KR920005749B1

KR920005749B1 - 신균주 코리네박테리움 글루타미쿰 mwex-46 및 이를 이용한 l-아르기닌의 제조방법

Info

Publication number: KR920005749B1
Application number: KR1019900007498A
Authority: KR
Inventors: 옥치영; 박청; 최옥윤; 임번삼
Original assignee: 주식회사 미원; 김채방
Priority date: 1990-05-24
Filing date: 1990-05-24
Publication date: 1992-07-18
Also published as: KR910020167A

Abstract

내용 없음.

Description

신균주 코리네박테리움 글루타미쿰 MWEX-46 및 이를 이용한 L-아르기닌의 제조방법

본 발명은 코리네박테리움 속에 속하는 신규 미생물 및 이을 이용하여 L-아르기닌을 제조하는 방법에 관한 것이다.

L-아르기닌은 의약품, 식품 , 기타 동물사료등에 널리 이용되는 천연 아미노산의 일종으로 간기능 촉진제, 뇌장해 치료제, 남성불임증 치료제, 종합아미노산 제제, 아미노산수액 등에 사용되고 있고, 녹차나 생선묵 첨가제 및 건간음료의 주원료등으로 각광을 받고 있는 물질이다.

종래에 알려져 있는 미생물 발효에 의한 L-아르기닌의 제조방법으로는 L-아르기닌 디이미나제가 결손된 브레비박테리움 플라붐 균주를 배양하는 방법(특허청 공고번호 81-897), 브레비박테이움속 또는 코리네박테리움속의 종래에 알려져 있는 L-아르기닌 생산균주에 초산 요구성을 부여한 균주를 배양하는 방법(일본 특허공개소 57-163487), 및 2-치아졸알라닌 내성과 L-라이신 요구성을 갖는 브레비박테리움속 또는 코리네박테리움속에 속하는 미생물을 배양하는 방법(일본 특허공개소 60-83593)등이 알려져 있다.

본 발명자등은 발효법에 의한 L-아르기닌의 공업적 생산을 위하여 연구한 결과 코리네박테리움 글루타미쿰에 속하는 균주로서 L-아르기닌 생산능이 있고 아르기닌하이드록사메이트에 내성을 갖는 동시에 L-알라닌에 의해 생육이 촉진되는 새로운 균주 MWEX-46(KCTC 8485P : 1900년 5월 22일 한국 과학기술 연구원에 기탁)^*를 발명하고 이 신균주가 다량의 L-아르기닌을 배지중에 축적한다는 것을 확인하였다.

본 발명에서 사용한 미생물은 코리네박테리움 글루타미쿰에 속하는 L-글루타민산 생성균의 야생주(ATCC 13032)를 모주로 하고 자외선 조사나 NTG(N-메칠-N'-니트로-N-니트로소 구아니딘)등에 의한 통상의 변이처리 방법을 이용하여 획득한 L-아르기닌의 생산능이 있는 균주 MWE-1010를 친주로 하였다. 이 친주에 아르기닌하이드록사메이트 내성을 부여한 후 다시 L-알라닌 첨가에 의해 생육이 촉진되는 본 발명의 균주 MWEX-46(KCTC 8485P)^*를 분리하였다.

본 발명의 균주가 배지층에 다량의 L-아르기닌을 축적하는 기작에 대하여는 분명하지 않으나 L-아르기닌 생합성 단계의 효소인 L-아세칠글루타메이트 카이네이스활성이 친주에 비하여 강화되었고 또한 최종산물인 L-아르기닌에 의한 피이드백 (Feed back)저해나 억제를 받지 않을 뿐만 아니라, L-알라닌 생성을 억제함으로서 L-아르기닌 생합성에 필요한 L-아스파트산과 L-시트룰린의 균형을 유지하게 되어 L-아르기닌의 생성이 촉진되는 것으로 추측된다.

본 발명을 좀더 상세히 설명하면 모주를 변이처리하여 알기닌하이드록사메이트 첨가에 의해 생육이 저해 되는 균주중에서 L-아르기닌을 배지중에 분비하고 L-아르기닌 분해능이 결손된 균주 MWE-1010를 친주로 하였다. 이 친주를 다시 변이처리하여 아르기닌하이드록사메이트 2mg/ml에 내성을 갖는 균주를 선별한 다음 후라스크 배양에 의하여 L-아르기닌의 생성량이 증가된 내성변이주 MWE-4125균주를 취득하였다. 이렇게 하여 얻은 내성변이주는 배양액중에 L-시트룰린이 부생되어 공업적으로 이용하기에 적합하지 않았다.

내성변이주의 L-시트룰린 부생을 방지하기 위하여 단일 콜로니 분리와 변이처리를 반복 실시한 결과 내성변이주로서 L-알라닌 첨가에 의해 생육이 촉진되는 균주 MWEX-46(KCTC 8485P)^*가 L-아르기닌을 배지중에 고농도로 축적시킬 뿐만 아니라 L-시트룰린을 부생하지 않는 것을 확인하여 본 발명을 완성하게 되었다.

본 발명에서 변이주의 분리방법의 예를들면 완전 사면배지에서 30℃ 24시간 배양된 균체를 원심분리나 여과에 의하여 집균한 후 0.05M TM(Tris-Malate)완충액(pH 6.2)으로 2회 세척하여 동일 완충액으로 균체 농도가 10⁸-10⁹/ml되도록 희석한 다음 NTG를 250μg/ml되도록 가하여 30℃에서 30분간 처리하였다. NTG처리가 완료되면 원심분리나 여과에 의하여 집균하고 생리식염수로 2회 세척한 다음 아르기닌하이드록사메이트가 첨가된 배지에 도말하고 30℃에서 3-5일간 배양하여 변이주를 분리하였다.

본 발명에서 사용한 완전배지 및 최소배지의 조성은 다음과 같다.

(주1). 완전배지 : 포도당 1.0%, 육즙 0.5%, 효소추출물 0.5%, 펩톤 1.0%, 식염 0.25%, 한천 1.5-2.0%, pH7.2.

(주2). 최소배지 : 포도당 0.5%, 황산암모늄 0.15%, 요소 0.15%, 제1인산칼륨 0.1%, 제2인산칼륨 0.3%, 황산마그네슘 7수염 0.01%, 염화칼슘 2수염 1mg/ℓ, 바이오친 100㎍/ℓ, 치아민 염산염 100㎍/ℓ, 미량요소^*1mg/ℓ, 한천 1-2%

^*미량요소 : 황선제 2동 270mg/ℓ, 황산아연 10mg/ℓ, 염화제 1철 870mg/ℓ, 염화망간 7.2mg/ℓ, 붕산나트륨 88mg/ℓ, 몰리브덴산암모늄 40mg/ℓ

본 발명의 균주를 친주 MWE-1010 및 내성변이주 MWE-4125와 비교한 결과는 아래와 같다.

[표 1]

[표 2]

본 발명에서 배양액중의 L-아르기닌 분석방법은 사카구치 방법의 변법으로 배양액중의 L-아르기닌 농도가 50-100μg/ml되도록 희석한 액 0.5ml에 0.43N가성소다용액 2.5ml를 혼합하고 A용액(n-프로판올 100ml중 8-하이드록시퀴놀린 5.0g과 1%의 디아세칠 수용액 2.5ml를 함유한 용액)1.0ml를 첨가하여 혼합한 후 25℃에서 1시간 동안 반응시키고 520nm에서의 흡광치를 측정하였다. 별도로 L-아르기닌 표준품을 사용하여 얻은 흡광치의 표준곡선과, 배양액을 사용하여 얻은 흡광치를 비교하여 배양액중의 L-아르기닌 농도를 산출하였다.

본 발명의 미생물을 이용하여 L-아르기닌을 제조하는 방법은 통상의 발효에 사용하는 탄소원, 질소원, 무기물 기타 영양물질을 함유하는 배지에 배양하여 배지중에 축적된 L-아르기닌을 회수하였다.

본 발명에서 사용하는 주요 탄소원으로는 포도당, 설탕, 전분가수분해물, 페당밀 등의 당류를 단독 또는 혼합하여 사용 가능하며 질소원으로는 황산암모늄, 요소, 암모니아가스, 펩톤, 육즙, 효모추출물, CSL, 카제인 가수분해물, 탈지대두박 가수분해물 등을 사용한다. 무기물로서는 인산칼륨, 황산마그네슘, 식염, 황산제 1철, 황산망간등을 사용할 수 있으며 영양물질로는 미생물 생육에 필요로 하는 영양원의 적당량을 배지에 가하여 사용한다.

배양은 통상의 호기적 조건하에서 배양온도 25℃-40℃ pH5.5-8.0의 범위에서 1-5일간 배양하며 배양중의 pH조절은 유기 또는 무기 알칼리성 물질 요소, 암모니아가스, 암모니아수, 탄산칼슘등을 사용한다. 배양완료액에서 L-아르기닌을 회수하는 방법은 이온교환 수지등을 이용한 통상의 방법을 사용한다.

이하 실시예를 들어 본 발명을 구체적으로 설명한다.

[실시예 1]

육즙 0.5%, 효모추출물 0.5%, 펩톤 1.0%, 식염 0.25%, 한천 2.0%를 함유한 사면배지(pH 7.2)에 본 발명의 균주 MWEX-46를 접종하여 28℃에서 24시간 배양한 다음 종배지에 접종하였다. 종배지의 제조는 포도당 5%, 효모추출물 1.0%, 요소 0.3%, C3L 0.5%, 펩톤 1.0%, 식염 0.25%, 바이오친 50μg/ml를 함유한 배지를 5N-가성소다용액으로 pH7.2로 조절한 후 500ml용량의 진탕후라스크에 50ml를 분주하여 121℃에 20분간 살균하였다. 사면배지에서 1백금니 접종한 다음 30℃에서 24시간 배양하여 발효배지에 접종하였다. 발효배지는 포도당 10%, 황산암모늄 4.0%, 요소 0.3%, 제1인산칼륨 0.1%, 제2인산칼륨 0.1%, 황산마그네슘 7수염 0.025%, 바이오친 50μg/ℓ를 함유한 배지를 5N-가성소다용액으로 pH7.2로 조절한 다음 30ml를 500ml진탕후라스크에 분주하여 121℃에서 20분간 가압살균하고 별도로 살균한 탄산칼슘을 3.0%가 되도록 첨가하였다. 종배지에서 1ml를 발효배지에 접종한 다음 30℃에서 왕복 진탕배양 하였다. 같은 방법으로 친주 및 내성변이주를 배양하여 배양액중의 L-아르기닌 생성량을 조사한 결과 표 3과 같은 결과를 얻었다.

[표 3]

[실시예 2]

실시예 1과 동일한 방법으로 종배양을 한 다음 종배양액 1ml를 2차 종배지에 접종하여 30℃에서 24시간 배양하고 2차 종배양액을 5발효조에 5%비율로 접종하여 배양하였다. 2차 종배지로는 폐당밀(포도당으로 환산)5.0%, 탈지대두박가수 분해물 4%, CSL 0.5%, 제1인산칼륨 0.05%, 제2인산칼륨 0.05%, 황산마그네슘.7수염 0.025%, 황산제 1철 7수염 10mg/ℓ, 황산망간.4수염 10mg/ℓ, 바이오치 50μg/ℓ, 치아민염산염 100μg/ℓ, 요소 0.3%를 함유한 배지를 5N-가성소다 용액으로 pH7.2로 조절한 다음 100ml진탕후라스크에 분주하고 121℃에서 20분간 살균하였다. 발효배지로서는 폐당밀(포도당으로 환산) 15.0%, 황산암모늄 1.0%, 제1인산칼륨 0.1%, 제2인산칼륨 0.1%, 황산마그네슘.7수염 0.05%, 바이오친 100mg/ℓ, 치아민염산염 100mg/ℓ, 되도록 용해한 배지 2ℓ를 5ℓ용량의 발효조에 넣어 121℃에서 20분간 살균하고 암모니아로 pH를 7.0으로 조절한 다음 2차종배양액을 접종하여 30℃에서 교반속도 500rpm토이량 1vvm에서 배양하였다. 동일한 방법에 의하여 친주와 내성변이주를 배양하여 L-아르기닌 생성량을 조사한 결과 표 4와 같은 결과를 얻었다.

[표 4]

상기의 방법으로 배양한 발효액을 원심분리하여 균체를 제거하고 상등액을 강산성 이온교환 수지에 통과한 다음 수지를 수세후 2N-가성소다용액으로 용출하였다. 용출액을 탈색 및 농축하여 L-아르기닌 결정을 얻어 표준품과 비교한 결과 순수 L-아르기닌으로 확인되었으며 회수 수율은 91.5%이었다.

Claims

L-아르기닌 생산능을 갖고 있고 아르기닌하이드록사메이트 내성을 갖고 있으며 L-알라닌에 의해 생육이 촉진되는 것을 특징으로 하는 코리네박테리움 글루타미쿰 MWEX-46.
코리네박테리움 글루타미쿰 MWEX-46을 영양 배지에 배양하여 수득함을 특징으로 하는 L-아르기닌의 제조방법.
제 2항에 있어서, 배양은 25℃~40℃, pH5.5~8.0범위의 호기적 조건하에 1~5일간 배양함을 특징으로 하는 L-아르기닌의 제조방법.