HU206989B

HU206989B - Process for producing vaccines comprising tocols as adjuvant

Info

Publication number: HU206989B
Application number: HU90653A
Authority: HU
Inventors: Lammert Cornelius; Eric Onno Rijke
Original assignee: Akzo Nv
Priority date: 1989-02-04
Filing date: 1990-02-02
Publication date: 1993-03-01
Also published as: EP0382271A1; KR900012630A; HU900653D0; CA2008856A1; US5650155A; AU633043B2; KR0162646B1; NZ232354A; JPH02250835A; DE69015222D1; US5667784A; CN1044594A; CN1056085C; GR3015438T3; ATE115862T1; JP2892739B2; EP0382271B1; ES2068989T3; DE69015222T2; ZA90512B

Description

A találmány tárgya eljárás adjuválószerként tokotokat tartalmazó vakcinák előállítására.

Az átvihető fertőző betegségek elleni védekezés szokásos módja a humán- és állatgyógyászatban olyan immunogén anyaggal végzett vakcinálás, amellyel szemben védő antitestek képződnek.

így e célból például magát a patogént viszik be az élő szervezetbe, előnyösen nem-fertőző formában, vagy az elölt patogént vagy pedig a patogén fertőző komponenst nem tartalmazó antigén frakcióját adják be.

Ez utóbbi két esetben az antigénnel egy vagy több olyan komponenst is be kell vinni a védendő szervezetbe, amely a szervezet immunválaszát fokozza. Az ilyen immunválaszt stimuláló komponenseket általában adjuválószereknek nevezzük. A Freund-féle komplett adjuválószer ásványi olajnak és az elölt mikobaktériumoknak víz az olajban (v/o) típusú emulziója és mint ilyen az egyik leghatásosabb adjuválószemek tekinthető. További ismert adjuválószerek az ásványi olaj emulziók, így például a Freund-féle inkomplett adjuválószer, a növényi olaj emulziók, így például földimogyoró olaj, kukorica olaj, gyapotmag olaj és napraforgó olaj, valamint a félszintetikus olajok, így például Miglyol 812N és Myritol olaj.

E fenti olajok, különösen az ásványi olaj alapú víz az olajban típusú emulziók azonban az adagolási helynél súlyos szöveti imitációt, gyulladásos duzzanatot és ciszták keletkezését okozzák. Emiatt az ilyen típusú emulziók humán- és állatgyógyászatban való rutinszerű alkalmazása kevésbé vonzó, sőt bizonyos esetekben tilos is. Ezen túlmenően a víz az olajban emulzió alapú vakcinák viszonylag viszkózusak és ez a vakcina injekció formában történő alkalmazását megnehezíti. Az olajtartalom csökkentése a viszkozitást olyan mértékben fokozza, hogy a vakcina injekcióban már nem is alkalmazható. Másrészről ez az emulzió stabilitását is befolyásolja.

Az α-tokoferil-acetátnak víz az olajban típusú emulzióként! alkalmazását kosok Brucella ovis-szal való fertőződése ellen védő vakcinában Afzal és munkatársai írják le [Veterinary Immunology and Immunpathology 7, 293-304 (1984)]. Ez a vakcina azonban mintegy 50% dl-a-tokoferil-acetátot tartalmaz, aminek következtében a vakcina viszkózus és így kezelése is nehézkes.

A találmány szerinti vakcinák adjuválószerként tokotoknak vízben való stabil emulzióját tartalmazzák.

Meglepő módon úgy találtuk, hogy az ilyen típusú tokol-származékok olaj a vízben emulziója előnyösen kis viszkozitással rendelkezik és így könnyen kezelhető, továbbá amelynek adjuváns hatása legalább olyan jó, mint a megfelelő tokol-származékot tartalmazó víz az olajban emulzióé. Ez annak a ténynek az ismeretében meglepő, miszerint az olaj a vízben emulziók kevésbé jó adjuválószerek, mint a víz az olajban típusú emulziók [Herbert, W. J., The mode of action of mineral-oil emulsion adjuvants on antibody production in mice, Immunology 14 (1968), 301-318 and Herbert, W. J., Mineral-oil adjuvants and the immunization of laboratory animals, in: Handbook of experimental immunology Vol. 3, ed. by D. M. Weir, 3. kiadás, Blackwell (1979)].

A találmány szerinti vakcina jó adjuváns tulajdonságokkal rendelkező stabil olaj a vízben emulziót tartalmaz, így a beadás után hátrányos helyi hatása nincs és könnyen injektálható.

A találmány szerinti adjuválószerként alkalmazható tokolok az (I) általános képletű tokol-származékok és maga a (II) képletű tokol.

Az (I) általános képletben

- R jelentése hidrogénatom, egy vagy több, adott esetben azonos 1-4 szénatomos alkil-, alkoxi-, 2-4 szénatomos acil-οχί-, hidroxil-, szulfát- vagy foszfátcsoport;

- Rj és R₃ jelentése egymástól függetlenül hidrogénatom vagy 1-4 szénatomos alkilcsoport;

- R₂ jelentése hidrogénatom vagy adott esetben minden egységben különböző 1-4 szénatomos alkilcsoport;

- a szaggatott vonal egy egységben adott esetben egy további szén-szén kötést jelent; és

- n jelentése 1-től 5-ig terjedő szám.

R, R_b R₂ és R₃ alkilcsoportként különösen 1-4 szénatomos egyenes vagy elágazó alkilcsoportot, így például metil-, etil-, butil- vagy izobutil-csoportot jelent.

A találmány szerinti tokol-származékok például az alábbiak: 5-metil-tokol, 7-metil-tokol, 8-metil-tokol, 5,7-dimetil-tokol, 5,8-dimetil-tokol, 7,8-dimetil-tokol, 5,7,8-trimetil-tokol, 8-metil-tokotrienol, 7,8-dimetiltokotrienol, 5,8-dimetil-tokotrienol, 5,7,8-trimetil-tokotrienol, 5,7-dietil-tokol, 5,7-dimetil-8-etil-tokol, 5,7dietil-8-metil-tokol, észterek, így például formiátok, acetátok, szukcinátok és nikotinátok, szulfátok és foszfátok, valamint éterek, így például e vegyületek metilés etil-éterei, továbbá a 6-dezoxi-tokoi. Előnyös találmány szerinti tokol-származékok a (ΙΠ) általános képletű vegyületek, ahol a képletben

- R₄ jelentése hidrogénatom, 2-4 szénatomos acilcsoport, amely előnyösen valamilyen 1-4 szénatomos alifás vagy aromás karbonsavból származtatható csoport vagy egy szulfát- vagy egy foszfátcsoport, és

-R₅ jelentése hidrogénatom vagy egy-három azonos vagy különböző 1-4 szénatomos alkilcsoport. Közelebbről a találmány szerinti vakcinákban előnyösen tokolt és (III) általános képletű észtereit, továbbá 5,7,8-trimetil-tokolt (E-vitamint) és (III) általános képletű észtereit használhatjuk.

Különösen előnyösen 5,7,8-trimetil-tokol-acetátot (α-tokoferol-acetátot) használunk. A gyakorlati alkalmazás során rendszerint racemátot, azaz dl-a-tokoferol-acetátot használunk, de optikailag aktív vegyületet is alkalmazhatunk.

A találmány szerinti vakcinákban a tokol-vegyületeket előnyösen mintegy 0,1 és 40 t% közötti, különösen előnyösen mintegy 2,5 és 10,0 t% közötti koncentrációban alkalmazzuk.

Adott esetben a vakcinában két vagy több adjuváns

HU 206 989 B hatású különböző tokolt keverék formában is alkalmazhatunk.

Kívánt esetben alkalmazott további komponensek például az avridin, karbomerek, nemionos, blokk-polimerek és muramil-dipeptidek.

A találmány szerinti stabil emulzióban emulgeálószerként a jelen célra egyébként szokásosan alkalmazott emulgeálószereket használtatjuk, így például nemionos felületaktív anyagokat - így polioxielilén-szorbitán-monooleátot, polioxielilén-monolaurátot, polioxietilén-zsírsavészteket, például polioxietilén-sztearátot, polioxialkil-étereket, például polioxietilén-cetilétert, polioxietilén-ricinusolaj származékokat, polivinil-pirrolidont, polivinil-alkoholt, kaiboximetil-cellulózt, lecitint és zselatint - anionos felületaktív anyagokat- így alkil-szulfát észterek sóit, például nátrium-lauril-szulfátot -, kationos felületaktív anyagokat, valamint amfoter felületaktív anyagokat. Az emulgeálószert előnyösen 0,1 és 20 t% közötti, különösen előnyösen 2,5 és 7,5 t% közötti mennyiségben használjuk.

A vakcinákat a tokol-vegyületek vizes oldószert tartalmazó immunogén anyagokkal történő emulgeálásával állíthatjuk elő. Egy másik módszer szerint a vakcinákat olyan módon állíthatjuk elő, hogy a tokol-vegyíileteket vizes oldószerrel emulgeáljuk, majd a kapott emulziót az immunogén anyaggal összekeverjük. Továbbá eljárhatunk úgy is, hogy a tokol-vegyiileteket kiindulási anyagként használjuk és az előzetesen vizes oldószerrel emulgeált immunogén anyagot hozzáadjuk.

A vakcinát előnyösen úgy állítjuk elő, hogy a tokolvegyiileteket valamilyen emulgeálószerrel összekeverjük, majd a keveréket vízzel emulgeáljuk. Az így kapott emulzióhoz az immunogén anyagot hozzáadjuk, amikor is a kívánt stabil emulzió képződik. A vakcina fizikai stabilitása szempontjából fontos, hogy a tokolszármazék diszpergált részecskéi meghatározott méretűek legyenek. Úgy találtuk, hogy a fizikai stabilitás szempontjából az a legelőnyösebb, ha a diszpergált részecskék előnyösen kisebbek, mint 20 μιη és különösen előnyösen kisebbek, mint 1 μιη .

A találmány szerinti vakcinákat immunizáló anyagként élő és nem élő anyagok esetén alkalmazhatjuk. A nem élő antigén anyagok elölt patogének vagy ezek immunogén frakciói (részegységei) lehetnek. A találmány szerinti vakcinák nem patogén anyagokkal szembeni immunválasz kiváltására is alkalmasak, így például diagnosztikai próbák végzésekor antiszérumok termelésére és immunológiai sterilizációra vagy kasztrációra.

A patogének például a következők lehelnek: vírusok, baktériumok vagy paraziták. Ezeket kémiai vagy fizikai módszerekkel ölhetjük el. E tekintetben az „elölés” kifejezés inaktiválást jelent, amelynek következtében például a genetikus és/vagy más vitái komponensekben olyan változások jönnek létre, hogy a patogén tovább már reprodukcióra nem lesz képes. A patogének elölésére alkalmas kémiai ágensek például az alábbiak: formaldehid, gluláraldehid, β-propiolaklon, etilénimin és származékai vagy olyan más vegyiiletek, amelyek a patogén reaktív csoportjaival bi- vagy multifunkcionálisán reagálni képesek. A patogének elölésére alkalmas fizikai ágensek például az alábbiak: UV-, y-besugárzás, „hősokk” és röntgen-besugárzás.

A fenti patogén vagy nem-patogén anyagok antigén frakcióit kémiai vagy fizikai módszerekkel állíthatjuk elő, és kívánt esetben ezt követően a frakciót kromatográfiával, centrifugálással és/vagy más hasonló módszerekkel elkülöníthetjük. Az ily módon kapott komponensek bár kívánt esetben igen nagy tisztaságúak, mégis immunogenitásuk gyakran gyenge minőségű. Kívánt esetben a patogén vagy nem-patogén anyagok komponenseit valamilyen vivőanyaghoz (például kürtöscsiga hemocianinlioz vagy liposzőmákhoz) vagy más micelláris komplexekhez köthetjük az immunogenitás fokozása céljából. A fentiekben használt kifejezés „patogén és nem-patogén anyagok immunogén frakciói” körébe a patogén vagy nem-patogén anyagok természetes antigénjeit utánzó szintetikus antigéneket vagy hapténeket is beleérjük. Az ilyen típusú szintetikus antigéneket vagy hapténeket szerves szintetikus módszerekkel ismert módon állíthatjuk elő, illetve polipeptidek esetében például rekombináns DNS módszereket alkalmazhatunk.

A találmány szerinti vakcinákban az antigén koncentrációja általában 1-85 t%. Az ilyen vakcinákon kívül (amelyek csak patogénből származó immunogén anyagot tartalmaznak, vagyis az úgynevezett monovalens vakcinák) azok a vakcinák is a találmány oltalmi körébe tartoznak, amelyek különböző patogénekből szánnaző immunogén anyagot tartalmaznak, vagyis az úgynevezett kombinációs vakcinák. Ilyen kombinációs vakcinák például különböző vírusokból, egy vírusnak különböző törzseiből vagy valamilyen vírus/baktérium kombinációból vagy különböző baktériumokból származó anyagot tartalmaznak. Ezek a kombinációs vakcinák továbbá parazita eredetű anyagot is tartalmazhatnak,

A találmányt az alábbi példákkal világítjuk meg közelebbről, az oltalmi kör korlátozása nélkül.

1. példa

Gumboro-betegség elleni vakcina előállítása

1,5 g E-vitamin-acetátot és 5,0 g Poliszorbát 80-at folyamatos keveréssel összekeverünk, majd a keverék össztömegét desztillált vízzel 50 g-ra egészítjük ki. Az így kapott keveréket 50 g inaktivált immunogén anyagot tartalmazó vizes oldattal összekeverjük, és így a kapott vakcina 18,2% (tömeg/térfogategység) Gumboro-vírus antigént tartalmaz.

2. példa

Tíz darab négyhetes SPF csirkét három csoportban intramuszkulárisan 0,5 ml inaktivált Gumboro-vírust tartalmazó (10⁷·³ TCID_S0/ml), az 1. példa szerinti módon előállított vakcinával kezelünk. Az oltás után 4, 8, 12, 16 és 20 hét múlva vérmintákat veszünk és a szérumban EL1SA módszerrel az antitest szintet meghatározzuk [inkubáció vírussal bevont mikrotiter lemez + csirkeszérum rendszerrel; inkubáció az anti-(csirkeIg antitestj-enzim konjugálumával].

HU 206 989 B

Vakcina	Antitestválasz a vakcinálást kővető időszakban (hetekben kifejezve)
	4	8	12	16	20
Sóoldat	7,2+2,2³	7,1+2,2	6,8+1,6	7,3+1,7	7,6+1,4
E-vitamin-acetát^b	12,6+2,1	11,5+1,3	9,3+1,5	9,4+1,3	9,0+1,3
Ásványi olaj^c	10,0+1,3	11,9+1,4	11,5+0,9	11,4+0,7	10,9+1,1

a) átlagos ELISA titer Fog) + standard deviáció

b) 7,5 t% o/v emulzió 10

c) Freund-féle inkomplett v/o emulzió.

3. példa

Tíz darab öthetes egeret két csoportban 0,1 ml inaktviált Aujeszky vírust tartalmazó, az 1. példa sze- 15 rintihez hasonlóan előállított vakcinával intramuszkulárisan kezelünk (10⁸ TCID₅₀/mI). A kezelés után 4, 8 és 12 hét múlva vérmintákat veszünk, és a szérumban ELISA módszerrel az antitest szintet meghatározzuk [inkubáció vírussal bevont mikrotiter lemez + egérszé- 20 rum rendszerrel; inkubáció az anti-(egér-Ig antitest)enzim konjugátumával].

tartalmazó, az 1. példához hasonlóan előállított vakcinával kezelünk. A kezelés után 4, 8, 12 és 16 hét múlva vérmintákat veszünk és a szérumban ELISA módszerrel az antitest szintet meghatározzuk [inkubáció E-coliFll-pilus fehérjével bevont mikrotiter lemez + csirkeszérum rendszerrel; inkubáció az anti-(csirke-Ig antitest)-enzim konjugátumával].

Vakcina	Antitestválasz a vakcinálást követő időszakban (hetekben kifejezve)
	4	8	12
Sóoldat	ll,7+l,2^a	11,2+1,3	11,3+1,6
E-vitamin-acetát^b	13,2+1,2	13,1+1,8	13,1+1,5

Vakcina	Antitestválasz a vakcinálást követő időszakban (hetekben kifejezve)
	4	8	12	16
Sóoldat	5,9+1,4³	8,3+2,4	8,6+2,2	7,2+0,8
E-vitamin- acetát^b	10,5+0,8	14,5+0,8	13,3+0,9	12,0+1,6
Ásványi olaj³	9,9+2,8	13,5+2,3	13,5+1,8	12,3+1,3

a) átlagos ELISA titer (Fog) + standard deviáció

b) 7,5 t% o/v emulzió

4. példa

Tíz darab négyhetes SPF csirkét intramuszkulárisan 35 0,5 ml tisztított E. coli-Fll-pilus fehérjét (20 ng/dőzis) π

a) átlagos ELISA titer ( lóg) + standard deviáció

b) 7,5 t% o/v emulzió

c) Freund-féle inkomplett v/o emulzió.

5. példa

A 4. példa szerint csirkéket ricinusolaj alapú E-vitamin-acetátot tartalmazó víz az olajban emulzióval vakcinálunk. A kapott eredmény a 4. példában az E-vitamin-acetát olaj a vízben emulziójával kapott eredménnyel hasonlítjuk össze.

Vakcina	Antitestválasz a vakcinálást követő időszakban (hetekben kifejezve)
	4	8	12	16	20
v/o-eraulzió^b	9,8+1,1³	11,8+1,5	12,0+1,6	10,6+1,2	9,0+1,1
o-v-emulzió^c	10,5+0,8	14,5+0,8	13,3+0,9	12,0+1,6	10,0+1,1

a) átlagos ELISA titer (²log) + standard deviáció

b) 7,5% E-vitamin-acetát + ricinusolaj (50%)

c) 7,5% E-vitamin-acetát.

6. példa

E példában tokollal és származékaival képzett stabil olaj a vízben emulziók adjuváns hatását demonstráljuk. Az adott vegyület adjuváns hatékonyságát, antigénként tisztított E. coli-Fll-pilus fehérjét alkalmazva, az alábbi táblázatban összefoglalt eredményekkel jellemezzük. A kísérleteket mindenben a 4. példában ismertetettek szerint végezzük.

Vakcina	Antitestválasz a vakcinálást követő időszakban (hetekben kifejezve)
	4	8	12
Sóoldat	7,7+1,6³	9,0+1,9	9,0+1,6
E-vitamin-acetát^b	12,1+0,7	12,4+0,7	11,8+0,9
E-vitamin-nikotinát^b	10,2+1,5	11,9+1,1	11,6+1,0
Tokol^b	12,0+1,7	11,9+0,6	11,4+0,8
Kontroll	5,4+0,6	5,9+1,1	6,6+1,0

a) átlagos ELISA titer (²log) + standard deviáció 50 b) 7,5 t% o/v emulzió

HU 206 989 B

7. példa

Öt négy- hathetes, Aujeszky-betegség (pszeudorabies) szempontjából szeronegatív malacokból képzett csoportokat elkülönítve tartunk, és a fenti betegség elleni élő vakcinával (PRV 783 törzs, beszerezhető Intervet Int.-től, Boxmeer, Hollandia) egy alkalommal kezelünk. A vakcinában az élő komponens titere 10⁶TCID₅o dózisonként. Valamennyi kezelést 2 ml dózissal a fül mögött intramuszkulárisan végeztük.

Az élő fagyasztva-szárított vakcinák esetében az alábbi oldószereket használjuk:

- vizes hígítószer (Diluvac, kereskedelemben beszerezhető az Intervel-től: dil)

- ásványi olaj o/v emulzió (kereskedelemben beszerezhető a Duphar-tól: o/v)

- E-vitamin-acetát o/v emulzió (7,5 t% E-vitaminon-acetát): GFA.

Az 1. ábrán bemutatott, időközökben veszünk vérmintákat. Az elkészített széárum-mintákat a vírusokat semlegesítő antitestek jelentése ELISA módszerrel vizsgáljuk. A vakcinálás után 16 héttel a fenti betegséget okozó vírus 75V19 virulens törzsével (beszerezhető Μ. B. Peusaerttől, Genli Egyetem, Viológia Tanszék, Belgium) 10⁷ TC1D_5O dózisban íntranazálisan végzünk kezelést. A víruskiválasztást és a súlygyarapodást folyamatosan meghatározzuk.

Eredmények

Vírust semlegesítő antitestek

Az 1. ábra a fenti három vakcinával végzett vakcinálás eredményeként vírust semlegesítő (VN) antitestek jelenlétét mutálja be. A virulens törzzsel végzett provokáció időpontjában a vakcinálás következtében létrejött VN szint az E-vitamin-acetát o/v emulzió esetében magasabb, mint az ásványi olaj o/v vakcina vagy mint a vizes hígítószert tartalmazó vakcina esetében.

Vírus kiválasztás

A virulens törzzsel végzett fertőzés után naponta nazális keneteket veszünk mindaddig, amíg az adott csoport valamennyi egyede esetében két egymást követő nap eredménye negatívnak bizonyul. A vírusszintet a 2. ábrán mutatjuk be, az adatokat 1 ml nazális váladékra vonatkoztatottan TCID_S0 értékekben adjuk meg. Az E-vitaminacetát o/v adjuvánst tartalmazó élő PRV vakcina esetében csökkent, vírusszintet kapunk, amely az ilyen típusú adjuvánsszer élő vakcináknál való alkalmazásának további pozitív hatását szemlélteti.

Testtömeggyarapodás

A virulens törzzsel végzett fertőzést megelőzően szabályos időközökben, majd ezután naponta mérjük a testtömeget. Az adatokat a 3. ábrán mutatjuk be. A fertőzést követő 7 napon át a „European Pharmacopeia” című kiadványban (Draft European Pharmacopoeia, 1988. nov.; Fagyasztva szárított Aujeszky-betegség elleni élő vakcina sertések esetében) ismertetett módszer szerint az átlagos napi tömeggyarapodást (veszteséget) meghatározzuk. Az eredményeket százalékban kifejezve az alábbi táblázatban foglaljuk össze.

Kísértei	Vakcina	Mcgjcgy- zcs	Az egy napra vonatkoztatott átlagos testtömeg-növekedés (a 0. cs a fertőzés utáni 7. nap között) %-ban
1	783	GFA	1,55
2	783	o/v	1,39
3	783	Diluvac	0,78
4	Kontroll	-	0,00	(-1,45)

Mindegyik csoport esetében a kontrollcsoporthoz viszonyított különbséget adjuk meg. A kontrollcsoport egyedeinél a 7 nap folyamán napi 1,45% testtömegcsökkenés következik be (ezt zárójelben tüntettük fel).

A 3. ábrából és a fenti táblázat adataiból következik, hogy az élő vakcina esetében az E-vitamin o/v típusú adjuválószer hatásosabb az ásványi olaj o/v típusú vakcinánál és ez utóbbi a vizes hígítószert tartalmazó vakcinánál.

Claims

SZABADALMI IGÉNYPONTOK

1. Eljárás adjuválószerként vízben diszpergált (I) általános képletű tokolok - ahol a képletben

- R jelentése hidrogénatom, egy vagy több, adott esetben azonos 1-4 szénatomos alkil-, alkoxi-, 2-4 szénatomos acil-οχί-, hidroxil-, szulfát- vagy foszfátcsoport;

- R, és R³jelentése egymástól függetlenül hidrogénatom vagy 1-4 szénatomos alkilcsoport;

-R₂ jelentése hidrogénatom vagy adott esetben mindenegységben különböző 1-4 szénatomos alkilcsoport;

- a szaggatott vonal egy egységben adott esetben egy további szén-szén kötést jelent; és

- n jelentése 1-től 5-ig terjedő szám stabil emulzióját tartalmazó vakcinák előállítására, azzal. jellemezve, hogy

a) (1) általános képletű tokol-vegyületeket vizes oldószert tartalmazó immunogén anyaggal emulgeálunk; vagy

b) (1) általános képletű tokol-vegyületeket vizes oldószerrel emulgeálunk, és a kapott emulziót az immunogén anyaggal összekeverjük; vagy

c) (1) általános képletű tokol-vegyületeket az immunogén anyaggal összekeverünk, és a keveréket vizes oldószenei emulgeáljuk;

és kívánt esetben egy vagy több további adjuvánst is hozzákeverünk.
2. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azz.al jellemezve, hogy tokol-vegyületként (III) általános képletű tokolokat alkalmazunk, ahol a képletben

- R_, jelentése hidrogénatom, 2-4 szénatomos aeilcsoport, egy szulfát- vagy egy foszfátcsoport;

- R₅ jelentése hidrogénatom, vagy egy-három azonos vagy különböző 1-4 szénatomos alkilcsoport.
3. A 2. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve,

HU 206 989 B hogy tokol-vegyülctként 5,7,8-trimetíl-tokol-acctátot alkalmazunk.
4. Az 1-3. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a tokol-vegyületckct 0,1 és 40 t% közötti mennyiségben alkalmazzuk.
5. A 4. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a tokol-vcgyülelekct 2,5 és 10 t% közötti menynyisegben alkalmazzuk.
6. Az 1-5. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a tokol-vegyiileteket 20 pm-nél, 5 előnyösen 1 μιτι-nél kisebb részecskékkel emulgeáljuk.