalatt az OVA-t és a MYO-t kinyeijük a dializálásból, majd 0,45 mikrométeres szűrőn átszűrve tisztítjuk. Az OVA-t és a MYO-t aktiváljuk oly módon, hogy mindegyiket 380 mikroliter jód-ecetsav N-hidroxi-szukcinimid-észterrel (NHIA) reagáltatjuk [Rector et al., J. Immunoi. Meth., 24, 321 (1978)], amelyet tetrahidrofuránban (THF) oldottunk (5 mg/ml), 30 percig szobahőmérsékleten kevertetjük, majd éjszakán át dializáljuk 4 liter PBS-sel szemben (PBS: 1,8 g NaH2PO4xH2O, 7,2 g Na2HPO4 χ H2 és 34 g NaCl 4 liter vízben). Közben a liofilezett peptidet 5 ml borát redukciós pufferben oldjuk (összetétele: 2 gNa2B4O7xl0H2O, 17,4 g NaCl és 335 mg dinátrium-EDTA egy liter vízben, pH 8,5-re állítva tömény sósavval, oxigénmentesítve nitrogén alatt 15 percig, ezután 178 mg aszkorbinsavat adunk hozzá). A dializált jód-acetilezett OVA-t és MYO-t kinyerjük, külön-külön összekeveijük azonos térfogatú (előnyösen 2 ml), a peptidet tartalmazó borát redukciós pufferrel, majd éjszakán át szobahőmérsékleten inkubáljuk. A kapott konjugátumokat SDS-PAGE-val vizsgáljuk (12,5% gél). A konjugátumot tartalmazó oldatot PBS-sel hígítjuk 1 mg/ml koncentrációra, sterilre szűrjük, majd alkalmas térfogatú alikvot részekre osztjuk (például 500 μΐ) az immunizáláshoz, és/vagy 4 °C-on tároljuk. A MYO-konjugátum elleni poliklonális antiszérumokat mind patkányokban, mind nyulakban előállítjuk (Uj-Zélandi Fehér). Az immunizálás menete a nyulaknál a következő: Először (0. hét) egy 10 ml-es szérumot extrahálunk, ez a kontroll. Egy héttel később (1. hét) 0,5 ml peptidhordozó konjugátumot keverünk 0,5 ml Freund-féle komplett adjuvánssal, és intraperitoneálisan beadjuk. Három héttel később (4. hét) egy erősítőinjekciót adunk be (0,5 ml peptidhordozó konjugátum 0,5 ml Freund-féle inkomplett adjuvánssal keverve). A következő héten (5. hét) újabb erősítőt adunk be, amely ismét 0,5 ml peptidhordozó konjugátum és 0,5 ml Freund-féle inkomplett adjuváns elegye, majd a következő (6. hét) héten újabb, azonos erősítőinjekciót adunk be. A 7. héten az állattól 20 ml szérumot veszünk. Miután a sejtes frakciót elválasztottuk a szérumból, a szérumot a pozitív anti-CENKSKAVE-titerre vizsgáljuk meg ELISA-val. A patkány immunizálását hasonló módon végezzük, azzal a különbséggel, hogy az indítóinjekció 0,15 ml PBS-t és 0,1 ml peptidhordozó konjugátumot tartalmaz 0,75 ml Freund-féle inkomplett adjuvánssal keverve, és csak 2-3 ml szérumot véreztetünk ki az állatból. Ismét pozitív anti-CENKSKAVE-reakciót detektálunk ELISA-val.
A találmány fenti előnyös megvalósítási módjait a találmány ismertetése céljából írtuk le. Nem korlátozó jellegűek, nem korlátozzák a leírt precíz kiviteli formákat, és természetesen számos módosítás és variáció elképzelhető a fenti kitanítás alapján. A megvalósítási módokat azért választottuk ki és írtuk le, hogy a legjobban ismertessék a találmány elveit, és ezáltal lehetővé tegyék, hogy a szakterületen jártas szakember a legjobban használni tudja a találmány egyes megvalósítási módjait, különböző módosításokkal, amelyek a legjobban illenek a szándékolt felhasználáshoz. A találmány oltalmi körét a megadott igénypontok határozzák meg.
A bejelentők külön letétbe helyezték a pcD(SRa)F115, pH5C és pH15C vektorokat tartalmazó Escherichia coli MCI601 törzseket az American Type Culture Collectionnál (Rockville, MD, Amerikai Egyesült Államok), 68027, 68191 és 68192 letéti sorszám alatt. A letéteket az ATCC és a Culture Deposits fór Patent Purposes közötti egyezmény alapján helyeztük el, ami lehetővé teszi, hogy a letétek hozzáférhetők legyenek az US Commissioner of Patents and Trademarks 35 USC 122 és 37 CFR 1,14 alapján, ami megköveteli, hogy a letéteket fenntartsák. A letétbe helyezett törzsek hozzáférhetősége nem tekinthető licencnek a találmány alkalmazására, azokkal a jogokkal szemben, amelyet bármely kormány biztosít a találmányi törvénnyel összhangban.
A letéteket a mikroorganizmusok letétbe helyezéséről szóló Budapesti Egyezmény alapján módosítottuk.
Claims (33)
- SZABADALMI IGÉNYPONTOK1. Eljárás nukleinsav előállítására, amely folyamatos nukleotidszekvenciával kódol egy emlős-citokinszintézist gátló faktoraktivitással rendelkező polipeptidet, azzal jellemezve, hogy az ATCC-nél 68 027, 68 191 és 68192 számon letétbe helyezett pcD(SRa)-F115, pH5C, illetve pH15C vektor cDNS-inszertjeiből származó próbával 5XSET jelenlétében, 60 °C-on vagy ennek megfelelő hibridizálási körülmények között egy detektálható hibridet képező nukleinsavat izolálunk.Elsőbbsége: 1989. 12.20.
- 2. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az izolált nukleinsav nukleotidszekvenciája legalább 90%-ban homológ a pcD(SRa)-F115, pH5C vagy pH15C vektor cDNS-inszertjének legnagyobb leolvasási kerete kódolórégiójával.Elsőbbsége: 1989. 12. 20.
- 3. Az 1. igénypont szerinti eljárás egér-citokinszintézist gátló faktort kódoló nukleotidszekvencia előállítására, azzal jellemezve, hogy a pCD(SRa)-Fl 15 vektor cDNS-inszertjéhez hibridizáló nukleotidszekvenciát állítjuk elő.Elsőbbsége: 1989.06.28.
- 4. Az 1. igénypont szerinti eljárás humán citokinszintézist gátló faktort kódoló nukleotidszekvencia előállítására, azzal jellemezve, hogy a pCD(SRcc)-Fl 15 vektor cDNS-inszertjéhez hibridizáló nukleotidszekvenciát izoláljuk.Elsőbbsége: 1989.06.28.
- 5. Az 1. igénypont szerinti eljárás humán citokinszintézist gátló faktort kódoló nukleotidszekvencia előállítására, azzal jellemezve, hogy a pH15C vagy pH5C cDNS-inszertjéhez hibridizáló nukleotidszekvenciát izoláljuk.Elsőbbsége: 1989. 12.20.
- 6. Az 5. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az alábbi nukleotidszekvenciát izoláljuk:AGCCCAGGCC AGGGCACCCA GTCTGAGAAC AGCTGCACCC 40ACTTCCCAGG CAACCTGCCT AACATGCTTC GAGATCTCCG 80AGATGCCTTC AGCAGAGTGA AGACTTTCTT TCAAATGAAG 120GATCAGCTGG ACAACTTGTT GTTAAAGGAG TCCTTGCTGG 160AGGACTTTAA GGGTTACCTG GGTTGCCAAG CCTTGTCTGA 200GATGATCCAG TTTTACCTGG AGGAGGTGAT GCCCCAAGCT 240GAGAACCAAG ACCCAGACAT CAAGGCACAT GTGAACTCCC 280TGGGGGAGAA CCTGAAGACC CTCAGGCTGA GGCTACGGCG 320CTGTCATCGA TTTCTTCCCT GTGAAAACAA GAGCAAGGCC 360GTGGAGCAGG TGAAGAATGC CTTTAATAAG CTCCAAGAGA 400AAGGCATCTA CAAAGCCATG AGTGAGTTTG ACATCTTCAT 440CAACTACATA GAAGCCTACA TGACAATGAA GATACGAAAC 480Elsőbbsége: 1989. 12.20.
- 7. Eljárás egy emlős-citokinszintézist gátló aktivitású polipeptidet kódoló nukleotidszekvenciát tartalmazó expressziós vektor előállítására, azzal jellemezve, hogy egy alkalmas expressziós vektorba egy, 1-6. igénypontok bármelyike szerint előállított nukleotidszekvenciát a megfelelő szabályozószekvenciákkal együtt működőképesen beépítünk.Elsőbbsége: 1989.06.28.
- 8. A 7. igénypont szerinti eljárás egér-citokinszintézist gátló faktort kódoló nukleotidszekvenciát tartalmazó expressziós vektor előállítására, azzal jellemezve, hogy az ATCC-nél 68027 számon letétbe helyezett pcD(SRa)-Fl 15 expressziós vektort állítjuk elő.Elsőbbsége: 1989.06.28.
- 9. A 7. igénypont szerinti eljárás humán citokinszintézist gátló faktort kódoló nukleotidszekvenciát tartalmazó expressziós vektor előállítására, azzal jellemezve, hogy az ATCC-nél 68 191 vagy 68 192 számon letétbe helyezett pH5C vagy pH15C expressziós vektort állítjuk elő.Elsőbbsége: 1989. 12.20.
- 10. A 7. igénypont szerinti eljárás humán citokinszintézist gátló faktort kódoló nukleotidszekvenciát tartalmazó expressziós vektor előállítására, azzal jellemezve, hogy a TAC-RBS-hCSIF konstrukciót állítjuk elő.Elsőbbsége: 1989. 12.20.
- 11. Eljárás emlős-citokinszintézist gátló faktoraktivitással rendelkező polipeptidet expresszáló gazdasejt előállítására, azzal jellemezve, hogy egy alkalmas gazdasejtet egy, a 7-10. igénypontok bármelyike szerint előállított expressziós vektorral transzformálunk.Elsőbbsége: 1989.06.28.
- 12. A 11. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy gazdasejtként bakteriális sejtet alkalmazunk.Elsőbbsége: 1989.06.28.
- 13. A 11. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy gazdasejtként emlőssejtet alkalmazunk.Elsőbbsége: 1989.06.28.
- 14. Eljárás emlős-citokinszintézist gátló faktor(CSIF) aktivitással rendelkező polipeptid előállítására, azzal jellemezve, hogy egy, a 11-13. igénypontok bármelyike szerint előállított gazdasejtet megfelelő táptalajon a polipeptid kifejeződését biztosító körülmények között tenyésztjük, és az expresszált polipeptidet izoláljuk.Elsőbbsége: 1989.06.28.
- 15. A 14. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az egér-citokinszintézist gátló faktort állítjuk elő.Elsőbbsége: 1989.06.28.
- 16. A 15. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az alábbi aminosavszekvenciával rendelkező egér-citokinszintézist gátló faktort állítjuk elő:QYSREDNNCT HFPVGQSHML LELRTAFSQV KTFFQTKDQLDNILLTDSLM QDFKGYLGCQ ALSEMIQFYL VEVMPQAEKHGPEIKEHLNS LGEKLKTLRM RLRRCHRHLP CRNKSKAVEQVKSDFNKLQD QGVYKAMNEF DIFINCIEAY MMIKMKS.Elsőbbsége: 1990.06.28.
- 17. A 14. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a humán citokinszintézist gátló faktort állítjuk elő.Elsőbbsége: 1989. 12.20.
- 18. A 17. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az alábbi aminosavszekvenciával rendelkező humán citokinszintézist gátló faktort állítjuk55 elő:MHSSALLCCL VLLTGVRASP GQGTQSENSC THFPGNLPNMLRDLRDAFSR VKTFFQMKDQ LDNLLLKESL LEDFKGYLGCQALSEMIQFY LEEVMPQAEN QDPDIKAHVN SLGENLKTLRLRLRRCHRFL PCENKSKAVE QVKNAFNKLQ EKGIYKAMSEFDIFINYIEA YMTMKIRNElsőbbsége. 1990. 06. 28. 5 kező érett humán citokinszintézist gátló faktort állít
- 19. A 17. igénypont szerinti eljárás, azzal jelle- jukelő:mezve, hogy az alábbi aminosavszekvenciával rendelSPGQGTQSEN SCTHFPGNLP NMLRDLRDAF SRVKTFFQMKDQLDNLLLKE SLLEDFKGYL GCQALSEMIQ FYLEEVMPQAENQDPDIKAH VNSLGENLKT LRLRLRRCHR FLPCENKSKAVEQVKNAFNK LQEKGIYKAM SEFDIFINYI EAYMTMKIRNElsőbbsége: 1990.06.28.
- 20. A 14. igénypont szerinti eljárás egy 6-30 aminosavból álló polipeptid előállítására, azzal jellemezve, hogy a 19. igénypontban megadott, érett humán citokinszintézist gátló faktor szekvenciájának egy alszekvenciájával rendelkező polipeptidet állítunk elő.Elsőbbsége: 1990.06.28.
- 21. A 20. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az említett alszekvencia az érett humán citokinszintézist gátló faktor alábbi szekvenciarészletében20 fordul elő:SPGQGTQSEN SCTHFPGNLP NMLRDLRDAF SRVKTFFQMK.Elsőbbsége: 1990.06. 28.
- 22. A 21. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a peptid aminosavszekvenciája RDLRDA.Elsőbbsége: 1990.06.28.
- 23. A 20. igénypont szerinti eljárás egy 6-12 aminosavból álló peptid előállítására, azzal jellemezve, hogy az említett alszekvencia az érett humán citokinszintézist gátló faktor alábbi szekvenciarészletében fordul elő:LEEVMPQAEN QDPDIKAHVN SLGEN.Elsőbbsége: 1990.06.28.
- 24. A 23. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a peptid aminosavszekvenciája ENQDPD.Elsőbbsége: 1990.06.28.
- 25. A 20. igénypont szerinti eljárás egy 6-12 aminosavból álló peptid előállítására, azzal jellemezve, hogy az említett alszekvencia az érett humán citokinszintézist gátló faktor alábbi szekvenciarészletében fordul elő:CHRFLPCENK SKAVEQVKNA FNK.Elsőbbsége: 1990.06.28.
- 26. A 25. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a peptid aminosavszekvenciája ENKSKA.Elsőbbsége: 1990.06.28.
- 27. Eljárás monoklonális antitest előállítására, azzal jellemezve, hogy önmagában ismert módon egy, a 14-26. igénypontok bármelyike szerint előállított polipeptidhez specifikusan kötődő és a CSIF biológiai aktivitást gátló monoklonális antitestet állítunk elő.Elsőbbsége: 1989. 12.20.
- 28. Eljárás gyógyszerkészítmény előállítására, azzal jellemezve, hogy a 14. igénypont szerint előállított CSIFaktivitású polipeptid hatásos mennyiségét a gyógyszer30 készítményben szokásos hordozó- és/vagy segédanyagokkal összekeverve gyógyszerkészítménnyé alakítjuk.Elsőbbsége: 1989.06. 28.
- 29. A 28. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemez35 ve, hogy CSIF aktivitású polipeptidként a humán citokinszintézist gátló faktort alkalmazzuk.Elsőbbsége: 1989.06.28.
- 30. A 28. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy MHC-hez kötődő immunválasszal kapcsolatos40 betegség kezelésére szolgáló gyógyszerkészítményt állítunk elő.Elsőbbsége: 1989. 06. 28.
- 31. A 30. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy 1-10 pg/kg testtömeg/nap tartományba eső45 humán CSIF-mennyiség beadására alkalmas gyógyszerkészítményt állítunk elő.Elsőbbsége: 1989.06.28.
- 32. A 28. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy sejt közvetítette immunválasz elnyomására50 szolgáló gyógyszerkészítményt állítunk elő. Elsőbbsége: 1989. 12. 20.
- 33. A 28. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy humorális immunválasz elnyomására szolgáló gyógyszerkészítményt állítunk elő.
Applications Claiming Priority (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US37266789A | 1989-06-28 | 1989-06-28 | |
US45395189A | 1989-12-20 | 1989-12-20 |
Publications (3)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
HU906705D0 HU906705D0 (en) | 1992-03-30 |
HUT61048A HUT61048A (en) | 1992-11-30 |
HU216310B true HU216310B (hu) | 1999-06-28 |
Family
ID=27005854
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
HU906705A HU216310B (hu) | 1989-06-28 | 1990-06-28 | Eljárás citokinszintézis inhibitorfaktor (CSIF), CSIF-aktivitású polipeptidek és CSIF-antagonisták, valamint ezeket tartalmazó gyógyszerkészítmények előállítására |
Country Status (22)
Country | Link |
---|---|
EP (2) | EP0567450B1 (hu) |
JP (1) | JP2813063B2 (hu) |
KR (1) | KR0183035B1 (hu) |
CN (3) | CN1318589C (hu) |
AT (1) | ATE180833T1 (hu) |
AU (1) | AU635058B2 (hu) |
CA (1) | CA2062763C (hu) |
CS (1) | CS414591A3 (hu) |
DE (1) | DE69033143T2 (hu) |
DK (1) | DK0567450T3 (hu) |
ES (1) | ES2132068T3 (hu) |
FI (1) | FI107926B (hu) |
GR (1) | GR3030404T3 (hu) |
HK (3) | HK1008834A1 (hu) |
HU (1) | HU216310B (hu) |
IL (1) | IL94878A (hu) |
NO (1) | NO301718B1 (hu) |
NZ (1) | NZ234291A (hu) |
PT (1) | PT94514B (hu) |
SG (1) | SG52282A1 (hu) |
TW (1) | TW218383B (hu) |
WO (1) | WO1991000349A1 (hu) |
Families Citing this family (38)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US5827513A (en) * | 1990-06-29 | 1998-10-27 | Schering Corporation | Methods of treating insulin-dependent diabetes mellitus by administration of IL-10 |
US6106823A (en) * | 1991-01-16 | 2000-08-22 | Schering Corporation | Treatment of neoplastic disease with interleukin-10 |
EP0567586B1 (en) * | 1991-01-16 | 1995-07-12 | Schering Corporation | Use of interleukin-10 in adoptive immunotherapy of cancer |
DE69201128T2 (de) * | 1991-01-16 | 1995-05-24 | Schering Corp | Behandlung von neoplastischen krankenheiten mit interleukin-10. |
DE4122402A1 (de) * | 1991-07-04 | 1993-01-07 | Schering Ag | Verwendung von interleukin 10 zur herstellung von arzneimitteln mit tumorhemmender wirksamkeit |
US5833976A (en) * | 1991-08-06 | 1998-11-10 | Schering Corporation | Use of interleukin-10 (IL-10) to treat endotoxin- or superantigen-induced toxicity |
KR100271197B1 (ko) * | 1991-08-06 | 2000-11-01 | 둘락 노먼 씨. | 인터루킨-10동족체또는길항제를포함하는내독소-또는초항원유도된독성치료용의약제학적조성물 |
US6277635B1 (en) | 1992-03-04 | 2001-08-21 | Schering Corporation | Use of interleukin-10 to produce a population of suppressor cells |
NZ249754A (en) * | 1992-03-04 | 1997-06-24 | Schering Corp | Interleukin-10 and its use in inhibiting graft vs host disease or tissue rejection |
US6884410B1 (en) | 1992-03-04 | 2005-04-26 | Schering Corporation | Methods for modulating antigen-specific immune responses |
AU3801193A (en) * | 1992-03-20 | 1993-10-21 | Schering Corporation | Use of interleukin-10 to induce the production of interleukin-1 receptor antagonist |
HU220103B (hu) * | 1992-08-20 | 2001-10-28 | Schering-Plough Corp. | IL-10 új alkalmazása |
US5601815A (en) * | 1992-08-21 | 1997-02-11 | Schering Corp | IL-4 and IL-10 to downregulate delayed-type hypersensitivity and cytokine expresion by T-cells |
WO1994006473A1 (en) * | 1992-09-18 | 1994-03-31 | Schering Corporation | Restoration of immunocompetency to t helper cells in hiv infected patients |
DE69325029T2 (de) * | 1992-10-01 | 1999-10-07 | Schering Corp., Kenilworth | Verwendung der il-10 zur verhinderung des insulin-abhängigen diabetes mellitus |
TW381026B (en) * | 1993-01-13 | 2000-02-01 | Schering Corp | Method of extracorporally activating cytolytic activity of peripheral blood mononuclear cells and pharmaceutical composition comprising the activated peripheral blood mononuclear cells |
CA2155109A1 (en) * | 1993-02-01 | 1994-08-18 | Daniel Abramowicz | Use of a pharmaceutical composition comprising an effective amount of interleukin-10, an analog and/or an agonist of interleukin-10 |
US5328989A (en) * | 1993-03-05 | 1994-07-12 | Schering-Plough | Purification of human interleukin-10 from a cell culture medium |
US5449688A (en) * | 1993-03-30 | 1995-09-12 | The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services | Method of treating chronic inflammatory diseases |
CA2168110A1 (en) * | 1993-07-26 | 1995-02-02 | Chuan-Chu Chou | Agonists and antagonists of human interleukin-10 |
US5650060A (en) * | 1994-01-28 | 1997-07-22 | Minnesota Mining And Manufacturing Company | Ionically conductive agent, system for cathodic protection of galvanically active metals, and method and apparatus for using same |
US6159937A (en) * | 1994-07-05 | 2000-12-12 | Steeno Research Group A/S | Immunomodulators |
US5770190A (en) * | 1995-07-14 | 1998-06-23 | Schering Corporation | Method of treatment of acute leukemia with inteleukin-10 |
CN101307106B (zh) * | 1995-12-13 | 2013-06-12 | 儿童医学中心公司 | 内皮细胞增殖抑制剂及其应用方法 |
WO1997026278A1 (en) * | 1996-01-18 | 1997-07-24 | Steeno Research Group A/S | Synthetic il-10 analogues |
IL126623A0 (en) * | 1996-04-17 | 1999-08-17 | Prendergast Patrick T | Pharmaceutical compositions and kits for dhea combined therapy |
WO1998009644A2 (en) * | 1996-09-06 | 1998-03-12 | Schering Corporation | Method for lowering cholesterol levels |
WO1998047516A1 (en) * | 1997-04-17 | 1998-10-29 | Prendergast Patrick T | Combination therapy utilising 17-ketosteroids and interleukin inhibitors, or interleukin-10 potionally with interleukin inhibitors |
US6465176B1 (en) * | 1998-10-02 | 2002-10-15 | Message Pharmaceuticals, Inc. | Method for identifying compounds RNA/RNA binding protein interactions |
AU5047600A (en) * | 1999-05-27 | 2000-12-18 | Schering Corporation | Mammalian interleukin-10 homologs: il-d110 and il-d210 |
CN1981868A (zh) | 2000-03-31 | 2007-06-20 | 拜奥根Idec公司 | 抗细胞因子抗体或拮抗剂与抗-cd20在b细胞淋巴瘤治疗中的联合应用 |
EP2582386A2 (en) | 2010-06-16 | 2013-04-24 | Allergan, Inc. | Il-10 and methods of treating ocular and other diseases |
WO2017160599A1 (en) | 2016-03-14 | 2017-09-21 | The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services | Use of cd300b antagonists to treat sepsis and septic shock |
AU2017370942A1 (en) | 2016-12-07 | 2019-06-13 | Progenity Inc. | Gastrointestinal tract detection methods, devices and systems |
CA3054156A1 (en) | 2017-03-30 | 2018-10-04 | Progenity Inc. | Treatment of a disease of the gastrointestinal tract with il-10 or an il-10 agonist |
KR20210095165A (ko) | 2018-11-19 | 2021-07-30 | 프로제너티, 인크. | 바이오의약품으로 질환을 치료하기 위한 방법 및 디바이스 |
EP4309722A2 (en) | 2019-12-13 | 2024-01-24 | Biora Therapeutics, Inc. | Ingestible device for delivery of therapeutic agent to the gastrointestinal tract |
GB202003428D0 (en) * | 2020-03-10 | 2020-04-22 | Univ Dundee | IL-10 mutiens |
Family Cites Families (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
IL78197A (en) * | 1985-03-22 | 1991-07-18 | Genentech Inc | Nucleic acid encoding tgf-beta and its uses |
IE62650B1 (en) * | 1989-08-04 | 1995-02-22 | David & Sons Ltd | Dispensing apparatus |
MX9203409A (es) * | 1989-12-20 | 1992-07-01 | Schering Corp | Proteinas bcrfi como inhibidores de la gama interferona. |
-
1990
- 1990-06-26 IL IL9487890A patent/IL94878A/xx active IP Right Grant
- 1990-06-27 CN CNB011124067A patent/CN1318589C/zh not_active Expired - Lifetime
- 1990-06-27 PT PT94514A patent/PT94514B/pt not_active IP Right Cessation
- 1990-06-27 CN CN90106678A patent/CN1051393A/zh active Pending
- 1990-06-28 WO PCT/US1990/003554 patent/WO1991000349A1/en active IP Right Grant
- 1990-06-28 CA CA002062763A patent/CA2062763C/en not_active Expired - Lifetime
- 1990-06-28 KR KR1019910700236A patent/KR0183035B1/ko active IP Right Grant
- 1990-06-28 JP JP2510725A patent/JP2813063B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 1990-06-28 SG SG1996001964A patent/SG52282A1/en unknown
- 1990-06-28 DK DK90911213T patent/DK0567450T3/da active
- 1990-06-28 HU HU906705A patent/HU216310B/hu unknown
- 1990-06-28 TW TW079105311A patent/TW218383B/zh active
- 1990-06-28 AT AT90911213T patent/ATE180833T1/de not_active IP Right Cessation
- 1990-06-28 NZ NZ234291A patent/NZ234291A/en unknown
- 1990-06-28 EP EP90911213A patent/EP0567450B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1990-06-28 AU AU60770/90A patent/AU635058B2/en not_active Expired
- 1990-06-28 ES ES90911213T patent/ES2132068T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1990-06-28 EP EP90307091A patent/EP0405980A1/en active Pending
- 1990-06-28 DE DE69033143T patent/DE69033143T2/de not_active Expired - Lifetime
-
1991
- 1991-12-27 NO NO915115A patent/NO301718B1/no not_active IP Right Cessation
- 1991-12-27 FI FI916126A patent/FI107926B/fi active
- 1991-12-30 CS CS914145A patent/CS414591A3/cs unknown
-
1998
- 1998-07-29 HK HK98109520A patent/HK1008834A1/xx not_active IP Right Cessation
-
1999
- 1999-06-03 GR GR990401398T patent/GR3030404T3/el unknown
-
2001
- 2001-03-29 CN CNB011124059A patent/CN1198642C/zh not_active Expired - Lifetime
-
2002
- 2002-03-13 HK HK02101932.7A patent/HK1040493B/zh not_active IP Right Cessation
- 2002-03-13 HK HK02101934.5A patent/HK1040531B/zh not_active IP Right Cessation
Also Published As
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
HU216310B (hu) | Eljárás citokinszintézis inhibitorfaktor (CSIF), CSIF-aktivitású polipeptidek és CSIF-antagonisták, valamint ezeket tartalmazó gyógyszerkészítmények előállítására | |
US5231012A (en) | Nucleic acids encoding cytokine synthesis inhibitory factor (interleukin-10) | |
US6217857B1 (en) | Cytokine synthesis inhibitory factor (IL-10) and pharmaceutical compositions thereof | |
JP4373495B2 (ja) | Il−17受容体 | |
JP2557361B2 (ja) | 哺乳動物インタ−ロイキン−4 | |
KR100358271B1 (ko) | 보호성면역반응및il-12생산의자극과증강을위한화합물및방법 | |
US5596072A (en) | Method of refolding human IL-13 | |
JPH07508179A (ja) | ヒトインターロイキン−13 | |
AU741419B2 (en) | Ligand for herpes simplex virus entry mediator and methods of use | |
EP0491878B1 (en) | Compositions for the inhibition of protein hormone formation and uses thereof | |
EP0851030B1 (en) | PROTEIN SPECIFIC TO HUMAN Th2, GENE (B19) ENCODING THE SAME, AND TRANSFORMANT, RECOMBINANT VECTOR AND MONOCLONAL ANTIBODY RELATING THERETO | |
US6312680B1 (en) | Methods of treatment using cytokine synthesis inhibitory factor | |
JP3231262B2 (ja) | ヒトTh1特異的タンパク質及びこれをコードする遺伝子、並びにこれに関連する形質転換体、組換えベクター及び抗体 | |
IE902346A1 (en) | Cytokine synthesis inhibitory factor, antagonists thereof,¹and methods of using same | |
JPH1070987A (ja) | ヒトTh2特異的タンパク質及びこれをコードする遺伝子(E26)、並びにこれに関連する形質転換体、組換えベクター及びモノクローナル抗体 | |
JPH05501116A (ja) | エプスタイン・バーウイルス感染治療用のbcrf1拮抗薬 |