HU215248B - Eljárás L-lizin előállítására - Google Patents

Abstract

A találmány tárgya eljárás L-lizin fermentációs útőn való termelésére.Az eljárás sőrán egy L-lizin termelésére képes Cőrynebacteriűmglűtamicűm törzset műtációs kezelésnek vetnek alá, sze ektálják a jód-tirőninnal szembeni rezisztenciával rendelkező törzsek közül a szülőtörzsénél jőbb L-lizin-termelő képességgel rendelkező törzseket, ésezeket alkalmas táptalajban az L-lizin felhalmő ódásáig tenyésztik,majd az L-lizint kinyerik a tenyészetből. ŕ

Description

A találmány tárgya eljárás L-lizin előállítására fermentációval.

Az L-lizin az esszenciális aminosavak egyike, amelyet kiterjedten használnak különböző célokra, például gyógyszerek készítésére, élelmiszerek és takarmányok adalékaként és más hasonló célokra.

Mostanáig L-lizinnek a Corynebacterium nemzetséghez tartozó mikroorganizmusok felhasználásával fermentációs úton végzett előállítására szolgáló eljárásokként ismertek voltak a tápanyagként különböző aminosavakat, például homoszerint igénylő törzseket (3,708,395 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírás), S-(2-amino-etil)-L-citeszinre rezisztens törzseket (3,708,395 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírás), aszparaginanalógra vagy kéntartalmú vegyületekre rezisztens törzseket (4,169,763 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírás), βnaftokinonra rezisztens törzseket (FR-A-2,601,03 5 számú francia szabadalmi bejelentés), purinanalógokra vagy pirimidinanalógokra rezisztens törzseket (4,657,860 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírás) és egy iturinhoz hasonló anyagra rezisztens törzseket (EP-A-0,327,945 számú európai közrebocsátási irat) alkalmazó eljárások.

Az L-lizin iránt mostanában megnövekedett igények kapcsán fokozott L-lizin-termelő képességű törzsek előállítására végzett különböző vizsgálatok eredményeképpen azt tapasztaltuk, hogy egy jód-tironinra rezisztens törzs jelentősen növekedett L-lizin-termelő képességgel rendelkezik.

A találmány tárgya egy L-lizin termelésére szolgáló olyan eljárás, amely egy, a Corynebacterium nemzetséghez tartozó és jód-tironinra rezisztens, L-lizint termelő mikroorganizmusnak valamilyen táptalajban az L-lizin felhalmozódásáig való tenyésztéséből és a termel L-lizinnek a tenyészetből való kinyeréséből áll.

Jód-tironinon a leírásban jóddal szubsztituált tironint értünk, amely lehet L-formájú, D-formájú és ezek keveréke. A jód-tironinra előnyös példaként 3,3’,5,5’tetrajód-tironin, 3,3’,5-trijód-tironin, 3,5-dijód-tironin és hasonlók említhetők. Továbbá a jód-tironin definíciójába a jód-tironin nátrium- és káliumsója is beletartozik.

A jelen találmány szerinti eljárásban bármely olyan mikroorganizmus használható, amely a Corynebacterium nemzetséghez tartozik, rezisztens jód-tironinra és L-lizin termelésére képes.

A jód-tironin rezisztenciával rendelkező, L-lizint termelő mikroorganizmus egy L-lizint termelő törzs jód-tironin rezisztenciával való ellátásával kapható. Más módszer szerint a kívánt mutáns nyerhető úgy is, hogy tápanyag auxotrófiát, egy anyaggal szembeni rezisztenciát stb., vagy például esetünkben L-lizin-termelő képességet viszünk be a jód-tironin rezisztenciával rendelkező törzsbe, amely egy vad törzsből származik.

A mutáció a szokásos módon, például ultraibolya fénnyel való besugárzással vagy vegyszerekkel, például N-metil-N’-nitro-N-nitrozo-guanidinnel végzett kezeléssel váltható ki.

A kívánt mutáns a mutációs kezelésnek alávetett törzsek közül úgy szelektálható, hogy egy alkalmas táptalajon, például jód-tironint a szülő törzs növekedésének gátlásához szükségesnél magasabb koncentrációban tartalmazó minimál agarlemez táptalajon kinövő mutánsok közül kiválasztunk egy mutánst, amelynek L-lizin-termelő képessége nagyobb, mint a szülő törzs L-bzin-termelő képessége.

A találmány szerinti kívánt mutánst alkalmazó Llizin előállítási eljárásban a baktériumok tenyésztésére szolgáló bármely szokásos módszer használható.

A találmány szerinti eljárásban táptalajként bármely szintetikus és természetes táptalaj használható, amennyiben megfelelő koncentrációban tartalmaz az alkalmazott mikroorganizmus növekedéséhez szükséges szénforrást, nitrogénforrást, szervetlen anyagokat és egyéb tápanyagokat.

Szénforrásként különböző szénhidrátok, például glükóz, fruktóz, szorbit, glicerin, szacharóz, keményítőhidrolizátum, melaszok, gyümölcslé stb., szerves savak, például ecetsav, fumársav, tejsav, citromsav stb. és alkoholok, például etanol, metanol stb. használhatók.

Nitrogénforrásként ammónia, szervetlen és szerves ammóniumsók, például ammónium-klorid, ammóniumszulfát, ammónium-acetát, ammónium-foszfát stb., karbamid, aminok, egyéb nitrogéntartalmú anyagok és pepton, húskivonat, élesztőkivonat, kukoricalekvár, kazeinhidrolizátum, szójaliszt savas hidrolizátuma, különböző mikrobiális sejtek, emésztett mikrobiális sejtek stb. használhatók.

Szervetlen anyagokként kálium-dihidrogén-foszfát, dikálium-hidrogén-foszfát, magnézium-szulfát, nátriumklorid, vas(II)-szulfát, mangán(II)-szulfát, réz(II)-szulfát, kalcium-karbonát stb. használhatók. Amennyiben egy, a találmány szerinti eljárásban felhasználandó mikroorganizmus növekedéséhez specifikus tápanyagokat igényel, akkor megfelelő mennyiségű tápanyagot adunk a táptalajhoz. Egyes esetekben ezeket a tápanyagokat a nitrogénforrásként felsorolt természetes anyagok komponenseiként adjuk a táptalajhoz.

A találmány szerinti eljárásban alkalmazott mikroorganizmusok L-lizin-termelő képességét egyes esetekben egyéb különböző adalékoknak, például vitaminoknak, így biotinnak, tiaminnak, nikotinsavnak, β alaninnak, pantoténsavnak stb., különböző antibiotikumoknak, aminosavaknak, így valinnak, ciszteinnek, leucinnak, aszparaginsavnak, glutaminsavnak stb. a táptalajba való adagolásával is fokozhatjuk.

A tenyésztést aerob körülmények között, például rázatott tenyészetben, kevertetett merített tenyészetben stb. végezzük, 20-40 °C, előnyösen 28-36 °C hőmérsékleten és 5-9, előnyösen semleges körüli pH-nál.

A táptalaj pH-ját kalcium-karbonáttal, sav- vagy lúgoldattal, ammóniával, pH-pufferoló ágensekkel stb. állíthatjuk be. Az L-lizin általában 1-7 napig tartó tenyésztés után halmozódik fel a kapott tenyészetben.

A tenyésztés befejezése után a kiválásokat, például sejteket eltávolítjuk a tenyészetből, és az L-lizin a tenyészetből szokásos módszerek, például ioncserélő gyantás kezelés, koncentrálás, adszorpció, kisózás és kombinációik alkalmazásával nyerhető ki.

A találmány gyakorlatban való speciális megvalósításait a következő példákkal szemléltetjük.

HU 215 248 Β

1. példa:

Jód-tironinnal szemben rezisztens mutáns előállítása

Corynebacterium glutamicum Η-4934-et (FERM BP-1655), amely tializinnel, rifampicinnel, sztreptomicinnel, 6-aza-uracillel, β-naftokinolinnal és egy iturinszerű anyaggal szembeni rezisztenciával rendelkezik, a következőkben leírt mutációs kezelésnek vetünk alá.

A H-4934 törsz sejtjeit egy 250 pg/ml N-metil-N’nitro-N-nitrozo-guanidint tartalmazó pufferoldatban 30 °C hőmérsékleten 30 percig szuszpendáljuk. A sejtszuszpenziót az alábbiakban megadott összetételű és még 50 pg/ml 3,3’,5-trijód-L-tironin-nátriumsót (a továbbiakban rövidítve „TIT”) is tartalmazó minimál táptalajból készített agarlemezen szélesztjük. Ez a TITkoncentráció elegendő a H-^4934 törzs növekedésének gátlására.

A 30 °C-on 3 napig végzett tenyésztés után a kinőtt telepeket elválasztjuk, mint TIT-re rezisztens mutánsokat, és az L-lizin-termelési tesztnek vetjük alá a szülő törzsnél nagyobb L-lizin-termelő képességgel rendelkező kívánt mutáns kiválasztása céljából. Az így szelektált mutánsok között van a Corynebacterium glutamicum H-8241.

A TIT-tel szembeni rezisztencia (azaz a TIT jelenlétében való növekedés) fokozatának megállapítása céljából a H-8241 és H-4934 törzsek mindegyikét steril vízben szuszpendáljuk, és a szuszpenziót az alábbiakban megadott összetételű, és még az 1. táblázatban megadott koncentrációkban TIT-et is tartalmazó minimál táptalajokból készített agarlemezeken szélesztjük úgy, hogy a sejtsűrűség l*10⁴ sejt/cm² lehessen. A növekedési fokozatot 30 °C-on 5 napig tartó tenyésztés után értékeljük ki. Az eredményeket az 1. táblázatban mutatjuk be.

A Corynebacterium glutamicum H-8241-et a Budapesti Egyezmény szerint letétbe helyeztük 1991. október 8-án a Fermentációs Kutatóintézetnél (Fermentation Research Institute, Agency of Industrial Science and Technology), és a FERM BP-3594 letéti számon került nyilvántartásra.

Az agarlemez minimáltáptalaj összetétele: glükóz 10 g/1, ammónium-klorid 8 g/1, karbamid g/1, kálium-dihidrogén-foszfát 1 g/1, dikálium-hidrogén-foszfát 3 g/1, magnézium-szulfát-víz (1/7) 0,4 g/1, vas(II)-szulfát-víz (1/7) 10 mg/1, mangán(II)-szulfát-víz (1/4) 10 mg/1, cink-szulfát-víz (1/7) 1 mg/1, réz(II)-szulfát-víz (1/5) 1 mg/1, biotin 50 pg/1, nikotinsav 5 mg/1 és agar 20 g/1; pH 7,3.

1. táblázat

Törzs	TIT (pg/ml)
0	10	30
H-4934	++	+	-
H-8241	++	++	++

++: megfelelő növekedés, +: bizonyos mértékű növekedés, semmiféle növekedés.

2. példa:

L-lizin-termelés a találmány szerinti mutáns felhasználásával

Corynebacterium glutamicum H-4934 és H-8241 mindegyikét egy-egy 300 ml-es Erlenmeyerlombikban lévő 10-10 ml-nyi alább megadott összetételű oltótáptalajba oltjuk, és rázatás közben 32 °C-on 24 óra hosszat tenyésztjük.

Az oltótáptalaj összetétele:

szacharóz 50 g/1, pepton 20 g/1, élesztőkivonat g/1, ammónium-szulfát 8 g/1, kálium-dihidrogénfoszfát 1 g/1, dikálium-hidrogén-foszfát 1 g/1, magnézium-szulfát-víz (1/7) 0,5 g/1, biotin 50 pg/1, tiaminhidroklorid 3 mg/1, karbamid 1 g/1, kalcium-karbonát 10 g/1; pH 7,2.

ml oltótenyészetet inokulálunk egy-egy 300 ml-es Erlenmeyer-lombikban lévő 30-30 ml-nyi alább megadott összetételű termelő táptalajba, és 32 °C-on 72 óra hosszat tenyésztünk rázatás közben.

A termelő táptalaj összetétele:

szacharóz 100 g/1, élesztőkivonat 5 g/1, ammónium-szulfát 50 g/1, kálium-dihidrogén-foszfát 1 g/1, magnézium-szulfát-víz (1/7) 0,5 g/1, vas(II)-szulfát-víz (1/7) 10 mg/1, mangán(II)-szulfát-víz (1/4) 10 mg/1, biotin 300 pg/1, karbamid 2 g/1, kalcium-karbonát 30 g/1; pH 7,2.

A tenyésztés befejezése után a tenyészetben felhalmozódott L-lizin mennyiségét kolorimetriásan határozzuk meg a savas réz-ninhidrin módszerrel [Chinard, F. D., Journal of Biological Chemistry, 199, 91 (1952)].

Az eredmények a 2. táblázatban láthatók.

2. táblázat

Törzs	L-lizin hidroklorid (mg/ml)
HM934	44
H-8241	48

A H-8241 törzs tenyésztésével kapott tenyészet 1000 ml-ét centrifugáljuk (3000 fordulat/perc, 10 perc), és a kapott felülúszó pH-ját kénsavval 1,5-re állítjuk. Az így kapott felülúszót átfolyatjuk egy erősen savas ioncserélő gyantával (Diaion SK-1B, H⁺-forma, a Mitsubishi Kaséi Corporation védj egy zett terméke) töltött oszlopon az L-lizin felkötése céljából.

Az oszlopot vízzel végzett mosás után 2 M vizes ammónium-hidroxid-oldattal eluáljuk. Az L-lizint tartalmazó frakciókat egyesítjük, koncentráljuk, és a koncentrátum pH-ját sósavval 5,5-re állítjuk. A kapott koncentrátumot lehűtjük, és etanolt adunk hozzá. így 38 g kristályos L-lizint nyerünk.

Claims (4)

1. SZABADALMI IGÉNYPONTOK

   1. Eljárás L-lizin termelésére, azzal jellemezve, hogy egy, a Corynebacterium nemzetséghez tartozó és jód-tironinnal szemben rezisztenciával rendelkező,

   HU 215 248 Β

   L-lizint termelő mikroorganizmust egy táptalajban tenyésztünk az L-lizinnek a táptalajban való felhalmozódásáig, és a keletkezett L-lizint onnan kinyerjük.
2. 2. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az említett jód-tironin 3,3’,5,5’-tetrajód-tironin,
3. 3,3’,5-trijód-tironin, 3,5-dijód-tironin vagy ezek nátrium- vagy káliumsója.

   3. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az említett mikroorganizmus Corynebacterium
4. 5 glutamicum H-8241 (FERM BP-3594).