HU193744B - Microbiological process for preparing l-carnitine - Google Patents
Microbiological process for preparing l-carnitine Download PDFInfo
- Publication number
- HU193744B HU193744B HU851012A HU101285A HU193744B HU 193744 B HU193744 B HU 193744B HU 851012 A HU851012 A HU 851012A HU 101285 A HU101285 A HU 101285A HU 193744 B HU193744 B HU 193744B
- Authority
- HU
- Hungary
- Prior art keywords
- betaine
- carnitine
- gamma
- butyrobetaine
- crotono
- Prior art date
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P13/00—Preparation of nitrogen-containing organic compounds
- C12P13/007—Carnitine; Butyrobetaine; Crotonobetaine
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
- C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
- C12N1/205—Bacterial isolates
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
- C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
- C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
- Y10S435/8215—Microorganisms
- Y10S435/822—Microorganisms using bacteria or actinomycetales
- Y10S435/824—Achromobacter
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Microbiology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Virology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Organic Low-Molecular-Weight Compounds And Preparation Thereof (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Prostheses (AREA)
- Eye Examination Apparatus (AREA)
- Diaphragms For Electromechanical Transducers (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Catalysts (AREA)
- Acyclic And Carbocyclic Compounds In Medicinal Compositions (AREA)
- Immobilizing And Processing Of Enzymes And Microorganisms (AREA)
- Agricultural Chemicals And Associated Chemicals (AREA)
- Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)
Description
A találmány tárgya mikrobiológiai eljárás L-karnitin előállítására.
Ismert az L-karnitín gamma-butiro-betainból való előállítása, amelynek során a gamma-butiro-betaint nátrium-2-oxo-glu tarát, redukáló anyagok, vasion-forrás és hidroxilcsoport-forrásként szolgáló oxigén jelenlétében a Neurospora crassa mikroorganizmusból felszabadított hidroxiláz enzimmel kezelik (4 371 618 sz. amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírás). Az eljárás hátránya, hogy számos járulékos tényezőt (kofaktor) igényel: így a reakció során stöchiometrikus mennyiségű 2-oxo-glutarát oxidáció útján szukcináttá dekarboxileződik, az oxigén aktiválásához kétvegyértékű vasionok kellenek, továbbá aszkorbát, hogy a vasionok redukált állapotban maradjanak, és végül kataláz a nyomokban keletkező káros hidrogén-peroxid lebontására.
Lindstedt et al. (Biochemistry 6, 1262-1270 (1967) „The Formation and Degradation of Carnitin in Pseudomonas”) Pseudomonas nembeli mikroorganizmust izoláltak, amely C- és N-forrásként gamma-butiro-betaint képes hasznosítani. A lebontás első lépcsőjében a gamma-butiro-betain L-karnitinná hidroxileződik, de az intermedierként keletkező L-karnitin a metabolizálás során teljesen lebomlik szén-dioxid, víz és ammónia végtermékre.
Az ebből a mikroorganizmusból nyert hidroxiláz—ha az L-karnitin előállításához hasznosítanák—járulékos tényezők szempontjából a fenti hátrányokkal járna (Lindstedt et al., Biochemistry 16, 2181-2188 (1977), „Purification and Properties of y-Butyrobetaine Hydroxylase from Pseudomonas sp. AK 1”).
A találmány célja olyan új típusú mikroorganizmus biztosítása volt, amellyel az ismert eljárások hátrányai kiküszöbölhetők és egyszerű módon nem a racém karnitin, hanem enantio-szelektív módon L-karnitin állítható elő krotono-betaninból, butiro-betainból vagy a kettő keverékéből.
A technika állásából ismert rendszerekkel ellentétben a találmány szerint alkalmazott mikroorganizmusok nem oxigént, hanem vizet alkalmaznak hidroxilcsoport-forrásként, ahogy H2 I8O és ,SO2 jelzett vegyszerekkel végzett saját kísérletek mutatták.
A találmány szerint alkalmazott mikroorganizmusok krotono-betainból és/vagy gamma-butiro-betainból L-karnitint termelnek, de az utóbbit nem katabolizálják.
Ahogy négy kontinensen szedett talajminták összehasonlító vizsgálata kimutatta, a butiro-betaint és krotono-betaint L-karnitinen keresztül katabolizáló mikroorganizmusok mindenütt jelen vannak; szennyvíztisztító berendezések feles eleveniszapjából is sikerül az elkülönítés. Ezek a törzsek potenciálisan mind alkalmasak az L-karnitin termelésére, ha a találmány szerinti elv alapján mutagenizáljuk őket. Alkalmas mutánsokat úgy állíthatunk elő, hogy
a) C- és N-forrásként betaint, gamma-butiro-betaint, krotono-betaint és L-karnitint hasznosítani képes mikroorganizmusokat a szokásos módon mutagenizáljuk, és
b) a tenyésztés során kapott mutált kúltúrából azokat a mikroorganizmusokat izoláljuk, amelyek stabilisak, L-karnitint nem katabolizálják, L-karnitint, krotono-betaint és gamma-butiro-betaint nem képesek hasznosítani, betaint azonban igen.
A b) szelekciós lépést követően előnyösen azokat a mikroorganizmusokat választjuk ki, amelyek az L-karnitint kiválasztják, és L-karnitint, krotono-betaint, gamma-butiro-betaint nem képesek hasznosítani, betaint azonban igen.
A mutált mikroorganizmusokat célszerűen betain-tartalmú közegen kultiváljuk tovább, majd a b) lépés végrehajtására előnyösen L-kamitin-tartalmú közegen tenyésztjük tovább. A betaint, gamma-butiro-betaint, krotono-betaint és L-karnitint C- és N-forrásként hasznosítani képes törzseket célszerűen úgy tenyésztjük, hogy baktérium keverékeket krotono-betaint tartalmazó tápoldattal oltva keverék kultúrát hozunk létre és a keverék kultúrából hagyományos mikrobiológiai módszerek segítségével krotono-betaint lebontani képes mikroorganizmusok tiszta tenyészetét nyerjük.
A betaint, gamma-butiro-betaint, krotono-betaint és L-karnitint C- és N-forrásként hasznosítani képes tenyészet mutációját ismert módszerekkel érhetjük el (J.H. Miller, Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory, 1972). Stabil mutánsok előállítására alkalmas a Frame-Shift-módszer, a deletálás módszere, valamint a transzpozon-inzertálás módszere. A mutált mikroorganizmusokat—betain-tartalmú közegben végzett tenyésztés, majd L'-karnitint tartalmazó közegre történő átoltás után—a b) szelekciós lépésnek vetjük alá, amelyben ismert „counter-szelektáló ágensek segítségével (P. Gerhardt et al. (eds.), Manual of Methods of General Bacteriology, Am. Soc. fór Microbiology, 1981) az L-karnitint nem katabolizáló, L-karnitint, krotono-betaint és gamma-butiro-betaint nem hasznosító, de betaint hasznosító mikroorganizmusokat szelektáljuk.
A betaint, gamma-butiro-betaint, krotono-betaint és L-karnitint C- és N-forrásként hasznosító mikroorganizmusok közül a 2938 szám alatt a Német Mikroorganizmus-Gyűjteményben (Deutsche Sammlung von Mikroorganismen (DSM), Gesellschaft für Biotechnologische Forschung mbH, 4300 Göttingen, Griesebachstr. 8., NSZK) 1984. március 3-án letétbe helyezett, HK 4 jelű törzset, valamint deszcendenseit és mutánsait részesítjük előnyben. (A mikroorganizmus tudományos leírása lásd I. táblázat.)
A HK 4 jelű mikroorganizmusból mutáció és szelektálás révén előállítottuk a HK 13
-2193744 jelű mikroorganizmust, amely stabil, L-karnitint nem katabolizál, L-karnitint, krotono-betaint és gamma-butiro-betaint nem hasznosít, betaint azonban igen. A HK 13 jelű törzset 1984.01.23-án helyeztük letétbe DSM 2903 szám alatt a fent említett törzsgyűjteményben. (A mikroorganizmus tudományos leírása lásd I. táblázat.)
A HK 13 törzs egyik származéka a HK 1331 b jelű törzs, amely stabil, L-karnitint nem katabolizál, L-karnitint, krotono-betaint és gamma-butiro-betaint külön-külön nem hasznosít, betaint, L-glutamátot és krotono-betaint együtt, L-glutamátot és gamma-butiro-betaint együtt, valamint L-glutamátot és L-karnitint együtt azonban igen. Ezt a törzset
I.
A három törzs tudomány
I985.02.08-án helyeztük letétbe DSM 3225 szám alatt a fent említett törzsgyűjteményben. A törzset spontán, jól növekedő mutáns-telepként különítettük el agarral megszilár5 dított, L-glutamátot és gamma-butiro-betaint tartalmazó táptalaj felületéről.
A három törzs tudományos leírását tartalmazó táblázatban az alábbi rövidítéseket használjuk:
Mac-Conkey agar, SS-agar lásd: DIFCO MANUAL, 9. Edition, 131., 132., 134-138. oldal OF-teszt: a savképződést egyszer oxigénnel oxidálva, majd párhuzamos fermentációs úton, oxigén nélkül határoz15 zuk meg
ONPG: o-nitrofenil-p-D-galaktopiranozid táblázat s leírása
paraméter | HK 4 | HK 13 | HK 1331 |
sej tforma | pálcika | pálcika | pálcika |
hossza m | részben pleomorf 1-2 | rés zben pleomorf 1 -2 | re'szben pleomorf 1-2 |
szelessége m | 0,5-0,8 | 0,5-0,8 | 0,5-0,8 |
mozgékonyság | + | + | + |
ostorok | peritrich | per itrich | peritrich |
Gram-reakció | - | - | - |
spórák | - | - | - |
poli-B-hidroxi-buti- | |||
rát képződésé | - | -· | - |
oxidaz f | + | + | + |
katala'z növekedés | + | + | + |
anaerob | - | - | - |
37°C | + | + | + |
41°C | - | - | - |
pH 5,6 | - | - | - |
Mac-Conkey agar | + | + | + |
SS-agar | - | - | - |
cetrimid agar | - | - | - |
pigment-kepzodes | |||
diffundáló | - | - | - |
nem diffundáló | - | - | - |
fluoreszkáló | - | - | - |
savkepzode's (OF-teszt) | |||
glükózbo'l aerob | - | - | - |
glükózból anaerob | - | - | - |
fruktózbo’l aerob | - | - | - |
ÁSS glükózból | + | + | |
xilózból | + | + | |
trehalózból | + | + | |
etanolból | - | - | - |
gázképződés glükózból | - | - | - |
ONPG | + | -f- | + |
arginin-dihidrolaz | - | - | - |
1izin-dekarboxiláz | - | - | - |
fenilalanin-dezaminaz | - | - | - |
-3193744
I. táblázat (folytatása) A három törzs tudományos leírása
paraméter HK | 4 | HK 13 | HK 1331 b |
ornitin-dekarboxilaz | — | — | |
h2s | - | - | - |
Voges-Proskauer | - | - | - |
indol | - | - | - |
nitrit nitrátból | + | + | + |
denitrifíkalas | + | + | + |
levánkápzodes | - | - | - |
léc itinaz | - | - | - |
ureaz | + | + | + |
lebontani kepes | |||
keme'nyito | - | - | - |
zselatin | - | - | - |
kazein | - | - | - |
tirozin | - | - | - |
Tween 80 | - | - | - |
DNS | + | + | 4- |
eszkulin | + | + | + |
. Z , / / szubsztratum hasznosítás | |||
acetat | - | - | - |
c i trét | - | - | - |
malonat | - | - | - |
glicin | - | - | |
norleucin | - | - | - |
xiláz | + | + | + |
fruktóz | + | + | + |
glükóz | + | + | + |
autotróf növekedés | |||
H2 | - | - | - |
3-ketolaktoz | - | - | - |
növekedés | |||
bétáin | + | + | + |
L-karnitin | + | - | - |
gamma-butiro-betain | + | - | |
krotono-betain | + | - | - |
L-glutamat es krotono- | |||
-bétáin | + | + | |
L-glutamát es gamma- | |||
-butiro-betain | + | + | |
L-glutamát és L-kar- | |||
nitin | + | + |
A találmány szerinti eljárást L-karnitin előállítására előnyösen úgy foganatosítjuk, hogy a mikroorganizmus előkultúráját, előnyösen a HK 13 törzs előkultúráját sterilizált, előnyösen vitamintartalmú ásványi közegben (Kulla et al., Arch. Microbiol. 135, 1 /1983/) 20-40°C-on, előnyösen 30°C-on 6-8 pH között, előnyösen pH 7 mellett 20—50 órán át, előnyösen 30—40 órán át tenyésztjük. Az előtenyészet előnyösen 0,1 —10 t%, különösen elő 4 nyösen 0,5—5 t% mennyiségben kolint, glutamátot, acetátot, dimetil-glicint vagy betaint tartalmaz növekedési szubsztrátumként. Különösen előnyös a bétáin 0,5—5 t% mennyi50 ségben.
A mikrobiológiai technikában szokásos, hogy az előtenyészet az átalakítani kívánt kiindulási vegyüieteket, tehát gamma-butiro-betaint, krotono-betaint vagy azok keveré65 két is tartalmazza 0,1-10 t%, előnyösen 0,5-4193744
-5 t% mennyiségben, a tápközegre vonatkoztatva. A gamma-butiro-betain, illetve krotono-betain hidroklorid-só, szabad belső só vagy származéka alakjában lehet jelem
A fentiek szerint készített előkultúrával további tenyészeteket olthatunk be. összetételük célszerűen az előkultúra összetételével egyezik. Az átalakítani kívánt krotono-betain, gamma-butiro-betain vagy e kettő keveréke 0,1-10 t%, előnyösen 0,5-5 t% mennyiségben van jelen a tápközegben. A kolin, glutamát, acetát, dimetil-glicin és bétáin növekedési szubsztrátumokat célszerűen szintén az előkultúrával kapcsolatban elmondott koncentrációban alkalmazzuk.
A tenyésztés körülményei az előkultúra tenyésztési körülményeihez hasonlóak, tehát a hőmérséklet előnyösen 20°C és 40°C közötti, különösen 30°C körüli érték, és a pH-értéket általában 6 és 8 között, előnyösen pH 7 mellett tartjuk.
A fentiek szerint elindított fermentálás 20-30 óra elteltével megáll, ekkor az L-karhitin koncentrációja általában a·gamma-butiro-betain vagy krotono-betain kezdeti menynyiségének ekvivalens.
A sejteket centrifugálással vagy szűréssel választhatjuk el és további kultúra beoltásához használhatjuk fel.
Az L-karnitint ismert módon (J.P. Vandecasteele', Appl. Environ. Microbiol. 39, 327 /1980/) kationcserélő gyantával végzett kromatográfiával a szűrletből elkülöníthetjük, majd átkristályosítással tisztíthatjuk.
A találmány szerinti eljárást folyamatos eljárásként is végrehajthatjuk, oly módon, hogy a sejteket kémosztátba, előnyös hígítási arány (0,04-0,2 óra-1) mellett tenyésztjük, a szakaszos tenyésztéshez hasonló körülmények között.
1. példa
Krotono-betaint lebontó mikroorganizmus elkülönítése
Talajmintát semleges kémhatású foszfát-pufferrel keverve mikroorganizmusokat extrahálunk. A kivonatot nagyobb szilárd részek eltávolítása céljából szűrjük, majd krotono-betaint tartalmazó tápoldatot oltunk be vele enyhe zavarosság bekövetkeztéig. A zavarosság (mint a sejtkoncentráció mértéke) 9 nap elteltével a 90-szeresére megnövekedett. Az oldat krotono-betaint már nem tartalmazott, bomlási termékként ammónia volt kimutatható. A keverék kultúrából hagyományos mikrobiológiai módszerek segítségével a krotono-betaint lebontó mikroorganizmusok tiszta tenyészetét nyertük (szilárdított agar táptalajon). Az egyik kultúrát a további műveletekhez kiválasztottuk, HK 4-nek neveztük. Ez a törzs gamma-butiro-betaint, L-karnitint és betaint is képes hasznosítani.
2. példa
Stabil, karnitin-dehidrogenáz szempontjából negatív mutáns elkülönítése
A cím szerinti mutánstól kívánható, hogy a gamma-butiro-betainból vagy krotono-be8 ’ainból felépített L-karnitint ne katabolizál;a, sőt ideális esetben kiválassza.
A HK 4 törzs kultúráját az 5 mikrogramm/ml mennyiségben vett „Acridin Mutagen ICR 191” mutagénnel szukcinátos közegben az előírásoknak megfelelően (J.H. Miller, Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Habor Laboratory, /1972/) mutagerizáltuk, majd a sejteket szabvártyszerűen „Nutrient Broth” tápon növesztettük, hogy a mutáció láthatóvá váljék. A sejteket tartalmazó közegre oltottuk át. A kész kultúrával L-karnitint tartalmazó közeget oltottunk.
Néhány óra elteltével a tenyészet elérte a logaritmikus növekedés szakaszát. Ebben az, időpontban 15 mg/ml mennyiségben G-penicillint és 0,5 mg/ml mennyiségben D-cikioszerint adagoltunk (Ornstorn et al., Biochim. Biophys. Rés. Commun. 36, 179 /1969/). Ezek az ellen-szelekcionáló ágensek csak növekvő baktériumokat ölnek, az L-karnitin hasznosítására ,már nem képes, kívánt mutánsok túlélnek, és viszonylagosan feldúsúlnak. Harminc óra elteltével az élő sejtek száma az eredeti érték egyszázadára csökkent. Az antibiotikumokat elmostdk, és a tenyészetet betaint tartalmazó közegbe vittük át. Növekedés után a tenyészet megfelelő hígításait megszilárdított tápagaron szélesztettük. Az elkülönült sejtekből telepek nőttek; a telepeket külön-külön megvizsgáltuk. A HK 13 jelű mutánst választottuk ki. Ebből a mutánsból a karnitin-dehidrogenáz stabilan hiányzik. a mutáns tehát L-karnitint, gamma-butiro-betaint és krotono-betaint nem tud hasznosítani, betaint azonban igen. Ez a törzs — betaint, dimeti 1-glicint, kolint, glutanátot vagy acetátot tartalmazó tápközegben fermentálva — krotono betaint vagy gamma-butiro-be'aint L-karnítinná alakít és az utóbbit kivál asztja.
3. példa \ HK 13 jelű 5 literes előkultúráját 1 t% betaint és 0,5 t% krotono-betain-hidrokloridot tartalmazó, vitamintartalmú ásványi közegben (Kulla et al., Arch. Microbiol. 135, /1983/) 30°C-on pH 7,0 mellett 32 órán át tenyésztettük. A tenyészettel azonos összetétel 15 literes közeget oltottunk, és az előkultúrával azonos módon (30°C, pH 7,0, pO2= =3 ppm) 24 órán át tenyésztettük. Miután a termelés megállt, a sejteket lecentrifugáltuk, és új szakaszos kultúra oltóanyagaként használtuk fel. A 19,8 liter térfogatú felüluszó részben az L-karnitin koncentrációját enzimes elemzéssel mértük. A felüluszó rész milliliterenként 4,26 mg L-karnitint tartalmazott, ami a krotono-betain-hidroklorid kiindulási mennyiségére vonatkoztatva 95,0%-os hozamnak felel meg. Az NMR-színkép sem kiindulási anyagokat, sem szennyeződéseket nem mutatott ki.
Az L-karnitint az irodalomból ismert módon J.P. Vandesteele, Appl. Environ. Microbiol. 39, 327 /1980/) kationcserélő gyantán
-5193744 végzett kromatográfiával elkülönítettük az oldatból, majd átkristályosítással tisztítottuk.
4. példa
A HK 13 jelű törzs 5 literes előkultúráját 1 t% kolint és 0,6 t% gamma-butiro-betain-hidrokloridot tartalmazó, vitamintartalmú ásványi közegben (az 1. példa szerinti) 30°Con pH 7,0 mellett 32 órán át tenyésztettük. A tenyészettel 15 liter térfogatú, azonos összetételű közeget oltottunk be. A kultúrát az 1. példában megadott módon tenyésztettük. Mintegy 30 óra elteltével a termelés megállt. A sejteket mikroszűréssel (Amicon Hollow-fiber cartridge) eltávolítottuk. A sejtmasszával további termelő kultúrát oltottunk be. A 19,6 liter térfogatú szőriét L-karnitin-koncentrációja 5,3 mg/ml volt, ami a gamma-butiro-betain kiindulási mennyiségére vonatkoztatva 97,6 %-os hozamnak felel meg. Az NMR-színkép sem kiindulási anyagot, sem szennyeződéseket nem mutatott ki. Ezért az L-karnitint ismert módon, például azeotrop desztillálással (23 00 492 sz. NSZK-beli szabadalmi leírás) különíthettük el az oldatból.
5. példa
Folyamatos fermentálásra alkalmas, 1,5 liter vitamintartalmú (1. példa szerinti), 1,5 t% betaint és 1,0 t% gamma-butiro-betain-hidrokloridot tartalmazó ásványi tápközeget tartalmazó fermentort a HK 13 törzs azonos közegben készített előkultúrájának 150 ml-jével oltottunk. 20 órán át 30°C-on, pH 7,0 és aerob körülmények mellett végzett tenyésztés után a kultúra kinőtt, és 0,1 I/óra átfolyási sebességgel kezdtük a folyamatos üzemet. A fermentorból kilépő oldatot 4°C-ra hűtött edénybe szedtük, a sejteket centrifugálással elválasztottuk. Az enzimes elemzés szerint a szűrlet L-karnitin-koncentrációja 8,8 g/l volt. Ez az érték a gamma-butiro-betain kiindulási mennyiségére vonatkoztatva 99,2 %-os hozamnak felel meg. Az oldatból ionos kromatográfiával és vízelválasztással különítettük el a szilárd L-karnitin-hidrokloridot.
Claims (9)
- SZABADALMI IGÉNYPONTOK1. Eljárás L-karnitin előállítására, azzal jellemezve, hogy a HK 13 jelű, DSM 2903 szám alatt letétbe helyezett mikroorganizmust vagy mutánsait krotono-betainnal és/vagy gamma-butiro-betainnal dimetil-glicin, kolin, glutamát, acetát és/vagy bétáin jelenlétében tenyésztjük, majd a feldúsúlt L-karnitint elkülönítjük. (1984.03.29.)
- 2. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a krotono-betaint, gamma-butiro-betaint vagy a kettő keverékét 0,1-10 t% mennyiségben adagoljuk a tápközeg5 hez. (1984.03.29.)
- 3. Az 1. vagy 2. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a dimetil-glicint, kolint, glutamátot, acetátot és/vagy betaint a tápközeg mennyiségére vonatkoztatva 0,110 -10 t% mennyiségben adagoljuk. (1984.03.29.)
- 4. Eljárás L-karnitin előállítására, azzal jellemezve, hogy a HK 13 jelű, DSM 2903 szám alatt letétbe helyezett, vagy a HK 1331 b15 jelű, DSM 3225 szám alatt letétbe helyezett mikroorganizmust vagy mutánsait krotono-betainnal és/vagy gamma-butiro-betainnal dimetil-glicin, kolin, glutamát, acetát és/vagy bétáin jelenlétében tenyésztjük, majd a fel20 dúsúlt L-karnitint elkülönítjük. (1985.03.19.)
- 5. A 4. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a krotono-betaint, gamma-butiro-betaint vagy a kettő keverékét 0,1-10 t% mennyiségben adagoljuk a tápközeg25 hez. (1985.03.19.)
- 6. A 4. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a dímetil-glícint, kolint, glutamátot, acetátot és/vagy betaint a tápközeg mennyiségére vonatkoztatva 0,1-10 t% meny30 nyiségben adagoljuk. (1985.03.19.)
- 7. Eljárás az 1—6. igénypontok bármelyike szerinti eljárásban alkalmazható mikroorganizmusok előállítására, azzal jellemezve, hogy35 a) C- és N-forrásként betaint, gamma-butiro-betaint, krotono-betaint és L-karnitint hasznosítani képes mikroorganizmusokat mutagén kezelésnek vetünk alá, majdb) a mutagén kezelés után tenyésztéssel40 kapott kultúrából a stabil, L-karnitint nem katabolizáló, L-karnitin, krotono-betain, gamma-butiro-betain hasznosítására képtelen, de betaint hasznosító mikroorganizmusokat szelektáljuk. (1984.03.29.)45
- 8. A 7. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a b) lépésben az L-karnitin, krotono-betain és gamma-butiro-betain hasznosítására képtelen, de betaint hasznosító, emellett L-karnitint kiválasztó mikroorga50 nizmusokat szelektáljuk. (1984.03.29.)
- 9. A 7. vagy 8. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az a) lépésben mutagén kezelésnek alávetett mikroorganizmust betain-tartalmú közegben tenyésztjük tovább.55 (1983.03.29.)
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CH160084 | 1984-03-29 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
HUT37653A HUT37653A (en) | 1986-01-23 |
HU193744B true HU193744B (en) | 1987-11-30 |
Family
ID=4214209
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
HU851012A HU193744B (en) | 1984-03-29 | 1985-03-19 | Microbiological process for preparing l-carnitine |
Country Status (25)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US5187093A (hu) |
EP (1) | EP0158194B1 (hu) |
JP (1) | JPS60224488A (hu) |
CN (1) | CN1004146B (hu) |
AT (1) | ATE64154T1 (hu) |
AU (1) | AU585216B2 (hu) |
BG (1) | BG50282A3 (hu) |
BR (1) | BR8501374A (hu) |
CA (1) | CA1265757A (hu) |
CS (1) | CS273163B2 (hu) |
DD (1) | DD232310A5 (hu) |
DE (1) | DE3583058D1 (hu) |
DK (1) | DK165191C (hu) |
ES (1) | ES8602940A1 (hu) |
FI (1) | FI86889C (hu) |
HU (1) | HU193744B (hu) |
IE (1) | IE58045B1 (hu) |
IL (1) | IL74552A (hu) |
IN (1) | IN164247B (hu) |
NO (1) | NO164918C (hu) |
PL (1) | PL145712B1 (hu) |
RO (1) | RO92477B (hu) |
SU (1) | SU1435159A3 (hu) |
YU (1) | YU45708B (hu) |
ZA (1) | ZA851959B (hu) |
Families Citing this family (16)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPS59183694A (ja) * | 1983-04-05 | 1984-10-18 | Hamari Yakuhin Kogyo Kk | 光学活性なカルニチンの生化学的製造法 |
JPS59192095A (ja) * | 1983-04-13 | 1984-10-31 | Ajinomoto Co Inc | L−カルニチンの製造法 |
DD221905B1 (de) * | 1983-11-03 | 1987-03-18 | Univ Leipzig | Verfahren zur herstellung von l(-)-carnitin und seinen derivaten |
JPS62275689A (ja) * | 1985-12-09 | 1987-11-30 | Bio-Le Kk | L−カルニチンの製造法 |
MX170707B (es) * | 1989-07-28 | 1993-09-08 | Lonza Ag | Procedimiento para la produccion discontinua de l-carnitina por transformacion microbiologica de crotonobetaina y gama-butirobetaina |
DE4017595A1 (de) * | 1990-05-31 | 1991-12-05 | Consortium Elektrochem Ind | Maltopentaose produzierende amylasen |
DE4106375A1 (de) * | 1991-02-28 | 1992-09-03 | Degussa | Eine l-carnitin-amidase produzierender mikroorganismus, l-carnitin-amidase, verfahren zu deren gewinnung und deren verwendung |
CN1058995C (zh) * | 1996-11-08 | 2000-11-29 | 江苏省微生物研究所 | L-肉碱或其盐的制备方法 |
KR100255039B1 (ko) | 1997-07-28 | 2000-05-01 | 박영구 | L-카르니틴의제조방법 |
DE19749480A1 (de) * | 1997-11-08 | 1999-05-20 | Univ Leipzig | Verfahren zur Herstellung von L-Carnitin aus Crotonobetain |
WO2002061094A2 (de) * | 2001-01-31 | 2002-08-08 | Lonza Ag | Mikrobiologisches verfahren zur herstellung von l-carnitin |
US7700074B2 (en) * | 2002-02-07 | 2010-04-20 | Pettegrew Jay W | Method and system for diagnosis of neuropsychiatric disorders including chronic alcoholism |
US7407778B2 (en) | 2002-02-07 | 2008-08-05 | Pettegrew Jay W | Compounds, compositions and methods for treating neuropsychiatric disorders |
US20060257842A1 (en) * | 2003-05-29 | 2006-11-16 | Pettegrew Jay W | Cryopreservation media and molecules |
ATE437884T1 (de) * | 2003-05-29 | 2009-08-15 | Jay W Pettegrew | Glycerophosphocholin und derivate davon zur medizinischen abbildung von neuropsychiatrischen erkrankungen |
EP1901715B1 (en) | 2005-07-05 | 2012-05-02 | Lonza AG | Spray-drying process for producing a dry carnitine powder or granulate |
Family Cites Families (14)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US2313573A (en) * | 1938-01-17 | 1943-03-09 | Gen Aniline & Film Corp | Capillary active compounds and process of preparing them |
US2367878A (en) * | 1939-05-04 | 1945-01-23 | Hoffmann La Roche | Betaine esters |
NL6511804A (hu) * | 1964-11-30 | 1966-05-31 | ||
FR1559839A (hu) * | 1968-01-30 | 1969-03-14 | ||
ES370147A1 (es) * | 1968-08-29 | 1971-04-01 | Gulf Research Development Co | Un procedimiento para fabricar ciclopropilamina. |
US3711549A (en) * | 1970-05-19 | 1973-01-16 | Gulf Research Development Co | Process for manufacturing cyclopropylamine |
US3796632A (en) * | 1971-12-10 | 1974-03-12 | Toray Industries | Process for racemizing alpha-amino-epsilon-caprolactam |
DE2751134C2 (de) * | 1977-11-16 | 1986-04-17 | Degussa Ag, 6000 Frankfurt | Verfahren zur Herstellung von γ-Chlorcarbonsäureestern |
IT1142201B (it) * | 1980-06-24 | 1986-10-08 | Sigma Tau Ind Farmaceuti | Procedimento per la produzione enzimatica di l-carnitina |
DE3214953A1 (de) * | 1982-04-22 | 1983-10-27 | Hoechst Ag, 6230 Frankfurt | Mikrobielle polysaccharide, verfahren zu ihrer herstellung, dafuer geeignete mikroorganismen und verwendung der polysaccharide |
JPS59192095A (ja) * | 1983-04-13 | 1984-10-31 | Ajinomoto Co Inc | L−カルニチンの製造法 |
DD221905B1 (de) * | 1983-11-03 | 1987-03-18 | Univ Leipzig | Verfahren zur herstellung von l(-)-carnitin und seinen derivaten |
CH664374A5 (de) * | 1985-02-27 | 1988-02-29 | Lonza Ag | Verfahren zur herstellung von l-carnitin auf mikrobiologischem weg. |
IT1190280B (it) * | 1986-04-24 | 1988-02-16 | Sigma Tau Ind Farmaceuti | Procedimento per la preparazione di gamma-butirrobetaina |
-
1985
- 1985-02-26 FI FI850781A patent/FI86889C/fi not_active IP Right Cessation
- 1985-03-04 IE IE53385A patent/IE58045B1/en not_active IP Right Cessation
- 1985-03-07 IN IN177/MAS/854A patent/IN164247B/en unknown
- 1985-03-10 IL IL74552A patent/IL74552A/xx not_active IP Right Cessation
- 1985-03-15 ZA ZA851959A patent/ZA851959B/xx unknown
- 1985-03-19 HU HU851012A patent/HU193744B/hu unknown
- 1985-03-21 AU AU40192/85A patent/AU585216B2/en not_active Expired
- 1985-03-22 AT AT85103420T patent/ATE64154T1/de not_active IP Right Cessation
- 1985-03-22 DE DE8585103420T patent/DE3583058D1/de not_active Expired - Lifetime
- 1985-03-22 EP EP85103420A patent/EP0158194B1/de not_active Expired - Lifetime
- 1985-03-26 BR BR8501374A patent/BR8501374A/pt unknown
- 1985-03-26 BG BG069432A patent/BG50282A3/xx unknown
- 1985-03-27 CS CS222085A patent/CS273163B2/cs unknown
- 1985-03-27 DK DK138085A patent/DK165191C/da not_active IP Right Cessation
- 1985-03-27 DD DD85274492A patent/DD232310A5/de not_active IP Right Cessation
- 1985-03-27 RO RO118151A patent/RO92477B/ro unknown
- 1985-03-28 ES ES541663A patent/ES8602940A1/es not_active Expired
- 1985-03-28 SU SU853874110A patent/SU1435159A3/ru active
- 1985-03-28 YU YU50485A patent/YU45708B/sh unknown
- 1985-03-28 JP JP60064931A patent/JPS60224488A/ja not_active Expired - Lifetime
- 1985-03-28 CA CA000477804A patent/CA1265757A/en not_active Expired - Lifetime
- 1985-03-28 PL PL1985252628A patent/PL145712B1/pl unknown
- 1985-03-28 NO NO851261A patent/NO164918C/no not_active IP Right Cessation
- 1985-04-01 CN CN85101191.8A patent/CN1004146B/zh not_active Expired
-
1990
- 1990-03-15 US US07/496,093 patent/US5187093A/en not_active Expired - Lifetime
Also Published As
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
HU193744B (en) | Microbiological process for preparing l-carnitine | |
IE58779B1 (en) | Process for the microbiological production of l-carnitine | |
HUP0300363A2 (hu) | Eljárás pszeudomonsav A előállítására mikrobiológiai eljárás segítségével | |
KR100233330B1 (ko) | 6-히드록시피콜린산을 제조하기 위한 미생물학적 방법 | |
EP0188712B1 (de) | Verfahren zur Gewinnung von Phenylalanin-Dehydrogenase enthaltenden Mikroorganismen und deren Verwendung zur Herstellung von L-alpha-Aminosäuren | |
Rode et al. | Ferrous-or cobalt ion-dependent D-(-)-tartrate dehydratase of pseudomonads: purification and properties | |
US4849354A (en) | Process for producing menaquinone-4 | |
JPH03191794A (ja) | 微生物処理によるr―(―)―3―ハロゲノ―1,2―プロパンジオールの製法 | |
US5496715A (en) | Process for preparing indigo | |
JP2586283B2 (ja) | 微生物学的手段によってl−カルニチンを製造する方法 | |
JP2008178314A (ja) | 新規ウリカーゼの製造方法 | |
KR0146493B1 (ko) | 발효법에 의한 l-알라닌의 제조 방법 | |
US5716815A (en) | Method for preparing dimethylcarboxylic acid compounds | |
Hong et al. | A 3, 5-diaminohexanoate-decomposing Brevibacterium | |
JP3600803B2 (ja) | マンニトール生成菌株カンジダ・マグノリア及びこれを使用したマンニトールの発酵製造方法 | |
JP4197778B2 (ja) | 光学活性なα−メルカプトカルボン酸の製造方法 | |
Duménil et al. | Production of vitamin B12 by gram-variable methanol-utilizing bacteria | |
JPH0647395A (ja) | 2−ナフタレンスルホン酸の分解法 | |
Maeda et al. | Identification of nicotine-1′-N-oxide degrading bacteria | |
JPH05153982A (ja) | 新規変異株及びそれを用いるグリセリンの製造方法 | |
FR2519649A1 (fr) | Procede de production de tyramine oxydase | |
JPH08196288A (ja) | 長鎖脂肪酸の製造法 | |
CZ279298B6 (cs) | Mikroorganismy Alcaligenes faecalis DSM 6335 a způsob mikrobiologické výroby kyseliny 6-hydroxypikolinové | |
JP2008167718A (ja) | 新規ウリカーゼの製造方法 | |
JPH08275776A (ja) | 新規キチナーゼ及びその製造方法 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
HU90 | Patent valid on 900628 |