KR100271197B1 - 인터루킨-10동족체또는길항제를포함하는내독소-또는초항원유도된독성치료용의약제학적조성물 - Google Patents

Abstract

유효량의 인터루킨-10을 투여함을 특징으로 하여 패혈병성 쇼크 또는 독성 쇼크를 치료하기 위한 방법이 제공된다.

Description

[발명의 명칭]

인터루킨-10 동족체 또는 길항제를 포함하는 내독소-또는 초항원 유도된 독성 치료용의 약제학적 조성물

[도면의 간단한 설명]

제1도는 TRPC11 플라스미드를 도시한 것이다[실시예 3 참조].

제2도는 IL-2-활성화된 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)에 의해서 (A) IFNγ와 (B) TNFα의 합성을 억제하는 IL-4, hIL-10 및 vIL-10을 도시한 것이다. ND는 측정되지 않음을 의미한다. 에라 바(error bar)는 1회 실험에서 2개 샘플의 범위를 나타낸다. IL-2로 자극할 경우, 상이한 공여체로부터의 PBMC는 TFNγ와 TFNα를 생성하는 능력에 있어 가변적이다. IL-4 및 IL-10의 억제 효과는 (C) 항-IL-4 및 (D) 항-IL-1O 중화 항체 각각에 의해 역전된다. PBMC는 1O㎍/ml의 중화 항-사이토킨 또는 이소타입-대조군(isotype-control) 면역글로불린의 존재하에서, 200U/ml의 재조합 IL-2(γIL-2) 및 다양한 양의 γIL-4 또는 COS 세포가 생성한 사람 IL-10(COS-hIL-10)과 함께 항온처리된다. 항체 및 사이토킨은 PBMC를 침가하기전 30분동안 항온처리한다.

제3(a)도는 PBMC내에서 IL-2에 의해 유발된 임파구 활성화된 킬스(kil1s)(LAK) 활성을 억제하는 IL-4와, 이의 활성을 나타내지 않는 사람 IL-10(hIL-10) 또는 바이러스 IL-10(vIL-10)을 도시한다. 제2도의 것과 유사한 실험으로부터의 PBMC를 상층액과 함께 하베스트하고⁵¹Cr-표지된 COLO(결장암, 제3a1도) 및 다우디[Daudi(Burkitt's 임파종), 제3a2도] 세포에 대한 세포 독성에 대해 시험한다. (B) LAK 활성은 IL-2 및 IL-10과 함께 배양한 PBMC내에서 CD56 + 세포에 의해 발현된다. PBMC는 FITC에 접합된 항-CD56 항체를 사용하여 염색하고, FacStar, Plus(Becton-Dickinson, San Jose, CA)상에서 분류한다. CD56+ 및 CD56-(순도 99.7%) 단편내에서의 세포 독성을 시험한다. 유사한 결과는 IL-2 단독과 PBMC의 배양물로부터 기원한 세포를 사용하여 수득한다.

제4(a)도는 정제된 NK세포에 의한 IL-2-유도된 IFNγ합성이 IL-4에 의해서 직접 억제되지만 hIL-10 또는 vIL-1O에 의해서는 억제되지 않음을 도시한 것이다. FACS-정제된 NK 세포(순도＞99.5%)를 200단위/ml γIL-2와 함께 500단위/ml의 γIL-4, 또는 COS-hIL-10, COS-vIL-10, 또는 예셀 배지(Yssel's medium)내 COS-무크(mock) 상층액(10%)을 10⁶세포/ml에서 4내지 5일동안 배양한 다음, 2개의 배양물로부터의 상층액을 수집하여 ELISA에 의한 IFNγ의 측정을 위해 혼합한다. 제4(b)도는 정제된 NK세포 및 PBMC에 의한 IL-2-유도된 증식이 IL-4에 의해 억제되지만 hIL-10/vIL-10에 의해서는 억제되지 않음을 도시한 것이다(제4b1도; 분류된 NK; 제4b2도; PBL).

제5(a)도는 T세포를 제외한 유착 세포의 첨가로 정제된 NK세포에 의해 IL-2-유도된 IFNγ합성의 IL-10-매개된 억제가 회복됨을 도시한 것이다. 제5(b)도는 정제된 단핵세포의 첨가로 정제된 NK세포에 의해 IL-2-유도된 IFNγ합성의 IL-10-매개된 억제가 회복됨을 도시한 것이다. 단핵세포 단독은 검출 가능한 양이하의 IFNγ를 생성한다. 에라 바는 1회 실험에서 2개 샘플의 범위를 나타낸다.

IL-2 부재하에서 IFNγ생성은 검출 한계 이하이다(제2도). 상이한 공여체로부터의 NK세포는 IFNγ를 생성하는 능력이 가변적이다. 제5(c)도는 NK세포, CD14 + 세포, 및 두 세포 유형 모두에 의한 IL-2-유도된 TNFα합성시 IL-10의 효과를 도시한 것이다. NK세포(1O⁶세포/ml) 및/또는 CD14 + 세포(3 × 1O⁵세포/ml)는 40OU/ml의 γIL-2 및 10% COS-hIL-10 상층액의 존재 또는 부재하에서 5일간 배양한다.

제6도는 LPS에 의해 활성학되어진, 사람 단핵 세포에 의한 IL-10.IL-6, TNFα 및 GM-CSF 생성 역학을 도시한 것이다. 원심분리 세정에 의해 분리한, 사람 단핵세프는 LPS(1㎍/ml)의 부재 또는 존재하에 테플론 백(4 × 1O⁶세포/ml) 중에서 배양하고 사이토킨 특이적인 ELISA에 의해 제시되는 시간에서 하베스트한 배양 상층액중에서 (A) IL-10,(B) IL-6, (C) TNFα 또는 (D) GM-CSF의 생성을 측정한다.

제7도는 LPS의 농도 증가에 따라서 사람 단핵 세포에 의한 IL-10의 생성을 도시한 것이다. 사람 단핵세포(4 × 10⁶세포/ml)는 LPS의 농도를 증가시키면서 24시간동안 태플론 백내에서 배양하여 IL-1O의 생성을 ELISA로 측정한다.

제8도는 IFNγ, LPS 또는 LPS와 IFNγ로서 활성화된 단핵 세포에 의한 사이토킨의 생성시 IL-10의 효과를 도시한 것이다. 사람 단핵세포(4 × 10⁶세포/ml)는 IFNγ(1OOU/ml), 1, 1O, 1OO 또는 1OOOng/ml의 LPS, 및 LPS(1, 1O, 1OO 또는 1OOOng/ml)와 IFNγ(1OOU/ml)의 배합물을 IL-1O(1OOU/ml)의 부재(□) 또는 존재() 하에서 24시간동안 배양하여 (A) IL-1α,(B) IL-1β,(C) IL-6,(D) TNFα또는 (E) GM-CSF의 생성을 상층액중에서 사이토킨 특이적인 ELISA로서 측정한다.

제9도는 LPS 활성화된 단핵세포에 의한 TNFα 및 GM-CSF의 생산시 사람 1L-1O 또는 바이러스-IL-1O의 효과를 도시한 것이다. 사람 단핵세포(4 × 1O⁶세포/ml)는 LPS(1㎍/ml)로서 활성화시키고 사람 IL-10(10OU/ml) 또는 바이러스-IL-10과 함께 중화 항-IL-10 mAb 19F1(10㎍/ml)의 부재 또는 존재하에서 24시간동안 배양하여 (A) TNFα 또는 (B) GM-CSF의 생산을 사이토킨 특이적인 ELISA로 측정한다.

제1O도는 LPS로서 활성화된 사람 단핵세포에 의한 사이토킨 특이적인 mRNA단계의 발현시 외인성 IL-10, 내인성적으로 생성된 IL-10 및 IL-4의 효과를 도시한 것이다. 사람 단핵 세포(4 × 10⁶세포/ml)는 4℃ 및 37℃의 배지에서 배양하거나 IL-4(10OU/ml), IL-10(10OU/ml), 및 중화 항-IL-1OmAb 19F1(10㎍/ml)의 부재 또는 존재하에서 LPS(1㎍/ml)로 활성화시켜, 24시간 후 mRNA를 분리한다. β-액틴, IL-1α, IL-1β, IL-6, IL-8, TNFα, GM-CSF, 및 G-CSF의 발현은 역전사된 mRNA상에서 사이토킨 특이적인 프라이머를 사용하는 PCR분석에 이어서 내부 프로브를 사용하는 반응 산물의 서던 블롯팅(Southern blotting)으로 측정한다. CD4⁺T세포 클론으로부터 수득한 cDNA는 TNFα, 및 GM-CSF의 발현용 대조군으로서 포함된다.

제11도는 LPS로서 활성화된 사람 단핵세포에 의한 사이토킨 특이적인 mRNA단계의 발현시 IL-10의 효과를 도시한 것이다. mRNA는 사람 단핵세포(4 × 10⁶세포/ml)로부터 분리하고, IL-10(10OU/ml)의 부재 또는 존재하에 7시간동안 LPS(1㎍/ml)로서 활성화시켜 IL-6, IL-8, IL-10, TGFβ 및 β-액틴의 발현을 노던 분석(northern analysis)으로 측정한다.

제12도는 LPS로 활성화된 사람 단핵세포에 의한 IL-10 및 TGFβ 특이적인 mRNA단계의 발현시 외인성 IL-10, 내인성적으로 생성된 IL-10 및 IL-4의 효과를 도시한 것이다. 사람 단핵세포(4 × 10⁶세포/ml)는 4℃ 및 37℃ 배지중에서 배양하거나 IL-4(100U/ml), IL-10(100U/ml) 및 중화 항-IL-10mAb 19F1(10㎍/ml)의 부재 또는 존재하에서 LPS(1㎍/ml)로써 활성화시킨다. mRNA는 24시간 후에 분리한다. (A) IL-1O, TGFβ 및 β-액틴의 발현은 노던 분석으로 측정하고 (B) IL-1O의 발현은 역 전사된 mRNA상에서 사이토킨 특이적인 프라이머를 사용하는 PCR-분석에 이은 내부 프로브가 있는 반응 산물의 서던 블롯팅에 의해 측정한다.

제13도는 LPS로 활성화시킨, 사람 단핵 세포에 의한 제II형 MHC 발현시 내인 성적으로 생성된 IL-1O의 효과를 도시한 것이다. 사람 단핵세포는 (A) 0ng/ml LPS, (B) O.1ng/ml LPS, (C) 1Ong/ml LPS 또는 (D) 1OOOng/ml LPS와 함께 중화 항-IL-10 mAb 19F1(10㎍/ml)의 부재 또는 존재하에서 40시간동안 배양한다. HLA-DR/DP(Q5/13)의 발현은 간접적인 면역형광성으로서 측정한다.

제14도는 대식세포주의 APC기능에 있어서 IL-10의 효과를 도시한 것이다. 상단(제14a도). 1G18.LA 또는 PU5.1 대식세포 주(10⁶세포/ml)는 lFNγ(2ng/ml)로 활성화시킨다. 다음 이 APC를 세척하고 HDK.1 Th1 세포(5 × 1O⁴세포/웰) 및 항원(TNP-KLH, 10㎍/ml)과 함께, 정제된 IL-10(200단위/ml)의 존재(□) 또는 부재(■)하에서 배양한다(10⁵세포/웰). 상층액을 48시간 후에 수집하여 IFNγ에 대해 시험한다. 하단(제14b도). 상기한 바와 같이, 1G18.LA 대식세포를 활성화시킨 다음, HDK.1 Th1 세포(5 × 10⁴세포/웰) + TNP-KLH(1O㎍/ml); 또는 DO11.1O T세포 하이브 리도마(5 × 10⁴세프/웰) + 오브 알부민(2.5mg/ml)과 함께, 정제된 IL-10(하단)(20O단위/ml)의 존재(□) 또는 부재(■)하에서 배양한다(10⁵세포/웰). 상층액을 2O시간 후 수집하여 IL-2에 대해 시험한다. 모든 패널에서는, 3개의 배양물의 평군 및 SD를 나타낸다.

제15도는 정제된 복막 대식세포내에서의 형태학적 변화를 유도하는 IL-10을 도시한 것이다. 복막 대식세포[Mac-1^+,bright, B220^-]를 FACS상에서 정제한 다음 IFNγ(2ng/ml) (상단, 제15a도), 또는 IFNγ(2ng/ml)+IL-10(200단위/ml) (하단, 제15b도)의 존재하에서 72시간동안 배양한다. 상층액을 제거하고, 세포를 공기-건조하여 고정시킨 다음 Wright's-Giemsa로 염색하고, 건조시킨 다음 사진을 찍는다.

제16도는 대식세포 주에 대한 IL-1, TNFα 및 IL-6 단백질의 LPS-유도된 생성을 억제하는 IL-10을 도시한 것이다. 대식세포 주 1G18.LA(제16a도, 16b도 및 16c도) 및 PU5.1(제16d도, 16e도 및 16f도)은 LSP(10㎍/ml); 또는 LPS (10㎍/ml)+IFNγ(2ng/ml)와 함께; IL-10 또는 IL-4(일부 경우)의 부재 또는 존재(둘다 2OO단위/ml)하에서, 제시한 바와 같이 배양한다(10⁶세포/ml). 상층액을 수집하여 IL-1, IL-6 또는 TNFα의 농도를 시험한다.

제17도(A, B1, B2 및 C 부분). IL-10은 대식세포 주내에서 TNFα RNA의 LPS-유도된 발현을 억제한다. 1G18.LA 대식세포주는 제16도에서와 같이 자극시킨다. 상층액을 6시간후 제거하고 RNA 침전을 위해 세포를 하베스트할때 구아니디늄 이소티오시아네이트 용액을 가한다. 이렇게 자극된 1G18.LA 세포주 샘플의 총 RNA중 1O㎍을 겔상에 로딩하고, 블롯팅한 다옴, TNFα 및 액틴에 대해 프로브화한다.

제18도는 복막 대식 세포의 자극을 도시한 것이다. IL-10은 복막 대식세포에 의한 IL-6 단백질의 LPS-유도된 합성을 억제한다. 복막 대식세포(Mac-1^+,bright, B220^-]을 FACS상에서 정제한 다음 단독으로 또는 LPS(10㎍/ml)와 함께, IL-10(200단위/ml), 항-IL-10(1O㎍/ml) 또는 IFNγ(2ng/ml)의 존재 또는 부재하 7×10⁵세포/ml에서 배양한다. 상층액을 하베스트한 다음 특이적인 면역검정(ELISA)을 사용하여 공지된 표준물에 대해 상대적인, 이의 IL-6 농도를 시험한다.

제19도는 대식세포로부터 가용성 공-자극인자를 하향 조절(down-regulate)하거나 가용성 억제인자를 유도시키지 않는 IL-1O을 도시한 것이다. (A) 상층액은 IFNγ를 사용하여 24시간동안 자극시킨 다음, Thl 세포(HDK-1, 2×10⁵세포/ml) 및 항원(KLH, 500㎍/ml)을 사용하여 24시간동안 추가로 자극시킨 후 1G18.LA 대식세포 주(10⁶세포/ml)로부터 수득한다. 상층액을 농축시키고 1FNγ와 IL-2를 소모시킨 다음, CSIF검정에 사용한다. 이 상층액만은 검출가능한 농도의 1FNγ 자체를 함유하지 않는다. IFNγ 활성화된 1G18.LA 대식세포 APC(1O⁵세포/웰)는 HDK-1 세포(5 × 10⁴세포/웰) 및 항원(TNP-KLH, 10㎍/ml) 단독(△)과 함께 또는 다양한 용량의 IL-10 + 상기 상층액(최종 농도 25%)(□) 또는 다양한 용량의 IL-10 - 상기 상층액(최종 농도 25%)(▲)의 존재하에서 배양한다. CSIF검정으로부터의 상층액을 48시간후 수집하고 IFNγ농도에 대해 검정한다. 1회 실험시 3개의 배양물 평군 및 SD를 나타낸다. (B) IL-10의 부재(■) 또는 존재(200단위/ml)(□)하에서, 가중되는 용량의 정제된 비장 대식세포; 또는 IL-10의 부재(●) 또는 존재(20O단위/ml)(○)하에 가중되는 용량의 정제된 대식세포와 B세포(2.5 × 10³세포/웰)의 혼합물; 또는 IL-1O의 부재(●) 또는 존재(20O단위/ml)(○)하 B세포 단독을 HDK-1 Th1 클론(10⁴클론/웰)과 TND-KLH(10㎍/ml)에 대한 APC로서 사용한다. 48시간후 상층액을 수집하여 IFNγ에 대해 검정한다. 3개 배양물의 평군 및 SD를 나타낸다.

제20도는 Balb/C 마우스내에서 하기 농도의 SEB-유발된 독성으로부터 보호하는 IL-10을 도시한 것이다; 제20a도; 20㎍ 또B/30mg d-Gal; 제20b도: IL-10/20㎍ SEB/30mg d-Gal; 제20c도: 10㎍ SEB/30mg d-Gal; 제20d도: IL-10/10㎍ SEB/30mg d-Gal; 제20e도: 30mg 갈락토사민; 제20f도: 10㎍ IL-10.

제21도는 치명적인 내독혈증으로부터 마우스를 보호하는 IL-10을 도시한 것이다. BALB/c 마우스 20개 그룹에 350㎍의 LPS 또는 350㎍의 LPS와 함께 다양한 용량의 정제된 재조합 뮤린(recombinant murine) IL-10을 복막(i.p.)내 주사한다. 6일에 걸쳐서 사멸을 모니터한다.

제22도는 치명적인 내독혈증으로부터 마우스를 보호하는 IL-10의 능력을 중화시키는 항-IL-10 항체를 도시한 것이다. BALB/c 마우스 20개 그룹에 LPS 투여 1시간전 2A5 항-IL-10 항체(제22a도) 1mg 또는 GL113 이소타입 대조군 항체(제22b도) 1mg을 주사한다. 다음 마우스에 제21도에서 기술한 바와 같이, LPS 350㎍을 단독으로 또는 다양한 용량의 IL-10과 함께 복막내 주사한다.

제23도는 LPS를 주사한지 30분후 치명적인 내독헐증으로부터 마우스를 보호하는 IL-10을 도시한 것이다. BALB/c 마우스 20개 그룹에 초기에 LPS 350㎍을 복막내 주사하고 재조합 IL-10 1.0㎍을 LPS를 주사한 초기, 0.5시간후, 1시간후, 2시간후 또는 5시간후에 복막내 주사한다. 본 실험에서 IL-10 부재시 LPS 350㎍이 복막내 투여된 대조군 마우스 모두는 사멸했다.

제24도는 항-IL-10 처리된 마우스 및 대조군 마우스로부터 수득한 전체의 생복막 세척 세포에 의한 표면 IgM 및 IgD 발현의 면역형광 분석을 도시한 것이다. BALB/c 마우스에 출생시부터 8주까지 SXC-1 항-IL-10 항체를 주사한다(제24d도). 이 실험 단락에서는 J5/D 이소타입 대조군 항체를 주사한 것(제24b도), 포스페이트 완충된 염수(PBS)를 주사한 것(제24c도) 또는 아무것도 주사하지 않은 것(제24a도)을 기술한다. 이 결과에서는 각각의 실험 그룹으로부터 계측된 5,000개의 살아있는 세포의 플루오레스세인 강도를 나타낸다.

제25도는 8주 처리후 시험한 항-IL-10 처리된 마우스 및 대조군 마우스의 혈청 IgM에 농도를 도시한 것이다. 이 결과는 각 그룹에서 개개의 혈청 5개의 등비평균 ±SEM을 나타내며 2회의 상이한 실험으로부터의 결과를 포함한다. 3회의 추가 실험에서 동일한 결과가 수득된다.

제26도는 α1,3-덱스트란(제26b도) 또는 포스포릴콜린(제26a도)에 대한 항-IL-10 처리된 마우스 및 대조군 마우스의 생체내 항체 반응을 도시한 것이다. BALB/c 마우스에 출생부터 9주까지 SXC.1 항-IL-10 항체, J5/D 이소타입 대조군 항체 및 PBS를 주사하거나, 비처리된 채로둔다. 8주후, 실험 단락에서 기술한 바와 같이, 마우스를 α1,3-덱스트란 또는 포스포릴콜린 원으로서 열 사멸시킨 스트렙토 코커스 뉴모니아에(Streptococcus pneumoniae)로 챌린지(challenge)한다. 5개의 개개 혈청에서 검측된 특이적인 항체 농도의 등비평균 ±SEM을 나타낸다.

제27도는 SXC.1 항-IL-10 처리된 마우스 및 대조군 마우스로부터 수득한 살아있는 비장 임파구 세포의 표면 B220 및 CD3 발현의 면역형광 분석을 도시한 것이다. 더욱 상세하게는 제24도 범례를 참조하며 제27도의 A내지 D부분은 제24도의 A내지 D부분과 각각 상응한다.

제28도는 TNP-KLH에 대하여 항-IL-10 처리된 마우스 또는 대조군 마우스의 생체내 반응을 도시한 것이다. 마우스에 출생부터 10주까지 항-IL-10 항체(●) 또는 이소타입 대조군(○)을 주사한다. 8주후, 이 동물은 TNP-KLH 10㎍을 사용하여 복막내적으로 챌린지한다. 면역화한지 7 및 14일후 각각 TNP-특이적인 IgM(제28a도) 및 IgG(제28b도)의 혈청 농도를 측정한다. 이 결과는 개개의 마우스를 대표하는 각각 원(○ 또는 ●)을 사용하는, 3개의 독립된 실험을 나타낸다.

제29도는 복막 세척 B세포에 대해 직접적으로 세포독성을 나타내지 않은 항-IL-10 항체를 도시한 것이다. 프라임되지 않은 8주짜리 BALB/c 마우스에 항-IL-10 항체(SXC.1-제29도 A, B 및 C부분) 1mg 또는 이소타입 대조군(J5/D-제29도 D, E 및 F부분) 1mg을 복막내 주사한다. 1, 2 또는 3일후 복막 세척 세포를 상이한 동물로부터 수집하여, 표면 IgD 및 IgM의 공발현에 대해 분석한다. 이 결과는 각각의 실험 그룹으로부터 계측한 5,000개의 살아있는 세포의 형광 강도를 나타낸다.

제30도는 항-IL-10 처리된 마우스 또는 대조군 마우스내에서의 혈청 IFNγ수준을 도시한 것이다. BALB/c 마우스에 출생부터 8주까지 항-IL-10 항체(●) 또는 이소타입 대조군(○)을 주사한다. 8주후 수집한 혈청은 면역검정으로써 IFNγ에 대해 분석한다. 이 결과는 개개의 마우스를 대표하는 각각의 원(○또는 ●)을 사용하는, 5개의 독립된 실험을 나타낸다.

제31도는 항-IL-10 치료능을 감소시킴으로써 마우스의 복막내 B세포를 고갈시키는 항-IFNγ 항체의 공투여를 도시한 것이다. BALB/c 마우스를 출생부터 8주까지 항-IL-10 항체(제31c도) 또는 항-IL-10 + 항-IFNγ 항체(제31b도)로 처리하거나 비처리한다(제31a도). 다음 복막 세척 세포를 B220의 공발현 및 IgM의 공발현에 대해 분석한다. 이 결과는 각각의 실험 그룹으로부터 계측된 5,000개의 살아있는 세포의 형광 강도를 나타낸다.

제32도는 항-IL-10 처리된 8주짜리의 마우스에서 혈청 TNFα농도를 도시한 것이다. 마우스를 실험 단락에서 기술한 바와 같이, 출생부터 8주까지 SXC.1 항-IL-10 항체(·) 또는 이소타입 매취된(matched) 대조군 항체(○)로 처리한다. 8주째에 수집한 혈청은 ELISA에 의해 TNFα 함량에 대해 검정한다. 이 결과는 개개의 마우스를 대표하는 각 원(○ 또는 ●)을 사용하는, 5개의 독립된 실험을 나타낸다.

제33도는 항-IL-10 처리된 마우스에서의 혈청 IL-6 농도를 도시한 것이다. 출생부터 8주까지 SCX.1 항-IL-10 항체(●) 또는 이소타입 매취된 대조군 항체(○)를 처리한 마우스로부터 수집한 혈청을 ELISA에 의해 IL-6 함량에 대해 검정한다. 이 결과는 개개의 마우스를 대표하는 각 원(○ 또는 ●)을 사용한, 5개의 독립된 실험을 나타낸다.

제34도는 LPS-유도된 쇼크의 결과인 사멸 가능성이 증가된 항-IL-10 처리된 마우스를 도시한 것이다(제34a도 에서는 LPS 500㎍, 제34b도에서는 LPS 400㎍, 제34c도에서는 LPS 100㎍, 제34d도에서는 LPS 50㎍, 제34e도에서는 LPS 50㎍, 및 제34f도에서는 LPS 1㎍). 출생에서 8주까지 마우스를 SXC.1 랫트 IgM 항-IL-10 항체(●), 2A5 랫트 IgG1, 항-IL-10항체(▲), 또는 적절한 이소타입 대조군 항체(○) (△)로 처리한다. 8주째에, 마우스(5마리의 마우스/그룹)에 상이한 용량의 LPS를 복막내 주사한다. 이어 4일에 걸쳐 사멸을 모니터한다.

제35도는 항-IL-10 처리된 마우스내에서 면역 글로불린 이소타입의 혈청 농도를 도시한 것이다. 마우스를 출생부터 8주까지 SXC.1 또는 2A5 항-IL-10 랫트 항체, 적절한 이소타입 대조군 항체 또는 PBS로 처리한다. 8주째에 수집한 혈청은 이소타입-특이적인 면역 글로불린 ELISA를 사용하여 뮤린 IgG1(제35a도), 뮤린IgG2a(제35c도), 뮤린 IgG2b(제35e도), 뮤린 IgG3(제35b도), 뮤린 IgE(제35d도) 또는 뮤린 IgA(제35f도)의 총 함량에 대해 검겅한다. 결과는 각각의 면역글로불린이소타입 분석에 대한 4개의 독립된 실험을 나타낸다. 각각의 실험에서, 데이타는 5개의 개개 혈청중에서 검출된 면역글로불린 농도의 기하평균 ±S.E.M으로 나타낸다.

제36도는 항-IL-10 처리된 마우스내에서 일시적인 Ly1 B 세포 고갈을 도시한 것이다. 마우스를 출생부터 8주까지 SXC.1 항-IL-10 항체로 처리한 다음 이 처리를 중단한다. 8주(제36a도 및 제36d도), 12주(제36b도 및 제36e도) 및 16주(제36c도 및 제36f도)에서 이와같은 마우스(3마리의 마우스/그룹)의 상이한 그룹으로부터 복막 세척 세포를 수집한다. 결과는 살아있는 총 복막 세척 세포에 의한 표면 IgM 및 표면 B220 발현의 면역형광 분석을 나타낸 것이며, 각 실험 그룹으로부터 5,000개의 살아있는 세포가 계측된다.

제37도는 SXC.1 항-IL-10 처리된 마우스(제37d도) 또는 대조군 마우스[제37c도에서는 J5/D 이소타입 대조군 항체로 처리, 제37b도에서는 포스페이트 완충된 염수(PBS)로 처리, 또는 제37a도에서는 아무것도 처리하지 않음]로부터 수득한 살아있는 복막 세척 임파구 세포에 의한 표면 Ly1 및 표면 IgM 발현의 면역형광 분석을 도시한 것이다. 결과는 각각의 실험 그룹으로부터 계측된 5,000개의 살아있는 세포의 형광 강도를 나타낸다.

제38도는 SXC.1 항-IL-10 처리된 마우스 또는 대조군 마우스(제37도와 평행)로부터 수득한 살아있는 총 복막 세척 세포에 의한 표면 Mac-1 및 표면 IgM 발현의 면역형광 분석을 도시한 것이다. 이 결과는 각 실험 그룹으로부터 계측된 5000개의 살아있는 세포의 형광 강도를 나타낸다.

제39도는 TNP-피콜(Ficoll)에 대한 항-IL-10 처리된 마우스 또는 대조군 마우스의 생체내 항체 반응을 도시한 것이다. 마우스에 출생부터 9주까지 SXC.1 항-IL-10 항체(○) 또는 이소타입 대조군 항체(●)를 주사한다. 8주째에, 동물을 TNP-피콜 1O㎍으로 복막내적으로서 챌린지한다. TNP-특이적인 IgM 또는 IgG의 혈청 수준을 ELISA에 의해 각각 5 또는 10일후에 측정한다. 각각의 데이타에서 원(● 또는 ○)은 개개 마우스를 나타낸다.

제40도는 NZB/W 마우스내에서 자가면역성의 개시를 지연시키는 항-IL-10 항체 처리를 도시한 것이다. 20마리의 암컷 NZB/W F1 마우스 그룹에 출생부터 시험전 과정을 통해 1주당 3회씩 SXC-1 랫트 IgM 항-마우스 IL-10 항체(●) 또는 J5/D로 지정된 이소타입 대조군 항체(○)를 주사한다. 이후 42주에 걸쳐 동물 생존을 모니터한다.

제41도는 항-IL-10 항체로 처리한 NZB/W 암컷 마우스 내에서 단백뇨(＞3+)의 진행을 도시한 것이다. 22마리의 암컷 NZB/W F1 마우스 그룹에 출생부터 시험 전체 기간동안에 걸쳐 1주일당 3회씩 SXC-1 항-IL-10 항체(●) 또는 이소타입 대조군 항체(○)를 주사한다. 12주째부터 42주째까지 알부스틱 딤 스틱(Albustix dip stick)을 사용하여 단백뇨를 측정함으로써 신장질환의 진행을 추정한다. 데이타는 뇨중에 300mg 이상의 단백질/d1이 있는 마우스의 비를 나타낸다.

제42도는 항-IL-10을 처리한 NZB/W 마우스로부터의 신장의 조직학적 실험을 도시한 것이다. 제42a도는 대조군 NZB/WF1 신장(PAS 염색)을 나타낸다: 여기서는 세관으로의 단백질 누출을 나타내는, 세관내 면역 복합체 및 단백질 사출의 동종 침착이 존재하는 심각한 사구체신염을 보이고 있다. 제42b도는 항-IL-10 처리된 NZB/WF1 신장(PAS 염색)을 도시한 것이다.

제43도는 항-IL-10 처리된 NZB/W 마우스내에서의 자가항체 생성을 도시한 것이다. NZB/W 암컷 마우스에 출생부터 전시험을 통해 매 3일마다 SXC-1 항-IL-10 항체(●) 또는 이소타입 대조군(○)을 주사한다. 5개월 또는 6개월째에 수집한 혈청은 ELISA를 사용하여 이-본쇄 DNA에 결합하고 있는 IgG 항체의 함량에 대해 평가한다. 각각의 원(● 또는 ○)은 개개의 마우스를 나타낸다.

제44도는 항-IL-10 처리된 NZB/WF1 마우스내에서의 혈청 TNFα의 농도를 도시한 것이다. NZB/W 암컷 마우스에 출생부터 전 시험을 통해 매 3일마다 SXC-1 항-IL-10 항체(●) 또는 이소타입 대조군(○)을 주사한다. 5개월, 7개월 또는 8개월째 수집한 혈청을 사이토킨-특이적인 ELISA를 사용하여 TNFα 함량에 대해 평가한다. 각각의 원(○ 또는 ●)은 개개의 마우스를 나타낸다.

제45도는 NZB/WF1 마우스의 항-IL-10 유도된 보호를 역전시키는 항-TNFα 항체를 도시한 것이다. 36마리 및 18마리의 NZB/W 암컷 마우스 그룹에 출생부터 전 실험을 통해 2A5 항-IL-10 항체(■)(▲) 또는 GL113으로 지정된 이소타입 대조군 항체( □)를 각각 1주에 2회씩 주사한다. 이 동물의 1/2에는 항-IL-10 항체를 주사하고 또한 출생후 30주째부터 시작하여 1주에 2회씩 XT22 항-TNFα 항체를 추가로 주사한다(▲). 34주 기간에 걸쳐서 동물 생존을 기록한다.

[발명의 상세한 설명]

[발명의 영역]

본 발명은 유효량의 인터루킨-10(IL-10), 또는 이의 동족체 또는 길항제를 포함하는, 패혈병성-쇼크 또는 독성-쇼크-유형 증후(예: 내독성 또는 초항원-유도된 독성)를 치료하기 위해 면역 반응을 조절하는데 유용한 약제학적 조성물에 관한 것이다.

[배경]

심각한 감염은 심각한 생리학적 및 대사적 변형을 초래할 수 있다. 증후는 다양할 수 있으나, 열, 저혈압증, 대사성 산성증, 조직 괴사 및 광범위한 기관 기능장애를 포함하며, 올바르게 처리하지 않을 경우, 궁극적으로는 죽음에 이를 수도 있다[참조: Berkow (ed) The Merck Manual, Rahway, New Jersey; WeatheraIL et al. (eds) Oxford Texbook of Medicine, Oxford University Press, New York; Braunwald et al. (eds) Harrison's Textbook of Internal Medicine, Mcgrw-HiIL, New York; or Wyngaarden et al. (eds) Cecil's Textbook of Medicine, Saunders Co., Philadelphia; 이들은 본원에서 참조로 인용됨]. 패혈병성 쇼크 및 독성 쇼크 상태는 상이한 감염 반응으로 특징지워지며 종종 상기 증후중 일부 또는 모두를 나타낸다.

패혈병성 쇼크는 내독소-유발된 반응의 모델이다. 패혈병성 쇼크는 내독소, 전형적으로는 그람-음성 세균 세포벽으로부터의 리포폴리사카라이드(LPS) 성분이 면역 시스템내로 도입됨으로써 유발된다. 독성 쇼크는 초항원-유발된 반응의 모델이며 그람-양성 세균 세포막, 예를 들면 스타필로코커스 장독소 B[staphylococcal enterotoxin B(SEB)]로부터 단백질 성분이 방출됨으로써 유발된다. 비록 상기 두 반응 모두가 초기에는 미생물 감염에 의해 유발된다해도, 면역 시스템은 각각의 반응을 유발시키는 미생물의 산물에 대해서 상이하게 반응한다.

내독소, 예를 들면 LPS에 의해 유발된 쇼크 반응에 있어서, 숙주-기원한 단백질인, 암 괴사 인자(TNF)는 최근에 그람 음성 패혈증의 많은 유해 효과를 유발시키는 것으로 입증되어 왔다. TNF에 대한 항혈청을 사용한 수동 면역화로 그람 음성 균혈증 또는 내독소혈증의 많은 치사 효과가 방지될 수 있다[참조: Tracey et al.(1986) Science, 234:470-474; Beutler et al. (1986) Nature 320:584-588; 및 Tracey et al. (1987) Nature 330:662-664]. TNF의 높은 혈청 농도는 수막염균성수막염, 말라리아 및 레이슈마니아증(leishmniasis)을 포함하는, 기타의 심각한 감염 질환에서 관측되어 왔다. TNF의 순환 농도가 높은 많은 환자는 기관 기능장해가 증가됨에 따라 치사도도 증가된다[참조: Waage et al.(1987) Lancet 355-357; Girardin et al. (1988) New Engl. J. Med., 319:397-400; Scuderi et al. (1988) Lancet 1364-1365; and Kern et al. (1989) Am. J. Med., 87:139-].

동물 또는 사람 환자에 대한 TNF의 투여는 2내지 6시간 후 검출가능한 인터루킨-6(IL-6) 혈청 농도를 가져오는 것으로 보고 되었다[참조: McIntosh et al. (1988) J. Immunol. 143: 162-167; Jablons et al, J. Immunol., Vol. 142, pg. 1542 (1989); 및 Brouckaert et al, J. Exp. Med., Vol. 169, pg. 2257(1989)]. B세포 자극 인자-2, 인터페론-β₂, 또는 간세포 자극 인자로서 또한 공지된 IL-6은, B세포를 성숙시키는 T세포-기원한 당단백질로 확인되었다(참조: Kishimoto, Blood 74:1-10). 더욱 최근에, IL-6은 간세포내에서 급성상 단백질의 유도와 조혈성 원시 세포(hematopoietic progenitor ceIL) 및 T세포상에서의 작용을 포함하는, 다상 유전성 생물학적 활성을 지니고 있는 것으로 입증되었다[참조: Geiger et al, Eur. J, Immunol., Vol. 18, pg. 717(1988); Marinjovic et al., J. Immunol., Vol. 1. 42, pg. 808(1989); Morrone et al, J. Biol. Chem., Vol. 263, pg. 12554(1988);및 Perlmutter et al, J. Clin. Invest., Vol. 84, pg. 138(1989)]. IL-6에 대한 항체 길항제는 패혈병성 쇼크의 마우스 모델에 있어서 생존기간을 연장시키는 것으로 보고되어 있다[참조: Starnes et al. J. Immunol, Vol. 145, pgs. 4185-4191(1990)].

스타필로코커스 장독소 B(SEB)는 초항원이며, 독성 쇼크 반응을 유발시킬 수 있다. 이 반응은 일련의 T세포 세브셋의 활성화에 의해 유발되며, 심각한 T-세포-매개된 전신 면역 반응을 초래한다. 이러한 반응은 T세포 매개된 반응의 특징이므로 IL-10, 또는 이의 동족체 또는 길항제는 이 반응을 치료하는데 유용하다. 대사적으로, 초항원은 T세포 수용체의 Vβ요소와 직접적으로 상호작용하여 MHC 제II형 특이성이 비교적 거의 없는 T세포를 활성화시키는 것으로 여겨진다[참조: Herman et a1.(1991) in An. Rev. Immunol. 9:745-772].

현재, 패혈증, 균혈증 등과 같은 패혈병성 상태는 통상적으로 항미생물성 화합물로 치료한다. 패혈증은 카테테르 삽입 또는 외과 수술시 세균 감염이 종종 발생하는 곳인 병원 환경에서는 흔하다. 그러나, 이와 같은 상태가 쇼크와 연관되는 경우, 부분적으로는 감염에 대한 반응시 유발된 사이토킨에 의해 유발되는 쇼크 증후를 완화시키기 위한 치료요법에 있어 효과적인 보조 방법이 존재하지 않는다[참조: Young(1985) "" pgs. 468-470, in MandeIL et al., (eds) Principles and Practice of Infectious Diseases (2nd Ed.) John Wiley ＆ Sons, New York]. 특히, 항생제를 사용한 치료는 미생물의 사멸 및 쇼크 반응을 유발하는 세균 산물의 방출을 가져온다.

세균성 패혈증 및 관련된 패혈병성 쇼크는 외과 수술, 복부 외상의 특정 유형과 암 또는 조직 이식 치료요법에 따른 면역 억제, 또는 기타 의학적 환경으로부터 초래된 감염에 의해 유발되는 흔하고도 치명적인 상태이다. 미합중국에서는, 매년 700,000명의 환자들이 세균성 감염에 의해 유발되는 패혈병성-쇼크로 고생한다. 이들중, 일부인 160,000명은 패혈병성 쇼크 증후로 진행하며, 이 결과 일부인 50,000명이 사망한다. 매년 독성 쇼크로 괴로움을 겪는 사람은 적어지지만, 통상적으로 이 반응의 심각성은 더욱더 생명을 위협하고 있다.

감염에 대한 이들 심각한 면역학적 반응의 증요성 측면에서 볼때, 미생물적으로-유도된 쇼크를 예방학적으로 또는 치료학적으로 치료하기 위한 효과적인 기술이 크게 요구되고 있다. 본 발명은 이들 쇼크 및 기타 심각한 면역학적 반응을 치료하기 위한 조성물 및 방법을 제공한다.

[발명의 요약]

본 발명은 유효량의 인터루킨-10, 또는 이의 동족체 또는 길항제를 투여함으로써 미생물에 의해 유발된 다양한 쇼크 증후를 치료하는 방법을 제공한다. 본 발명은 또한 이들 인터루킨-10 관련 화합물을 포함하는 약제학적 조성물을 포함한다. 바람직하게, 본 발명의 인터루킨-10은 하기 아미노산 서열로서 정의된 개방 판독 프레임의 성숙한 폴리펩타이드로 이루어진 그룹으로부터 선택된다:

상기 서열식에서, 표준 3문자의 약자는 N-말단으로부터 출발하는, L-아미노산을 나타낸다.

IL-10의 이들 2개 유형은 때때로 각각 사람 IL-10(또는 사람 사이토킨 합성 억제 인자) 및 바이러스 IL-10(또는 BCRF1)으로서 언급한다[참조: Moore et a1. (1990) Science 248:1230-1234; Vieira et al.(1991) Proc. Natl. Acad. Sci. 88:1172-1176; Fiorentino et al.(1989) J. Exp. Med. 170:2081-2095; and Hsu et al.(1990) Science 250:830-832]. 결실 및 삽입 변이체를 포함하는, 천연 단백질 서열의 돌연변이체[예: 대립 형질성 변이체 및 뮤테인(mutein)]는 또다른 조성물이며 이의 용도는 본원에 기술되어 있다.

더욱 바람직하게는, 본 발명의 방법에 사용된 성숙한 IL-6은 하기 서열로 이루어진 그룹중에서 선택된다:

본 발명은 부분적으로는 IL-10이 바람직하지 않은 염증 반응(예: 패혈병성 쇼크)을 매개된하는 몇몇 사이토킨의 합성과 초항원에 의한 T세포 활성화의 결과로써 독성 쇼크-유형 증후를 초래하는 상태 모두를 억제한다는 발견에 기초한다. 역으로, IL-10 길항제는 동일한 면역 반응을 증가시키며, 이러한 증가는 사실상 기타의 임상적인 상황(예: 특정의 암 및 자가면역 모델)시 바람직하다.

본 발명은 IL-10, 또는 동족체 또는 이의 길항제를 사용하여, 면역기능을 조절하고, 특히 미생물적으로 유발된 쇼크의 유해 효과를 방지 및/또는 감소시키거나 B세포 분화 또는 발육을 제어하는 방법에 관한 것이다. 본 발명은 또한 이 방법을 수행하기 위한, IL-10, 또는 이의 동족체 또는 길항제를 포함하는 약제학적 조성물을 포함한다. 본 발명에 사용하기 위한 IL-10은 바람직하게 pH5C, pH15C 및 pBCRF1(SRA)[이들 각각은 기탁번호 제68191호, 제68192호 및 제68193호하에 아메리칸 타입 컬춰 컬렉션(American Type Culture Collection; ATCC, Rockvi1le, Maryland 소재)에 기탁되어 있다]의 cDNA 삽입체로서 정의된 개방 판독 프레임에 의해 암호화된 성숙한 폴리펩타이드 그룹으로부터 선택된다.

IL-10은 단핵세포 또는 단핵세포+천연 킬러(NK) 세포에 의한 TNFα 및 IFNγ합성을 억제하나, NK세포 단독에 의한 이의 합성은 억제하지 않는다. IL-4는 IL-2 활성화된 NK세포로부터의 사이토킨 분비를 직접적으로 억제한다. 이 사실은 IL-4 및 IL-10이 NK세포상에서 분명한 경로를 통해 작용함을, 예를 들면 IL-10 작용은 난핵세호의 참여를 필요로함을 나타낸다. IL-10은 IL-2 활성화된 NK세포로부터의 사이토킨 분비를 억제하지만 임파구-활성화될 킬러(LAK) 활성을 억제하지 않으며, 이 사실은 IL-2 유도된 사이토킨 합성 및 LAK 활성이 상이한 메카니즘에 의해 조절됨을 나타낸다.

IL-1O은 분명하게는 단핵세포 및/또는 활성화된 대식세포 또는 NK세포에 의한 프로-염증성 사이토킨의 생성을 억제하는 자체 능력의 메카니즘에 의해, 소염 활성을 지니는 것으로 입증된다. 사이토킨 생성의 억제는 전사 단계에서 일어난다.

본원에서 IL-1O은 또한 포유동물내 초항원-유도반응, 예를 들면 T세포 매개된 반응을 조절하는 것으로 입증되었다. 스타필로코커스 장독소 B(SEB)는 심각한 독성 쇼크 반응을 유발시킬 수 있으며, 마우스내 연구는 생체내에서의 효능을 입증한다. 초항원에 노출과 동시에 또는 심지어 노출후 IL-10의 투여는 높은 SEB 노출로부터 치사도를 예방하는데 효과적이다.

그람-음성 세균 리포폴리사카라이드(LPS)는 포유동물 내에서 패혈병성 쇼크반응을 유발한다. 이 내독소-유발된 쇼크반응은 상술한 바와 같이, 자극된 대식세포/단핵세포로부터 TNFα,IL-1 및/또는 IL-6의 방출을 초래한다. 그러나 IL-10의 투여로 IL-1α, IL-1β, IL-6, IL-8 및 GM-CSF의 유도된 발현이 억제된다. 이 데이타는 심지어 LPS가 출현한 후 투여한 경우에도, 장독소-유발된 쇼크로부터 마우스를 보호할 수 있음을 입증하고 있다. 역으로, 항-IL-10 항체는 보호 효과를 차단시킬 수 있다. 또한 이 연구는 항-IL-10 처리된 마우스가 또한 순환하는 종양괴사 인자 α(TNFα), 순환하는 IL-6 및 내독소-유발된(예:LPS-유발된) 쇼크로의 위험성에 있어 실제적인 상승 수준을 나타낸다.

항-IL-10항체는 또한 기타 면역 질환을 치료하는데 사용된다. 자료는 장기간에 걸쳐 항-IL-10 항체를 어린 마우스에게 투여함으로써 B세포의 Ly-1 아부류를 고갈시킬 수 있음을 나타낸다. 이것은 Ly-1 B세포 발육의 조절인자로서 IL-10의 관련성을 나타내며, Ly-1 B세포를 고갈시키는 수단을 제공한다. 이 관측은 자가 면역 질환의 치료를 통찰하도록 한다.

자가면역 반응의 진행에는 복잡한 T세포 상호작용을 필요로 한다. 마우스의 NZB/W 균주는 낭창(전신홍반성 낭창, SLE) 프론(prone)이며 자가면역 질환 치료용의 치료 시약을 시험하기 위한 모델을 제공한다. 더우기, 이들 마우스는 기타 B세포 유형과 비교되는 Ly-1 B세포의 특정 비율을 나타낸다. 생체내 마우스 실험은 NZB/W 균주를 사용하여 기술한다.

이들 마우스에 대한 항-IL-10의 처리는, 전체 생존율에 의해, 단백뇨증 또는 신장신염의 진행에 의해, 또는 항체 역가로 기록되는 것으로서 자가면역 반응의 개시를 실제적으로 지연시킨다. 이 결과는 항 IL-10 치료가 기타의 포유동물, 예를 들면 사람을 치료하는데 유용함을 나타낸다.

광범위한 단일세포 및 다수세포 발현 시스템(예: 숙주-발현 벡터 배합물)을 사용하여 본 발명의 방법에 사용하기 위한 폴리펩타이드를 제조할 수 있다. 숙주 세포 유형에는 세균, 효모, 곤충, 포유동물 등이 포함되나, 이에 제한되지는 않는다. 특수한 발현 시스템을 선택하고/하거나 변형시키기 위한 안내서 다수가 시판되고 있다[참조: de Boer 및 Shepard "Strategies for Optimizing Foreign Gene Expression in Escherichia coli," pgs. 205-247, in Kroon (ed.) Genes: Structure and Expression(John Wiley ＆ Sons, New York, 1983), 이것은 몇몇의 이.콜라이 발현 시스템을 기술하고 있다; Kucherlapati et al., Critical Reviews in Biochemistry, Vol. 16, Issue 4, pgs. 349-379(1984), 및 Banerji et al., Genetic Engineering, Vol. 5. pgs. 19-31(1983), 이것은 포유동물 세포를 형질감염 및 형질전환시키기 위한 방법을 기술하고 있다; Reznikoff 및 Gold, eds., Maximizing Gene Expression (Butterworths, Boston, 1986) 이것은 이.콜라이, 효모 및 포유동물 세포내에서 유전자 발현시 선별된 화제를 기술하고 있다; 및 Thilly, Mammalian Cell Technology(Butterworths, Boston, 1986) 이것은 포유동물 발현 시스템을 기술하고 있다]. 상기 문헌 각각은 본원에서 참조로 인용한다. 한편, 특수한 cDNA를 연졀시키고/시키거나 증폭시키기 위한 기술 및 조건과 본 발명에 따라 사용하기에 적합한 발현 벡터를 창조하고/하거나 변형시키기 위한 발현 조절 서열을 기술한 다수의 문헌을 입수할 수 있다[참조: Maniatis et al.(1982) Molecular Cloning; A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, New York; Sambrook et al. Molecular Cloning; A Laboratory Manual(2d ed.; vols 1-3), Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, New York; and Ausubel et al.(1987 and periodic supplements) Current Protocols in Molecular Biology, Wiley and Sons, New York], 상기 문헌은 본원에서 참조로 인용한다.

이. 콜라이 발현 시스템은 본원에서 참조로 이용한, 리그스(Riggs)의 미합중국 특허 제4,431,739호에 기술되어 있다. 이. 콜라이내에서의 고 발현용으로 특히 유용한 원핵세포성 프로 모터는 본원에서 참조로 인용한 드 보어(de Boer)의 미합중국 특허 제4,551,433호에 기술된 태크(tac) 프로모터이다. 분비 발현 벡터는 또한 이. 콜라이 숙주용으로 유용하다. 전사될 cDNA가 ompA 단백질의 시그날 펩타이드를 암호화하는 이. 콜라이 ompA 유전자의 부위에 융합됨으로써 결국 완전한 단백질이 세균의 외세포질 영역내로 분비되도록 하는 그라이브(Ghrayeb) 등이 기술한 문헌[참조: EMBO J., Vol. 3, pgs. 2437-2442(1984)]에 기술된 pIN-IIL-ompA 벡터가 특히 유용하다. 미합중국 특허 제4,336,336호 및 제4,338,397호 또한 원핵세포에 대한 분비 발현 벡터를 기술하고 있다. 따라서, 이들을 본원에서 참조로서 인용한다.

다수의 세균 군주는 진핵세포 발현 벡터용으로 적합한 숙주이며 W3110(ATCC No 27325), JA221, C600, ED767, Dm, LE392, HB101, X1776(ATCC No.31244), X2282, RRl(ATCC No. 31343) MRCI와 같은 이. 클라이 균주; 바실러스 서브릴리스(Bacillus subtilus) 균주; 및 살모넬라 타이 피 무리 움(Salmonella typhimurium) 또는 세라티아 마르세센스(Serratia marcescens)와 같은 기타의 장세균과, 다양한 종의 슈도모나스(Pseudomonas)가 포함된다. 이. 콜라이 K12 X1776과 같은 진핵세포성 단백질의 발현에 유용한 세균 균주를 유도시키기 위한 일반적인 방법이 커티스 3세(Curtis III)의 미합중국 특허 제4,190,495호에 기술되어 있으며, 이 문헌을 본원에서 참조로 인용한다.

원핵세포 및 진핵세포성 미생물외에, 다세포 유기체로부터 기원한 세포를 포함하는 발현 시스템이 또한 본 발명의 단백질을 생산하는데 사용될 수 있다. 포유동물 발현 시스템의 해독후 프로세싱 장치는 생물학적으로 활성인 포유동물 단백질을 더욱 생성할 수 있으므로 특히 흥미롭다. 몇몇의 DNA 종양 바이러스는 포유동물 숙주용 벡터로서 사용되어 왔다. 특히 중요한 것은 세균의 복제 조절 서열에 커플링된 SV40 복제, 전사 및/또는 해독조절 서열을 포함하는 다수의 벡터(예:pcD벡터)이다[참조: 0kayama 및 Berg에 의해 개발됨, Ml1. Cell. Biol., Vol. 2, pgs. 161-170(1982) 및 Mol. Cell. Biol., Vol. 3, pgs. 280-289(1983), 및 Takebe et al이 진전시킨 Mol. Cell. Biol., Vol. 8, pgs. 466-472(1988)]. 따라서, 이들 문헌은 본원에서 참조로 인용한다. 기타 SV40-기본한 포유동물 발현 벡터는 본원에서 참조로 인용한 문헌[참조: Kaufman and Sharp, in Mol. Cell. Biol., Vol. 2, pgs. 1304-1319(1982), 및 Clark et al., in U.S. patent 4,675,285]에 기술된 것을 포함한다. 원숭이 세포가 상기 벡터용으로 바람직한 숙주이다. SV40 오리 서열(ori seguence) 및 완전한 A유전자를 함유하는 이와 같은 벡터는 원숭이 세포내에서 자동적으로 복제되어, 비자동적으로 복제되는 플라스미드보다 더욱 늪은 카피 수 및/또는 더욱 안정한 카피수를 수득할 수 있게 한다. 더우기, 완전한 A유전자가 없는 SV40 오리 서열을 함유하는 벡터는 COS7 원숭이 세포내에서 높은 카피수(안정하지는 않다)로서 자가적으로 복제할 수 있으며[참조: Gluzman의, Cell, Vol. 23, pgs. 175-182 (1981)] ATCC No. CRL 1651로서 시판된다. 상기 SV-40-기준한 벡터는 또한 숙주 세포 DNA내로 통합시킴으로써, 마우스 세포와 같은 기타의 포유동물 세포를 형질전환시킬 수 있다.

다세포 유기체는 또한 본 발명의 폴리펩타이드를 생산하기 위한 숙주, 예를 들면 곤충 유충[참조: Maeda et al, Nature, Vol. 315, pgs. 592-594(1985) 및 Ann. Rev. Entomol., pgs. 351-372 (1989); 및 전이종 동물[참조: Jaenisch, Science, Vol. 240, pgs. 1468-1474(1988)]으로서 공급될 수 있다. 이들 문헌들은 또한 본원에서 참조로서 인용된다.

I 인터루킨-10 및 동족체에 대한 검정

IL-1Os로서 총칭되는, IL-10 관련된 단백질 및 펩타이드는 검정 및 단위의 기본을 형성할 수 있는 몇몇의 생물학적 활성을 나타낸다. 특히, IL-10s는 동유전형의 항원 존재 세포(APCs) 및 항원에 노출시킴으로써 하나 이상의 이들 사이토킨을 합성하도록 유도된 T헬퍼-세포의 집단중에서 IFNγ, 임파독소, IL-2, IL-3 및 GM-CSF로 이루어진 그룹중 하나 이상의 사이토킨의 합성을 억제하는 특성이 있다. 이 활성에 있어서, APCs는 복제될 수 없으나, 이의 항원 프로세싱 장치가 작동하도록 처리된다. 이것은 T세포와 혼합하기 전에 예를 들면, 약 1500내지 300OR(γ 또는 X-선)을 사용하여 APCs를 조사함으로써 편리하게 달성시킨다(마우스 IL-10에 대한 검정을 위해 표 2 참조).

[표 2]

증식 검정에 대해 변형시킨 IL-10(CSIF) 검정

항원 존재 세포(APC)

1) cRPMI의 튜브내에 BALB/c 비장(대략 1O⁸세포/비장)을 넣는다.

2) 10ml짜리 주사기의 스트레이너(strainer) 및 배럴(barrel)을 사용하여 단일 세포 현탁액을 제조하고(후드내의 멸균기술 사용), 1200rpm에서 회전시킨다.

3) 5ml짜리 냉 NH₄Cl(H₂O중 0.83%)중에 펠렛을 재현탁시킨다. 12OOrpm에서 다시 회전시킨다.

4) 5ml짜리 cRPMI(검정을 위한 IL-2는 없음)중에 펠렛을 재현탁시키고 회전하여 세척한다.

5) 5ml짜리 cRPM1중에서 재현탁하여 계수한다.

6) 3000rad.(20분간)로 조사한다.

7) 세포 농도를 8 × 10⁶/ml로 조절한다(검정시 50ml/웰을 가하여 최종 4 ×1O⁵/웰이 되게 한다). (미세적정 플레이트중에 최종 용량이 1OOml가 되게 하거나 세척하는 경우 항-IL-10 항체를 가하기 위해 최종 용량이 50ml가 되도륵 IL-10을 적정한다).

Th1 세포

1) 검정 3일전에 HDK1 세포의 앰플을 IL-2를 함유하는 25ml짜리 cRPMI 2개내로 직접 해동시킨다.

2) 이후 세포를 점검하고 필요할 경우 ½ 또는 ⅓로 분할한다.

3) 검정하는날 세포를 1200rpm에서 회전시킨다. 플레이팅하기 직전에 5ml중에 재현탁시킨다. cRPMI 및 계수한다[트립판 블루우(trypan blue) 2중에 1로 희석]

4) 농도를 2 ×10⁵/ml로 재조절하고 웰당 50ml를 가한다(최종 10⁴세포/웰). 플레이팅 하기전에 KLH를 가하여 40Omg/ml의 농도를 수득한다(이로써 최종 농도는 1OOmg/ml가 된다).

조절

KLH가 없는 Th1 세포 50ml

TH1 세포 50ml + KLH

비장 APC 50ml ± IL-10(최고의 농도가 양호).

최종 용량이 200ml가 되게 함.

검정 순서

1) APC를 제조한다.

2) IL-10을 플레이트한다.

3) Th1 세포를 제조하여 플레이트한다.

4) APC를 플레이트한다.

48시간 후, IFNγ ELISA를 위해 상층액 10Oml를 제거한 다음;³H-티미핀(1mCi/웰)을 가하고 다음날 아침 하베스트한다.

한편, 사이토킨 억제는 제1 또는, 바람직하게는 제2의 혼합된 임파구 반응(MLR)에서 검정할 수 있으며, 이 경우에 동유전자형의 APCs를 사용할 필요는 없다. MLR는 당해 분야에 잘 공지되어 있다[참조: Bradley, pgs. 162-166, in Mishell et al, eds. Selected Methods in Cellular Immunology(Freeman, San Francisco, 1980); and Battisto et al, Meth. in Enzymol., Vol. 150, pgs. 83-91(1987) 이는 본원에서 참조로 인용하였다]. 명확하게는, 이종 임파구 세포 2집단을 혼합하고, 혼합전에 처리한 집단중 하나는 조사에 의해 증식을 방지시킨다. 바람직하게는, 세포집단을 보충 배지(예: 10%/ 태아 송아지 혈청이 있는 RPMI 1640)중 약 2 × 10⁶세포/ml의 농도에서 제조한다. 대조군 및 시험 배양물 모두에 대해서, 검정을 위한 각 집단 0.5ml를 혼합한다. 제2의 MLR을 위하여 7일후 제1 MLR중에 잔류하는 세포를 새로이 제조하고 조사한 자극인자 세포로써 재-자극시킨다. IL-10을 함유하는 것으로 추정되는 샘플을 혼합시기에 시험 배양물에 가하고, 대조군 및 시험배양물 모두를 혼합한지 1내지 3일후에 사이토킨 생성에 대해서 검정할 수 있다.

T세포 집단 및/또는 IL-1O 검정을 위한 APC 집단을 수득하는 것은 당해 분야에 잘 공지되고 기술되어 있는 기술을 사용한다[참조: 본원에서 참조로 인용한, DiSabato et al., eds., Meth. in Enzymol., Vol. 108 (1984)]. 바람직한 IL-10 검정용 APCs는 말초 혈액 단핵세포 또는 조직 대식세포이다. 이들은 본원에서 참조로 인용한 문헌[참조: Boyum, Meth. in Enzymol., Vol. 108, pgs. 88-102(1984); Mage, Meth. in Enzymol., Vol. 108, pgs. 118-132 (1984); Litvin et al., Meth. in Enzymol., Vol. 108, pgs. 298-302 (1984); Stevenson, Meth. in Enzynol., Vol. 108, pgs. 242-249(1989); and Romain et al, Meth. in Enzymol., Vol. 108, pgs. 148-153 (1984)]에 기술된 표준 기술을 사용하여 수득한다. 바람직하게는 헬퍼 T세포를 IL-1O 검정중에서 사용하는데, 이 T세포는 우선 말초 혈액, 비장 또는 임파절로부터 임파구를 분리하고, 예를 들면 패닝(panning) 또는 유동 혈구 계산에 의해서, 시판되는 항-CD4 항체[예: 미합증국 특허 제4,381,295호에 기술되어 있고 Ortho Pharmaceutical Corp.에서 시판하는 OKT4]를 사용하여 헬퍼 세포를 선택한다. 마우스 항- CD4는 Becton-Dickson 또는 Pharmingen에서 시판하고 있다. 필요한 기술은 본원에서 참조로 인용한 문헌[참조: Boyum, Scand. J. Clin. Lab. Invest., Vol. 21 (Supp1. 97), pg. 77 (1968); Meth. in Enzymol., Vol. 108(상기 인용), and in Bram et al, Meth. in Enzymol., Vol. 121, pgs. 737-748 (1986)]에 완전히 기술되어 있다. 일반적으로, PBLs는 피클-하이파크 밀도 구배 원심분리기(Ficoll-Hypaque density gradient centrifugation)에 의한 신선한 혈액으로부터 수득한다.

다양한 항원을 검정, 예를 들면 키홀 림펫 헤모시아닌[keyhole limpet hemocyanin(KLH)], 포울 γ-글로불린(fowl γ-globulin) 등에 사용할 수 있다. 더욱 바람직하게는, 항원 대신에 헬퍼 T세포를 검정시 항-CD3 모노클로날 항체, 예를 들면 미합중국 특허 제4,361,549호에 기술된 OKT3로 자극시킨다.

대조군 및 시험 샘플에서 사이토킨 농도는 표준 생물학적 및/또는 면역화학적 검정으로서 측정한다. 정제된 사이토킨이 유용한 경우 특이적인 사이토킨을 위한 면역화학적 검정의 순서는 당해 분야에 잘 공지되어 있다[참조: 본원에서 참조로 인용하고 해당 분야의 확실한 문헌의 예인 Campbell, Monoclonal Antibody Technology(Elsevier., Amsterdam, 1984); Tijssen, Practice and Theory of Enzyne Immunoassays(Elsevier, Amsterdam, 1985); 및 U.S. patent 4,486,530]. 사람 IL-2, 사람 IL-3 및 사람 GM-SCF에 대한 ELISA 키트는 Genzyme Corp(Baston, MA 소재)에서 시판되며; 사람 IFNγ에 대한 ELISA 키트는 Endogen, Inc. (Boston, MA 소재)에서 시판된다. 사람 임파독소에 대한 방사면역 검정에서 사용될 수 있는[참조문헌: Chard, An Introduction to Radioimmunoassay and Related Techniques(Elsevier, Amsterdam,1982)], 사람 임파독소에 대해 특이적인 폴리클로날 항체는 Genzyme Corp.에서 시판된다.

상기 나열한 사이토킨의 생물학적 검정은 또한 IL-10 활성을 측정하는데 사용할 수 있다. 사람 임파독소에 대한 생물학적 검정은 본원에서 참조로 인용한 문헌[참조: Aggarwal, Meth. in Enzymol., Vol. 116, pgs. 441-447(1985), 및 Matthews et al, pgs. 221-225, in Clemens et al, eds., Lymphokines and Interferons: A Practical Approach(IRL Press, Washington, D. C., 1987)]에 기술되어 있다. 사람 IL-2 및 GM-CSF는 각각 기탁번호 TIB 214 및 CCL 246하에 ATCC로부터 입수 가능한 인자 의존성 세포주 CTIL-2 및 KG-1으로 검정할 수 있다. 사람 IL-3은 연질 아가 배양물내에서 조혈성 세포 쿨로니의 광범위한 형성을 자극시키는 능력에 의해 검정될 수 있다[참조: Metcalf, The Hemopoietic Colony Stimulating Factors(Elsevier, Amsterdem, 1984)]. INFγ는 항-바이러스성 검정을 사용하여 적량할 수 있다[Meager, pgs. 129-147, in Clemens et al, eds. (상기 인용)]. 마우스 등량체는 또한 적절한 세포주를 사용하여 검정할 수 있다.

사이토킨 생성은 또한 mRNA분석으로서 측정할 수 있다. 사이토킨 mRNA는 문헌[참조: White et al., J. Biol. Chem., Vol. 257, pgs. 8569-8572 (1982) 및 Gillespie et al., U.S. patent 4,483,920]에 기술된 바와 같이 세포질성 도트 하이브리드화(cytoplasmic dot hybridization)에 의해 측정할 수 있다. 따라서, 이 문헌도 본원에서 참조로 인용한다. 다른 시도에는 문헌[참조: chapter 6, in Hames et al., eds., Nucleic Acid Hybridization A Practical Approach(IRL Press, Washington, D.C., 1985)]에서와 같이 정제된 RNA을 사용하는 도트 블롯팅이 포함된다. 폴리머라제 쇄 반응(PCR) 기술 또한 사용할 수 있다[참조: 본원에서 참조로 인용한 문헌인, Innis et al.(ed) (1990) PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications, Academic Press, Inc., New York].

몇몇의 경우에, IL-10 활성에 대해 시험할 샘플을 예비 처리하여 검정을 방해할 우려가 있는 예정된 사이토킨을 제거한다. 예를들어, IL-2는 몇몇 세포내에서 IFNγ의 생성을 증가시킨다. 따라서, 검정에 사용된 헬퍼 T세포에 따라서, IL-2는 시험할 샘플로부터 제거할 수 있다. 이러한 제거는 샘플을 표준 항-사이토킨 친화 컬럼위에 통과시킴으로써 편리하게 달성된다.

편리하게는, IL-10 활성 단위를 미합중국 특허 제4,559,310호에 기술되고 기탁번호 CRL 8306하에 ATCC로부터 입수 가능한, MC/9 세포의 IL-4 유도된 증식을 증가시키는 IL-10의 능력 측면에서 정의한다. 1단위/ml는 연속되는 검정시 IL-4 수준 이상으로의 MC/9 증식의 최대 자극의 50%를 수득케 하는 IL-10의 농도로서 정의한다. IL-4 및 IL-10의 2배 또는 3배 희석은 표준 미세적정 플레이트내 50μl배지/웰 중에서 제조한다. 배지는 RPMI 1640, 10% 태아 송아지 혈청, 50μM 2-머캅토에탄을, 2mM 글루타민, 페니실린(10OU/L) 및 스트렙토마이신(10Omg/L)로 구성된다. 배지중에서 희석된 25μl/160U/ml(400U/ml 최종)의 웰에 IL-4를 가하고 밤새, 예를 들면 20내지 24시간동안 배양한다.³H-티미딘(예를 들면, 배지중 50mCi/ml)을 0.5내지 1.0mCi/웰에서 가하고 이 세포를 다시 밤새 배양한 후, 세포를 하베스트하여 혼합된 방사성을 측정한다.

사이토킨 IL-4 및 IL-10의 제조에 대한 일반적인 기술은 본원에서 참조로 인용한 미합중국 특허 제5,017,691호 및 미합중국 연속출원 제07/453,951호를 참조한다.

II. 효능제(agonist) 및 길항제

IL-10 효능제는 IL-10과 이의 수용체의 상호 작용을 모사하는 분자일 수 있다. 이것은 IL-10의 동족체 또는 단편이거나, IL-10 수용체의 리간드 결합 부위 에피토프에 대한 항체, 또는 IL-10의 수용체-상호작용 부위에 결합하는 특수 항체에 대한 항-유전형 항체일 수 있다.

길항제는 수용체 결합에 대해 경쟁하는 단백질 형태를 취할 수 있는데, 예를 들어, 이는 IL-10 결합 또는 IL-10 걸합 분자(예: 항체)를 차단하는 동안 수용체를 활성화시키는 능력을 상실한다.

항체는 천연적으로 존재하는 형태 및 이의 재조합 형태인 IL-10 사이토킨, 단편 및 유사체에 대해 생성될 수 있다. 또한, 항체는 활성 형 또는 불활성 형태로서 IL-10에 대해 생성될 수 있으며, 이 차이는 활성 사이토킨에 대한 항체가 단지 활성 구조로 존재하는 에피토프를 더욱 잘 인지한다는 점이다. 항-유전형 항체는 또한 본 방법에서 정관되며, 강력한 IL-10 효능제일 수 있다.

목적한 항원(예: 사이토킨)의 예정된 단편에 대한, 결합 단편 및 일본 쇄 버젼(version)을 포함하는 항체는 면역원성 단백질과 단편의 접합체를 사용하여 동물을 면역화시킴으로써 생성시킬 수 있다. 모노클로날 항체는 바람직한 항체를 분비하는 세포로부터 제조할 수 있다. 이들 항체는 정상 또는 불활성 동족체에 대한 결합에 대하여 스크리닝(screening)되거나, 효능 또는 길항 활성에 대해 스크리닝된다. 이 모노클로날 항체는 일반적으로 약 1mM 이상의 K_D, 더욱 보편적으로는 약 300μM이상의 K_D, 통상적으로는 약 10μM 이상의 K_D, 및 더욱 통상적으로는 약 30μM 이상의 K_D, 바람직하게는 약 10μM 이상, 및 더욱 바람직하게는 약 3μM 이상의 K_D와 결합한다. 비록 앞서 IL-10에 대해서만 기술했다해도, 유사한 항체는 다른 동족체, 이의 수용체 및 길항제에 대해 생성될 것이다.

항원 결합 단편을 포함하는, 본 발명의 항체는 현저한 진단 또는 치료학적 가치가 있다. 이것은 IL-10 수용체에 결합하여 수용체에 대한 리간드 결합을 억제하거나 IL-10 능력을 억제하여 생물학적 반응을 이끌어내는 강력한 길항제일 수 있다.

IL-10 또는 단편은 기타 물질, 특히 면역원으로서 사용될 융합되거나 공유적으로 결합된 폴리펩타이드로서의 폴리펩타이드에 연결될 수 있다. 사이토킨 및 이의 단편은 키롤 림페트 헤모시아닌(keyhole limpet hemocyanin), 소 혈청 알부민, 파상풍 독소 등과 같은 다양한 면역원에 융합되거나 공유적으로 결합될 수 있다[참조: 폴리글로날 항 혈청 제조방법 기술시 본원에서 참조로서 인용한 문헌인, Microbiology, Hoeber Medical Division, Harper and Row, 1969; Landsteiner(1962) Specificity of Serological Reactions, Dover Publications, New York, and Williams et al. (1967) Methods in Immunology and Immunochemistry. Vol. 1, Academic Press, New York]. 대표적인 방법에는 항원을 사용한 동물의 초면역화가 포함된다. 다음 동물의 혈액을 반복된 면역화 직후에 수집하고 γ글로불린을 분리한다.

일부 예에서는, 마우스, 설치류, 영장류, 사람 등과 같은 다양한 포유동물 숙주로부터 모노클로날 항체를 제조하는 것이 바람직하다. 이와 같은 모노클로날 항체 제조기술의 설명은 문헌[Stites et al. (eds) Basic and Clinical Immunology(4th ed.), Lange Medical Publications, Los Altos, CA, 및 여기서, 인용한 참조 문헌; Harlow and Lane (1988) Antibodies: A Laboratory Manual, CSH Press; Goding (1986) Monoclonal Antibodis: Principles and Practice (2d ed) Academic Press, New York; Coligan et al.(eds; 1991 and periodic supplements) Current Protocols in Immunology, Wiley and Sons, New York]에서 찾을 수 있으며, 특히 코흘러 및 밀스타인의 문헌[참조: Kohler 및 Milstein (1975) in Nature 256:495-497]에서는 모노클로날 항체의 생성 방법을 기술하고 있다. 이들 문헌 각각은 본원에서 참조로 인용하였다. 간략히 요약하면, 이 방법에는 면역원을 동물에 주사함이 포함된다. 다음 동물은 참수시켜 이 동물의 비장으로부터 세포를 수거하고, 이를 골수종 세포와 융합시킨다. 이로써 골수증 모 세포와는 다른, 선택 조건하에서 실험관내 재생성이 가능한 하이브리드 세포(hybrid cell) 또는 "하이브리 도마(hybridoma)"가 수득된다. 다음 하이브리도마 집단을 선별하여 개개 클론을 분리하며, 이들 각각은 면역원에 대해 단일 항체종을 분비한다. 이 방법에서, 수득된 개개 항체종은 면역원성 물질상에서 인지된 특이 부위에 대한 반응에서 생성된 면역 동물로부터의 비치사되어 클로닝된 단일 B세포의 산물이다.

다른 적합한 기술은 항원성 폴리펩타이드에 대한, 또한 달리는 파아지 또는 유사한 벡터중에서 항체의 하이브러리의 선택에 대한 임파구의 실험관내 노출을 포함한다[참조: 본원에서 참조로 인용한 문헌인, Huse et al.(1989) "Generation of a Large Combinatorial Library of the Immunoglobulin Repertoire in Phage Lambda," Science 246:1275-1281; 및 Ward et al.(1989) Nature 341:544-546], 키메라성 또는 사람화된 항체를 포함하는, 본 발명의 폴리펩타이드 및 항체는 변형되거나 변형되지 않은 채로 사용될 수 있다. 제조합 면역글로불린 또한 생성될 수 있다[참조: 본원에서 참조로 인용한 문헌인, 미합중국 특허 제4,816,567호].

사이토킨 또는 이의 수용체에 대하여 생성된 항체는 효능제 또는 길항제 특성을 나타낼 수 있는 항-유전형 항체를 생성하는데 사용될 것이다. 이것은 본원에 기술된 바와 같이 다양한 면역학적 반응을 조절하는데 유용하다.

III. 정제 및 약제학적 조성물

본 발명의 폴리펩타이드가 형질전환된 효모 또는 포유동물 세포의 분비된 생성물로서의 가용성 형태로 발현되는 경우, 이것은 황산암모늄 침전, 이온 교환 크로마토그래피, 겔 여과, 전기 영동, 친화 크로마토그래피 및/또는 기타의 방법[참조: 본원에서 참조로 인용하고 이와 같은 정제를 기술하는 문헌인, "Enzyme Purification and Related Techniques," Methods in Enzymology, 22:233-577(1977), and Scopes, R., Protein Purification: Principles and Practice(Springer-Verlag, New York, 1982)]의 단계를 포함하는 당해 분야의 표준 방법에 따라 정제할 수 있다. 한편, 본 발명의 폴리펩타이드를 예를 들면, 응집체, 봉입체등과 같은 불용성 형태로 발현시키는 경우, 이것은 원심분리에 의해 파괴된 숙주 세포로부터 봉입체를 분리하고, 카오트로프제(chaotropic agent) 및 환원제를 사용하여 봉입체를 가용화하며, 용해된 혼합물을 희석시키고, 카오트로프제 및 환원제의 농도를 저하시킴으로써 폴리펩타이드가 생물학적으로 활성인 구조를 지니도록 하는 것을 포함하는, 당해 분야의 표준방법에 의해 정제할 수 있다. 후자의 방법은 본원에서 참조로 인용한 하기 문헌에 기술되어 있다[참조: Winkler et al, Biochemistry, 25: 4041-4045(1986); Winkler et al, Biotechnology, 3: 992-998(1985); Koths et al, U.S. patent 4,569,790; 및 European patent applications 86306917.5 and 86306353.3].

본원에서 사용된 것으로서 "유효량"은 예를 들면 오한, 혈관 수축, 정신 착란, 관류 부전(hypoperfusion), 과 고체온 등과 같이 인지된 증후에 의해 측정되는 것으로서의 쇼크 상태를 회복하거나 예방하는데 충분한 양을 의미한다. 특정 환자에 대한 유효량은 치료할 패혈증의 상태 및 유형, 환자의 전체 건강 상태, 투여 방법, 부작용의 중증도 등과 같은 인자에 따라 변할 수 있다. 일반적으로 IL-10 반응제는 반응제 유효량과 약제학적 담체를 포함하는 약제학적 조성물로서 투여된다[참조: 본원에서 참조로 인용한 문헌인, Kaplan and Pasce (1984) Clinical Chemistry: Theory, Analysis, and Correlation, Mosby and Co., St. Louis, MO; 및 Gilman et al.(1990) Goodman and Gilmans: The Phamacological Basis of Therapeutics(8th ed.), Pergamon Press]. 특정의 적용에 있어서, IL-10 치료학적 반응제는 항미생물성 조성물을 포함하는, 기타의 약제학적으로 활성인 성분과 합할 수 있다.

약제학적 담체는 본 발명의 조성물을 환자에게 이동시키기에 적합한 상용성이고, 무독성인 물질일 수 있다. 이와 같은 약물의 비경구 투여에 유용한 다수의 조성물은 공지되어 있다[참조: Remington's Pharmaceutical Science, 15th Ed.(Mack Publishing Company, Easton, PA 1980)]. 한편 본 발명의 조성물은 이식가능하거나 주사 가능한 약물 이동 시스템으로써 환자 체내에 도입시킬 수 있다[참조: 본원에서 참조로 인용한 문헌인, Urquhart et al., Ann. Rev. Pharnncol. Toxicol., Vol. 24, pgs. 199-236 (1984); Lewis, ed. Controlled Release of Pesticides and Pharmaceuticals (Plenum Press, New York, 1981); U.S. patent 3,773,919; U.S. patent 3,270,960].

비경구 투여시, IL-10은 약제학적 담체와 배합된 단위 용량 주사 형태(액제, 현탁제, 유제)로 제형화된다. 이와 같은 담체의 예에는 정상적인 염수, 링거액, 덱스트로즈 용액 및 핸크스 용액(Hank's solution)이 있다. 고정 오일 및 에틸 올레에이트와 같은 비수성 담체를 또한 사용할 수 있다. 바람직한 담체는 5% 덱스트 로즈/염수이다. 담체는 등장성 및 화학 안정성을 증진시키는 물질(예: 완충제 및 방부제)와 같은 부가제 소량을 함유할 수 있다. IL-10 반응제는 바람직하게는 실제적으로 응집체가 없고 약 5내지 20mg/㎖ 범위 농도의 기타 단백질의 정제형으로 제형화됨이 바람직하다. 바람직하게는, IL-10을 연속적으로 주사함으로써 하루에 약 50내지 800mg 범위의 양(즉, 약 1내지 16㎎딩/kg/일)이 전달되도록 투여한다. 매일 주사량은 부작용 및 혈액 세포수를 기록한 것을 기준으로 하여 변할 수 있다.

비록 특정의 길항제가 광범위한 용량 범위, 예를 들면, 보다 높은 용량을 필요로 할 수 있다 해도, 유효량의 IL-1O 효능제 또는 길항제를 측정하는데 있어 유사하게 고려할 수 있다.

IV. 생물학적 관측 및 메카니즘

비록 하기 제시한 메카니즘에 부합되지 않는다해도, 하기의 기술은 IL-10 동족체, 효능제, 및 길항제의 용도 및 적용으로의 통찰력을 제공한다. 면역 시스템 기능, 진행, 및 분화에 대한 유용한 배경은 본원에서 참조로 인용한 문헌[참조: Paul(ed) (1989) Eundamental Immunology (2d ed) Raven Press, New York]에서 제공된다. 기타 문헌[참조: Chapters 26 on inflammation, 28 on delayed type hypersensitivity, and 31 on autoimmunity]도 특히 본원에서 기술한 용도와 관련되어 있다.

사람 PBMC 및 정제된 NK세포내 IL-2에 의해서 유도된 사이토킨 합성 및 LAK활성에 있어서 IL-4 및 IL-1O의 효과는 연구 A에서 시험한다. IL-4 및 IL-10 모두는 PBMC에서 IL-2-유도된 IFNγ 및 TNFα합성을 억제한다해도, 단지 IL-4만이 정제된 NK세포에 의한 IL-2-유도된 IFNγ합성을 억제한다. 즉 IL-4 및 IL-10은 상이한 메카니즘에 의해서 NK세포 사이토킨 합성을 억제한다.

TNFα생성을 조사하는 실험 결과는 유사한 결론을 제안한다. 그러나 이 경우, 단핵세포는 또한 이 사이토킨을 생성한다. IL-10은 NK세포에 의한 IL-2-유도된 TNFα 합성에 있어 직접적인 효과가 없으나, 단핵세포에 의한 TNFα 생산을 차단시킬 수 있다. NK세포 및 CD14+ 세포 모두를 함유하는 배양물의 IL-2에 의한 자극으로 TNFα생성의 큰 증가, 및 이 증가를 완전히 차단한 IL-10이 수득된다. IL-2는 CD14+ 세포를 활성화하여 추가의 TNFα를 생성시키지 않으므로, 상승적인 증가는 아마도 NK 세포 TNFα합성의 증가를 의미한다. 따라서, IL-10은 단핵세포에 의한 TNFα생성과 NK 세포 TNFα합성시 공동의-자극 효과 모두를 억제하는 것으로 여겨진다.

비록 IL-4 및 hIL-10/vIL-10 모두가 IL-2-자극된 PBMC에 의한 IFNγ 및 TNFα합성을 억제한다해도, 단지 IL-4 만이 IL-2-유도된 LAK 활성을 억제한다. 이 관측은 PBMC 내에서 IL-2-유도된 사이토킨의 생성 및 세포 독성이 상이한 경로를 통해 조절됨을 나타낸다. 이 발견을 IL-2 및 LAK 세포의 임상적인 용도에 있어서 중요하다. IL-2 치료요법과 관련된 문제에는 심장혈관 효과 및 모관 누출 증후가 포함된다. 이러한 부작용의 원인은 명확치 않으나, 암 환자내에서 IL-2에 의해 유도된 TNFα와 같은 사이토킨의 방출이 포함될 수 있다. IL-10이 IL-2-유도된 사이토킨 합성을 억제하나 LAK 활성을 억제하지 않는다는 사실은 사이토킨이 이와 같은 환자 치료를 위한 IL-2와의 배합물에 유용할 수 있음을 제안한다. 더우기, TNFα가 감염된 T 세포 내에서 사람 면역결핍 바이러스의 발현을 유도시킬 수 있다고 제인하고 있는 데이타를 볼때, TNFα의 합성을 억제하는 IL-10의 능력이 이와 관련하여 흥미있다.

이 연구는 또한 사람 IL-10이 단핵세포에 이은 활성화에 의해 비교적 다량으로 생성됨을 입증한다. 역학적 연구는 IL-10의 저 수준이 단핵세포가 활성화된지 7시간 후 관측될 수 있으며, 최대의 IL-10 생성은 활성화된지 28 내지 48시간 후에 일어남을 나타낸다. 이것은 활성화된지 4 내지 8시간 사이에 고 수준으로 분비되는, IL-1α, IL-1β, IL-6, IL-8 및 TNFα의 생성과 비교할 때 비교적 느리다. 이것은 또한 사람 IL-10이 단핵 세포에 의한 사이토킨 생성에 이은 IFNγ, LPS 또는 IFNγ와 LPS의 배합물을 사용한 활성화시 강력한 억제 효과가 있음을 나타낸다. 이 억제 효과는 IL-10 및 v-IL-10 활성 모두를 억제하는 mAb 19Fl에 의해 완전히 중화될 수 있기 때문에 IL-10에 대해 특이적이다. 100U/ml의 농도로 가해진 IL-10은 이어지는 IFNγ(100U/ml) 및 LPS(1㎍/ml)의 배합물에 의한 단핵세포의 90% 이상의 최적 활성화에 의해 IL-1α, TNFα, GM-CSF 및 G-SCF 합성을 억제한다. IL-1β, IL-6 및 IL-8 생성에 있어서 억제 효과는 특히, 단핵세포가 IFNγ 및 LPS의 배합물에 의해 최적으로 활성화되는 경우에 어느 정도 덜 판명되어 있다. 단핵세포에 의한 사이토킨 생성을 억제하는 IL-10의 메타니즘, 즉 IL-10의 효과가 다른 인자를 통해 직접 또는 간접적으로 매개되는지의 여부는, 분명치 않다. IL-1은 섬유아세포, 흉선세포 및 단핵 세포 내에서 IL-6 생성을 유도할 수 있기 때문에, 예를 들어 IL-6 생성의 부분 억제는 감소된 IL-1 생성의 결과이다.

사람 IL-10과 유사한, 사람 세포상에서 생물학적 활성을 지닌 것으로 밝혀진 바이러스-IL-10은 덜 강력한 것으로 시험하였다. 그러나, v-IL-10은 LPS 활성화된 단핵세포에 의한 TNFα 및 GU-CSF 생성을 사람 IL-10과 등일한 정도로 억제시킨다. TNFα 및 GM-CSF 생성에 있어서 v-IL-10의 이러한 억제 효과는 mAb 19Fl에 의해 중화되며, 이는 v-IL-10 효과의 특이성을 나타낸다.

IL-1α, IL-1β, IL-6, IL-8, TNFα, GM-CSF 및 G-CSF 분비의 억제는 전사단계에서 일어난다. IL-10은 노던 및 PCR 분석에 의해 측정되는 바와 같이, LPS에 의해 유도된 사이토킨 특이적인 mRNA 합성을 강력하게 억제한다. PCR 분석은 반-정량적인 방식으로 개개 샘플의 반응 산물을 비교하도록 하는 조건하에서 수행한다. 이것은 β-액틴에 대해 특이적인 프라이머가 있는 cDNA의 증폭으로, 동일한 샘플내에서 노던 및 PCR 분석에 의해 IL-10 mRNA 발현이 측정되는 경우에 수득된 정량적으로 비교되는 결과와 샘플 사이에 등량의 반응 산물을 수득된다는 사실에 의해 확인된다. 또한, 사이토킨 mRNA 발현 수준은 이 배양물의 상층액중에 단백질 수준으로 교정된다. IL-10은 활성화된 단핵세포 중에서 TGFβ nlRNA 발현에 영향을 미치지 못한다. 그러나, TGFβ는 비활성화된 단핵세포 내에서 구조적으로 발현되며 LPS에 의한 단핵세포의 활성화는 TGFβ mRNA 수준에 영향을 미치지 않는다는 사실에 주목해야 한다. 아소얀 등은 문헌[참조 : Assoian et al, (1987) Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 84 : 6020 : 602]에서 단핵세포가 TGFβ mRNA를 구성적으로 발현하며 TGFβ 분비에는 단핵세포 활성화가 요구된다는 사실을 입증하였다. 그러나, IL-10이 TGFβ의 전환에 있어 잠복기로부터 활성형에까지 영향을 미치는 지의 여부는 분명치 않다

IL-10의 생성은 전사 단계에서 IL-4에 의해 억제되는 것으로 밝혀졌다. 비록 IL-10 생성에 있어서 IL-4의 억제 효과가 고려된다해도, IL-4는 IL-10의 생성을 완전하게 차단할 수 없다. 심지어 IL-1, IL-6 및 TNFα의 생성을 완전하게 억제하기에 충분한, 고 농도(400U/ml)의 IL-4을 사용하는 경우에도, IL-4는 IL-10의 생성을 단지 70% 이하로 억제한다. IL-4가 사람 단핵세포에 의한 IL-1α, IL-1β, IL-6, IL-8 및 TNFα의 생성을 억제할 수 있다는 사실은 이미 입증되어 있다. 이 발견은 IL-4가 또한 LPS 활성화된 사람 단핵세포에 의한 IL-8, GM-CSF 및 G-CSF의 생성을 억제하는 사실을 입증함으로써 확립되고 확장된다. 이 억제는 전사 수준에서 일어난다. 더우기 이 데이타는 IL-4 및 IL-10이 사람 단핵세포에 의한 사이토킨 발현시 유사한 효과를 지니고 있음을 나타내며, 사람 면역 시스템에서 사이토킨의 다상유전성 효과 및 풍부성을 강조하고 있다.

흥미있게도, IL-10은 24시간 동안 활성학된 단핵세포 내에서 IL-10 mRNA 합성을 강력하게 억제하기 때문에, 자가 조절성 사이토킨이다. 더우기, 중화 항-IL-10 mAbs의 존재하에 LPS에 의한 단핵 세포의 활성화가 24시간 후 IL-10 mRNA의 증가된 발현을 가져온다는 사실은, 내인성적으로 생성된 IL-10이 또한 IL-10 mRNA 합성을 억제함을 나타낸다. IL-10이 사람 단핵세포에 의한 자체 생성을 하향 조절할 수 있다는 사실은 이 제1의 사이토킨이 네가티브 피이드백 메카니즘(negative feedback mechanism)에 의해 조절되도록 한다. 내인성적으로 생성된 IL-10의 자가 조절효과는 또한 항-IL-10 항체의 존재하에서 LPS 활성화된 단핵세포와 LPS에 의해 IL-1α, IL-1β, IL-6, IL-8, TNFα, GM-CSF, 및 G-SCF의 생성시 관측된다. 그러나, 이 사이토킨의 생성시 내인성 IL-10의 억제 효과는 배양물에 가해진 외인성의 IL-10의 것보다 덜 명백하다. 이것은 IL-1α, IL-1β, IL-6, IL-8, TNFα 및 G-CSF가 활성화한지 4 내지 8시간 후 고 수준으로 생성되는 반면, 최대의 내인성의 IL-10 생성은 활성화한지 24 내지 48시간 후 더욱 많이 일어난다는 사실과 관련되어 있다. 이 주의는 내인성적으로 생성된 IL-10의 강력한 억제 효과가 단핵 세포의 활성화를 수반하여 말기에 생성됨을 보여주는 GM-CSF 분비시에 발견된다는 관측에 의해 지지된다. IL-10 mRNA 합성은 IL-10 단백질 분비를 반영하여 먼저 일어나며, IL-10이 단지 세포 표면상에서 이의 수용체와 상호 작용할 수 있다고 추정할 때, 이 결과는 내인성적으로 생성된 IL-10의 억제 효과가 상대적으로 느리므로 면역 반응의 말기 상태에서 특히 중요할 수 있음을 제시한다.

IL-10은 마우스내에서 우선 Th1 세포에 의한 사이토킨 생성(주로 IFNγ)을

억제하는, Th2 세포에 의해 생성된 사이토킨 합성 억제 인자(CSIF)인 것으로 기술 된다. 사이토킨 생성시 Th1 세포에 의한 m-IL-10의 억제 효과는 대식 세포의 존재를 필요로 한다[참조 : 본원에서 참조로 인용한 문헌인, Fiorentino et al. (1991) J. Immunol. 146 : 3444-3451; Trowbrige et al. (1981) J. Ept'l Med. 154 : 1517-1524; Lambert et al. (1989) Cell. Immunol. 120 : 401-418; 및 Hirsch et al. (1981) J. Ept'l Med. 154 : 713-725]. 여기서 단핵세포가 APC로서 사용되는 경우 IL-10과 v-IL-10은 항원 특이적인 T 세포 증식을 강력하게 억제한다. 또한 항원 특이적인 증식성 T 세포 반응의 감소는 이들 세포상에서 제II형 MHC 항원 발현시 IL-10의 강력한 하향 조절 효과로서 야기된 단핵세포의 감소된 항원 제공 능력에 크게 의존한다. 이 데이다와 함께, IL-10이 단핵세포에 의해 말기에 생성되고 이 세포에 의한 IL-10 분비에 있어 자가조절 효과를 가진다는 본 발견은, IL-10이 항원 특이적인 T 세포 반응의 진행시 강력한 하향 조절 효과를 가짐을 나타낸다. 따라서 IL-10은 항원 추진된 증식성 T 세포 반응을 정지시키는데 주요한 역할을 할수 있다. 단핵 세포에 의해 생성된 IL-10이 또한 T 세포 활성화에 있어서 강력한 자가조절 피이드백 활성을 지닐 수 있다는 사실은 단핵세포에 이은 LPS에 의한 활성화에 의해 생성된 IL-10이 이러한 세포상에서 제II형 MHC 항원의 하향 조절에 관여한다는 사실에 의해 지지되는데, 이는 LPS 자극이 중화 항-IL-10 mAb의 존재하에 수행되는 경우 제II 헝 MHC 발현이 감소되지 않고 심지어 강력하게 증진되기 때문이다.

프로염증성 사이토킨, IL-1α, IL-1β, IL-6, IL-8 및 TNFα는 급성 및 만성 염증 반응과 류마치스 관절염을 포함하는 다수의 자가면역 질환중에 포함된다. 이들 사이토킨은 면역 시스템 세포의 활성화 및 기능을 조절하지만, 내피 세포, 케라티노사이트(Keratinocyte) 및 헤파토사이트(hepatocyte)의 활성화 및 기능도 조절한다. IL-10이 이들 사이토킨의 분비에 있어 강력한 하향 조절 효과를 지닌다는 발견은 IL-10이 강력한 염증 억제제임을 의미한다. 단핵세포 상에서 제II형 MHC 항원의 하향 조절을 통하여 단핵 세포의 APC 능력을 감소시킴에 의한 항원 특이적인 T 세포 증식의 억제 효과 및 단핵 세포에 의한 프로염증성 사이토킨 분비에 있어서의 억제 효과를 포함하는, 지금까지 기술한 특성에 기준하여 볼때, IL-10은 면역반응 및 염증 반응의 억제제로서 중요한 역할을 하는 것으로 여겨진다. 이 역할은 내독소 및 장독소 초항원 반응 모두의 실험관내 연구와 생체내 모델에서 더욱더 확증된다.

본 발명의 연구는 IL-10이 대식세포주 및 복막의 대식세포에 의한 LPS-유도된 사이토킨 생성에 있어서 억제 효과를 지님을 입증한다. 즉 IL-10은 T-세포 반응 조절에 있어 중요한 역활을 할 뿐아니라, 감염 또는 상해동안 발생하는 염증 반응에 있어서도 또한 중요한 역활을 한다.

대식세포주상에서 IL-10의 효과는 뮤린 및 사람 대식세포 및 단핵세포 모두에 의한 사이토킨 생성을 억제하는 것으로 이미 밝혀진, 유사량의 IL-4로써 유출되는 것보다 더욱더 명백하다. 이 결과는 이 세포주 내에서, IL-4에 의해. LPS-유도 된 TNFα단백질 생성이 현저하게 억제되지만, IL-6 합성의 억제는 현저하지 않음을 나타낸다. 그러나, IL-4에 의한 TNFα의 억제는 사람 단핵세포에 대해 이미 보고된 것보다 크지 않다. 이러한 차이는 종의 차이, 단핵세포보다는 오히려 분화된 대식세포주의 사용, 또는 사람 단핵세포 시스템중 하나에서 사용된 LPS 100ng/nl 용량과는 반대되는 것으로서 LPS 10㎍/ml를 사용한 연구로써 설명될 수 있다. IL-4와는 대조적으로, IL-10은 LPS가 고농도일때 IL-6, TNFα 및 IL-1 단백질 생성을 현저하게 억제한다. LPS 및 IFNγ를 사용한 대식세포 주의 자극은 TNFα 및 IL-6을 더욱 높은 수준으로 유도시키며, 일부 경우 이것은 IL-4 작용을 다루기 어렵게 하며, 이러한 사실은 IL-4 및 IFNγ가 대식세포 활성화의 특정 측면에 있어서 반대 및 역효과를 지닐 수 있음을 제시하고 있다. 다시 이것은 보다 적은 양의 LPS를 사용하여 수행한, 사람 단핵세포 상에서의 연구와는 대조적이다. 또한, IL-10-매개된 IFNγ의 억제 + LPS-유도된 IL-6 및 TNFα 단백질의 생성은 IL-4를 사용하여 관측된 것보다 더욱더 현저하다. LPS 또는 IFNγ + IL-6과 TNFα을 암호화하는 RNA의 LPS-유도된 발현의 억제는 또한 역-전사된 RNA에 대한 반-정량적인 PCR 증폭 방법을 사용하여 관측한다. 일부 경우, IL-4가 IL-10에서와 유사한 정도로 발현을 억제한다는 사실은, IL-10이 또한 해독된 단백질의 분비 또는 안정성에 효과적임을 의미한다. 그러나 IL-10은 자체적으로도 효과적이며, 이것은 대식 세포에 의한 사이토킨 생성시 이의 최종적인 억제 효과가 IL-4를 사용할 때 관측되는 것보다 더욱 강력한 것으로 여겨진다. 모노킨(monokine) 생성에 있어서 IL-10의 효과는 이러한 강력한 억제제가 아마도 광범위한 임상 상태에서 소염제로서 효과적일 수 있음을 제안하고 있다.

복막의 대식세포는 T 세포 자극으로부터 IL-10에 의해 억제됨이 밝혀졌기 때문에, 정제된 세포 집단에 의한 IL-10 억제된 사이토킨 분비 여부를 시험한다. BALB/c 또는 CBA/J 마우스로부터 수득한 FACS-정제된 복막의 대식세포는, IL-10의 존재시 단지 약간 감소된 IL-6 단백질을 현저한 수준으로 생성하는 LPS을 사용하여 자극시킨다. 예비 PCR 데이타는 정제된 대식세포가 IL-10을 생성함을 제안하기 때문에, IL-10에 대해 지시된 항체는 일부의 LPS 자극 중에 포함된다. 2개의 마우스균주 모두에 있어서 LPS 자극에 대한 본 항체의 첨가로 IL-6 단백질의 생성이 더욱 높은 수준(30 내지 35ng/ml/7 x 10⁵세포/ml, 20시간 이내)으로 상승된다. 이것은 대식세포에 의한 사이토킨 생성이 엄격한 오토크린(autocrine) 조절하에 있다는 사실과 일치하거나, 대식세포의 하나 이상의 집단이 MaC-1^+,bright복막의 대식세포중에 함유되며, 이들중 하나는 IL-10의 생성에 의해 다른것 이상으로 조절된다는 사실과 일치한다. 사람 단핵세포 시스템과 유사하게 수득된 데이타는 IL-10이 또한 용출처리에 의해 정제된 사람 단핵세포에 의한, IL-10 자체의 생성을 포함하는 LPS-유도된 사이토킨 생성을 억제함을 나타낸다. IFNγ와 같은 Th1 T-헬퍼 세포 사이토킨을 사용한 IL-4 및 IL-10과 같은 사이토킨에서 기원한 T-헬퍼 세포의 효과와 대조되는 선행의 보고에 따라서, 이들 사이토킨이 서로 대조되는 효과를 지닐 수 있다는 추가 증거가 제공된다. IFNγ는 동일한 대식세포에 의한 IL-10의 생성을 표면상으로 억제 시킴으로써, LPS에 대한 반응으로 생성된 IL-6의 수준을 항-IL-10에 의해 달성된 것과 거의 동일한 높은 수준으로 증가시킨다. 이 데이타는 IL-6 및 TNFα와 같은 사이토킨의 생성이 IL-10에 의해 조절되므로, 결국 활성화된 T-세포 및 NK 세포에 의해 생성된 IFNγ의 조절하에 있음을 제안하고 있다. IFNγ의 작용은 24시간 동안 IFNγ를 사용한 복막의 대식세포 배양이 Th1 세포를 자극하는 능력을 증진시킴을 보여주는 선행의 관측을 설명할 수 있다.

IL-10이 세포를 자극시키는 것에서부터 사이토킨을 합성하는데까지 대식세포를 억제하는 방법의 메카니즘은 현재까지 해결되고 있지 않다. IL-10의 존재하에서 대식세포가 자극되는 경우 관측된 사이토킨 합성에 있어서의 현저한 감소 측면에서 볼 때, IL-10은 대식세포 및 항원에 대한 반응에 있어서 최적의 사이토킨 분비에 요구되는 공동-자극 활성을 하향 조절할 수 있다. 자극된 IG18.LA 대식세포로부터 수득된 상층액을 사용하는 경우, 대식세포 및 Th1 세포의 항원-의존성 자극시 IL-10의 억제 효과를 극복하는 것은 불가능하다. 이것은 IL-10이 가용성의 공동-자극인자를 하향 조절함으로써 사이토킨 합성에 있어서의 효과를 조절하지 않는 경우의 메카니즘과 일치한다. 비록 정확하지는 않다해도, IL-10이 이와 같은 인자의 생성 보다는 오히려 작용을 방해하거나, 이와 같은 공동-자극인자가 매우 불안정하거나 흡수성이므로해서, 이들 상층액 제제중에 존재하지 않을 수 있다. 한편, IL-10은 막-결합된 공동-자극인자의 발현을 억제할 수 있으며, 이는 또한 세포의 자극이 가용성인 공동-자극인자에 의해 교체될 수 없는 APC/보조 세포(accessory cell)를 필요로한다고 제안하고 있는 선행의 보고를 또한 됫받침한다. 사이토킨 합성시 IL-10 억제의 메카니즘에 대한 또다른 해석은 결국 T 세포상에서 사이토킨 분비를 억제하도록 작용하는, 대식 세포에 의한 억제 인자의 생성을 IL-10이 유도한다는 것일 수 있다. Th1 세포의 자극을 위한 항원-특이적인 시스템에 있어서 대식 세포 및 B-세포 APC의 혼합은 각각의 개개 APC를 사용한 자극과 비교되는 것으로서, T-세포의 추가적인 자극을 이끈다. IL-10의 존재는 세포에 의한 사이토킨 합성을 B 세포 APC가 스스로 달성하는 수준으로 억제한다. 이 사실은 대식세포가 T-세포상에서 직접 작용하는 억제제 또는 B 세포 APC의 생성을 유도하지 않음을 제안한다. 비록 명확하지는 않으나, 이와 같은 억제제가 대식 세포-T 세포 상호작용에 대해 특이적일 수 있거나, B 세포 APC가 어느 정도 이와 같은 활성 효과를 극복 또는 무효화시키는 것이 가능하다. 사람 시스템에서 수득된 데이타는 IL-10이 단핵세포에 의해 생성된 가용성의 억제 인자 또는 공동-자극 인자를 통해 T-헬퍼 세포 증식을 억제시킬 수 없음을 나타낸다. 그러나, 이러한 효과는 사람 단핵세포 상에서 IL-10에 의한 MHC-제II형 항원의 하향 조절에 의해서만 설명될 수 있으며, 아직까지 마우스 시스템에서는 관측되지 않았다.

유효인자 기능의 조절 이외에, IL-10은 또한 상이한 양식의 사이토킨을 생성하는 CD4 T-헬퍼 세포의 상이한 아류를 활성화시킴으로써, 항체 생성 또는 지연된 유형의 과감작성(DTH)에 대한 면역 반응의 개시에 중요한 역할을 할 수 있다. B 세포 및 대식세포 모두가 IL-10을 생성하며 또한 APC로서 작용하는 반면, 상이한 사이토킨 조절인자에 대해 민감하다는 사실(IFNγ는 많은 B 세포 기능을 억제하며; IL-10은 대식세포를 억제하나 B 세포 APC 기능은 억제하지 않는다)은 이 이론을 지지한다. 또한 이 연구는 IL-10이 대식세포에 의한 사이토킨 합성에 있어 현저한 억제 효과가 있을뿐 아니라, 복막의 대식세포내에서 현저한 형태학적 변화를 유발시킴을 나타낸다. 이와 함께, 이 관측은 IL-10이 T-세포 반응 조절뿐만이 아니라 감염 또는 상해로 유발된 급성 염증 반응의 중요한 조절인자로서 중요한 역할을 함을 제안한다.

연구 D에 있어서는, 생체내에서 초항원-매개된 독성을 억제하는 IL-10의 능력을 시험한다. IL-10은 부분적으로 T 세포를 활성화시키기 위해 대식세포의 능력을 억제함으로써, T 세포에 의한 사이토킨 생성을 억제시킬 수 있다. 초항원은 TCR의 Vβ 쇄 및 APCs 상에 존재하는 제II형 MHC 분자 사이에 "브릿지(bridge)"을 형성시킴으로써 T 세포를 활성화시키는 분자로 정의한다. 이 결과는 IL-10이 대식세포가 나타내는 초 항원에 의해 활성화된 T 세포로써 사이토킨 생성을 억제시킬 수 있음을 제시한다. 이 효과는 실험관 시험에서 관측되었다. 초 항원은 내인성, 예를 들면 바이러스에 의해 암호화될 수 있거나, 외인성, 예를 들면 미생물성 장독소일 수 있다. 후자 그룹의 가장 잘 연구된 초 항원에는 스타필로코커스 장독소가 포함된다. 현재 이러한 독소에 의해 억제된 독성은 생체내에서 T 세포를 활성화시키 능력에 의존한다. 이 관측은 T 세포 활성을 억제하는 제제가 초항원에 의해 억제된 독성을 예방함을 제안한다. 이것은 사이클로스포린이 SEB-매개된 독성을 방지한다는 관측과 일치한다. 이 모델에 따르면, TNFα는 독성의 주요 매개된 인자이다. 본원에서 나타낸 결과는 IL-10이 T 세포에 의한 TNF 생성을 억제하는 능력을 통해서, SEB의 독성을 방지할 수 있음을 나타낸다.

이 관측은 생체내 IL-10 작용의 메카니즘과 관련있다. IL-10은 대식세포 기능, 예를 들면 사이토킨 생성, T 세포를 활성화시키는 능력을 억제하며, B 세포내에서 Ia 항원 발현을 유도하는 것으로 나타났다. 그러나 SEB의 독성은 APC에 의한 Ia 항원의 발현에 의존하기 때문에, 생체내에서 이러한 실험의 결과는 명확치 않다. IL-10이 SEB-유도된 독성을 방지한다는 사실은 생체내 주요 APC가 B 세포가 아니라, 대식 세포임을 의미한다.

이러한 결과는 IL-10의 치료학적 용도와 중요한 관련이 있다. 스타필로코커스 장독소에 의해 야기된 식품 독성화 외에, 최근에는 다수의 질환들이 초 항원-유발된, 즉 독성 쇼크 질환, 가와사키 질환(Kawasaki disease), 스트렙토코커스 독소에 의해 야기된 질환 및 류마치스 관절염과 같은 자가 면역 질환인 것으로 보고 되었다.

IL-10이 치명적인 내독혈증으로부터 마우스를 보호하는데 매우 효과적이라는 사실은, IL-10이 세균성 패혈증의 치료에 유용할 수 있음을 제시한다. 다수의 다른 반응제, 예를 들면 TNFα 또는 내독소에 대한 항체, 및 IL-1Ra가 현재 세균성 패혈증의 치료를 위해 임상적으로 시도되고 있으며, 이것 대부분은 최적의 보호를 위한 동물 모델 실험에서 패혈증 유도전에 주입시킬 필요가 있다. 이 사실에 예외적인 것은, IL-1Ra가 동물 모델 실험에서 패혈증 유도시기에 투여할때 효과적이지만, 모든 내인성 IL-1 수용체를 차단하기에 충분한 다량으로 투여되어야만 한다는 것이다. IL-10의 약리학적 용량은 또한 가능하게는 수용체 포화량 이하에서, 치사의 내독혈증으로부터의 보호에 기여해야만하는 대식세포/단핵세포 기능상에 있어 일련의 효과를 수득케한다.

전술한 기술이 면역 시스템의 다양한 측면의 조절 및 분화에 있어서 IL-10 투여 효과에 주지되어 있다 해도, 항-IL-10 항체를 사용하는 IL-10 사이토킨의 효과의 차단을 통해서 추가의 통찰이 이루어진다.

본원에서 나타낸 데이타는 출생부터 성숙할 때까지 마우스에 계속적으로 항-IL-10 항체를 투여함으로써 동일한 동물의 비장내에 존재하는 통상적인 B 세포의 수, 표현형 또는 면역경쟁성을 변경시키지 않고도, 총 Ly-1 B 세포 수 및 기능을 현저히 감소시킴을 나타낸다. 몇몇의 관측이 항-IL-10 처리된 마우스내에서 Ly-1-B 세포의 제안된 고갈을 지지하고 있다 :

(a) 항-IL-10 처리된 마우스는 정상 마우스내에서 Ly-1 B 세포가 풍부하게 존재하는 부위인, 복막강내에 B 세포가 거의 없거나 없다(DNAX 동물 시설내 8주된 BALB/c 마우스의 복막 세척 세포는 표현형-분석에 의해서 통상적인 B 세포의 5% 미만을 함유한다); (b) 항-IL-10 처리된 마우스는 정상의 혈청 IgM 수준의 0 내지 10%을 함유하며, 이는 순환하는 IgM의 주 공급원으로서 Ly-1 B 세포를 동정하는 선행의 재구성 실혐과 일치한다; 및 (c) 항-IL-10 처리된 마우스는 프스프릴콜린 및 α1,3-텍스트란과의 결합에 대한 반응으로 항체를 거의 또는 전혀 생성하지 않으며, 황원에 대해 특이적인 B 세포는 Ly-1 B 세포 아단위 내에 존재한다. 이 자료는 항-IL-10 처리된 마우스에서 변경되지 않은 통상의 B 세포 구획이, 정상 세포 표면 마커 표현형을 나타내며, 흉선-의존성 항원 및 B 세포 유사분열 물질에 대해 정상적으로 반응하는 변하지 않은 수의 비장 B 세포와 동등하게 경쟁함을 나타낸다. 항-IL-10 처리된 마우스에서 Ly-1 B 세포의 선택적인 고갈은 항-IL-10 처리한지 수주후 이 동물의 복막강내에서 재출현한 Ly-1 B 세포가 불연속적인 것과 같이, 일시적인 것으로 밝혀졌다.

몇몇의 가능한 메카니즘이 항-IL-10 처리된 마우스내에서 Ly-1 B 세포의 선택적인 고갈을 설명하는 것으로 고려된다. 나타낸 데이타는 본 연구에서 중화하는 항-IL-10 및 항-IFNγ항체의 공투여로 복막의 B 세포 고갈이 방지되기 때문에, 항-IL-10 치료 후 IFNγ 상승결과가 부분적으로는 매우 중요함을 의미한다. IFNγ가 직접 또는 간접적으로 Ly-1 B 세포 발육을 억제한다는 것은, IFNγ가 Ly-1⁺B 임파종 BCL1의 실험관내 증식으로 유도된 IL-5를 약간 억제시킨다는 선행의 관측을 회상시킨다. 본 연구를 확장시켜 보면, 복막 세포의 LPS-유도된 증식의 IFNγ-매개된 억제는 관측되지만, 정상 BALB/c 마우스로부터의 비장 세포에서는 관측되지 않는다. 항-IL-10 처리된 마우스내에서 IFNγ의 상승이 전체적으로 Ly-1 B 세포 고갈을 의미하는지의 여부와 이것이 Ly-1 B 세포의 IFNγ의 직집적인 작용 또는 일부 IFNγ매개된 간접적인 효과를 반영하는지의 여부는 완전히 이해되지 않고 있다. 아마도, 항-IL-10 처리된 마우스내에서의 기타 변화가 Ly-1 B 세포의 고갈에 추가로 기여하는 것같다. 항-IL-10 치료는 내인성 모노킨 수준의 상승을 이끈다. 심지어 모노킨에 의해 매개되고, 개개의 항-IL-10 처리된 마우스 32마리중 5마리가 실제적인 수준의 혈청 IL-6을 함유하는 경우에도, 항-IL-10 처리된 마우스는 LPS 유도된 쇼크에 의해서 치사에 대해 약 50배 이상 민감하다(여기서, 모노킨은 일반적으로 정상 동물의 순환중에 발견되지 않으며 본 실험으로부터 어떠한 10마리의 대조군 마우스의 혈청중에서는 검출되지 않는다). 그러나, IL-6 유전자 전이성 마우스 또는 LPS 투여시 생체내에서 혈청 모노킨 수준이 크게 상승된 동물이 정상적인 혈청 IgM 수준을 가진다는 사실은, Ly-1 B 세포의 변하지 않은 수를 제안하고 있다. 통상적인 B 세포가 아닌 Ly-1 B 세포가 구성적이고 유도적인 IL-10을 생성한다고하는 기존의 발견으로 IL-10이 오토크린(autocrine) 성장인자로서 작용한다는 제안이 유추되었다. 이 사실은 현재 항-IL-10 및 항-IFNγ 항체 모두를 처리한 마우스로부터 회수한 복막 Ly-1 B 세포의 실제적인 수 측면에서 일치하지 않는다.

연속적인 항-IL-10 처리에 의해 창출된 Ly-1 B 세포-고갈된 마우스는 면역결핍성 xid 마우스, Ly-1 B 세포를 상실하고 있는 CBA/CaH 마우스로부터 기원한 자발적인 돌연변이체 계통과 매우 유사하며, 일련의 흉선-의존성 항원에 대해 반응하지 않는다. 이러한 유사성에도 불구하고, 본 발명자의 예비 시험은 xid 마우스가 IL-10을 정상적으로 생성하며, 기능적인 IL-10 수용체를 함유함으로써, xid 마우와 항-IL-10 처리된 마우스는 기계적으로 구별됨을 보여주고 있다. 더우기, xid 마우스로부터 항-IL-10 처리된 마우스를 구별하는 한가지 특성은 항-IgM 자극에 대한 비장 세포의 실험관내 반응성이며, 항-IL-10 처리된 마우스 동물에서 나타나지만 xid 마우스에서는 나타나지 않는다.

IL-10의 생리학적 역활은 IL-10을 특이하게 중화시키는 모노클로날 항체를 출생부터 성숙할때까지 마우스에 주사함으로써 연구한다. 이와 같은 처리는 이들 동물의 면역 상태에 있어서 다수의 뚜렷한 변학를 가져온다. 이 동물은 순환하는 TNFα IFN-γ, 및 많은 경우, IL-6에 있어서의 증가로 특징지워진다. 이 효과는 세포 배양 실험에서 IFNγ 및 모노킨 생성의 강력한 억제제인,이미 보고된 IL-10의 실험관내 특성과 일치한다. 내인성 IFNrγ에 있어서의 증가는 항-IL-10 처리로 인해 수득되는 다른 몇가지 중요성과 관련있는 것으로 여겨진다. 예를 들어, 이것은 Ly-1 B 세포의 고갈을 이끄며, 결국 이것은 순환하는 IgM 및 IgA 항체 및 포스포릴콜린과 α1,3 텍스트란에 대한 특이적인 항체 반응의 감소를 가져온다. 상승된 IFN-γ 수준은 IgG_2a동형이 IFN-γ에 의해 양성적으로 조절되는 순환하는 IgG2a의 증가에 관여하는 것으로 여겨진다. 복막 T 세포, 과립세포, 및 순환하는 IgG2b에 있어서 증가의 나머지 변화는 대사적으로 이해되지 않으나, 이것은 제2의 사이토킨 교란의 결과일 수 있다. 반면 일반적으로 건강한, 항-IL-10 처리된 마우스는 내독소-유도된 쇼그로부터 귀결되는 치사에 매우 민감한 것으로 밝혀졌다. 이 치명적인 염증 반응을 TNF-α, IL-1, IL-6 또는 내독소에 대해 특이적인 항체의 수동적 이동에 의해 방지될 수 있는 경우에도 모노킨 매개된다. 따라서, 내인성 모노킨 상향조절(upregulation)을 나타내며 항-내독소 항체(예 : Ly-1 B 세포)를 주로 생성하는 B 세포 집단을 상실한, 항-IL-10 처리된 마우스가 이 염증 반응을 일으키기가 매우 용이하다는 것이 놀라운 것은 아니다. 이 데이타는 소염제로서 IL-10에 대한 임상적인 역활을 제시하고 있다. 이 주시와 일치하게도, 실험은 IL-10의 약리학적 용량이 장독소-유발된 쇼크에 기인한 치사로부터 마우스를 보호함을 나타낸다.

항-IL-10 처리된 마우스의 대략적인 표현형이 IL-10의 공지된 실험콴내 특성과 분명히 일치한다해도, 유전자 타겟팅(targeting)에 의해서 IL-10이 결핍된 마우스에 대한 예비 보고의 것과는 대조적인 것임에 틀림없다. 이 돌연변이체는 검출 불가능한 수준의 순환하는 NFN-γ, TNF-α 및 IL-6, 복강내에 정상적인 수의 Ly 1 B 세포와 정상과 근사한 수준의 혈청 Ig을 지닌다. 비록 유사한 모순 상태가 IL-2 넉-아웃 마우스(Knock-out mouse) 및 출생에서 성숙할때까지 항 IL-2 수용체 항체를 처리한 마우스의 일부 보고에서 존재한다해도, 이러한 모순에 대한 해석은 분명치 않다. 한가지 해석에는 사이토킨 시스템내에 존재하는 잘-인지된 풍부성이 포함된다. 발육하고 있는 태아 마우스는 밀접하게 연관된 기능의 사이토킨을 암호화하고 있는 유전자의 발현을 증폭시킴으로써 중요한 사이토킨 유전자의 상실을 보충할 수 있다. 예를들어, IL-4는 IL-10과 많은 특성을 공유하기 때문에, 이 사이토킨은 전체의 IL-10 상실을 보충하는 우수한 후보 물질일 수 있으므로, 이의 발현은 IL-10 넉-아웃 마우스내에서 상향조절될 수 있다. 반대로, 출생부터 마우스의 항체 처리를 통한 내인성 IL-10의 중학는 기껏해야 사이토킨의 "리키(leaky)" 제거를 나타낼 수 있으며, 이렇게 잔류하는 미량의 내인성 IL-10은 보충성 사이토킨 경로의 심각한 면역 결핍 및 조절 활성을 방지하기에 충분할 수 있다. 항체 처리된 동물이 투여된 이종의 항체 및/또는 수득되는 면역 복합체에 대한 인공의 면역 반응을 상승시킨다는 또다른 해석은 완전히 무시될 수 없다. 더구나, 상기 다른 해석은 이소타입 대조군 항체 및 생체내에서 또한 면역 복합체를 생성하는 기타의 사이토킨에 대한 항체가 항-IL-10 처리된 마우스에 대해 추정된 면역-조절을 수득하지 못하므로 옳지 않은 것으로 여겨진다.

항-IL-10 처리된 마우스에서 관측된 면역-조절 양식이 어떠한 공지된 사람 면역결핍 질환과 완전히 관련되어 있지 않다해도, 위스코트-알드리흐(Wiskott-Aldrich) 환자 및 IgA 결핍 증후군 환자 모두에 대한 특정의 유사성이 존재한다. 이러한 사람 면역결핍증은 순환하는 IgM 또는 IgA 각각의 상실, 항-세균성 항체 반응을 생성시키는 능력의 감소, 및 순환하는 IgG1에 있어서의 잦은 증가, 쥐 IgG 2a와 거의 상관 관계가 있는 주요보체-고정성 사람 항체 이소타입으로서 특징화된다. 이와 같이 환자가 감소된 IL-10 생성 또는 반응성을 나타내는지의 여부 및 그럴경우, 이것이 결국 이의 면역결핍성에 기여하는지의 여부는 확증을 대기하고 있는 상태이다. IgA 결핍 증후에 있어서 IL-10의 강력한 역활은 천연의 사람 B 세포가 IgA-분비성 세포내로 분화된 후 이어서 가교결합된 항-CD 40 항체 및 TGFβ를 사용한 이의 활성에 요구되는 중요한 공동-인자(co-factor)로서 IL-10과 분명하게 관련되는 최근 연구의 측면에서 특히 관심이 있다. 항-IL-10 처리된 마우스가 2개의 세균성 항원에 대해 특이적인 항체 반응을 생성치 못하는 능력은 또한 IL-10이 상술한 바와 같이, 항-세균성 면역에 있어서 효과적인 보조제일것이라는 제안을 지지 한다.

IL-10의 생리학적 역활 및 임상적 효능에 대한 정보를 제공하는 것 외에도, 항-IL-10 처리된 마우스는 면역 시스템에 대한 Ly-1 B 세포의 기여도를 평가하는 새로운 기회를 제공한다. 상기 주목한 바와 같이, 항-IL-10 처리된 마우스내에서

Ly-1 B세포 고갈로부터 귀결되는 제2의 중요성은 이러한 소수의 B세포 아-집단에 대해서 전술한 많은 특성을 확증한다. 그러나 이러한 데이타는 추가로 면역시스템에 대한 Ly-1 B 세포의 기여도와 관련하여 새로운 통찰을 제공한다. 특히, 이소타입인 IgG1, IgG 2a, IgG 2b, IgG 3, 또는 IgE의 혈청 수준은 Ly-1 B 세포 고갈된 항-IL-10 처리된 마우스내에서 감소되지 않기 때문에, 상기 이소타입의 생성에 있어 Ly-1 B 세포는 요구되지 않는다고 결론지을 수 있다. 유사하게 Ly-1 B 세포는 일부의 흉성 의존성 제II형 항원(예; 포스포릴콜린 및 α1,3 덱스트란)에 대해 필수적으로 반응성이어야하는 반면, 이것은 기타 항원(예; TNP-Ficoll 및 항-IgM)에 대해서 반응성일 필요가 없다. 더우기, 순환하는 IgG3의 변하지 않거나 약간 상승된 수준, 다당류 항원에 대한 B 세포 반응성과 유일하게 연관된 이소타입은 Ly-1 B 세포 결핍성 마우스가 대부분의 흉선 의존성 제II형 항원에 반응할 수 있음을 제시한다. 항-IL-10 처리된 마우스의 본 양태는 xid 마우스, Ly-1 B 세포를 또한 상실하고 있으나. 모든 흉선 의존성 제II형 항원에 대해 반응하지 않는 자발적으로 발생하는 면역결핍성 마우스 균주로부터 이들을 용이하게 구별되게 한다.

면역 시스템에 대한 Ly 1 B 세포의 기여도에 대한 정보를 제공하는 것외에, 항-IL-10 처리된 마우스는 본 발명자들이 생체내에서 TNFα 상승의 결과를 평가할 수 있도록 한다. 본 데이타는 생체내에서 IL-10의 길항작용이 혈청 TNFα 수준을 실제적으로 상승시킨다는 사실을 분명히 제시하고 있다. TNFα상승의 바람직하지 않은 결과가 상기에서 상세히 고려되였다해도(예; 패혈증성 쇼크, 대뇌 말라리아 등 ), TNF α상승의 다수의 바람직한 결과가 또한 고려되어져야 한다. 이는 직접적인 항-종양 효과, 과립세포-단핵세포 조혈성 직계(granulocyte-monocyte hemopoietic lineage)의 확대, 방사성 보호와 일부 자가면역 및 감염성 질환에 대한 보호의 동물 도델에서 입증된다. 따라서 이러한 고려는 이러한 유형의 질환치료시 치료학적 방해용 후보인자로서의 IL-10 길항제를 제시하고 있다.더우기, 본 발명자는 항-IL-10 항체가 낭창으로 판명된 NZB/W 마우스에서 자가면역성의 진행을 실제적으로 지연시킬 수 있음을 입증하는 정도까지 본 제안을 확증하였다.

요약하면, 본 발명은 많은 질환상태의 주요 매개된자인 모노킨의 생성을 조절하기 위한 IL-10 또는 IL-10 길항제의 용도에 관한 것이다. IL-10 및 이의 효능제는 TNF α와 같은 모노킨을 현저히 억제시키므로 이 방법은 세균성 패혈증, 독성 쇼크, 류마치스 관절염 및 건선과 같은 바람직하지 않은 염증 반응을 보호한다. 유사하게, IL-10 길항제 TNFα와 같은 모노킨의 농도를 증진시키므로, 결국 종양 치료제로 작용할 수 있으며 방사성 보호 및 특정의 자가면역 질환과 감염성 질환에 대한 보호를 제공할 것이다.

[실사예]

하기 실시예는 본 발명을 나열하기 위해서 제공된다. 벡터 및 숙주의 선택외에 반응제의 농도, 온도 및 기타 가변적인 매개변수의 값은 본 발명의 적용을 예시하기 위함이며 이에 제한되는 것은 아니다

[실사예 1]

[세균 숙주내에서 사람 IL-10의 발현]

사람 IL-10 합성 유전자를 다수의 화학적으로 합성된 이본쇄 DNA 단편으로부터 조립하여 TAC-RBS-hIL-10으로 지정된 발현 벡터를 형성시킨다. 클로닝 및 발현은 비에라 및 메싱의 문헌[참조 : Viera 및 Messing, in Gene, Vol. 19, pgs. 259-268(1982)]에 기술된 바와 같이, 표준 세균 시스템(예; 이.콜라이 K-12 균주 JM101, JM103 등) 내에서 수행한다. 제한 엔도뉴클레아제 분해 및 리가제 반응은 통상적으로 본원에서 참조로 인용한 표준 프로토콜[참조; Maniatis et al., Molecular Cloning : A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory, New York, 1982), Sambrook et al. Molecular Cloning : A Laboratory Manual ((Cold Spring Harbor Laboratory, New York), and Ausubel et a1.(1987 and periodic supplements) Current Protocols in Molecular Biology, Wiley and Sons, New York]을 사용하여 수행한다.

알칼리 방법은 소규모 플라스미드 제조에 사용한다. 대량 제조를 위해서 동량의 이소프로판올을 사용하여 깨끗한 분해물로부터 핵산을 침전시키는 알칼리 방법의 변형을 사용한다. 염화세슘 평형 밀도 원심분리 및 에티디움 브로마이드를 사용한 검출전에 2.5M의 냉 암모늄 아세테이트로 침전시켜 RNA를 제거한다.

필터 하이브리드화를 위해서 화트만 540 필터(Whatman 540 filter) 순환을 이용하여 콜로니를 이동시키고 이를 분해한 다음 0.5 M NaOH, 1.5 M NaCl; 1 M 트리스-HCl pH 8.0, 1.5 M NaCl로 각각 2분씩 완전히 처리하고 80℃에서 30분간 가열함으로써 고정시킨다. 하이브리드화는 6xSSPE, 20%/ 포름아미드, 0.1% 나트륨 도데실설페이트(SDS), 100㎍/ml 이.콜라이 tRNA, 및 100㎍/ml의 꼬마지에 브릴리언트 블루 G-250(Coomassie Brilliant Blue G 250 : Bio-Rad 제조원)중 42℃에서 6시간동안³²p-표지된(키나제화된) 합성 DNA를 사용하여 수행한다(20xSSPE는 H₂O 800ml중에 NaCl 174g, NaH₂PO₄9H₂O 29.6g, 및 EDTA 7.4g을 용해시킴으로써 제조한다. pH는 NaOH로서 7.4로 조절한다. 용량은 1ℓ로 조절하고, 오토클레이브로 멸균시킨다). 필터는 1xSSPE, 0.1% SDS를 사용하여 실온에서 15분간 2회 세척한다. 방사선 자기법(후지 RX 필름)후에, 필터상에서 청색-염색된 콜로니와 함께 재성장한 콜로니를 정렬시킴으로써 포지티브 클론을 배치한다. DNA는 디데옥시 방법[참조; Sanger et al. Proc. Natl. Acad. Sci., Vol. 74, pg 5463 (1977)]에 따라서 서열분석한다. 디데옥시 반응에 대한 주형은 M13mp 벡터내로 재클론한 관련된 영역의 일본쇄 DNA [참조 : Messing et al., Nucleic Acids Res., Vol. 9, pg. 309 (1981)]이거나, 또는 미니알칼리 방법으로 제조하고 0.2M NaOH로 변성시키며(5분간 실온에서) 2ℓ의 에탄올을 첨가시킴으로써 0.2M NaOH, 1.43M 암모늄 아세테이트로부터 침전시킨 이-본쇄 DNA이다. DNA는 어플라이드 바이오시스템스 380A 합성기(Applied Biosystems 380A synthesizers)를 사용하는 포스포르아미디트 화학으로써 합성한다. 합성, 탈보호, 절단 및 정제(7M 요소 PAGE, 용출, DEAE-셀룰로즈 크로마토그래피)는 380A 합성기 메뉴얼에 기술되어 있는 바와 같이 수행한다.

클론할 합성 DNA의 상보적인 쇄(각각 40Ong)를 합하고 50ml의 반응 용량중에서 폴리뉴클레오타이드 키나제를 사용하여 포스포릴화한다. 이 DNA를 벡터 DNA 1mg과 연결하고, 적절한 제한 효소로 분해하며, 연결은 50㎕용적으로 실온에서 4 내지 12시간동안 수행한다. 포스포릴화, 제한 효소 분해, 폴리머라제 반응 및 연결에 대한 조건은 문헌(참조 : 상기 인용한 Maniatis et al.)에 기술되어 있다. 콜로니는 암피실린, 이소프로필-1-티오-β-D-갈락토사이드(IPTG)(0.4mM) 및 5-브로모-4-클로로-3-인돌릴-β-D-갈락토피라노사이드(X-gal)(40㎍/ml)가 보충된 L 아가상에 플레이팅 함으로써 바람직하게는 lac Z⁺에 대해 기록한다.

TAC-Rl3S 벡터는 DNA 폴리머라제를 사용하여 tacP-생성 플라스미드 pDR540(파마시아 제조원)의 단일 BamHI 부위에 필링-인(filling-in)함으로써 작제한다. 다음 이것을 컨센수스(consensus) 리보소옴 결합 부위(RBS, GTAAGGAGGTTTAAC)를 암호화 하는 이본쇄 단편을 형성하는 비포스포릴화된 합성 올리고뉴클레오타이드(파마시아 제조원)에 연결한다. 연결후, 다음 이 혼합물을 포스포릴학하여 Sst I 링커 ATGAGCTCAT와 재연결 한다. 다음 이 복합체를 Sst I 및 EcoRI으로 분해하고, 173bp의 단편은 폴리아크릴아미드 겔 전기영동(PAGE)를 통해 분리하여 EcoRI-SstI 제한된 pUC19(파마시아 제조원) 내로 클로닝한다(상기 기술). 최종 작제물(TAC-RBS로 지칭)의 PBS-ATG-폴리링커 영역의 서열은, 본원에서 참조로 인용한 미합중국 특허 제5,017,691호에 기술되어 있다.

합성 IL-10 유전자는 8단계로서 pLTC19 플라스미드내에 조립한다. 각 단계에서 결실이 엾는 삼입체 및/또는 삽입체는 제1단계에서 삽입된 ATG 출발 코돈과 함께 구조내에(in frame) pUC19의 lacZ(a) 유전자를 유지시킴에 의해 클로닝한 후 검출할 수 있다. 결실 및/또는 삼입 변화를 함유하는 클론은 X-gal 및 IPTG를 함유하는 L-암피실린 플레이트 상에서 청색 클로니를 기록함으로써 여과할 수 있다. 달리는, 각 단계에서, 삽입체 서열을 소규모 플라스미드 DNA 제제상에서 공통의 서열분석 프라이머를 사용하여 용이하게 확증할 수 있다.

제1단계에서는 TAC-RBS 벡터를 SstI으로 분해하고, T4 DNA 폴리머라제(이의 3' 엑소뉴클레아제 활성을 SstI 절단물의 3' 돌출된 쇄를 분해하여 평활 말단 단편을 형성한다)로 처리하며, T4 DNA 폴리머라제로 불활성화시킨후, EcoRI으로 처리하여 173개의 염기쌍(bp) 단편을 형성한다. 이 단편은 TAC-RBS 영역을 함유하며 ATG 출발 코돈에서 평활 말단을 지니고 EcoRI은 반대쪽 말단에서 절단한다. 최종적으로, 173bp의 TAC-RBS 단편이 분리된다.

제2단계에서는 제1단계의 분리된 TAC-RBS 단편을 EcoRI/KpnI 분해된 플라스미드 pUC19 및 합성 단편 1A/B[이는 후술하는 바와 같이 상부측 말단 부위에 평활말단을 지니며 하부측 말단 부위에 KpnI 절단물과 상응하는 스태그된 말단(staggered end)을 지닌다]와 혼합한다. 이 KpnI 말단은 BstEIl 부위로 부터 하부쪽으로 인접해 있다. 이 단편을 연결시켜 제2단계의 pUC19를 형성한다.

제3단계에서는 합성 단편 2A/B 및 3A/B(후술함)를 제2단계의 BstEII/SmaI 분해된 pUC19와 혼합하고(증폭 및 정제후) 연결시켜 제3단계의 pUC19를 형성시킨다. 단편 3A/B의 하부측 말단은 SmaI 평활 말단을 형성하는 예외적인 염기를 함유하는 것에 주목하라. 이 예외적인 염기는 제4단계에서 분해된다. 또한 단편 2A/B 및 3A/B는 pUC19에 연결시키기 위한 2A/B의 상부측 BstEII 절단부 및 3A/B의 하부측 평활 말단이 남아있는, 혼합시 어닐링(annealing)되는 상보적인 9개 잔기의 일 본쇄 말단을 지닌다.

제4단계에서는 제3단계의 AflII/XbaI 분해된 pUC19(증폭 및 정제후 수행)를 재정제하고, 합성 단편 4A/B(후술됨)와 혼합하며, 연결시켜 제4단계의 pUC19를 형성시킨다.

제5단계에서는 제4단계의 XbaI/SalI 분해된 pUC19(증폭 및 정제후 수행)를 합성 단편 5A/B(후술됨)와 혼합하고 연결시켜 제5단계의 pUC19를 형성시킨다. 단편 5A/B의 SalI 스테그된 말단은 제6단계의 HpaI을 사용한 분해로써 제거된다.

제6단계에서는 제5 단계의 HpaI/PstI 분해된 pUC19(증폭 및 정제후)를 합성 단편 6A/B(후술됨)와 혼합하고 연결하여 제6단계의 pUC19를 형성한다.

제7단계에서는 제6단계의 ClaI/SphI 분해된 pUC19(증폭 및 정제후)를 합성 단편 7A/B(후술됨)와 혼합하고 연결하여 제7단계의 pUC19를 형성한다.

제8단계에서는 제7단계의 MluI/HindIII 분해된 pUC19(증폭 및 정제후)를 합성 단편 8A/B 및 9A/B와 혼합하고 연곁하여 최종 작제물을 형성한다. 최종 작제물은 표준 기술에 의해 예를들면, 기탁번호 제33876호하에 ATCC로부터 입수가능한 이.콜라이 K-12 균주 JM101내로 삽입한다. 항온처리한후, 단백질을 JM101 세포로부터 추출하고 추출물의 희석액을 생물학적 활성에 대해 시험한다. 단편 서열에 대해서는 표 1에서 언급한다.

하단 문자는 염기가 동일한 부위에서 천연 서열의 염기와 상이함을 나타낸다.

[표 1. ]

단편 1A/B

단편 2A/B

단편 3A/B

단편 4A/B

단편 5A/B

단편 6A/B

단편 7A/B

단편 8A/B

단편 9A/B

[실시예 2]

[COS 7 원숭이 세포내에서 vIL-10의 발현]

vIL-10에 대한 개방 판독 프레임을 암호화하는 유전자는 후에 EcoRI-분해된 pcD(SRa) 벡터내로 증폭된 단편이 삽입되도록 하는 프라이머를 사용하는 폴리머라제 쇄반응으로써 증폭시킨다[참조 : Takebe et al. (1988) Mol. Cell. Biol. 8 : 466-472]. 삽입된 단편의 암호화 쇄는 후술한다(개방 판독 프레임을 대문자로 나타낸다).

적절한 배향의 삽입체를 지닌 클론은 vIL-10 및/또는 제한 분해물의 전기영동 양식을 발현시킴으로써 동정한다. vIL-10 유전자를 지닌 이와 같은 벡터는 pBCRF1(5Ra)으로 지명되며 기탁번호 제68193호하에 ATCC에 기탁되어 있다. pBCRF1(SRa)은 이.콜라이 MC1061내에서 증폭시키고, 표준 기술로써 분해하며, 하기와 같이 C0S 7 원숭이 세포를 형질 감염시키는데 사용한다 : 형질 감염 1일전에, 대략 1.5x10⁶COS 7 원숭이 세포를 5% 태아 소 혈청(FCS) 및 2mM 글루타민을 함유하는 둘베코 변형된 이글 배지[Dulbecco's modified Eagle medium (DME)]중 개개 100mm 플레이트상에서 종균배양한다. 형질감염을 수행하기 위해, C0S 7 세포를 트립신과 함께 배양함으로써 디쉬(dish)로부터 제거하고, 혈청이 유리된 DME 중에서 2회 세척하며, 혈청이 유리된 DME중에서 107세포/ml로 현탁시킨다. 0.75ml의 분취량을 20㎍ DNA와 혼합하고 멸균된 0.4cm짜리 전기영동 큐벳(cuvette)으로 이전시킨다. 10분후, 세포는 바이오레드 진 펄서 단위(BioRad Gene. Pulser unit)내 20OV, 960mF에서 펄스한다. 다시 10분후, 이 세포를 큐벳으로부터 제거하여 5% FCS, 2mM 글루타민, 페니실린, 스트렙토마이신 및 겐타마이신을 함유하는 DME 20ml에 가한다. 이 혼합물을 4개의 100mm 짜리 조직 배양 디쉬로 분춰시킨다. 37℃, 5% CO₂에서 12 내지 24시간후, 이 배지를 단지 1% FCS를 함유하는 유사 배지로 교체하고 37℃, 5% CO₂에서 72시간동안 추가로 계속 배양한 후, 배지를 수집하여 IFNγ 합성을 억제하는 이의 능력에 대해 검정한다.

새로이 분리한 말초 혈액 백혈구(PBLs) 10ml짜리 분취량(약 2x10⁶세포/ml)은 (i) 5% FCS 및 2mM 글루타민이 보충된 90% DME, 및 (ii) pBCRF1(SRa)로 이미 형질감염시킨 COS 7 세포로부터의 10% 상층액으로 이루어진 배지중에서 파이토헤모-아글루티닌(phytohemo-agglutinin; PHA)(100ng/ml)과 함께 37℃에서 배양한다. 24시간후 세포 및 상층액을 하베스트하여 각각 IFNγ mRNA 또는 IFNγ 단백질의 존재에 대해 검정한다. 10% 상층액을 관련되지 않은 cDNA 삽입체를 지닌 플라스미드로 이미 형질감염시킨 COS7 배양물로부터 입수하는 것을 제외하고는, 동일하게 대조군을 처리한다. vIL-10-처리된 샘플은 대조군에 비해서 IFNγ 합성이 약 50% 억제된다.

[실시예]

[이.콜라이내에서 vIL-10의 발현]

하기의 성숙한 vIL-10을 암호화하는 유전자는 이.콜라이내에서 발현될 수 있다.

pBCRF1(SRa)의 cDNA 삽입체는 N13 플라스미드내로 재클로닝되며 여기서 이것은 부위-지시된 돌연변이 유발에 의해 2회 변헝되는데; 처음에는 성숙한 vIL-10 폴리펩타이드에 대해 암호화 영역의 5' 말단에서 Cla I 부위를 형성하고, 두번째에는 성숙한 vIL-10 폴리펩타이드에 대한 암호화 영역의 3' 말단에 BamHI 부위를 형성한다. 다음 돌연변이된 서열은 후술하는 TRPC11 발현 벡터내로 삽입시킨다.

TRPC11 벡터는 합성의 컨센수스 Rl3S 단편을 ClaI 링커 (ATGCAT)에 연결하고 수득되는 단편을 ClaI 제한된 pMTllhc (이것은 이미 ClaI 부위를 함유하도록 변형시킨다)내로 클로닝함으로써 작제한다. pMTllhc는 작고 (2.3 kilobase) 높은 카피수를 지니며, pVX 플라스미드 EcoRI-HindIII 폴리링커 영역 [pVX는 Maniatis et al. (1982)의 문헌인, Molecular Cloning : A laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor에 기술되어 있다]을 지니는 pBR322의 AMP^R, TET^S유도체이다. 이것은 EcoRI 및 BamHI으로 pMTllhc를 제한 분해하고, 5'의 수득되는 점성 말단을 필링(filling)하며 ClaI 링커(CATCGATG)로 연결시킴으로써, EcoRI 및 BamHI 부위를 보존하고 SmaI 부위를 ClaI 부위로 교체시킴에 의해 ClaI 부위를 함유하도록 변형시킨다. TRPC11 작제물로부터의 형질전화체 하나는 ClaI 부위로서 플랭크(flank)된 텐던(tandem) RBS 서열을 지닌다. ClaI 부위중 하나와 RBS 서열의 제2카피중 일부는 이 플라스미드를 PstI으로 분해하고, Bal31 뉴클레아제로 처리하며, EcoRI으로 제한분해하고 4개의 모든 데옥시뉴클레오타이드 트리포스페이트 존재하에서 T4 DNA 폴리머라제로 처리함으로써 제거한다. 수득되는 30 내지 40bp의 단편은 PAGE를 통해 회수하여 SmaI 제한분해된 pUC12내로 클로닝시킨다. 다음 pKC101[참조 : Nichols et al. (1983)의 Methods in Enzymology 101 : 155-164, Academic Press, N. Y]로부터 기원한 248bp의 이.콜라이 trp^P-함유 EcoRI 단편을 EcoRI 부위내로 클로닝시켜 TRPC11 작제물을 완성한다. 이것은 제1도에 나타낸다. TRPC11을 우선 ClaI 및 BamHI으로 분해하며, 이를 정제한 후 성숙한 BCRF1을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 함유하는 M13의 ClaI-BamHI 단편을 지닌 표준연결 용액중에서 이를 혼합함으로써 vIL-10에 대한 벡터로서 사용한다. TRPC11-BCRF1으로 언급되 는, 삽입체-함유 TRPC11은 기탁번호 제33876호하에 ATCC로 부터 입수가능한 이.콜라이 K12 균주 JM101내에서 증식시킨다.

[연구 A]

[인터루킨-2-유도된 인터페론-γ 합성시 인터루킨-4 및 인터루킨-10의 분화 효과 및 임포킨-활성화된 킬러 활성]

본 단락에서 나타낸 자료는 우선일 경과후 휴등에 의해 문헌[참조 : Hsu et al. (1992), Int'l Immunology 4 : 563-569]에 공개되었으며, 이 내용은 모두 본원에서 참조로 인용하였다.

[요약]

인터루킨-2(IL-2)를 지닌 사람 말초 혈액 단핵 세포(PBMlC)의 배양물은 사이토킨의 합성 및 임포킨-활성화된 킬러(LAK) 활성의 생성을 자극한다. 인터루킨-4(IL-4) 및 인터루킨-10(IL-10; 사이토킨 합성 억제 인자, CSIF) 모두는 사람 PBMC에 의한 IFNγ 및 TNFα의 IL-2-유도된 합성을 억제한다. 그러나, IL-4와는 달리, IL-10은 PBMC 및 새로운 천연의-킬러(NK) 세포의 IL-2-유도된 증식 또는 IL-2-유도된 LAK 활성을 억제하지 못한다. 더우기, IL-4는 정제된 새로운 NK 세포에 의한 IL-2-유도된 IFNγ 합성을 억제하는 반면, IL-10의 억제효과는 CD1⁴+ 세포(단핵세포/대식세포)에 의해 매개된다. IL-10는 단핵세포 또는 단핵세포 + NK 세포에 의한 TNFα 합성을 억제하지만, NK 세포만에 의한 TNFα 합성을 억제하지 않는다. 이 결과는 IL-4 및 IL-10이 명백한 경로를 통해 NK 세포상에서 작용하며, IL-2-유도된 사이토킨 합성 및 LAK 활성은 상이한 메카니즘을 통해 조절됨을 보여준다.

인터루킨-1이사이토킨 합성 억제 인자, CSIF)은 마우스 및 사람 T-임파구와 단핵세포/대식세포에 의한 사이토킨(예; IFNγ)의 합성을 억제한다. T세포 사이토킨 합성에 있어서 억제 효과는 간접적이며, 항원이 존재하는 세포에서와 같이 이의 능력은 단핵세포/대식세포에 의해 조절된다. 마우스 및 사람 IL-10(mIL-10; hIL-10) 모두는 마우스 및 사람 세포상에서 IL-10 활성을 나타내는, 엡스테인-바르 바이러스(Epstein-Barr virus) 개방 판독 프레임 BCRF1(바이러스 IL-10; vIL-10)에 대해 상동이다. vIL-10이 사람 PBMC에 의한 IL-2-유도된 IFNγ 합성을 억제함이 일찌기 관측되었다. NK 세포가 IL-2-자극된 PBMC내에서 IFNγ의 기본적인 공급원임이 보고되었기 때문에, IL-2-유도된 사이토킨 합성 및 LAK 활성에 있어서 hIL-10 및 vIL-10의 효과는 LAK 활성의 공지된 억제제인, IL-4에 대한 이들 사이토킨을 비교함에 따라서 연구되어 왔다. 이 데이타에서 IL-4, hIL-10 및 vIL-10은 IL-2- 자극된 PBMC에 의한 IFNγ 및 TNFα의 합성을 억제하지만, 단지 IL-4만이 정제된 NK 세포에 의한 IFNγ합성을 억제함을 보여준다. 더우기, IL-4와는 다르게, IL-10은 IL-2-유도된 LAK 활성을 억제하지 않는다. 이 결과는 IL-4 및 IL-10이 NK 세포상에서 상이한 메카니즘으로 작용하여, IL-2 유도된 사이토킨 합성 및 LAK 활성이 명확한 경로로써 조절되는 모델을 지지한다.

[실시예 A1]

[IL-2-유도된 사이토킨 합성 및 LAK 활성에 있어서 IL-4 및 IL-10의 효과]

[사이토킨]

사람 재조합체 IL-2(rIL-2)는 에스. 주라우스키[S. Zurawski(DNAX)]에 의한 표준 방범을 사용하여 편리하게 제조하거나 구입한다(Cetus, Emerybille, CA 제조원). 사람 rIL-4는 쉐링-플로우 리서치(Schering-Plough Research)로부터 입수한다. 사람 γIL-1β는 바이오소오스 인터네셔날(Biosource International; Camarillo, CA)로부터 입수한다. 재조합체 hIL-10 및 vIL-10은 COS7 형질감염 상층액으로서 사용하며; 비가역적인 cDNA를 사용하거나 cDNA를 사용하지 않은 형질감염으로부터의 상층액을 대조군으로서 사용한다[참조; 본원에서 참조로 인용한 문헌인, Viera et al.(1991) al. (1990) Proc. Nat'l Acad Sci., USA 88 : 1172-1176, and Hsu et al (1990) Science 250 : 830-832]. IFNγ 및 TNFα (Endogen, Boston, MA 제조원)는 ELISA로서 측정한다. IL-2-부재하에서의 사이토킨 생성은 IFNγ 및 TNFαELISA 검정의 감도의 한계 이하이며 각각 0.37ng/ml 및 12pg/ml이다.

[세포주]

다우디[Daudi, 버킷 임파종(Burkitt lymphoma)] 세포는 쉐링-플로우(Lyon, France)에서 제공된다. 루이스 라니어(Lewis Lanier)에 의해 제공된 COLO(결장암) 세포는 RPMI 1640 + 5% 태아 소 혈청중에서 배양한다

[항체]

백혈구 세포 표면 항원에 대한 모노클로날 항체(CD3, CD4, CD5, CD14, CD16, CD19 및 CD56)는 벡톤-디킨슨(Becton-Dickinson; San Jose, CA)에서 시판된다. 마그네틱 비드 고갈 실험용 항체(CD3, CD4, CD5, CD14 및 CD19)는 적절한 세포주를 주사한 SCID 마우스의 복수액으로부 제조한다. 항-IL4 및 항-IL-10 중화 항체는 본원에서 참조로 인용한 문헌[참조 Chretien et al. (1989) J. Immunol. Methods 117 : 67-81; 및 Yssel et al. J. Immunol. Methods. 72 : 219-227]에 기술되어 있다.

[PBMC 제조 및 배양]

사람 PBMC는 Ficoll-Hypaque 위에서 원심분리함으로써 건강한 공여자의 연막으로부터 분리하고 1% 사람 Ab⁺혈청이 있는 예셀(Yssel's) 배지내에서 다른 사이토킨이 있거나 없이 10⁶/ml ub γIL-2(200단위/ml)에서 배양한다. 배양은 24(또는 96)-웰 플레이트내에서 5일등안 수행하고 상층액을 하베스트한다. 상이한 공여자로부터의 PBMC는 IL-2로 자극시킬 경우IFNγ및 TNFα를 생성하는 능력에 있어 가변적이다.

[세포 정제]

PBMC를 세척하고 37℃의 조직 배양 디쉬내에서 40분동안 배양한다. 유착세포는 러버 폴리스만(rubber policeman)으로 스크랩핑(scraping)함으로써 수집한다. 비-유착 세포를 제거하고, 펠렛화하며, 나일론 울 컬럼(nylon wool column)에 적용시키고 37℃에서 40분동안 배양한다. 컬럼으로부터 용출시킨후, 세포를 폘렛화하고, 10% FCS/PBS와 함께 30% Percol1중에 재현탁시키며 40% Percol1상에서 적층화한다. 실온에서 30분동안 원심분리한후, 표면에서 큰 과립성 임파세포를 회수하여 2회 세척한다. 이 세포를 항-CD56 항체(Becton-Dickinson, San Jose, CA 제조원)와 함께 4℃에서 30분동안 배양하고, 세척한 다음 FACS 분류이전에 염소-항-마우스-FITC(Jackson Immunoresearch, Avondale, PA 제조원)로써 염색한다. CD56+ 세포는 분류할 세포 약 35 내지 50%를 포함한다. 분류한 세포는 재분석시 99.5% CD56+이상이다. 9x10⁴개의 정제된 NK 세포를 최종 100ml 용량중에서 3x10⁴유착 세포 또는 T 세포와 혼합하고 IL-2와 함께 기타의 사이토킨이 있거나 없이 배양한다.

동일한 공여체로부터의 정제된 NK세포 및 단핵세포를 하기와 같이 수득한다 : PBMC는 양 혈액 적색 세포와 함께 밤새 배양한다; 로제팅(rosetting) "E+"(CD2+) 및 비-로제팅 "E-" 세포는 피콜-하이파그 구배(ficoll-hypaque gradient)위에서 원심 분리함으로써 분리한다. E+ 세포는 PBMC에 대해 기술한 바와 동일한 정제방법(상기 참조)에 적용시켜 정제된 NK 세포를 수득한다. E-세포는 항-CD 14mAb(LeuM3)와 함께 계속 배양하고 FITC-표지된 염소 항-마우스 IgG 항체 및 CD14+ 세포는 FACS_tar플러스(plus)상에서 분류한다. 이 세포의 순도는 98% 이상이다. 105개의 정제된 NK세포를 100ml중 104개의 순수한 단핵세포와 혼합하고 단독 또는 IL-2 및 상술한 바와 같은 다른 부가물과 함께 배양한다.

달리는, NK 세포 및 단핵세포를 마그네틱 비드 선택에 의해 풍부하게 한후, 하기와 같이 분류한다 : PBMC를 우선 모노클로날 항-CD3, -CD4, -CD5 및 항-CD19 항체와 함께 배양하여 T세포 및 B 세포를 염색한다. PBS로 2회 세척한 후, 염소 항-마우스 IgG- 피복된 마그네틱 비드(Dynabeads M-450, Dynal Inc., Great Neck, NY 제조원)를 가하여 항체-피복된 T 세포를 제거하고 마그네틱성 선별에 의해 B 세포를 제거한다. 수득되는 풍부한 NK세포 및 단핵세포는 항-CD 56-PE 및 항-CD 14-FlTC와 세포 분류기상에서 분리된 CD56+ 및 CD14+세포로 염색한다. 2개의 분포류된 세포 집단의 순도는 98.5% 이상이다.

[세포독성 검정]

PBMC는 1% 사람 AB+혈청을 함유하는 예셀 배지중에서 3일동안 10⁶세포/ml에서 200U/ml IL-2와 함게 배양한다. 배양은 Linbro 24-웰 플레이트(Flow Laboratories, MeLean, VA 제조원)의 1ml 웰중에서 수행한다. 배양 기간후, 세포를 하베스트하고, 2회 세척하여⁵¹Cr 방출 검정시 유효기 세포로서 사용한다[참조 : 본원에서 참조로 인용한 문헌인 Spits et al. (1988) J. Immunl. 141 : 29-]. 1000개의⁵¹Cr-표지된 타젯 세포(COLO 또는 Daudi)를 U-형의 96-웰 플레이트 내에서 0.25% BSA(Sigma Chemical Co., St, Louis, MO 제조원)를 함유하는 이스코브 배지(Iscove's medium)내에서 가변적인 수의 유효기 세포와 혼합한다. 플레이트는 급습시킨 5% CO₂대기중 37℃에서 4시간동안 배양하기전에 50xg에서 5분동안 원심분리 한다. 샘플을 하베스트하여 r-카운터(LAB, Bromma, Sweden) 내에서 계수한다.

제조합 hIL-10, vIL-10 및 hIL-4를 IFNγ 및 TNFα 합성에 있어서의 효과, 및 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)내에서 IL-2에 의해 유도된 LAK 활성에 있어서의 효과에 대해 시험한다. PBMC를 γIL-2 200U/ml 중에서 γIL-4(200U/ml) 또는 hIL-10, vIL-10을 함유하거나, 사이토킨[모크(mock)]이 없는 COS7 상층액과 함께 5일동안 배양한 후, 사이토킨 합성을 측정한다. hIL-10, vIL-10 또는 IL-4를 함유하는 배양물중에서 IL-2 유도된 IFNγ 및 TNFα 합성은 실제적으로 억제된다(제2a, 2b도).

IL-4를 사용하여 수득한 결과는 IL-4가 IFNγ mRNA 및 단백질의 IL-2-유도된 발현을 억제한다는 관측을 확증시킨다. IL-4 및 IL-10 모두에 의한 사이토킨 합성의 억제는 용량-의존성이며, 각각 항-hIL-4 및 항-hIL-10 모노클로날 항체를 차단함으로써 역전되나, 이소타입 대조군 면역글로불린에 의해서는 역전되지 않는다(제2c, 2d도 ).

LAK 활성은 또한 LAK 세포에 의해 효율적으로 사멸되지만, 새로운 NK 세포에 의해서 사멸되지 않는, 버킷 임파종 세포주 Daudi 및 결장암 세포주 COLO에 대해서 추정된다. Daudi 및 COLO 세포에 대한 IL-2-유도된 LAK 활성은 IL-4를 함유하는 배양물중에서만 억제되며, hIL-10 및 vIL-10 배양물중에서는 변화되지 않거나 단지 약간만 증진된다(제3a도). IL-2-유도된 LAK 활성은 우선 CD56(Leu 19)+NK 세포에 의해 매개된다. COLO 세포에 대한 LAK 활성이 IL-10에 의해서 억제되지 않는다는 사실은 활성화된 NK 세포에 의해서 매개된 세포 독성이 이 사이토킨에 의해 영향받지 않음을 의미한다. 그러나, 활성화된 CD3+ gd+ T세포는 Daudi 세포를 사멸시킬 수 있기 때문에, IL-10이 Daudi에 대해서 IL-2-유도된 gd+ T세포 독성을 자극하며 동시에 이 타겟 세포에 대한 IL-2-유도된 NK 활성을 차단함도 가능하다.

IL-2 및 hIL-10과 함께 배양시킨 PMBC중에서 유도된 항-Daudi LAK 세포의 표현형을 측정하기 위해서, CD56+ 및 CD56- 집단은 FACS로써 분류하고 Daudi 세포에 대한 세포독성을 시험한다. 제3b도는 IL-2 단독을 사용할때와 같이, 현저한 LAK 활성이 단지 CD56+ 집단에서만 관측됨을 보여준다. 따라서 IL-4 및 IL-10 모두는 IFN 및 TNFα의 IL-2-유도된 합성을 억제하는 반면, 단지 IL-4만이 PBMC중에 존재하는 활성화된 NK 세포에 의해서 IL-2-유도된 세포독성을 억제한다.

[실시예 2]

[IL-2-자극시킨 정제된 NK 세포의 증식에 의해서 IFNγ합성을 억제하지 않는 IL-10]

[증식검정]

세포를 96-웰 환저 플레이트 내에서 10⁵세포/웰로 분산시키고 사이토킨 존재 또는 부재하에 4일동안 최종 용량이 200㎕/웰이 되도록 배양한다. 다음 10㎕ 중³H-티미딘 1mCi를 각각의 웰에 가한다. 6시간후, 이 배양물을 하베스트하고 혼입된 방사성을 신틸레이션 카운팅으로 추정한다.

PBMC중에서 IL-2-유도된 IFNγ 합성의 대부분은 T세포 보다는 오히려 NK 세포로부터 기원한다고 보고되어 있다. 따라서 IL-2-유도된 IFNγ 합성시 hIL-10, vIL-10 및 IL-4의 효과를 FACS-정제된 NK세포(순도 ＞ 99.5%)로써 시험한다. IL-4는 이들 세포에 의한 IL-2-유도된 IFNγ 분비를 억제하며; 반대로, hIL-10 또는 vIL-10 어느 것도 정제된 새로운 NK 세포에 의한 IFNγ 합성을 억제하지 않는다(제4a도). 더우기, IL-4는 PBMC 또는 정제된 NK 세포에 의한 IL-2-유도된 증식을 현저히 억제하는 반면, IL-10은 IL-2-매개된 증식에 있어서 효과적이지 않다(제4b도).

IL-4와는 대조적으로, IL-10은 NK 세포에 직접적으로 영향을 미치지 않으나, 단핵세포 능력을 억제하여 공동의-자극적인 시그날을 제공한다. 이 결론은 IL-2-유도된 IFNγ 생산시 IL-10의 효과에 의해 명백히 지지된다. 상기 주시한 바와 같이, 보조 세포 제제는 IFNγ를 생성하지 않는다. 비록 IL-2-자극된 NK 세포가 보조세포없이 IFNγ를 현저한 수준으로 생성한다해도(제4a, 5a 및 5b도), 정제된 NK 세포에 대한 플라스틱-유착 세포 및 정제된 CD14+세포의 첨가는 다량의 IFNγ 합성을 초래한다. NK 세포상에서 IL-10의 직접적인 효과의 부재는(제4a 및 4b도),

IL-10이 단핵세포상에서 작용함으로써 IL-2-유도된 IFNγ생성을 억제함을 제안하고 있다. 유사하게, IL-10에 의한 T세포 사이토킨 합성의 억제는 단핵세포/대식세포 보조 세포에 의해 매개된다.

[실시예 A3]

[IL-2-자극된 IFNγ의 IL-10에 의한 억제 및 NK 세포에 의한 TNFα 합성을 매개하는 단핵세포]

IFNγ 합성은 PMㄸ의 배양물중에서 IL-10에 의해 억제되나 순수한 NK 세포의 배양물중에서 1L-10에 의해 억제되지 않는다는 사실은 IL-10의 효과가 보조세포에 의해 매개됨을 의미한다. 이들 보조 세포의 특성을 시험하기 위해서, NK 세포는 퍼콜 구배 원심분리에 의해 수득한 저-밀도 세포 분획, 또는 T-세포-, B-세포- 및 단핵세포-고갈된 PBMC로부터의 CD56+ 세포를 분류함으로써 정제하고, 플라스틱-유착 세포 또는 퍼클 구배로부터의 고-밀도 세포 집단(98% T 세포)와 혼합한다. NK 세포에 유착 세포를 첨가함으로써 NK 세포에 의한 IL-2-유도된 IFNγ 생성이 크게 증가되며; 유착 세포의 자극 효과는 IL-10에 의해 차단된다(제5a도). 이 유착 세포 집단 자체는 IL-2와 반응시 검출가능한 수준의 IFNγ를 생성하지 않는다. 역으로, T세포-함유 분획은 NK 세포에 의한 IL-2-유도된 IFNγ 생성에 있어 효과가 없으며 IL-10에 의한 IFNγ 생성의 억제를 매개된하지 않는다(제5a도).

플라스틱-유착 세포에는 단핵세포가 풍부하나, 다른 세포 집단을 함유하지는 않는다. 단핵세포가 IL-2-유도된 IFNγ생성을 증진시키고 IL-10에 의한 이의 억제를 매개된한다는 것을 확증하기 위해, NK 세포 및 CD14+ 단핵세포를 분류시킴으로써 정제하고 IL-2 및 IL-10의 존재하에 배양한다. 제5b도는 NK 세포에 정제된 단핵세포를 첨가시킴으로써 IL-2-유도된 IFNγ 생성을 증가시키고, IL-10은 이러한 증가를 억제시킴을 나타낸다.

질적으로 유사한 결과가 TNFα 합성에 대해서 관측된다. 제5c도에서는, 예상된 바와 같이, NK 세포가 IL-2와 반응시 검출가능한 TNFα를 생성함을 나타낸다.

CD14+ 세포는 IL-2와는 독립적으로 TNFα를 생성한다. IL-10은 IL-2의 존재(제5c도) 및 부재하 모두에서 단핵세포에 의한 TNFα 생성을 억제한다. 역으로, NK 세포에 의한 TNFα 합성은 IL-10에 의해 억제되지는 않는다. NK 및 CD14+ 세포 모두의 자극은 세포 단독에 대해서 관측되는 것보다 실제적으로 더욱 높은 수준의 TNFα 생성을 초래하며, 이 증가는 IL-10에 의해 차단된다.

단핵세포 및 이의 산물은 나머지 NK 세포에 의한 IL-2-유도된 IFNγ 생성을 실제적으로 증가시킴이 밝혀져 있다(제5b도). IL-1 및 TNFα와 같은, 몇몇의 모노킨은 다양한 조건하에서 사람 및 마우스 NK 세포에 의한 IFNγ 합성시 공동- 자극인자로서 연관되어 있다. IL-10이 LPS- 또는 IFNγ-자극된 단핵세포/대식세포에 의한 모노킨(예; IL-1, IL-6 및 TNFα)의 합성을 억제한다는 사실은 본원에 보고된 IL-10의 효과가 보조 세포에 의한 공동-자극성 분자의 생성을 억제하는 IL-10에 기인한다는 것을 암시한다. 유착 세포의 상층액(대부분의 단핵세포를 함유)은 IL-2-자극되고, 정제된 NK 세포에 의한 IFNγ 생성을 증진시키는 반면, IL-10의 존재하에서 배양시킨 유착 세포의 상층액은, 심지어 IL-10이 고갈된 경우라도 이 능력을 상실함이 관측되었다. 상층액 활성이 보조 세포의 공동-자극 효과 전체를 포함하는지의 여부는 분명치않다. IL-6 또는 TNFα를 제외한 IL-1α 및 IL-1β는 NK 세포에 의한 IL-2-유도된 IFNγ 생성을 공동-자극시키나, 100OU/ml 이하의 IL-1의 첨가로 분휙화되지 않은 PBMC에 의해서 IL-2-유도된 IFNγ 합성시 IL-10의 억제효과를 역전시키지 않는다. 따라서, 하나이상의 추가 활성 기능이 이 시스템에 존재하거나, IL-10이 NK 세포에 의한 사이토킨 합성을 억제하는 제2인자의 합성을 유도한다는 가능성이 존재한다.

[연구 B]

[사람 단핵세포 의한 사이토킨 합성을 억제하는 IL-10 : 단핵 세포에 의해 생성된 IL-10의 자가조절성 역할]

본 단락에서 나타낸 데이타는 우선일 경과후 발표된, 본원에서 참조로 인용한 문헌[참조 : de Waal Malefyt et al. (1990) J. Exptl. Med 174; 1209-122이에 공개되어 있다.

[요약]

본 단락에서는 LPS에 의해 활성화된 사람 단핵세포가 용량 의존성 양식으로, 사이토킨 합성 억제 인자(CSIF)로 이미 지명된, 인터루킨 10(IL-10)을 고수준으로 생성시킬 수 있음을 입증한다. IL-10은 단핵세포 활성화후 7시간만에 관측가능하며 IL-10 생성의 최대 수준은 24 내지 48시간후 관측된다. 이 역학에서는 사람 단핵 세포에 의한 IL-10의 생성이 활성화된지 4 내지 8시간후 모두 높은 수준으로 분비되는, IL-1α, IL-1β, IL-6, IL-8, TNFα 및 G-CSF의 생성과 비교할때 상대적으로 느림을 나타낸다. LPS 활성화된 단핵세포에 의한 IL-10의 생성은, IL-4에 의해 억제된 IL-1α, IL-1β, IL-6, IL-8, TNFα, GM-CSF 및 G-CSF의 것과 유사하다. 더우기, 단핵세포에 가해진 IL-10은, 배양단계에서 IFNγ, LPS 또는 LPS와 IFNγ의 배합물에 의해 활성화되며, 전사 단계에서 IL-1α, IL-1β, IL-6, IL-8, TNFα, GM-CSF, 및 G-CSF의 생성을 강력하게 억제한다. 사람 세포상에서 유사한 생물학적 활성을 지니는 바이러스-IL-10 역시, 단핵세포에 이은 LPS 활성화에 의한 TNFα 및 GM-CSF의 생성을 억제한다. 중화 항-IL-10 mAbs의 존재하에서 LPS에 의한 단핵세포의 활성화는 LPS 단독 처리와 비교시 다량의 사이토킨 생성을 초래하며, 이는 내인성적으로 생성된 IL-10이 IL-1α, IL-1β, IL-6; IL-8, TNFα, GM-CSF, 및 G-CSF의 생성을 억제함을 나타낸다. 또한, IL-10은 LPS 활성화된 단색세포내에서 IL-10 mRNA 합성을 강력하게 억제하기 때문에 자가조절 효과를 지닌다. 더우기, 내인성적으로 생성된 IL-10은 제II형 MHC 발현에 이어 LPS를 사용한 단핵 세포의 활성화시 감소에 관여하는 것으로 밝혀졌다. 이 결과로부터 IL-10이 제II형 MHC 발현을 하향 조절하고, 단핵세포에 의한 프로염증성 사이토킨의 생성을 억제하는 능력으로 인해 면역학적 반응 및 염증 반응에 있어서 중요한 조절 효과를 가짐을 알 수 있다.

뮤린(murine)-인터루킨 10(IL-10)은 최근에 동정되었으며 클론된 유전자는 사이토킨 합성 억제(CSIF) 활성에 기준한다. 뮤린 시스템에서, IL-10은 CD4⁺Th2아류에 의해 생성되며 Th1 클론에 의해서, 사이토킨, 특히 IFNγ 생성을 억제한다.

IL-10에 의한 사이토킨 생성의 억제는 B세포를 제외한, 대식세포를 항원 존재 세포(APC)로서 사용하는 경우에만 관측된다. 이 CSIF 활성 이외에, IL-10은 다상 유전성이며 흉선세포, 세포독성 T 세포, 유방세포, B 세포, 및 대식세포를 포함하는 상이한 세포 유형 상에서 작용하는 것으로 나타났다.

사람 IL-10은 또한 CSIF 활성을 나타낸다. PHA 또는 항-CD3 mAbs에 의해 활성화된 PBMC에 의한 IFNγ 및 GM-CSF의 생성은 IL-10에 의해 강력히 억제되며 이 억제는 전사 단계에서 일어난다. 사람 및 뮤린 IL-10 모두는 엡스타인 바르 바이러스 게놈내 특성화되지 않은 개방 판독 프레임인, BCRF-1과 상동성인 확장 서열을 지닌다. 상기 개방 판독 프레임이 발현되면 마우스 및 사람 T 세포상에서의 CSIF활성을 포함하는, 사람 및 뮤린 IL-10의 모든 특성을 공유하고 있는, 활성 단백질인 바이러스-IL-10 (v-IL-10)이 수득된다.

사람 IL-10 및 v-IL-10은 제II 부류 MHC 분자의 하향 조절을 통하여 사람 단핵세포의 항원 존재 능력을 감소시킴으로써 항원 특이적인 증식성 T 세포 반응을 억제할 수 있다. 이 결과는 본원에서 사람 단핵세포가 IL-10을 고수준으로 생성함에 이어 LPS로서 활성화시킬 수 있으며 이 생성은 다른 모노킨의 것과 비교할때 상대적으로 느림을 나타낸다. 또한, 본원에서 IL-10이 프로염증성 사이토킨, 즉 IL-1α, IL-1β, IL-6, IL-8 및 TNFα와 조헐성 성장인자, LPS에 의해 활성화된 단핵세포에 의한 GM-CSF 및 G-CSF 또는 LPS 및 IFNγ의 생성을 강력히 억제한다고 보고하였다. 내인성적으로 생성된 IL-10은 IL-1α, IL-1β, IL-6, IL-8, TNFα GM-CSF 및 단핵세포에 의한 G-CSF 생성시 자가조절 효과를 지닐뿐아니라, 단핵 세포상에서 자체 생성 및 제II부류 MHC 발현을 자가 조절 양식으로 하향 조절시킨다. 이 결과는 IL-10이 면역학적 반응 및 염증 반응에 있어서 중요한 조절 효과를 지님을 나타낸다.

[실시예 B1]

사람 단핵세포에 의해 생성된 IL-10

사람 단핵세포의 분리 및 배양

사람 말초혈액 단핵세포를 정상 공여자의 혈액 500ml로부터 분리한다. 단핵세포는 혈액 성분 분리기내에서 밀도 원심분리한후, 이어서 원심분리성 용출처리에 의해 임파구와 단핵세포로 분획화함으로써 분리한다. 이 단핵세포 제제는 비특이적인 에스터라제 염색에 의해 판단된 것으로서의 순도가 ＞95%이며 살아있는 세포 98% 이상을 함유한다. 단색세포는 1% 혼주되고, 가열로 불활성화시킨 사람 AB⁺혈청이 보층된 사람 혈청 알부민(HSA)을 함유하는 예셀 배지내에서 배양한다. 이 배양 배지는 리물루스 아베바양세포 분해물 검정(limulus amebocyte lysate assay)에 의해 측정된 것으로서 내독소를 함유하지 않는다(내독소 ＜ 0.2ng/ml). 단핵세포는 이들 세포의 유착을 방지하는, 테플론 백(Jansen MNL, St Niklaas, Belgium 제조원)내에서 4×10⁶세포/ml의 농도로 배양한다. 제시한 시간동안 배양한후, 단핵세포를 수집하고 직접적인 면역형광에 의해 세포 표면 발현을 분석하거나 노던 및 PCR 분석에 의해 림포킨(lymphokine) 유전자 발현을 분석한다. 또한, 단핵세포 배양 상층액을 IL-1α, IL-1β, IL-6, IL-8, 1L-10, TNFα, GM-CSF 및 G-CSF 생성에 이은 이들 세포의 활성을 위해 수집한다. 배양후 세포의 생존도는 트립판 블루우 배출(trypan blue e×clusion)에 의해 측정한 것으로써 항상 95%를 초과한다.

[반응제]

제조합 사람 IL-10 및 v-IL-10은 글루타티은-S-트랜스퍼라제 융합 단백질로서 이.콜라이내에서 발현시키고, 정제하며, 트롬빈으로 분해하여 N-말단 융합부분을 제거함으로써, 활성의 사람 및 바이러스 IL-10을 생성시킨다. 정제된 사람 r-IL-4 및 r-IFNγ는 쉐링-플로우 리서치(Bloomfield, NJ 제조원)에서 제공한다. LPS(이.클라이 O127:B8)는 디프코 래보러토리(Difco laboratories; Detroit, MI)에서 입수한다. 중화 항-IL-10 mAb 19F1은 vIL-10에 대해 생성되며 사람 및 바이러스-IL-10 모두를 효과적으로 중화시킨다.

[림포킨 측정]

단핵세포에 의한 IL-1α 및 TNFα의 생성은 엔도겐(Endogen; Boston, MA 제조원)으로부터 입수한 림포킨 특이적인 ELISA로써 측정한다. 이 ELISA의 최저 검출 한계는 각각 50pg/ml 및 10pg/ml이다. IL-1β의 생성은 시스트론(Cistron, Pine Brook, MJ 제조원)으로부터 입수한 림포킨, 특이적인 ELISA로써 측정한다.

이 ELISA의 감도는 20pg/ml이다. IL-6 농도는 겐자임(Genzyme, Boston, MA 제조원)으로부터 입수한 림포킨 특이적인 ELISA로써 측정한다. 이 검정의 감도는 0.313ng/ml이다. IL-8 및 G-CSF 특이적인 ELISA는 R ＆ D 시스템(R ＆ D Systems; Minneapalis, MN 제조원)으로부터 입수하고 IL-8 및 G-CSF 생성을 적량하는데 사용한다. 이 ELISA의 감도는 각각 4.7pg/ml 및 7.2pg/ml이다. GM-CSF 생성은 림포킨 특이적인 ELISA로 측정한다. 이 ELISA의 감도는 50pg/ml 이다. IL-10 생성은 항-IL-10mAb(JES 9D7)를 피 복항체로서 사용하고 다른 항-IL-10mAb(JES3-12G8)는 트레이서 항체(tracer antibody)로 사용하는 특이적인 ELISA로써 측정한다. 이 ELISA의 감도는 50pg/ml이다.

IL-10은 활성화된 사람 T 세포 클론, 활성화된 말초 혈액 T 세포 및 B 세포, EBV 형질전환된 B 세포주 및 단핵세포에 의해 생성된다. 고도로 정제된 사람 단핵세포는 원심분리성 용출 처리로서 분리하고, IL-10을 생성시킨후 LPS로써 활성화시킨다. 또한, 이들 사람 단핵세포는 높은 농도의 IL-6, TNFα 및 GM-CSF를 생성할 수 있음을 알 수 있다(제6도). LPS 활성화된 단핵세포에 의한 사이토킨 생성 역학은 LPS 활성화된 단핵세포에 의한 IL-10 생성이 상대적으로 느림을 나타낸다. 이것은 7.5시간만에 하베스트한 상층액중에서 처음으로 검출되나, 최대 생성은 활성화된지 20 내지 48시간만에 관측된다. 이와는 대조적으로, TNFα 및 IL-6은 활성화되면 빠르게 생성되어 활성화를 수반한지 각각 3.5 및 7.5시간만에 최대 농도의 생성에 이른다(제6도). 그러나, GM-CSF 생성은 또한 LPS에 의한 단핵 세포의 활성화후 7.5시간만에 처음으로 검출되나, 이 경우 최대 생성 농도는 20시간만에 이른다. 용량 반응 연구는 10ng/ml에서 LPS에 의한 단핵세포의 활성화가 IL-10를 현저한 농도로 생성시키는 반면, 최대의 IL-10 합성은 1㎍/ml의 LPS 농도에서 관측됨을 나타낸다(제7도).

[실시예 B2]

사람 단핵세포에 의한 사이토킨 생성을 억제하는 IL-10

IL-10은 활성화된 PBMC에 의한 IFNγ 및 GM-CSF 생성을 억제하는 것으로 나타났다. 단핵세포에 의한 사이토킨의 생성시 IL-10의 효과를 측정하기 위해서, 고도로 정제된 단핵세포를 IL-10의 부재 또는 존재하에서 LPS로서 24시간 동안 활성화시킨다. 또한, 단핵세포는 IL-4(100U/ml) 또는 중화시키는 항-IL-10mAb 19F1의 존재하에서, v-IL-10에 대해서는 생성되지만 사람 IL-10 및 v-IL-10 모두를 효율적으로 중화시키는 LPS를 사용하여 24시간동안 활성화시킨다. 사이토킨 생성은 활성화후 24시간동안 하베스트한, 이 배양물의 상층액중에서 사이토킨 특이적인 ELISA's로써 측정한다. 표B1에 나타낸 바와 같이, 37℃의 배지 단독중에서 배양된 단핵세포는 IL-1α, IL-1β, IL-6, IL-10, TNFα, GM-CSF 및 G-CSF를 생성하지 않는다. 이러한 조건하에서, 단지 현저한 농도의 IL-8만이 합성된다. LPS(1㎍/ml)를 사용한 단핵세포의 활성화로 고농도의 IL-1α, IL-1β, IL-6, IL-8, IL-10, TNFα, GM-CSF 및 G-CSF가 생성된다. 흥미롭게도 IL-10은 IL-1α, IL-1β, IL-6, IL-8, TNFα, GM-CSF 및 G-CSF의 생성을 다양한 정도로 억제한다(표B1).

IL-10의 가장 강력한 억제효과는 IL-1α, TNFα, GM-CSF 및 G-CSF의 생성시 관측되며, 이는 80 내지 100% 차단된다. IL-1β 및 IL-6 생성의 억제는 덜 명확한 반면, IL-8의 합성은 IL-10에 의해서 단지 약간만 영향 받는다.

[표 B1]

[실시예 B3]

IFNγ에 의해 활성화된 단핵세포의 사이토킨 생성을 억제하는 IL-10

IL-10은 또한 IFN-γ 또는 IFN-γ와 LPS의 배합물에 의해 활성화된 단핵세포에 의한 사이토킨 생성을 억제한다. 제8도는 100U/ml의 최적농도에서 IFNγ가 일반적으로 1㎍/ml의 최적 농도에서의 LPS 보다 사이토킨 분비의 보다 덜 강력한 유도체임을 나타낸다. 더우기, 사이토킨 생성에 있어서 단핵세포에 의한의 IFNγ와 LPS의 배합물의 효과는 일반적으로 부가적임이 입증되었다. IL-10의 가장 강력한 억제 효과는 IL-1α, TNFα 및 GM-CSF 생성시 관측된다. TNFα 및 GM-CSF 분비는 심지어 최적의 LPS 및 IFNγ 농도로서 단핵세포를 활성화시켜도, 90% 이상 억제된다. 비록 IL-1β 및 IL-6 분비에 있어서 고려할만한 억제 효과가 최적의 자극 조건에서 관측된다해도, 이들의 억제는, 최적 농도의 IFNγ의 부재 또는 존재하에서, 단핵세포를 적당한 농도의 LPS로서 자극시키는 경우에도 명백하다.

[실시예 B4]

단핵세포에 의한 사이토킨 생성을 억제하는 바이러스-IL-10

바이러스 IL-10 및 사람 IL-10은 사람 세포상에서 유사한 효과를 지닌다. 제9도는 IL-10 및 v-IL-10이 단핵세포에 의한 TNFα 및 GM-CSF 생성을 유사한 양식으로 억제함을 나타낸다. 100U/ml의 농도로 가해진, IL-10 및 v-IL-10은 단핵세포에 의한 TNFα 및 GM-CSF 생성에 이은 LPS(1㎍/ml)에 의한 활성화시 현저한 억제효과가 있다. TNFα 및 GM-CSF 분비에 있어서 IL-10 및 v-IL-10의 억제 효과는 배양을 mAb 19F1의 존재하에 수행하는 경우 역전되며 (제9도), 이 사실은 v-IL-10의 억제 효과의 특이성을 입증하고 있다. 사실상, IL-10 또는 v-IL-10 및 중화시키는 항-IL-10mAb의 존재하에서 LPS에 의한 단핵세포의 활성화가 심지어 TNFα 및 GM-CSF의 생성을 증진시킨다는 사실은, 내인성적으로 생성된 IL-10이 이 사이토킨 생성을 억제함을 나타낸다.

단핵세포에 의한 사이토킨 생성에 있어서 내인성적으로 생성된 IL-10의 억제효과는 중화시키는 항-IL-10mAb의 존재하에서 LPS 활성화된 단핵세포에 의해 생성된 사이토킨 농도를 적량함으로써 추가로 평가한다. 표 B1는 LPS + 단핵세포의 항-IL-10 처리로 LPS 만으로 활성화시킨 것과 비교하여 더욱 높은 농도의 사이토킨을 생성함을 나타내며, 이러한 사실은 내인성적으로 생성된 IL-10외에 TNFα 및 GM-CSF 생성시 이의 억제효과가 IL-1α, IL-1β, IL-6;IL8 및 G-CSF의 생성을 차단함을 나타낸다. 가장 현저한 억제 효과는 IL-1α, GMS-CSF 및 TNFα의 생성시 발견되는 반면, IL-1β, IL-6, IL-8 및 G-CSF 발현시 억제효과는 고려할만하나, 명확치 않다. 이들 결과를 함께 고려할때 내인성 IL-10 및 내인성으로 생성된 IL-10 모두는 LPS 활성화된 단핵 세포에 의한 IL-1α, IL-1b, IL-6, IL-8, TNFα, GM-CSF 및 G-CSF의 생성을 억제함을 알 수 있다.

[실시예 B5]

활성화된 단핵세포에 의한 IL-10 생성을 억제하는 IL-4

IL-4는 LPS 활성화된 단핵세포에 의한 IL-1β, IL-6 및 TNFα의 생성을 억제한다. IL-4가 또한 IL-10 생성을 억제하는지의 여부를 측정하기 위하여, 단핵세포를 LPS로써 24시간동안 활성화시켜 IL-10 분비를 측정한다. 표 B1은 IL-4가 LPS 활성화된 단핵세포에 의한 IL-10 생성을 강력하게 억제함을 나타낸다. 더우기, IL-4 외에, IL-1β, IL-6 및 TNFα 분비에 있어서 이의 억제 효과는, GM-CSF 및 G-CSF의 생성을 효율적으로 차단한다. 그러나, IL-10에 대해 관측한 바와 같이, IL-8의 생성은 IL-4에 의해서 단지 약간만 영향 받는다. 전체적으로 이 자료는 IL-4 및 IL-10이 활성화된 단핵세포에 의한 사이토킨 생성시 비교할만한 억제 효과가 있음을 나타낸다.

[실시예 B6]

전사 단계에서 일어나는 모노킨 생성의 억제

프로브

하기 프로브는 노던 분석을 위해 사용한다: pCD-hTGFβ의 SmaI 단편 600bp(nt 1299-1899)[참조; Yokota et al.(1987) in Lymphokines vol.13, Goeddel and Webb(eds.) Academic Press, New York]; pAL(b-액틴)의 PstI 단편 1200bp [참조;Vieira et a1.(1991)Proc. Natl. Acad. Sci USA 88:1172-1176]; pCD-hIL-6의 BamHI-×ba I 단편 567bp (nt 1-567) [참조; Yokota et al. (1987)]; SP64-3-10c(IL-8)의 Hind III 단편 268bp(nt 29-297) [참조; Schmid et al.(1987) J. Immunol 139:250-]; pCD-SRa-hIL-10의 BglII-Hind III 단편 760bp (nt 159-919) [참조;Vierea et al.(1991)]. 하기 올리고뉴클레 오타이드는 PCR 산물의 서던 분석을 위해 사용한다: 5'-CATGGGTGCTTATAAGTCATC-3'(nt 500-521), [참조: March et al.(1985) Nature 315:641- ]; IL-1β: 5'-CGATCACTGAACTGCACGCTCCGGG-3' (nt 444-469), [참조: March et al.(1985) Nature]; IL-6: 5'-GAGGTATACCTAGAGTACCTC-3' (nt 510-531), [참조: Hirano et al. (1986) Nature 324:73- ]; IL-8: 5'-TAAAGACATACTCCAAACCTT-3' (nt 200-221), [참조; Schmid et al.(1987) J. Immunol.]; IL-10: 5'-CAGGTGMGAATGCCTTTAATAAGCTCCMGAGAAAGGCATCTACAAAGCCATGA-GTGAGTTTGACATC-3' (nt 429-498), [참조: Viereal et al.(1991) Proc. Nat'l Acad, Sci, USA]; TNFα: 5-GGCGTGGAGCTGAGAGATAAC-3' (nt 500-521),[참조: pennica et al.(1984) Nature 312:724- ]; GM-CSF: 5'-CCGGCGTCTCCTGAACCT-3'(nt 150-168), [참조: Lee et al. (1985) Proc. Nat'l Acad, Sci, USA 82:4360-4364]; 액틴: 5'-CTGMCCCTAAGGCCAACCGTG-3' (nt 250-272),[참조: Alonso et al. (1986) J. Mol. Evol. 23:11- ]; 및 G-CSF: 5'-GCCCTGG-AAGGGATCCCCCC-31 (nt 400-421), [참조: Nagata et al.(1986) Nature 319:415- ], 뉴클레오타이드 서열은 또한 GENBANK (c/o InteILigenetics, Inc., Menlo Park, CA), 및 BCCG 데이타 베이스, 및 University of Wisconsin Biotechnology Center (Madison, Wisconsin 소재)로부터 시판된다. 합성의 뉴클레오타이드 생합성은 본원에서 참조로 인용한 문헌[참조: Gait (1984) IRL Press,O×ford]에 기술되어 있다.

[mRNA 분리 및 노던 분석]

전체 RNA를 구아니디움 티오시아네이트-CsCl 방법에 의해 2O×10⁶단핵세포로부터 분리한다. 노던 분석을 위해서, 샘플당 총 RNA 10㎍을 6.6% 포름알데하이드를 함유하는 1% 아가로즈 겔상에서 크기별로 분리하고, 나이트란 나일론 막(Nytran nylon membranes; Schleicher ＆ SchueIL, Keene, NH)에 이동시키며, 프로브를 사용하여 하이브리드화하고 특이적인 활성 (＞10⁸cpm/mg)이 되도록 표지한다. 필터를 하이브리드화하고, 스트링전트 조건(stringent condition)하에서 세척하여, 현상한다.

[PCR분석]

1㎍의 총 RNA를 프라이머로서 올리고(dT) 12 내지 18 (Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN 제조원) 및 ANW 리버스 트랜스크립타제(Boehringer Mannheim 제조원)을 사용하여 20㎕의 반응물중에서 역 전사시킨다. 역 전사물 2㎕(총 RNA의 등량 내지 100ng)를 각각의 증폭 반응에 직접 사용한다. PCR에 대한 조건은 하기와 같다: 반응물 50㎕중, 각각의 프라이머 25nmol, dGTP, dATP, dCTP, 및 dTTP 각각 125μM(Pharnncia, Uppsala, Sweden 제조원), 50mM KCl, 10mM 트리스-HCl, pH 8.3, 1.5mM MgCl2, 1mg/ml 젤라틴,100㎍/ml 비-아세틸화된 BSA 및 1단위의 벤트(Vent) DNA 폴리머라제(New England Biolabs, Beverly, MA 제조원). 사용한 프라이머는 하기와 같다: IL-1α 센스 프라이머(sense primer) 5'-CATCGCCAATGACTCAGAGGAAG-3' (nt 302-325); IL-1α 안티-센스 프라이머(anti-sense primer) 5'-TGCCAAGCACACCCAGTAGTCTTGCTT-3' (nt 770-743); IL-1β 센스 프라이머 5'-CCAGCTACGAATCTCGGACCACC-3' (nt 230-253); IL-1β 안티-센스 프라이머 5'-TTAGGAAGAC-ACAAATTGCATGGTGAAGTCAGT-3' (nt 896-863); IL-6 센스 프라이머 5'-ATGAACTCCTTCTCCACAAGC-3' (nt 1-21); IL-6 안티-센스 프라이머 5'-CTACATTTGCCGAAGAGCCCTCAGGCTGGACTG-3' (nt 810-777); IL-8 센스 프라이머 5'-ATGACTTCCAAGCTGGCCGTG-3' (nt 1-21); IL-8 안티-센스 프라이머 5'-TTATGAATTCTCAGCCCTCTTCAAAAA-CTTCTC-3' (nt 302-269); IL-10 센스 프라이머 5'-ATGCCCCAAG-CTGAGAACCAAGACCCA-3' (nt 323-349); IL-10 안티-센스 프라이머 5'-TCTCAAGGGGCTGGGTCAGCTATCCCA-3' (nt 674-648 ); TNFα 센스 프라이머 5'-AGAGGGAAGAGTTCCCCAGGGAC-3' (nt 310-333); TNFα 안티-센스 프라이머 5'-TGAGTCGGTCACCCCTT-CTCCAG-3' (nt 782-760 ); GM-CSF 센스 프라이머 5'-GCATCTCTGCACCCGCCC-GCTCGCC-3' (nt 76-1000); GM-CSF 안티-센스 프라이머 5'-CCTGCTTGTACAGCTCCAGGCGGGT-3' (nt 276-250 ); G-CSF 센스 프라이머 5'-GAGTGTGCCACCTACAAGCTGTGCC-3' (nt 233-258); G-CSF 안티-센스 프라이머 5'-CCTGGGTGGGCTGCAGGGCAGGGGC-3' (nt 533-508); β-액틴 센스 프라이머 5'-GTGGGGCGCCCCAGGCACCA-3' (nt 1-20); β-액틴 안티-센스 프라이 머 5'-GTCCTTAA-TGTCACGCACGATTTC-3'(nt548-530). 반응물은 퍼킨-엘머/세투스 DNA 터말 사이클러(Perkin-Elmer/Cetus DNA Thermal cycler)내에서 20주기(변성 94℃에서 30초, 어닐링 55℃에서 30초, 연장 72℃에서 60초)동안 항온처리한다. 반응물을 CHCl₃로 추출하고 샘플당 40㎕를 TAE 완충액중 1% 아가로즈 겔상에 건다. 생성물을 에티디움 브로마이드 염색으로써 가시화한다. 계속해서, 겔을 0.5M NaOH, 1.5M NaCl중에서 변성시키고, 10M 암모늄 아세테이트중에서 중화시키며, 나이트란 나일론 막에 이전시킨다. 막을 6×SSC, 1% SDS, 10× 덴하르트 용액(Denhardt's solution; 0.2% Ficoll, 0.2% 폴리비날 피롤리돈, O.2%J BSA, 펜탁스 분획 V), 및 이.콜라이 tRNA(Boehringer, Mannheim, FRG) 200㎍/ml중 55℃에서 4시 간동안 예비-하이브리드화시킨다. 증폭시 사용된 프라이머에 대한 서열 내부에 대해서 특이적인 올리고뉴클레오타이드 프로브(200ng)을 T4 폴리뉴클레오타이드 키나제(New England Biolabs제조원) 및 γ-32P-ATP(Amersham, Arlington Heigths, IL 제조원)로써 5' 말단에 표지한다. 프로브를 닉 걸럼(Nick column; Pharnncia, Uppsala, Sweden 제조원) 위에 통과시킴으로써 혼입되지 않는 뉴클레오다이드로부터 분리하고 하이브리드화 혼합물에 가한다. 55℃에서 12시간동안 하이브리드화한후, 필터를 0.1×SSC(1×SSC : 150mM NaCl, 15mM Na-시트레이트 pH=7.0, 및 1% SDS중 실온에서 세척하여 Kodak ×AR-5 필름에 1 내지 2시간 노출시킨다.

단핵세포에 의한 사이토킨의 생성을 억제하는 IL-10의 농도를 측정하기 위해, 비교 PCR 분석을 단핵세포로부터 분리된 RNA상에서 수행하고 IL-10, IL-4 또는 중화시키는 항-IL-10 mAb의 부재 또는 존재하에서 24시간동안 LPS로서 활성화시킨다. 이 실험의 사이토킨 측정은 표 B1에 나타낸다. 이 샘플로부터 분리한 mRNA를 cDNA내로 역 전사시키고 계속해서 사이토킨 특이적인 프라이머로 증폭시킨다. 비교적 적은 수의 주기를 증폭에 사용하여 증폭된 DNA의 양이 주기수와 비례하며 원샘플중 특이적인 mRNA의 양과 관련되도록 한다. 제10도는 이러한 조건하에서 등량의 β-액틴 특이적인 cDNA가 증폭됨을 나타낸다. 단핵세포를 매우 적은 농도의 IL-8 mRNA가 발현된 배지중 4℃에서 24시간 동안 배양한다. 37℃에서 이 세포를 배양함으로써 IL-8 mRNA의 발현은 증가되나 IL-1α, IL-1β, IL-6, IL-10, TNFα GM-CSF 또는 G-CSF mRNA의 발현이 유도되지는 않는다. LPS 활성화는 IL-10에 IL-1β, IL-6, IL-8 및 G-CSF mRNA의 강력한 발현을 가져오는 반면, TNFα 및 GM-CSF mRNA가 적절히 유도된다. 또한, 제10도는 IL-1α, IL-6, TNFα GM-CSF 및 G-CSF 발현이 mRNA 단계에서 IL-10 및 1L-4에 의해 강력히 억제됨을 나타낸다. 반면 IL-1β 및 IL-8 발현은 IL-10에 의해서 단지 약간 영향을 받는다. 항-IL-10mAb의 존재하에서 LPS에 의한 단핵세포의 활성은 IL-1α, IL-1β, IL-6, IL-8 및 G-CSF mMA의 발현의 적절한 증가와 TNFα 및 GM-CSF mRNA 합성의 큰 증가를 가져올 수 있다. 사이토킨 특이적인 mRNA의 발현 단계 및 외인성 및 내인성 IL-10 또는 IL-4에 의한 이의 조절은 표 B1에 나타난 바와 같이 상응하는 단백질의 분비와 매우 관련되어 있으며 이러한 사실은 IL-10 및 IL-4가 전사 단계에서 LPS 단핵세포에 의한 사이토킨 발현을 억제함을 나타낸다.

[실시예 B7]

활성화된 단핵세포내에서 IL-10 mRNA를 조절하나 TGFβ mRNA 발현을 조절하지 않는 IL-10

사람 단핵세포가 LPS에 의한 활성화를 수반하면서 IL-10을 비교적 늦게 생성함을 입증하기 위해, IL-10이 내인성 IL-10 mRNA 합성에 영향을 미칠 수 있는지의 여부를 측정한다. 사람 단핵세포는 IL-10의 존재 또는 부재하에 7시간동안 LPS로써 활성화시키고 mRNA 발현은 노던 블롯팅으로 분석한다. 제11도는 IL-10 mRNA가 LPS에 의한 활성화후 기간만에 검출되며 IL-10이 이 시점에서는 IL-10 mRNA 발현에 있어 단지 최소의 억제 효과를 지니거나 또는 억제 효과를 지니지 않음을 나타낸다. 이와 대조적으로, IL-6 및 IL-8 mRNA의 발현은 IL-10에 의해 강력하게 억제된다. 그러나, 단핵세포를 LPS에 의해 24시간동안 활성화시키는 일련의 다른 실험에서, IL-10은 제12도의 노던 분석에서 나타난 바와 같이 IL-10mRNA의 발현을 현저히 감소시킨다. 더우기, 제12도에는 중화시키는 항-v-IL-10 nlAb의 존재하에서 LPS를 사용한 단핵세포의 활성화로 24시간만에 IL-10 mRAN 발현의 상향 조절이 초래됨을 나타낸다. 이 결과는 후자 실험에서 사용된 RNA가 또한 제10도에 나타난 바와 같은 PCR 분석을 위해 사용되기 때문에 IL-10 특이적인 프라이머를 사용하는 PCR 분석에 의해 확증된다. 제12B도에서는 노던 분석에 의한 IL-10 mRNA 발현시 관측된 적량적 차이가 PCR 비교분석에 의해 관측된 것과 연관되어 있음을 나타낸다.

더우기, 더욱 민감한 PCR 분석은 37℃의 배지 단독중에서 단핵세포의 배양 24시간후 유도된 저농도의 IL-10 mRNA 검출을 가능케한다. 이 결과는 1L-10이 IL-10 mRNA 합성에 있어서 자가조절 효과를 지니며, mRNA 농도가 IL-10 단백질 생성, 적절하게는 사람 단핵세포에 의한 IL-10 생성을 명확히 반영하는지의 여부를 제시한다. 그러나, IL-10 생성의 하향조절은 활성화 단계에서 더욱더 늦게 일어난다. 새로이 분리된 활성화되지 않은 단핵세포 중에서 구조적으로 발현된, TGFβ mRNA는 7 또는 24시간동안의 LPS 활성학에 의해 증진되지 않는다(제11도 및 제12도). 더우기, 제11도 및 제12도는 활성화를 IL-4, IL-10 또는 중화시키는 항-IL-10mAbs 존재하에 수행하는 경우 TGFβ mRNA의 농도가 영향받지 않음을 나타낸다.

[실시예 B8]

단핵세포에 의한 제II형 MHC 발현시 자가조절 효과를 지니는 IL-10

면역형광 분석

세포(10⁵)를 V자형 바닥의 미세역가 플레이트(V bottom microtiter plate; Flow Laboratories, McLean, VA 제조원)내에서 정제된 mAb (1mg/ml) 10㎕와 함께 4℃에서 30분 동안 배양한다. 0.02대 나트륨아지드 및 1% BSA(Signn, St Louis, MO 제조원)를 함유하는 PBS로 2회 세척한 후, 이 세포를 염소 항-마우스 항체(TAGO, Inc. Burlingame, CA 제조원)의 FITC 표지된 F(ab')₂분획의 1/40 회석액과 함께 4℃에서 30분동안 배양한다. 추가로 3회 세척한 후, 표지된 세포 샘플은 FACScan(Becton Dickinson, Sunnyvale, CA 제조원)상에서 유동 마이크로플루오메트리(flow microfluometry)로써 분석한다. 항 MHC 제II형 mAbs PdV 5.2(HLA-DR/DP/DQ), Q5/13 HLA-DR/DP, 및 L243(HLA-DR)은 이미 기술되어 있다[참조; Koning et al.(1984) 9:221- ; Quaranta et al.(1980) J. Immunol. 125:1421-1425; and Lampson et al.(1980) J. Immunol. 125:293- ].

IL-10은 사람 단핵세포의 세표 표면상에서 제II형 MHC 분자의 발현을 하향조절시킨다. IL-10은 구조적 IL-4- 또는 IFNγ-유도된 MHC 제II형 발현을 하향조절시킴이 밝혀졌다. 단핵세포가 LPS에 의한 활성화를 수반하면서 고농도의 IL-10을 생성하기 때문에, 내인성 IL-10이 LPS 활성화된 단핵세포에 의한 제II형 MHC 발현을 억제할 수 있는지의 여부를 시험한다. 단핵세포는 중화시키는 항-IL-10 mAb의 존재 또는 부재하에서 다양한 농도의 LPS로 활성화시킨다. 제13도는 LPS를 사용한 단핵세포의 활성화로 이들 세포상에서 구조적 HLA-DR/DP 발현이 용량 의존성 방식으로 감소됨을 나타낸다. 그러나, 중화시키는 항-IL-10mAb 19F1의 존재하에서 HLA-DR/DP 발현의 강력한 유도가 관측된다. 몇몇의 HLA-DR 또는 HLA-DR/DP 특이적인 mAb를 사용하여 동일한 결과를 수득한다. 이 결과는 자가조절양식으로서, 내인성적으로 생성된 IL-10이 LPS 활성학를 수반하는 사람 단핵세포상에서의 제II부류 MHC 발현에 있어서의 하향조절과 관련됨을 나타낸다.

[연구 C]

활성화된 대식세포에 의한 사이토킨 생성을 억제하는 IL-10

본 단락에서 나타내는 데이타는 우선일 경과후 공개되었으며 [참조: Fiorentino et al.(1991) J. Immunology 147:3815-3822], 본 명세서에서 참조로 인용된다.

[요약]

IL-10은 대식세포능력을 억제하나 B세포 항원이 존재하는 세포(APC)는 억제하지 않음으로써 Th1 T 세포 클론에 의한 사이토킨 합성을 자극한다. 대식세포 주 및 정상의 복막 대식세포 모두에서 IL-10의 직접적인 효과를 연구한다. IL-1, IL-6 및 TNFα 단백질의 LPS-(또는 LPS 및 IFNγ) 유도된 생성은 2개의 대식세포 세포주내에서 IL-10에 의해 현저하게 억제된다. 더우기, IL-10은 유사한 농도로 가해지는 경우 IL-4보다도 모노킨 합성의 더욱 강력한 억제제이다. IL-1α, IL-6 또는 TNFα mRNA의 LPS 또는 LPS와 IFNγ-유도된 발현은 또한 반-정량적인 PCR 또는 노던 블롯 분석으로 나타나는 바와 같이, IL-10에 의해 억제된다. IL-10에 의한 LPS-유도된 IL-6 분비의 억제는 대식세포주에서 보다는 FACS-정제된 복막 대식 세포내에서 거의 현저하지 않다. 그러나, 복막 대식세포에 의한 IL-6의 생성은 항-IL-10 항체의 첨가에 의해 증진되며, 이것은 이들 배양물중 내인성 IL-10의 존재가 LPS 활성화를 수반하는 모노킨 합성의 고유 감소를 초래함을 내포한다. 더우기, LPS-자극된 복막 대식세포는 EILSA에 의해 검출가능한 IL-10을 직접 생성함을 알 수 있다. IFNγ는 LPS-자극된 복막 대식세포에 의한 IL-6 생성을 증진시킴이 밝혀졌으며, 이것은 동일한 세포 집단에 의한 IL-10 생성의 억제로부터 귀결되는것 같다. 모노킨 합성에 있어서 이의 효과외에, IL-10은 또한 IFNγ-자극된 복막 대식세포내에서 현저한 형태학적 변화를 유발한다. 대식세포, 특히 모노킨 생성단계에서 IL-10의 강력한 작용은, 이 사이토킨이 T-세포 반응을 조절하고, 또한 급성 염증 반응을 조절하는데 중요한 역활을 함을 나타낸다.

IL-10은 Thl T 헬퍼 세포에 의한 대식세포 APC-의존성 사이토킨 합성을 억제하는 Th2 T 헬퍼 세포 클론에 의해 생성된 사이토킨으로 기술되었으며, 다양한 다른 세포상에서 다상유전성 효과를 나타내고 다른 세포에 의해 생성된다. Th1 세포는 IL-2와 IFNγ를 분비하며 바람직하게는 대식세포 활성 및 지연된 유형의 고감도(DTH)를 유도시키는 반면, Th2 세포는 IL-4 및 IL-5를 생성하고 B세포 반응을 돕는다. 일단 활성화되면, 각 유형의 Th 세포는 다른 세포의 증식 및/또는 기능을 조절할 수 있다. 이러한 교차-조절은 다양한 사이토킨에 의해 매개되며, 일부 항체 및 DTH 반응이 서로 배타적일 수 있다는 관측을 설명한다. IL-10은 대식세포상에서 작용하나 B세포상에서는 작용하지 않음으로써 Th1 클론에 의한 사이토킨 합성을 억제하며, IL-10은 대식세포상에서 직점적인 효과를 발휘한다.

IL-1, IL-6 및 TNFα와 같은 대식세포 산물은, 감염 또는 조직 상해동안 유발되는 다수의 염증 및 면역학적 반응과 관련되어 있다. TNFα 및 IL-1은 또한 다양한 세포 유형내에서 다수의 대사적 변화를 유발하는 내인성 발열질이다. 더우기, IL-1 및 IL-6은 간 급성-상 단백질 합성의 근원적인 유도체이다. 하기 실시예는 IL-10이 LPS-활성화된 대식세포에 의한 IL-1, TNFα 및 IL-6과 같은 사이토킨의 생성을 억제함을 나타낸다. 따라서, IL-10은 대식세포 기능의 조절에 의한 염증 반응외에 T-세포 활성화시 이의 역활에 중요하다.

[실시예 C1]

상이한 대식세포 주의 APC 기능을 억제하는 IL-10

사이토킨

정제된 재조합체 mIL-1α는 업자(P. Lomedico, Hoffman-La Roche, Nutley, NJ)로부터 대량의 증정용으로서 수득하였다. 재조합체 mIL-2 및 mIFNγ는 쉐링 리서치(Schering Research, Bloomfield, NJ)로부터 입수하였다. 엠.피어스, DNA×(M.Pearce, DNA×)가 제공한 재조합체인 정제된 마우스 IL-6을 Cos 7 세포내에서 발현시키고, 면역친화성 정제한다. 마우스 TNFα는 겐자임 코포레이션(Genzyme Corporation, Boston, MA)으로부터 수득한다. COS7 세포를 상술한 바와 같이 F115 cDNA 클론으로 형질갇염시킴으로써 수득한, 재조합체 마우스 IL-10(CSIF) 및 모크(mock) 형질감염된 세포로부터의 대조군 상층액을, 달리 제시하지 않는한 2%의 최종 농도로 사용한다. 달리는, 와렌 당(Warren Dang)에 의해 제공된, 재조합체 마우스 IL-10을 이.콜라이내에서 발현시키고 S×C2 항-IL-10 항체를 사용하여 친화 정제한다.

[항체]

IFNγ(×MG1.2)에 대해 중화시키는 모노클로날 항체(mAbs)와 IL-10(S×Cl)을 사용한다[참조: Cherwinski et al. (1987) J. E×pt'l Med. 166:1229-1244; 및 Mosmann et al.(1990) J. Immunol. 145:2938-2945]. J5, S×C-1에 대해 이소타입 매취된 대조군은 로버트 코프만(Robert Coffman, DNAK)이 제공하였다. IL-6(20F3 및 32C11)에 대한 모노클로날 항체[참조; Starnes et al.(1990) J. Immunol 145:4185-4191], 및 TNFα (MP6. ×T3.11 및 ×T22.11)에 대한 모노클로날 항체는 정제하여 존 아브람스(John Abrams: DNA×)가 대량 제공하였다. FACS-분류용으로 사용된 항체에는 랫트 항-마우스 B220(RA3-6B2)[참조;Coffnnn et al.(1981) Nature 289:681-683] 및 랫트 항-마우스 Mac-1(ml/70)[참조; Springer et a1. (1978) Eur. J. Immunol 8:539-542]가 포함된다. Fc-gR에 대한 랫트 항-마우스 모노클로날 항체는 2,4G2이다[참조: Unkeless (1979) J. E×pt'l Med. 150:580-596].

[배지]

검정배지(cRPMI)는 RPMI 1640[J.R. Scientific Inc., Woodland, CA 제조원) 및 10% 가열-불활성화된 태아 송아지 혈청(FCS) (J.R. Scienticfic Inc. 제조원), 0.05mM 2-ME(Sigma Chemical Co., St. Louis, MO 제조원), 및 10mM Hepes 완충액(Gibco Laboratories, Grand Island, NY제조원)으로 구성된다. T 세포 성장을 위해, 재조합체 mIL-2(330U/ml)를 cRPMI에 가한다.

[항원]

키홀 림펫 헤모시아닌[keyhole limpet hemocyanin(KLH); pacific Bio-Marine Laboratories, Inc.(Venice, CA) 또는 Calbiochem Labs(La JoILa, CA) 제조원]은 100 내지 500㎍/ml의 최종농도로 사용하고, 오브알부민(Signn 제조원)은 1mg/ml의 최종 농도로 사용한다.

[세포주]

Th1 클론, HDK1(I-A^d/KLH에 대해 특이적임) [참조; Cherwinski et al. (1987) J. E×pt'l Med.], 및 T-세포 하이브리도마 DO11.10(I-A^d/오브알부민에 대해 특이적임)[참조; Kappler et al. (1981) J. E×pt'l Med. 153:1198-]을 사이토킨 합성(CSIF) 억제 검정용으로 사용한다. 업자 C. Janeway(Yale University, New Haven, CT]로부터 입수한, Th2 클론, D10. G4.1(D10), AKR/J 항-콘알부민[참조: Kaye et al. (1983) J. E×pt'l Med. 153:836-856]을 IL-1 검정에 사용한다[참조: Suda et al.(1989) J. Immunol. Methods 120:173-178]. 모든 클론은 항원(Ag) 및 조사된 APC를 사용한 간헐적인 자극에 이어, IL-2-함유 배지내에서 생장시킴으로써 유지시킨다[참조; Cherwinski et al. (1987) J. E×pt'l Med.]. 이 클로닝된 IG.18. LA 대식세포 주(H-2^d)는 흉선 기질 세포 배양물로부터 기원하며 20% L-세포 상층액중에 유지시킨다. PU5.1 대식세포 주(H-2^d) [참조; Ralph et al.(1977) J. Immunol. 119:950-954]는 cRPMI 및 10% FCS중에 유지시킨다. APC로서 사용하기 위해서, 1G. 18. LA 및 PU5.1 세포 주를 1FNγ(0.5 내지 2ng/ml)로 20 내지 24시간동안 활성화시킨다. TNFα 및 TNFβ에 반응성인 WEHI.164.13 세포주[참조; Espevik et al.(1986) J. Immunol. Methods 65:55-63]를 cRPM나5% FCS중에 유지시킨다.

[사이토킨에 대한 면역측정 검정]

사이토킨 농도(IL-6, IFNγ 및 CSIF/IL-10)은 2-부위 샌드위치 ELISA 포맷(format)중에서 측정 한다.

[생검정]

비색성 MTT 증식 검정을 TNFα(WEH1164.13 세포), IL-2(HT-2세포) 및 IL-1(D10 세포) (모든 검정에 대해 104 세포/웰) 생검정을 위해 사용한다. 활성은 공지된 표준물 또는 Pg 또는 ng/ml에 대해 상대적인 단위/ml로서 나타낸다. 각 경우에 있어서 U/ml단위는 이 생검정의 최대 반응의 50%를 생성하는 특수 사이토킨의 양으로 나타낸다.

[Th1 사이토킨 합성의 유도 및 측정]

1 내지 5×10⁴Th1, HDK.1 세포 또는 DO-11.10 T-세포 하이브리도마 세포를 96-웰 평편-바닥의 미세적정 트레이(96-weIL flat-bottomed microtiter tray)내에서 항원의 존재 또는 부재하에 총 용적 200㎕/웰로서 다양한 수의 생 APC와 합한다. 사이토킨 농도는 20 또는 48시간후 상층액중에서 측정한다.

[대식세포 주의 자극]

대식세포 주 1G.18. LA 및 PU5.1을 약하게 스크랩핑(scraping)함으로써 하베스트하고, 세척하며 9.5cm 조직 배양 디쉬(Becton Dickinson. NJ 제조원)중 10⁶세포/ml에서 cRPMI/5% FCS중 37℃ 및 5% CO₂/95%/ 공기하에서, RNA 발현을 위해서는 6시간 동안, 또는 상층액중에서 사이토킨의 검출을 위해서는 24시간 동안 재현탁시킨다. IL-10(200단위/ml) 또는 IL-4(200단위/ml)의 존재 또는 부재하에서, LPS를 사용한 자극은 10㎍/ml에서 하거나, 일부경우 LPS 및 IFNγ를 사용한 자극은 100단위/ml에서 한다. 상층액을 수집하고, 원심분리(800×g)하며, -80℃에서 저장한 다음, IL-1, IL-6 또는 TNFα의 농도를 검정하는데 사용한다. 또한, 대식세포주는 상기한 바와 같이 24시간 동안, IFNγ를 사용하여 자극시키고, 일부경우에는 Th1 클론, HDK.1 및 이의 특이적인 항원 KLH의 존재하에서 24시간 동안 추가로 자극시킨다. 이 경우 상층액은 10,OOOW의 막을 사용하는 AMICON 필터를 사용하여 더욱 농축시키고 면역친화 컬럼을 사용하여 IL-2 및 IFNγ를 고갈시킨다. 다음 이 상충액 및 농축 단계로부터의 유동 통과액을 항원 특이적이고 APC-의존성인 Th1 사이토킨 합성을 공동-자극하는 능력에 대해 시험한다. 또한 APC로서 사용하기 위해, 대식세포주 1G18. LA 및 PU5.1을 우선 IFNγ(0.5 내지 2ng/ml)을 사용하여 20 내지 24시간 동안 활성화시킨다.

IL-10은 정상의 복막 또는 비장 대식세포 또는 대식세포주 1G 18.LA를 APC로서 사용할 경우 Th1 세포에 의한 IFNγ 생성을 자극하는 APC의 능력을 억제한다. IL-10은 또한, Th1 세포에 대한 APC로서 PU5.1 세포주를 사용하여 수행한 자극이 1G18. LA 대식세포 주를 사용하여 관측한 것보다 크다해도, 1G18.LA(제14도)로부터의 상이한 오리진을 지니는 PU5.1 대식세포 주상에서 또한 효과적이다. 제14b도는 1G18.LA 세포주가 또한 Th1 클론 및 오브알부민-특이적인 T 세포 하이브리도마 DO11.10 모두에 의한 IL-2 생성의 항원-특이적인 유도를 매개할 수 있음을 나타낸다. 자극 모두는 IL-10에 의해 현저하게 억제된다.

[실시예 C2]

IFNγ-자극된 복막 대식세포내에서 형태학적 변화를 유도하는 IL-10

복막 대식세포의 정제 및 자극

복막 세포는 냉 cRPMI/10% FCS 7교의 주사 및 회수에 의해 수득하고, 대식세포는 Mac-1 및 B220를 기준으로 분류한다(대식세포는 Mac-1^{+ bright}; B220^-이다). 세포를 IL-10, 항-IL-10 모노클로날 항체 또는 IFNγ의 존재 또는 부재하에 10㎍/ml LPS를 사용하여 자극시킨다. 상층액을 37℃의 급습시킨 5% CO₂의 대기중, 8×10⁵세포/ml에서 20시간동안 배양후 수집한다. 상층액은 효소-연결된 면역 검정을 사용하여 TNFα 및 IL-6에 대해 검정한다.

FACS-정제된 복막 대식세포를 다양한 경과시간 동안 IL-10의 존재 또는 부하에 IFNγ와 함께 배양한다. 다음 상층액을 제거하고, 세포를 공기-건조하며, 고정 및 염료(Wright's-Giemsa)로써 염색한다. 제15도에 나타낸 바와 같이, IL-10은 세포주변에서 유도되며 탈-유착성이고, 대식세포 APC 기능의 억제 측면에서 현저할 수 있다.

[실시예 C3]

활성화된 대식세포 주에 의해 생물학적으로 활성화되거나 분비된 사이토킨의 생성을 하향조절시키는 IL-10

일찌기 IL-10이 APC로서 작용하고 Th1 사이토킨 합성을 활성화시키는 대식세포의 능력에 직점 영향을 미침이 제안되어 왔다. 이 대식세포 주에 의한 모노킨 생성시 IL-10의 직접적인 효과를 시험한다. IL-10의 존재 또는 부재하에서, IFNγ, LPS 또는 FNγ + LPS를 사용하여 자극시킨 대식세포주로부터 수집한 상층액을 사이토킨의 농도에 대해 시험한다. IL-4는 활성화된 대식세포에 의한 사이토킨 생성을 억제하는 것으로 밝혀졌기 때문에, 이 인자는 대조군으로서 사용할 수 있다. IFNγ 단독을 사용한 대식세포 세포주의 자극으로 상층액중에 모노킨, IL-1, IL-6 또는 TNFα의 검출가능한 농도가 유도되지는 않는다. 이와는 대조적으로, LPS 또는 LPS+IFNγ는 이 사이토킨을 현저한 농도로 유도한다(제16도). IL-1을 검출하기 위해 사용되며, 콘코나발린 A(Conconavalin A;ConA)의 부재하에 수행된 Dl0.G4.1 검정은 대식세포에 의해 발현된 다른 사이토킨을 검출하지 않는다. 1G.18.LA 및 PU5.1 대식세포주는 모두 LPS를 사용한 유도후에 IL-1 생활성을 생성하는 능력에 있어서 현저하게 억제된다(제16도). IL-10은 또한 WEHl.164.13. 생검정에서 입증되는 바와 같이, 대식세포 주 모두의 상층액중에서 LPS 유도된 TNFα의 생성 또는 IFNγ + LPS 유도된 TNFα에 있어 현저한 억제효과가 있다(대식세포 상층액중 활성 모두는 특이적인 차단 항체를 사용하여 TNFα에 기여하는 것으로 여겨진다). 유사하게, IL-10은 효소-결합된 면역검정시 IL-6에 대해 측정된 바와 같이 유도된 IFNγ + LPS 및/또는 LPS에 의해 자극된, 대식세포 주에 의한 IL-6 단백질의 생성을 억제한다. 시험한 모든 실험에서 IL-10은 LPS 또는 IFNγ+LPS-유도된 모노킨 생성시 IL-4 보다 더욱 현저한 억제 효과를 지닌다(단백질 농도에 있어서).

[실시예 C4]

활성화된 대식세포에 의한 사이토킨 mRNA 발현을 하향 조절하는 IL-10

RNA 추출 및 RNA 분석

총 세포 RNA는 구아니디늄-이소티오시아네이트 방법을 사용하여 대식세포주로부터 추출한다. RNA의 농도는 260nm에서의 흡광도로서 측정한다. RNA 블롯 검정은 문헌[참조:Moore et al.(1990) Science 248:1230-1234]에 기술되어 있으며 또한 역-전사된 RNA의 PCR도 문헌[참조:0IGarra et al.(1990) Intn'l Immunol 2:821-832]에 기술되어 있다. 특이적 양의 각각의 cDNA 샘플(1/20 cDNA의 희석물)은 하기 조건하에서 터말라제(Thernnlase; 테르무스 아쿠아티구스 DNA 폴리머라제)(IBI) 2.5 단위 및 세투스/퍼킨-엘머 열순환기(Cetus/Perkin-Elmer thermocycler)를 사용하여 증폭시킨다: 94℃ 용융, 30초; 55℃ 어닐링, 30초; 및 72℃ 연장, 1분. 하기에 나타낸 바와 같이 HPRT[하우스-키핑 효소(house keeping enzyme)], TNFα 및 IL-6에 대해 특이적인 프라이머를 사용한다:

센스 : 5-5'-GTA ATG ATC AGT CAA CGG GGG AC-3'(nt 422-444); HPRT 안티-센스: 5'-CCA GCA AGC TTG CAA CCT TAA CCA-3'(nt 598-575); HPRT 프로비 5'-GCT TTC CCT GGT TAA GCA CTA CAG CCC C-3'(nt 543-570); TNFα 센스: 5'-GCG ACG TGG AAC TGG CAG AAG-3'(nt 4499-4519); TNFα 안티-센스: 5'-GGT ACA ACC CAT CGG CTG GCA-3'(nt 5865-5845); TNFα 프로브: 5'-CAG TTC TAT GGC CCA GAC CCT C-3'(nt 5801-5821);IL-6 센스: 5-CCA GTT GCC TTC TTG GGA CTG-3'(nt 1520-1540); IL-6 안티-센스: 5'-GGT AGC TAT GGT ACT CCA-3'(nt 6093-6075); IL-6 프로브: 5'-GTG ACA ACC ACG GCC TTC CCT ACT-3'(nt 1547-1570).

모든 프라이머는 유전자내에서 인터베닝 서열(intervening sequence)을 채운다. 감도 및 특이성은 증폭된 생성물에 대해 내부 방사표지된(³²-P, γ-ATP) 올리고 뉴클레오타이드로써 증폭된 산물의 도트-블롯을 프로브화 함에 의해 더욱 증가 된다. 방사활성 블롯은 앰비스 상 스캐너(Ambis lnnge Scanner)를 사용하여 적량하고, ×-선 필름에 노출시킴으로써 가시화한다. 각 경우에 있어서, P388D1 RNA의 표준 곡선은 검정의 재생성을 보장하기 위해서 포함되며, 최종 도트 블롯내 RNA 도입량 pg에 대해 상대적인 조절된 단위가 이로부터 수득된다. 더우기, 하우스 키핑 효소 HPRT의 내부 표준물을 사용하여 동일한 양의 RNA가 정확히 사용되고 모든 샘플이 역 전사되며 동일한 효율로서 PCR에 의해 증폭되였는지를 확인한다.

RNA는 IL-10 또는 IL-4의 존재 또는 부재하에서, LPS 또는 LPS + IFNγ를 사용한 자극후 6시간만에 대식세포주, 1G18.LA 및 PU5.1로부터 추출한다. 총 RNA 10㎍의 RNA 블롯 분석은 IL-10이 두 세포주내에서 LPS 또는 IFNγ + LPS에 의해 유도된 TNFγ 디A의 발현을 하향조절함을 나타낸다(제17도). (이때, 후자의 경우는 더욱 적은 정도로 하향조절된다). 이것은 두 세포주 모두로부터의 역-전사된 RNA를 분석하기 위한 반-정량적 PCR 방법을 사용하여 확증한다. 표 C1에 기술된 바와 같이 각각의 사이토킨에 대한 표준 곡선을 포함시킴으로써, 각 토트내에서 나타난 총 표준 RNA의 pg에 대해 상대적인 조절단위를 수득함으로써 이 데이타를 숫자적으로 나타내는 것이 가능하다. 표 C1은 IL-10 및 IL-4가 1G18.LA 대식세포 주내에서 LPS- 및 IFNγ + LPS-유도된 TNFα의 발현을 억제시킴을 나타낸다. 이 사실은 표준 곡선의 직선부분으로부터 수득된 값으로 잘 설명되며, 표 C1 범례는 슷자적 데이타를 유도시키기 위해 사용된 방법을 설명한다. 동일한 방법을 사용하여, LPS 및 lFNγ + LPS에 대한 반응시 PU5.1 대식세포 주에 의한 RNA 발현의 분석은, 또한 IL-6 및 TNFα의 발현이 또한 IL-10에 의해 억제됨을 나타낸다(표 C2).

[표 C1]

IL-10 및 IL-4^a에 의한 IG18.LA 대식세포주내에서 LPS-유도된 TNF-α발현의 억제

^aThe IG18.LA 대식세포주를 제3도에서와 같이 자극시킨다. 6시간후 상층액을 제거하고 RNA 제조를 위해 세포를 하베스트하는 동안 구아니디늄 이소티오시아네이트용액을 가한다. IG18.LA 대식세포 주로부터 총 삐A의 1㎍을 총 20μl중에서 역전사시킨다. cDNA로 회석하여(도면에 나타냄) 각 회석물 1㎕를 HRRT(내부 표준물) 또는 TNF-α에 대해 특이적인 프라이머를 사용하는 PCR에 의해 증폭시킨다. 증폭된 cDNA 생성물의 10㎕를 도트-블롯팅하고 각각의 방사선 표지된 프로브(프라이머에 대해 내부적임)로 더 프로프학한다. 나타나는 시그날은 앰비스 상 스캐너를 사용하여 측정한다. 매변 희석시, TNFα에 대한 원래의 cpm을 "0" 샘플 (즉, IL-10 또는 IL-4가 없는 샘플)에 대해 비교하여 HRRT cpm으로부터 수득한 교정인자(*)에 따라서 표준화(*cpm)한다. 포지티브 대조군의 적정에 대해 비교하여, 이의 HRRT 함량(*pg RNA/토트)에 대해 교정한, 교정 단위는 표준 곡선(나타내지 않음)을 사용함으로써 지정될 수 있다.

[표 C2]

액틴의 IL-10 메카니즘

PU5.1 대식세포주a내에서 IL-6 및 TNFα를 암호화하는 RNN의 LPS 유도된 발현을 억제하는 IL-10

^aPU5.1의 샘플은 필수적으로 표 C1에 기술한 바와 같이 처리하고 HPRT, TNF-α 및 IL-6 수준에 대해 분석한다. 상기 나타낸 원래의 cpm은 표 C1에 기술한 바와 같이 샘플당 HPRT의 수준에 따라서 우선 교정한다. TNFα 또는 IL-6에 대한 포지티브 대조군의 공지량의 표준 곡선을 사용함으로써, 도트 블롯에 대한 교정 단위 *pg RNA는 표 C1에 기술한 바와 같이 지정한다. TNFα 모두에 대한 값은 cDNA 1㎕를 127배 회석하여 수득하며 IL-6은 cDNA 1μ을 1/9배로 희석하여 수득한다(RNA 1㎍은 총 20㎕의 용량내에서 역 전사된다).

[실시예 C5]

LPS-활성화된 복막 대식세포에 의한 IL-6 단백질의 생성을 하향조절하는 IL-10

Th1 세포에 대한 APC 기능이 IL-10에 의해 억제됨이 이미 밝혀진 복막 대식세포(Mac-1 및 B220을 기준으로 분류) (대식 세포는 Mac-1^+(bright); B220^-이다)를, LPS에 대해 반응하는 이들의 TNF2 및 IL-6의 생성에 대해서 더 시험한다. TNFα는 LPS-자극된 FACS 분류한 대식세포의 상층액(세포 밀도, 7×10⁵세포/ml) 중에서 검출 불가능하다. 이와는 대조적으로, 현저한 농도의 IL-6이 BALB/c 또는 CBA/J 마우스로부터 기원한 복막 대식세포로부터 수득하여, 상기한 바와 같이 LPS로 자극시킨 상층액중에서 검출가능하다(제18도). IL-6 농도는 세포를 IL-10의 존재하에서 LPS로 자극시키는 경우에 감소되지만, 눌랍게도 억제 수준을 대식세포 주를 사용하여 관측한 것(제16도)보다 덜 현저하다(제18도). 그러나, LPS로써 유도된 IL-6의 생성 수준은 LPS-자극시, IL-10에 대해 지시된 모노클로날 항체를 포함시킴으로써 증가시킬 수 있다(제18도). 대식세포가 LPS에 대한 반응시 IL-10을 생성한다는 사실은 IL-10에 대해 특이적인 ELISA 중에서 확증된다(상기한 바와 같이 LPS로 자극시킨 CBA/J 또는 BALB/c 복막 대식세포는 각각 IL-10을 2단위/ml 또는 4.5단위/ml로 생성한다).

제18도는 또한 정제된 BALB/c 복막 대식세포가 LPS 만으로 자극시킨 경우와 상반된 것으로서 IFNγ의 존재하에서 LPS로 자극시킨 경우 고 농도의 IL-6을 생성함을 나타낸다. 이것은 BALB/c 마우스로부터 기원한 복막 대식 세포에 의한 IL-10 생성시 추가 실험의 결과로써 해석할 수 있다. 이 경우에, LPS로 자극시킨 대식세포는 12단위/ml의 L-10을 생성하며, 세포를 IFNγ의 존재하에 LPS로 자극시키는 경우 이는 3단위/ml 미만으로 감소된다.

[실시예 C6]

대식세포 APC 기능의 IL-10 억제용의 가용성 공동-자극인자 메카니즘에 대한 시험

IL-10은 살아있는 항원 존재 세포(APC)(대식세포) 존재하에서 Th1 사이토킨 합성만을 억제한다. IL-10 작용의 가능한 메카니즘중 하나는 Th1 세포로부터 최적의 사이토킨 방출을 위해 요구되는 가용성 공동-인자의 생성을 억제하는 것이다. 상층액은 Th1 세포 및 특이적인 항원의 존재 또는 부재하에서, IFNγ로 자극시킨 대식세포로 부터 수득한다. 이의 농축 동안 생성된 상층액(제19a도), 또는 유동 배출액은 Th1 세포에 대한 대식세포 APC 기능의 IL-10-매개된 억제를 역전시킬 수 없다. 이 데이타는 IL-10이 Th1 사이토킨 합성시 필요한 가용성의 공동 자극인자를 하향조절시킨다는 확증을 제공하지 못한다. 억제제가 불안정하거나 막 결합될 수 있다해도, 유사한 실험에서 IL-10이 T 세포상에 직접 작용하는 가용성 억제 인자를 생성하기 위한 대식 세포를 유도시킨다는 확증을 제공하지 못한다. 이를 실험하기 위해서, 세포 혼합 실험을 하기와 같이 수행한다. 비장 B 세포 및 대식세포는 FACS 분류한다(B220 및 Mac-1 기준). B 세포의 존재 또는 부재하, 및/또한 IL-10의 존재 또는 부재하에서 분류된 용량의 대식세포를 HDK.1 세포의 항원-특이적인 자극을 위한 APC로서 사용한다. Th1 사이토킨 합성의 B 세포 자극을 제외한 대식세포는 IL-10에 의해 억제된다(제19b도). 분류된 용량의 대식세포와 일정 수의 B 세포를 혼합함으로써, Th1 사이토킨 합성의 추가적인 자극이 수득된다(제19b도). 그러나, 이러한 APC 혼합물에 IL-10의 첨가는 Th1 사이토킨 합성 수준을 B 세포 APC 단독으로 달성한 수준으로만 저하시키며, 이 관측은 Th1 세포 또는 B 세포 APC 상에서 직접 작용하는 짧은 영역의 또는 불안정한 억제제의 존재에 대해 입증한다.

[연구 D]

조항원 유도된 치명적인 쇼크에 대해서 마우스를 보호하는 IL-10 요약

마우스 모델내에서 스타필로코커스 장독소 B(SEB)에 의해 유도된 치명적인 쇼크에 대한 보호시 IL-10의 역활을 시험한다. IL-10을 사용한 마우스의 예비처리로 SEB 및 D-갈락토사민이 주사된 후 마우스의 치사가 방지된다(D-갈락토사민은 SEB에 대한 마우스의 자연적인 내성을 극복하는데 요구된다). 이 효과는 IL-10이 T 세포를 활성화시키기 위한 대식세포의 능력을 억제하는 자체의 능력을 통하여, 생체내에서 T 세포 활성을 억제할 수 있음을 나타낸다.

상층액은 TCR vB 쇄 및 제II형 MHC 분자의 B 쇄를 결합시킴으로써 T 세포 수용체(TCR) vB-특이적인 방식으로 T 세포를 활성화시키는 T 세포 유사분열물질이다. 상층액은 스타필로코커스 아우레우스에 의해 생성된 것과 유사한 장독소를 포함하는 외인성 초항원 및 뮤린 유방의 종양 바이러스에 의해 생성된 내인성 분자를 포함한다. 초항원의 독성 효과는 항원이 존재하는 세포(APC)의 존재에 따른다. 최근에 이들 독소의 독성 효과가 생체내에서 입증되는 T 세포 유사분열물질의 활성에 기인한다는 것이 인식되어 왔다.

IL-10은 다양한 세포 계통상에서 다상유전성 활성을 나타내는 사이토킨이다. 이것은 뮤린 T 세포 및 유방 세포에 대한 성장 조인자, B 세포내에서의 Ia 유도, 및 T 세포 활성화를 억제하는 능력이 포함된다. 후자의 효과는 APC로서 작용하기 위한 대식세포의 능력을 억제함으로써, 간접적으로 입증될 수 있다. 이 효과는 사이토킨 유사 IL-1, TNFα, 및 IL-6을 생성하는 이의 능력을 포함하는, 대식세포 기능에 있어서 IL-10의 일반적인 억제 효과의 일부인 것으로 여겨진다.

본 연구는 T 세포-매개된 치명적인 쇼크의 생체내 모델로서 마우스내 스타필로코커스 장독소 B-(SEB) 유도된 쇼크를 사용한다. 이 모델에서는, 마우스를 D-갈락토사민으로 예비처리함으로써 SEB의 독성효과에 민감하도록 한다. 이 처리는 간청정 메카니즘(liver C1earance mechanism)에 영향을 미침에 의해 장독소에 대해서 마우스가 지니는 천연의 내성을 저하시킨다. 소 용량의 SEB를 연속 투여함으로써 2일 이내에 치사한다. 이 모델에서 독성은 TNFα 생성을 생성하는 T 세포가 임계적인 역활을 하는 것으로 나타난 거대한 T 세포 활성에 기인하는 것으로 보인다. IL-10을 사용한 마우스의 처리는 대식세포-의존성 T 세포 활성화를 억제하는 이의 능력을 통해서, SEB-매개된 독성을 억제한다.

[실시예 D1]

생체내에서 SEB-매개된 독성을 방지하는 IL-10 마우스

4 내지 5주된 수컷 BALB/c H-2^d마우스를 업자(Simonson Laboratories, Gilroy, California)로부터 입수한다.

[반응제]

사용한 물질은 하기와 같다: 뮤린 인터루킨-10 (mIL-10)은 표준방법[참조: Satish Menon of DNAX Research Institute(Palo Alto, CA)]으로 제조한다. D(+)-갈락토사민(G-0500)은 업자(Signn, St. Louis, Mo)로부터 입수한다. 초기 실험에서 사용한 스타필로코커스 장독소 B(SEB)는 또한 시그마(Sigm)에서 시판된다. 연속적인 실험에서 사용된 SEB는 피. 휴고(P. Hugo, National Jewish Center for Immunology, Denver, Co.)에 의해 제공된 업자(Toxin Technology, Madison, WIS.)로부터 입수한다. 모든 물질은 군형잡힌 염 용액중에서 희석시킨다.

[처리]

4 내지 5주된 수컷 마우스에 다양한 농도의 mIL-10을 복막내 주사한다. 3 내지 4시간 후 동일한 마우스에 D-갈락토사민을 복막내 주사한다. 2번째 주사후 1 시간 만에, 이 마우스에 상이한 농도의 SEB를 주사한다. 주사후 이 마우스를 24, 36 및 48시간 경과 후 관찰한다.

초기 실험에서는 IL-10이 생체내 마우스 모델내에서 SEB의 독성을 변경시킴을 확증한다. 예비실험은 이 모델에서 고 치사도를 관측하는데 요구되는 SEB의 최소 용량을 측정하는데 촛점이 맞추어졌다. 이 용량은 기원(업자) 및 SEB의 상실에 따라 가변적이다. 일단 이 용량을 주어진 SEB의 양에 대하여 결정하고, IL-10(10㎍/마우스)를 사용한 예비처리를 시험한다. 제20도는 il-10을 사용한 예비처리가 10㎍ SEB/마우스를 사용하여 주사한 마우스 모두를 생존시킴을 입증한다. 비록 IL-10을 사용한 예비처리가 20㎍ SEB/마우스를 주사한 동물의 실제적인 치사를 방지하지 않는다해도, 이것은 이의 생존 기간을 연장시킨다.

[연구 E]

치명적인 내독혈증으로부터 마우스를 보호하는 인터루킨 10

요약

IL-10은 실험관내에서 IL-1, IL-6 및 TNFα의 생성을 갇소시키며, 마우스에서의 IL-10의 중화는 동일한 모노킨의 상승을 초래한다. 본 연구는 IL-10의 모노킨-억제 특성이 마우스를 LPS-유도된 쇼크 및 모노킨 매개된 염증 반응으로부터 보호하는 능력을 부여하는지의 여부를 시험한다. 재조합체 뮤린 IL-10의 0.5 내지 1㎍의 1회 주사는 내독소의 치명적인 복막내 주사로부터 BALB/c 마우스를 재생적로 보호한다. 이 결과는 IL-10을 장독소 주사와 동시에, 또는 주사후 30분 후에서도 수득되었다. IL-10의 보호 효과는 중화시키는 항-IL-10 항체의 선행 주사에 의해 역전되며, 장독소-유도된 TNFα 방출에서의 실제적인 감소와 관련되어 있다. 이 자료는 세균성 패헐증의 치료용 후보물질로서, 및 더욱 일반적으로는 효과적인 소염성 반응제로서의 IL-10과 관련되어 있다.

심각한 세군 감염은 저헐압증, 열, 조직 괴사, 광범위한 기관 기능장애 및 궁극적으로는 치사를 포함하는 밝혀진 생리학적 변화를 초래한다. 그람-음성 세균의 경우에, 이 독성은 내독소, 세균 세포 벽의 리포폴리사카라이드(LPS) 성분에 기인한다. 더우기, 토끼, 마우스, 및 기타 동물에 적절한 용량의 LPS를 주사함으로써 통상적인 패헐병성 쇼크 증후인 변화가 일어나서, 결국은 이 염증성 반응의 단순한 동물 모델이 수득된다. 동물은 모노클로날 항체 또는 IL-1Ra라 칭하는 생리학적 IL-1 길항제를 사용하여, 이들 모노킨을 중화시킴으로써 세균 및 장독소-유도된 쇼크로부터 보호될 수 있기 때문에, 내독소-유도된 독성은 내독소-자극된 대식세포/단핵세포로부터의 TNFα, IL-1 및/또는 IL-6의 방출에 기인하는 것으로 보인다.

인터루킨 10(IL-10)은 헬퍼 T 세포 및 NK 세포에 의한 IFNγ 생성의 억제; 흉선세포, 유방 세포와 B 세포의 생장 공동-자극; 및 모노킨 생성의 억제를 포함하는 다수의 실험관내 특성을 지닌다. 후자의 특성면에서 볼 때, IL-10은 사람 단핵세포 및 마우스 복막 대식세포에 의한 TNFα,IL-1α, IL-1β, IL-6, IL-8 및 GM-CSF의 유도된 생성을 크게 억제한다. 이와는 대조적으로,IL-10은 단핵세포에 의한 TGFβ의 구조적인 발현에 있어서의 효과가 없으며 IL-1Ra의 단핵세포 생성을 실제적으로 상향 조절한다. 이 실험관내 데이타는 특이적인 모노클로날 항체를 사용하는 IL-10의 중화가 마우스내에서 순환하는 TNFα 및 IL-6를 상승된 농도로 이끈다는 실험관내 실험에 의해 지지된다. IL-1Ra을 증가시키는 능력과 합해진 TNFα, IL-1 및 IL-6의 생성을 억제하기 위한 IL-10의 능력은, 사이토킨을 내독소-유발된 쇼크에 대해서 마우스를 보호할 수 있도록 하는지의 여부에 대해 시험 가능하도록 한다.

[실시예 E1]

마우스에서의 치명적인 내독혈증에 있어서 IL-10의 효과

마우스

8주된 BALB/c 암컷 마우스는 업자[Simonsen Laboratories(Gi1roy, CA)]로부터 입수한다.

[반응제]

이. 콜라이 혈청형 0111:B4로부터의 리포폴리사카라이드(LPS)는 업자(Sigma Chemical Co.)로부터 입수한다. 재조합 뮤린 IL-10을 이. 콜라이내에서 발현시키고 친화-정제 및 이온-교환 크로마토그래피에 의해서 고 특이적인 활성에 따라 정제한다. 이 물질은 내독소를 최소로 함유하며, 4개월 이상 4℃에서 안정하다. 뮤린 IL-10의 특이적인 활성은 사이토킨 합성 억제 검정[참조: Fiorentino et a1. (1989) J. Expt'l Med. 170:2081-2095], 및 MC/9 유방 세포 공동-자극 검정[참조: Thompson-Snipes et al.(1991) J Exp Med.173:507-510] 모두에서 평가한다. 중화시키는 항체 실험을 2A5, 랫트 IgG1 항-마우스 IL-10 모노클로날 항체 또는 GL113으로 지명된 이소타입 대조군 항체를 이용한다.

[TNFα검정]

TNFα의 혈청 농도는 사이토킨 특이적인 ELISA를 사용하여 평가한다.

BALB/c 마우스 20개 그룹에 치명적인 용량의 LPS 단독, 또는 동일한 양의 LPS와 함께 가변적인 양의 재조합 뮤린 IL-10을 복막내 주사한다. 이러한 유형의 몇몇 실험에서, 마우스는 IL-10 0.5㎍, 1.0㎍ 또는 10㎍을 LPS와 동시에 동물에 투여한 경우 LPS-유도된 쇼크로부터 생성되는 치사로부터 모두 보호되었다(제21도). 이 실험의 일부에서, 부분적인 보호는 또한 LPS 투여시에 IL-10 0.1㎍ 또는 0.05㎍을 주입받는 마우스에서 관측되었다(제21도).

[실시예 E2]

항 IL-10 항체에 의한 보호의 중화

치명적인 내독헐증으로부더의 IL-10 매개된 보호는 중화시키는 항-IL-10 항체의 선행투여로 차단되나, 이소타입 조절 항체에 의해서는 차단되지 않으며(제22도), 이 사실은 이 효과의 특이성을 확증한다.

[실시예 E3]

역학적 연구는 치명적인 내독헐증으로부터의 IL-10 매개된 보호가, IL-10을 LPS 주사 30분후 투여하는 경우에도 달성됨을 보여준다(제23도). 그러나, IL-10 투여시 이러한 지연은 실제적으로 보호를 갇소시키며, IL-10을 LPS 주사후 5시간만에 투여하는 경우 보호하지 않음을 나타낸다(제23도).

[실시예 E4]

IL-10의 TNFα에 있어서의 효과

치명적인 내독헐증은 바람직하지 않는 모노킨-매개된 염증 반응이다. IL-10은 실험관내에서 활성화된 대식세포 및 단핵 세포에 의한 모노킨 생성을 억제함이 밝혀졌으며, 이 사실은 상기 IL-10-매개된 보호가 내독소-유도된 반응에서 모노킨 생성의 억제를 반영함을 제안하고 있다. 더우기, LPS1±IL-10 주사후 1,2 및 3시간만에 수집한 혈청에는, IL-10에 의해 보호된 동물에서 순환하는 TNFα 수준이 현저히 감소되어 있다. 항-TNF 항체는 치명적인 내독헐증으로 부터 마우스를 유사하게 보호하기 때문에, TNFα의 IL-10 유도된 억제가 치명적인 내독혈증에 대해 제공되는 사이토긴을 보호하는 것으로 여겨진다. 대식세포/단핵세포 기능에 있어서 IL-10의 또다른 효과는 치명적인 장독헐증에 대해 보호하는 이의 능력에 기여할 수 있다. 실험관내 연구에서는 IL-10이 IL-1 및 IL-6만을 억제하는 것이 아니라 IL-1Ra를 상향조절하며, 이 결과 또한 치명적인 내독헐증도 보호함을 나타내며, 이 사실은 중화시키는 항-사이토킨 항체의 사용 또는 직접적인 IL-1Ra 투여에 대한 보고로써 제안된다.

[연구 F]

마우스의 Ly-1 B 세포는 고갈시키나 통상적인 B 세포는 고갈시키지 않는 연속적인 항-인터루킨 10 항체의 투여

요약

Ly-1 B 세포는 연속적인 자가-보충의 뚜렷한 특성을 지니며, 또한 최근에 기술된 사이토킨 인터루킨 D(IL-10)의 크게 상승된 구조적이고 유도적인 생성을 기초로 하여 통상적인 B 세포로부터 구별될 수 있다. IL-10이 Ly-1 B 세포에 대한 오토크린(autocrine) 또는 파라크린(paracrine) 성장 인자로서 작용하는지의 여부는 마우스 IL-10을 특이적으로 중화시키는 모노클로날 토끼 IgM 항체를 출생부터 8주까지의 마우스에 계속 처리함으로써 시험한다. 이 방법으로 처리된 마우스는 복막-잔류성 Ly-l B 세포를 상실하며, 크게 감소된 농도의 혈청 면역글로불린 M을 포함하며, α1,3-덱스트란 또는 포스포릴클린의 복막내 주사에 반응하는 항체, Ly-1 B 세포 소단위중에 잔류하는 특이적인 B 세포에 대한 항원을 생체내에서 현저하게 생성할 수 없다. 이와는 대조적으로, 항-IL-10 처리된 마우스의 통상적인 비장 B 세포는 총 수, 표현형, 및 B 세포 유사분열물질 및 흉선-의존성 항원 트리니트로페닐-키홀 림페트 헤모시아닌(TNP-KLH)에 대한 실험관내 반응성에 있어 정상이다.

중화시키는 항-IFNγ 항체의 공동 투여는 이들 마우스내에 복막-잔류성 Ly-1 B 세포의 수를 실제적으로 보유하기 때문에, Ly-1 B 세포 고갈의 메카니즘은 항-IL-10-처리된 마우스내에서의 내인성 인터페론-γ(IFNγ) 농도의 상승과 관련되어 있는 것으로 여겨진다. 이 결과는 IL-10이 Ly-l B 세포 발육의 조절 인자임을 나타내며, Ly-1 B 세포를 특수하게 고갈시키는 방법을 확인시킴으로써, 면역 시스템내에서 이들 세포의 역활을 추가로 평가할 수 있게 한다.

Ly-1 B 세포는 성장한 마우스의 총 B 세포중 약 2%를 포함하며 통상적인 B 세포와 구별되는 몇가지의 흥미있는 다음 특성을 보인다: (a) 비록 대부분의 1차 및 2차 임파조직중에서 거의 검출되지 않는다해도, 이들은 복막강 및 흉막강내에 매우 풍부하게 존재하므로, 장기와-연관된 임파 조직내에서 이의 제2세대이다; (b) 이들은 초기 개체 발생시 발육되어 우세하게 존재하며, 동물의 생명에 있어서 자가-보충적이다; (c) 이들은 자가-결정 인자와 고도로 가교-반응성인 저-친화성 항체의 제한된 레퍼토리를 생성하며, 체세포 돌연변이에 의해서 성숙되는것 같지는 않다; (d) 이들은 혈청중에서 발견되는 대부분의 IgM 항체를 생성하며, 포스포릴콜린 및 α1,3-덱스트란과 같은, 몇몇 세군성 결정인자에 의해 유발된 전체 항체 반응을 생성한다. 비록 면역 시스템 기능중에서의 이들의 상세한 역활이 분명치 않다해도, Ly-1 B 세포에 의해 생성된 항체의 특이성 면에 기준하여, 향상된 다양한 모델은 항-세균성 면역성; 노쇠한 적헐구와 같은 숙주 세포 파괴물의 세정;및 발육 동안 항체 레퍼토리의 변형에 있어서의 역활을 포함한다. Ly-1 B 세포가 몇몇의 모노킨 및 T 세포-기원한 사이토킨의 생성을 하향조절하는 IL-10의 강력한 유도인자라는 최근의 발견은, Ly-1 B 세포의 광범위한 면역조절 역활의 가능성을 상승시킨다. 이러한 많은 구별가능한 특징을 사람에게 평가하기란 어렵지만, 관련된 특성을 지닌 Ly-1-보유의 사람 B 임파구의 집단은 동정되었다.

[실시예 F1]

마우스의 Ly-1 B세포를 고갈시키는 연속적인 IL-10의 중화

마우스

가임 중간단계인 BALB/c 마우스 및 C3H/HeJ 마우스는 업자[Simonsen Laboratory (Gilroy, CA)]로부터 입수한다.

항-IL-10 처리

5내지 10마리의 나이가 맞는 BALB/c 마우스에 생후부터 8주까지 SXC.1로 지명되는 중화시키는 랫트 IgM 항-마우스 IL-10 항체(1주동안 O.2mg/주사량, 2주동안 0.5mg/주사량, 3내지 8주동안 1.0mg/주사량), 동량의 J5/D로 지명된 이소타입 대조군 또는 동 용적(100 또는 200μl)의 인산염 완충된 염수(PBS)를 1주당 3회씩 복막내 주사한다. 처리하지 않은 나이가 맞는 BALB/c 마우스를 비교용의 모든 실험에 포함시킨다. SXC. 1 및 J5/D 항체는 혈청이 유리된 하이브리도마 상층액으로부터 입수하여, 연속적인 2회의 35% 황산암모늄 침전 단계로 정제한다. 몇몇 실험에서, 별개의 2A5로 지명된 랫트 IgGl 항-마우스 IL-10 항체 또는 이의 이소타입, 대조군 GL113을 유사량으로 마우스에 주사한다. 후자의 항체를 1주동안 0.5mg/주사량, 2주동안 1mg/주사량, 3내지 8주동안 2mg/주사량으로 복막내 투여한다.

면역형광성

세척한 세포를 하기 반응제의 배합물로 염색한다; 플루오레스세인화된 항-마우스 IgM 항체(DS-1; Pharmingen, San Diego, CA 제조원); 바이오티닐화된 랫트 항-마우스 IgD 항체(11-26C)(J. Kearney가 제조); 플루오레스세인화된 항-마우스 CD3항체(145-2C11, Boehringer Mannheim, Corp., Indianapolis, IN 제조원; Caltag Labs., South San Francisco, CA). 바이오티닐화된 반응제는 파이코에리트린-접합된 스트렙토아비딘(Becton Dickinson ＆ Mountain View, CA 제조원)과 함께 사용한다. 세포를 FACScan으로 분석하고, 사멸한 세포는 정면각 및 측면 산란을 기준으로 제외시킨다. 이 결과는 5000개의 살아있는 세포의 형광 강도가 각 실험 그룹으로부터 계수됨을 나타낸다.

항체 ELISA

처리한지 8주후 수집한 혈청 샘플을 랫트 항-마우스 IgM(R8-103, Pharmingen 제조원)을 PVC 미세적정 플레이트상에서 혈청 샘플 희석액 5㎍/ml로 피복하거나, 표준물로서 몇개의 정제된 골수종 마우스 IgM 단백질의 혼합물을 가하고, 면역 복합체를 바이오티닐화된 랫트 항-마우스 IgM(R19-15, Pharmingen 제조원) 및 아비딘-접합된 서양 고추냉이 퍼옥시다제(CalBiochem Corp., La JoILa, CA 제조원)와 1mg/ml의 기질(2,2'-아지노비스[3-에틸-벤즈티아졸린 설포르산; Sigma Chemical Corp. 제조원)을 사용하여 연속적으로 검출하는, 샌드위치 ELISA를 사용하여 마우스 IgM의 존재에 대해 검정한다.

포스포릴콜린 및 α1,3-덱스트란에 대한 특이적인 항체 반응은 항-IL-10 또는 대조군 마우스를 염수 0.5ml, 류코노스톡 메센테로이데스(Leuconostoc mesenteroides; Dr. Slodki의 U.S. Department of Agriculture. Agricultural Research Service 제공)로부터 기원한 α1,3-덱스트란 50㎍, 또는 포스포릴콜린 공급원으로서의 2x10⁸개 가열-사멸시킨 스트렙토코커스 뉴모니아에(Streptococcus pneumoniae)로써 챌린지한후에 측정한다. 7일후 모든 마우스로부터 수집한 혈청을 ELISA를 사용하여 α1,3-덱스트란 또는 포스포릴콜린에 대한 특이적인 항체에 대해 분석한다. TNP-KLH내에 대한 특이적인 항체 반응을 TNP-KLH 10㎍을 마우스에 복막내로 챌린지하고, IgM 분석 후 7일만에 혈청을 수집하며, 10내지 14일후 IgG에 대해 분석함으로써 측정한다. TNP-특이적인 항체는 ELISA를 사용하여 적량한다. 모든 경우에 있어서, 항-IL-10 처리는 항원 챌린지 및 혈청 수집사이에서 지속시킨다.

IENγELISA

항-IL-10 처리한 마우스 또는 대조군 마우스로부터 수집한 혈청 샘플을 사이토킨-특이적인 ELISA를 사용하여 뮤린 IFNγ에 대해 검정한다.

암컷 및 수컷 BALB/c 마우스에 SXC. 1으로 지명되는 중화시키는 랫트 IgM 항-마우스 IL-10mAb의 상이한 용량을 출생부터 8주까지 1주일당 3회 주사하고, Ly-1B 세포수 및 기능에 대하여 계속해서 분석한다. 처리하지 않거나 PBS 또는 관련된 랫트 IgM 이소타입 대조군(J5/D로 지명)을 주사한 나이가 맞는 BALB/c 마우스의 대조군 그룹이 비교용으로 포함된다. 항체를 결과의 현저한 변형없이 복막내 또는 경피적으로 투여한다. 사용한 항체 주사 방식으로 SXC.1 및 J5/D 항체의 경우 모두에서 랫트 IgM-특이적인 ELISA로서 측정한 것으로써 8주만에 50mg/ml의 평균 혈청 랫트 IgM 농도가 수득된다. 처리한지 8주후, 항-IL-10 처리한 마우스는 하기 범주면에서 3개의 대조군 그룹과 구별되지 않는다: 총 체중, 간, 비장, 흉선, 임파절, 장 및 폐의 전체적인 조직학적 실험; 헤마토크릿법(henutocrits); 비장, 흉선, 임파절 및 복막내 백혈구 세포의 총 수; 및 비장, 임파절 및 흉선내 B세포, T세포, 및 비-B/-T 세포의 비. 이와는 대조적으로, 기술된 4개의 실험 그룹 각각에 포함된 5내지 10마리의 마우스로부터 수집한 혼주된 복막 세척물내에서 수득한 면역형광성 표현형의 세포는 항-IL-10(SXC.1)-처리된 마우스내에서 IgM⁺및 IgD⁺세포의 현저한 고갈을 나타내나, 다른 대조군 동물 어느것 중에서는 나타나지 않는다(제24도). 동일한 데이타를 C3H/HeJ 마우스를 포함하는 24개의 독립된 실험과 별개의 랫트 IgG1 항-IL-10 중화시키는 항체를 사용하는 몇몇 실험에서 수득한다. 항-IL-10-처리된 동물은 또한 면역형광성에 의해 평가한 것으로서, B220-생성의 복막세포가 고갈되어 있으며 50㎍/ml의 LPS와 함께 공동-배양한지 3일 후 [³H]-티미딘을 혼입시키는 이 세포의 능력에 의해 평가된 것으로서, LPS-반응성 복막 세포가 고갈되어 있다. 이러한 발견은 항-IL-10-처리된 BALB/c 마우스가 복막강내에 B세포를 함유하지 않지만, 이들 부위로부터 정상적으로 회수가능한 1내지 5x10⁶의 B세포를 함유함을 나타낸다. 3색 면역형광성에 의해서 본 실험 동물 이용시 8주된 BALB/c 마우스의 복막강이 극소수(＜5%)의 통상적인 B세포를 함유함은 명백해진다. 따라서 제24도에 나타낸 결과는 Ly-1 B 세포가 먼저-우세하게 고갈됨을 나타낸다. 복막 B세포의 현저한 고갈에도 불구하고, 항-IL-10 처리한 마우스의 복막강의 총 세포질은 대조군 그룹의 것과 현저히 상이하지는 않다. 상이한 조헐성 세포 계수와 함께, 추가의 면역형광성 분석에서는, B세포 상실이 항-IL-10 처리된 동물에서 복막의 CD4+T 세포 및 과립구의 증가로써 보충됨을 나타낸다. 다른 2개의 관측은 항-IL-10 처리된 마우스에서 Ly-1 B 세포의 고갈이 면역시스템 전체에서 일어나며 복막강에 한정되지 않음을 나타낸다. 우선, 항-IL-10 처리된 마우스는, 마우스 IgM-특이적인 ELISA에 의한 기록된 것으로서, 3개의 대조군 그룹과 비교할 때 혈청 IgM 농도가 90 내지 100%로 현저히 감소함을 나타낸다(제25도). 둘째로, 항-IL-10 처리된 마우스는 α1,3-덱스트란 또는 포스포릴콜린(제26도), Ly-l B 세포 소단위내에서 전체적으로 기능적으로 반응성인 B 세포가 존재하는 2개의 흉선-의존성 항체에 대한 생체내 항체 반응을 생성하는 능력이 현저히 결굅되어 있다.

[실시예 F2]

표현형적으로 및 기능적으로 정상인 통상의 B 세포를 함유하는 항-IL-10 처리된 마우스

Ly-1 B 세포의 항-IL-10 처리에 따른 현저한 효과 측면에서, 이들 동물내 통상적인 B 세포 상태를 조심스럽게 평가함이 중요하다. 상술한 바와 같이, 항-IL-10 처리한 동물 또는 대조군 동물의 비장내 백헐구 세포의 총 수는 24개의 독립된 실험에서와 현저하게 상이하지 않다. 제27도는 마우스의 실험 그룹 4개중 어느 것에서도 B220+B 세포, CD3+T 세포 및 비-B시 세포(B220-CD3-)의 비율이 상이지 않음을 나타낸다. Ig⁺B 세포 또는 CD4⁺T 세포를 비교하는 경우 동일한 데이타가 수득된다. 이 데이타는 항-IL-10 처리된 마우스내 비장 B 세포의 표현형의 총수가 대조군 그룹의 각각의 것과 동일함을 나타낸다. 항-IL-10 처리된 마우스내서 통상적인 B 세포의 면역경쟁성은 2가지 방법으로 시험한다. 첫째로, 항-IL-10 처리한 마우스는 흉선-의존성 항원 TNP-KLH를 주사한 것에 대해 반응하는 정상의 IgM 및 IgG 항체를 생성한다(제28도). 항-IL-10 처리한 마우스에서 TNP-KLH에 대한 2차 반응은 정상이다. 둘째로, 항-IL-10 처리한 마우스로부터의 비장 B 세포는 50㎍/ml LPS 또는 항-IgM 항체에 대한 실험관내 증식 반응을 정상으로 진행시켰다(표 F1). 항-IL-10 처리한 마우스에 대한 비장 세포의 백그라운드 증식 반응은 대조군의 반응보다 3 내지 5배 더 높다(표 F1). 총칭해서, 이 데이타는 항-IL-10 처리한 마우스내에서 통상적인 B 세포가 대조군 마우스내의 것과는 정량적으로 및 기능적으로 구별되지 않음을 나타낸다.

[표 F1]

LPS, 항-IgM 및 항-CD3 자극에 대해서 항-IL-10 처리된 마우스 및 대조군 마우스로부터 비장세포의 실험관내 증식 반응.

동물을 생후부터 8주까지 제1도에 기술한 바와 같이 처리한다. 각 그룹의 마우스 3 마리로부터 수득한 2×10⁶/ml의 혼주된 비장 세포를 배지 단독, 또는 LPS(50mg/ml)가 보층된 배지 또는 염소 항-마우스 IgM 항체(50mg/ml) 또는 햄스터 항-마우스 CD3 항체(5mg/ml)가 보층된 배지중에서 3일 동안 배양한다. 항-CD3 자극을 위해서, 항체를 비장 세포 첨가전에 미세적정 플레이트상에 피복시킨다. 증식을 1mC/웰 [³H]티미딘(NET O27; New England Nuclear, Boston, MA)을 사용하여 16시간 동안 펄스(pu1se)시킨 후, [³H]티미딘의 혼입을 통해 평가한다.

[실시예 F3]

Ly-1 B 세포 고갈의 메카니즘

증식 검정

각 그룹의 마우스 3마리로부터 입수한 2×10⁶세포/ml의 혼주된 비장 세포를 배지 단독, 또는 LPS(50㎍/ml), 염소 항-마우스-IgM 항체(0611-0201; Cappel Laboratories, CochranviILe, PA)(50㎍/ml) 또는 햄스터 항-마우스 CD3 항-항체(D.J. Blusetone, University of Chicago, Chicago,IL) (5㎍/ml)가 보충된 배지 중에서 3일 동안 배양한다. 항-CD3 자극을 위해서, 항체를 비장 세포 침가전에 미세역가 플레이트 상에서 피복한다. 증식은 1mCi/웰 [³H]티미딘(NET O27; New England Nuclear, Boston, MA)을 사용한 16 시간의 펄스 후 [³H]티미딘의 혼입을 통해 평가한다.

몇몇의 가능한 메카니즘이 항-IL-10 처리된 마우스에서 Ly-1 B 세포의 고갈에 대한 해석으로 고려된다. 이 효과는 항-IL-10 처리된 항체에 의한 Ly-1 B 세포의 선택적인 세포 독성을 포함하지 않는 것으로 여겨지는데, 그 이유는 성숙한 마우스내에 동일한 항체의 주입이 1,2 또는 3일후 총 복막 세척 세포 또는 총 복막 B 세포(제29도)의 연속적인 회수에 있어 영향을 미치지 않기 때문이다. 또 다른 해석으로서, 본 발명자는 Ly-1 B 세포 고갈이 일부 다른 내인성 사이토킨 교란의 제2의 결과를 반영한다는 가능성을 고려하고 있다. 더우기, 항-IL-10 처리된 마우스에는 일반적으로 혈청 IFNγ 농도가 상승되어 있는 것으로 밝혀졌으며(제30도), 이 관측은 실험관내에서 Th1 및 NK 세포에 의한 IFNγ 생성을 억제하는 IL-10의 이미 보고된 능력과 일치한다. 이러한 IFNγ의 항-IL-10 유도된 상승이 Ly-1 B 세포의 고갈에 대해 직접 또는 간접적으로 관여하는 가능성에 대해 시험하기 위해, 마우스에게 출생부터 성숙될 때까지 항-IL-10과 항-IFNγ 중화시키는 항체, 또는 항-IL-10과 적절한 이소타입 대조군 항체의 배합물을 주사한다. 이 결과는 이의 이소타입 대조군을 제외한, 항-IFNγ 항체(제31도)가, 마우스의 복막 Ly-l B 세포를 고갈시키기 위한 항 IL-10 처리 능력을 실질적으로 감소시킴을 나타낸다. 항-IFNγ 항체 단독, 또는 항-IL-10 + 항-IFNγ 항체의 배합물의 연속 투여가 항 IL-10 또는 이의 이소타입 대조군을 처리한 마우스로부터의 총 복막 세척 세포의 회수를 변경하지 않는 것이 중요하다. 이 데이타는 Ly-1 B 세포 고갈이 항-IL-10 처리된 마우스내에서 IFNγ 상승을 적어도 부분적으로 초래한다는 사실을 지지한다.

[연구 G]

항 IL-10 처리된 마우스의 변형된 면역학적 상태

요약

상기에서는 마우스에 생후부터 성숙할 때까지 중화시키는 항-IL-10 항체의 연속처리가 Ly 1 B 세포의 특이적인 고갈을 초래하는 반면, 통상적인 B 세포는 수, 표현형 및 기능면에 있어서 정상으로 남는다는 것을 나타내었다(참조: Study F.). 이들 동물의 특성을 확대해 보면, 이 데이타는 항-IL-10 처리된 마우스가 비처리되거나 이소타입 대조군 처리된 마우스로부터 기타 몇몇 범주에 의해 구별될 수 있음을 제시한다. 항-IL-10 처리된 마우스는 실제적으로 증가된 농도의 순환하는 TNFγ 및 많은 경우 순환하는 IL-6을 함유하며 LPS-유도된 쇼크, 모노킨 매개된 염증 반응에 의한 치사 가능성이 높다. 항-IL-10 처리된 마우스내에서는 혈청 면역글로불린 농도의 분석은 혈청 IgM 농도의 이미 보고된 감소와 더불어 이미 보고된 혈청 IgM 농도의 감소와 IgG2a 및 IgG2b농도의 현저한 증가를 보인다. 더우기 항-IL-10 처리된 마우스의 Ly1 B 세포 고갈의 시험은 이 효과가 항-IL-10 처리를 중단한지 8주후 Ly1 B 세포가 정상으로 환원되는 것에 의해 입증되는 바와 같이 일시적임을 나타낸다. 항-IL-10 처리동안 발생된 Ly1 B 세포 고갈은 복막의 T 세포 및 과립구에 있어서의 증가로써 보충된다. 최종적으로, 항-IL-10 처리된 마우스는 포스포릴콜린 및 α1,3 덱스트란에 대한 항체를 생성할 수 없는 반면, 이들은 TNP-피콜의 복막내 주입후 정상적인 항체 반응으로 진행되었다. 이 결과는 흉선 독립성 제II형 폴리사카라이드 항원 그룹내에 있는 하위 범주의 존재를 제안하고 있다. 이 자료는 면역 시스템내에서 IL-10 및 Ly1 B 세포의 역활에 대한 이들의 연관성 문맥내에서 논해진다.

면역 시스템은 다양한 조헐 세포 및 비조헐 세포에 의해 생성된 사이토킨이라는 가용성 당단백질군에 의해서 조절된다. 지난 5년간 이들 면역 조절인자의 실험관내 광범위한 특성 분석은 사이토킨 시스템 내에서 광범위한 기능적 다상유전성 및 과잉성의 개념을 가져왔다. 면역학자들은 현재 이러한 개념이 생체내에서 사이토킨의 생리학적 역활을 정확히 반영하는지의 여부를 평가하는 도전에 직면해 있다. 최근에 발견한 사이토킨 IL-10의 생리학적 역활이 이 시험의 목적이다.

실험관내 특성의 광범위한 목록은 몇몇의 모노킨 및 사이토킨의 생성을 하향조절시키고, 전부는 아니지만 일부 항원 존재 세포에 의한 항원 존재를 억제할 수 있는 강력한 면역 억제제로서의 IL-10을 특성화한다. 자극 특성의 동등하게 긴 리스트는 흉선 세포, 복막 T 세포, B 세포 및 유방 세포의 성장 공동-자극 인자, 세포 독성 T 세포 성장 및 기능의 증폭 인자 및 B 세포 생존 및 분화의 유도인자로서의 동일한 사이토킨을 나타낸다. 생체내 IL-10의 생리학적 역할을 평가하기 위해, 마우스에 생후부터 성숙할 때까지 1주당 2 내지 3회씩 증화시키는 항-IL-10 모노클로날 항체를 주사한다. 초기 분석은 이 처리로 Ly-1 또는 B-1 B 세포로 칭해지는, 소단위의 B 임파구가 현저히 고갈되므로써, IL-10이 Ly-1/B-1 B 세포 발육의 조절인자임을 나타낸다.

Ly-1 B 세포는 사람 및 마우스의 태아 및 신생 임파 조직에서는 매우 우세하지만, 성숙한 면역 시스템에서는 단지 소수만이 발견되는 B 임파구의 아집단이다. Ly-1 B 세포는 성숙한 제1 및 제2임파 조직내에서는 거의 검출되지 않는 반면, Ly-1 B 세포는 성숙한 마우스의 복막 및 흉막강내에 매우 풍부하게 존재하며, 성인의 순환계에는 소수로 발견된다. 뮤린 시스템에서 이의 광범위한 특성은 쉽게 체세포 돌연변이를 겪지 않으며 자가 항원 및 세균 세포벽 성분과 교차-반응성이 높은 저 친화성 항체의 제한된 레파토리를 포함하는, 다수의 흥미있는 특성을 나타낸다. 더우기, 뮤린 재구성 실험은, 통상적인 B 세포와는 대조적으로, Ly-1 B 세포가 숙주의 전 생애에 대해 자가-보층이 가능하며, 대부분의 혈청 I엔 및 포스포릴콜린 및 α1,3 덱스트란과 같은 몇몇 세균성 결정인자에 대해 반응성인 전체 항체를 생성함을 나타낸다. Ly-1 B 세포의 선행 특성은 이들이 매우 상승되고 유도된 IL-10의 생성, 이들 세포에 대한 광범위한 면역조절성 역할의 가능성 증대를 기준으로하여 통상적인 B 세포와 구별될 수 있다. 이러한 흥미있는 특성에도 불구하고, 면역 시스템내에서 Ly-1 B 세포의 상세한 역활은 아직 애매하다.

출생부터 성숙할 때까지 중화시키는 항-IL-10 항체로 계속 처리한 마우스에서는, 이의 복막 B 세포의 상실과 이들의 혈청 IgM농도 및 α1,3 덱스트란과 및 포스포릴콜린에 대한 생체내 항체 반응이 현저히 감소되어 있다는 사실에 의해 입증되는 바와 같이 Ly-1 B 세포가 고갈되어 있다. Ly-1 B 세포의 고갈은 내인성 IFNγ 상승의 제 2결과인 것으로 밝혀졌으며, 이는 항-TFNγ 항체를 공동-투여함으로써 방지할 수 있다. 이들 마우스의 연속적인 면역 상태에 있어서 Ly-1 B 세포 및 내인성 IL-10 모두의 특이적 고갈의 결과는 본원에서 보고한다.

[실시예 G1]

내인성 사이토킨 농도에 있어서 마우스의 항-IL-10 처리효과

마우스

임신 중기의 BALB/c 마우스를 Simonsen Laboratory(Gilroy, CA)로부터 입수한다.

항-IL-10 처리

5 내지 10 마리의 나이가 맞는 BALB/c 마우스에 출생부터 8주까지 항-IL-10 항체 2개중 1개를 하기 프로토콜에 따라서 복막내 주사한다. 일부 실험에서는, 마우스에 1주에 3회씩 SXC.1 랫트 1gM 항-마우스 IL-10 항체를[참조: Mosnnnn et al.(1990) J. Immunol 145: 2938-2945), (1주간은 0.2mg/주사량, 2주간은 O.5mg/주사량, 3주 내지 8주간은 1.0mg/주사량), 동량의 J5/D로 지명된 이소타입 대조군 또는 동용적(100 또는 200㎕)의 인산염 완층액(PBS)을 주사한다. 다른 실험에서는, 마우스에 1주일에 2회썩 2A5, 랫트 IgG1 항-마우스 IL-10 항체(1주간은 0.2mg/주사량,2 주간은 0.5mg/주사량, 3 내지 8주간은 1mg/주사량), 동량의 GIL13으로 지명된 이소타입 대조군, 또는 등 용적(100 또는 200㎕)의 인산염 완충된 염수(PBS)를 주사한다. 비처리한 나이가 맞는 BALB/c 마우스를 비교용의 모든 실험에 포함시킨다. 모든 항체는 혈청-유리된 하이브리도마 상층액으로부터 수득하여 황산암모늄 침전으로써 정제한다. 이 처리 양태에 이어서, 혼주된 비장, 흉선, 임파절 또는 복막 세척 세포를 각각의 마우스 4개 그룹으로부터 수집하여 유동 혈구 계산 또는 기능 검정으로써 분석한다.

사이토킨 ELISA

항-IL-10 처리된 마우스 또는 대조군 마우스로부터 수집한 혈청 샘플을 사이토킨 특이적인 ELISA를 사용하여 뮤린 TNFα 또는 쥐 IL-6에 대해 검정한다.

출생부터 성숙할 때까지 마우스에 항-IL-10의 연속처리는 8주만에 수집된 혈청중에 실제적인 양의 IFNγ의 존재를 이끌지만, 이와 대조적으로 비처리되거나 이소타입 대조군 처리된 마우스 모두는 혈청중에 검출가능한 IFNγ를 상실하고 있다. 항-IL-10 처리로부터 수득된 내인성 사이토킨 파괴를 더 조사하기위해, 처리 8주후에 수집한 혈청을 사이토킨 특이적인 ELISA를 사용하여, TNFα 및 IL-6의 존재에 대해 평가한다. 항-IL-10 처리된 마우스로부터의 혈청은 크게 상승된 농도의 TNFα를 함유하며(제32도), 흔히 상승된 농도의 IL-6을 함유한다(제33도). 항-IL-10 처리된 마우스에 있어서 TNFα 및 IL-6의 상승은 실험관내에서 모노킨 생성을 억제하는 IL-10의 보고된 능력과 일치한다.

[실시예 G2]

마우스 혈청 Ig 농도에 있어서 항-IL-10 처리의 효과

내독소-유발된 쇼크

마우스에 1㎍ 내지 500㎍ 범위의 내독소(이.콜라이 혈청형 0111:B4으로부터의 리포폴리사카라이드, Signn Chemical Co.) 용량을 복막내 주사한다. 1 내지 6일에 걸쳐 생존을 기록한다.

내인성 모노킨 농도에 있어서 항-IL-10 처리의 효과는 LPS-유도된 쇼크에 대한 이들 동물의 감도, 모노킨-매개된 염증반응을 평가함으로써 추가로 분석한다. 초기에 나타낸 데이터는 TNFα,IL-1 또는 IL-6과 1L-lRa라 칭하는 생리학적 IL-1 길항제에 대한 중화 모노클로날 항체가 LPS-유도된 쇼크로부터 마우스를 효과적으로 보호함을 나타낸다. 이 실험을 SXC.1(랫트 IgM) 또는 2A5(랫트 IgG1) 항-IL-10 항체를 출생부터 8주까지 주사한 마우스가 LPS 유도된 쇼크에 의해 사망할 가능성이 높음을 나타낸다(제34도). DNAX 동물시설에 있어서 8주된 BALB/c 마우스의 LPS LD₁₀₀＞380㎍/마우스(복막내 투여)인 것으로 밝혀졌다해도, 장독소 치사된 대부분의 항-IL-10 처리된 마우스는 1㎍으로 작다(제34도). 이러한 사망 가능성의 증가에 대한 상세한 메카니즘은 측정되지 않았지만, 이 데이타는 항-IL-10 처리된 마우스내에서 염증성 모노킨의 일반적인 상향조절과 일치한다.

[항체 ELISA]

처리 8주후 수집한 혈청 샘플을 이소타입 특이적인 샌드위치 ELISA를 사용하여 모든 이소타입의 마우스 면역글로불린의 존재에 대해 검정한다. 이 목적을 위해 사용하는 플레이트 결합 항체는 하기와 같다: 랫트 항-마우스 IgG1(3096, R. Coffman이 제공, DNAX); 랫트 항-마우스 IgG2a(R8-103; Pharmingen, San Diego, CA); 랫트 항-마우스 IgG2b(R9-91, Pharmingen); 랫트 항-마우스 IgG3(R2-38, Pharmingen); 랫트 항-마우스 IgA(R5-140, Pharmingen); 랫트 항-마우스 IgE(EM95, R. Coffman이 제공). 플레이트 피복항체는 1 내지 5㎍/ml에서 사용한다. ELISA에서 사용된 샌드위치 항체는 바이오티닐화된 랫트 항-마우스 IgG1(3098B, R. Coffman이 제공); 바이오티닐화된 랫트 항-마우스 IgG2a(R19-15, Pharmingen); 바이오티닐화된 랫트 항-마우스 IgG2b(R12-3, Pharmingen); 바이오티닐화된 랫트 항-마우스 IgG3(R40-82, Pharmingen); 바이오티닐화된 랫트 항-마우스 IgA(2740B. R. Coffman이 제공); 바이오티닐화된 랫트 항-마우스 IgER35-118, Pharmingen)이다.

이 샌드위치 항체는 스트렙트아비딘-접합된 서양 고추냉이 퍼윽시다제(Cal Biochem, La Jolla, CA) + 1mg/ml 기질 [2,2-아지노비스(3-에틸벤즈티아솔린 황산); Sigma]와 함께, 1 내지 3㎍/ml로 사용한다. ELISA는 표준물로서 정제된 마우스 골수종 면역글로불린을 사용하여 적량한다.

출생부터 성숙될때까지 마우스에 항-IL-10의 연속처리는 이소타입 대조군 처리된 마우스에서 관측된 정상의 혈청 IgM 수준과 비교하여 혈청 IgM 농도를 현저히 감소시킨다. 처리 8주후 수집된 혈청중에서의 기타 면역글로불린 이소타입의 측정은 제35도에 나타낸다. 마우스의 3개 대조군 그룹(즉, 비처리된, PBS 처리된 또는 이소타입 대조군 항체가 처리된)에서 각각의 면역글로불린 이소타입의 농도는 정상 마우스내에서 혈청 녕 농도의 이미 측정된 범위로부터 현저이 변하지 않는다. 그러나, 다수의 변화가 항-IL-10 처리된 마우스내 혈청 Ig 농도에서 관측된다. 이 마우스는 이미 보고된 혈청 IgM의 감소와 IgG2α 및 IgG2β의 현저한 증가와 함께 혈청 IgM 농도의 현저한 감소를 보인다. 나머지 이소타입(IgGl, IgG3, IgE)는 변화가 없거나 일부 실험에서 2- 내지 4-배 증가한다.

[실시예 G3]

항-IL-10 처리된 마우스내에서 일시적인 Ly-1 B 세포 고갈 면역형광성

세척한 세포를 하기 반응제의 배합물로 염색한다:

플루오레스세인화된 항-마우스 IgM 항체(DS-1, Pharmingen, San Diego, CA); 바이오티닐화된 랫트 항-마우스 IgD 항체(11-26c, J. Kearney 제공, U. Birmingham, Ala.);플루오레스세인화된 항-마우스 CD3 항체(145-2 C11, Boehringer-Mannheim, Indianapo1is, IN); 바이오티닐화된 항-마우스 B220 항체(RA3-6B2; Caltag, S.F.);및 바이오티닐화된 랫트 항-마우스 과립세포/호산구 항체(8C5; R. Coffman 제공, DNAX). 바이오티닐화된 반응제는 파이코에리티린-접합된 스트렙토 아비딘(Becton-Dickinson, Mountain View, CA)과 함께 사용한다. 세포를 FACScan을 사용하여 분석하고 사멸한 세포는 정면각 및 측면 분산을 기준으로 하여 배출시킨다. 결과는 각 실험 그룹으로부터 계측된 5000개의 생존 세포의 형광성 강도를 보여준다.

항-IL-10 처리후 평가한 항-IL-10 처리된 마우스를 이 동물내 Ly-1 B 세포의 고갈이 비가역적인지의 여부에 대해 불연속적으로 측정한다. 마우스의 몇 그룹에 생후부터 8주까지 IL-10 항체를 주사하고, 이후 처리시간은 불연속적으로 수행한다. 다음 각 그룹을 8주에서 처리 종결동안 즉시 또는 상이한 시점에서 복막 Ly1 B 세포의 존재에 대해 분석한다. 중요하게도, 상이한 시점에서 수집한 총 복막 세척 세포의 수율에 있어서의 현저한 차이는 관측되지 않는다. 이 몇몇 실험자체에서 마우스에는 초기 3주부터 항-IL-10 처리 종결까지 복막 Ly1 B 세포가 고갈되어 있다. 시간 간격후, Ly1 B 세포는 복망강내에 재출현하기 시작하여 8주부터 항-IL-10 처리의 종결까지 Ly1 B 세포의 정상적인 보층이 관측된다. 복막 B세포 구획의 재구성은 항-IL-10 처리가 불연속적이 된지 약4주부터 B220^brightIgM^dullB 세포가 초기 출현한 후, 몇주 후 B220^dullIgM^brightB 세포가 출현하는 것으로 특징화된다.

[실시예 G4]

항-IL-10 처리된 마우스에서 복막 T 세포 및 과립구의 증가된 수 특이적인 조혈세포 수

비장 또는 복막 세척액으로부터의 세포 현탁액을 세포형태 분석용 사이토스핀을 제조하기 위해서 사용한다. 샘플을 Wright's-Giemsa(Sigma, St. Louis)로 염색하고 임파구, 대식세포, 과립구, 호산구 및 유방세포에 대해 현미경으로 분석한다.

생후부터 8주까지 계속해서 처리한 마우스가 복막 B 세포를 상실하고 있는 반면, 이와같은 마우스로부터 수득할 수 있는 복막 세척 세포의 총수는 대조군 마우스의 것과 현저하게 상이하지 않다. 항-IL-10 처리한 마우스로부터 수집한 복막 세척 세포상에서 수행된 특이적인 조혈세포수는 이것이 복막 과립세포 호산구 및 현저한-비-B 세포 림파구에 있어서의 증가를 반영하고 있음을 나타낸다(표 G1). 항-IL-10 처리된 마우스로부터 복막 세척 세포의 표면 마커 표현형은 Ly1-^brightIg-음성세포(제37도), CD3-양성 Ig-음성세포, Macl-^brightIg-음성 세포(제38도) 및 8C5-^brightIg-음성세포에 있어서의 증가를 나타낸다. 이 분석은 Ly1-양성, CD3-양성 T 임파구에 있어서의 증가를 나타내며 Macl 및 8C5 표면 마커를 발현하는 과립구에 있어서의 증가를 확증한다(표 G1).

[표 G1]

항-IL-10 처리된 마우스 또는 대조군 마우스내에서 조헐성 아-집단의 비율

(†모든 그룹은 복막세포 및 비장세포 수/마우스가 대략 동일하다; 수는 계수한 총 세포의 %로 나타낸다)

[실시예 G5]

항-IL-10 처리된 마우스의 흉선-독립성 항원-TNP-Ficoll에 대한 반응

특이적 항체 반응

TNP-Ficoll에 대한 특이적 항체 반응은 마우스를 TNP-Ficoll(닥터 제임스 몬드에 의해 제공, USUHS) 10㎍을 복강내 챌린지한 지 5 또는 10일 경과후 혈청을 채취하여 측정한다. 항-IL-10 또는 대조군 항체 주사는 항원 챌린지와 혈청 수집사이에도 계속한다. TNP-특이 항체는 ELISA를 사용하여 정량한다.

항-IL-10 처리된 마우스는 2개의 흉선-독립성 제II형, 포스포릴콜린 및 α1, 3 덱스트란에 대한 생체내 항체 반응을 일으키는 능력이 부족하다. 제39도는 항-IL-10 처리된 마우스가 제3의 흉선-독립성 제II형 항원 TNP-Ficoll에 대한 통상생체내 항원 반응을 진행시킴을 나타낸다. 이 반응성은 항-IL-10 처리된 마우스로부터의 비장 B 세포가 정상적인 증식반응을 일으킨 다음 이어서 항-IgM 항체로 흉선 독립성 제II형 항원의 추정된 폴리클로날 동족체를 자극하는 것에 대한 본 발명자의 관찰과 일치한다.

[연구 H]

항-IL-10 항체의 연속 투여에 의한 NZB/W 마우스에서의 자가면역성 개시의 지연

요약

BALB/c 마우스에게 항-IL-10 항체를 연속해서 투여하면 '낭창-프론(lupus-prone)' NZB/W 마우스에서 자가면역성의 발달에 영향을 주는 것으로 공지된 3개의 면역-매개물질(im mune-mediator)인 자가항체, 플렉스(plex) TNFα 및 IFNγ의 내인성 수준이 변형된다. NZB/W 마우스에 있어서 IL-10 중화 결과를 설명하기 위하여, 동물에게 생후 8 내지 10개월까지 항-IL-10 항체 또는 이소타입 대조군 항체를 주당 2 내지 3회 주사한다. 항-IL-10 처리는 전체적 생존율 또는 단백뇨증, 신장염이나 자가항체에 의해 모니터되는 바와 같이 NZB/W 마우스에 있어서 자가면역성의 개시를 실질적으로 지연시킨다. 9개월에서의 생존율은 대조군에 비해 처리된 마우스에 있어서 10%/ 에서 80%로 증가되었다. 자가면역성에 대한 상기 보호는 중화시키는 항-TNFα 항체를 30주에서 장기적으로 항-IL-10 처리된 마우스내로 도입시 보호된 NZB/W 마우스가 신속하게 자가면역성을 보호시키기 때문에, 내인성 TNF α의 상향조절을 유도하는 항-IL-10에 기인한 것으로 나타난다. 이들 데이타는 IL-10 길항제가 사람 전신 흥반성 낭창의 치료에 유용할 것임을 나타낸다.

(NZBxNZW) F1 하이브리드 마우스는 사람에 있어서 전신 홍반성. 낭창과 매우 유사한, 심각한 자가면역 질환을 전개시킨다. NZB/W 마우스에 있어 암컷에서는 6 내지 9개월경, 수컷에서는 12 내지 18개월경에 치명적인 면역-복합체 매개된 사구체신염이 유발된다. NZB/W 마우스에서의 자가면역분석의 근본적인 원인을 정의하기 위한 선행의 시도는 MHC 유전자의 잠재적인 역할에 촛점을 맞추어왔다. 사실, 각종 세포타입에서 MHC 제II형 항원의발현을 상향조절하는 사이토킨인 인터페론γ(IFNγ)는 NZB/W 마우스에서 자가면역성 전개를 가속시킨다. 몇가지 최근의 연구는 MHC 복합체내에 위치하는 TNFα 유전자가 NZB/W 마우스에서의 낭창 신염의 병인에 관련될 수 있음을 제시하고 있다. 이들 연구는 NZB/W 마우스가 예외적으로 낮은 수준의 TNFα를 생산하며, 이는 TNFα 유전자 j에서의 제한 단편 길이 다형성및 TNFα 유전자의 5' 조절 영역에서 단순디뉴클레오타이드 텐덤 반복부위에서의 다형성과 상관있음을 밝히고 있다. 재조합 TNFα를 사용한 대체요법이 NZB/W 마우스에서의 신염의 전개를 현격하게 지연시키는 사실은 상기 관찰에 대한 원인을 내포한다.

IL-10은 시험관내 검정에 있어서 마우스 및 사람의 다양한 면역 자극 및 면역억제 특성을 둘다 조절하는 활성화된 T 세포, B 세포 및 대식구의 서브세트에 의해 생산되는 사이토킨이다. IL-10의 생리학적 역할을 규명하기 위한 최근의 노력에서는, BALB/c 마우스를 생후 8주가될때까지 연속적으로 중화시키는 항-IL-10 항체로 처리한다. IL-10의 공지된 시험관내 특성과 일치하여, 항-IL-10 처리된 마우스는 내인성 INFγ 및 TNFα의 상승된 수준에 의해 특징화된다. 상승된 INFγ는 결국 수 적으로 적은 Ly 1 또는 CD 5 또는 B-1 B 세포로 언급하여 이로부터 대부분의 뮤린 자가-항체가 유도되는 집단인 B 임파구의 서브세트를 고갈시킨다. 정상 마우스에서의 이들 연구는 IL-10의 중화가 NZB/W 마우스에 있어서 몇몇 바람직한 결과, 즉 내인성 TNFα의 상승 및 자가항체 생산의 감소와 몇멎 바람직하지 못한 결과, 즉 내인성 INFγ의 상승을 가져올 수 있음을 나타낸다. NZB/W 암컷 마우스에서의 자가면역성의 진행시 항-IL-10의 연속 처리의 전체적인 영향이 하기에 연구되어 있다. 이 데이타는 IL-10의 중화로 내인성 TNFα의 상승조절에 기인한 이들 마우스에서의 자가면역성의 개시를 현저하게 지연시킴을 나타낸다.

마우스

NZB/W F1 마우스를 잭슨 래버러토리(Bar Harber, ME)로부터 구입한 NZB 암컷 및 시몬센 래보러토리(Gilroy, CA)로부터 구입한 NZW 수컷을 사용하는 DNAX 리서치 인스티튜트의 동물집단에서 사육한다. 더욱 신속한 자가면역성의 개시로 인하여 암컷 F1 마우스만이 이용된다.

항-IL-10 처리

17-23 B/W F1 암컷 마우스 그룹을 SXC.1、또는 JES 2A5로 지명되는, IL-10에 대한 랫트 IgM mAb 또는 IgM mAb로 처리한다. 그룹당 연령이 일치하는 21-23마리의 B/W F1 암컷 마우스를 J5/D(IgM) 또는 GL113(IgG)로 지명되는 이소타입-매치된 대조용 mAbs로 처리한다. 항-IL-10 mAbs 및 이소타입 대조용 mAbs를 면도시킨(nu/nu) 마우스로부터의 복수증으로서 하베스팅시킨 다음, 2회의 연속적인 황산암모늄 침전에 의해 정제하고, 인산염 완층염수(PBS)에 대해 투석시킨 다음, 단백질 전기영동법 및 흡광도 측정으로 정량화한다. 시험은 3부분으로 이루어져있다: (a) 생후 제1주까지 마우스당 mAb 0.2mg을 IgG에서는 4회 또는 IgG에서는 2회 복강내 주사하고 (b) 제2주까지 마우스당 mAb O.5mg을 IgM으로 3회 또는 IgG로 2회 복강내 주사하며, (c) 제3주에서 성체 마우스까지, 마우스당 mAb 1mg을 주당 IgM으로 3회 또는 IgG로 2회 복강내 주사한다. 상기 처방이 마우스에서의 랫트 IgM의 농도가 약 50㎍/ml를 유지시킬 수 있음을 예비적 연구로 알 수 있다.

신장 질환의 평가

단백뇨증은 알부스틱스 딥 스틱(Albustix dip sticks; Miles Laboratories, Inc., Elklnrt, IN)을 사용하여 비색법으로 측정하고, 하기 코드에 따라서 등급화한다: 미량 = 10mg/dl; 1+=30mg/dl; 2+=100mg/dl; 3+=300mg/dl; 4+=1,000mg/dl. 사구체신염의 조직학적 심화도는 조직병리학적 변화의 강도 및 정도를 기준으로 0에서 2+ 스케일로 등급화한다: 0 = 사구체 병변이 없는 신장; 1+ = 미약한 병변, 예를 들면 증가된 맥관막 매트릭스, 맥관막/사구체 세포층실성, 겸상 형성 또는 염증성 삼출액 및 캡슐형 접착체의 존재; 인식가능한 세뇨관 원주(noticable tubular casts)는 없음; 2+ = 심한 병변, 예를 들면, 강력한 세뇨관 원주 형성과 함께 사구체의 70% 이상이 제거된 사구체 구조물.

[자가항체 ELISA]

이본쇄- 또는 일본쇄-DNA(ds- 또는 ss-DNA)에 대해 특이적인 혈청 항체를 ELISA로 정량한다. 간략해서, ds- 또는 ss DNA 5mg/ml를 사용하여 4℃ 밤새 항온 처리하여 ELISA 플레이트(Flow Laboratories, McLean, VA)를 절단한다. 항원-피복된 플레이트를 연속해서 Tween 20 0.05%, NaN3 0.02%를 함유하는 PBS로 1시간 동안 차단시킨 다음, 1:100으로 희석시킨 시험 또는 표준 혈청으로 실온에서 1시간 동안 항온처리한다. 다음, 플레이트를 PBS-0.05% 트원 20으로 세척하고 항-마우스 IgG또는 IgM(Zymed laboratories,Inc. S.San Francisco, CA)과 접 합된 1㎍lml의 서양 고추냉이 퍼옥시다제(HRP)와 함께 1시간 동안 항온 처리한다. 2,2'-아지노-비스(3-에틸벤티아졸린-6-설폰산); ABTS(Sigma Chemicals, St. Louis, MO)1mg/ml를 가한지 30분 후 Vmax 마이크로플레이트 판독기(Molecular Devices, Menlo Park, CA)를 사용하여 흠광도를 측정한다. 항-DNA 역가를 쉐링-플러우 코포레이션(Schering-P10ugh Corp.)의 셀비 움라트(Shelby Umland) 박사에 의해 제공되는 4개 월된 MRL/MpJ-1pr/1pr 마우스로부터의 혼주된 혈청의 참조물질을 사용하여 단위로서 표시한다. 상기 표준 혈청의 1:10O 희석물은 임의로 10O단위/ml인 것으로 추정한다.

Ig 및 INFα의 혈청 농도

Ig ELISA의 경우, 염소 항-마우스 IgG(Kirkegaard ＆ Perry Laboratories, Inc., Gaithersburg, MD) 1㎍/ml로 피복시킨 플레이트를 1:1000 또는 1:5000 희석시킨 시험 혈청과 함께 항온처리한 다음, HRP-접합된 염소 항-IgG 또는 항-IgM(zymed Laboratories,Inc.)과 함께 항온처리하고, 발색시킨다. 골수종 단백질의 혼합물인, 공지된 농도의 스톡과 함께 항온처리하여 수득한 표준 곡선으로부터 IgG 및 IgM 농도를 측정한다.

TNFα EILSA의 경우, 랫트 항-마우스 TNFα mAb(MP6-XT3.11) 5㎍/ml로 피복시킨 플레이트를 1:10 회석된 시험 혈청과 함께 항온처리한 다음, HRP-접합된 랫트 항 마우스 TNFα mAb(MP6-XT22)와 함께 항온처리하여 발색시킨다.

본 출원인은 pH5C, pH15C 및 pBCRFl(SRa)를 포함하는 이.콜라이(E.coli) MC1061의 별개의 배양물을 미합중국 매릴랜드 록크빌 소재의 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션(American Type Culture Collection, ATCC)에 기탁번호 제68191호, 제68192호 및 제68193호로 각각 기탁하였다. 이들 기탁물은 특허 목적용 배양물 기탁에 관한 ATCC 합의하에 제공되는 조건하에 이루어졌으며, 이는 기탁이 35 USC 122 및 37 CFR 1.14에 따라 미합중국 특허 및 상표청에 대해 유효하고, 유지된 기탁물 미합중국 특허 허여시 일반인에게 제공될 수 있다. 기탁된 균주의 입수가능성은 특허법에 따라 정부의 권위하에 허여된 권리에 위반된 발명을 실시할 권한으로서 해석되지 않는다.

상기 기탁은 1989년 12월 20일 부다페스트 조약에 위배되지 않도록 전환되었다.

서열 리스트

(1) 일반적인 정보 :

(2) 출원인 : 렌 드 왈 맬피트, 디-웨이 슈, 안느 오가라 및 허겐 스피츠

(ii) 발명의 명칭 : 패혈병성 쇼크를 치료하기 위한 인터루킨-10의 용도

(iii) 서열번호 : 2

(iv) 거주 주소 :

(A) 주소 : 드낙스 리서치 인스티튜트 스테판 씨. 마세비츠,

(B) 거리 : 901 캘리포니아 애비뉴

(C) 도시 : 팔로 알토

(D) 주 : 캘리포니아

(E) 국가 : 미합중국

(F) 우편번호 : 94304

(v) 컴퓨터 판독형 :

(A) 매체형 : 3.5 인치 디스켓

(B) 컴퓨터 : 메킨토시 SE

(C) 운용 시스템 : 메킨토시 6.0.1

(D) 소프트웨어 : 마이크로소프트 워드 4.0

(vi) 현 출원 데이타:

(A) 출원번호 :

(B) 출원일 :

(C) 분류 :

(vii) 선 출원 데이타 :

(A) 출원번호 :

(B) 출원일 :

(viii) 위임자/대리인 정보 :

(A) 이름 : 스테판 씨. 마세비츠

(B) 등록번호 : 30,285

(C) 참조/도켓 번호 : DX0221

(ix) 통신 정보 :

(A) 전화번호 : (415) 496-1204

(B) 팩스번호 : (415) 496-1200

(2) 서열확인번호 제1에 대한 정보 :

(i) 서열 특성 :

(A) 길이 : 160개 아미노산

(B) 유형 : 아미노산

(C) 쇄형 :

(D) 위상 : 선형

(xi) 서열 기술 : 서열동정번호 제 1

(2) 서열확인번호 제2에 대한 정보 :

(i) 서열 특성 :

(A) 길이 : 147개 아미노산

(B) 유형 : 아미노산

(C) 본쇄형

(D) 위상 : 선형

*

*(xi) 서열기술 : 서열동정번호 제 2

Claims (26)

1. (정정) 생물학적으로 활성인 인터루킨-10_을 유효량 프함하는, 패혈성 쇼크 증상을 조절하는데 유용한 약제학적 조성물.
2. (정정) 생물학적으로 활성인 인터루킨-10_을 유효량 포함하는, 독성 쇼크 증상을 조절하는데 유용한 약제학적 조성물.
3. (정정) 생물학적으로 활성인 인터루킨-10_을 유효량 포함하는, 감염성 쇼크 증상을 조절하는데 유용한 약제학적 조성물.
4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 증상 상태가 종양 괴사 인자-알파(TNF-α) 농도의 상승을 수반하는 약제학적 조성물.
5. 제4항에 있어서 TNF-α의 농도를 감소시키는 약제학적 조성물.
6. 제1항 내지 제3항중 어느 한 항에 있어서, 인터루킨-1 또는인터루킨-6의 농도를 감소시키는 약제학적 조성물.
7. 제1항에 있어서, 증상 상태가 수술 진행 후에 발생한 약제학적 조성물·
8. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 인터루킨-10이 전체 길이의 인터루킨-10인 약제학적 조성물.
9. (정정) 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 인터루킨-10_이 마우스, 인간 또는 바이러스 인터루킨-10인 약제학적 조성물.
10. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 증상이 열, 오한, 저혈압, 혈관 수축, 고열, 저관류, 조직 괴사, 대사성 산증 또는 기관 기능부전으로부터 선택된 약제학적 조성물.
11. 제1항에 있어서, 패혈성 쇼크 상태가 그램 음성균에 의해 유발된 약제학적 조성물.
12. 제2항에 있어서, 독성 쇼크 상태가 그램 양성균에 의해 유발된 약제학적 조성물.
13. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 비경구 투여 제형인 약제학적 조성물.
14. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 유효량이 1㎍/kg/일 이상인 약제학적 조성물.
15. 제3항에 있어서, 증상 상태가 T-세포를 매개로 한 약제학적 조성물.
16. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 증상 상태가 단구를 매개로 한 약제학적 조성물.
17. (정정) 치료 유효량의 인터루킨-10_을 포함하는, 염증 치료용 약제학적 조성물.
18. (정정) 유효량의 인터루킨-10_을 포함하고, 인터루킨-1α, 인터루킨-1β, 인터루킨-6, 인터루킨-8 및 TNF-q 의 실질적인 농도 상승을 특징으로 하는 염증 반응에서 상기 사이토킨의 농도를 실질적으로 감소시킴으로써 염증 반응을 감소시키는 약제학적 조성물.
19. 제18항에 있어서, 인터루킨-10이 마우스, 인간 또는 바이러스 인터루킨-10인 약제학적 조성물.
20. 제19항에 있어서, 인터루킨-10이 서열번호 1(SEQ ID NO:1) 또는 서열번호 2(SEQ ID NO:2)로 정의되는 아미노산 서열로부터 생성되는 재조합 숙성 단백질인 약제학적 조성물.
21. 제19항에 있어서, 염증 반응이 세균 감염에 의해 유발된 약제학적 조성물.
22. 제22항에 있어서, 염증 반응이 그램 음성균에 의해 생성된 내독소에 의해 유발된 약제학적 조성물.
23. 제23항에 있어서, 세균 감염으로 패혈성 쇼크 증상이 생기는 약제학적 조성물.
24. 제22항에 있어서, 세균감염이 그램 양성균에 의해 유발된 약제학적 조성물.
25. 제24항에 있어서, 세균 감염으로 독성 쇼크 증상이 생기는 약제학적 조성물.
26. 제25항에 있어서, 세균 감염 결과 T-세포 의존성 반응이 일어나는 약제학적 조성물.