CS273163B2 - Method of l-carnitine production - Google Patents

Method of l-carnitine production Download PDF

Info

Publication number
CS273163B2
CS273163B2 CS222085A CS222085A CS273163B2 CS 273163 B2 CS273163 B2 CS 273163B2 CS 222085 A CS222085 A CS 222085A CS 222085 A CS222085 A CS 222085A CS 273163 B2 CS273163 B2 CS 273163B2
Authority
CS
Czechoslovakia
Prior art keywords
carnitine
crotonobetaine
betaine
dsm
butyrobetaine
Prior art date
Application number
CS222085A
Other languages
English (en)
Other versions
CS222085A2 (en
Inventor
Hans Dr Kulla
Pavel Dr Lehky
Original Assignee
Lonza Ag
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Lonza Ag filed Critical Lonza Ag
Publication of CS222085A2 publication Critical patent/CS222085A2/cs
Publication of CS273163B2 publication Critical patent/CS273163B2/cs

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P13/00—Preparation of nitrogen-containing organic compounds
    • C12P13/007—Carnitine; Butyrobetaine; Crotonobetaine
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
    • C12N1/205—Bacterial isolates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
    • C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
    • Y10S435/8215—Microorganisms
    • Y10S435/822—Microorganisms using bacteria or actinomycetales
    • Y10S435/824—Achromobacter

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Organic Low-Molecular-Weight Compounds And Preparation Thereof (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Prostheses (AREA)
  • Eye Examination Apparatus (AREA)
  • Diaphragms For Electromechanical Transducers (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Catalysts (AREA)
  • Acyclic And Carbocyclic Compounds In Medicinal Compositions (AREA)
  • Immobilizing And Processing Of Enzymes And Microorganisms (AREA)
  • Agricultural Chemicals And Associated Chemicals (AREA)
  • Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)

Description

Je známa příprava 1-karaitinu z ý4-butyrobetainu. ^-Butyrobetain se uvede do styku s hydroxylázovým enzymem získaným ze spor Keurospora crassa /US-PS 4371618/ za přítomnosti natrium-2-oxoglutarátu, redukčního činidla, zdroje železa a vzdušného kyslíku. Tento způsob má tu nevýhodu, že vyžaduje značný počet kofaktorů. Tak se v reakci stechiometrická množství 2-oxoglutarátu oxidačně dekarboxylují na sukoinát. Pe2+ je potřebný jako Og-aktivátor, askorbát pro udržení iontu železa v redukované formě a kataláza pro likvidaci škodlivého peroxidu vodíku vznikajícího ve stopovém množství.
lindstedt a kol. /Biochemistry _6_, 1262-1270 /1967/ The Pormation and Degradation of Camitin in Pseudomonas/ izolovali mikroorganismus rodu Pseudomonss, který se kultivuje s ^-butyrobetainem jako zdrojem uhlíku a dusíku. První reakcí odbourávání je hydroxylaoe -butyrobetainu na 1-kamitin, přičemž intermediárně vznikající 1-kamitin je dále zcela katabolizován na oxid uhličitý, vodu a amoniak.
Také při tomto postupu, který používá hydroxylázu získanou z bakterií pro přípravu I-karaitinu, je třeba značného množství kofaktorů /linstedt a kol., Biochemistry 16, 2181-2188 /1977/ Purifikation and Properties of -hutyrobetaine Hydroxylase from Pseudomonas sp. AK 1/.
Úkolem vynálezu je nalézt nový mikroorganismus, který nemá nevýhody známých způsobů a umožnit tak získat jednoduchým způsobem ne racemát, ale enantio-selektivní 1-kamitin z krotonbetainu, butyrobetainu nebo jejich směsi.
1-kamitin se podle vynálezu vyrábí kultivací bakteriálního produkčního kmene v* živné půdě, která obsahuje ^-butyrobetain a/nebo krotonobetain jako zdroj uhlíku a dusíku, růstové faktory, při podmínkách čeření do maximálního nahromadění konečného produktu a jeho následnou izolací. Způsob výroby spočívá v tom, že se jako bakteriálního produkčního kmene použije Agrobaoterium ÍHK4DSM 2938 ·, nebo Agrobacterium HK 13 DSM 2903, nebo Agrobacterium HK 1331 b DSM 3225. ^-butyrobetain a/nebo krotonobetain se použije v množství od 0,1 do 10,0 %. hmotnostních, vztaženo na kultivační médium.
Ma rozdíl od způsobů podle známého stavu techniky používají mikroorganismy podle vynálezu jako donátor hydroxylových skupin vodu a ne kyslík, což je dokázáno pokusy za použití Hg^O a 180.
Mikroorganismy podle vynálezu jsou schopny produkovat 1-kamitin z krotonobetainu a/nebo ^-butyrobetainu, přičemž vzniklý 1-kamitin nekatabolizují.
Jak ukazují srovnávací pokusy na vzorcích půd ze čtyř kontinentů, jsou mikroorganismy, které katabolizují butyrobetain a krotonobetain na I-karaitin, všudypřítomné, Izolace se podařila také z aktivovaného kalu z čistíren odpadních vod. Všechny tyto kmeny přicházejí v úvahu jako producenti I-kamitinu, jestliže se podrobí mutagennímu procesu dále uvedeným způsobem podle vynálezu.
Takové mutanty se získají následující selekční metodou:
a/ mikroorganismy, které rostou na betainu, ^butyrobetainu, krotonobetainu a 1-kamitinu jako zdroji uhlíku a dusíku, se běžným způsobem podrobí mutagennímu procesu.
b/ Z kultury mikroorganismů získané kultivací se oddělí ten, který je stabilní, nekatabolizuje I-kamitin a neroste s I-kamitinem, krotonobetainem,^-butyrobetainemj ale raději s betainem.
Výhodně se volí ty mikroorganismy získané ve stupni selekce b/, které produkují
1-kamitin a nerostou s 1-kamitiněm, krotonobetainem, ^-butyrobetainem, ale raději b betainem.
Účelně se mikroorganismy podrobené mutagennímu procesu dále kultivují v betainovém mediu- a tyto dále kultivované mikroorganismy se provedením stupně selekce b/ dále kultivují, výhodně v I-karaitinovém mediu. Kultivace kmenů rostoucích s betainem, ^“«butyrobetainem, krotonobetainam a L-karnltinem jako zdroji uhlíku a dusíku sa účelně provádí tak, že se ze směsi bakterií připraví naočkováním krotonobétainového živného roztoku směsná kultura a z této se běžnou mikrobiologickou technikou získá čistá kultura mikroorganismu kultivovaného na krotonobetainu.
Mutace takové kultury, která roste na betainu, ψ -butyrobetainu, krotonobetainu a L-karnltinu jako zdrojích uhlíku a dusíku, se může provést známými postupy /J.H.Miller, Experimente in Molecular Genetice, Cold Spring Harbor Laboratory, 1972/.
Účelně užívanými metodami pro přípravu stabilních mutant jsou Práme-Shift-metoda, deleční' metoda nebo transposon-inserČní metoda.
Mikroorganismy tekto podrobené mutagennímu procesu se pak po další kultivaci v betainovém médiu a převedení do L-karnitinového média podrobí selekčnímu stupni b/, kde se známými counter-salekčními činidly /P.Gerhardt a kol. /eds./, Manual of Methods for General Baoteriology, Am.Soo. for Mikrobiology, 1981/ oddělí ty mikroorganismy, které L-kamitin nekatabolizují a nerostou s L-kamitinem, krotonobetainem, ^-butyrobetainem, ale spíše s betainem.
Výhodným mikroorganismem, který roste s betainem, ^-butyrobetainem, krotonobetainem, L-kamitinem jako zdroji uhlíku a dusíku, je kmen HK 4 /DSM č. 2938/ a jeho descendenty a mutanty.
Tento kmen byl 3.3.1984 uložen v Německé sbírce mikroorganismů /DSM/, Gesellsohaft fur Biotechnologische Porschung mbH, Griesebachstrasse 8, 4300 Gottingen, Spolková republika Německa, pod číslem DSM 2938.
Vědecký popis kmene HK 4 /DSM č. 2938/
Buňky tyčinka pleomorfní kataláza růst +
délka μιη 1 až 2 anaerobní -
šířka (Um 0,5 až 0,8 37 °C +
pohyblivost 41 °C -
bičíky peritrichní pH 5,6 -
Gramova reakce - Mao-Conkejův
spory - agar +
tvorba póly-/? - SS-agar -
hydroxybutyrátu M oetrimidový
oxidáza + agar -
tvorba pigmentu odbourávání
nadifundující - škrobu -
difundujíoí - želatiny -
fluoreskující - kaseinu -
tvorba kyseliny tyrosinu -
/OP-test/ z Tneenu 80 -
glukózy aerobně ae DNA +
anaerobně aesoullnu +
fruktózy aerobně - využití substrátu
ASS glukóza + acetát -
xylóza + citrát -
trehalóza + malonát -
ethanol glyoin -
fenylalanindeamináza - norleucin -
omitindekarboxyláza - xylóza +
C.S 273163 B2
H2S
Voges-Proakauer indol dusitan z dusičnanu + denitrifikace + tvorba levanu lecithinaza ureáza + argininhydroláza lysindekarboxyláza
fruktóza +
glukóza +
autotrofní růst -
s H2
3-ketolaktoza -
tvorba plynu z glu-
kozy -
ONPG +
růst
betain +
L-karaitin +
-butyrobetain +·
krotonobetain +
Přednostním mikroorganismem, který vzniká z popsaného mikroorganismu mutagenním procesem a selekcí, je stabilní, nekatabolizuje E-karnitin, avšak jej vylučuje a neroste s l-karnitinem, krotonobetainem a ýi -butyrobetainem, ale spíše s betainem, je HK 13,
Uvedený kmen byl 23.1.1984- deponován v Německé sbírce mikroorganismů /DSM/, Gesellschaft fur Biotechnologiaohe Porschung mbH, Griesebachstrasse 8, 43000 Gottingen, Spolková republika Německa, pod číslem 2903.
Vědecký popis kmene HK 13 /DSM 6.2903/
Buňky tyčinky pleomorfní tvorba poly-^-hydroxybutyrátu
délka jim 1 až 2 oxidáza +
šířka jim 0,5 až 0,8 kataláza +
pohyblivost + fenylalanindeamináza -
bičíky peritriohní ornitindekarboxyláza -
Gramova reakce - h2s -
spory - Voges-ProBkauer
indol - anaerobně -
dusitan z dusična- fruktózy aerobně -
nu + ASS glukóza +
denitrifikace + xylóza +
tvorba levanu - trehalóza +
lecithináza - ethanol -
ureáza + tvorba plynu z glu-
růst kózy -
anaerobní - ONPG +
37 °C + argininhydroláza -
41 °C - lysidekarboxyláza -
pH 5,6 - odbourávání
Mac-Conkeyův škrobu -
agar + želatiny OB
SS-agar - kaseinu -
Cetrimidový tyrosinu -
agar - Tweenu 80 -
tvorba pigmentu DNA +
nedifundujíoí aesculinu +
difundujíoí a· využití substrátu
fluoreskující - acetát -
tvorba kyseliny /OF-test/z glukózy aerobně norleuoin xylóza + fruktóza + . glukóza + autotrofní růst s Hg 3-ketolaktóza citrát malonát glycin růst betain +
L-karaitin ^-butyrobetain krotonobetain L-glutamát a krotonbetain L-glutamát a butyrobetain .i
L-glutamát a
L-kamitin i
Příkladem descendentu mikroorganismu HK 13, který je stabilní, nekatabolizuje L-kamitin, avšak produkuje jej, naroste na L-karnitinu, krotonbetainu a -butyrobstainu, ale spíše na betainu, L-glutamátu a krotonbetainu, L-glutamátu a butyrobe- i tainu, L-glutamátu a L-karaitinu, je kman HK 1331 b.
Tento byl izolován jako spontánně, dobře rostoucí mutantová kolonie z povrchu agarem ztuženého živného media, které obsahuje L-glutamát a ý^-butyrobetain.
Tento kmen byl 8.2,1985 deponován v Německé sbírce mikroorganismů /DSM/, Gesellsehaft fur Biotechnologisohe Forsohung mbH, Griesebachstrasse 8, 4300 Gottingen/ Spolková republika Německa, pod číslem DSM 3225.
Vědecký popis kmene HK 1331 b /DSM č. 3225/s
buňky tyčinky pleomorfní délka ^im 1 a: šířka pum 0,5
pohyblivost + anaerobně
bičíky peritriehní fruktóza aerobně
Gramova reakce - ASS glukózy
spory - xylózy
tvorba póly-- trehalózy
hydroxybutyrátu - ethanolu
oxidáza + tvorba plynu z glukózy
kataláza + ONPG
růst arginindihydroláza
anaerobní - lysind ekarboxyláza
37 °C + fenylalanindeamináza
41 °C - omitlndekarboxyláza
pH 5,6 - H2S
Mae-Conkeyův Voges-Proskauer
agar + indol
SS-agar - dusitan z dusičnanu ,
oetrimidový denitrifikace
agar - tvorba levanu
tvorba pigmentu lecithináza
nedifundující - ureáza
difundujíoí - odbourávání
fluoreskující - škrobu
C.S 273 163 B2 tvorba kyseliny /OF-test/z glukóza aerobně Tweenu 80 DNA aesculinu využiti substrátu aoetát citrát malonát glycin norleucin xylóza fruktóza glukóza želatiny kaseinu tyroeinu autotrofní růst s H2
3-ketolaktóza růst betain 1-karaitin Λ-butyrobetain krotonobetain L-glutamát a krotonobetain
L-glutamát a butyrobetain
L-glutamát a L-karnitin
Způsob výroby L-kamitinu ss výhodně provádí tak, že se kultivuje předkultura mikroorganismu, přednostně mikroorganismu označeného HK 13zve sterilním, výhodně vitaminy obsahujícím minerálním médiu /Kulla a kol., Aroh.líicrobiol, 135, 1 /1983//, při 20 až 40 °0, výhodně při 30 °C, při hodnotě pH 6 až 8, výhodně 7, po dobu 20 až 50 hodin, výhodně 30 až 40 hodin. Tato předkultura obsahuje účelně 0,1 až 10 % hmot., výhodně 0,5 až 5 % hmotu, oholinu, glutamátu, acetátu, dimethylglycinu nebo betainu jako růstového substrátu. Zvláště je výhodný betain v množství od 0,5 do 5 % hmot.
Dále se pracuje běžnou mikrobiologickou technikou, k předkultuře se přidají také výchozí sloučeniny, -butyrobetain, krotonobetain, nebo jejich směs v množství 0,1 až 10 % hmot., výhodně 0,5 až 5 % hmot., vztaženo na reakční médium.
-butyrobetain, popřípadě krotonobetain, může být použit jako hydrochlorid, jako volná vnitřní sůl, jakož i ve formě svého derivátu.
S předkulturou vyrobenou uvedeným postupem mohou být očkovány další kultury.
Tyto další kultury mají účelně stejné složení jako předkultury.
Koncentrace přidávaného krotonobetainu, ^-butyrobetainu něho jejich směsi se pohybují od 0,1 do 10 % hmot., výhodně 0,5 až 5 % hmot.
Také růstové substráty - cholin, glutamát, acetát, dimethylglycin a betain- se výhodně používají v koncentracích používaných pro předkulturu.
Výhodně se při další kultivaci používají stejné podmínky kultivace jako pro předkulturu.
Teploty se také výhodně pohybují mezi 20 až 40 °C, výhodně 30 °C a hodnota pH pravidelně mezi 6 a 8, výhodně 7.
Tímto způsobem provedená výroba L-kamitinu se po 20 až 30· hodinách zastaví.
Koncentrace L-kamitinu pak zpravidla odpovídá ekvivalentnímu množství ^-butyrobetainu nebo krotonobetainu použitého jako výchozí látka.
Buňky mohou být odstředěny nebo odfiltrovány a použity jako očkovací materiál pro novou kulturu.
sobě známým způsobem /J.P.Vandecasteele, Appl.Environ. Microbiol. 39. 327 /1980// lze L-karaitin pomocí kationtovýměnné chromatografie izolovat ze zbytku a přečistit krystalizací.
Způsob výroby L-kamitinu je možno provádět také kontinuálním způsobem, při kterém
C.S 273163 B2 se buňky kultivují v chemostatu při přibližném zřeáovacím poměru 0,04 až 0,2 b“\ výhodně při 0,06 až 0,08 h“\ za podobných podmínek jako v batoh-kultuře.
Příklad 1
Izolace mikroorganismu odbourávájícího krotonobetain:
Mikroorganismy se extrahují z půdy neutrálním fosfátovým pufrem za míchání, nakonec se větší částice oddělí filtrací papírem a krotonobetainové živné médium se očkuje takto získanými bakteriemi až do slabého zákalu. Po 9 dnech vzrostl zákal jako míra koncentrace buněk devadesátkrát. Krotonobetain z roztoku zcela zmizel a amoniak jako produkt odbourávání byl prokazatelný.
Ze směsné kultury se pomocí běžných mikrobiologických technik /zpevněná agarová živná půda/ získají;.': čisté kultury mikroorganismů odbourávájících krotonobetain. Jedna kultura byla zvolena pro další práci a označena jako HK 4.
Tento kmen také roste s ý7-butyrobetainem, L-kamitinem a betainem.
Příklad 2
Izolace stabilní karaitin-dehydrogenázové negativní mutanty:
Takový mutant by neměl dále katabolizovat L-kamitin vzniklý z ^-butyrobetainu nebo krotonobetainu a v ideálním případě tento také produkovat.
Kultura HK 4 se stabilně podrobí, mutagennímu procesu za přítomnosti Acridin Mutagen ICR 191 5 mikrogramů na ml, v sukcinátovém mediu /J.H.Miller, Experiment in Molecular Genetice, Cold Spring Harbor Laboratory, 1972/, pak se buňky nechají standardním způsobem růst v Nutrient Broth pro zvýraznění mutace, pak se převedou do betainového me?dla. Vyprodukovanou kulturou bylo naočkováno L-karnitinové medium.
Po málo hodinách dosáhla kultura logaritmického růstu. V této době se přidá penicilín G /15 mg/ml/ a D-cykloserin /0,5 mg/ml/ /Ornston a kol., Biochim. Biophys.Res. Commun. £6, 179 /1969//. Tato counter-selekční činidla ničí pouze rostoucí bakterie. Mutanty, které již nemohou růst s L-karaitinem, a které jsou středem našeho zájmu, přežívají a tímto způsobem se relativně obohacuji. Po 30 hodinách počet živých buněk klesl na setinu, antibiotika byla vymyta a kultura byla převedena do betainového média. Po kultivaci byla kultura zředěna a převedena na zpevněný živný agar. Takto rozdělené buňky vytvořily kolonie a byly jednotlivě zkoušeny.
Byla zvolena mutanta HK 13. Nemá již stabilní karnitindehydrogenázu a podle toho již neroste s L-karnitinem. -butyrobetainem nebo krotonobetainem, ale spíše s betainem. Při růstu na betainu, dimethylglycinu, oholinu, glutamátu nebo acetátu přeměňuje tento kmen krotonobetain nebo -butyrobetain na L-karnitln a produkuje jej.
Příklad 3
1 předkultury HK 13 se kultivuje v minerálním médiu obsahujícím vitamíny /Kulla a kol., Arch. Mlcrobiol. 135, 1 /1983//, které obsahuje 1 % hmot. betainu a 0,5 % hmot. chloridu krotonobetainu při 30 °C a pH 7,0 32 hodin. Tímto médiem se naočkuje kultura stejného složení o objemu 15 1 a kultivuje se 24 hodin za stejných podmínek jako předkultura /30 °C, pH 7,0, pOg * 3 ppm/. Po ukončení produkce se buňky odstředí a mohou být použity jako očkovací materiál pro další vsázku. Koncentrace L-karaitinu ve zbytku /19,8 1/ byla stanovena enzymatickou analýzou.
Zbytek obsahoval 4,26 mg L-kamitinu na ml. To odpovídá výtěžku 95,0 % vztaženo na výchozí množství chloridu krotonobetainu.
Edukty a jiné nečistoty nebyly v NMR spektru prokázány.
Jak bylo popsáno /J.P.Vandecasteele, Appl.Environ.Microbiol. 39, 327 /1930//, může být L-kamitin izolován ze zbylého média.kationtovýměnnou chromatografií a přečištěn překrystalováním.
Příklad 4 litrů předkultury HK 13 se kultivuje 32 hodin v minerálním médiu obsahujícím vitamíny /podle příkladu 1/, které obsahuje 1 % oholinu a 0,6 % ^-butyroberain-chloridu, při pH 7,0 a 30 °C. Touto předkulturou se naočkuje 15 1 média stejného složení a kultivace se provádí za stejných podmínek jako v příkladu 1.
Když je produkce asi po 30 hodinách ukončena, oddělí se buňky mikrofiltrací /Amioon Hollow-fiber cartridge/. Tato hmota buněk může být použita pro další produkci L-karnitinu. Koncentrace L-karnitinu se ve filtrátu /19,6 1/ stanoví enzymaticky. Filtrát- obsahuje 5,3 ng L-karnitinu na ml. Tato hodnota odpovídá analytickému výtěžku 97,6 %, vztaženo na výchozí množství chloridu^1-butyrobetainu.
HMR-analýzou nebyly ve filtrátu prokázány žádné edukty ani jiné cizí organické produkty. Proto je možno izolovat z roztoku L-karaitin známým způsobem, např. azeotropní destilací /DE-IS 2300492/.
Příklad 5
Fermentor pro kontinuální fermentaci, který obsahuje 1,5 1 minerálního média obsahujícího vitamíny /podle příkladu 1/, ve kterém je obsaženo 1,5 % betainu a 1,0 % chloridu ý^-butyrobetainu, se naočkuje 150 ml předkultury HK 13 ve stejném médiu. Po 20 hodinách aerobní kultivace při 30 °0 a pH 7,0 kultura-vyrostla a mohla začít kontinuální výroba s průtokovou rychlostí 0,1 1/h. Roztok kultury odebíraný z fermentoru byl umístěn do nádoby chlazené na 4 °C. Buňky byly odděleny odstředěním. Filtrát obsahuje 8,8 g L-kamitinu, což bylo stanoveno enzymatickou analýzou.
Tato hodnota odpovídá výtěžku 99,2 %, vztaženo na výchozí koncentraci chloridu ý^-butyrobetainu.
Pevný chlorid í-karnitinu může být z roztoku izolován iontovýmšnnou chromatografií a oddělením vody.
Příklad Mikroorga- nismus Edukt množství Růstový substrát Podmínky Výtěžek L-karnitinu
6 HK 1331b 0,1 % Bubet Dimethylglycin 1 % 25 47 °C h pH 6,5 94,1 %
7 HK 13 10 % Bubet Acetat 2 % 35 25 °C h PH 7,5 96,3 %
8 HK 13 0,1 % Crotbet Glutamat 0,7 % 20 33 °C h pH 7 92,5 %
9 HK 13 1 % Bubet Betain 10 % 30 30 °C h pH 8 97,1 %
10 HK 1331b 1 % Bubet Betain 0,1 % 30 24 °C h pH 6 97,9 %
11 HK 13 1 % Crotbet Betain 1,6 % 50 22 °C h pH 7 98,8 %
12 HK 1331b 0,5 % Bubet 0,5 %Crot- Betain 1,5 % 30 24 °C h pH 7 98,9 %
bet
Bubet =y-butyrobetainhydrochlorid
Crotbet Crotonobetainhydrochlorid

Claims (1)

  1. Způsob výroby L-karnitinu kultivací bakteriálního produkčního kmene v živné půdě, která obsahuje ^-butyrobetain a/nebo krotonobetain jako zdroj uhlíku a dusíku, růstové faktory při podmínkách čeření do maximálního nahromadění konečného produktu a jeho následnou izolací, vyznačující se tím, že se jako bakteriálního produkčního kmene použije Agrobaoterium HK 4 DSM 2938, nebo Agrobacterium HK 13 ĎSM 2903, nebo Agrobacterium HK 1331 b DSM 3225, přitom se ^-butyrobetain a/nebo krotonobetain použije v množství od 0,1 až 10,0 % hmotnostních, vztaženo na kultivační médium.
CS222085A 1984-03-29 1985-03-27 Method of l-carnitine production CS273163B2 (en)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CH160084 1984-03-29

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CS222085A2 CS222085A2 (en) 1990-07-12
CS273163B2 true CS273163B2 (en) 1991-03-12

Family

ID=4214209

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CS222085A CS273163B2 (en) 1984-03-29 1985-03-27 Method of l-carnitine production

Country Status (25)

Country Link
US (1) US5187093A (cs)
EP (1) EP0158194B1 (cs)
JP (1) JPS60224488A (cs)
CN (1) CN1004146B (cs)
AT (1) ATE64154T1 (cs)
AU (1) AU585216B2 (cs)
BG (1) BG50282A3 (cs)
BR (1) BR8501374A (cs)
CA (1) CA1265757A (cs)
CS (1) CS273163B2 (cs)
DD (1) DD232310A5 (cs)
DE (1) DE3583058D1 (cs)
DK (1) DK165191C (cs)
ES (1) ES8602940A1 (cs)
FI (1) FI86889C (cs)
HU (1) HU193744B (cs)
IE (1) IE58045B1 (cs)
IL (1) IL74552A (cs)
IN (1) IN164247B (cs)
NO (1) NO164918C (cs)
PL (1) PL145712B1 (cs)
RO (1) RO92477B (cs)
SU (1) SU1435159A3 (cs)
YU (1) YU45708B (cs)
ZA (1) ZA851959B (cs)

Families Citing this family (16)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS59183694A (ja) * 1983-04-05 1984-10-18 Hamari Yakuhin Kogyo Kk 光学活性なカルニチンの生化学的製造法
JPS59192095A (ja) * 1983-04-13 1984-10-31 Ajinomoto Co Inc Ｌ−カルニチンの製造法
DD221905B1 (de) * 1983-11-03 1987-03-18 Univ Leipzig Verfahren zur herstellung von l(-)-carnitin und seinen derivaten
JPS62275689A (ja) * 1985-12-09 1987-11-30 Bio-Le Kk Ｌ−カルニチンの製造法
MX170707B (es) * 1989-07-28 1993-09-08 Lonza Ag Procedimiento para la produccion discontinua de l-carnitina por transformacion microbiologica de crotonobetaina y gama-butirobetaina
DE4017595A1 (de) * 1990-05-31 1991-12-05 Consortium Elektrochem Ind Maltopentaose produzierende amylasen
DE4106375A1 (de) * 1991-02-28 1992-09-03 Degussa Eine l-carnitin-amidase produzierender mikroorganismus, l-carnitin-amidase, verfahren zu deren gewinnung und deren verwendung
CN1058995C (zh) * 1996-11-08 2000-11-29 江苏省微生物研究所 L-肉碱或其盐的制备方法
KR100255039B1 (ko) 1997-07-28 2000-05-01 박영구 L-카르니틴의제조방법
DE19749480A1 (de) * 1997-11-08 1999-05-20 Univ Leipzig Verfahren zur Herstellung von L-Carnitin aus Crotonobetain
WO2002061094A2 (de) * 2001-01-31 2002-08-08 Lonza Ag Mikrobiologisches verfahren zur herstellung von l-carnitin
US7700074B2 (en) * 2002-02-07 2010-04-20 Pettegrew Jay W Method and system for diagnosis of neuropsychiatric disorders including chronic alcoholism
US7407778B2 (en) 2002-02-07 2008-08-05 Pettegrew Jay W Compounds, compositions and methods for treating neuropsychiatric disorders
US20060257842A1 (en) * 2003-05-29 2006-11-16 Pettegrew Jay W Cryopreservation media and molecules
ATE437884T1 (de) * 2003-05-29 2009-08-15 Jay W Pettegrew Glycerophosphocholin und derivate davon zur medizinischen abbildung von neuropsychiatrischen erkrankungen
EP1901715B1 (en) 2005-07-05 2012-05-02 Lonza AG Spray-drying process for producing a dry carnitine powder or granulate

Family Cites Families (14)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US2313573A (en) * 1938-01-17 1943-03-09 Gen Aniline & Film Corp Capillary active compounds and process of preparing them
US2367878A (en) * 1939-05-04 1945-01-23 Hoffmann La Roche Betaine esters
NL6511804A (cs) * 1964-11-30 1966-05-31
FR1559839A (cs) * 1968-01-30 1969-03-14
ES370147A1 (es) * 1968-08-29 1971-04-01 Gulf Research Development Co Un procedimiento para fabricar ciclopropilamina.
US3711549A (en) * 1970-05-19 1973-01-16 Gulf Research Development Co Process for manufacturing cyclopropylamine
US3796632A (en) * 1971-12-10 1974-03-12 Toray Industries Process for racemizing alpha-amino-epsilon-caprolactam
DE2751134C2 (de) * 1977-11-16 1986-04-17 Degussa Ag, 6000 Frankfurt Verfahren zur Herstellung von γ-Chlorcarbonsäureestern
IT1142201B (it) * 1980-06-24 1986-10-08 Sigma Tau Ind Farmaceuti Procedimento per la produzione enzimatica di l-carnitina
DE3214953A1 (de) * 1982-04-22 1983-10-27 Hoechst Ag, 6230 Frankfurt Mikrobielle polysaccharide, verfahren zu ihrer herstellung, dafuer geeignete mikroorganismen und verwendung der polysaccharide
JPS59192095A (ja) * 1983-04-13 1984-10-31 Ajinomoto Co Inc Ｌ−カルニチンの製造法
DD221905B1 (de) * 1983-11-03 1987-03-18 Univ Leipzig Verfahren zur herstellung von l(-)-carnitin und seinen derivaten
CH664374A5 (de) * 1985-02-27 1988-02-29 Lonza Ag Verfahren zur herstellung von l-carnitin auf mikrobiologischem weg.
IT1190280B (it) * 1986-04-24 1988-02-16 Sigma Tau Ind Farmaceuti Procedimento per la preparazione di gamma-butirrobetaina

Also Published As

Publication number Publication date
BR8501374A (pt) 1985-11-26
AU4019285A (en) 1985-10-03
HUT37653A (en) 1986-01-23
YU50485A (en) 1987-12-31
EP0158194B1 (de) 1991-06-05
IE850533L (en) 1985-09-29
BG50282A3 (en) 1992-06-15
CN85101191A (zh) 1987-06-10
IL74552A0 (en) 1985-06-30
CS222085A2 (en) 1990-07-12
FI850781A0 (fi) 1985-02-26
RO92477B (ro) 1987-10-01
FI850781L (fi) 1985-09-30
PL252628A1 (en) 1986-02-25
YU45708B (sh) 1992-07-20
DD232310A5 (de) 1986-01-22
IL74552A (en) 1988-12-30
DK165191B (da) 1992-10-19
NO851261L (no) 1985-09-30
RO92477A (ro) 1987-09-30
IE58045B1 (en) 1993-06-16
EP0158194A3 (en) 1987-07-22
ATE64154T1 (de) 1991-06-15
FI86889C (fi) 1992-10-26
DK138085D0 (da) 1985-03-27
NO164918C (no) 1990-11-28
CA1265757A (en) 1990-02-13
ES541663A0 (es) 1985-12-01
NO164918B (no) 1990-08-20
CN1004146B (zh) 1989-05-10
IN164247B (cs) 1989-02-04
US5187093A (en) 1993-02-16
DE3583058D1 (de) 1991-07-11
EP0158194A2 (de) 1985-10-16
FI86889B (fi) 1992-07-15
ES8602940A1 (es) 1985-12-01
AU585216B2 (en) 1989-06-15
ZA851959B (en) 1985-11-27
JPS60224488A (ja) 1985-11-08
DK138085A (da) 1985-09-30
DK165191C (da) 1993-03-01
HU193744B (en) 1987-11-30
PL145712B1 (en) 1988-10-31
SU1435159A3 (ru) 1988-10-30

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EP0530803B1 (en) Process for producing L-threonine
US4529697A (en) Process for producing L-glutamic acid by fermentation
CS273163B2 (en) Method of l-carnitine production
CA1168999A (en) Method for preparing 2,5-diketo-d-gluconic acid
US4745064A (en) Process for the degradation of s-triazine derivatives in aqueous solutions
KR100198039B1 (ko) 발효에 의한 l-글루탐산의 제조방법
CZ279790B6 (cs) Mikrobiologický způsob výroby hydroxylovaných de rivátů pyrazinu
US4492756A (en) Microorganisms of the genus Hyphomicrobium and process for degrading compounds wich contain methyl groups in aqueous solutions
KR100233330B1 (ko) 6-히드록시피콜린산을 제조하기 위한 미생물학적 방법
EP0188712B1 (de) Verfahren zur Gewinnung von Phenylalanin-Dehydrogenase enthaltenden Mikroorganismen und deren Verwendung zur Herstellung von L-alpha-Aminosäuren
DE69738080T2 (de) Biokatalysatoren mit amin-acylase aktivität
Rode et al. Adaptation of Rhodopseudomonas sphaeroides to Growth on d-(—)-Tartrate and Large-Scale Production of a Constitutive d-(—)-Tartrate Dehydratase During Growth on dl-Malate
US4060455A (en) Process for the microbial production of L-serine using pseudomonas Sp. DSM 672
US5212089A (en) Process for prepartion of s-(+)-3-halogeno-1,2-propanediol by treatment with alcaligenes
EP1018546B1 (en) Microorganisms producing 5-aminolevulinic acid and processes for producing 5-aminolevulinic acid by using the same
US5496715A (en) Process for preparing indigo
US5246843A (en) Process for preparation of R-(-)-3-halogeno-1,2,-propanediol by treatment with microorganism
Igarashi et al. Excretion of L-tryptophan by analogue-resistant mutants of Pseudomonas hydrogenothermophila TH-1 in autotrophic cultures
EP0799895B1 (en) Fermentative production of d-biotin
US4416987A (en) Method of synthesizing proteins from methanol
JP2586283B2 (ja) 微生物学的手段によってｌ−カルニチンを製造する方法
KR0146493B1 (ko) 발효법에 의한 l-알라닌의 제조 방법
Duménil et al. Production of vitamin B12 by gram-variable methanol-utilizing bacteria
SU1377290A1 (ru) Штамм бактерий ALcaLIGeNeS FaecaLIS, используемый дл очистки сточных вод от 2-хлор-цис,цис-муконовой кислоты
US5266482A (en) Agrobacterium useful for the microbiological process for the production of hydroxylated pyrazine derivatives