JP3600803B2 - マンニトール生成菌株カンジダ・マグノリア及びこれを使用したマンニトールの発酵製造方法 - Google Patents
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Description
【0001】
【発明の属する技術分野】
本発明は天然から分離した、マンニトール(mannitol)を高収率かつ高生産性で生産する新菌株カンジダ・マグノリア(Candida magnoliae)、及びこれを使用して果糖(fructose)からマンニトールを製造する方法に関するものである。
【0002】
【従来の技術】
マンニトールは、六炭糖糖アルコールとして自然界では褐藻類、きのこ類、菌類等に含まれている。マンニトールは、砂糖の30〜40%の甘美度を有しており、砂糖の使用が制限される食品製造で代替甘味料で使われているだけでなく、冷飲昧、低吸湿性、流動性などの優秀な特性により製菓類の添加剤、医薬品の充填剤、界面活性剤、防水剤等でたくさん利用されている。また、低血圧治療剤の中間物質として使われて、各種医薬品製剤の製造工程で苦味を軽減させるためのコーティング剤としても利用されている等食品及び医薬品産業で広範囲に使われている。
【0003】
マンニトールは色々な果物や野菜に天然に存在するが、この場合にはきわめて微量にしか存在しないために、果物や野菜から抽出することは産業的に経済性がない。したがって、マンニトールの商業的生産方法は砂糖等から加水分解によって生成された果糖を分離して、この果糖に高温・高圧下の触媒下で化学的に水素を添加して製造する。しかし、副産物としてソルビトール(sorbitol)が作られるため別の精製工程を必要とするだけでなく、転換収率が非常に低くて製造原価が高い。また高温高圧の反応であるために危険性と廃棄物処理の問題が存在する短所がある。
【0004】
このような短所を解決するために、微生物によるマンニトール生産方法に対する多くの研究が進行されている。マンニトール生産に関連された微生物としては、酵母の場合、カンジダ・ゼイラノイド(Candida zeylannoide)、カンジダ・リフォリチカ(Candida lipolitica)、クリプトコッカス・ネオフォマンス(Cryptococcus neoformans)、トルロップシス・マンニトパシエンス(Torulopsis mannitofaciens)などがあり、細菌の場合、ラクトバチルス・ブレビス(Lactobacillus brevis)、リューコノストック・メセンテリオド(Leuconostoc mesenteriode)とマイコバクテリウム・スメグマチス(Mycobacterium smegmatis)などがあり、かびの場合ミュコ・ラウジ(Mucor rouxii)、アスペルギルス・ニデュランス(Aspergillus nidulans)、ペニシリウム・カブロサム(Penicillum scabrosum)などがある。微生物による方法は経済性が高く、ブドウ糖または果糖から特異的にマンニトールのみ生産させることができ、反応後マンニトールの分離精製過程を非常に容易にすることができるが、その生産性または収率が低いという短所を有するために産業化に難しさがある。
【0005】
【発明が解決しようとする課題】
本発明が解決すべき技術的課題は、キシリトール(xylitol)製造会社(Bolak Co.、Ltd.烏山)の発酵スラッジから高収率のマンニトール生産新菌株カンジダ・マグノリア(Candida magnoliae)を分離同定して、培養条件を最適化することによって、マンニトールを高生産性かつ高収率で製造する方法を開発したものである。
【0006】
【課題を解決するための手段】
本発明は天然スラッジから分離された新菌株カンジダ・マグノリア(Candida magnoliae)(寄託番号KCCM−10252号)を種培養し、種培養された菌株をブドウ糖、果糖、窒素源及び無機塩類を含有する培地で発酵培養させて生成されたマンニトールを分離精製することを特徴とする高収率かつ高生産性のマンニトール製造方法及びその方法で製造されたマンニトールを提供することである。
【0007】
また前記発酵培地はブドウ糖50〜100g/L、果糖50〜120g/L、酵母抽出物5〜20g/L、硫酸アンモニウム1〜5g/L、二リン酸カリウム1.0〜5.0g/L及び硫酸マグネシウム0.1〜0.5g/Lを含むことを特徴とし、前記発酵培養時の撹拌速度は200〜500rpmであり、通気量は0〜0.5vvmであり、pHは4.5〜5.5であり、培養温度は27〜35℃であることを特徴とする。
【0008】
一方、前記新菌株カンジダ・マグノリアの種培養はブドウ糖15〜25g/L、酵母抽出物7〜13g/L及びペプトン15〜25g/Lが含まれたYPD培地で行い、菌体濃度が3〜5g/Lで増殖するまで振とう培養することを特徴とする。
【0009】
また、天然スラッジの試料を希釈した後、ブドウ糖10〜20g/L、果糖18〜22g/L、ペプトン15〜25g/L、酵母抽出物7〜15g/L、寒天12〜17g/Lが含まれた平板を使用して27〜33℃で速く増殖する菌株を中心に単一コロニーを選別して、これら選別された菌株をブドウ糖30〜70g/L、果糖50〜100g/L、酵母抽出物5〜20g/L、硫酸アンモニウム1〜5g/L、二リン酸カリウム1〜5g/Lで構成された培地で発酵時間68〜76時間後にマンニトールを最も多く生成する菌を選別することを特徴とする新菌株カンジダ・マグノリア(Candida magnoliae)(寄託番号KCCM−10252号)の分離方法及び分離されたマンニトール生成新菌株カンジダ・マグノリア(Candida magnoliae)(寄託番号KCCM−10252号)を提供する。
【0010】
以下、本発明の新菌株カンジダ・マグノリアの分離方法を説明すれば次の通りである。
【0011】
キシリトール(xylitol)製造会社の発酵スラッジ試料を適当に希釈した後、ブドウ糖200〜400g/L、ペプトン15〜25g/L、酵母抽出物7〜15g/L、寒天(agar)12〜17g/Lが含まれた平板を使用して27〜33℃で速く生長する菌株を中心に単一コロニーを選別し、これらの選別された菌株をブドウ糖30〜70g/L、果糖50〜100g/L、酵母抽出物5〜20g/L、硫酸アンモニウム1〜5g/L、二リン酸カリウム1〜5g/Lとから構成された培地で発酵時間68〜76時間後にマンニトールを最も多く生産する菌を最終的に選別した。
【0012】
菌株の同定は26s rRNAの塩基配列を分析する方法(Kurtzman & Robnett、1998)及び形態学的、培養学的及び生理学的特性をYarrow(Elsevier Science Publishers、Amsterdam、1998)の方法に準じて調べたBarnett等(Yeasts:Characteristics and identification. Cambridge university Press、London、1983)の分類方法によって同定した。選別された菌株の26s rRNAの塩基配列及び類似種との塩基配列の分析結果を各々表1と表2に表した。
【0013】
【表1】
【0014】
【表2】
【0015】
また、形態学的特性、生理学的及び生化学的特性は表3に表し、新菌株の炭素源代謝の有無を表4に表した。
【0016】
【表3】
【0017】
【表4】
【0018】
以上のような菌株の特性を同定した結果、本菌株はカンジダ・マグノリア種の菌株と判断され、新菌株カンジダ・マグノリア(Candida magnoliae)を韓国微生物保存協会に2001年3月5日付で寄託番号KCCM−10252号で寄託した。
【0019】
本発明のマンニトール発酵生成法をさらに具体的に説明すれば次の通りである。
【0020】
本菌株の種培養のための増殖培地としては、ブドウ糖15〜25g/L、酵母抽出物7〜13g/L及びペプトン15〜25g/Lを含むYPD培地を使用し、フラスコの発酵培地としては炭素源でブドウ糖50g/L及び果糖100g/L、窒素源としては酵母抽出物及び硫酸アンモニウム、無機塩としては二リン酸カリウム、硫酸マグネシウムとから構成された培地を使用した。各成分の量はマンニトールの生産性を高めるために変更することができる。発酵槽で使用した培地は、流加式で総添加された濃度として300g/Lの果糖、ブドウ糖50g/L、酵母抽出物10g/L、二リン酸カリウム2.5g/L、硫酸アンモニウム2.5g/L、硫酸マグネシウム0.4g/Lとから構成された最適培地であった。
【0021】
種培養は冷凍保存された菌株をYPD培地50mlが入っている250mlのフラスコに接種して振とう培養器で230〜270rpm、27〜33℃で菌体濃度が3〜4g/L(約24時間)で増殖するまで行った。フラスコ培養では培地の5%に該当される種培養液を発酵培地50mlが入っている250mlのフラスコに接種して振とう培養器で210〜230rpm、27〜33℃で68〜76時間培養した。
【0022】
流加式発酵槽培養では、発酵初期に100g/Lの果糖が含まれた2Lの培地を含む5L発酵槽(韓国培養器(株))を使用した。発酵過程中に撹拌速度は200〜500rpmに調節し、通気量は0〜0.5vvmに調節した。pHは発酵全前過程の間4.5〜5.5に調節し、培養温度は27〜33℃であり、維持される果糖の濃度は50〜120g/Lに調節した。
【0023】
ブドウ糖、果糖、マンニトールの濃度は、Carbohydrate Analysisカラム(Waters、USA)を装着したHPLCのRefractive Index Detector(Waters2410、USA)を使用して測定した。この時、溶媒はアセトニトリール(acetonitrile)と水を8:2で混ぜて使用し、流速は1.5ml/分であった。菌体濃度は濁度計を使用して600nmで懸濁度を測定してあらかじめ測定した標準曲線を使用して乾燥重量に転換した。溶存酸素濃度はIngold社(Swiss、polarographic type)の溶存酸素電極を使用して特定した。
【0024】
以上のような本発明の目的と別の特徴及び長所等は、以下に参照する本発明の好適な実施例に対する以下の説明から明確になるであろう。
【0025】
【発明の実施の形態】
本発明を実施例によってより詳細に説明すれば次の通りである。
(実施例1)
種培養:キシリトール(xylitol)製造会社の発酵スラッジから分離した菌株カンジダ・マグノリア(KCCM−10252号)をYPD培地50mlが入っている250mlフラスコに接種して250rpm、30℃で24時間培養した。
【0026】
本培養:発酵培地50mlを含む250mlフラスコに種培養液を接種した後、振とう培養器で220rpmで30℃で果糖が完全に消費されるまで培養した。培地のpHは、発酵初期に5.0で調節し、その後の調節は行わなかった。この時、培地成分はブドウ糖50g/L、果糖100g/L、酵母抽出物5g/L、硫酸アンモニウム2.5g/L、二リン酸カリウム2.5g/Lであった。時間の経過によるマンニトールの生産を観察した結果を表5に表した。分離菌株の最大非増殖速度は0.26h−1、最大菌体量は3.9g/Lであり、42g/Lのマンニトールが生産された。
【0027】
【表5】
【0028】
(実施例2)
培養方法は実施例1と同様であり、ブドウ糖50g/L、果糖100g/L、硫酸アンモニウム2.5g/L、二リン酸カリウム2.5g/L、酵母抽出物5g/Lの窒素含有量に準じるそれぞれの窒素源とから構成された発酵培地で発酵時間72時間後、各種の窒素源がマンニトールの生産に及ぼす影響を観察した。各種の窒素源で培養した結果を表6に表した。マンニトールは酵母抽出物と酵母窒素(yeast nitrogen base)を除く他の有機窒素源では低い濃度を表して、酵母抽出物が最も良い窒素源であった。
【0029】
【表6】
【0030】
(実施例3)
培養方法は実施例1と同様であり、本培養で発酵培地をブドウ糖50g/L、果糖100g/L、硫酸アンモニウム2.5g/L、酵母抽出物、二リン酸カリウム2.5g/Lとして、このうち酵母抽出物の濃度を変化させて72時間培養した結果を表7に表示した。
【0031】
【表7】
【0032】
(実施例4)
培養方法は実施例1と同様であり、本培養で発酵培地をブドウ糖50g/l、果糖100g/L、酵母抽出物10g/L、硫酸アンモニウム2.5g/L、二リン酸カリウムとして、このうち二リン酸カリウムの濃度を変化させながら72時間培養した結果を表8に表示した。
【0033】
【表8】
【0034】
(実施例5)
培養方法は実施例1と同様であり、本培養で発酵培地を果糖100g/L、酵母抽出物10g/L、二リン酸カリウム2.5g/L、硫酸アンモニウム2.5g/L、硫酸マグネシウムとして、このうち硫酸マグネシウムの濃度を変化させながら30時間培養した結果を表9に表示した。
【0035】
【表9】
【0036】
(実施例6)
種培養は実施例1と同様であり、本培養で最適発酵培地(ブドウ糖50g/L、果糖100g/L、酵母抽出物10g/L、硫酸アンモニウム2.5g/L、二リン酸カリウム2.5g/L、硫酸マグネシウム0.4g/L)が3Lである5L発酵槽を使用して培養した。培養温度30℃でいろいろなpH別の実験を行った。通気量は0.5vvm、撹拌速度は200〜500rpmに調節して、pHを変化させて果糖が完全に消費されるまで培養した結果を表10に表示した。
【0037】
【表10】
【0038】
(実施例7)
培養方法と発酵培地は実施例6と同様であり、本培養で培養pHは5.0として培養温度別実験を行い、その結果を表11に表示した。
【0039】
【表11】
【0040】
(実施例8)
選定された最適培地(酵母抽出物10g/L、二リン酸カリウム2.5g/L、硫酸マグネシウム0.4g/L)で果糖の濃度を300g/Lで増加させて発酵槽で流加式培養を行った。この時、流加式培養を行った理由は、カンジダ・マグノリアの場合100g/L以上の果糖ではマンニトール生産速度が低下したためであった。培養は、発酵初期に炭素源として50g/Lのブドウ糖を含む2Lの培地を含む5L発酵槽(韓国発酵器(株))を使用した。発酵過程中に225gの果糖が含まれた250mlの溶液を4回(20h,36h,62h,90h)追加して、最終培養液の体積が3L(総添加された果糖の濃度は300g/Lに該当)になる流加式培養をした。溶存酸素は撹拌速度を500〜600rpmで調節して培養初期には20%以上維持させて菌体濃度が約5g/Lになる時点で撹拌速度を200〜350rpmに変化させて溶存酸素を制限した。pHは発酵全過程の間5.0、培養温度は30℃、通気量は0.5vvmで調節し、時間によるマンニトールの生産は表12に表した。このように流加式培養方法により300g/Lの果糖から120時間後に248g/Lのマンニトールを得た。このような結果は、果糖に対するマンニトールの収率83%とマンニトールの生産性2.07g/L−hに該当するものである。
【0041】
【表12】
【0042】
【発明の効果】
本発明の効果は天然スラッジから分離された新菌株カンジダ・マグノリア(Candida magnoliae)を使用してブドウ糖50〜100g/L、果糖50〜120g/L、酵母抽出物5〜20g/L、二リン酸カリウム1.0〜5.0g/L及び硫酸マグネシウム0.1〜0.5g/Lを含有する培地で培養して、マンニトールを高収率かつ高生産性で生産することができる。これは従来の化学合成及び発酵方法に比べて選択的、経済的、効果的にマンニトールを発酵生産できるものであり、製品品質及び国際競争力でも比較優位を占めることができる。
【0043】
以上では本発明を実施例によって詳細に説明したが、本発明は実施例によって限定されず、本発明が属する技術分野において通常の知識を有するものであれば本発明の思想と精神を離れることなく、本発明を修正または変更できるであろう。
【発明の属する技術分野】
本発明は天然から分離した、マンニトール(mannitol)を高収率かつ高生産性で生産する新菌株カンジダ・マグノリア(Candida magnoliae)、及びこれを使用して果糖(fructose)からマンニトールを製造する方法に関するものである。
【0002】
【従来の技術】
マンニトールは、六炭糖糖アルコールとして自然界では褐藻類、きのこ類、菌類等に含まれている。マンニトールは、砂糖の30〜40%の甘美度を有しており、砂糖の使用が制限される食品製造で代替甘味料で使われているだけでなく、冷飲昧、低吸湿性、流動性などの優秀な特性により製菓類の添加剤、医薬品の充填剤、界面活性剤、防水剤等でたくさん利用されている。また、低血圧治療剤の中間物質として使われて、各種医薬品製剤の製造工程で苦味を軽減させるためのコーティング剤としても利用されている等食品及び医薬品産業で広範囲に使われている。
【0003】
マンニトールは色々な果物や野菜に天然に存在するが、この場合にはきわめて微量にしか存在しないために、果物や野菜から抽出することは産業的に経済性がない。したがって、マンニトールの商業的生産方法は砂糖等から加水分解によって生成された果糖を分離して、この果糖に高温・高圧下の触媒下で化学的に水素を添加して製造する。しかし、副産物としてソルビトール(sorbitol)が作られるため別の精製工程を必要とするだけでなく、転換収率が非常に低くて製造原価が高い。また高温高圧の反応であるために危険性と廃棄物処理の問題が存在する短所がある。
【0004】
このような短所を解決するために、微生物によるマンニトール生産方法に対する多くの研究が進行されている。マンニトール生産に関連された微生物としては、酵母の場合、カンジダ・ゼイラノイド(Candida zeylannoide)、カンジダ・リフォリチカ(Candida lipolitica)、クリプトコッカス・ネオフォマンス(Cryptococcus neoformans)、トルロップシス・マンニトパシエンス(Torulopsis mannitofaciens)などがあり、細菌の場合、ラクトバチルス・ブレビス(Lactobacillus brevis)、リューコノストック・メセンテリオド(Leuconostoc mesenteriode)とマイコバクテリウム・スメグマチス(Mycobacterium smegmatis)などがあり、かびの場合ミュコ・ラウジ(Mucor rouxii)、アスペルギルス・ニデュランス(Aspergillus nidulans)、ペニシリウム・カブロサム(Penicillum scabrosum)などがある。微生物による方法は経済性が高く、ブドウ糖または果糖から特異的にマンニトールのみ生産させることができ、反応後マンニトールの分離精製過程を非常に容易にすることができるが、その生産性または収率が低いという短所を有するために産業化に難しさがある。
【0005】
【発明が解決しようとする課題】
本発明が解決すべき技術的課題は、キシリトール(xylitol)製造会社(Bolak Co.、Ltd.烏山)の発酵スラッジから高収率のマンニトール生産新菌株カンジダ・マグノリア(Candida magnoliae)を分離同定して、培養条件を最適化することによって、マンニトールを高生産性かつ高収率で製造する方法を開発したものである。
【0006】
【課題を解決するための手段】
本発明は天然スラッジから分離された新菌株カンジダ・マグノリア(Candida magnoliae)(寄託番号KCCM−10252号)を種培養し、種培養された菌株をブドウ糖、果糖、窒素源及び無機塩類を含有する培地で発酵培養させて生成されたマンニトールを分離精製することを特徴とする高収率かつ高生産性のマンニトール製造方法及びその方法で製造されたマンニトールを提供することである。
【0007】
また前記発酵培地はブドウ糖50〜100g/L、果糖50〜120g/L、酵母抽出物5〜20g/L、硫酸アンモニウム1〜5g/L、二リン酸カリウム1.0〜5.0g/L及び硫酸マグネシウム0.1〜0.5g/Lを含むことを特徴とし、前記発酵培養時の撹拌速度は200〜500rpmであり、通気量は0〜0.5vvmであり、pHは4.5〜5.5であり、培養温度は27〜35℃であることを特徴とする。
【0008】
一方、前記新菌株カンジダ・マグノリアの種培養はブドウ糖15〜25g/L、酵母抽出物7〜13g/L及びペプトン15〜25g/Lが含まれたYPD培地で行い、菌体濃度が3〜5g/Lで増殖するまで振とう培養することを特徴とする。
【0009】
また、天然スラッジの試料を希釈した後、ブドウ糖10〜20g/L、果糖18〜22g/L、ペプトン15〜25g/L、酵母抽出物7〜15g/L、寒天12〜17g/Lが含まれた平板を使用して27〜33℃で速く増殖する菌株を中心に単一コロニーを選別して、これら選別された菌株をブドウ糖30〜70g/L、果糖50〜100g/L、酵母抽出物5〜20g/L、硫酸アンモニウム1〜5g/L、二リン酸カリウム1〜5g/Lで構成された培地で発酵時間68〜76時間後にマンニトールを最も多く生成する菌を選別することを特徴とする新菌株カンジダ・マグノリア(Candida magnoliae)(寄託番号KCCM−10252号)の分離方法及び分離されたマンニトール生成新菌株カンジダ・マグノリア(Candida magnoliae)(寄託番号KCCM−10252号)を提供する。
【0010】
以下、本発明の新菌株カンジダ・マグノリアの分離方法を説明すれば次の通りである。
【0011】
キシリトール(xylitol)製造会社の発酵スラッジ試料を適当に希釈した後、ブドウ糖200〜400g/L、ペプトン15〜25g/L、酵母抽出物7〜15g/L、寒天(agar)12〜17g/Lが含まれた平板を使用して27〜33℃で速く生長する菌株を中心に単一コロニーを選別し、これらの選別された菌株をブドウ糖30〜70g/L、果糖50〜100g/L、酵母抽出物5〜20g/L、硫酸アンモニウム1〜5g/L、二リン酸カリウム1〜5g/Lとから構成された培地で発酵時間68〜76時間後にマンニトールを最も多く生産する菌を最終的に選別した。
【0012】
菌株の同定は26s rRNAの塩基配列を分析する方法(Kurtzman & Robnett、1998)及び形態学的、培養学的及び生理学的特性をYarrow(Elsevier Science Publishers、Amsterdam、1998)の方法に準じて調べたBarnett等(Yeasts:Characteristics and identification. Cambridge university Press、London、1983)の分類方法によって同定した。選別された菌株の26s rRNAの塩基配列及び類似種との塩基配列の分析結果を各々表1と表2に表した。
【0013】
【表1】
【0014】
【表2】
【0015】
また、形態学的特性、生理学的及び生化学的特性は表3に表し、新菌株の炭素源代謝の有無を表4に表した。
【0016】
【表3】
【0017】
【表4】
【0018】
以上のような菌株の特性を同定した結果、本菌株はカンジダ・マグノリア種の菌株と判断され、新菌株カンジダ・マグノリア(Candida magnoliae)を韓国微生物保存協会に2001年3月5日付で寄託番号KCCM−10252号で寄託した。
【0019】
本発明のマンニトール発酵生成法をさらに具体的に説明すれば次の通りである。
【0020】
本菌株の種培養のための増殖培地としては、ブドウ糖15〜25g/L、酵母抽出物7〜13g/L及びペプトン15〜25g/Lを含むYPD培地を使用し、フラスコの発酵培地としては炭素源でブドウ糖50g/L及び果糖100g/L、窒素源としては酵母抽出物及び硫酸アンモニウム、無機塩としては二リン酸カリウム、硫酸マグネシウムとから構成された培地を使用した。各成分の量はマンニトールの生産性を高めるために変更することができる。発酵槽で使用した培地は、流加式で総添加された濃度として300g/Lの果糖、ブドウ糖50g/L、酵母抽出物10g/L、二リン酸カリウム2.5g/L、硫酸アンモニウム2.5g/L、硫酸マグネシウム0.4g/Lとから構成された最適培地であった。
【0021】
種培養は冷凍保存された菌株をYPD培地50mlが入っている250mlのフラスコに接種して振とう培養器で230〜270rpm、27〜33℃で菌体濃度が3〜4g/L(約24時間)で増殖するまで行った。フラスコ培養では培地の5%に該当される種培養液を発酵培地50mlが入っている250mlのフラスコに接種して振とう培養器で210〜230rpm、27〜33℃で68〜76時間培養した。
【0022】
流加式発酵槽培養では、発酵初期に100g/Lの果糖が含まれた2Lの培地を含む5L発酵槽(韓国培養器(株))を使用した。発酵過程中に撹拌速度は200〜500rpmに調節し、通気量は0〜0.5vvmに調節した。pHは発酵全前過程の間4.5〜5.5に調節し、培養温度は27〜33℃であり、維持される果糖の濃度は50〜120g/Lに調節した。
【0023】
ブドウ糖、果糖、マンニトールの濃度は、Carbohydrate Analysisカラム(Waters、USA)を装着したHPLCのRefractive Index Detector(Waters2410、USA)を使用して測定した。この時、溶媒はアセトニトリール(acetonitrile)と水を8:2で混ぜて使用し、流速は1.5ml/分であった。菌体濃度は濁度計を使用して600nmで懸濁度を測定してあらかじめ測定した標準曲線を使用して乾燥重量に転換した。溶存酸素濃度はIngold社(Swiss、polarographic type)の溶存酸素電極を使用して特定した。
【0024】
以上のような本発明の目的と別の特徴及び長所等は、以下に参照する本発明の好適な実施例に対する以下の説明から明確になるであろう。
【0025】
【発明の実施の形態】
本発明を実施例によってより詳細に説明すれば次の通りである。
(実施例1)
種培養:キシリトール(xylitol)製造会社の発酵スラッジから分離した菌株カンジダ・マグノリア(KCCM−10252号)をYPD培地50mlが入っている250mlフラスコに接種して250rpm、30℃で24時間培養した。
【0026】
本培養:発酵培地50mlを含む250mlフラスコに種培養液を接種した後、振とう培養器で220rpmで30℃で果糖が完全に消費されるまで培養した。培地のpHは、発酵初期に5.0で調節し、その後の調節は行わなかった。この時、培地成分はブドウ糖50g/L、果糖100g/L、酵母抽出物5g/L、硫酸アンモニウム2.5g/L、二リン酸カリウム2.5g/Lであった。時間の経過によるマンニトールの生産を観察した結果を表5に表した。分離菌株の最大非増殖速度は0.26h−1、最大菌体量は3.9g/Lであり、42g/Lのマンニトールが生産された。
【0027】
【表5】
【0028】
(実施例2)
培養方法は実施例1と同様であり、ブドウ糖50g/L、果糖100g/L、硫酸アンモニウム2.5g/L、二リン酸カリウム2.5g/L、酵母抽出物5g/Lの窒素含有量に準じるそれぞれの窒素源とから構成された発酵培地で発酵時間72時間後、各種の窒素源がマンニトールの生産に及ぼす影響を観察した。各種の窒素源で培養した結果を表6に表した。マンニトールは酵母抽出物と酵母窒素(yeast nitrogen base)を除く他の有機窒素源では低い濃度を表して、酵母抽出物が最も良い窒素源であった。
【0029】
【表6】
【0030】
(実施例3)
培養方法は実施例1と同様であり、本培養で発酵培地をブドウ糖50g/L、果糖100g/L、硫酸アンモニウム2.5g/L、酵母抽出物、二リン酸カリウム2.5g/Lとして、このうち酵母抽出物の濃度を変化させて72時間培養した結果を表7に表示した。
【0031】
【表7】
【0032】
(実施例4)
培養方法は実施例1と同様であり、本培養で発酵培地をブドウ糖50g/l、果糖100g/L、酵母抽出物10g/L、硫酸アンモニウム2.5g/L、二リン酸カリウムとして、このうち二リン酸カリウムの濃度を変化させながら72時間培養した結果を表8に表示した。
【0033】
【表8】
【0034】
(実施例5)
培養方法は実施例1と同様であり、本培養で発酵培地を果糖100g/L、酵母抽出物10g/L、二リン酸カリウム2.5g/L、硫酸アンモニウム2.5g/L、硫酸マグネシウムとして、このうち硫酸マグネシウムの濃度を変化させながら30時間培養した結果を表9に表示した。
【0035】
【表9】
【0036】
(実施例6)
種培養は実施例1と同様であり、本培養で最適発酵培地(ブドウ糖50g/L、果糖100g/L、酵母抽出物10g/L、硫酸アンモニウム2.5g/L、二リン酸カリウム2.5g/L、硫酸マグネシウム0.4g/L)が3Lである5L発酵槽を使用して培養した。培養温度30℃でいろいろなpH別の実験を行った。通気量は0.5vvm、撹拌速度は200〜500rpmに調節して、pHを変化させて果糖が完全に消費されるまで培養した結果を表10に表示した。
【0037】
【表10】
【0038】
(実施例7)
培養方法と発酵培地は実施例6と同様であり、本培養で培養pHは5.0として培養温度別実験を行い、その結果を表11に表示した。
【0039】
【表11】
【0040】
(実施例8)
選定された最適培地(酵母抽出物10g/L、二リン酸カリウム2.5g/L、硫酸マグネシウム0.4g/L)で果糖の濃度を300g/Lで増加させて発酵槽で流加式培養を行った。この時、流加式培養を行った理由は、カンジダ・マグノリアの場合100g/L以上の果糖ではマンニトール生産速度が低下したためであった。培養は、発酵初期に炭素源として50g/Lのブドウ糖を含む2Lの培地を含む5L発酵槽(韓国発酵器(株))を使用した。発酵過程中に225gの果糖が含まれた250mlの溶液を4回(20h,36h,62h,90h)追加して、最終培養液の体積が3L(総添加された果糖の濃度は300g/Lに該当)になる流加式培養をした。溶存酸素は撹拌速度を500〜600rpmで調節して培養初期には20%以上維持させて菌体濃度が約5g/Lになる時点で撹拌速度を200〜350rpmに変化させて溶存酸素を制限した。pHは発酵全過程の間5.0、培養温度は30℃、通気量は0.5vvmで調節し、時間によるマンニトールの生産は表12に表した。このように流加式培養方法により300g/Lの果糖から120時間後に248g/Lのマンニトールを得た。このような結果は、果糖に対するマンニトールの収率83%とマンニトールの生産性2.07g/L−hに該当するものである。
【0041】
【表12】
【0042】
【発明の効果】
本発明の効果は天然スラッジから分離された新菌株カンジダ・マグノリア(Candida magnoliae)を使用してブドウ糖50〜100g/L、果糖50〜120g/L、酵母抽出物5〜20g/L、二リン酸カリウム1.0〜5.0g/L及び硫酸マグネシウム0.1〜0.5g/Lを含有する培地で培養して、マンニトールを高収率かつ高生産性で生産することができる。これは従来の化学合成及び発酵方法に比べて選択的、経済的、効果的にマンニトールを発酵生産できるものであり、製品品質及び国際競争力でも比較優位を占めることができる。
【0043】
以上では本発明を実施例によって詳細に説明したが、本発明は実施例によって限定されず、本発明が属する技術分野において通常の知識を有するものであれば本発明の思想と精神を離れることなく、本発明を修正または変更できるであろう。
Claims (4)
- 菌株カンジダ・マグノリア ( 寄託番号 KCCM- 10252号 ) を用いた、高収率かつ高生産性のマンニトール製造方法であって、
i)以下の発酵条件
a)マンニトール高収率かつ高生産のための培地組成は、ブドウ糖50〜100 g/L 、果糖50〜120 g/L 、酵母抽出物5〜20 g/L 、硫酸アンモニウム1〜5 g/L 、二リン酸カリウム1.0〜5.0 g/L 及び硫酸マグネシウム0.1〜0.5 g/L を含み、
b) pH は4.5〜5.5であり、
c)培養温度は27〜35℃であり、
d)通気量は0〜0.5 vvm であり、
e)発酵培養時の撹拌速度は200〜500 rpm である
を調整することによって前記菌株によりブドウ糖又は果糖培地を発酵させるステップと、
ii)発酵培地から細胞及び他の残渣を取り除くステップと、
iii)ステップii)の発酵培地からマンニトールを分離し回収するステップと
を含む、方法。 - 前記新菌株カンジダ・マグノリアの種培養はブドウ糖15〜25g/L、酵母抽出物7〜13g/L及びペプトン15〜25g/Lが含まれたYPD培地で行い、菌体濃度が3〜5g/Lで増殖するまで振とう培養することを特徴とする請求項1に記載のマンニトールの製造方法。
- 天然スラッジの試料を希釈した後、ブドウ糖10〜20g/L、果糖18〜22g/L、ペプトン15〜25g/L、酵母抽出物7〜15g/L、寒天(agar)12〜17g/Lが含まれた平板を使用して、27〜33℃で速く増殖する菌株を中心に単一コロニーを選別し、これらの選別された菌株をブドウ糖30〜70g/L、果糖50〜100g/L、酵母抽出物5〜20g/L、硫酸アンモニウム1〜5g/L、二リン酸カリウム1〜5g/Lとから構成された培地で68〜76時間発酵させた後にマンニトールを最も多く生成する菌を選別することを特徴とする新菌株カンジダ・マグノリア (寄託番号KCCM-10252号)の分離方法。
- 請求項3の方法によって分離されたマンニトール生成新菌株カンジダ・マグノリア (寄託番号KCCM-10252号)。
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