JPS6312292A - Ｌ−リジンの製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 本発明は発酵法によるＬ−リジンの製造法に関する。さ
らに詳しくは、本発明はコリネ型グルタミン酸生産菌に
属し、β−ナフトキノリンに抵抗性を有し、かつＬ−リ
ジン生産能を有する微生物を培地に培養して、該培養物
からＬ−リジンを採取することを特徴とする発酵法によ
るＬ−リジンの製造法に関する。

その目的とするところは必須アミノ酸の１つであり、医
薬品あるいは飼料や食品への添加剤として需要の大きい
Ｌ−ＩＪリジン工業的に安価に製造する方法を提供する
ことにある。

従来の技術 従来、発酵法によるＬ−リジンの製造法に関してはコリ
ネバクテリウム属、ブレビバクテリウム属、アースロバ
フタ−属、バチルス属の細菌やその他の微生物のホモセ
リン（またはメチオニンとスレオニン）要求性変異株（
特公昭３６−６４９９号、　ＵＳＰ２，９７９．４３９
）やその他要求性変異株〔特公昭４８−２８６７７号、
同５１−２１０７８号、同５１−３４４７７号（ＬＩＳ
Ｐ３，８２５．４７２）。

同５５−１０４０号、特開昭５６−８６９２号。

同５５−９７８４号〕を用いる方法、また各種薬剤抵抗
性変異株〔特公昭４８−２８０７８号（ＵＳＰ３．７０
７．４４１　）　、同５３−１８３３号。

同５３−４３５９１号、同５９−４９９３号、特開昭５
３−９３９４号、同５５−９７８５号（ＵＳＰ３，６８
７．８１０　）　：１などを用いる方法、あるいはこれ
らの組合せの性質を有する微生物を用いる方法などが知
られている。

発明が解決しようとする問題点 必須アミノ酸の１つであり、医薬品あるいは飼料や食品
への添加剤として需要の大きいＬ−’Ｊリジン、工業的
に安価に製造する方法の開発は常に望まれている。

問題点を解決するための手段 本発明者は、Ｌ−リジンの生産性の改良された菌株を得
るため種々研究を重ねた結果、コリネ型グルタミン酸生
産菌に属するＬ−ＩＪリジン産菌株にさらにβ−ナフト
キノリン抵抗性を付与すると、Ｌ−リジン生産性が飛躍
的に向上することを見出し、本発明を完成するに至った
。発酵法によるＬ−リジンの製造に際し、キノリン類に
対する耐性を付与することによってリジン生産能が向上
することが知られている（特公昭５９−４９９３号）が
、これらの薬剤による生育阻害はＬ−ロイシンで解除さ
れることが示されている。従って、これらのキノリン類
は、Ｌ−ロイシンアナログとして作用していることが推
定される。しかし、β−ナフトキノリンによる生育阻害
は、Ｌ−ロイシンで回復されないことから、β−ナフト
キノリンは特公昭５９−４９９３号におけるキノリン類
とは別の範鴫に属する物質であると考えられる。このよ
うな性質をもったβ−ナフトキノリンに抵抗性を有する
菌株を用いればｌ、−＋Ｊリジン生産性が飛躍的に改善
されることは本発明者によってはじめて見出された知見
である。

以下、本発明の詳細な説明する。

本発明は、コリネ型グルタミン酸生産菌に属し、β−ナ
フトキノリンに抵抗性を有し、かつＬ−リジン生産能を
有する微生物を培地に培養し、培養物中にＬ　ＩＪリジ
ン生成蓄積させ、該培養物からＬ−リジンを採取するこ
とを特徴とするＬ−リジンの製造法を提供する。

本明細書において、コリネ型グルタミン酸生産菌とは、
コリネバクテリウム属、ブレビバクテリウム属、ミクロ
バクテリウム属またはアースロバフタ−属に属する一群
のグルタミン酸生産菌をいう〔「発酵と工業」第４０巻
、　１０２．１９８２年参照〕。

本発明で用いる微生物は、コリネ型グルタミン酸生産菌
に属し、β−ナフトキノリンに抵抗性を有するＬ−リジ
ン生産菌株であればいかなる菌株をも用いることができ
る。すなわち、本発明ではコリネ型グルタミン酸生産菌
に属し、Ｌ−リジン生産能を有する菌株にβ−ナフトキ
ノリン抵抗性を付与させた菌株を用いてもよいし、コリ
ネ型グルタミン酸生産菌に属し、β−ナフトキノリン抵
抗性を有する菌株にＬ−Ｕジン生産能を付与させた菌株
を用いてもよい。

コリネ型グルタミン酸生産菌に属するＬ−リジン生産能
を有する菌株としては、各種の栄養（例えばホモセリン
、メチオニン、スレオニン、ヒスチジン、ブ（１リン、
アラニン、ロインン、イソＬ１イシン、バリン、セリン
、グルタミン酸、パントテン酸、ニコチン酸アミド、酢
酸、アデニン、ヒポキサンチン、イノシトールおよびこ
れらの組合せ）要求性、各種のアミノ酸アナログ（例え
ばリジン、スレオニン、メチオニン、ロイシン、インロ
イシン、バリン、アスパラギン酸、トリプトファンある
いはヒスチジンのアナログおよびこれらの組合せ）抵抗
性、その他薬剤（例えば各種抗生物質、サルファ剤、各
種有機酸、キノン化合物。

キノリン化合物およびこれらの組合せ）抵抗性の１つあ
るいはこれらの組合せの性質を有するＬ−リジン生産菌
株が挙げられる。

したがって、上記のようなし　ＩＪリジン産菌株に、さ
らにβ−ナフトキノリン抵抗性を付与することによって
本発明に使用する菌株を得ることもできるし、コリネ型
グルタミン酸生産菌に属し、β−ナフトキノリン抵抗性
を有する菌株に上記のような各種栄養要求性、各種アミ
ノ酸アナログ抵抗性、またはその他薬剤の抵抗性を付与
することによって得られるＬ−リジン生産菌株を本発明
で使用することもできる。また、本発明に用いる菌株は
上記のような性質の他にＬ−Ｕジン生産に寄与するいか
なる性質を備えていてもさしつかえない。

本発明の変異株を誘導する際に用いられる親株としては
、コリネ型グルタミン酸生産菌として知られている下記
微生物があげられる。例えば、コリネバクテリウム・グ
ルタミクムＡＴＣＣ１３０３２゜コリネバクテリウム・
グルタミクムＨ−３１４９（ＦＥＲＭ　　ＢＰ−１５８
）、コリネバクテリウム・アセトアシドフィラムＡＴＣ
Ｃ１３８７０゜ブレビバクテリウム・ラクトフェルメン
タムＡＴＣＣ１３８６９、ブレビバクテリウム・フラバ
ムＡＴＣＣ１４０６７などがある。

本発明における変異株の誘導は、紫外線照射やＮ−メチ
ル−Ｎ′−二トローＮ−二トロングアニジンなどによる
化学処理など、通常用いられる変異処理方法により行う
ことができる。

変異処理した菌株から本発明の変異株を分離するには、
親株が生育阻害を示す濃度のβ−ナフトキノリン（４０
ｕ／ｍ１以上）を含む最少培地寒天平板上に生育する変
異株を取得すればよい。

本発明に使用する微生物のうち、β−ナフトキノリン抵
抗性菌株の具体的−例として、コリネバクテリウム・グ
ルタミクムＨ−４４１２の取得例を以下に示す。

コリネバクテリウム・グルタミクムＨ−３１４９（ＦＥ
ＲＭ　　ＢＰ−１５８）（チアリジン抵抗性。

リファンピシン抵抗性、ストレプトマイシン抵抗性、６
−アヂウラシル抵抗性）を親株として用いる。この親株
を０．　Ｉ　Ｎ　）　！Ｊスス−レイン酸緩衝液（ｐＨ
６，０）中に１０”細胞／ｍｌの濃度に懸濁し、ここに
Ｎ−メチル−Ｎ′−二トローＮ−ニトロソグアニジンを
最終濃度０６２■／ｍｌになるように添加し、室温で３
０分間静置する。親株が生育阻害を示す濃度のβ−ナフ
トキノリン（例えば４０ｇ／ｍｌ　）を含む下記のよう
な組成を有する最少培地寒天平板上に塗抹し、生育する
コロニーの中から変異株を選択する。その１株がＨ−４
４１２であり、β−ナフトキノリン抵抗性を有する点で
第１表に示すように、親株のＨ−３１４９と明らかに区
別できる。

最少培地寒天平板培地組成ニ ゲルコース１０ｇ／ｌ、ＮＨ１Ｃｊ！　　Ｉｇ／ｊ！。

尿？、２ｇ／ｌ、ＫＨ２ＰＯ４１ｇ／１．ＫｔＨＰＯｓ
３ｇ／ｊ！、Ｍｇ５Ｏｎ・７Ｈ２００，４ｇ／ｌ。

Ｆｅ５０．・７Ｈｚ０　１０ｍｇ／ｌ、ＭｎＳ○、・４
　Ｈ２Ｏ４ｍｇ／　ｌ　、ビオチン５０ｐｘ／１．ニコ
チン酸５ｍｇ／ｊ！、ＺｎＳＯ４・７Ｈ＊Ｏ１ｍｇ／ｆ
。

Ｃｕ５Ｏ＊　・５Ｈ２０１ｍｇ／１．（ＮＨ＊）ｓＭＯ
ｔｏ２＜・４８２０１■／ｌ、寒天２％、ｐＨ７，０第
　　　　１　　　　表 Ｈ−３１４９＋＋　　＋　　− Ｈ４４１２＋＋　＋＋　　＋ ＋＋：充分な生育、＋：わずかに生育、−二生育せずＨ
−３１４９を変異誘導することによって得られたβ−ナ
フトキノリンに抵抗性を有するＨ−４４１２は、昭和６
１年５月２７日付で工業技術院微生物工業技術研究所（
微工研）にＦＥＲＭＢＰ−１０６９として寄託されてい
る。

本発明に使用する培地組成としては使用菌株の　　　　
　゛利用しろる炭素源、窒素源、無機物その他の必要な
栄養素を程良く含有するものであれば合成培地、天然培
地のいずれも使用できる。

すなわち炭素源としてはグルコース、フラクトース、ソ
ルビトール、グリセロール、蔗Ｉｌｌ、　ａｍ。

澱粉加水分解物、糖蜜、果汁などの各種炭水化物、酢酸
、フマール酸、乳酸、コハク酸などの有機酸、さらにエ
タノール、メタノールなどのアルコール類も使用できる
。

窒素源としては、アンモニア、塩化アンモニウム、硫酸
アンモニウム、酢酸アンモニウム、リン酸アンモニウム
などの各種無機酸のアンモニウム塩、尿素、アミン類、
その地合窒素化合物、ならびにペプトン、肉エキス、酵
母エキス、コーン・スチープ・リカー、カゼイン加水分
解物、大豆粕酸加水分解物、各種発酵菌体およびその消
化物などが使用できる。

さらに無機物としては、リン酸第−カリウム。

リン酸第二カリウム、リン酸マグネシウム、硫酸マグネ
シウム、塩化ナトリウム、硫酸第一鉄、硫酸マンガン、
炭酸カルシウムなどが使用できる。

本発明に使用する微生物が生育のために特定の栄養素を
必要とする場合には、その栄養素を適当量培地中に存在
させなければならないが、これらの物質は窒素源として
例示した天然物に含まれて添加される場合がある。また
培地中に各種の添加物、例えば各種抗生物質、α−アミ
ノ酪酸、システィン、ロイシン、ロイシン発酵液あるい
はアスパラギン酸、グルタミン酸などを添加することに
よりＬ−リジン生産量を増加させうる場合がある。

培養は振盪培養あるいは深部通気攪拌培養などの好気的
条件下で行う。培養温度は通常２０〜４０℃の範囲であ
る。培地のｐＨは３〜９の範囲で、好ましくは中性付近
に保持することが望ましいが、これ以外の条件下でも使
用菌株が生育すれば実施できる。培地のｐＨ調節は炭酸
カルシウム、尿素。

酸あるいはアルカリ溶液、ｐＨ緩衝剤などによって行う
。培養時間は通常１〜６日間で培養液中にＬ−リジンが
生成蓄積する。

培養終了後、培養液より菌体などの沈殿物を除去し、公
知のイオン交換処理法、濃縮法、吸着法、塩析法などを
併用することにより、培養液からし−リジンを回収する
ことができる。

以下、実施例をあげて本発明を具体的に示す。

実施例１゜ 種菌としてコリネバクテリウム・グルタミクムＨ−４４
１２（ＦＥＲＭ　　ＢＰ−１０６９）を使用した。

この菌株をグルコース４０ｇ／ｊ！、尿素３ｇ／ＣＫＨ
ａＰＯ４１，５ｇ＃！、ＫａＨＰＯａ　０．５ｇ／Ａ。

Ｍｇ５Ｏ＜・７Ｈｚ○　０．５ｇ／！、ビオチン５０■
／ｌ、ペプトン２０ｇ／ｌ、酵母エキス５ｇ／ｊ！から
なる種培地（ｐＨ７゜２）２０ｍｌを含む３０３ｍｌ容
三角フラスコに接種し、３０℃で２４時間培養した。こ
の培養液２＋１１１を廃糖蜜１００ｇ／ｊ！（グルコー
ス換算）、硫酸アンモニウム４０ｇ／β、　Ｋ　Ｈ２Ｐ
　０４０．５ｇ／ＣＭｇ　ＳＯ４０，５ｇ／ｊ！　、　
ＣａＣＯ５３０ｇ／１２からなる発酵培地（ｐＨ７，２
）　２０ｍｌを含む３、ＯＱ＋ｎｌ容三角フラスコに接
種し、３２℃で３日間振盪培養（２２Ｏｒｐｍ）を行っ
た。このとき培養液中にＬ−ＩＪリジン塩酸塩４７ｇ／
ｊ！蓄積した。

対照として、同一の条件で同時に培養した親株のＨ−３
１４９のＬＩＪジン塩酸塩の生成量は４３ｇ／ｌであっ
た。

発明の効果 本発明方法によれば、Ｌ−リジンを工業的に安価に供給
することができる。

手続補正書（自発） 昭和６２年　７月　ｌｓ″日 １、事件の表示 昭和６１年特許願第１５６７７５号 ２、発明の名称 Ｌ−リジンの製造法 ３、補正をする者 事件との関係　　特許出願人 郵便番号　１００ 住所　東京都千代田区大手町−丁目６番１号名称　（１
０２）協和醗酵工業株式会社明細書の発明の詳細な説明
の欄 ５、補正の内容 の次に「、特公昭５５−４４５９７Ｊを加入する。

（２）同書第１０頁２２行のｒＭｇｓＯｎＪをｒｉＪｇ
ｓＯ４・７ｔｌｚＯｊに訂正する。

（３）同書第１０頁最下行の「３日」を「４日」に訂正
する。

（４）同書第１１頁１〜５行の「このとき・・・・・・
・・・４３ｇ／βであった。」を次の文章に訂正する。

［培養終了後、Ｌ−１ジンの生成量を酸性銅ニンヒドリ
ン反応を用いる比色法によって測定した。その結果、培
養液中のｌ、　　ＩＪリジン成量は塩酸塩として５２ｇ
／Ｉｌであった。対照として、同一の条件で同様にして
培養した親株Ｈ−３１４９のＬ−ＩＪリジン成量は、塩
酸塩として４４ｇ／ｊ！であった。

Ｈ−４４１２株を用いて得た培養液１１を遠心分離し、
得られた上清液を硫酸でｐＨ１，５に調整した後、強酸
性イオン交換樹脂ダイヤイオン５Ｋ−ＩＢ（Ｈ“型）（
三菱化成工業社製）のカラムに通し、Ｌ−リジンを吸着
させ、カラムを水洗後、２規定のアンモニア水で溶出し
て、Ｌ−リジン画分を集めた。集めた両分を濃縮し、得
られたａ槽液を塩酸でｐＨ２，０に調整した後、エタノ
ールを添加しながら冷却することによりＬ−リジン塩酸
塩を晶出させ、結晶４１ｇを得た。」

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. コリネ型グルタミン酸生産菌に属し、β−ナフトキノリ
   ンに抵抗性を有し、かつＬ−リジン生産能を有する微生
   物を培地に培養し、培養物中にＬ−リジンを生成蓄積さ
   せ、該培養物からＬ−リジンを採取することを特徴とす
   るＬ−リジンの製造法。