DE69201128T2 - Behandlung von neoplastischen krankenheiten mit interleukin-10. - Google Patents
Behandlung von neoplastischen krankenheiten mit interleukin-10.Info
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Description
- Die Erfindung bezieht sich allgemein auf Zusammensetzungen zum Behandeln von Neoplasmen oder Krebs beim Menschen und genauer auf die Verwendung von Interleukin-10 (IL-10) zur Herstellung von Zusammensetzungen zum Behandeln von Krebs.
- Immunologische Wege der Krebstherapie beruhen auf der Idee, daß Krebszellen die Verteidigung des Körpers gegen abweichende oder fremde Zellen und Moleküle auf irgendeine Weise umgangen haben und daß diese Verteidigung therapeutisch stimuliert werden könnte, um verlorenen Boden zurückzugewinnen; z.B. S. 623-648 in Klein, Immunology (Wiley-Interscience, New York, 1982). Die kürzlichen Beobachtungen, daß verschiedene Immuneffektoren das Tumorwachstum direkt oder indirekt hemmen können, hat zu einem neuerlichen Interesse an diesem Weg einer Krebstherapie geführt: z.B. Herberman, Concepts Immunopathol., Bd. 1, S. 96-132 (1985) (natürliche Killerzellen setzen einem Tumorzellenwachstum Widerstand entgegen); Rosenberg et al., Ann. Rev. Immunol., Bd. 4, S. 681-709 (1988) (klinische Verwendung von IL-2-aktivierten Killerzellen zum Behandeln von Krebs); Ralph et al., J. Exp. Med., Bd. 167, S. 712-717 (1988)(tumorizide Aktivität durch Makrophagen, die durch Lymphokine stimuliert wurden), Tepper et al., Cell, Bd. 57, S. 503-512 (1989) (IL-4 besitzt Antitumoraktivität), M. Cohen, "Lymphokines and Tumor Immunity", S. 237- 253 in S. Cohen, Hrsg., "Lymphokines and the Immune Response" (CRC Press, Boca Raton, 1990) und dergleichen.
- Die Erfindung bezieht sich auf die Verwendung von Interleukin-10 (IL-10) zum Verringern und/oder Verhindern des Wachstums von Tumoren. Die Erfindung schließt auch pharmazeutische Zusammensetzungen, die Interleukin-10 umfassen, ein. Vorzugsweise wird das Interleukin-10 der Erfindung aus der Gruppe ausgewählt, die aus den reifen Polypeptiden mit den offenen Leserahmen besteht, welche durch die hierin in SEQ. ID. Nr. 1 und 2 angegebenen Aminosäuresequenzen definiert werden (alle SEQ. IDs werden unmittelbar vor den Ansprüchen angegeben), wobei die Standardabkürzung mit drei Buchstaben zum Anzeigen von L-Aminosäuren verwendet wird und vom N-Terminus ausgegangen wird. Diese beiden Formen von IL-10 werden manchmal als Human-IL-10 (hIL-10 oder Human-Cytokinsynthese-Hemmfaktor) beziehungsweise Virus-IL-l0 (vIL-10 oder BCRF1) bezeichnet: z.B. Moore et al., Science, Bd. 248, S. 1230-1234 (1990); Vieira et al., Science, Bd. 88, S. 1172-1176 (1991); Fiorentino et al., J. Exp. Med., Bd. 170, S. 2081-2095 (1989); Hsu et al., Science, Bd. 250, S. 830-832 (1990). Bevorzugter wird das bei dem Verfahren der Erfindung verwendete reife IL-10 aus der Gruppe ausgewählt, die aus den reifen Polypeptiden mit den offenen Leserahmen besteht, welche durch die hierin in SEQ. ID Nr. 3 und 4 angegebenen Aminosäuresequenzen definiert werden.
- Figur 1 ist eine diagrammartige Darstellung des Säuger-Expressionsvektors pcD(SRα).
- Figur 2 ist eine diagrammartige Darstellung des Bakterien-Expressionsvektors TRP-C11.
- Figur 3 zeigt das Plasmid pGSRG, das den offenen Leserahmen (ORF) von Maus-IL-10, Virus-IL-10 oder Human-IL-10 trägt, welche in seine XhoI-Restriktionsstelle inseriert sind; sie zeigt auch die Sequenz der RBS-ATG-Polylinker-Regionen des endgültigen Aufbaus (TAC-RBS genannt).
- Die Erfindung ist auf die Verwendung von IL-10 bei der Herstellung eines Arzneimittels zum Verhindern und/oder Verringern des Krebswachstums gerichtet. IL-10 zur Verwendung bei der Erfindung wird aus der Gruppe reifer Polypeptide ausgewählt, welche durch die offenen Leserahmen kodiert werden, die durch die cDNA-Inserts von pH5C, pH15C und pBCRF1(SRα) definiert werden, die bei der American Type Culture Collection (ATCC), Rockville, Maryland, unter den Zugangsnummern 68191, 68192 beziehungsweise 68193 hinterlegt sind.
- Ein breiter Bereich einzelliger und mehrzelliger Expressionssysteme (d.h. Wirt-Expressionsvektor-Kombinationen) kann zum Herstellen der Polypeptide der Erfindung verwendet werden. Mögliche Typen von Wirtszellen schließen Bakterien, Hefe, Insekten, Säuger und dergleichen ein, sind aber nicht darauf beschränkt. Viele Übersichten stehen zur Verfügung, welche eine Anleitung zum Durchführen einer Wahl und/oder Modifikationen spezieller Expresßionssysteme liefern; um z.B. einige zu nennen geben de Boer und Shepard, "Strategies for Optimizing Foreign Gene Expression in Escherichia coli", S. 205-247, in Kroon, Hrsg., Genes: Structure and Expression (John Wiley & Sons, New York, 1983), einen Überblick über mehrere E. coli-Expressions- systeme; Kucherlapati et al., Critical Reviews in Biochemistry, Bd. 16, Ausgabe 4, S. 349-379 (1984), und Banerji et al., Genetic Engineering, Bd. 5, S. 19-31 (1983) geben einen Überblick über Verfahren zum Transfizieren und Transformieren von Säugerzellen; Reznikoff und Gold, Hrsg., Maximizing Gene Expression (Butterworths, Boston, 1986) geben einen Überblick über ausgewählte Themen der Genexpression in E. coli, Hefe und Säugerzellen, und Thilly, Mammalian Cell Technology (Butterworths, Boston, 1986) gibt einen Überblick über Säugerexpressionssysteme. Gleichfalls stehen viele Übersichten zur Verfügung, die Techniken und Bedingungen zum Linken und/oder Manipulieren spezieller cDNA und Expressionskontrollsequenzen zum Herstellen und/oder Modifizieren von Expressionsvektoren beschreiben, die zur Verwendung bei der vorliegenden Erfindung geeignet sind, z.B. Sambrook et al. (vorstehend zitiert).
- Ein E. coli-Expressionssystem wird durch Riggs im US-Patent 4 431 739 offenbart, welches durch Verweis inbegriffen ist. Ein besonders nützlicher prokaryontischer Promotor zur hohen Expression in E. coli ist der durch de Boer im US-Patent 4 551 433 offenbarte tac-Promotor. Sekretionsexpressionsvektoren stehen ferner für E. coli-Wirte zur Verfügung. Besonders nützlich sind die durch Ghrayeb et al., EMBO J., Bd. 3, S. 2437-2442 (1984) offenbarten pIN-III-ompA-Vektoren, in denen die zu transkribierende cDNA mit dem Teil des E. coli-OmpA-Gens fusioniert ist, der das Signalpeptid des ompA-Proteins kodiert, welches wiederum bewirkt, daß das reife Protein in den periplasmatischen Raum des Bakteriums ausgeschieden wird. Die US-Patente 4 336 336 und 4 338 397 offenbaren ebenfalls Sekretionsvektoren für Prokaryonten.
- Zahlreiche Bakterienstämme sind geeignete Wirte für prokaryontische Expressionsvektoren, welche E. coli-Stämme wie etwa W3110 (ATCC Nr. 27325), JA221, C600, ED767, DH1, LE392, HB1O1, X1776 (ATCC Nr. 31244), X2282, RR1 (ATCC Nr. 31343) MRCI; Bacillus subtilis-Stämme und andere Enterobacteriaceae wie etwa Salmonella typhimurium oder Serratia marcescens und verschiedene Pseudomonas-Spezies einschließen. Allgemeine Verfahren zum Ableiten von Bakterienstämmen wie etwa E. coli K12X1776, die bei der Expression eukaryontischer Proteine nützlich sind, werden von Curtis III im US-Patent 4 190 495 offenbart.
- Außer prokaryontischen und eukaryontischen Mikroorganismen können Expressionssysteme, die aus mehrzelligen Organismen stammende Zellen umfassen, ebenfalls zum Herstellen von Proteinen der Erfindung verwendet werden. Von besonderem Interesse sind Säugerexpressionssysteme, weil der Weiterverarbeitungsmechanismus nach der Translation wahrscheinlicher biologisch aktive Säugerproteine erzeugt. Mehrere DNA-Tumorviren sind als Vektoren für Säugerwirte verwendet worden. Besonders wichtig sind die zahlreichen Vektoren, die SV40-Replikations-, Transkriptions- und/oder Translationskontrollsequenzen umfassen, welche an Kontrollsequenzen der Bakterienvermehrung gekoppelt sind; z.B. die durch Okayama und Berg entwickelten, in Mol. Cell. Biol., Bd. 2, S. 161-170 (1982) und Mol. Cell. Biol., Bd. 3, S. 280-289 (1983) offenbarten und durch Takebe et al., Mol. Cell. Biol., Bd. 8, S. 466-472 (1988) verbesserten pcD-Vektoren. Andere Säugerexpressionsvektoren auf SV-40-Grundlage schließen die durch Kaufman und Sharp in Mol. Cell. Biol., Bd 2, S. 1304- 1319 (1982) und Clark et al. im US-Patent 4 675 285 offenbarten ein, welche beide durch Verweis hierin inbegriffen sind. Affenzellen sind üblicherweise die bevorzugten Wirte für die vorstehenden Vektoren. Derartige, die SV40-ori-Sequenzen und ein intaktes A-Gen enthaltende Vektoren können sich in Affenzellen autonom vermehren (unter Ergeben höherer Kopienzahlen und/oder stabilerer Kopienzahlen als sich nicht-autonom vermehrende Plasmide). Weiterhin können sich die SV40-ori-Sequenzen enthaltenden Vektoren ohne ein intaktes A-Gen in COS7-Affenzellen, die von Gluzman, Cell, Bd. 23, S. 175-182 (1981) beschrieben und von der ATCC erhältlich sind (Zugangsnummer CRL 1651), autonom (aber nicht stabil) zu hohen Kopienzahlen vermehren. Die vorstehenden Vektoren auf SV40-Grundlage sind auch zum Transformieren anderer Säugerzellen wie etwa Maus-L-Zellen durch Einbau in die Wirtszellen-DNA befähigt.
- Mehrzellige Organismen können ebenfalls als Wirte für die Herstellung der Polypeptide der Erfindung dienen, z.B. Insektenlarven, Maeda et al., Nature, Bd. 315, S. 592-594 (1985), und Ann. Rev. Entomol., S. 351-372 (1989), und transgene Tiere, Jaenisch, Science, Bd. 240, S. 1468-1474 (1988).
- IL-10 zeigen mehrere biologische Aktivitäten, welche die Grundlage von Tests und Einheiten bilden. Insbesondere besitzen IL-10 die Eigenschaft des Hemmens der Synthese wenigstens eines Cytokins in der aus IFN-γ, Lymphotoxin, IL-2, IL-3 und GM-CSF bestehenden Gruppe in einer γ-Helferzellenpopulation, die zum Synthetisieren eines oder mehrerer dieser Cytokine durch Aussetzen gegenüber syngenen, Antigen-aufweisenden Zellen (APCs) und Antigen veranlaßt wurden. Bei dieser Aktivität werden die APCs so behandelt, daß sie nicht zur Vermehrung befähigt sind, ihr Antigen-verarbeitender Mechanismus jedoch funktionsfähig bleibt. Dies wird bequemerweise durch Bestrahlen der APCs, z.B. mit etwa 1500-3000 R (Gamma- oder Röntgenstrahlung) vor dem Mischen mit den T-Zellen bewerkstelligt.
- Wahlweise kann die Cytokinhemmung in primären oder vorzugsweise sekundären Mischlymphozytenreaktionen (MLR) bestimmt werden, in welchem Fall syngene APCs nicht verwendet zu werden brauchen. MLR sind in der Technik gut bekannt, z.B. Bradley, S. 162-166, in Mishell et al., Hrsg., Selected Methods in Cellular Immunology (Freeman, San Francisco, 1980), und Battisto et al., Meth. in Enzymol., Bd. 150, S. 83-91 (1987). Kurz gesagt, werden zwei Populationen allogener Lymphzellen gemischt, wobei eine der Populationen vor dem Mischen zum Verhindern des Wachstums z.B. durch Bestrahlung behandelt worden ist. Vorzugsweise werden die Zellpopulationen in einer Konzentration von etwa 2 x 10&sup6; Zellen/ml in ergänztem Medium, z.B. RPMI 1640 mit 10% fetalem Kälberserum, hergestellt. Sowohl für die Kontrollen als auch Testkulturen werden für die Bestimmung 0,5 ml jeder Population gemischt. Für eine sekundäre MLR werden die nach 7 Tagen bei der primären MLR zurückbleibenden Zellen durch frisch hergestellte, bestrahlte Stimulatorzellen erneut stimuliert. Die Probe, die verdächtig wird, IL-10 zu enthalten, kann den Testkulturen zum Zeitpunkt des Mischens zugesetzt werden und sowohl Kontrollen als auch Testkulturen können 1 bis 3 Tage nach dem Mischen auf Cytokinerzeugung getestet werden.
- Zum Erhalten von T-Zellpopulationen und/oder APC-Populationen für IL-10-Bestimmungen werden in der Technik wohlbekannte Techniken eingesetzt, die bei DiSabato et al., Hrsg., Meth. in Enzymol., Bd. 108 (1984), vollständig beschrieben werden. APCs für den bevorzugten IL-10-Test sind periphere Blutmonozyten. Diese werden mittels Standardtechniken erhalten, wie z.B. von Boyum, Meth. in Enzymol., Bd. 108, S. 88-102 (1984); Mage, Meth. in Enzymol., Bd. 108, S. 118-132 (1984); Litvin et al., Meth. in Enzymol., Bd. 108, S. 298-302 (1984); Stevenson, Meth. in Enzymol., Bd. 108, S. 242-249 (1989) und Romain et al., Meth. in Enzymol., Bd. 108, S. 148-153 (1984) beschrieben, wobei die Zitate durch Verweis inbegriffen sind. Vorzugsweise werden Helfer-T-Zellen in den IL-10-Tests verwendet, welche durch zuerst Abtrennen von Lymphozyten aus dem peripheren Blut, anschließend Selektieren, z.B. durch Panning oder Durchflußzytometrie, von Helferzellen mittels eines im Handel erhältlichen Anti-CD4-Antikörpers, z.B. im US-patent 4 381 295 beschriebener und von Ortho Pharmaceutical Corp. erhältlicher OKT4, erhalten wurden. Die erforderlichen Techniken werden von Boyum in Scand. J. Clin. Lab. Invest., Bd. 21 (Erg. 97), S. 77 (1986), und in Meth. in Enzymol., Bd. 108 (vorstehend zitiert), und von Bram et al., Meth. in Enzymol., Bd. 121, S. 737-748 (1986), vollständig offenbart. Im allgemeinen werden PBL aus frischem Blut durch Ficoll-Hypaque-Dichtegradienten-Zentrifugation erhalten.
- Eine Vielfalt von Antigenen kann in der Bestimmung eingesetzt werden, z.B. Hämocyanin der "Schlüsselloch-Napfschnecke", Geflügel-γ-Globulin oder dergleichen. Vorzugsweise werden anstelle von Antigen Helfer-T-Zellen mit monoklonalem Anti-CD3-Antikörper, z.B. im US-Patent 4 361 549 offenbartes OKT3, bei der Bestimmung stimuliert.
- Cytokinkonzentrationen in Kontroll- und Testproben werden durch biologische und/oder immunchemische Standardtests gemessen. Der Aufbau der immunchemischen Tests auf spezifische Cytokine ist, wenn das gereinigte Cytokin zur Verfügung steht, in der Technik wohlbekannt, z.B. sind Campbell, Monoclonal Antibody Technology (Elsevier, Amsterdam, 1984); Tijssen, Practise and Theory of Enzyme Immunoassays (Elsevier, Amsterdam, 1985), und das US- Patent 4 486 530 für die ausgedehnte Literatur über den Gegenstand beispielhaft. ELISA-Kits für Human-IL-2, Human-IL-3 und Human-GM-SCF sind im Handel von Genzyme Corp. (Boston, MA) erhältlich und ein ELISA-Kit für Human-IFN-γ ist von Endogen, Inc. (Boston, MA) im Handel erhältlich. Für Human-Lymphatoxin spezifische polyklonale Antikörper sind von Genzyme Corp. erhältlich, welche in einem Radioimmuntest auf Human-Lymphotoxin verwendet werden können, z.B. Chard, An Introduction to Radioimmunoassay and Related Techniques (Elsevier, Amsterdam, 1982).
- Biologische Bestimmungen der vorstehend angeführten Cytokine können ebenfalls zum Bestimmen der IL-10-Aktivität verwendet werden. Ein biologischer Test auf Human-Lymphotoxin wird von Aggarwal, Meth. in Enzymol., Bd. 116, S. 441-447 (1985) und Matthews et al., S. 221-225, in Clemens et al., Hrsg., Lymphokines and Interferons: A Practical Approach (IRL Press, Washington, D.C., 1987) offenbart. Human-IL-2 und GM-CSF kann mit den Faktor-abhängigen, von der ATCC unter den Zugangsnummern TIB 214 beziehungsweise CCL 246 erhältlichen Zellinien bestimmt werden. Human-IL-3 kann durch seine Fähigkeit, die Bildung eines breiten Bereichs hämatopoetischer Zellkolonien in Weichagarkulturen wie z.B. von Metcalf, Th- Hematopoietic Colony Stimulating Factors (Elsevier, Amsterdam, 1984) beschrieben, zu stimulieren, bestimmt werden. INF-γ kann mit Anti-Virus-Tests, z.B. Meager, S. 129-147, in Clemens et al., Hrsg. (vorstehend zitiert) mengenmäßig bestimmt werden.
- Die Cytokin-Produktion kann auch durch mRNA-Analyse bestimmt werden. Cytokin-mRNA kann, wie von White et al., J. Biol. Chem., Bd. 257, S. 8569-8572 (1982), und Gillespie et al., US-Patent 4 483 920, beschrieben, durch zytoplasmatische Punkthybridisierung gemessen werden. Andere Wege schließen Punktblotting mittels gereinigter RNA, z.B: Kapitel 6 in Hames et al., Hrsg., Nucleic Acid Hybridization A Practical Approach (IRL Press, Washington, D.C., 1985), ein.
- In einigen Fällen müssen auf IL-10-Aktivität zu testende Proben vorbehandelt werden, um vorbestimmte Cytokine zu entfernen, die den Test stören könnten. Zum Beispiel erhöht IL-2 die Produktion von IFN-γ in einigen Zellen. Somit kann IL-2 in Abhängigkeit von den im Test verwendeten Helfer-T-Zellen von der zu testenden Probe entfernt werden müssen. Ein derartiges Entfernen wird bequemerweise durch Führen der Probe durch eine Anti-Cytokin- Affinitätsstandardsäule bewerkstelligt.
- Zur Erleichterung werden Einheiten der IL-10-Aktivität als die Fähigkeit von IL-10 definiert, die IL-4-induzierte Vermehrung von MC/9-Zellen zu erhöhen, die im US-Patent 4 559 310 beschrieben und von der ATCC unter der Zugangsnummer CRL 8306 erhältlich sind. 1 Einheit/ml ist als die IL-10-Konzentration definiert, welche 50% der maximalen Stimulation der MC/9-Vermehrung über dem Wert von IL-4 in dem folgenden Test ergibt. Es werden zweifache oder dreifache Verdünnungen von IL-4 und IL-10 in 50 ul Medium je Näpfchen in einer Standard-Mikrotiterplatte hergestellt; das Medium besteht aus RPMI 1640, 10% fetalem Kälberserum, 50 uM 2-Mercaptoethanol, 2 mM Glutamin, Penicillin (100 E/L) und Streptomycin (100 ug/ml). Man setzt 25 ul/Näpfchen in Medium verdünntes IL-4 mit 1600 E/ml (400 E/ml zum Schluß) zu und inkubiert über Nacht, z.B. 20-24 Stunden. Man setzt ³H-Thymidin (z.B. 50 uCi/ml in Medium) zu 0,5-1,0 uCi/Näpfchen zu und inkubiert die Zellen erneut über Nacht; danach werden die Zellen geerntet und die eingebaute Radioaktivität wird gemessen.
- Wenn Polypeptide der vorliegenden Erfindung in löslicher Form exprimiert werden, zum Beispiel als sekretiertes Produkt transformierter Hefe- oder Säugerzellen, können sie gemäß Standardverfahren der Technik, einschließlich Schritten der Ammoniumsulfatfällung, Ionenaustauschchromatographie, Gelfiltration, Elektrophorese, Affinitätschromatographie und/oder dergleichen; z.B: liefern "Enzyme Purification and Related Techniques", Methods in Enzymology, 22:233-577 (1977), und Scopes, R. Protein Purification: Principles and Practise (Springer-Verlag, New York, 1982) eine Anleitung bei derartigen Reinigungen. Wenn Polypeptide der Erfindung in unlöslicher Form, zum Beispiel als Aggregate, Einschlußkörper oder dergleichen, exprimiert werden, können sie gleichermaßen durch Standardverfahren in der Technik, einschließlich des Abtrennens der Einschlußkörper aus aufgebrochenen Wirtszellen durch Zentrifugieren, Löslichmachen der Einschlußkörper mit chaotropen Mitteln und Reduktionsmitteln, Verdünnen des löslich gemachten Gemischs und Erniedrigen der Konzentration des chaotropen Mittels und Reduktionsmittels gereinigt werden, so daß das Polypeptid eine biologisch aktive Konformation einnimmt. Die letzteren Verfahren werden in den folgenden Zitaten offenbart: Winkler et al., Biochemistry, 25:4041-4045 (1986); Winkler et al., Biotechnology, 3:992-998 (1985); Koths et al., US-Patent 4 569 790 und die europäischen Patentanmeldungen 86306917.5 und 86306353.3.
- Hierin verwendet bedeutet "wirksame Menge" eine zum Verringern oder Verhindern des Tumorwachstums ausreichende Menge. Die wirksame Menge für einen besonderen Patienten kann in Abhängigkeit von solchen Faktoren wie dem Zustand und Typ der zu behandelnden neoplastischen Erkrankung, der Gesamtgesundheit des Patienten, dem Verabreichungsverfahren, der Schwere der Nebenwirkungen und dergleichen schwanken. Im allgemeinen wird IL-10 als pharmazeutische Zusammensetzung verabreicht, die eine wirksame Menge IL-10 und einen pharmazeutischen Träger umfaßt. Ein pharmazeutischer Träger kann jede verträgliche, nicht-toxische Substanz sein, die zum Zuführen der Zusammensetzungen der Erfindung an einen Patienten geeignet sind. Im allgemeinen sind zur parenteralen Verabreichung derartiger Wirkstoffe nützliche Zusammensetzungen gut bekannt; z.B. Remington's Pharmaceutical Science, 15. Ausg. (Mack Publishing Company, Easton, PA 1980). Alternativ können Zusammensetzungen der Erfindung durch ein implantierbares oder injizierbares Wirkstoff-Zufuhrsystem in den Körper eines Patienten eingeführt werden: z.B. Urquhart et al., Ann. Rev. Pharmacol. Toxicol., Bd. 24, S. 199-236 (1984); Lewis, Hrsg., Controlled Release of Pesticides and Pharmaceuticals (Plenum Press, New York, 1981); US-Patent 3 773 919; US-Patent 3 270 960.
- Wenn IL-10 parenteral verabreicht wird, wird es in einer injizierbaren Einheitsdosisform (Lösung, Suspension, Emulsion) in Verbindung mit einem pharmazeutischen Träger formuliert. Beispiele derartiger Träger sind normale Kochsalzlösung, Ringersche Lösung, Dextroselösung und Hanksche Lösung. Nicht-wäßrige Träger, wie etwa fette Öle und Ölsäureethylester, können ebenfalls verwendet werden. Ein bevorzugter Träger ist 5% Dextrose/Kochsalzlösung. Der Träger kann untergeordnete Menge Additive enthalten, wie etwa Substanzen, welche die Isotonie und chemische Stabilität verstärken, z.B. Puffer und Konservierungsmittel. Das IL-10 wird vorzugsweise in gereinigter Form, im wesentlichen frei von Aggregaten und anderen Proteinen in einer Konzentration im Bereich von etwa 5 bis 20 ug/ml formuliert. Vorzugsweise wird IL-10 durch ununterbrochene Infusion verabreicht, so daß eine Menge im Bereich von etwa 50-800 ug je Tag (d.h. etwa 1-16 ug/kg/Tag) zugeführt wird. Die tägliche Infusionsrate kann auf der Grundlage des Überwachens von Nebenwirkungen und Blutzellenzählungen verändert werden.
- Die folgenden Beispiele dienen zum Veranschaulichen der vorliegenden Erfindung. Die ausgewählten Vektoren und Wirte, die Konzentration von Reagenzien, die Temperaturen und die Werte anderer Variablen sind nur zum Veranschaulichen der vorliegenden Erfindung und sollen nicht als deren Einschränkung angesehen werden.
- Ein synthetisches Human-CSIF-Gen wird aus einer Mehrzahl chemisch synthetisierter, doppelsträngiger DNA-Fragmente unter Bilden eines als TAC-RBS-hCSIF bezeichneten Expressionsvektors zusammengesetzt. Das Klonieren und die Expression werden in einem Standard-Bakteriensystem, zum Beispiel dem von Viera und Messing in Gene, Bd. 19, S. 259-268 (1982), beschriebenen E. coli K12-Stamm JM101, JM103 oder dergleichen, durchgeführt. Verdauungen mit Restriktionsendonukleasen und Reaktionen mit Ligasen werden unter Anwenden von Standardvorschriften ausgeführt, z.B. Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory, New York, 1982).
- Das Alkaliverfahren (Maniatis et al., vorstehend zitiert) wird zu Plasmidherstellungen in kleinem Maßstab verwendet. Für Herstellungen in großem Maßstab wird eine Abänderung des Alkaliverfahrens verwendet, bei dem ein gleiches Volumen Isopropanol zum Fällen von Nukleinsäuren aus dem geklärten Lysat verwendet wird. Die Fällung mit kaltem 2,5M Ammoniumacetat wird zum Entfernen von RNA vor der Äquilibriumsdichtezentrifugation mit Cesiumchlorid und dem Nachweis mit Ethidiumbromid verwendet.
- Für Filterhybridisierungen werden Kreise aus Whatman 540-Filter zum Abheben von Kolonien verwendet, die anschließend durch Behandlung (jeweils 2 Minuten lang) mit 0,5M NaOH, 1,5M NaCl und anschließend mit 1M Tris-HCl pH 8,0, 1,5 M NaCl und anschließend durch Erhitzen auf 80ºC (30 min) lysiert und fixiert werden. Hybridisierungen finden 6 h bei 42ºC in 6xSSPE, 20% Formamid, 0,1% Natriumdodecylsulfat (SDS), 100 mg/ml E. coli tRNA, 100 mg/ml Coomassie Brilliant Blue G-250 (Bio-Rad) mittels ³²P-markierter (kinasierter) synthetischer DNA statt. (20xSSPE wird durch Lösen von 174 g NaCl, 27,6 g NaH&sub2;PO&sub4; 9H&sub2;O und 7,4 g EDTA in 800 ml H&sub2;O hergestellt. Der pH wird mit NaOH auf 7,4 eingestellt, das Volumen wird auf 1 Liter eingestellt und die Probe wird durch Autoklavieren sterilisiert.) Die Filter werden zwei Mal (15 min, Raumtemperatur) mit 1xSSPE, 0,1% SDS gewaschen. Nach der Autoradiographie (Fuji RX Film) werden positive Kolonien durch Abgleichen der erneut gewachsenen Kolonien mit den blau angefärbten Kolonien auf den Filtern ausfindig gemacht. Die DNA wird durch das Didesoxyverfahren, Sanger et al., Proc. Natl. Acad. Sci., Bd. 74, S. 5463 (1977) sequenziert. Matrizen für die Didesoxyreaktionen sind entweder einzelsträngige DNA relevanter Regionen, die erneut in M13mp-Vektoren kloniert wurden (z.B. Messing et al., Nucleic Acids Res., Bd. 9, S. 309 (1981)), oder doppelsträngige DNA, die durch das Minialkaliverfahren hergestellt und mit 0,2M NaOH (5 min, Raumtemperatur) denaturiert und aus 0,2M NaOH, 1,43M Ammoniumacetat durch Zusatz von 2 Volumina Ethanol gefällt wurde. DNA kann durch Phosphoramiditchemie mittels Applied Biosystems 380A-Synthetisierern synthetisiert werden; die Synthese, das Entschützen, die Spaltung und Reinigung (7M Harnstoff PAGE, Elution, DEAE-Cellulose-Chromatographie) werden wie im Handbuch des 380A Synthetisierers beschrieben ausgeführt.
- Komplementäre Stränge zu klonierender synthetischer DNAs (jeweils 400 ng) werden gemischt und mit Polynucleotid-Kinase in einem Reaktionsvolumen von 50 ml phosphoryliert. Diese DNA wird in einem Volumen von 50 ml bei Raumtemperatur 4 bis 12 Stunden mit 1 mg mit einem geeigneten Restriktionsenzym verdauter Vektor-DNA ligiert. Bedingungen für die Phosphorylierung, Verdauung mit Restriktionsenzymen, Polymerase-Reaktionen und die Ligation sind beschrieben-worden (Maniatis et al., vorstehend zitiert).
- Kolonien werden (gewünschtenfalls) durch Plattieren auf L-Agar, der mit Ampicillin, Isopropyl-1-thio-beta-D-galactosid (IPTG) (0,4 mM) und 5-Brom-4-chlor-3-indolyl-beta-D-galactopyranosid (x-gal) (40 mg/ml) ergänzt ist, auf lacZ+-Kolonien gezählt.
- Der TAC-RBS-Vektor wird durch Auffüllen der einzigen BamHIStelle des tacP-tragenden Plasmids pDR540 (Pharmacia) mit DNAPolymerase aufgebaut. Dieser wird anschließend mit unphosphorylierten synthetischen Oligonucleotiden (Pharmacia) ligiert, die ein doppelsträngiges Fragment bilden, das eine hierin in SEQ. ID. Nr. 5 angegebene und RBS bezeichnete Konsensusribosom-Bindungsstelle kodiert. Nach der Ligation wird das Gemisch phosphoryliert und erneut mit dem SstI-Linker ATGAGCTCAT ligiert. Dieser Komplex wurde anschließend mit SstI und EcoRI gespalten und das Fragment mit 173 Basenpaaren (bp) wurde durch Polyacrylamid-Gelelektrophorese (PAGE) isoliert und in EcoRI-SstI-verkürztes pUC19 (Pharmacia) kloniert (wie nachstehend beschrieben). Die Sequenz der RBS-ATG-Polylinker-Regionen des endgültigen Aufbaus (TAC-RBS genannt) wird in Figur 3 gezeigt.
- Das synthetische IL-10-Gen wird in acht Schritten in einem pUC19-Plasmid zusammengesetzt. Bei jedem Schritt können deletionsfreie Inserts und/oder Inserts nach dem Klonieren durch Halten des lacZ(α)-Gens von pUC19 im Rahmen mit dem in Schritt 1 inserierten ATG-Startkodon nachgewiesen werden. Deletions- und/oder Insertionsänderungen enthaltende Klone können durch Zählen auf blaue Kolonien auf x-gal und IPTG enthaltenden L- Ampicillin-Platten herausgefiltert werden. Wahlweise können bei jedem Schritt Insertsequenzen leicht mittels eines universellen Sequenzierungsstarters bei z.B. von Boehringer Mannheim erhältlichen Plasmid-DNA-Zubereitungen in kleinem Maßstab bestätigt werden.
- In Schritt 1 wird der TAC-RBS-Vektor mit SstI verdaut mit T4- DNA-Polymerase (deren 3'-Exonukleaseaktivität die überhängenden 3'-Stränge der Sstl-Schnitte unter Bilden von Fragmenten mit stumpfem Ende verdaut) behandelt und nach der Deaktivierung von T4-DNA-Polymerase mit EcoRI unter Bilden eines 173 bp-Fragments behandelt, das die TAC-RBS-Region enthält und ein stumpfes Ende am ATG-Startkodon und den EcoRI-Schnitt am entgegengesetzten Ende besitzt. Schließlich wird das 173 bp-TAC-RBS-Fragment isoliert.
- In Schritt 2 wird das isolierte TAC-RBS-Fragment von Schritt 1 mit EcoRI/KpnI-verdautem Plasmid puC19 und dem hierin in SEQ. ID. Nr. 6 dargestellten synthetischen Fragment 1A/B gemischt, welches, wie nachstehend gezeigt wird, eine stumpfes Ende an seinem stromaufwärts gelegenen Terminus und ein versetztes, einem KpnI-Schnitt entsprechendes Ende an seinem stromabwärts gelegenen Terminus besitzt. Dieses KpnI-Ende befindet sich stromabwärts neben einer BstEII-Stelle. Die Fragmente werden unter Bilden des pUC19 von Schritt 2 ligiert.
- In Schritt 3 werden die synthetischen Fragmente 2A/B, das hierin in SEQ. ID. Nr. 7 dargestellt ist und 3A/B, das hierin in SEQ. ID. Nr. 8 dargestellte ist, mit BstEII/Smal-verdautem pUC19 aus Schritt 2 (nach Verstärkung und Reinigung) gemischt und unter Bilden von puC19 des Schritts 3 ligiert. Es ist anzumerken, daß der stromabwärts gelegene Terminus des Fragments 3A/B zusätzliche Basen enthält, welche das stumpfe SmaI-Ende bilden. Diese zusätzlichen Basen werden in Schritt 4 gespalten. Ferner besitzen die Fragmente 2A/B und 3A/B komplementäre, einzelsträngige 9-Rest-Enden, die sich beim Mischen rekombinieren, wobei sie den stromaufwärts gelegenen BstEII-Schnitt von 2A/B und das stromabwärts gelegene stumpfe Ende von 3A/B zum Ligieren mit dem pUC19 hinterlassen.
- In Schritt 4 wird das pUC19 aus Schritt 3 mit AflII/XbaI verdaut, verstärkt, gereinigt, erneut gereinigt, mit dem hierin in SEQ. ID. Nr. 9 dargestellten synthetischen Fragment 4A/B gemischt und unter Bilden des pUC19 von Schritt 4 ligiert.
- In Schritt 5 wird das pUC19 von Schritt 4 mit Xbal/Sa/I verdaut, verstärkt und gereinigt und mit dem hierin in SEQ. ID. Nr. 10 dargestellten Fragment 5A/B gemischt und unter Bilden des pUC19 von Schritt 5 ligiert. Es ist anzumerken, daß das versetzte Sa/I-Ende des Fragments 5A/B durch Verdauung mit HpaI in Schritt 6 entfernt wird.
- In Schritt 6 wird pUC19 von Schritt 5 mit HpaI/PstI verdaut, verstärkt und gereinigt und mit dem hierin in SEQ. ID. Nr. 11 dargestellten synthetischen Fragment 6A/B gemischt und unter Bilden des pUC19 von Schritt 6 ligiert.
- In Schritt 7 wird pUC19 von Schritt 6 mit ClaI/SphI verdaut, verstärkt und gereinigt und mit dem hierin in SEQ. ID. Nr. 12 dargestellten synthetischen Fragment 7A/B gemischt und unter Bilden des pUC19 von Schritt 7 ligiert.
- In Schritt 8 wird pUC19 von Schritt 7 mit MluI/HindIII verdaut, verstärkt und gereinigt und mit den synthetischen Fragmenten, 8A/B, das hierin in SEQ. ID. Nr. 13 dargestellt ist, und 9A/B, das hierin in SEQ. ID. Nr. 14 dargestellt ist, gemischt und unter Bilden des endgültigen Aufbaus ligiert, welcher anschließend durch Standardtechniken in den E. coli K-12-Stamm JM101 inseriert wird, der zum Beispiel von der ATCC unter der Zugangsnummer 33876 erhältlich ist. Nach der Kultivierung wird Protein aus den JM101-Zellen extrahiert und Verdünnungen dieser Extrakte werden auf biologische Aktivität getestet.
- Ein den offenen Leserahmen für vIL-10 kodierendes Gen wurde durch eine Polymerase-Kettenreaktion unter Verwenden von Startern verstärkt, welche die spätere Insertion des verstärkten Fragments in einen EcoRI-verdauten pcD(SRα)-Vektor (Figur 1) erlaubten. Der kodierende Strang des inserierten Fragments wird hierin in SEQ. ID. Nr. 15 dargestellt.
- Klone, die das Insert in der richtigen Orientierung trugen, wurden durch Expression von vIL-10 und/oder das elektrophoretische Muster des Restriktionsverdauten nachgewiesen. Ein derartiger, das vIL-10-Gen tragender Vektor wurde als pBCRF1(SRα) bezeichnet und wurde bei der ATCC unter der Zugangsnummer 68193 hinterlegt. pBCRF1(SRα) wurde in E. coli MC1061 verstärkt, durch Standardtechniken isoliert und zum Transfizieren von COS7-Affenzellen wie folgt verwendet: ein Tag vor der Transfizierung wurden ungefähr 1,5 x 10&sup6; COS7-Affenzellen auf einzelne 100 mm- Platten in Dulbeccos modifiziertes Eagle-Medium (DME) eingeimpft, das 5% fetales Kälberserum (FCS) und 2 mM Glutamin enthielt. Zum Ausführen der Transfizierung wurden COS7-Zellen von den Platten durch Inkubation mit Trypsin entnommen, zwei Mal in serumfreiem DME gewaschen und zu 10&sup7; zellen/ml in serumfreiem DME suspendiert. Eine aliquote Menge von 0,75 ml wurde mit 20 ug DNA gemischt und in eine sterile Elektroporationsküvette mit 0,4 cm überführt. Nach 10 Minuten wurden die Zellen mit 200 Volt, 960 uF in einer BioRad Gene Pulser-Einheit gepulst. Nach weiteren 10 Minuten wurden die Zellen aus der Küvette entnommen und 20 ml DME zugesetzt, das 5% FCS, 2 mM Glutamin, Penicillin, Streptomycin und Gentamycin enthielt. Das Gemisch wurde in aliquoten Mengen auf vier 100 mm-Gewebekulturschalen verteilt. Nach 12-24 Stunden bei 37ºC, 5% CO&sub2;, wurde das Medium durch ein ähnliches Medium ersetzt, das nur 1% FCS enthielt, und die Inkubation wurde weitere 72 Stunden bei 37ºC, 5% CO&sub2;, fortgesetzt, wonach das Medium gesammelt und auf seine Fähigkeit, die IFN-γ-Synthese zu hemmenm getestet wurde.
- Aliquote Mengen von 10 ml frisch isolierten PBL (etwa 2x10&sup6; Zellen/ml) wurden bei 37ºC mit PHA (100 ng/ml) in einem Medium inkubiert, das aus (i) 90% mit 5% FCS und 2 mM Glutamin ergänztem DME und (ii) 10% Überstand aus zuvor mit pBCRF1(SRα) transfizierten COS7-Zellen bestand. Nach 24 Stunden wurden die Zellen und Überstände zum Testen auf Anwesenheit von IFN-γ-mRNA beziehungsweise IFN-γ-Protein geerntet. Kontrollen wurden identisch behandelt, außer daß 10% Überstand von COS7-Kulturen stammte, die zuvor mit einem Plasmid transfiziert wurden, das ein nicht-verwandtes cDNA-Insert trug. Die vIL-10-behandelten Proben zeigten eine 50%ige Hemmmung der IFN-γ-Synthese bezogen auf die Kontrollen.
- Ein das hierin in SEQ. ID. Nr. 4 dargestellte reife vIL-10 kodierende Gen kann in E. coli exprimiert werden.
- Das cDNA-Insert von pBCRF1(SRα) wird erneut in ein M13-Plasmid kloniert, wo es zwei Mal durch ortsgerichtete Mutagenese verändert wird: zuerst unter Bilden einer ClaI-Stelle am 5'-Ende der Kodierungsregion für das reife vIL-10-Polypeptid und zweitens unter Bilden einer BamHI-Stelle am 3'-Ende der Kodierungsregion für das reife vIL-10-Polypeptid. Die mutierte Sequenz wird anschließend leicht in den nachstehend beschriebenen TRP- C11-Expressionsvektor inseriert.
- Der TRPC11-Vektor wurde durch Ligieren eines synthetischen Konsensus-RBS-Fragments an ClaI-Linker (ATGCAT) und durch Klonieren der sich daraus ergebenden Fragmente in ClaI-verkürztes pMT11hc (das zuvor zum Enthalten der ClaI-Stelle modifiziert worden war) aufgebaut. pMT11hc ist ein kleines (2,3 Kilobasen) AMPR, TETS-Derivat von pBR322 mit hoher Kopienzahl, welches die πVX-Plasmid-EcoRI-HindIII-Polylinker-Region trägt. (πVX wird von Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1982, beschrieben.) Dieses wurde durch Verkürzen von pMT11hc mit EcoRI und BamHI, Auffüllen der sich daraus ergebenden klebrigen Enden und Ligieren mit ClaI-Linker (CATCGATG), wodurch die EcoRI- und BamHI-Stellen wiederhergestellt wurden und die SmaI-Stelle durch eine ClaI-Stelle ersetzt wurde, zum Enthalten der ClaI-Stelle modifiziert. Eine Transformante aus dem TRPC11-Aufbau besaß eine von ClaI-Stellen flankierte Tandem-RBS-Sequenz. Eine der ClaI-Stellen und ein Teil der zweiten Kopie der RBS-Sequenz wurden durch Verdauen dieses Plasmids mit PstI, Behandeln mit Bal31-Nuklease, Verkürzen mit EcoRI und Behandeln mit T4-DNA-Polymerase in Anwesenheit aller vier Desoxynucleotidtriphosphate entfernt. Die sich daraus ergebenden 30-40 bp-Fragmente wurden durch PAGE gewonnen und in SmaI-verkürztes pUC12 kloniert. Ein von pKC101 (von Nichols et al. in Methods in Enzymology, Bd. 101, S. 155 (Academic Press, N.Y., 1983) beschrieben) abgeleitetes, E. coli-trP- tragendes EcoRI-Fragment mit 248 bp wurde anschließend in die EcoRI-Stelle kloniert, um den TRPCII-Aufbau zu vervollständigen, welcher in Figur 2 veranschaulicht wird. TRPC11 wird als Vektor für vIL-10 eingesetzt, indem man es zuerst mit ClaI und BamHI verdaut, reinigt und anschließend in einer Standardligationslösung mit dem ClaI-BamHI-Fragment des die für den reifen BCRF1 kodierende Nukleotidsequenz enthaltenden M13 mischt. Das inserthaltige, als TRPC11-BCRF1 bezeichnete TRPC11 wird im z.B. von der ATCC unter der Zugangsnummer 33876 erhältlichen E. coli K12- Stamm JM101 vermehrt.
- Die Wirkung von IL-10 auf das Tumorwachstum wurde in einer zu der von Tepper et al., Cell, Bd. 57, S. 503-512 (1989) beschriebenen ähnlichen Bestimmung getestet. Kurz gesagt, umfaßt die hier angewandte Bestimmung das getrennte Injizieren von Mäusen mit zwei Gruppen van Zellen aus einer syngenen Tumorzellinie, wobei eine Gruppe mit einem IL-10-exprimierenden Plasmid stabil transfiziert ist und die andere eine nicht-transfizierte Kontrolle ist. Die Häufigkeit der Tumorbildung wurde anschließend bei Mäusen verglichen, denen Zellen der beiden Gruppen getrennt injiziert wurden.
- Bei allen Versuchen wurden BALB/c-Mäusen entweder transfizierte oder nicht-transfizierte, von der ATCC unter der Zugangsnummer TIB 18 erhältliche NS1-Myelom-Tumorzellen injiziert. Die NS1- Zellen wurden durch Elektroporation mit Plasmid pGSRG (in Fig. 3 veranschaulicht), das den offenen Leserahmen (ORF) von in die XhoO-Restriktionsstelle inseriertem Maus-IL-10, Virus-IL-10 oder Human-IL-10 trug, transfiziert. pGSRG enthält einen Marker zum Bestimmen stabil transfizierter NS1-Zellen und ist ein Abkömmling des von Schnee et al., Proc. Natl. Acad. Sci., Bd. 84, S. 6904-6908 (1987), beschriebenen pSVDtβ. Die IL-10-Inserts für pGSRG wurden wie folgt erhalten. EcoRI-Linkersequenzen enthaltende PCR-Starter wurden jeweils für pH5C, pBRCRF1 und pcD(SRα)- F115 hergestellt, so daß die ORF der entsprechenden cDNA-Inserts verstärkt werden konnten. Die verstärkten ORF wurden anschließend erneut in EcoRI-verdaute pcD(SRα)-Vektoren kloniert und zum Selektieren von Vektoren, welche die ORF in der richtigen Orientierung enthielten, getrennt exprimiert. Schließlich wurden die XhoI-Fragmente der pcD(SRα) erneut in entsprechende XhoI-verdaute pGSRG-Plasmide kloniert.
- Die NS1-Zellen wurden wie folgt mit den pGSRG transfiziert. Zellen (2-3 x 106) aus einer halbkonfluenten Petrischale mit 100 mm Durchmesser wurden zentrifugiert, ein Mal in 10 ml steriler, phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) gewaschen, zentrifugiert und erneut in 0,5 ml PBS suspendiert. 20-100 ug Plasmid- DNA wurden in 1 ml PBS suspendiert. Die Zellen und DNA wurden gemischt, in eine Küvette auf Eis verbracht und in einem Bio-Rad Gene Pulser, der auf 960 Mikrofarad Kapazität und 200-300 Volt eingestellt war, mit einem Elektroschock versetzt. Nach 10 min auf Eis wurden die Zellen anschließend auf eine Standard-Mikrotiterplatte mit 96 Näpfchen in 100 ul Volumen plattiert. 48-78 Stunden später wurden jedem Näpfchen 100 ul Mycophenolsäure- Selektionsmedium (0,5 ug/ml Mycophenolsäure, 100 ug/ml Xanthin, 15 ug/ml Hypoxanthin, 12-15% fetales Kälberserum, 600 ug/ml Glutamin in DME High Glucose) zugesetzt.
- In einem ersten Versuch wurden jeweils 4, 3, 4 beziehungsweise 5 Mäusen 5 x 10&sup6; nicht-transformierte Zellen (Kontrolle), pGSRG- mIL10-transformierte Zellen, pGSRG-vIL10-transformierte Zellen und pGSRG-hIL10-transformierte Zellen intraperitoneal injiziert.
- Nach 4 Wochen hatten 3 von 4 Kontrollmäusen sichtbare Tumore entwickelt; keine der Versuchsmäuse entwickelte nach 4 Wochen Tumore.
- In einem zweiten Versuch wurden 16 Mäusen 5 x 10&sup6; nicht-transformierte Zellen intraperitoneal injiziert und 15 Mäusen wurde 5 x 10&sup6; pGSRG-mIL10-transformierte Zellen injiziert. Nach zwei Wochen wurden 8 der 16 Kontrollmäuse erneut 5 x 10&sup6; nicht-transformierte Zellen injiziert und 7 der 15 Versuchsmäuse wurden erneut 5 x 10&sup6; pGSRG-mIL10-transformierte Zellen injiziert. 4 Wochen nach den ersten Injektionen wurden die Mäuse auf-Anzeichen einer Tumorentwicklung untersucht. 16 von 16 Kontrollmäusen hatten sichtbare Tumore entwickelt und keine Versuchsmaus hatte irgendwelche Zeichen von Tumoren entwickelt.
- Die Beschreibungen der vorangehenden Ausführungsformen der Erfindung sind zum Zweck der Veranschaulichung und Beschreibung vorgestellt worden. Sie sind nicht dazu bestimmt, erschöpfend zu sein oder die Erfindung auf die genauen offenbarten Formen einzuschränken. Die Ausführungsformen wurden ausgewählt und beschrieben, um die Grundsätze der Erfindung am besten zu erläutern und dadurch anderen Fachleute zu ermöglichen, die Erfindung in verschiedenen Ausführungsformen und mit verschiedenen Abwandlungen, die an die besondere, beabsichtigte Verwendung angepaßt sind, am besten zu nützen. Es ist beabsichtigt, daß der Umfang der Erfindung durch die hieran angefügten Ansprüche definiert werden soll.
- Die Anmelder haben pH5C, pH15C und pBCRF1(SRα) tragende, getrennte Kulturen von E. coli MC1061 bei der American Type Culture Collection, Rockville, MD, USA (ATCC), unter den Zugangsnummern 68191, 68192 beziehungsweise 68193 hinterlegt. Diese Hinterlegungen wurden unter nach dem Vertrag der ATCC zur Kulturhinterlegung für Patentzwecke angegebenen Bedingungen durchgeführt, was sicherstellt, daß die Hinterlegung dem US Comissioner of Patents and Trademarks gemäß 35 USC 122 und 37 CFR 1.14 zugänglich gemacht wird und der Öffentlichkeit nach Erteilung eines US-Patents zugänglich gemacht wird, was erfordert, daß die Hinterlegung aufrechterhalten wird. Die verfügbarkeit des hinterlegten Stamms darf nicht als Lizenz zum Ausüben der Erfindung unter Verstoß der unter der Autorität einer Regierung Einklang mit ihren Patentgesetzen gewährten Rechte aufgefaßt werden. SEOUENZLISTEN
Claims (4)
1. Verwendung van Interleukin-10 bei der Herstellung eines
Arzneimittels zum Behandeln van Tumoren in einem Patienten.
2. Verwendung von Anspruch 1, wobei das Interleukin-10 aus der
Gruppe ausgewählt ist, die aus Virus-Interleukin-10 und Human-
Interleukin-10 besteht.
3. Verwendung von Anspruch 1, wobei das Arzneimittel zur
Verabreichung des IL-10 durch kontinuierliche Infusion geeignet
ist.
4. Verwendung von Anspruch 3, wobei das Arzneimittel zur
Verabreichung des IL-10 in einer Menge im Bereich von etwa 50-
800 ug je Tag geeignet ist.
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