HRP20020131A2

HRP20020131A2 - Streptomyces avermitilis gene directing the ratio of b2:b1 avermectins

Info

Publication number: HRP20020131A2
Application number: HR20020131A
Authority: HR
Inventors: Kim Jonelle Stutzman-Engwall
Original assignee: Pfizer Prod Inc
Priority date: 1999-08-12
Filing date: 2002-02-12
Publication date: 2003-12-31
Also published as: PL353770A1; YU8402A; AP2002002417A0; US6511841B2; KR20020022809A; DE60016231T2; GT200000138CA; DE60016231D1; AU5702100A; CA2381427A1; GT200000138A; US20010024818A1; NO20020665D0; CO5290296A1; EA004569B1; HUP0202517A2; US7259241B2; US6248579B1; PA8499201A1; WO2001012822A1

Description

Područje izuma

Ovaj izum odnosi se na pripravke i postupke proizvodnje avermektina, a prvenstveno je u području veterine. Specifičnije, ovaj izum odnosi se na polinukleotidne molekule s nukleotidnim sljedovima, koji kodiraju genski produkt AveC, koji se može upotrijebiti za modulaciju odnosa klase 2:1 avermektina koje proizvode fermentacijom kulture bakterije Streptomyces avermitilis, kao i na smjese i postupke pregleda takvih polinukleotidnih molekula. Ovaj izum se također odnosi na vektore, transformirane stanice domaćina i nove mutantne sojeve bakterije S. avermitilis, u kojima je aveC gen mutirao, tako da modulira odnos klase 2:1 proizvedenih avermektina.

Pozadina izuma

1. Avermektini

Vrste roda Streptomyces proizvode široki spektar sekundarnih metabolita, uključujući avermektine, koje čini grupa od osam srodnih šesnaesteročlanih makrocikličkih laktona, s potentnim anthelmintskim i insekticidnim djelovanjem. Osam različitih, no vrlo srodnih spojeva označava se kao A1a, A1b, A2a, A2b, B1a, B1b, B2a i B2b. Serija "a" spojeva odnosi se na prirodni avermektin, gdje supstituent na C25 položaju je (S)sec-butil, a "b" serija odnosi se na one spojeve gdje supstituent na C25 položaju je izopropil. Oznake "A" i "B" odnose se na avermektine kod kojih supstituent na položaju C5 je metoksi odnosno hidroksi. Broj "1" odnosi se na avermektine kod kojih na C22,23 položaju je prisutna dvostruka veza, a broj "2" odnosi se na avermektine s vodikom na položaju C22 i hidroksi na položaju C23. Među srodnim avermektinima, smatra se da B1 tip avermektina ima najdjelotvornije antiparazitsko i pesticidno djelovanje, te je stoga tržišno najpoželjniji avermektin.

Avermektini i njihova proizvodnja aerobnom fermentacijom od strane sojeva bakterije S. avermitilis opisani su u US patentima 4310519 i 4429042. Smatra se da biosinteza prirodnih avermektina započinje endogeno, od CoA-tioesterskih analoga izomaslačne kiseline i S-(+)-2-metilmaslačne kiseline.

Kombinacija, kako poboljšanja soja slučajnom mutagenezom, tako i upotrebe egzogenih masnih kiselina dovela je do djelotvorne proizvodnje analoga avermektina. Mutanti bakterije S. avermitilis kojima nedostaje dehidrogenaza 2-oksokiselina razgranatog lanca (bkd deficijentni mutanti) mogu proizvesti avermektine samo kada se fermentacijskim smjesama doda masne kiseline. Pregled i izolacija mutanata kod kojih ne postoji aktivnost dehidrogenaze razgranatog lanca (npr. S. avermitilis, ATCC 53567) opisani su u Evropskom patentu (EP) 276103. Fermentacija takvih mutanata u prisustvu egzogenih masnih kiselina rezultira proizvodnjom samo četiri avermektina, koji odgovaraju upotrijebljenim masnim kiselinama. Stoga, dodavanje S-(+)-2-metilmaslačne kiseline fermentacijskim smjesama bakterije S. avermitilis (ATCC 53567) rezultira proizvodnjom prirodnih avermektina, A1a, A2a, B1a i B2a; dodavanje izomaslačne kiseline fermentacijskim smjesama rezultira proizvodnjom prirodnih avermektina, A1b, A2b, B1b i B2b; te dodavanje ciklopentankarboksilne kiseline fermentacijskoj smjesi rezultira proizvodnjom četiri nova ciklopentilavermektina, A1, A2, B1 i B2.

Ukoliko se vrši dodavanje drugih masnih kiselina, proizvodi se nove avermektine. Pregledom preko 800 mogućih prekursora, identificirano je više od 60 novih avermektina (vidjeti, npr. Dutton i drugi: "J. Antibiot.", 44: 357-365, (1991.); i Banks i drugi: "Roy. Soc. Chem.", 147: 16-26, (1994.)). Osim toga, mutanti deficijentni u aktivnosti 5-O-metiltransferaze, uglavnom proizvode samo B analoge avermektina. Prema tome, S. avermitilis mutanti kojima nedostaje aktivnost dehidrogenaze 2-oksokiselina razgranatog lanca i aktivnost 5Ometiltransferaze proizvode samo B avermektine koji odgovaraju masnoj kiselini upotrijebljenoj kao dodatak fermentacijskoj smjesi. Stoga, dodavanje S-(+)-2-metilmaslačne kiseline takvim dvostrukim mutantima rezultira proizvodnjom samo prirodnih avermektina B1a i B2a, dok dodatak izomaslačne kiseline ili ciklopentankarboksilne kiseline rezultira proizvodnjom prirodnih avermektina B1b i B2b, odnosno novih ciklopentil B1 i B2 avermektina. Dodavanje cikloheksankarboksilne kiseline dvostruko mutantnom soju je poželjan postupak proizvodnje tržišno važnog novog avermektina, cikloheksilavermektina B1 (doramektina). Izolaciju i karakteristike takvih dvostrukih mutanata, npr. S. avermitilis (ATCC 53692), opisuje se u EP 276103.

2. Geni uključeni u biosintezu avermektina

U mnogim slučajevima, geni uključeni u proizvodnju sekundarnih metabolita i geni koji kodiraju specifične antibiotike grupirani su zajedno na kromosomu. Takav je slučaj npr. sa Streptomyces poliketidnom sintaznom genskom grupom (polyketide synthase, PKS) (vidjeti, Hopwod i Sherman: "Ann. Rev. Genet.", 24: 37-66, (1990.)). Stoga, jedna strategija kloniranja gena u biosintetskom putu bila je izoliranje gena za otpornost na antibiotike i nakon toga testiranje susjednih kromosomskih regija u pogledu drugih gena povezanih s biosintezom tog antibiotika. Druga strategija kloniranja gena uključenih u biosintezu važnih metabolita bila je komplementacija mutanata. Primjerice, dijelove biblioteke DNA iz organizma sposobnog proizvesti određeni metabolit uvodi se u neproduktivnog mutanta, nakon čega se vrši pregled transformanata na proizvodnju metabolita. Osim toga, radi određivanja i kloniranja gena u biosintetskim putovima, upotrebljava se hibridizacija biblioteke sondama izvedenim iz drugih Streptomyces vrsta.

Uočeno je da su geni uključeni u biosintezu avermektina (ave geni), poput gena nužnih za biosintezu drugih Streptomyces sekundarnih metabolita (npr. PKS), grupirani na kromosomu. Određen broj ave gena uspješno je kloniran vektorima za komplementaciju S. avermitilis mutanata, blokiranih u biosintezi avermektina. Kloniranje takvih gena opisano je u US patentu 5252474. Osim toga, Ikeda i drugi: "J. Antibiot.", 48: 532-534, (1995.), opisuju smještavanje kromosomske regije, koja uključuje korak dehidratacije C22,23 (aveC), u 4,82 kb BamHI fragment iz bakterije S. avermitilis, kao i mutacije u aveC genu, koje rezultiraju dobivanjem jednokomponentnog B2a proizvođača. Kako se ivermektin, potentni anthelmintski spoj, može kemijski dobiti iz avermektina B2a, takav jednokomponentni proizvođač avermektina B2a smatra se osobito korisnim za komercijalnu proizvodnju ivermektina.

Određivanje mutacija u aveC genu koje umanjuju složenost proizvodnje avermektina, kao što su, npr. mutacije koje smanjuju odnos B2:B1 avermektina, pojednostavilo bi proizvodnju i pročišćavanje tržišno važnih avermektina.

Bit izuma

Ovaj izum odnosi se na izoliranu polinukleotidnu molekulu, koja sadrži potpuni aveC ORF iz bakterije S. avermitilis ili njegov bitan dio, gdje toj izoliranoj polinukleotidnoj molekuli nedostaje slijedeći potpuni ORF, smješten nizvodno od aveC ORF-a in situ u S. avermitilis kromosomu. Izolirana polinukleotidna molekula prema ovom izumu po mogućnosti sadrži nukleotidni slijed isti kao slijed iz plazmida pSE186 (ATCC 209604), koji kodira S. avermitilis genski produkt AveC, ili isti kao nukleotidni slijed aveC ORF-a sa Slike 1 (SEQ ID NO: 1), ili njegov bitan dio. Ovaj izum se također odnosi na izoliranu polinukleotidnu molekulu s nukleotidnim slijedom SEQ ID NO: 1 ili njegovom degeneriranom varijantom.

Ovaj izum se također odnosi na izoliranu polinukleotidnu molekulu s nukleotidnim slijedom homolognim slijedu iz plazmida pSE186 (ATCC 209604), koji kodira S. avermitilis genski produkt AveC, ili nukleotidnom slijedu aveC ORF-a prikazanog na Slici 1 (SEQ ID NO: 1), ili njegovom bitnom dijelu.

Ovaj izum se također odnosi na izoliranu polinukleotidnu molekulu s nukleotidnim slijedom koji kodira polipeptid s aminokiselinskim slijedom homolognim aminokiselinskom slijedu kojeg kodira slijed iz plazmida pSE186 (ATCC 209604), koji kodira genski produkt AveC, ili aminokiselinskom slijedu sa Slike 1 (SEQ ID NO: 2), ili njegovom bitnom dijelu.

Ovaj izum se također odnosi na izoliranu polinukleotidnu molekulu s nukleotidnim slijedom koji kodira homolog genskog produkta AveC. U poželjnoj izvedbi, izolirana polinukleotidna molekula sadrži nukleotidni slijed koji kodira homolog genskog produkta AveC iz bakterije S. hygroscopicus, gdje homolog genskog produkta sadrži aminokiselinski slijed SEQ ID NO: 4, ili njegov bitan dio. U poželjnoj izvedbi, izolirana polinukleotidna molekula prema ovom izumu, koja kodira S. hygroscopicus homolog genskog produkta AveC, sadrži nukleotidni slijed SEQ ID NO: 3, ili njegov bitan dio.

Ovaj izum se također odnosi na izoliranu polinukleotidnu molekulu s nukleotidnim slijedom homolognim S. hygroscopicus nukleotidnom slijedu SEQ ID NO: 3. Ovaj izum se također odnosi na izoliranu polinukleotidnu molekulu s nukleotidnim slijedom koji kodira polipeptid homologan S. hygroscopicus homologu genskog produkta AveC, s aminokiselinskim slijedom SEQ ID NO: 4.

Ovaj izum se također odnosi na oligonukleotide koji hibridiziraju s polinukleotidnom molekulom, s nukleotidnim slijedom sa Slike 1 (SEQ ID NO: 1) ili SEQ ID NO: 3, ili s polinukleotidnom molekulom, s nukleotidnim slijedom koji je komplement nukleotidnog slijeda sa Slike 1 (SEQ ID NO: 1) ili SEQ ID NO: 3.

Ovaj izum se također odnosi na rekombinantne klonske vektore i ekspresijske vektore korisne u kloniranju ili ekspresiji polinukleotida prema ovom izumu, uključujući polinukleotidne molekule koje sadrže aveC ORF iz bakterije S. avermitilis, ili homolog aveC ORF-a. U neograničavajućoj izvedbi, ovaj izum odnosi se na plazmid pSE186 (ATCC 209604), koji sadrži cijeli ORF aveC gena iz bakterije S. avermitilis. Ovaj izum se također odnosi na transformirane stanice domaćina koje sadrže polinukleotidnu molekulu ili rekombinantni vektor prema ovom izumu, te na nove sojeve i stanične linije izvedene iz njih.

Ovaj izum se također odnosi na rekombinantno eksprimirani genski produkt AveC ili homolog genskog produkta AveC, ili njihov bitan dio, koji je uglavnom pročišćen ili izoliran, kao i na njihove homologe. Ovaj izum se također odnosi na postupak proizvodnje rekombinantnog genskog produkta AveC, koji se sastoji u kultiviranju stanica domaćina s rekombinantnim ekspresijskim vektorom, gdje navedeni ekspresijski vektor sadrži polinukleotidnu molekulu s nukleotidnim slijedom koji kodira genski produkt AveC ili homolog genskog produkta AveC, gdje je ta polinukleotidna molekula u operativnoj asocijaciji s jednim ili više regulacijskih elemenata, koji kontroliraju ekspresiju polinukleotidne molekule u stanici domaćina, pod uvjetima pogodnim za proizvodnju rekombinantnog genskog produkta AveC ili homologa genskog produkta AveC, te u prikupljanju genskog produkta AveC ili homologa genskog produkta AveC iz kulture stanica.

Ovaj izum se također odnosi na polinukleotidnu molekulu s nukleotidnim slijedom inače istim kao S. avermitilis AveC alel, ili slijed iz plazmida pSE186 (ATCC 209604), koji kodira genski produkt AveC, ili njegova degenerirana varijanta, ili nukleotidni slijed aveC ORF-a iz bakterije S. avermitilis, kao što je prikazano na Slici 1 (SEQ ID NO: 1), ili njegova degenerirana varijanta, ali koja također sadrži jednu ili više mutacija, tako da stanice S. avermitilis soja ATCC 53692 kod kojih je inaktiviran divlji tip aveC alela i koje eksprimiraju polinukleotidnu molekulu mutiranog nukleotidnog slijeda, proizvode različit odnos ili količinu avermektina u usporedbi s onom koju proizvode stanice S. avermitilis soja ATCC 53692, koje umjesto toga eksprimiraju samo divlji tip aveC alela. Prema ovom izumu, takve polinukleotidne molekule može se upotrijebiti u dobivanju novih sojeva bakterije S. avermitilis, koji pokazuju uočljivu promjenu u proizvodnji avermektina, u usporedbi s istim sojem koji eksprimira samo divlji tip aveC alela. U poželjnoj izvedbi, takve polinukleotidne molekule korisne su u dobivanju novih sojeva bakterije S. avermitilis, koji proizvode avermektine u smanjenom odnosu klase 2:1 u usporedbi s istim sojem, koji umjesto toga eksprimira samo divlji tip aveC alela. U daljnjoj poželjnoj izvedbi, takve polinukleotidne molekule su korisne u dobivanju novih sojeva S. avermitilis, koji proizvode avermektine u povećanim količinama u usporedbi s istim sojem, koji umjesto toga eksprimira samo jedan divlji tip aveC alela. U daljnjoj poželjnoj izvedbi, takve polinukleotidne molekule korisne su u dobivanju novih sojeva bakterije S. avermitilis, u kojima je inaktiviran aveC gen.

Ovaj izum odnosi se na postupke određivanja mutacija aveC ORF-a iz bakterije S. avermitilis, koje mogu promijeniti odnos i/ili količinu proizvedenih avermektina. U poželjnoj izvedbi, ovaj izum odnosi se na postupak određivanja mutacija aveC ORF-a, koje mogu promijeniti odnos klase 2:1 proizvedenih avermektina, a koji se sastoji u: (a) određivanju odnosa klase 2:1 avermektina, koje proizvode stanice soja bakterije S. avermitilis kod kojeg je nativni aveC alel inaktiviran i kod koga je uvedena i eksprimirana polinukleotidna molekula s nukleotidnim slijedom koji kodira mutirani genski produkt AveC; (b) određivanju odnosa klase 2:1 avermektina koje proizvode stanice istog soja bakterije S. avermitilis kao u koraku (a), ali koje umjesto toga eksprimiraju samo divlji tip aveC alela ili ORF-a sa Slike 1 (SEQ ID NO: 1) ili nukleotidni slijed koji im je homologan; i (c) usporedbi odnosa klase 2:1 avermektina koje proizvode S. avermitilis stanice iz koraka (a) s odnosom klase 2:1 avermektina koje proizvode S. avermitilis stanice iz koraka (b); stoga, ako je odnos klase 2:1 avermektina koje proizvode S. avermitilis stanice iz koraka (a) različit od odnosa klase 2:1 avermektina koje proizvode S. avermitilis stanice iz koraka (b), mutacija aveC ORF koja može promijeniti odnos klase 2:1 avermektina je određena. U poželjnoj izvedbi, odnos klase 2:1 avermektina je smanjen mutacijom.

U daljnjoj poželjnoj izvedbi, ovaj izum odnosi se na postupak određivanja mutacija aveC ORF-a ili genskih konstrukata koji sadrže aveC ORF, koje mogu promijeniti količinu avermektina, koji se sastoji u: (a) određivanju količine avermektina koje proizvode stanice soja bakterije S. avermitilis kod kojeg je nativni aveC alel inaktiviran i kod koga je uvedena i eksprimirana polinukleotidna molekula s nukleotidnim slijedom koji kodira mutirani genski produkt AveC ili koja sadrži genetički konstrukt koji sadrži nukleotidni slijed koji kodira genski produkt AveC; (b) određivanju količine avermektina koje proizvode stanice istog soja S. avermitilis kao u koraku (a), ali koje umjesto toga eksprimiraju samo jedan divlji tip aveC alela s nukleotidnim slijedom ORF-a sa Slike 1 (SEQ ID NO: 1) ili nukleotidnim slijed koji mu je homologan; i (c) usporedbi količine avermektina koje proizvode S. avermitilis stanice iz koraka (a) s količinom avermektina koje proizvode S. avermitilis stanice iz koraka (b); stoga, ako je količina avermektina koje proizvode S. avermitilis stanice iz koraka (a) različita od količine avermektina koje proizvode S. avermitilis stanice iz koraka (b), mutacija aveC ORF ili genskog konstrukta koja može promijeniti količinu avermektina je određena. U poželjnoj izvedbi, odnos klase 2:1 avermektina je smanjen mutacijom. U poželjnoj izvedbi, količina avermektina je povećana mutacijom.

Ovaj izum se također odnosi na rekombinantne vektore korisne za dobivanje novih sojeva bakterije S. avermitilis koji imaju promijenjenu proizvodnju avermektina. Primjerice, ovaj izum odnosi se na vektore koje se može upotrijebiti za usmjereno uvođenje bilo koje polinukleotidne molekule koja sadrži mutirane polinukleotidne sljedove prema ovom izumu na mjesto aveC gena na S. avermitilis kromosomu, kako bi se insertiralo ili zamijenilo aveC alel ili ORF ili njihov dio homologom rekombinacijom. Prema ovom izumu, međutim, polinukleotidna molekula s mutiranim nukleotidnim slijedom prema ovom izumu koju se ovdje opisuje, može također modulirati biosintezu avermektina kad je se insertira u S. avermitilis kromosom, na mjesto koje nije aveC gen, ili kada je se održava u obliku episoma u S. avermitilis stanicama. Stoga, ovaj izum također opisuje vektore koji sadrže polinukleotidnu molekulu s mutiranim nukleotidnim slijedom prema ovom izumu, gdje se ove vektore može upotrijebiti za inserciju polinukleotidne molekule na mjesto u S. avermitilis kromosomu, koje nije mjesto aveC gena, ili održavati u obliku episoma. U poželjnoj izvedbi, ovaj izum odnosi se na vektore genske zamjene, koje se može upotrijebiti za inserciju mutiranog aveC alela u S. avermitilis kromosom, kako bi se dobilo nove sojeve stanica koji proizvode avermektine u smanjenom odnosu klase 2:1, u usporedbi sa stanicama istog soja, koje umjesto toga eksprimiraju samo divlji tip aveC alela.

Ovaj izum se također odnosi na postupke dobivanja novih sojeva bakterije S. avermitilis, koje čine stanice koje eksprimiraju mutirani aveC alel i koje proizvode promijenjeni odnos i/ili količinu avermektina, u usporedbi sa stanicama istog soja bakterije S. avermitilis, koje umjesto toga eksprimiraju samo divlji tip aveC alela. U poželjnoj izvedbi, ovaj izum odnosi se na postupak dobivanja novih sojeva bakterije S. avermitilis, koje čine stanice koje eksprimiraju mutirani aveC alel i koje proizvode avermektine u promijenjenom odnosu klase 2:1, u usporedbi sa stanicama istog soja bakterije S. avermitilis, koje eksprimiraju samo divlji tip aveC alela, koji se sastoji u transformaciji stanica soja bakterije S. avermitilis vektorom koji nosi mutirani aveC alel, koji kodira genski produkt koji mijenja odnos klasa 2:1 avermektina, koje proizvode stanice soja bakterije S. avermitilis, koje eksprimiraju mutirani alel, u usporedbi sa stanicama istog soja koje eksprimiraju samo divlji tip aveC alela, i selekciji transformiranih stanica, koje proizvode avermektine u promijenjenom odnosu klase 2:1, u usporedbi s odnosom klase 2:1 avermektina, koje proizvode stanice soja koji umjesto toga eksprimira divlji tip aveC alela. U poželjnoj izvedbi, odnos klase 2:1 proizvedenih avermektina smanjen je kod stanica novog soja.

U daljnjoj poželjnoj izvedbi, ovaj izum odnosi se na postupak dobivanja novih sojeva bakterije S. avermitilis, koje čine stanice koje proizvode promijenjene količine avermektina, koji se sastoji u transformaciji stanica soja bakterije S. avermitilis vektorom koji nosi mutirani aveC alel ili genetički konstrukt koji sadrži aveC alel, čija ekspresija rezultira promijenjenom količinom avermektina, koje proizvode stanice soja bakterije S. avermitilis koje eksprimiraju mutirani aveC alel ili genetički konstrukt, u usporedbi sa stanicama istog soja koje umjesto toga eksprimiraju samo divlji tip aveC alela, i odabiru transformiranih stanica koje proizvode avermektine u promijenjenoj količini, u usporedbi s količinom avermektina koje proizvode stanice istog soja, koje umjesto toga eksprimiraju samo divlji tip aveC alela. U poželjnoj izvedbi, količina proizvedenih avermektina je povećana u stanicama novog soja.

U daljnjoj poželjnoj izvedbi, ovaj izum odnosi se na postupak dobivanja novih sojeva bakterije S. avermitilis, čije stanice sadrže inaktivirani aveC alel, koji se sastoji u transformaciji stanica soja bakterije S. avermitilis, koji eksprimira bilo koji aveC alel, vektorom koji inaktivira aveC alel i selekciji transformiranih stanica u kojima je aveC alel inaktiviran.

Ovaj izum se također odnosi na nove sojeve bakterije S. avermitilis, koje čine stanice transformirane bilo kojom polinukleotidnom molekulom ili vektorom s mutiranim nukleotidnim slijedom prema ovom izumu. U poželjnoj izvedbi, ovaj izum odnosi se na nove sojeve bakterije S. avermitilis, koje čine stanice koje eksprimiraju mutirani aveC alel umjesto, ili uz divlji tip aveC alela, gdje stanice novog soja proizvode avermektine u promijenjenom odnosu klase 2:1, u usporedbi sa stanicama istog soja, koje umjesto toga eksprimiraju samo divlji tip aveC alela. U poželjnijoj izvedbi, stanice novog soja proizvode avermektine u smanjenom odnosu klase 2:1, u usporedbi sa stanicama istog soja, koje umjesto toga eksprimiraju samo divlji tip aveC alela. Takvi novi sojevi korisni su u industrijskoj proizvodnji tržišno poželjnih avermektina, poput doramektina.

U daljnjoj poželjnoj izvedbi, ovaj izum se odnosi na nove sojeve bakterije S. avermitilis, koje čine stanice koje eksprimiraju mutirani aveC alel, ili genetički konstrukt koji sadrži aveC alel, umjesto ili uz njihov nativni aveC alelu, što rezultira proizvodnjom promijenjene količine avermektina od strane stanica, u usporedbi s količinom avermektina koje proizvode stanice istog soja, koje umjesto toga eksprimiraju samo divlji tip aveC alela. U poželjnoj izvedbi, nove stanice proizvode povećanu količinu avermektina.

U daljnjoj poželjnoj izvedbi, ovaj izum odnosi se na nove sojeve bakterije S. avermitilis, koje čine stanice u kojima je aveC gen inaktiviran. Takvi sojevi korisni su kako zbog širokog spektra avermektina koje proizvode u odnosu na sojeve divljeg tipa, tako i u preglednim testovima komplementacije, kao što je ovdje opisano, kako bi se odredilo utječe li usmjerena ili slučajna mutageneza aveC gena na proizvodnju avermektina.

Ovaj izum se također odnosi na postupak proizvodnje avermektina, koji se sastoji u kultiviranju stanica soja bakterije S. avermitilis, pri čemu te stanice eksprimiraju mutirani aveC alel, koji kodira genski produkt koji mijenja odnos klase 2:1 avermektina, koje proizvode stanice soja bakterije S. avermitilis, koje eksprimiraju mutirani aveC alel, u usporedbi sa stanicama istog soja koje ne eksprimiraju mutirani aveC alel, već umjesto toga eksprimiraju samo divlji tip aveC alela, u mediju za kulturu, pod uvjetima koji omogućuju ili induciraju proizvodnju avermektina od strane istih, te prikupljanju navedenih avermektina iz kulture. U poželjnoj izvedbi, odnos klase 2:1 avermektina koje proizvode stanice koje eksprimiraju mutaciju je smanjen. Ovaj proces opisuje povećanu djelotvornost u proizvodnji tržišno vrijednih avermektina, kao što je doramektin.

Ovaj izum se također odnosi na postupak proizvodnje avermektina, koji se sastoji u kultiviranju stanica soja bakterije S. avermitilis, gdje te stanice eksprimiraju mutirani aveC alel ili genetički konstrukt koji sadrži aveC alel, što rezultira proizvodnjom promijenjene količine avermektina koje proizvode stanice soja S. avermitilis, koje eksprimiraju mutirani aveC alel ili genetički konstrukt, u usporedbi sa stanicama istog soja koje ne eksprimiraju mutirani aveC alel ili genetički konstrukt, već umjesto toga eksprimiraju samo divlji tip aveC alela, u mediju za kulturu pod uvjetima koji omogućuju ili induciraju njihovu proizvodnju avermektina, te prikupljanju navedenih avermektina iz kulture. U poželjnoj izvedbi, količina avermektina koje proizvode stanice koje eksprimiraju mutaciju ili genetički konstrukt je povećana.

Ovaj izum se također odnosi na novu smjesu avermektina koju proizvodi soj bakterije S. avermitilis, koji eksprimira mutirani aveC alel prema ovom izumu, gdje su avermektini proizvedeni u smanjenom odnosu klase 2:1, u usporedbi s odnosom klase 2:1 avermektina koje proizvode stanice istog soja bakterije S. avermitilis, koje ne eksprimiraju mutantni aveC alel, već umjesto toga eksprimiraju samo divlji tip aveC alela. Nova smjesa avermektina može biti prisutna kao što je proizvedena u tekućini za fermentacijsku kulturu, ili je se može odatle prikupiti i odatle se može djelomično ili potpuno pročistiti.

Kratki opis slika

Slika 1. Slijed DNA (SEQ ID NO: 1) koji sadrži S. avermitilis aveC ORF, te izvedeni aminokiselinski slijed (SEQ ID NO: 2).

Slika 2. Plazmidni vektor pSE186 (ATCC 209604) koji sadrži potpuni ORF aveC gena iz bakterije S. avermitilis.

Slika 3. Vektor genske zamjene pSE180 (ATCC 209605) koji sadrži ermE gen iz bakterije Sacc. erythraea, insertiran u aveC ORF iz bakterije S. avermitilis.

Slika 4. BamHI restrikcijska mapa avermektinske poliketidne sintazne genske grupe iz bakterije S. avermitilis s pet određenih preklapajućih kozmidnih klonova (npr. pSE65, pSE66, pSE67, pSE68, pSE69). Prikazan je i odnos između pSE118 i pSE119.

Slika 5. HPLC analiza produkata fermentacije koje proizvode S. avermitilis sojevi. Kvantifikaciju istaknutih vrijednosti provodi se usporedbom sa standardnim količinama cikloheksil B1. Vrijeme zadržavanja cikloheksil B2 bilo je 7,4-7,7 minuta; vrijeme zadržavanja cikloheksil B1 bilo je 11,9-12,3 minuta.

Slika 5A. S. avermitilis soj SE180-11 s inaktiviranim aveC ORF.

Slika 5B. S. avermitilis soj SE180-11 transformiran s pSE186 (ATCC 209604).

Slika 5C. S. avermitilis soj SE180-11 transformiran s pSE187.

Slika 5D. S. avermitilis soj SE180-11 transformiran s pSE188.

Slika 6. Usporedba izvedenih aminokiselinskih sljedova koje kodira aveC ORF iz bakterije S. avermitilis (SEQ ID NO: 2), djelomični homolog aveC ORF-a iz bakterije S. griseochromogenes (SEQ ID NO: 5), te homolog aveC ORF-a iz bakterije S. hygroscopicus (SEQ ID NO: 4). Valinski ostatak u masno tiskanom tekstu je moguće startno mjesto za protein. Konzervirani ostaci prikazani su velikim slovima za homologiju u sva tri slijeda, a malim slovima za homologiju u 2 od 3 slijeda. Aminokiselinski sljedovi sadrže približno 50 % istovjetnosti sljedova.

Slika 7. Hibridni plazmidni konstrukt koji sadrži 564 bp BsaAI/KpnI fragment iz bakterije S. hygroscopicus, homologan aveC genu, insertiran na BsaA/KpnI mjesto u S. avermitilis aveC ORF.

Detaljni opis izuma

Ovaj izum odnosi se na određivanje i karakterizaciju polinukleotidnih molekula s nukleotidnim sljedovima koji kodiraju genski produkt AveC iz bakterije S. avermitilis, konstrukciju novih sojeva bakterije S. avermitilis koje se može upotrijebiti za pregled djelovanja mutiranih genskih produkata AveC na proizvodnju avermektina, te na otkriće da određeni mutirani genski produkti AveC mogu smanjiti odnos B2:B1 avermektina koje proizvodi bakteija S. avermitilis. Ovaj izum opisan je, putem primjera, u poglavljima niže, u odnosu na polinukleotidnu molekulu s nukleotidnim slijedom istim kao slijed iz plazmida pSE186 (ATCC 209604), koji kodira S. avermitilis genski produkt AveC, ili nukleotidni slijed ORF-a sa Slike 1 (SEQ ID NO: 1), te na polinukleotidne molekule, s mutiranim nukleotidnim sljedovima izvedenim iz njih i njihove degenerirane varijante. Međutim, gore navedene principe prema ovom izumu može se analogno primijeniti na druge polinukleotidne molekule, uključujući homologe aveC gena iz drugih vrsta roda Streptomyces uključujući, primjerice, bakterije S. hygroscopicus i S. griseochromogenes, između ostalih.

1. Polinukleotidne molekule koje kodiraju genski produkt AveC S. avermitilis

Ovaj izum odnosi se na izoliranu polinukleotidnu molekulu koja sadrži potpuni aveC ORF iz bakterije S. avermitilis ili bitan njegov dio, pri čemu toj izoliranoj polinukleotidnoj molekuli nedostaje slijedeći potpuni ORF, smješten nizvodno od aveC ORF-a in situ u S. avermitilis kromosomu.

Izolirana polinukleotidna molekula prema ovom izumu po mogućnosti sadrži nukleotidni slijed isti kao slijed iz plazmida pSE186 (ATCC 209604), koji kodira S. avermitilis genski produkt AveC, ili isti kao nukleotidni slijed ORF-a sa Slike 1 (SEQ ID NO: 1), ili njegov bitan dio. Kao što se ovdje upotrebljava, "bitan dio" izolirane polinukleotidne molekule, s nukleotidnim slijedom koji kodira S. avermitilis genski produkt AveC, odnosi se na izoliranu polinukleotidnu molekulu koja sadrži najmanje 70 % slijeda potpunog aveC ORF-a, prikazanog na Slici 1 (SEQ ID NO: 1), koji kodira funkcionalno ekvivalentni genski produkt AveC. U tom pogledu, "funkcionalno ekvivalentan" genski produkt AveC definira se kao genski produkt što, kada ga se eksprimira u S. avermitilis soju ATCC 53692 u kojem je nativni aveC alel inaktiviran, rezultira proizvodnjom uglavnom istog odnosa i količine avermektina koje proizvodi S. avermitilis soj ATCC 53692, koji umjesto toga eksprimira samo funkcionalni divlji tip aveC alela, što prirodno karakterizira S. avermitilis soj ATCC 53692.

Osim nukleotidnog slijeda aveC ORF, izolirana polinukleotidna molekula prema ovom izumu može također sadržavati nukleotidne sljedove koji su prirodnom stanju pobočni aveC genu in situ u bakteriji S. avermitilis, poput onih pobočnih nukleotidnih sljedova prikazanih na Slici 1 (SEQ ID NO: 1).

Ovaj izum se također odnosi na izoliranu polinukleotidnu molekulu s nukleotidnim slijedom SEQ ID NO: 1 ili njegovom degeneriranom varijantom.

Kao što se ovdje upotrebljava, namjera je da se izrazi "polinukleotidna molekula", "polinukleotidni slijed", "kodirajući slijed", "otvoreni okvir čitanja (open reading frame)" i "ORF" odnose i na DNA i na RNA molekule, od kojih svaka može biti jednolančana ili dvolančana, a koje mogu biti transkribirane i translatirane (DNA) ili translatirane (RNA) u genski produkt AveC, ili, kao što je opisano niže, u homolog genskog produkta AveC, ili u polipeptid homologan genskom produktu AveC ili homologu genskog produkta AveC, u odgovarajućem ekspresijskom sustavu stanice domaćina, kada ih se stavi pod kontrolu odgovarajućih regulacijskih elemenata. Kodirajući slijed može uključivati, ali nije ograničen na prokariotske sljedove, cDNA sljedove, sljedove genomske DNA i kemijski sintetizirane DNA i RNA sljedove.

Nukleotidni slijed prikazan na Slici 1 (SEQ ID NO: 1) sadrži četiri različita GTG kodona na položajima bp (baznih parova) 42, 174, 177, 180. Kao što je opisano u Poglavlju 9 niže, višestruke delecije 5' regije aveC ORF-a (Slika 1; SEQ ID NO: 1) konstruirane su kako bi se omogućilo određivanje koji bi od ovih kodona mogao funkcionirati u aveC ORF-u kao startno mjesto ekspresije proteina. Delecija prvog GTG mjesta na bp 42 nije uklonila AveC aktivnost. Dodatna delecija svih GTG kodona na položajima bp 174, 177 i 180 zajedno, uklonila je AveC aktivnost, ukazujući na to da je ova regija nužna za ekspresiju proteina. Ovaj izum stoga obuhvaća aveC ORF-ove različitih duljina.

Ovaj izum se također odnosi na polinukleotidnu molekulu s nukleotidnim slijedom homolognim slijedu iz plazmida pSE186 (ATCC 209604), koji kodira S. avermitilis genski produkt AveC, ili nukleotidnom slijedu aveC ORF-a prikazanog na Slici 1 (SEQ ID NO: 1), ili njegovom bitnom dijelu. Izraz "homologan", kada ga se upotrebljava u odnosu na polinukleotidnu molekulu homolognu slijedu koji kodira S. avermitilis genski produkt AveC, odnosi se na polinukleotidnu molekulu s nukleotidnim slijedom: (a) koji kodira isti genski produkt AveC kao slijed iz plazmida pSE186 (ATCC 209604), koji kodira S. avermitilis genski produkt AveC, ili koji kodira isti genski produkt AveC kao nukleotidni slijed aveC ORF-a prikazan na Slici 1 (SEQ ID NO: 1), ali koji uključuje jednu ili više tihih promjena nukleotidnog slijeda, u skladu s degeneriranošću genetskog koda (tj. degenerirana varijanta); ili (b) koji hibridizira s komplementom polinukleotidne molekule, s nukleotidnim slijedom koji kodira aminokiselinski slijed kojeg kodira slijed iz plazmida pSE186 (ATCC 209604), koji kodira genski produkt AveC, ili koji kodira aminokiselinski slijed prikazan na Slici 1 (SEQ ID NO: 2), pod umjereno strogim uvjetima, npr. hibridizacija s DNA vezanom na filter u 0,5 M NaHPO4, 7 % natrij-dodecil-sulfatu (sodium dodecyl sulfate, SDS), 1 mM EDTA na 65 °C, i uz ispiranje u 0,2 × SSC/0,1 % SDS na 42 °C (vidjeti, Ausubel i drugi: "Current Protocols in Molecular Biology", Svezak I, poglavlje 2.10.3, (1989.), izdanje Green Publishing Associates Inc., John Wiley & Sons Inc., New York), a kodira funkcionalno ekvivalentni genski produkt AveC, kao što je definirano gore. U poželjnoj izvedbi, homologna polinukleotidna molekula hibridizira s komplementom nukleotidnog slijeda iz plazmida pSE186 (ATCC 209604), koji kodira genski produkt AveC ili s komplementom nukleotidnog slijeda aveC ORF-a, prikazanog na Slici 1 (SEQ ID NO: 1), ili njegovim bitnim dijelom, pod veoma strogim uvjetima, npr. hibridizacija s DNA vezanom na filter u 0,5 M NaHPO4, 7 % SDS, 1 mM EDTA na 65 °C, i uz ispiranje u 0,1 × SSC/0,1 % SDS na 68 °C (Ausubel i drugi: (1989.), gore navedeno), a kodira funkcionalni ekvivalentni genski produkt AveC, kao što je definirano gore.

Aktivnost genskog produkta AveC i njegovih potencijalnih funkcionalnih ekvivalenata može se odrediti HPLC analizom produkata fermentacije, kao što je opisano u primjerima niže. Polinukleotidne molekule s nukleotidnim sljedovima koji kodiraju funkcionalne ekvivalente S. avermitilis genskog produkta AveC uključuju prirodne aveC gene, prisutne u drugim sojevima bakterije S. avermitilis, homologe aveC gena prisutne u drugim vrstama roda Streptomyces i mutirane aveC alele, bilo prirodne ili konstruirane.

Ovaj izum se također odnosi na polinukleotidnu molekulu s nukleotidnim slijedom koji kodira polipeptid s aminokiselinskim slijedom homolognim aminokiselinskom slijedu kojeg kodira slijed iz plazmida pSE186 (ATCC 209604), koji kodira genski produkt AveC, ili aminokiselinski slijed prikazan na Slici 1 (SEQ ID NO: 2), ili njegov bitan dio. Kao što se ovdje upotrebljava, "bitan dio" aminokiselinskog slijeda sa Slike 1 (SEQ ID NO: 2) odnosi se na polipeptid koji sadrži najmanje oko 70 % aminokiselinskog slijeda prikazanog na Slici 1 (SEQ ID NO: 2) i koji čini funkcionalno ekvivalentni genski produkt AveC, kao što je definirano gore.

Kao što se ovdje upotrebljava u odnosu na aminokiselinske sljedove homologne aminokiselinskom slijedu genskog produkta AveC iz bakterije S. avermitilis, izraz "homologan" odnosi se na polipeptid koji inače ima aminokiselinski slijed sa Slike 1 (SEQ ID NO: 2), ali u kojem je jedan ili više aminokiselinskih ostataka konzervativno supstituirano različitim aminokiselinskim ostatkom, gdje navedeni aminokiselinski slijed ima najmanje oko 70 %, poželjnije najmanje oko 80 %, a najpoželjnije najmanje oko 90 % istovjetnosti aminokiselinskog slijeda s polipeptidom kojeg kodira slijed iz plazmida pSE186 (ATCC 209604), koji kodira genski produkt AveC, ili aminokiselinski slijed sa Slike 1 (SEQ ID NO: 2), kao što je određeno bilo kojim standardnim algoritmom za istovjetnost aminokiselinskih sljedova, kao što je BLASTP algoritam (GENBANK, NCBI), a gdje takve konzervativne supstitucije rezultiraju funkcionalno ekvivalentnim genskim produktom, kao što je definirano gore. Konzervativne aminokiselinske supstitucije su dobro poznate u ovom području tehnike. Pravila za stvaranje takvih supstitucija uključuju ona opisana u M.D. Dayhof: "Nat. Biomed. Res. Found.", Svezak 5, Dodatak 3, (1978.), Washington D.C., između ostalih. Specifičnije, konzervativne aminokiselinske supstitucije su one koje se u općem slučaju dešavaju unutar porodice aminokiselina, srodne u odnosu na kiselost ili polarnost. Genetski kodirane aminokiseline u općem slučaju se dijeli u četiri grupe: (1) kisele = aspartat, glutamat; (2) bazične = lizin, arginin, histidin; (3) nepolarne = alanin, valin, leucin, izoleucin, prolin, fenilalanin, metionin, triptofan; i (4) nenabijene polarne = glicin, asparagin, glutamin, cistein, serin, treonin, tirozin. Fenilalanin, triptofan i tirozin također se zajedno klasificira kao aromatske aminokiseline. Jedna ili više zamjena unutar određene grupe, npr. leucina izoleucinom ili valinom, ili aspartata glutamatom, ili treonina serinom, ili bilo kojeg aminokiselinskog ostatka strukturno srodnim aminokiselinskim ostatkom, npr. aminokiselinski ostatak slične kiselosti ili polarnosti, ili sa sličnošću u kombinaciji ovih svojstava, u općem slučaju će imati zanemariv učinak na funkciju polipeptida.

Ovaj izum se također odnosi na izoliranu polinukleotidnu molekulu s nukleotidnim slijedom koji kodira homolog genskog produkta AveC. Kao što se ovdje upotrebljava, "homolog genskog produkta AveC" definira se kao genski produkt s najmanje oko 50 % istovjetnosti aminokiselinskog slijeda s genskim produktom AveC iz bakterije S. avermitilis, koji sadrži aminokiselinski slijed kojeg kodira slijed iz plazmida pSE186 (ATCC 209604), koji kodira genski produkt AveC, ili aminokiselinski slijed prikazan na Slici 1 (SEQ ID NO: 2), kao što je određeno bilo kojim standardnim algoritmom za istovjetnost aminokiselinskih sljedova, kao što je BLASTP algoritam (GENBANK, NCBI). U neograničavajućoj izvedbi homolog genskog produkta AveC je iz bakterije S. hygroscopicus, (opisan u EP prijavi 0298423; depozit FERM BP-1901) i sadrži aminokiselinski slijed SEQ ID NO: 4, ili njegov bitan dio. "Bitan dio" aminokiselinskog slijeda SEQ ID NO: 4 odnosi se na polipeptid koji sadrži najmanje oko 70 % aminokiselinskog slijeda SEQ ID NO: 4, koji je funkcionalno ekvivalentni homolog genskog produkta AveC. "Funkcionalno ekvivalentni" homolog genskog produkta AveC definira se kao genski produkt koji, kada se eksprimira u S. hygroscopicus soju FERM BP-1901, u kojem je nativni homologni aveC alel inaktiviran, rezultira proizvodnjom uglavnom istog odnosa i količine milbemicina kojeg proizvodi S. hygroscopicus soj FERM BP-1901, koji umjesto toga eksprimira samo divlji tip, funkcionalni homolog aveC alela nativan za S. hygroscopicus soj FERM BP-1901. U neograničavajućoj izvedbi, izolirana polinukleotidna molekula prema ovom izumu, koja kodira S. hygroscopicus homolog genskog produkta AveC, sadrži nukleotidni slijed SEQ ID NO: 3 ili njegov bitan dio. U tom pogledu, "bitan dio" izolirane polinukleotidne molekule s nukleotidnim slijedom SEQ ID NO: 3 odnosi se na izoliranu polinukleotidnu molekulu prema ovom izumu s najmanje oko 70 % nukleotidnog slijeda SEQ ID NO: 3, koja kodira funkcionalno ekvivalentni homolog genskog produkta AveC, kao što je definirano gore.

Ovaj izum se također odnosi na polinukleotidnu molekulu s nukleotidnim slijedom homolognim S. hygroscopicus nukleotidnom slijedu SEQ ID NO: 3. Izraz "homologan", kada ga se upotrebljava u odnosu na polinukleotidnu molekulu s nukleotidnim slijedom homolognim slijedu SEQ ID NO: 3, koji kodira S. hygroscopicus homolog genskog produkta AveC, odnosi se na polinukleotid s nukleotidnim slijedom: (a) koji kodira isti genski produkt kao nukleotidni slijed SEQ ID NO: 3, ali koji uključuje jednu ili više tihih promjena nukleotidnog slijeda, u skladu s degeneriranošću genetskog koda (tj. degenerirana varijanta); ili (b) koji hibridizira s komplementom polinukleotidne molekule, s nukleotidnim slijedom koji kodira aminokiselinski slijed SEQ ID NO: 4, pod umjereno strogim uvjetima, npr. hibridizacija s DNA vezanom na filter u 0,5 M NaHPO4, 7 % natrij-dodecil-sulfatu (SDS), 1 mM EDTA na 65 °C, i uz ispiranje u 0,2 × SSC/0,1 % SDS na 42 °C (vidjeti Ausubel i drugi: gore navedeno), a kodira funkcionalno ekvivalentni homolog genskog produkta AveC, kao što je definirano gore. U poželjnoj izvedbi, homologna polinukleotidna molekula hibridizira s komplementom nukleotidnog slijeda SEQ ID NO: 3, koji kodira homolog genskog produkta AveC, pod veoma strogim uvjetima, npr. hibridizacija s DNA vezanom na filter u 0,5 M NaHPO4, 7 % SDS, 1 mM EDTA na 65 °C, i uz ispiranje u 0,1 × SSC/0,1 % SDS na 68 °C (Ausubel i drugi: (1989.), gore navedeno), a kodira funkcionalno ekvivalentni homolog genskog produkta AveC, kao što je definirano gore.

Ovaj izum se također odnosi na polinukleotidnu molekulu s nukleotidnim slijedom koji kodira polipeptid homologan S. hygroscopicus homologu genskog produkta AveC. Kao što se ovdje upotrebljava u odnosu na polipeptide homologne homologu genskog produkta AveC, SEQ ID NO: 4, iz bakterije S. hygroscopicus, izraz "homologan" odnosi se na polipeptid koji inače ima aminokiselinski slijed SEQ ID NO: 4, ali u kojem su jedan ili više aminokiselinskih ostataka konzervativno supstituirani različitim aminokiselinskim ostatkom, kao što je definirano gore, gdje navedeni aminokiselinski slijed ima najmanje oko 70 %, poželjnije najmanje oko 80 %, a najpoželjnije najmanje oko 90 % istovjetnosti aminokiselinskog slijeda s polipeptidom SEQ ID NO: 4, kako što je određeno bilo kojim standardnim algoritmom za istovjetnost aminokiselinskih sljedova, kao što je BLASTP algoritam (GENBANK, NCBI), i gdje takve konzervativne supstitucije rezultiraju funkcionalno ekvivalentnim homologom genskog produkta AveC, kao što je definirano gore.

Ovaj izum se također odnosi na oligonukleotide koji hibridiziraju s polinukleotidnim molekulama s nukleotidnim slijedom sa Slike 1 (SEQ ID NO: 1) ili SEQ ID NO: 3, ili s polinukleotidnom molekulom s nukleotidnim slijedom koji je komplement nukleotidnog slijeda sa Slike 1 (SEQ ID NO: 1) ili SEQ ID NO: 3. Takvi oligonukleotidi dugi su najmanje 10 nukleotida, po mogućnosti od oko 15 do oko 30 nukleotida, a koji hibridiziraju s jednom od gore navedenih polinukleotidnih molekula pod veoma strogim uvjetima, npr. ispiranje u 6 × SSC/0,5 % natrij-pirofosfatu na oko 37 °C za oligonukleotide duge oko 14 baza, na oko 48 °C za oligonukleotide duge oko 17 baza, na oko 55 °C za oligonukleotide duge oko 20 baza, i na oko 60 °C za oligonukleotide duge oko 23 baze. U poželjnoj izvedbi, oligonukleotidi su komplementarni dijelu jedne od gore navedenih polinukleotidnih molekula. Ovi oligonukleotidi korisni su u različite svrhe, uključujući kodiranje ili djelovanje kao antisens molekule, korisne u regulaciji gena, ili kao klice u umnažanju kodirajućih polinukleotidnih molekula aveC ili homologa aveC.

Upotrebom polinukleotidnih molekula ili oligonukleotida otkrivenih u ovom izumu zajedno s poznatim tehnikama može se odrediti dodatne homologe aveC gena u drugim vrstama ili sojevima roda Streptomyces. Primjerice, oligonukleotidnu molekulu s dijelom S. avermitilis nukleotidnog slijeda sa Slike 1 (SEQ ID NO: 1) ili dijelom S. hygroscopicus nukleotidnog slijeda SEQ ID NO: 3 može se uočljivo obilježiti i upotrijebiti za pregled genomske biblioteke, konstruirane od DNA izvedene iz organizma od interesa. Strogost hibridizacijskih uvjeta bira se na osnovu odnosa referentnog organizma, u ovom primjeru bakterija S. avermitilis ili S. hygroscopicus, s organizmom od interesa. Zahtjevi za različitom strogošću uvjeta dobro su poznati stručnjacima u ovom području tehnike, a takvi zahtjevi će predvidljivo varirati ovisno o specifičnom organizmu iz kojeg je izvedena biblioteka i obilježeni sljedovi. Takvi oligonukleotidi po mogućnosti su dugi najmanje oko 15 nukleotida i uključuju npr. one opisane u primjerima niže. Umnažanje homolognih gena može se provesti, pomoću ovih i drugih oligonukleotida, standardnim tehnikama, poput lančane reakcije polimeraze (polymerase chain reaction, PCR), iako se također može upotrijebiti i druge tehnike umnažanja poznate u ovom području tehnike, npr. lančanu reakciju ligaze.

Klonove određene na prisustvo nukleotidnog slijeda homolognog aveC može se testirati u odnosu na njihovu sposobnost kodiranja funkcionalnog homologa genskog produkta AveC. U ovu svrhu, klonove se može podvrgnuti analizi sljedova, kako bi se odredilo pogodan okvir čitanja, kao i inicijacijske i terminacijske signale. Alternativno ili osim toga, klonirani DNA slijed može se insertirati u odgovarajući ekspresijski vektor, tj. vektor koji sadrži nužne elemente za transkripciju i translaciju insertiranog slijeda koji kodira protein. Bilo koji od različitih sustava domaćin/vektor može se upotrijebiti kao što je opisano niže, uključujući, ali i neograničavajući se na bakterijske sustave, kao što su plazmidni, bakteriofagni, ili kozmidni ekspresijski vektori. Odgovarajuće stanice domaćina transformirane s takvim vektorima, koji sadrže potencijalne sljedove koji kodiraju aveC homolog može se zatim analizirati u odnosu na AveC-tip aktivnosti, upotrebom postupaka poput HPLC analize produkata fermentacije, kao što je opisano, npr. u Poglavlju 7, niže.

Proizvodnja i manipulacija polinukleotidnih molekula otkrivenih u ovom izumu su unutar mogućnosti ovog područja tehnike i može ih se provesti u skladu s rekombinantnim tehnikama opisanim, npr. u Maniatis i drugi: "Molecular Cloning, A Laboratory Manual", (1989.), Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY; Ausubel i drugi: "Current Protocols In Molecular Biology", (1989.), Greene Publishing Associates & Wiley Interscience, NY; Sambrok i drugi: "Molecular Cloning: A Laboratory Manual", 2. izdanje, (1989.), Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY; Innis i drugi: "PCR Strategies", (1995.), izdavač Academic Press, Inc., San Diego; i Erlich: "PCT Technology", (1992.), izdavač Oxford University Press, New York, sve ovdje uključene kao reference. Polinukleotidni klonovi koji kodiraju genske produkte AveC ili homologe genskog produkta AveC može se odrediti bilo kojim postupkom poznatim u ovom području tehnike, uključujući, ali neograničavajući se na postupke prikazane u Poglavlju 7, niže. Genomske biblioteke DNA može se pretraživati u odnosu na kodirajuće sljedove aveC i homologa aveC upotrebom tehnika kao što su postupci navedeni u Benton i Davis: "Science", 196: 180, (1977.), za bakteriofagne biblioteke i u Grunstein i Hogness: "Proc. Natl. Acad. Sci. USA", 72: 3961-3965, (1975.), za plazmidne biblioteke. Polinukleotidne molekule s nukleotidnim sljedovima za koje se zna da uključuju aveC ORF, kao što su prisutni, npr. u plazmidu pSE186 (ATCC 209604), ili u plazmidu pSE119 (opisanom u Poglavlju 7, niže), može se upotrijebiti kao sonde u ovim preglednim eksperimentima. Alternativno, oligonukleotidne sonde može se sintetizirati tako da odgovaraju nukleotidnim sljedovima izvedenim iz djelomičnih ili kompletnih aminokiselinskih sljedova pročišćenog homologa genskog produkta AveC.

2. Rekombinantni sustavi

2.1. Klonirajući i ekspresijski vektori

Ovaj izum se također odnosi na rekombinantne klonske vektore i ekspresijske vektore korisne u kloniranju ili ekspresiji polinukleotidnih molekula prema ovom izumu, koji sadrže, npr. aveC ORF iz bakterije S. avermitilis ili ORF-ove bilo kojeg aveC homologa. U neograničavajućoj izvedbi, ovaj izum odnosi se na plazmid pSE186 (ATCC 209604), koji sadrži potpuni ORF aveC gena iz bakterije S. avermitilis.

Sav slijedeći opis u pogledu aveC ORF-a iz bakterije S. avermitilis, ili polinukleotidne molekule koja sadrži aveC ORF iz bakterije S. avermitilis ili njegov dio, ili genskog produkta AveC iz bakterije S. avermitilis, također se odnosi na aveC homologe i homologe genskog produkta AveC, ukoliko nije eksplicitno naznačeno ili u odnosu na kontekst.

Razvijen je veliki broj različitih vektora za specifičnu upotrebu u rodu Streptomyces, uključujući fage, plazmide velikog broja kopija, plazmide malog broja kopija i E. coli-Streptomyces taksi-vektore, između ostalih, a svaki od ovih se može upotrijebiti u izvedbi predmetnog izuma. Određen broj gena za otpornost na lijekove također je kloniran iz roda Streptomyces, a nekoliko ovih gena ugrađeno je u vektore kao selekcijski markeri. Primjeri važećih vektora za upotrebu u rodu Streptomyces su prikazani između ostalog, u Hutchinson: "Applied Biochem. Biotech.", 16: 169-190, (1980.).

Rekombinantni vektori ovog izuma, osobito ekspresijski vektori, po mogućnosti su konstruirani tako da je kodirajući slijed polinukleotidne molekule prema ovom izumu u operativnoj asocijaciji s jednim ili više regulacijskih elemenata, nužnih za transkripciju i translaciju kodirajućeg slijeda, kako bi se proizvelo polipeptid. Kao što se ovdje upotrebljava, izraz "regulacijski element" uključuje, ali nije ograničen na nukleotidne sljedove koji kodiraju inducibilne i neinducibilne promotore, pojačivače, operatore i druge elemente poznate u ovom području tehnike, koji služe za poticanje i/ili reguliranje ekspresije kodirajućih polinukleotidnih sljedova. Također, kao što se ovdje upotrebljava, kodirajući slijed je u "operativnoj asocijaciji" s jednim ili više regulacijskih elemenata, gdje regulacijski elementi djelotvorno reguliraju i omogućuju transkripciju kodirajućeg slijeda ili translaciju odgovarajuće mRNA, ili oba.

Tipični plazmidni vektori, koje se može konstruirati tako da sadrže polinukleotidnu molekulu prema ovom izumu, uključuju pCR-Blunt, pCR2.1 (Invitrogen), pGEM3Zf (Promega) i taksi-vektor pWHM3 (Vara i drugi: "J. Bact.", 171: 5872-5881, (1989.)), među mnogim drugima.

U ovom području tehnike dobro su poznati postupci konstruiranja rekombinantnih vektora koji sadrže određene kodirajuće sljedove u operativnoj asocijaciji s odgovarajućim regulacijskim elementima i može ih se upotrijebiti u izvedbi predmetnog izuma. Ovi postupci uključuju rekombinantne tehnike in vitro, tehnike sinteze, kao i genetsku rekombinaciju in vivo. Vidjeti npr. tehnike opisane u Maniatis i drugi: (1989.), gore navedeno; Ausubel i drugi: gore navedeno; Sambrok i drugi: (1989.), gore navedeno; Innis i drugi: (1995.), gore navedeno; i Erlich: (1992.), gore navedeno.

Regulacijski elementi ovih vektora mogu varirati u odnosu na svoju jačinu i specifičnost. Ovisno o upotrijebljenom sustavu domaćin/vektor može se upotrijebiti bilo koji od određenog broja pogodnih transkripcijskih i translacijskih elemenata. Neograničavajući primjeri transkripcijskih regulacijskih regija ili promotora za bakterije uključuju β-gal promotor, T7 promotor, TAC promotor, lijevi i desni λ promotor, trp i lac promotore, trp-lac fuzionirane promotore i, što je specifičnije za Streptomyces promotore ermE, melC i tipA itd. U specifičnoj izvedbi opisanoj u Poglavlju 11 niže, konstruiran je ekspresijski vektor tako da sadrži aveC ORF, kloniran u susjedstvo jakog konstitutivnog ermE promotora iz bakterije Saccharopolyspora erythraea. Vektor je transformiran u bakteriju S. avermitilis, a HPLC analiza produkata fermentacije provedena nakon toga pokazivala je povećani titar proizvedenih avermektina u odnosu na proizvodnju istog soja, ali koji eksprimira samo divlji tip aveC alela.

Ekspresijske vektore za fuzijske proteine može se upotrijebiti za ekspresiju fuzijskog proteina genskog produkta AveC. Pročišćeni fuzijski protein može se upotrijebiti u dobivanju antiseruma protiv genskog produkta AveC, za proučavanje biokemijskih svojstava genskog produkta AveC, za konstruiranje AveC fuzijskih proteina različitog biokemijskog djelovanja, ili kao pomoć u određivanju ili pročišćavanju eksprimiranog genskog produkta AveC. Mogući ekspresijski vektori za fuzijske proteine uključuju, ali nisu ograničeni na vektore koji sadrže sljedove koji kodiraju fuziju β-galaktozidaze i trpE, fuziju maltoza-vežućeg proteina, fuzije glutationStransferaze i fuzije polihistidina (nosive regije). U alternativnom obliku, genski produkt AveC ili njegov dio može biti fuzioniran s homologom genskog produkta AveC, ili njegovim dijelom, koji je izveden iz druge vrste ili soja roda Streptomyces, npr. bakterije S. hygroscopicus ili S. griseochromogenes. U posebnoj izvedbi opisanoj u Poglavlju 12, niže, i prikazanoj na Slici 7, konstruiran je kimerni plazmid koji sadrži regiju od 564 bp iz S. hygroscopicus homologa aveC ORF-a, koji zamjenjuje homolognu regiju od 564 bp iz S. avermitilis aveC ORFa. Takve hibridne vektore može se transformirani u S. avermitilis stanice i testirati, kako bi se odredio njihovo djelovanje, npr. na odnos klase 2:1 proizvedenih avermektina.

AveC fuzijske proteine može se konstruirati tako da sadrže regiju korisnu za pročišćavanje. Primjerice, fuzije AveCmaltoza-vežući protein može se pročistiti amiloznom smolom; AveC-glutation-S-transferaza fuzijske proteine može se pročistiti glutation-agaroznim zrnima; a AveC-polihistidinske fuzije može se pročistiti smolom s dvovalentnim niklom. Alternativno se u pročišćavanju fuzijskih proteina afinitetnom kromatografijom može upotrijebiti protutijela protiv proteinskog ili peptidnog nosača. Primjerice, nukleotidni slijed koji kodira ciljni epitop monoklonskog protutijela može se insertirati u ekspresijski vektor u operativnoj asocijaciji s regulacijskim elementima i postaviti tako da je eksprimirani epitop fuzioniran s AveC polipeptidom. Primjerice, nukleotidni slijed koji kodira FLAGTM epitopski marker (International Biotechnologies Inc.), koji je hidrofilni marker peptid, može se insertirati standardnim tehnikama u ekspresijski vektor na mjesto koje odgovara, npr. karboksilnom kraju AveC polipeptida. Eksprimirani fuzijski produkt AveC polipeptid-FLAGTM epitop se zatim može odrediti i afinitetno pročistiti, upotrebom tržišno dostupnih anti-FLAGTM protutijela.

Ekspresijski vektor koji kodira AveC fuzijski protein također se može konstruirati tako da sadrži polilinkerske sljedove koji kodiraju specifična mjesta za cijepanje proteazama, tako da se eksprimirani AveC polipeptid može osloboditi s nosive regije ili fuzijskog partnera obradom specifičnom proteazom. Primjerice, vektor fuzijskog proteina može uključivati DNA sljedove koji kodiraju mjesta za cijepanje trombinom ili faktorom Xa, između ostalih.

Signalni slijed uzvodno od, i u okviru čitanja, aveC ORF-a, može se insertirati poznatim postupcima u ekspresijski vektor, kako bi se usmjerilo transport i izlučivanje eksprimiranog genskog produkta. Neograničavajući primjeri signalnih sljedova uključuju one iz α-faktora, imunoglobulina, proteina vanjske membrane, penicilinaze i T-staničnih receptora, između ostalih.

Kako bi se pomoglo selekciju stanica domaćina transformiranih ili transinficiranih klonirajućim ili ekspresijskim vektorima prema ovom izumu, može se konstruirati vektor tako da također sadrži kodirajući slijed za produkt reporter-gena ili drugi selekcijski marker. Takav kodirajući slijed po mogućnosti je u operativnoj asocijaciji s kodirajućim sljedovima regulacijskog elementa, kao što je opisano gore. Reporter-geni korisni u ovom izumu su dobro poznati u ovom području tehnike, i uključuju one koji kodiraju zeleni fluorescentni protein, luciferazu, xylE i tirozinazu, između ostalih. Nukleotidni sljedovi koji kodiraju selekcijske markere su dobro poznati u ovom području tehnike i uključuju one koje kodiraju genske produkte koji omogućuju otpornost na antibiotike ili antimetabolite, ili koji ispunjavaju auksotrofne zahtjeve. Primjeri takvih sljedova uključuju one koji kodiraju otpornost na eritromicin, tiostrepton ili kanamicin, između ostalih.

2.2. Transformacija stanica domaćina

Ovaj izum se također odnosi na transformirane stanice domaćina, koje sadrže polinukleotidnu molekulu ili rekombinantni vektor prema ovom izumu, te na iz njih izvedene nove sojeve ili stanične linije. Stanice domaćina korisne u izvedbi predmetnog izuma po mogućnosti su Streptomyces stanice, iako se može upotrijebiti i druge prokariotske ili eukariotske stanice. Takve transformirane stanice domaćina u tipičnom slučaju uključuju, ali nisu ograničene na mikrorganizme, poput bakterija transformiranih s DNA rekombinantnog bakteriofaga, plazmidnim DNA, ili kozmidnim DNA-vektorima, ili kvasca transformiranog rekombinantnim vektorima, između ostalih.

Namjera je da polinukleotidne molekule prema ovom izumu funkcioniraju u Streptomyces stanicama, ali ih se također može transformirati u druge bakterijske ili eukariotske stanice, npr. za potrebe kloniranja ili ekspresije. U tipičnom slučaju može se upotrijebiti soj bakterije E. coli, kao što je, npr. DH5α soj, dostupan od strane American Type Culture Collection (ATCC = Zbirka kultura američkog tipa), Rockville, MD, USA (Pristupni br. 31343) i na tržištu (Stratagene). Poželjne eukariotske stanice uključuju stanice kvasca, iako se stanice sisavaca ili kukaca također može djelotvorno upotrijebiti.

Rekombinantni ekspresijski vektor prema ovom izumu po mogućnosti se transformira ili transinficira u jednu ili više stanica domaćina uglavnom homogene kulture stanica. Ekspresijski vektor u općem slučaju se uvodi u stanice domaćina u skladu s dobro poznatim tehnikama, npr. transformacijom protoplasta, taloženjem s kalcijfosfatom, obradom kalcij-kloridom, mikroinjekcijom, elektroporacijom, transfekcijom putem kontakta s rekombiniranim virusom, liposomski posredovanom transfekcijom, DEAE-dekstranskom transfekcijom, transdukcijom, konjugacijom, ili bombardiranjem mikroprojektilima. Selekciju transformanata može se provesti standardnim postupcima, poput selekcije stanica koje eksprimiraju selekcijski marker, npr. otpornost na antibiotik, vezano za rekombinantni vektor, kao što je opisano gore.

Jednom kad se ekspresijski vektor uvede u stanicu domaćina, integraciju se i održavanje aveC kodirajućeg slijeda, bilo u kromosomu stanice domaćina, ili u obliku episoma, može potvrditi standardnim tehnikama, npr. hibridizacijskom analizom po Southern-u, analizom restrikcijskim enzimima, PCR-analizom, uključujući PCR s reverznom transkriptazom (reverse transcriptase PCR, rt-PCR), ili imunološkim testom, kako bi se otkrilo očekivani genski produkt. Stanice domaćina koje kodiraju i/ili eksprimiraju rekombinantni aveC kodirajući slijed može se odrediti bilo kojim od najmanje četiri opća pristupa dobro poznata u ovom području tehnike, koji uključuju: (i) DNA-DNA, DNA-RNA, ili RNA-antisens RNA hibridizaciju; (ii) detekciju prisustva funkcija gena "markera"; (iii) određivanje razine transkripcije, mjereno ekspresijom aveC-specifičnih mRNA transkripata u stanici domaćina; i (iv) detekcija prisustva zrelog polipeptidnog produkta, mjereno, npr. imunotestom ili prisustvom biološke aktivnosti AveC (npr. proizvodnja specifičnih odnosa i količina avermektina indikativnih za AveC aktivnost u, npr. S. avermitilis stanicama domaćinima).

2.3. Ekspresija i karakterizacija rekombinantnog genskog produkta AveC

Jednom kad se aveC kodirajući slijed stabilno uvede u odgovarajuću stanicu domaćina, transformiranu stanicu domaćina se klonalno razmnoži, a nastale stanice može se uzgajati pod uvjetima koji omogućuju maksimalnu proizvodnju genskog produkta AveC. Takvi uvjeti u tipičnom slučaju uključuju uzgoj stanica do velike gustoće. U slučajevima kod kojih ekspresijski vektor sadrži inducibilni promotor, upotrijebi se, po potrebi, u indukciji ekspresije, odgovarajuće indukcijske uvjete, npr. temperaturne pomake, potpuno iscrpljivanje nutricijenata, dodatak induktora (npr. analoge ugljikohidrata, poput izopropil-�-d-tiogalaktopiranozida (IPTG)), nakupljanje nusprodukata metabolizma, ili slično.

U slučajevima gdje se eksprimirani genski produkt AveC zadržava unutar stanice domaćina, stanice se prikuplja i lizira, a produkt se izolira i pročisti iz lizata pod ekstrakcijskim uvjetima pogodnim za smanjenje degradacije proteina, poznatim u ovom području tehnike, npr. na 4 °C, ili u prisustvu inhibitora proteaze, ili oboje. U slučajevima gdje se produkt eksprimiranog AveC gena izlučuje iz stanice domaćina, može se jednostavno prikupiti iscrpljeni hranjivi medij i iz njega izolirati produkt.

Eksprimirani genski produkt AveC može se izolirati ili bitno pročistiti iz staničnih lizata ili medija za kulturu, na odgovarajući način, upotrebom standardnih postupaka, koji uključuju, ali nisu ograničeni na bilo koju kombinaciju slijedećih postupaka: taloženje amonij-sulfatom, frakcioniranje prema veličini, ionskoizmjenjivačku kromatografiju, HPLC, centrifugiranje prema gustoći i afinitetnu kromatografiju. U slučajevima kada eksprimirani genski produkt AveC pokazuje biološku aktivnost, povećanje čistoće dobivanja može se pratiti na svakom koraku postupka pročišćavanja uz pomoć odgovarajućeg testa. Bez obzira pokazuje li eksprimirani genski produkt AveC biološku aktivnost ili ne, može ga se detektirati na osnovu, npr. veličine, ili reaktivnosti s protutijelom, inače specifičnim za AveC, ili prisustvom fuzijskog markera. Kao što se ovdje upotrebljava, genski produkt AveC je "bitno pročišćen" kada produkt čini više od oko 20 težinskih % proteina u određenom dobivanju. Također, kao što se ovdje upotrebljava, genski produkt AveC je "izoliran" kada produkt čini najmanje oko 80 težinskih % proteina u određenom dobivanju.

Ovaj se izum prema tome odnosi na rekombinantno eksprimirani izolirani ili bitno pročišćeni S. avermitilis genski produkt AveC, s aminokiselinskim slijedom kojeg kodira slijed iz plazmida pSE (ATCC 209604), koji kodira genski produkt AveC, ili aminokiselinski slijed sa Slike 1 (SEQ ID NO: 2) ili njegov bitan dio, te njegove homologe.

Ovaj izum se također odnosi na rekombinantno eksprimirani izolirani ili bitno pročišćeni S. hygroscopicus homolog genskog produkta AveC, aminokiselinskog slijeda SEQ ID NO: 4 ili njegov bitan dio, te njegove homologe.

Ovaj izum se također odnosi na postupak proizvodnje genskog produkta AveC, koji se sastoji u kultiviranju stanice domaćina transformirane rekombinantnim ekspresijskim vektorom, gdje navedeni vektor sadrži polinukleotidnu molekulu s nukleotidnim slijedom koji kodira genski produkt AveC, gdje je ta polinukleotidna molekula u operativnoj asocijaciji s jednim ili više regulacijskih elemenata, koji kontroliraju ekspresiju polinukleotidne molekule u stanici domaćina, pod uvjetima pogodnim za proizvodnju rekombinantnog genskog produkta AveC, te na prikupljanje genskog produkta AveC iz kulture stanica.

Rekombinantno eksprimirani S. avermitilis AveC genski produkt koristan je za veći broj primjena, uključujući pregled spojeva koji mijenjaju funkciju genskog produkta AveC i tako moduliraju biosintezu avermektina i stvaranje protutijela protiv genskog produkta AveC.

Jednom kada se dobije genski produkt AveC dovoljne čistoće, može ga se karakterizirati standardnim postupcima, uključujući tu SDS-PAGE (SDS polyacrylamide gel electrophoresis, elektroforeza na poliakrilamidnom gelu uz dodatak natrij-dodecil-sulfata), kromatografiju izdvajanjem po veličini, analizu aminokiselinskog slijeda, biološku aktivnost u proizvodnji odgovarajućih produkata u biosintetskom putu avermektina itd. Primjerice, aminokiselinski slijed genskog produkta AveC može se odrediti standardnim tehnikama sekvenciranja peptida. Genski produkt AveC može također karakterizirati analizom hidrofilnosti (vidjeti, npr. Hop i Wods: "Proc. Natl. Acad. Sci. USA", 78: 3824, (1981.)), ili analognim softverskim algoritmima, kako bi se odredilo hidrofobnu i hidrofilnu regiju genskog produkta AveC. Može se provesti strukturnu analizu kako bi se odredilo regije genskog produkta AveC koje poprimaju specifične sekundarne strukture. Može se upotrijebiti biofizičke postupke, poput rendgenske kristalografije (Engstrom: "Biochem. Exp. Biol.", 11: 7-13, (1974.)), kompjuterskog modeliranja (Fletterick i Zoller: "Current Communications in Molecular Biology", (1986.), izdavač Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY) i nuklearne magnetske rezonancije (NMR), kako bi se mapiralo i proučavalo mjesta međudjelovanja između genskog produkta AveC i njegovog supstrata. Informacije dobivene iz ovih studija može se upotrijebiti za odabir novih mjesta za mutacije u aveC ORF-u, kako bi se olakšalo dobivanje novih sojeva S. avermitilis s poželjnijim karakteristikama u odnosu na proizvodnju avermektina.

3. Konstruiranje i upotreba AveC mutanata

Ovaj izum odnosi se na polinukleotidnu molekulu s nukleotidnim slijedom inače istim kao S. avermitilis aveC alel ili njegova degenerirana varijanta, ili slijed iz plazmida pSE186 (ATCC 209604), koji kodira genski produkt AveC ili njegovu degeneriranu varijantu, ili nukletidni slijed aveC ORF-a iz bakterije S. avermitilis, kao što je prikazano na Slici 1 (SEQ ID NO: 1) ili njegova degenerirana varijanta, ali koja također sadrži jednu ili više mutacija, tako da stanice S. avermitilis soja ATCC 53692, u kojem je divlji tip aveC alela inaktiviran i koji eksprimira polinukleotidnu molekulu mutiranog nukleotidnog slijeda ili njenu degeneriranu varijantu, proizvode različit odnos ili količinu avermektina od onih koje proizvode stanice S. avermitilis soja ATCC 53692, koje umjesto toga eksprimiraju samo divlji tip alela aveC alela.

Prema ovom izumu, takve polinukleotidne molekule može se upotrijebiti u dobivanju novih sojeva bakterije S. avermitilis, koji pokazuju uočljivu promjenu u proizvodnji avermektina, u usporedbi s istim sojem, koji umjesto toga eksprimira samo divlji tip aveC alela. U poželjnoj izvedbi, takve polinukleotidne molekule korisne su u dobivanju novih sojeva bakterije S. avermitilis, koji proizvode avermektine u smanjenom odnosu klase 2:1, u usporedbi s istim sojem, koji umjesto toga eksprimira samo divlji tip aveC alela. U daljnjoj poželjnoj izvedbi, takve polinukleotidne molekule korisne su u dobivanju novih sojeva bakterije S. avermitilis, koji proizvode povećanu razinu avermektina, u usporedbi s istim sojem koji umjesto toga eksprimira samo jedan divlji tip aveC alel. U daljnjoj poželjnoj izvedbi, takve polinukleotidne molekule korisne su u dobivanju novih sojeva bakterije S. avermitilis, kod kojih je aveC gen inaktiviran.

Mutacije na aveC alelu ili kodirajućem slijedu uključuju bilo koje mutacije koje uvode jednu ili više aminokiselinskih delecija, adicija, ili supstitucija u genskom produktu AveC, ili rezultiraju skraćivanjem genskog produkta AveC, ili bilo koju njihovu kombinaciju, a koje daju željeni rezultat. Namjera je također da takvi mutirani aveC sljedovi uključuju bilo koje svoje degenerirane varijante. Primjerice, ovaj izum se odnosi na polinukleotidne molekule s nukleotidnim slijedom aveC alela ili njegovom degeneriranom varijantom, ili slijedom iz plazmida pSE186 (ATCC 209604), koji kodira genski produkt AveC ili njegovu degeneriranu varijantu, ili nukleotidnim slijedom aveC ORF-a iz bakterije S. avermitilis prikazanim na Slici 1 (SEQ ID NO: 1) ili njegovom degeneriranom varijantom, ali koja također sadrži jednu ili više mutacija, koje kodiraju supstituciju aminokiselinskog ostatka različitim aminokiselinskim ostatkom na odabranim položajima u genskom produktu AveC. U nekoliko neograničavajućih izvedbi, prikazanim u primjerima niže, takve supstitucije može se provesti na bilo kojem aminokiselinskim položajima genskog produkta AveC koji odgovaraju aminokiselinskim položajima 38, 48, 55, 89, 99, 111, 136, 138, 139, 154, 179, 228, 230, 238, 266, 275, 289 ili 298 iz SEQ ID NO: 2, ili nekoj njihovoj kombinaciji.

Mutacije na aveC kodirajućem slijedu provede se bilo kojim od niza poznatih postupaka, uključujući griješeću PCR, ili kasetnu mutagenezu. Primjerice, usmjerenu mutagenezu pomoću oligonukleota može se upotrijebiti kako bi se promijenilo slijed aveC alela ili ORF-a na definiran način, npr. uvođenjem jednog ili više restrikcijskih mjesta, ili terminacijskog kodona, u specifične regije unutar aveC alela ili ORF-a. Također se može upotrijebiti postupke poput onih opisanih u US patentu 5605793, US patentu 5830721 i US patentu 5837458, uključuju slučajnu fragmentaciju, ponovljene cikluse mutageneze i nukleotidno preslagivanje, u dobivanju velike biblioteke polinukleotida s nukleotidnim sljedovima koji kodiraju aveC mutacije.

Usmjerene mutacije mogu biti korisne, osobito tamo gdje služe za promjenu jednog ili više konzervativnih aminokiselinskih ostataka u genskom produktu AveC. Primjerice, usporedba izvedenih aminokiselinskih sljedova genskih produkata AveC i homologa genskih produkata AveC iz bakterija S. avermitilis (SEQ ID NO: 2), S. griseochromogenes (SEQ ID NO: 5) i S. hygroscopicus (SEQ ID NO: 4) prikazana na Slici 6, ukazuje na mjesta bitne konzervativnosti aminokiselinskih ostataka među ovim vrstama. Usmjerena mutageneza uzrokuje promjene u jednom ili više ovih konzervativnih aminokiselinskih ostataka može biti osobito djelotvorna u dobivanju novih mutantnih sojeva koji pokazuju poželjne promjene u proizvodnji avermektina.

Slučajna mutageneza može također biti korisna, te je se može provesti izlaganjem stanica bakterije S. avermitilis ultraljubičastom zračenju ili rendgenskim zrakama, ili kemijskim mutagenima, poput NmetilN'nitrozogvanidina, etil-metansulfonata, dušičaste kiseline ili dušikovih iperita. Za pregled tehnika mutageneze vidjeti, npr. Ausubel: (1989.), gore navedeno.

Jednom kada se polinukleotidne molekule dobije, pregledava ih se kako bi se odredilo mogu li modulirati biosintezu avermektina kod bakterije S. avermitilis. U poželjnoj izvedbi, polinukleotidnu molekulu s mutiranim nukleotidnim slijedom testira se komplementacijom soja bakterije S. avermitilis kod kojeg je aveC gen inaktiviran, kako bi se dobilo aveC negativnu (aveC–) pozadinu. U neograničavajućoj izvedbi, mutiranu polinukleotidnu molekulu ubacuje se u ekspresijski plazmid u operativnoj asocijaciji s jednim ili više regulacijskih elemenata, gdje taj plazmid također po mogućnosti sadrži jedan ili više gena za otpornost na lijekove, kako bi se omogućilo selekciju transformiranih stanica. Ovaj vektor se zatim transformira u aveC– stanice domaćina poznatim tehnikama, a transformirane stanice se selekcionira i kultivira u odgovarajućim fermentacijskim medijima, pod uvjetima koji omogućuju ili induciraju proizvodnju avermektina. Produkte fermentacije se zatim analizira HPLC-om, kako bi se odredilo sposobnost mutirane polinukleotidne molekule da komplementira stanicu domaćina. Nekoliko vektora koji nose mutirane polinukleotidne molekule koje mogu smanjiti odnos B2:B1 avermektina, uključujući pSE188, pSE199, pSE231, pSE239 i pSE290 do pSE297, prikazuje se u primjerima u Poglavlju 8.3, niže.

Ovaj izum odnosi se na postupak određivanja mutacija aveC ORF-a u bakteriji S. avermitilis, koje mogu promijeniti odnos i/ili količinu proizvedenih avermektina. U poželjnoj izvedbi, ovaj izum odnosi se na postupak određivanja mutacija aveC ORF-a koje mogu promijeniti odnos klase 2:1 proizvedenih avermektina, koji se sastoji u: (a) određivanju odnosa klase 2:1 avermektina koje proizvode stanice soja bakterije S. avermitilis, kod kojih je njihov nativni aveC alel inaktiviran, a u koji je uvedena i eksprimira se polinukleotidna molekula s nukleotidnim slijedom koji kodira mutirani genski produkt AveC; (b) određivanju odnosa klase 2:1 avermektina koje proizvode stanice istog soja bakterije S. avermitilis kao u koraku (a), ali koje umjesto toga eksprimiraju samo divlji tip aveC alela ili aveC alel s nukleotidnim slijedom kao kod ORF-a na Slici 1 (SEQ ID NO: 1), ili njima homologni nukleotidni slijed; i (c) usporedbi odnosa klase 2:1 avermektina koje proizvode S. avermitilis stanice iz koraka (a) s odnosom klase 2:1 avermektina koje proizvode S. avermitilis stanice iz koraka (b); ako je odnos klase 2:1 proizvedenih avermektina od strane bakterije S. avermitilis stanice iz koraka (a) različit od odnosa klase 2:1 avermektina koje proizvode S. avermitilis stanice iz koraka (b), mutacija aveC ORFa, koja može promijeniti odnos klase 2:1 avermektina, je određena. U poželjnoj izvedbi, odnos klase 2:1 avermektina je smanjen mutacijom.

U daljnjoj poželjnoj izvedbi, ovaj izum se odnosi na postupak određivanja mutacija u aveC ORF-u ili genetičkim konstruktima koji sadrže aveC ORF, koji može promijeniti količinu proizvedenih avermektina, koji se sastoji u: (a) određivanju količine avermektina koje proizvode stanica soja bakterije S. avermitilis, kod kojeg je ovdje nativni aveC alel inaktiviran, a u koji se uvede i eksprimira polinukleotidna molekula s nukleotidnim slijedom koji kodira mutirani genski produkt AveC ili koji sadrži genetički konstrukt s nukleotidnim slijedom koji kodira genski produkt AveC; (b) određivanju količine avermektina koje proizvode stanice istog soja bakterije S. avermitilis kao u koraku (a), ali koje umjesto toga eksprimiraju samo divlji tip aveC alela, ili njemu homologni nukleotidni slijed; i (c) usporedbi količine avermektina koje proizvode S. avermitilis stanice iz koraka (a) s količinom avermektina koje proizvode S. avermitilis stanice iz koraka (b); ako je količina avermektina koje proizvode S. avermitilis stanice iz koraka (a) različita od količine avermektina koje proizvode S. avermitilis stanice iz koraka (b), mutacija aveC ORF ili genskog konstrukta, koja može promijeniti količinu avermektina, je određena. U poželjnoj izvedbi, količina avermektina je povećana mutacijom.

Bilo koji od prethodno navedenih postupaka treba provesti uz upotrebu fermantacijskog medija za kulturu u koji se po mogućnosti dodaje cikloheksankarboksilna kiselina, iako se također može upotrijebiti i druge prekursore, poput bilo kojeg masnokiselinskog prekursora navedenog u Tablici 1.

Jednom kada se odredi mutiranu polinukleotidnu molekulu koja modulira proizvodnju avermektina, može se odrediti lokacija mutacije u nukleotidnom slijedu. Primjerice, polinukleotidnu molekulu s nukleotidnim slijedom koji kodira mutirani genski produkt AveC može se izolirati PCR-om i podvrgnuti analizi slijeda DNA poznatim postupcima u ovom području tehnike. Usporedbom DNA slijeda mutiranog aveC alela s onim kod aveC alela divljeg tipa, može se odrediti mutaciju(e) odgovornu(e) za promjenu u proizvodnji avermektina. U specifičnim, ali neograničavajućim izvedbama ovog izuma, S. avermitilis genski produkti AveC koji sadrže bilo kakvu aminokiselinsku supstituciju na bilo kojem od ostataka 55 (S55F), 138 (S138T), 139 (A139T), ili 230 (G230D), ili dvostruke supstitucije na položajima 138 (S138T) i 139 (A139T ili A139F), dovode do promjene u funkciji genskog produkta AveC, gdje je odnos klase 2:1 proizvedenih avermektina promijenjen (vidjeti Poglavlje 8, niže), pri čemu navedeni aminokiselinski položaji odgovaraju onima prikazanim na Slici 1 (SEQ ID NO: 2). Osim toga, pokazalo se da slijedećih sedam kombinacija mutacija djelotvorno smanjuje odnos klase 2:1 avermektina: (1) D48E/A89T; (2) S138T/A139T/G179S; (3) Q38P/L136P/E238D; (4) F99S/S138T/A139T/G179S; (5) A139T/M228T; (6) G111V/P289L; (7) A139T/K154E/Q298H. Kao što se ovdje upotrebljava, prethodno navedene oznake, kao što je A139T, odnose se na izvorni aminokiselinski ostatak oznažen jednoslovnom oznakom, u ovom slučaju alanin (A), na označenom položaju, u ovom primjeru 139 (odnosi se na SEQ ID NO: 2) polipeptida, nakon čega slijedi aminokiselinski ostatak koji zamjenjuje izvorni aminokiselinski ostatak, u ovom slučaju treonin (T). Analogno tome, polinukleotidne molekule s nukleotidnim sljedovima koji kodiraju mutirane S. avermitilis genske produkte AveC koji sadrže supstitucije ili delecije na jednom ili više aminokiselinskih položaja 38, 48, 55, 89, 99, 111, 136, 138, 139, 154, 179, 228, 230, 238, 266, 275, 289 ili 298 (vidjeti Sliku 1), ili bilo koju njihovu kombinaciju, obuhvaćeni su ovim izumom.

U poželjnoj izvedbi, takve mutacije kodiraju aminokiselinske supstitucije koje se bira između jedne ili više iz grupe koju čine:

(a) aminokiselinski ostatak Q na položaju 38, kojeg se zamjenjuje s P ili s aminokiselinom koja je konzervativna supstitucija za P;

(b) aminokiselinski ostatak D na položaju 48, kojeg se zamjenjuje s E ili s aminokiselinom koja je konzervativna supstitucija za E;

(c) aminokiselinski ostatak A na položaju 89, kojeg se zamjenjuje s T ili s aminokiselinom koja je konzervativna supstitucija za T;

(d) aminokiselinski ostatak F na položaju 99, kojeg se zamjenjuje sa S ili s aminokiselinom koja je konzervativna supstitucija za S;

(e) aminokiselinski ostatak G na položaju 111, kojeg se zamjenjuje s V ili s aminokiselinom koja je konzervativna supstitucija za V;

(f) aminokiselinski ostatak L na položaju 136, kojeg se zamjenjuje s P ili s aminokiselinom koja je konzervativna supstitucija za P;

(g) aminokiselinski ostatak S na položaju 138, kojeg se zamjenjuje s T ili s aminokiselinom koja je konzervativna supstitucija za T;

(h) aminokiselinski ostatak A na položaju 139, kojeg se zamjenjuje s T ili F, ili s aminokiselinom koja je konzervativna supstitucija za T ili F;

(i) aminokiselinski ostatak K na položaju 154, kojeg se zamjenjuje s E ili s aminokiselinom koja je konzervativna supstitucija za E;

(j) aminokiselinski ostatak G na položaju 179, kojeg se zamjenjuje sa S ili s aminokiselinom koja je konzervativna supstitucija za S;

(k) aminokiselinski ostatak M na položaju 228, kojeg se zamjenjuje s T ili s aminokiselinom koja je konzervativna supstitucija za T;

(l) aminokiselinski ostatak E na položaju 238, kojeg se zamjenjuje s D ili s aminokiselinom koja je konzervativna supstitucija za D;

(m) aminokiselinski ostatak P na položaju 289, kojeg se zamjenjuje s L ili s aminokiselinom koja je konzervativna supstitucija za L; i

(n) aminokiselinski ostatak Q na položaju 298, kojeg se zamjenjuje s H ili s aminokiselinom koja je konzervativna supstitucija za H;

gdje su konzervativne aminokiselinske supstitucije kao što je definirano gore u Poglavlju 5.1.

U daljnjoj poželjnoj izvedbi, takve mutacije kodiraju kombinaciju aminokiselinskih supstitucija, gdje se kombinaciju supstituiranih aminokiselinskih ostataka bira iz grupe koju čine:

(a) aminokiselinski ostaci S138 i A139;

(b) aminokiselinski ostaci D48 i A89;

(c) aminokiselinski ostaci S138, A139 i G179;

(d) aminokiselinski ostaci Q38, L136 i E238;

(e) aminokiselinski ostaci F99, S138, A139 i G179;

(f) aminokiselinski ostaci A139 i M228;

(g) aminokiselinski ostaci G111 i P289; i

(h) aminokiselinski ostaci A139, K154 i Q298.

U daljnjoj poželjnoj izvedbi, specifične kombinacije mutacija u aveC alelu korisne u djelotvornom smanjivanju odnosa klase 2:1 avermektina prema ovom izumu bira se između jedne ili više iz grupe koju čine:

(a) S138T/A139T;

(b) S138T/A139F;

(c) D48E/A89T;

(d) S138T/A139T/G179S;

(e) Q38P/L136P/E238D;

(f) F99S/S138T/A139T/G179S;

(g) A139T/M228T;

(h) G111V/P289L; i

(i) A139T/K154E/Q298H.

Ovaj izum se također odnosi na pripravke za dobivanje novih sojeva S. avermitilis, čije stanice sadrže mutirani aveC alel, što rezultira promjenom proizvodnje avermektina. Primjerice, ovaj izum odnosi se na rekombinantne vektore koje se može upotrijebiti za usmjeravanje bilo kojih polinukleotidnih molekula, koje sadrže mutirani nukleotidni slijed prema ovom izumu, prema mjestu aveC gena na S. avermitilis kromosomu, kako bi se homolognom rekombinacijom bilo ubacilo unutar ili zamijenilo aveC ORF ili njegov dio. Prema ovom izumu, međutim ovdje navedena polinukleotidna molekula, s mutiranim nukleotidnim slijedom prema ovom izumu, može također imati funkciju u modulaciji biosinteze avermektina kada je se insertira u S. avermitilis kromosom na mjesto različito od aveC gena, ili kada je se održava u obliku episoma u S. avermitilis stanicama. Prema tome, ovaj izum također opisuje vektore koji sadrže polinukleotidnu molekulu s mutiranim nukleotidnim slijedom prema ovom izumu, gdje se ove vektore može upotrijebiti za insertiranje polinukleotidne molekule na mjesto u S. avermitilis kromosomu različitom od aveC gena, ili ih se može održavati u obliku episoma.

U poželjnoj izvedbi, ovaj se izum odnosi na vektore genske zamjene, koje se može upotrijebiti za ubacivanje mutiranog aveC alel ili njegove degenerirane varijante u stanice soja bakterije S. avermitilis čime se dobije nove sojeve bakterije S. avermitilis, čije stanice proizvode avermektine u promijenjenom odnosu klase 2:1, u usporedbi sa stanicama istog soja koje umjesto toga eksprimiraju samo divlji tip aveC alela. U poželjnoj izvedbi, odnos klase 2:1 avermektina koje proizvode stanice je smanjen. Takve vektore genske zamjene može se konstruirati mutiranim polinukleotidnim molekulama prisutnim u ekspresijskim vektorima prema ovom izumu, kao što su, npr. pSE188, pSE199 i pSE231, pri čemu su ovi ekspresijski vektori prikazani u primjerima u Poglavlju 8 niže.

U daljnjoj poželjnoj izvedbi, ovaj izum odnosi se na vektore koje se može upotrijebiti za ubacivanje mutiranih aveC alela ili njegove degenerirane varijante u stanice soja S. avermitilis, kako bi se dobilo nove sojeve stanica koji proizvode promijenjene količine avermektina, u usporedbi sa stanicama istog soja koji umjesto toga eksprimira samo divlji aveC alel. U poželjnoj izvedbi, količina avermektina koje proizvode stanice je povećana. U specifičnom, ali neograničavajućoj izvedbi, takav vektor također sadrži jak promotor kao što je poznato u ovom području tehnike, npr. snažni konstitutivni ermE promotor iz bakterije Saccharopolyspora erythraea, koji se nalazi uzvodno od, i u operativnoj asocijaciji s aveC alelom. Takav vektor može biti plazmid pSE189, opisan u Primjeru 11 niže, ili može se konstruirati pomoću mutiranog aveC alela s plazmida pSE189.

U daljnjoj poželjnoj izvedbi, ovaj izum odnosi se na vektore genske zamjene korisne za inaktiviranje aveC gena u soju bakterije S. avermitilis divljeg tipa. U neograničavajućoj izvedbi, takve vektore genske zamjene može se konstruirati pomoću mutirane polinukleotidne molekule prisutne u plazmidu pSE180 (ATCC 209605), što je prikazano u primjeru u Poglavlju 8, niže (Slika 3). Ovaj izum se također odnosi na vektore genske zamjene koji sadrže polinukleotidnu molekulu koja sadrži ili se sastoji od nukleotidnih sljedova, prirodno pobočnih aveC genu in situ u S. avermitilis kromosomu, uključujući, npr. one pobočne nukleotidne sljedove prikazane na Slici 1 (SEQ ID NO: 1), gdje se ove vektore može upotrijebiti za deleciju S. avermitilis aveC ORF-a.

Ovaj izum se također odnosi na postupke dobivanja novih sojeva bakterije S. avermitilis, koje čine stanice koje eksprimiraju mutirani aveC alel i koje proizvode promijenjeni odnos i/ili količinu avermektina, u usporedbi sa stanicama istog soja bakterije S. avermitilis, koje umjesto toga eksprimiraju samo divlji tip aveC alela. U poželjnoj izvedbi, ovaj izum odnosi se na postupak dobivanja novih sojeva bakterije S. avermitilis koje čine stanice koje eksprimiraju mutirani aveC alel i koje proizvode promijenjeni odnos klase 2:1 avermektina, u usporedbi sa stanicama istog soja bakterije S. avermitilis, koje umjesto toga eksprimiraju samo divlji aveC alela, koji se sastoje u transformaciji stanica soja bakterije S. avermitilis vektorom koji nosi mutirani aveC alel koji kodira genski produkt koji mijenja odnos klase 2:1 avermektina koje proizvode stanice soja bakterije S. avermitilis, koje eksprimiraju mutirani aveC alel, u usporedbi sa stanicama istog soja, koje umjesto toga eksprimiraju samo divlji aveC alel, te selekciji transformiranih stanica koje proizvode avermektine u promijenjenom odnosu klase 2:1 u usporedbi s odnosom klase 2:1 kako ga proizvode stanice istog soja, koji umjesto toga eksprimira samo divlji aveC alel. U još poželjnijem obliku, ovaj izum odnosi se na postupak dobivanja novih sojeva bakterije S. avermitilis, koji se sastoji u transformaciji stanica soja bakterije S. avermitilis vektorom koji može uvesti mutaciju u aveC alel takvih stanica, gdje ta mutacija na aveC alelu u kodiranom genskom produktu AveC rezultira supstitucijom različitog aminokiselinskog ostatka na jednom ili više aminokiselinskih položaja, koji odgovaraju aminokiselinskim ostacima 38, 48, 55, 89, 99, 111, 136, 138, 139, 154, 179, 228, 230, 238, 266, 275, 289 ili 298 iz SEQ ID NO: 2, tako da stanice S. avermitilis soja kod kojeg je aveC alel tako mutiran proizvode odnos klase 2:1 avermektina različit od odnosa koji proizvode stanice istog S. avermitilis soja, koje umjesto toga eksprimiraju samo divlji tip aveC alela. U poželjnoj izvedbi, promijenjen odnos klase 2:1 avermektina je smanjen.

Kao što se ovdje upotrebljava, gdje se za aminokiselinski ostatak koji kodira aveC alel na S. avermitilis kromosomu, ili vektor ili izolirana polinukleotidna molekula prema ovom izumu, upotrebljava izraz da "odgovara" određenom aminokiselinskom ostatku iz SEQ ID NO: 2, ili gdje se za aminokiselinsku supstituciju upotrebljava izraz da se javlja na određenom položaju koja "odgovara" specifičnom, obrojčanom aminokiselinskom ostatku iz SEQ ID NO: 2, namjera je da se izraz odnosi na aminokiselinski ostatak na istoj relativnoj lokaciji u genskom produktu AveC, koju stručnjak u ovom području tehnike može brzo odrediti u odnosu na aminokiselinski slijed, prikazan ovdje kao SEQ ID NO: 2.

Ovaj izum se također odnosi na postupke dobivanja novih sojeva, gdje se specifične mutacije u aveC alelu, koje kodiraju određene mutacije, navodi kao promjene baza na specifičnim nukleotidnim položajima u aveC alelu koje "odgovaraju" određenim nukleotidnim položajima, kao što je prikazano u SEQ ID NO: 1. Kao gore, u odnosu na odgovarajuće aminokiselinske položaje, gdje se za nukleotidni položaj u aveC alelu upotrebljava izraz da "odgovara" određenom nukleotidnom položaju u SEQ ID NO: 1, namjera je da se ovo odnosi na nukleotide na istoj relativnoj lokaciji u aveC nukleotidnom slijedu, koju stručnjak u ovom području tehnike može brzo odrediti na osnovu reference na nukleotidni slijed prikazan ovdje kao SEQ ID NO: 1.

U daljnjoj poželjnoj izvedbi, ovaj izum odnosi se na postupak dobivanja novih sojeva bakterije S. avermitilis, koje čine stanice koje proizvode promijenjene količine avermektina, koji se sastoji u transformaciji stanica soja bakterije S. avermitilis vektorom koji nosi mutirani aveC alel ili genetički konstrukt koji sadrži aveC alel, čija ekspresija rezultira promijenjenom količinom avermektina koje proizvode stanice soja bakterije S. avermitilis, koje eksprimiraju mutirani aveC alel ili genetički konstrukt, u usporedbi sa stanicama istog soja, koje umjesto toga eksprimiraju samo divlji tip aveC alela, i selekciji transformiranih stanica koje proizvode avermektine u promijenjenoj količini, u usporedbi s količinom avermektina koje proizvode stanice istog soja, koje umjesto toga eksprimiraju samo divlji tip aveC alela. U poželjnoj izvedbi, količina proizvedenih avermektina je povećana u stanicama novog soja.

U daljnjoj poželjnoj izvedbi, ovaj izum odnosi se na postupak dobivanja novih sojeva bakterije S. avermitilis, čije stanice sadrže inaktivirani aveC alel, koji se sastoji u transformaciji stanica soja bakterije S. avermitilis, koje eksprimiraju bilo koji aveC alel, vektorom koji inaktivira aveC alel i selekciji transformiranih stanica u kojima je aveC alel inaktiviran. U poželjnoj, iako neograničavajućoj izvedbi, stanice soja bakterije S. avermitilis su transformirane vektorom genske zamjene, koji nosi aveC alel inaktiviran mutacijom ili zamjenom dijela aveC alela slijedom iz heterolognog gena, i selekciji takvih transformiranih stanica u kojima je njihov inače nativni aveC alel, kojeg se zamjenjuje inaktiviranim aveC alelom. Inaktivaciju aveC alela može se odrediti HPLC analizom produkata fermentacije, kao što je opisano niže. U specifičnom iako neograničavajućoj izvedbi opisanoj u Poglavlju 8.1 niže, aveC alel je inaktiviran insercijom ermE gena iz bakterije Saccharopolyspora erythraea u aveC ORF-u.

Ovaj izum se također odnosi na nove sojeve bakterije S. avermitilis, koje čine stanice transformirane bilo kojim polinukleotidnom molekulom ili vektorom prema ovom izumu. U poželjnoj izvedbi, ovaj izum odnosi se na nove sojeve bakterije S. avermitilis, koje čine stanice koje eksprimiraju mutirani aveC alel ili njegovu degeneriranu varijantu umjesto, ili kao dodatak, divljem tipu aveC alela, gdje stanice novog soja proizvode avermektine u promijenjenom odnosu klase 2:1, u usporedbi s odnosom klase 2:1 avermektina koje proizvode stanice istog soja, koje umjesto toga eksprimiraju samo divlji tip aveC alela. U poželjnoj izvedbi, promijenjeni odnos klase 2:1, kako ga proizvode nove stanice, je smanjen. Takvi novi sojevi korisni su u industrijskoj proizvodnji tržišno poželjnih avermektina, poput doramektina. U poželjnijoj izvedbi, ovaj izum odnosi se na stanice bakterije S. avermitilis, koje sadrže bilo koju od gore navedenih mutacija ili kombinacije mutacija u aveC alelu na nukleotidnim položajima, koje odgovaraju onima prikazanim gore, ili koje inače kodiraju bilo koju od gore navedenih aminokiselinskih supstitucija u genskom produktu AveC. Iako takve mutacije mogu biti prisutne u takvim stanicama u ekstrakromosomskom elementu poput plazmida, po mogućnosti su takve mutacije prisutne u aveC alelu smještenom na S. avermitilis kromosomu. U poželjnoj izvedbi, ovaj izum odnosi se na soj bakterije Streptomyces avermitilis, koji čine stanice koje imaju mutacije u aveC alelu, koji kodira genski produkt AveC, sa supstitucijom na jednom ili više aminokiselinskih položaja, koji odgovaraju aminokiselinskim ostacima 38, 48, 55, 89, 99, 111, 136, 138, 139, 154, 179, 228, 230, 238, 266, 275, 289, ili 298 iz SEQ ID NO: 2, gdje stanice koje proizvode odnos klasa 2:1 avermektina različit od odnosa kako ga proizvode stanice istog soja bakterije S. avermitilis, koji eksprimira divlji tip aveC alela.

Osnovni cilj ovdje opisanih preglednih testova je određivanje mutiranih alela aveC gena, čija ekspresija u S. avermitilis stanicama mijenja i, specifičnije, smanjuje odnos klase 2:1 proizvedenih avermektina. U poželjnoj izvedbi, odnos B2:B1 avermektina koji proizvode stanice novog S. avermitilis soja prema ovom izumu, koji eksprimira mutirani aveC ili njegovu degeneriranu varijantu prema ovom izumu je oko 1,6:1 ili manje. U poželjnijoj izvedbi, odnos je oko 1:1 ili manji. U poželjnijoj izvedbi, odnos je oko 0,84:1 ili manje. U poželjnijoj izvedbi odnos je oko 0,80:1 ili manje. U poželjnijoj izvedbi odnos je oko 0,75:1 ili manje. U poželjnijoj izvedbi odnos je oko 0,73:1 ili manje. U poželjnijoj izvedbi odnos je oko 0,68:1 ili manje. U poželjnijoj izvedbi odnos je oko 0,67:1 ili manje. U poželjnijoj izvedbi odnos je oko 0,57:1 ili manje. U poželjnijoj izvedbi odnos je oko 0,53:1 ili manje. U poželjnijoj izvedbi odnos je oko 0,42:1 ili manje. U poželjnijoj izvedbi odnos je oko 0,40:1 ili manje.

U specifičnoj izvedbi opisanoj niže, nove stanice prema ovom izumu proizvode cikloheksil B2:cikloheksil B1 avermektine u odnosu manjem od 1,6:1. U drugačijoj specifičnoj izvedbi, opisanoj niže, nove stanice prema ovom izumu proizvode cikloheksil B2:cikloheksil B1 avermektine u odnosu od oko 0,94:1. U daljnjoj drugačijoj specifičnoj izvedbi, opisanoj niže, nove stanice prema ovom izumu proizvode cikloheksil B2:cikloheksil B1 avermektine u odnosu od oko 0,88:1. U daljnjoj drugačijoj specifičnoj izvedbi, opisanoj niže, nove stanice prema ovom izumu proizvode cikloheksil B2:cikloheksil B1 avermektine u odnosu od oko 0,84:1. U još daljnjoj drugačijoj specifičnoj izvedbi, opisanoj niže, nove stanice prema ovom izumu proizvode cikloheksil B2:cikloheksil B1 avermektine u odnosu od oko 0,75:1. U još daljnjoj drugačijoj specifičnoj izvedbi, opisanoj niže, nove stanice prema ovom izumu proizvode cikloheksil B2:cikloheksil B1 avermektine u odnosu od oko 0,73:1. U još daljnjoj drugačijoj specifičnoj izvedbi, opisanoj niže, nove stanice prema ovom izumu proizvode cikloheksil B2:cikloheksil B1 avermektine u odnosu od oko 0,68:1. U još daljnjoj drugačijoj specifičnoj izvedbi, opisanoj niže, nove stanice prema ovom izumu proizvode cikloheksil B2:cikloheksil B1 avermektine u odnosu od oko 0,67:1. U još daljnjoj drugačijoj specifičnoj izvedbi, opisanoj niže, nove stanice prema ovom izumu proizvode cikloheksil B2:cikloheksil B1 avermektine u odnosu od oko 0,57:1. U još daljnjoj drugačijoj specifičnoj izvedbi, opisanoj niže, nove stanice prema ovom izumu proizvode cikloheksil B2:cikloheksil B1 avermektine u odnosu od oko 0,53:1. U još daljnjoj drugačijoj specifičnoj izvedbi, opisanoj niže, nove stanice prema ovom izumu proizvode cikloheksil B2:cikloheksil B1 avermektine u odnosu od oko 0.42:1. U pogotovo još daljnjoj drugačijoj specifičnoj izvedbi, opisanoj niže, nove stanice prema ovom izumu proizvode cikloheksil B2:cikloheksil B1 avermektine u odnosu od oko 0,40:1.

U daljnjoj poželjnoj izvedbi, ovaj izum se odnosi na nove sojeve bakterije S. avermitilis, koje čine stanice koje eksprimiraju mutirani aveC alel ili njegovu degeneriranu varijantu ili genetički konstrukt koji sadrži aveC alel ili njegovu degeneriranu varijantu, umjesto, ili kao dodatak, divljem tipu aveC alela, gdje stanice novog soja proizvode promijenjenu količinu avermektina u usporedbi sa stanicama istog soja koje umjesto toga eksprimiraju samo divlji tip aveC alela. U poželjnoj izvedbi novi soj proizvodi povećanu količinu avermektina. U neograničavajućoj izvedbi, genetički konstrukt također sadrži snažan promotor, poput snažnog konstitutivnog ermE promotora iz bakterije Saccharopolyspora erythraea, uzvodno od i u operativnoj asocijaciji s aveC ORFom.

U daljnjoj poželjnoj izvedbi, ovaj izum odnosi se na nove sojeve bakterije S. avermitilis, koje čine stanice u kojima je aveC gen inaktiviran. Takvi sojevi korisni su i zbog različitog spektra avermektina koji proizvode u usporedbi sa sojem divljeg tipa, kao i za pregledne testove komplementacije kao što su ovdje opisani, kako bi se odredilo ima li usmjerena ili slučajna mutageneza aveC gena utjecaja na proizvodnju avermektina. U specifičnoj izvedbi opisanoj niže, S. avermitilis stanice domaćina obrađene su genetskim inženjeringom tako da sadrže inaktivirani aveC gen. Primjerice, soj SE180-11, opisan u primjerima niže, dobiven je upotrebom plazmida genske zamjene pSE180 (ATCC 209605) (Slika 3), konstruiranog za inaktiviranje S. avermitilis aveC gena insercijom ermE gena za otpornost u aveC kodirajuću regiju.

Ovaj izum se također odnosi na rekombinantno eksprimirane mutirane S. avermitilis genske produkte AveC, koje kodira bilo koja od gore navedenih polinukleotidnih molekula prema ovom izumu, kao i na postupke njegovog dobivanja.

Ovaj izum se također odnosi na postupak proizvodnje avermektina, koji se sastoji u kultiviranju stanica soja bakterije S. avermitilis, gdje te stanice eksprimiraju mutirani aveC alel, koji kodira produkt gena koji mijenja odnos klase 2:1 avermektina koje proizvode stanice soja S. avermitilis, koje eksprimiraju mutirani aveC alel, u usporedbi sa stanicama istog soja, koje umjesto toga eksprimiraju samo divlji tip aveC alela, u mediju za kulturu, pod uvjetima koji tu omogućuju ili induciraju proizvodnju avermektina, kao i prikupljanje navedenih avermektina iz kulture. U poželjnoj izvedbi, odnos klase 2:1 avermektina, koje u kulturi proizvode stanice koje eksprimiraju mutirani aveC alel, je smanjen. Ovaj postupak omogućuje povećanu djelotvornost u proizvodnji tržišno vrijednih avermektina, poput doramektina.

Ovaj izum se također odnosi na postupak proizvodnje avermektina, koji se sastoji u kultiviranju stanica soja bakterije S. avermitilis, gdje te stanice eksprimiraju mutirani aveC alel ili genetički konstrukt koji sadrži aveC alel, što rezultira proizvodnjom promijenjene količine avermektina od strane stanica soja bakterije S. avermitilis, koje eksprimiraju mutirani aveC alel ili genetički konstrukt, u usporedbi sa stanicama istog soja koje ne eksprimiraju mutirani aveC alel ili genetički konstrukt, već umjesto toga eksprimiraju samo divlji tip aveC alela, u mediju za kulturu pod uvjetima koji omogućuju ili induciraju proizvodnju avermektina odatle, kao na i prikupljanje navedenih avermektina iz kulture. U poželjnoj izvedbi, količina avermektina koje proizvode u kulturi stanice koje eksprimiraju mutirani aveC alel, degeneriranu varijantu ili genetički konstrukt je povećana.

Ovaj izum se također odnosi na nove smjese avermektina koje proizvodi soj bakterije S. avermitilis koji eksprimira mutirani aveC alel ili njegovu degeneriranu varijantu, koji kodira genski produkt koji smanjuje odnos klase 2:1 avermektina koje proizvode stanice soja bakterije S. avermitilis, koje eksprimiraju mutirani aveC alel ili njegovu degeneriranu varijantu, u usporedbi sa stanicama istog soja, koje umjesto toga eksprimiraju samo divlji tip aveC alela, gdje su avermektini u novoj smjesi proizvedeni u smanjenom odnosu klase 2:1 u usporedbi s odnosom klase 2:1 avermektina kako ih proizvode stanice istog soja bakterije S. avermitilis, koji umjesto toga eksprimira samo divlji tip aveC alela. Nova smjesa avermektina može biti kao što je proizvedena u iscrpljenoj tekućini za fermentacijsku kulturu ili je se može odatle prikupiti. Novu smjesu avermektina može se djelomično ili bitno pročistiti iz tekućine za kulturu poznatim biokemijskim tehnikama pročišćavanja, poput taloženja amonij-sulfatom, dijalizom, frakcioniranjem na osnovu veličine, ionskoizmjenjivačkom kromatografijom, HPLC-om itd.

4. Upotrebe avermektina

Avermektini su visoko aktivni antiparazitici, osobito korisni kao anthelmintici, ektoparazitocidi, insekticidi i akaricidi. Spojevi avermektina proizvedeni u skladu s postupcima prema ovom izumu korisni su za bilo koju od ovih upotreba. Primjerice, avermektinski spojevi proizvedeni prema ovom izumu korisni su u liječenju raznih bolesti ili stanja kod ljudi, osobito tamo gdje su te bolesti ili stanja uzrokovani parazitskim infekcijama, kao što je poznato u ovom području tehnike. Vidjeti, npr. Ikeda i Omura: "Chem. Rev.", 97(7): 2591-2609, (1997.). Specifičnije, avermektinski spojevi proizvedeni prema ovom izumu djelotvorni su u liječenju niza bolesti ili stanja uzrokovanih endoparazitima, poput parazitskih nematoda, koje mogu inficirati ljude, domaće životinje, svinje, ovce, perad, konje ili goveda.

Specifičnije, spojevi avermektina, dobiveni prema ovom izumu, djelotvorni su protiv nematoda koji inficiraju ljude, kao i onih koje inficiraju razne vrste životinja. Takve nematode uključuju želučanocrijevne parazite, primjerice Ancylostoma, Necator, Ascaris, Strongyloides, Trichinella, Capillaria, Trichuris, Enterobius, Dirofilaria, te parazite nađene u krvi ili drugim tkivima ili organima, poput filarijskih crvića i izlučenih crijevnih stadija nematoda Strongyloides i Trichinella.

Spojevi avermektina, dobiveni prema ovom izumu, također su korisni i u liječenju ektoparazitskih infekcija, uključujući, npr. infestacije sisavaca i ptica s člankonošcima, koje uzrokuju krpelji, grinje, uši, buhe, muhe zujare, kukci koji ujedaju, ili seleće ličinke dvokrilaca, koji, između ostalog, mogu napasti goveda i konje.

Spojevi avermektina, dobiveni prema ovom izumu, također su korisni i kao insekticidi protiv kućne gamadi poput, između ostalog, žohara, suknenog moljca, kožuškara i kućne muhe, kao i kukaca štetnika na uskladištenom žitu i poljoprivrednom bilju, gdje ti štetnici, između ostalog, uključuju paučaste grinje, biljne uši, gusjenice, te ravnokrilce poput skakavaca.

Životinje koje se može liječiti spojevima avermektina, dobivenim prema ovom izumu, uključuju ovce, goveda, konje, jelensku divljač, koze, svinje, ptice, uključujući perad, te pse i mačke.

Avermektinske spojeve proizvedene prema ovom izumu primjenjuje se u pripravcima koji odgovaraju specifičnoj namjeravanoj upotrebi, određenoj vrsti životinja koju se liječi, kao i parazitu ili insektu koji je u pitanju. Prilikom upotrebe kao parazitocidi, avermektinske spojeve proizvedene prema ovom izumu može se primijeniti oralno u obliku kapsule, velike pilule, tablete ili tekućeg pripravka ili, alternativno primijeniti kao infuziju, ili injekcijom, ili kao implantat. Takve pripravke pripravlja se na konvencionalan način u skladu sa standardnom veterinarskom praksom. Prema tome, kapsule, velike pilule ili tablete može se pripraviti miješanjem aktivnog sastojka s odgovarajućim fino razdijeljenim razrjeđivačem ili podlogom i dodatno sadržavati dezintegrans i/ili vezivo, poput škroba, laktoze, talka, magnezij-stearata itd. Tekući pripravak može se pripremiti disperzijom aktivnog sastojka u vodenoj otopini zajedno s dispergirajućim sredstvom ili močilom itd. Injektibilne pripravke može se pripraviti u obliku sterilne otopine, koja može sadržavati druge tvari poput, npr. dovoljno soli i/ili glukoze, kako bi se dobilo otopinu izotoničnu s krvlju.

Takvi pripravci će varirati u odnosu na težinu aktivnog spoja ovisno o pacijentu, ili životinjskoj vrsti koju treba liječiti, ozbiljnosti i tipu infekcije, kao i o tjelesnoj težini domadara. U općem slučaju, za oralnu primjenu zadovoljavajuća je doza aktivnog spoja od oko 0,001-10 mg/kg tjelesne težine pacijenta ili životinje u obliku pojedinačne doze ili u podijeljenim dozama u periodu od 1-5 dana. Mogući su, međutim, slučajevi gdje je indicirana viša ili niža doza, kao što određuje, npr. liječnik ili veterinar, a na osnovu kliničkih simptoma.

Kao alternativa, avermektinski spoj proizvoden prema ovom izumu može biti pripraviti u kombinaciji životinjskim krmivom, a u ovu svrhu koncentrirani aditiv hrani ili premiks za miješanje s normalnim životinjskim krmivom.

Prilikom upotrebe kao insekticid, ili za tretiranje poljoprivrednih štetnika, avermektinski spoj proizveden prema ovom izumu može se primijeniti u obliku spreja, praška, emulzije i slično, u skladu standardnom poljoprivrednom praksom.

PRIMJER: FERMENTACIJA STREPTOMYCES AVERMITILIS I ANALIZA B2:B1 AVERMEKTINA

Sojevi kojima nedostaju aktivnosti i dehidrogenaze razgranatih 2-oksokiselina i 5-O-metiltransferaze ne proizvode avermektine ukoliko fermentacijskom mediju nisu dodane masne kiseline. Ovaj primjer ukazuje da se od takvih mutanata može dobiti širok opseg odnosa B2:B1 avermektina, kada se biosintezu započne u prisustvu različitih masnih kiselina.

1. Materijali i postupci

Streptomyces avermitilis ATCC 53692 skladišti se na –70 °C kao cjeloviti bujon, pripravljen u mediju za nasađivanje, koji sadrži: škrob (Nadex, Laing National), 20 g; Pharmamedia (Trader's Protein, Memphis, TN), 15 g; Ardamine pH (Yeast Products Inc.), 5 g; kalcijkarbonat, 1 g. Konačni volumen podesi se vodom iz vodovoda na 1 l, pH podesi na 7,2, a medij 25 minuta autoklavira na 121 °C.

2 ml otopljene suspenzije iz prethodnog dobivanja upotrijebi se za nasađivanje tikvice koja sadrži 50 ml istog medija. Nakon 48 sati inkubacije na 28 °C u rotacijskoj tresilici na 180 okretaja u minuti, 2 ml bujona upotrijebi se za nasađivanje tikvice koja sadrži 50 ml produkcijskog medija, koji sadrži: škrob, 80 g; kalcij-karbonat, 7 g; Pharmamedia, 5 g; dikalij-hidrogenfosfat, 1 g; magnezij-sulfat, 1 g; glutaminsku kiselinu, 0,6 g; željezo(II)-sulfat heptahidrat, 0,01 g; cink-sulfat, 0,001 g; mangan(II)-sulfat, 0,001 g. Konačni volumen podesi se vodom iz vodovoda na 1 l, pH podesi na 7,2, a medij 25 minuta autoklavira na 121 °C.

Različite karboksilnokiselinske supstrate (vidjeti Tablicu 1) otopi se u metanolu i doda u fermentacijski bujon 24 sata nakon nasađivanja, kako bi se dobilo konačnu koncentraciju od 0,2 g/l. Fermentacijski bujon inkubira se 14 dana na 28 °C, zatim se bujon centrifugira (2.500 okretaja u minuti tijekom 2 minute), a supernatant baci. Istaloženi micelij ekstrahira se acetonom (15 ml), zatim diklorometanom (30 ml), te se organska faza odvoji, filtrira, a zatim otpari do suhog. Ostatak se prebaci u metanol (1 ml) i analizira HPLC-om, HewlettPackard 1090A tekućinskim kromatografom, opremljenim skenirajućim detektorom s poljem dioda, podešenim na 240 nm. Upotrijebljeni stupac je Beckman Ultrasphere C-18, 5 µm, 4,6 mm × 25 cm stupac, održavan na 40 °C. 25 µl gore navedene metanolne otopine ubrizga se u stupac. Eluciju se provede linearnim gradijentom metanol:vode s 80:20 do 95:5, tijekom 40 minuta, uz protok od 0,85 ml u minuti. Dvije standardne koncentracije cikloheksila B1 upotrebljava se za kalibriranje odgovora detektora, te se mjeri površinu ispod krivulja za B2 i B1 avermektine.

2. Rezultati

Vremena zadržavanja tijekom HPLC-a opažena za B2 i B1 avermektine, te 2:1 odnosi, prikazani su u Tablici 1.

Tablica 1

[image]

Podaci prikazani u Tablici 1 pokazuju ekstremno široki raspon B2:B1 odnosa avermektinskih produkata, koji ukazuje na bitnu razliku u rezultatima dehidratacije spojeva klase 2 u spojeve klase 1, ovisno o prirodi prisutne početne jedinice bočnog lanca masne kiseline. Ovo ukazuje da promjene u odnosima B2:B1, koje su rezultat promjena u AveC proteinu mogu biti specifične za određene supstrate. Sljedstveno tome, pregled mutantata koji pokazuju promjene u odnosu B2:B1 dobivenom na određenom supstratu, trebalo bi izvesti u prisustvu tog supstrata. U slijedećim primjerima, opisanim niže, upotrebljava se cikloheksankarboksilna kiselina kao pregledni supstrat. Međutim, ovaj supstrat se upotrebljava samo kao dao primjer mogućnosti, bez namjere ograničavanja primjenjivosti predmetnog izuma.

PRIMJER: IZOLIRANJE aveC GENA

Ovaj primjer opisuje izoliranje i karakterizaciju regije na Streptomyces avermitilis kromosomu, koja kodira genski produkt AveC. Kao što je pokazano niže, opaženo je da aveC gen može modificirati odnos cikloheksilB2 prema cikloheksil-B1 (B2:B1) proizvedenih avermektina.

1. Materijali i postupci

1.1. Uzgoj bakterija roda Streptomyces za izolaciju DNA

Praćen je slijedeći postupak uzgoja bakterija roda Streptomyces. Pojedinačne kolonije S. avermitilis ATCC 31272 (izolat pojedinačne kolonije br. 2) izolirane su na YPD-6 1/2 jakosti, koji sadrži: Difco ekstrakt kvasca, 5 g; Difco Bacto-peptone, 5 g; glukozu, 2,5 g; MOPS, 5 g; Difco Bacto agar, 15 g. Konačni volumen podesi se s dH2O na 1 l, pH podesi na 7,0, a medij 25 minuta autoklavira na 121 °C.

Micelije uzgojene u gore navedenom mediju upotrebljava se za nasađivanje 10 ml TSB medija (Difco Triptic Soy Broth, 30 g, u 1 l dH2O, 25 minuta autoklaviranja na 121 °C) u epruveti od 25 × 150 mm, koja se 48-72 sata uz tresenje (300 okretaja u minuti) drži na 28 °C.

1.2. Izolacija kromosomske DNA iz bakterija roda Streptomyces

Alikvote (0,25 ml ili 0,5 ml) micelija uzgojenih kao što je opisano gore, prebaci se u epruvete za mikrocentrifugiranje od 1,5 ml, a stanice koncentrira centrifugiranjem na 12.000 × g, tijekom 60 sekundi. Supernatant se ukloni, a stanice resuspendira u 0,25 ml TSE pufera (20 ml 1,5 M saharoze, 2,5 ml 1 M TrisHCl, pH 8,0, 2,5 ml 1 M EDTA, pH 8,0, te 75 ml dH2O), s 2 mg/ml lizozima. Uzorke se 20 minuta inkubira na 37 °C uz tresenje, prebaci u AutoGen 540TM uređaj za automatsko izoliranje nukleinskih kiselina (Integrated Separation Systems, Natick, MA), a genomsku DNA izolira pomoću Cycle 159 (softverska oprema), u skladu s uputama proizvođača.

Alternativno, 5 ml micelija prebaci se u epruvetu od 17 × 100 mm, stanice koncentrira centrifugiranjem na 3.000 okretaja u minuti tijekom 5 minuta, a supernatant ukloni. Stanice se resuspendira u 1 ml TSE pufera, koncentrira centrifugiranjem na 3.000 okretaja u minuti tijekom 5 minuta, a supernatant ukloni. Stanice se resuspendira u 1 ml TSE pufera s 2 mg/ml lizozima, te 30-60 minuta inkubira na 37 °C uz tresenje. Nakon inkubacije, doda se 0,5 ml 10 % natrij-dodecil-sulfata (SDS), a stanice inkubira na 37 °C, do završetka lize. Lizat se 10 minuta inkubira na 65 °C, ohladi na sobnu temperaturu, razdijeli u dvije Eppendorf-epruvete od po 1,5 ml, te 1 × ekstrahira s 0,5 ml fenol/kloroforma (50 % fenol prethodno uravnotežen s 0,5 M Tris, pH 8,0, 50 % kloroformom). Vodenu fazu se ukloni i 2-5 × ekstrahira kloroform:izoamil-alkoholom (24:1). DNA se istaloži dodavanjem 1/10 volumena 3 M natrij-acetata, pH 4,8, smjesu 10 minuta inkubira na ledu, 10 minuta centrifugira na 15.000 okretaja u minuti na 5 °C, a supernatant prebaci u čistu epruvetu, u koju se doda 1 volumen izopropanola. Smjesu supernatanta s izopropanolom se zatim 20 minuta inkubira na ledu, 20 minuta centrifugira na 15.000 okretaja u minuti na 5 °C, supernatant uklon, a talog DNA 1 × ispere 70 % etanolom. Nakon što se talog osuši, DNA se resuspendira u TE puferu (10 mM Tris, 1 mM EDTA, pH 8,0).

1.3. Izolacija plazmidne DNA iz bakterija roda Streptomyces

Alikvot (1,0 ml) micelija prebaci se u epruvete za mikrocentrifugiranje od po 1,5 ml, a stanice se koncentrira centrifugiranjem na 12.000 × g tijekom 60 sekundi. Supernatant se ukloni, stanice resuspendira u 1,0 ml 10,3 % saharoze i koncentrira centrifugiranjem na 12.000 × g tijekom 60 sekundi, a supernatant ukloni. Stanice se zatim resuspendira u 0,25 ml TSE pufera s 2 mg/ml lizozima, te 29 minuta inkubira na 37 °C uz tresenje i prebaci u AutoGen 540TM uređaj za automatsko izoliranje nukleinskih kiselina. Plazmidnu DNA izolira se pomoću Cycle 106 (softverska oprema), u skladu s uputama proizvođača.

Alternativno, 1,5 ml micelija prebaci se u epruvete za mikrocentrifugiranje od po 1,5 ml, a stanice se koncentrira centrifugiranjem na 12.000 × g tijekom 60 sekundi. Supernatant se ukloni, stanice resuspendira u 1,0 ml 10,3 % saharoze i koncentrira centrifugiranjem na 12.000 × g tijekom 60 sekundi, a supernatant ukloni. Stanice se resuspendira u 0,5 ml TSE pufera s 2 mg/ml lizozoma, te 15-30 minuta inkubira na 37 °C. Nakon inkubacije, doda se 0,25 ml alkalnog SDS (0,3 N NaOH, 2 % SDS), a stanice 15-30 minuta inkubira na 55 °C ili do izbistrenja otopine. U otopinu DNA doda se natrij-acetat (0,1 ml, 3 M, pH 4,8), te je se zatim 10 minuta inkubira na ledu. Uzorke DNA centrifugira se 10 minuta na 14.000 okretaja u minuti, na 5 °C. Supernatant se prebaci u čistu epruvetu, te se doda 0,2 ml fenol:kloroforma (50 % fenol:50 % kloroform) i blago promiješa. Otopinu DNA centrifugira se 10 minuta na 14.000 okretaja u minuti, na 5 °C, a gornji sloj prebaci u čistu Eppendorfepruvetu. Doda se izopropanol (0,75 ml), a otopinu blago promiješa, te zatim 20 minuta inkubira na sobnoj temperaturi. Otopinu DNA centrifugira se 15 minuta na 14.000 okretaja u minuti, na 5 °C, supernatant ukloni, a talog DNA ispere 70 % etanolom, osuši, te resuspendira u TE puferu.

1.4 Izolacija plazmidne DNA iz bakterije E. coli

Pojedinačnu transformiranu E. coli koloniju nasadi se u 5 ml Luria-Bertani (LB) medij (Bacto-Tryptone, 10 g, Bactoyeast extract (ekstrakt kvasca), 5 g, te NaCl, 10 g u 1 l dH2O, pH 7,0, 25 minuta autoklaviranja na 121 °C uz dodatak 100 µg/ml ampicilina). Kulturu se inkubira preko noći, a alikvot od 1 ml prebaci u epruvetu za mikrocentrifugiranje od 1,5 ml. Uzorke kulture prebaci se u AutoGen 540TM uređaj za automatsko izoliranje nukleinskih kiselina, a plazmidnu DNA izolira pomoću Cycle 159 (softverska oprema), u skladu s uputama proizvođača.

1.5. Dobivanje i transformacija S. avermitilis protoplasta

Pojedinačne kolonije bakterije S. avermitilis izolira se na YPD-6 1/2 jakosti. Micelije se upotrebljava za nasađivanje 10 ml TSB medija u epruvetu od 25 × 150 mm, koju se zatim nasadi uz tresenje (300 okretaja u minuti) na 28 °C tijekom 48 sati. 1 ml micelija upotrebljava se za nasađivanje 50 ml YEME medija. YEME medij sadrži po litri: Difco Yeast Extract, 3 g; Difco Bacto-peptone, 5 g; Difco Malt Extract (ekstrakt slada), 3 g; saharozu 300 g. Nakon 25 minuta autoklaviranja na 121 °C, doda se slijedeće: 2,5 M MgCl2·6H2O (zasebno 25 minuta autoklaviran na 121 °C), 2 ml; te glicin (20 %) (filterski steriliziran), 25 ml.

Micelije se 48-72 sata uzgaja na 30 °C, te prikupi centrifugiranjem u epruveti za centrifugiranje od 50 ml (Falcon) na 3.000 okretaja u minuti tijekom 20 minuta. Supernatant se ukloni, a micelije resuspendira u P puferu, koji sadrži: saharozu, 205 g; K2SO4, 0,25 g; MgCl2·6H2O, 2,02 g; H2O, 600 ml; K2PO4 (0,5 %), 10 ml; otopinu mikroelemenata*, 20 ml; CaCl2·2H2O (3,68 %), 100 ml; te MES pufer (1,0 M, pH 6,5), 10 ml. (*Otopina mikroelemenata sadrži po litri: ZnCl2, 40 mg; FeCl3·6H2O, 200 mg; CuCl2·2H2O, 10 mg; MnCl2·4H2O, 10 mg; Na2B4O7·10H2O, 10 mg; (NH4)6Mo7O24·4H2O, 10 mg). pH se podesi na 6,5, a konačni volumen podesi na 1 l, a medij filtrira u vrućem stanju preko 0,45 µm filtera.

Micelije se istaloži na 3.000 okretaja u minuti tijekom 20 minuta, supernatant ukloni, a micelije resuspendira u 20 ml P pufera s 2 mg/ml lizozima. Micelije se 15 minuta inkubira na 35 °C uz tresenje, te mikroskopski pregleda, kako bi se odredilo doseg nastajanja protoplasta. Kada je nastajanje protoplasta gotovo, protoplaste se 10 minuta centrifugira na 8.000 okretaja u minuti. Supernatant se ukloni, a protoplaste resuspendira u 10 ml P pufera. Protoplaste se 10 minuta centrifugira na 8.000 okretaja u minuti, supernatant ukloni, protoplaste resuspendira u 2 ml P pufera, a približno 1 × 109 protoplasta raspodijeli u kriogene fijale od po 2,0 ml (Nalgene).

Fijalu s 1 × 109 protoplasta centrifugira se 10 minuta na 8.000 okretaja u minuti, supernatant ukloni, a protoplaste resuspendira u 0,1 ml P pufera. 2-5 µg transformirajuće DNA doda se protoplastima, nakon čega se odmah dodaje 0,5 ml radnog T pufera. T puferska baza sadrži: PEG-1000 (Sigma), 25 g; saharozu, 2,5 g; H2O, 83 ml. pH se podesi na 8,8 s 1 N NaOH (filterski steriliziran), a T pufersku bazu filterski sterilizira i spremi na 4 °C). Radni T pufer, pripravljen na dan upotrebe, bio je T puferska baza, 8,3 ml; K2PO4 (4 mM), 1 ml; CaCl2·2H2O (5 M), 0,2 ml; te TES (1 M, pH 8), 0,5 ml. Svaki sastojak radnog T pufera je filterski steriliziran.

Unutar 20 sekundi dodavanja T pufera protoplastima, doda se i 1,0 ml P pufera, a protoplaste se 10 minuta centrifugira na 8.000 okretaja u minuti. Supernatant se ukloni, a protoplaste resuspendira u 0,1 ml P pufera. Protoplaste se zatim nasadi na RM14 medije, koji sadrže: saharozu, 205 g; K2SO4, 0,25 g; MgCl2·6H2O, 10,12 g; glukozu, 10 g; Difco Casamino Acids, 0,1 g; Difco Yeast Extract, 5 g; Difco Oatmeal Agar (agar sa zobenim brašnom), 3 g; Difco Bacto Agar, 22 g; dH2O 800 ml. Otopinu se 25 minuta autoklavira na 121 °C. Nakon autoklaviranja, doda se sterilne matične otopine slijedećeg: K2PO4 (0,5 %), 10 ml; CaCl2·2H2O (5 M), 5 ml; lprolin (20 %), 15 ml; MES pufer (1,0 M, pH 6,5), 10 ml; otopina mikroelemenata (isto kao gore), 2 ml; matična otopina cikloheksimida (25 mg/ml), 40 ml; te 1 N NaOH, 2 ml. Po 25 ml RM14 medija stavi se kao alikvote po ploči, a ploče su osuši 24 sata prije upotrebe.

Protoplaste se 20-24 sata inkubira, uz 95 % vlage, na 30 °C. Radi selekcije transformanata otpornih na tiostrepton, 1 ml pufera za prekrivanje, s 125 µg/ml tiostreptona, rasprši se ravnomjerno po RM14 regeneracijskim pločama. Pufer za prekrivanje sadrži na 100 ml: saharozu, 10,3 g; otopinu mikroelemenata (isto kao gore), 0,2 ml; te MES (1 M, pH 6,5) 1 ml. Protoplaste se 7-14 dana inkubira, uz 95 % vlage, na 30 °C, dok kolonije otporne na tiostrepton (Thior) ne postanu vidljive.

1.6. Transformacija Streptomyces lividans protoplasta

U nekim slučajevima, za transformacije se upotrebljava bakterija S. lividans (dobavlja John Innes Institute, Norwich, UK). Postupci i pripravci potrebni za uzgoj, dobivanje protoplasta i transformiranje bakterije S. lividans opisani su u Hopwood i drugi: "Genetic Manipulation of Streptomyces, A Laboratory Manual", John Innes Foundation, Norwich, UK, (1985.), te ih se provodi kao što je tu opisano. Plazmidnu DNA izolira se iz S. lividans transformanata, kao što je opisano u Poglavlju 7.1.3, gore.

1.7. Analiza fermentacije S. avermitilis sojeva

S. avermitilis micelije, 4-7 dana uzgajane na YPD-6 1/2 jakosti, nasadi se u epruvete od 2,54 × 15,24 cm (1 × 6 in), s 8 ml radnog medija i dvije staklene kuglice veličine 5 mm. Radni medij sadrži: topivi škrob (bilo rijetkokuhani škrob ili KOSO, Japan Com Starch Co., Nagoya), 20 g/l; Pharmamedia, 15 g/l; Ardamine pH, 5 g/l (Champlain Ind., Clifton, NJ); CaCO3, 2 g/l; 2 bcfa ("bcfa" su razgranate masne kiseline (branched chain fatty acids)), konačne koncentracije u mediju od 50 ppm 2-(±)-metilmaslačne kiseline, 60 ppm izomaslačne kiseline i 20 ppm izovalerijanske kiseline. pH se podesi na 7,2, a medij 25 minuta autoklavira na 121 °C.

Epruvetu se 3 dana trese pod kutom od 17°, na 215 okretaja u minuti, na 29 °C. 2 ml Alikvota kulture za nasađivanje upotrebljava se za nasađivanje Erlenmeyer-tikvice od 300 ml, s 25 ml produkcijskog medija, koji sadrži: škrob (bilo rijetkokuhani škrob ili KOSO), 160 g/l; Nutrisoy (Archer Daniels Midland, Decatur, IL) 10 g/l; Ardamine pH, 10 g/l; K2HPO4, 2 g/l; MgSO4·4H2O, 2 g/l; FeSO4·7H2O, 0,02 g/l; MnCl2, 0,002 g/l; ZnSO4·7H2O, 0,002 g/l; CaCO3, 14 g/l; 2 × bcfa (kao gore); te cikloheksankarboksilnu kiselinu (cyclohexane carboxylic acid, CHC) (pripravljena kao 20 %-tna otopina na pH 7,0), 800 ppm. pH se podesi na 6,9, a medij 25 minuta autoklavira na 121 °C.

Nakon nasađivanja, tikvicu se 12 dana inkubira na 29 °C, uz tresenje na 200 okretaja u minuti. Nakon inkubacije, 2 ml uzorka uzme se iz tikvice, razrijedi s 8 ml metanola, promiješa, a smjesu 10 minuta centrifugira na 1250 × g, radi taloženja detritusa. Supernatant se zatim testira pomoću HPLC, na Beckman Ultrasphere ODS stupcu (25 cm × 4,6 mm unutarnjeg promjera), uz brzinu protoka od 0,75 ml u minuti, te detekciju apsorbancom na 240 nm. Pokretna faza bila je 86/8,9/5,1 metanol/voda/acetonitril.

1.8. Izolacija S. avermitilis PKS gena

Načini se kozmidna biblioteka S. avermitilis (ATCC 31272, SC-2) kromosomske DNA, te je se hibridizira sa sondom za ketosintazu (ketosynthase, KS) načinjenom od fragmenta Saccharoployspora erythraea gena za poliketidnu sintazu (polyketide synthase, PKS). Detaljan opis dobivanja kozmidne biblioteke može se naći u Sambrook i drugi: (1989.), gore navedeno. Detaljan opis dobivanja biblioteka Streptomyces kromosomske DNA navodi se u Hopwood i drugi: (1985.), gore navedeno. Kozmidni klonovi s ketosintaza-hibridizirajućim regijama određeni su hibridizacijom s 2,7 kb NdeI/Eco47III fragmentom iz pEX26 (ljubaznošću Dr. P. Leadlay, Cambridge, UK). Približno 5 ng pEX26 obradi se s NdeI i Eco47III. Reakcijsku smjesu prebaci se na 0,8 % SeaPlaque GTG agarozni gel (FMC BioProducts, Rockland, ME). 2,7 kb NdeI/Eco47III fragmenta izreže se iz gela nakon elektroforeze, a DNA prikupi iz gela pomoću enzima GELaseTM, od strane Epicentre Technologies, prema Brzom Protokolu. 2,7 kb NdeI/Eco47III fragment markira se s [α-32P]dCTP (tetra(trietilamonij) sol [alfa32P]deoksicitidin-5'-trifosfata) (NEN-Dupont, Boston, MA) pomoću BRL Nick Translation System (BRL Life Technologies, Inc., Gaithersburg, MD), u skladu s uputama dobavljača. Tipičnu reakciju provodi se u 0,05 ml volumena. Nakon dodavanja 5 µl pufera za zaustavljanje, markiranu DNA izdvoji se od neuključenih nukleotida G-25 Sephadex Quick SpinTM stupcem (Boehringer Mannheim), u skladu s uputama dobavljača.

Približno 1800 kozmidnih klonova pregleda se hibridizacijom u koloniji. Nađeno je 10 klonova koji su snažno hibridizirali sa Sacc. erythraea KS sondom. E. coli kolonije s kozmidnom DNA uzgoji se u LB tekućem mediju, a kozmidnu DNA izolira se iz svake kulture AutoGen 540TM uređajem za automatsko izoliranje nukleinskih kiselina, pomoću Cycle 3 (softverska oprema), u skladu s uputama proizvođača. Mapiranje restrikcijskim endonukleazama i analize hibridizacije bugačenjem po Southern-u otkriva da 5 klonova sadrži preklapajuće kromosomske regije. S. avermitilis genomska BamHI restrikcijska mapa od pet kozmida (npr. pSE65, pSE66, pSE67, pSE68, pSE69) konstruirana je analizom preklapajućih kozmida i hibridizacijama (Slika 4).

1.9. Određivanje DNA koja modulira odnose avermektina B2:B1 i određivanje aveC ORF-a

Upotrijebljeni su slijedeći postupci testiranja supkloniranih fragmenata dobivenih iz pSE66 kozmidnog klona na njihovu sposobnost moduliranja odnosa avermektina B2:B1 kod AveC mutanata. pSE66 (5 µg) obradi se sa SacI i BamHI. Reakcijsku smjesu prebaci se na 0,8 % SeaPlaqueTM GTG agarozni gel (FMC BioProducts), 2,9 kb SacI/BamHI fragmenta izreže iz gela nakon elektroforeze, a DNA prikupi iz gela pomoću GELaseTM (Epicentre Technologies), prema Brzom Protokolu. Približno 5 µg taksi-vektora pWHM3 (Vara i drugi: "J. Bacteriol.", 171:5872-5881, (1989.)), obradi se sa SacI i BamHI. Oko 0,5 µg 2,9 kb inserta i 0,5 µg obrađenog pWHM3 promiješa se zajedno i inkubira preko noći s 1 jedinicom ligaze (New England Biolabs, Inc., Beverly, MA) na 15 °C, u ukupnom volumenu od 20 µl, u skladu s uputama dobavljača. Nakon inkubacije, 5 µl ligacijske smjese inkubira se 10 minuta na 70 °C, ohladi na sobnu temperaturu, te upotrijebi u transformiranju kompetentnih E. coli DH5α stanica (BRL), u skladu s uputama proizvođača. Plazmidnu DNA izolira se iz transformanata otpornih na ampicilin, a prisustvo 2,9 kb SacI/BamHI inserta potvrdi restrikcijskom analizom. Ovaj plazmid označen je kao pSE119.

Dobije se protoplaste S. avermitilis soja 1100-SC38 (soj kuće Pfizer) i transformira s pSE119, kao što je opisano gore. Soj 1100-SC38 je mutant, koji proizvodi znatno više cikloheksil-B2 oblika avermektina, u usporedbi s cikloheksil-B1 oblikom avermektina, uz dodatak cikloheksankarboksilne kiseline (B2:B1 oko 30:1). pSE119 upotrijebljen za transformiranje S. avermitilis protoplasta, izolira se bilo iz E. coli soja GM2163 (ljubaznošću Dr. B.J. Bachmann, upravitelja, E. coli Genetic Stock Center, Yale University), E. coli soja DMA (BPL), ili S. lividans soja TK64. Transformante soja 1100-SC38 otporne na tiostrepton izolira se i analizira HPLC analizom produkata fermentacije. Transformanti S. avermitilis soja 1100-SC38 koji sadrže pSE119 daju izmijenjen odnos cikloheksil-B2:cikloheksil-B1 avermektina od oko 3,7:1 (Tablica 2).

Nakon što je utvrđeno da pSE119 može modulirati odnose avermektina B2:B1 u AveC mutantu, sekvencira se DNA insert. Približno 10 µg pSE119 izolira se kompletom za izoliranje plazmidne DNA (Qiagen, Valencia, CA), u skladu s uputama proizvođača, te sekvencira uređajem ABI 373A Automated DNA Sequencer (Perkin Elmer, Foster City, CA). Podatke o slijedu prikupi se i obradi programima Genetic Computer Group (GCG, Medison, WI). DNA slijed i aveC ORF prikazani su na slici 1 (SEQ ID NO: 1).

Novi plazmid, označen kao pSE118, konstruiran je kao što slijedi. Približno 5 µg od pSE66 obradi se s SphI i BamHI. Reakcijsku smjesu prebaci se na 0,8 % SeaPlaque GTG agarozni gel (FMC BioProducts), 2,8 kb SphI/BamHI fragment izreže iz gela nakon elektroforeze, a DNA prikupi iz gela pomoću GELaseTM (Epicentre Technologies), prema Brzom Protokolu. Približno 5 µg taksi-vektora pWHM3 obradi se sa SphI i BamHI. Oko 0,5 µg 2,8 kb inserta i 0,5 µg obrađenog pWHM3 pomiješa se zajedno i inkubira preko noći s 1 jedinicom ligaze (New England Biolabs) na 15 °C, u ukupnom volumenu od 20 µl, u skladu s uputama dobavljača. Nakon inkubacije, 5 µl ligacijske smjese inkubira se 10 minuta na 70 °C, ohladi na sobnu temperaturu, te upotrijebi za transformiranje kompetentnih E. coli DH5α stanica, u skladu s uputama proizvođača. Plazmidnu DNA izolira se iz transformanata otpornih na ampicilin, a prisustvo 2,8 kb SphI/BamHI inserta potvrdi restrikcijskom analizom. Ovaj plazmid označen je kao pSE118. DNA insert u pSE118 i pSE119 preklapa se s približno 838 nukleotida (Slika 4).

Protoplaste S. avermitilis soja 1100-SC38 transformira se s pSE118, kao gore. Transformante S. avermitilis soja 1100-SC38 otporne na tiostrepton izolira se i analizira HPLC analizom produkata fermentacije. Kod transformanata S. avermitilis soja 1100-SC38 koji sadrže pSE118 nisu promijenjeni odnosi avermektin cikloheksil-B2:avermektin cikloheksil-B1, u usporedbi sa sojem 1100-SC38 (Tablica 2).

1.10. Umnažanje aveC gena iz S. avermitilis kromosomske DNA pomoću PCR-a

Oko 1,2 kb fragmenta, koji sadrži aveC ORF, izolira se iz S. avermitilis kromosomske DNA umnažanjem pomoću PCR, uz upotrebu klica konstruiranih na osnovu gore dobivenog nukleotidnog slijeda aveC. Klice za PCR dobavlja Genosys Biotechnologies, Inc. (Texas). Desno usmjerena klica je: 5'-TCACGAAACCGGACACAC-3' (SEQ ID NO: 6); a lijevo usmjerena klica je: 5'-CATGATCGCTGAACCGAG-3' (SEQ ID NO: 7). PCR reakciju provodi se pomoću Deep VentTM (New England Biolabs), u puferu koji dobavlja proizvođač, u prisustvu 300 µM dNTP, 10 % glicerola, 200 pmol obje klice, 0,1 µg kalupa, te 2,5 jedinica enzima, u konačnom volumenu od 100 µl, u uređaju Perkin-Elmer Cetus thermal cycler. Toplinski profil prvog ciklusa bio je 5 minuta na 95 °C (faza denaturacije), 2 minute na 60 °C (faza zagrijavanja), te 2 minute na 72 °C (faza ekstenzije). Slijedeća 24 ciklusa bila su sličnog toplinskog profila, s tim što je faza denaturacije skraćena na 45 sekundi, a faza zagrijavanja je skraćena na 1 minutu.

Produkt PCR podvrgava se elektroforezi u 1 % agaroznom gelu, uz detekciju jedne vrpce od oko 1,2 kb. Ovu DNA pročisti se iz gela, te ligira (pomoću ligaze) s 25 ng lineariziranog, tupog pCR-Blunt vektora (Invitrogen), u 1:10 molarnom odnosu vektor:insert, u skladu s uputama proizvođača. Ligacijsku smjesu upotrebljava se za transformiranje One ShotTM Competent E. coli stanice (kompetencija u 1 pokušaju) (Invitrogen), u skladu s uputama proizvođača. Plazmidnu DNA izolira se iz transformanata otpornih na ampicilin, a prisustvo oko 1,2 kb inserta potvrdi se restrikcijskom analizom. Ovaj plazmid označen je kao pSE179.

DNA insert iz pSE179 izolira se obradom s BamHI/XbaI, odvoji elektroforezom, pročisti iz gela, te veže s taksivektorom pWHM3, kojeg se također obradi s BamHI/XbaI, uz koncentraciju ukupne DNA od 1 µg, u 1:5 molarnom odnosu vektor:insert. Ligacijsku smjesu upotrebljava se za transformiranje kompetentnih E. coli DH5α stanica, u skladu s uputama proizvođača. Plazmidnu DNA izolira se iz transformanata otpornih na ampicilin, a prisustvo oko 1,2 kb inserta potvrdi se restrikcijskom analizom. Ovaj plazmid, označen kao pSE186 (Slika 2, ATCC 209604), transformira se u E. coli DM1, a plazmidnu DNA izolira se transformanata otpornih na ampicilin.

2. Rezultati

Uočeno je da 2,9 kb SacI/BamHI fragment iz pSE119, kada ga se transformira u S. avermitilis soj 1100-SC38, bitno mijenja odnos dobivanja avermektina B2:B1. S. avermitilis soj 1100-SC38 normalno ima odnos B2:B1 od oko 30:1, no kada je transformiran vektorom koji sadrži 2,9 kb SacI/BamHI fragment, odnos avermektina B2:B1 smanji se na oko 3,7:1. Postfermentacijska analiza kultura transformanata potvrđuje prisustvo transformirajuće DNA.

Sekvenciran je 2,9 kb fragment iz pSE119, te je određen ORF od oko 0,9 kb (Slika 1) (SEQ ID NO: 1), koji sadrži PstI/SphI fragment, koji je ranije mutiran drugdje, radi dobivanja samo B2 produkata (Ikeda i drugi: (1995.), gore navedeno). Usporedba ovog ORF, ili odgovarajućeg izvedenog polipeptida, s poznatim bazama podataka (GenEMBL, SWISS-PROT) nije pokazala nikakvu visoku homologiju s poznatim DNA ili proteinskim sljedovima.

Tablica 2 prikazuje analizu fermentacije S. avermitilis soja 1100-SC38 transformiranog različitim plazmidima.

Tablica 2

[image]

PRIMJER: KONSTRUKCIJA S. AVERMITILIS AveC MUTANATA

Ovaj primjer opisuje konstrukciju nekoliko različitih S. avermitilis AveC mutanata, uz upotrebu gore opisanih pripravaka i postupaka. Opći opis tehnika uvođenja mutacija u gen kod roda Streptomyces opisan je u Kieser i Hopwood: "Meth. Enzym.", 204: 430-458, (1991.). Detaljniji opis dat je u Anzal i drugi: "J. Antibiot.", XLI (2): 226233, (1988.), te u Stutzman-Engwall i drugi: "J. Bacteriol.", 174 (1): 144-154, (1992.). Ove reference uključene su ovdje kao referenca u svojoj cijelosti.

1. Inaktiviranje S. avermitilis aveC gena

AveC mutante koji sadrže inaktivirane aveC gene konstruira se pomoću nekoliko postupaka, kao što je detaljno navedeno niže.

U prvom postupku, 640 bp SphI/PstI fragment, prema van, u odnosu na aveC gen u pSE119 (plazmid opisan u Poglavlju 7.1.9, gore), zamijeni se ermE genom (za otpornost na eritromicin) iz bakterije Sacc. erytraea. ermE gen izolira se iz pIJ4026 (dobavlja John Innes Institute, Norwich, U.K.; vidjeti također Bibb i drugi: "Gene", 41: 357-368, (1985.)), uz obradu restrikcijskim enzimima BglII i EcoRI, nakon čega slijedi elektroforeza, te ga se pročisti iz gela. Ovaj oko 1,7 kb fragment ligira se u pGEM7Zf (Promega), obrađen s BamHI i EcoRI, a ligacijsku smjesu transformira se u kompetentne E. coli DH5α stanice, u skladu s uputama proizvođača. Plazmidnu DNA izolira se iz transformanata otpornih na ampicilin, a prisustvo oko 1,7 kb inserta potvrdi se restrikcijskom analizom. Ovaj plazmid označen je kao pSE27.

pSE118 (opisan u poglavlju 7.1.9, gore) obradi se s SphI i BamHI, obradak podvrgne elektroforezi, a oko 2,8 kb SphI/BamHI insert pročisti iz gela. pSE119 obradi se s PstI i EcoRI, obradak podvrgne elektroforezi, a oko 1,5 kb PstI/EcoRI insert pročisti iz gela. Taksi-vektor pWHm3 obradi se s BamHI i EcoRI. pSE27 obradi se s PstI i SphI, obradak podvrgne elektroforezi, a oko 1,7 kb PstI/SphI insert pročisti se iz gela. Sva četiri fragmenta (tj. oko 2,8 kb, oko 1,5 kb, oko 7,2 kb, oko 1,7 kb) ligira se zajedno ligacijom na 4 načina. Ligacijsku smjesu transformira se u kompetentne E. coli DH5α stanice, u skladu s uputama proizvođača. Plazmidnu DNA izolira se iz transformanata otpornih na ampicilin, a prisustvo ispravnog inserta potvrdi restrikcijskom analizom. Ovaj plazmid označen je kao pSE180 (Slika 3; ATCC 209605).

pSE180 transformira se u bakteriju S. lividans TK64, a transformirane kolonije odredi pomoću otpornosti na tiostrepton i eritromicin. pSE180 izolira se iz bakterije S. lividans i upotrebljava za transformiranje S. avermitilis protoplasta. Određena su četiri S. avermitilis transformanta otporna na tiostrepton, dobije se protoplaste, te ih se nasadi na ploče pod neselektivnim uvjetima u RM14 medijima. Nakon regeneriranja protoplasta, pojedinačne kolonije pregleda se na prisustvo otpornosti na eritromicin i odsustvo otpornosti na tiostrepton, što ukazuje na integraciju inaktiviranog aveC gena u kromosom i gubitak slobodnog replikona. Određen je jedan Ermr Thios transformant i označen kao soj SE180-11. Ukupnu kromosomsku DNA izolira se iz soja SE180-11, obradi restrikcijskim enzimima BamHI, HindIII, PstI, ili SphI, obradak podvrgne elektroforezi u 0,8 % agaroznom gelu, prebaci na najlonsku membranu, te hibridizira s ermE sondom. Ove analize pokazale su da je integracija u kromosom ermE gena otpornosti, uz prateću deleciju 640 bp PstI/SphI fragmenta, protekla kao dvostruki crossing-over događaj. HPLC analiza produkata fermentacije soja SE180-11 pokazala je da se normalne avermektine više ne proizvodi (Slika 5A).

U drugom postupku inaktiviranja aveC gena, 1,7 kb ermE gen ukloni se iz kromosoma S. avermitilis soja SE180-11, što rezultira 640 bp PstI/SphI delecijom u aveC genu. Plazmid zamjene gena konstruira se na slijedeći način: pSE180 se djelomično obradi s XbaI, a oko 11,4 kb fragment pročisti iz gela. Oko 11,4 kb vrpci nedostaje 1,7 kb ermE gen otpornosti. DNA se ligira i transformira u E. coli DH5α stanice. Plazmidnu DNA izolira se iz transformanata otpornih na ampicilin, a prisustvo ispravnog inserta potvrdi restrikcijskom analizom. Ovaj plazmid, označen kao pSE184, transformira se u bakteriju E. coli DM1, a plazmidnu DNA izolira iz transformanata otpornih na ampicilin. Ovaj plazmid upotrebljava se za transformiranje protoplasta S. avermitilis soja SE180-11. Dobije se protoplaste transformanata soja SE180-11 otpornih na tiostrepton i nasadi na ploče s RM14 kao pojedinačne kolonije. Nakon regeneriranja protoplasta, pojedinačne kolonije se pregleda na odsustvo kako otpornosti na eritromicin tako i otpornosti na tiostrepton, što ukazuje na integraciju inaktiviranog aveC gena u kromosom i gubitak slobodnog replikona koji sadrži ermE gen. Određen je jedan Erms Thios transformant i označen kao SE184-1-13. Analiza fermentacije SE184-1-13 pokazuje da se normalne avermektine ne proizvodi i da SE184-1-13 ima isti fermentacijski profil kao SE180-11.

U trećem postupku inaktiviranja gena aveC, adicijom pomoću PCR, dva G nakon C na nt položaju (nukleotidni položaj) 471, čime se stvara BspE1 mjesto, uvodi se pomak okvira čitanja u kromosomski aveC gen. Prisustvo konstruiranog BspE1 mjesta bilo je korisno u detekciji događaja zamjene gena. Konstruirane su klice za PCR radi uvođenja mutacije pomaka okvira čitanja u aveC genu, te dobivene od strane Genosys Biotechnologies, Inc. Desno usmjerena klica je: 5'-GGTTCCGGATGCCGTTCTCG-3' (SEQ ID NO: 8), a lijevo usmjerena klica je: 5'AACTCCGGTCGACTCCCCTTC-3' (SEQ ID NO: 9). Uvjeti PCR bili su kao što su opisani u Poglavlju 7.1.10, gore. 666 bp produkt PCR obradi se s SphI, kako bi se dobilo dva fragmenta od 278 bp odnosno 388 bp. 388 bp fragment pročisti se iz gela.

Plazmid zamjene gena konstruira se na slijedeći način: taksi-vektor pWHM3 obradi se s EcoRI i BamHI. pSE119 obradi se s BamHI, obradak podvrgne elektroforezi, a oko 840 bp fragment pročisti iz gela. pSE119 obradi se s EcoRI i XmnI, obradak podvrgne elektroforezi, a oko 1,7 kb fragment pročisti iz gela. Sva četiri fragmenta (npr. oko 7,2 kb, oko 840 bp, oko 1,7 kb i oko 388 bp) ligira se zajedno ligacijom na 4 načina. Ligacijsku smjesu transformira se u kompetentne E. coli DH5α stanice. Plazmidnu DNA izolira se iz transformanata otpornih na ampicilin, a prisustvo ispravnog inserta potvrdi restrikcijskom analizom i analizom slijeda DNA. Ovaj plazmid, označen kao pSE185, transformira se u bakteriju E. coli DM1, a plazmidnu DNA izolira iz transformanata otpornih na ampicilin. Ovaj plazmid upotrebljava se za transformiranje protoplasta S. avermitilis soja 1100SC38. Izolira se transformante soja 1100-SC38 otporne na tiostrepton i analizira HPLC analizom produkata fermentacije. pSE185 ne mijenja bitno odnose avermektina B2:B1 kada ga se transformira u S. avermitilis soj 1100-SC38 (Tablica 2).

pSE185 se upotrebljava za transformiranje protoplasta bakterije S. avermitilis, radi postizanja mutacije pomaka okvira čitanja u kromosomskom aveC genu. Dobije se protoplaste transformanata otpornih na tiostrepton i nasadi na ploče kao pojedinačne kolonije u RM14. Nakon regeneriranja protoplasta, pojedinačne kolonije se pregleda na odsustvo otpornosti na tiostrepton. Izolira se kromosomska DNA iz kolonija osjetljivih na tiostrepton i pomoću PCR pregleda na prisustvo mutacije pomaka okvira čitanja integrirane u kromosomu. PCR klice konstruira se na osnovu nukleotidnog slijeda aveC, a dobavlja ih Genosys Biotechnologies, Inc. (Texas). Desno usmjerena klica za PCR je: 5'-GCAAGGATACGGGGACTAC-3' (SEQ ID NO: 10), lijevo usmjerena klica za PCR je: 5'-GAACCGACCGCCTGATAC-3' (SEQ ID NO: 11), a uvjeti PCR bili su kao što su opisani u Poglavlju 7.1.10, gore. Dobiveni produkt PCR bio je 543 bp, a nakon obrade s BspE1 opažena su tri fragmenta od po 368 bp, 96 bp, te 79 bp, što ukazuje na integraciju inaktiviranog aveC gena u kromosom i gubitak slobodnog replikona.

Analiza fermentacije S. avermitilis mutanata, koji sadrže mutaciju pomaka okvira čitanja u aveC genu, ukazuje da se normalne avermektine više ne dobiva, te da ovi mutanti imaju isti HPLC fermentacijski profil kao sojevi SE180-11 i SE184-1-13. Određen je jedan Thios transformant i označen kao soj SE185-5a.

Osim toga, načinjena je mutacija u aveC genu koja mijenja nt položaj 520 s G u A, što rezultira promjenom kodona koji kodira triptofan (W), na položaju 116, u stop-kodon. S. avermitilis soj s ovom mutacijom ne proizvodi normalne avermektine i ima isti fermentacijski profil kao sojevi SE180-11, SE184-1-13, te SE185-5a.

Osim toga, načinjene su mutacije u aveC genu koje mijenjaju kako: (i) nt položaj 970 s G u A, što mijenja aminokiselinu na položaju 266 iz glicina (G) u aspartat (D), tako i (ii) nt položaj 996 s T u C, što mijenja aminokiselinu na položaju 275 iz tirozina (Y) u histidin (H). S. avermitilis soj s ovim mutacijama (G256D/Y275H) ne proizvodi normalne avermektine i ima isti fermentacijski profil kao sojevi SE180-11, SE184-1-13, te SE185-5a.

S. avermitilis aveC inaktivacijski mutirani sojevi SE180-11, SE184-1-13, SE185-5a, te drugi navedeni ovdje, osiguravaju pregledne alate za procjenu utjecaja drugih mutacija u aveC genu. pSE186, koji sadrži kopiju divljeg tipa aveC gena, transformira se u bakteriju E. coli DM1, a plazmidnu DNA izolira iz transformanata otpornih na ampicilin. Ovu pSE186 DNA upotrebljava se za transformiranje protoplasta S. avermitilis soja SE180-11. Izolira se transformante soja SE180-11 otporne na tiostrepton, odredi prisustvo otpornosti na eritromicin, a Thior Ermr transformante analizira se HPLC analizom produkata fermentacije. Prisustvo funkcionalnog aveC gena in trans bilo je dovoljno za obnovu normalne proizvodnje avermektina u soju SE18011 (Slika 5B).

2. Analiza mutacija u aveC genu koje mijenjaju odnose klasa B2:B1

Kao što je opisano gore, S. avermitilis soj SE180-11, koji sadrži inaktivirani gen, komplementira se transformacijom plazmidom koji sadrži funkcionalni aveC gen (pSE186). Soj SE180-11 također se upotrebljava kao soj domaćin u karakterizaciji drugih mutacija u aveC genu, kao što je opisano niže.

Kromosomsku DNA izolira se iz soja 1100-SC38, te upotrebljava kao kalup za umnažanje aveC gena pomoću PCR. 1,2 kb ORF izolira se umnažanjem pomoću PCR, uz upotrebu klica konstruiranih na osnovu nukleotidnog slijeda aveC. Desno usmjerena klica je SEQ ID NO: 6, a lijevo usmjerena klica je SEQ ID NO: 7 (vidjeti Poglavlje 7.1.10, gore). PCR i uvjeti supkloniranja opisani su gore. Analiza slijeda DNA 1,2 kb ORF ukazuje na mutaciju u aveC genu, koja mijenja nt položaj 337 s C u T, što mijenja aminokiselinu na položaju 55 iz serina (S) u fenilalanin (F). Gen aveC koji sadrži S55F mutaciju supklonira se u pWHM3 radi dobivanja plazmida označenog kao pSE187, kojeg se upotrebljava za transformiranje protoplasta S. avermitilis soja SE180-11. Izolira se transformante soja SE180-11 otporne na tiostrepton, odredi prisustvo otpornosti na eritromicin, a Thior Ermr transformante analizira HPLC analizom produkata fermentacije. Prisustvo promjene aveC gena koji kodira promjenu aminokiselinskog ostatka 55 (S55F) može obnoviti normalnu proizvodnju avermektina u soju SE18011 (Slika 5C). Međutim, odnos cikloheksil-B2:cikloheksil-B1 bio je oko 26:1, u usporedbi sa sojem SE180-11 transformiranim s pSE186, kod kojeg je odnos B2:B1 bio oko 1,6:1 (Tablica 3), što ukazuje da pojedinačna mutacija (S55F) modulira dobivenu količinu cikloheksil-B2, u odnosu na cikloheksil-B1.

Određena je druga mutacija u aveC genu, koja mijenja nt položaj 862 s G u A, što mijenja aminokiselinu na položaju 230 od glicina (G) u aspartat (D). S. avermitilis soj s mutacijom (G230D) daje odnos avermektina B2:B1 od oko 30:1.

3. Mutacije koje smanjuju odnos B2:B1

Konstruirano je nekoliko mutacija koje smanjuju proizvedenu količinu cikloheksil-B2, u odnosu na cikloheksilB1, kao što slijedi.

Određena je mutacija u aveC genu, koja mijenja nt položaj 588 od G u A, što mijenja aminokiselinu na položaju 139 od alanina (A) u treonin (T). Gen aveC koji sadrži A139T mutaciju supklonira se u pWHM3, radi dobivanja plazmida označenog kao pSE188, te kojeg se upotrebljava za transformiranje protoplasta S. avermitilis soja SE18011. Izolira se transformante soja SE180-11 otporne na tiostrepton, odredi prisustvo otpornosti na eritromicin, a Thior Ermr transformante analizira HPLC analizom produkata fermentacije. Prisustvo mutiranog aveC gena, koji kodira promjenu aminokiselinskog ostatka 139 (A139T), može obnoviti proizvodnju avermektina u soju SE180-11 (Slika 5D). Međutim, odnos B2:B1 bio je oko 0,94:1, što ukazuje da ova mutacija smanjuje proizvedenu količinu cikloheksil-B2, u odnosu na cikloheksil-B1. Ovaj rezultat bio je neočekivan, stoga što objavljeni rezultati, kao i rezultati gore opisanih mutacija, prikazuju samo bilo inaktiviranje aveC gena ili povećanu proizvodnju B2 oblika avermektina, u odnosu na oblik B1 (Tablica 3).

Stoga što mutacija A139T mijenja odnose B2:B1 u pravcu povoljnijeg B1, konstruirana je mutacija koja kodira treonin umjesto serina na aminokiselinskom položaju 138. Stoga se pSE186 obradi s EcoRI i klonira u pGEM3Zf (Promega) obrađen s EcoRI. Ovaj plazmid, označen kao pSE186a, obradi se s ApaI i KpnI, DNA fragmente razdvoji na agaroznom gelu, a dva fragmenta od po oko 3,8 kb i oko 0,4 kb pročisti se iz gela. Oko 1,2 kb DNA insert s pSE186 upotrebljava se kao kalup za PCR, kako bi se uvelo jednu promjenu baze na položaju 585. Konstruira se klice za PCR, kako bi se uvelo mutaciju na nt položaju 585, a dobavlja ih Genosys Biotechnologies, Inc. (Texas). Desno usmjerena klica za PCR je: 5'GGGGGCGGGCCCGGGTGCGGAGGCGGAAATGCCCCTGGCGACG-3' (SEQ ID NO: 12); a lijevo usmjerena klica za PCR je: 5'-GGAACCGACCGCCTGATACA-3' (SEQ ID NO: 13). PCR reakciju provodi se Advantage GC genomic PCR kompletom (Clonetech Laboratories, Palo Alto, CA), u puferu koji dobavlja proizvođač, u prisustvu 200 µM dNTP, 200 pmol obje klice, 50 ng DNA kalupa, 1,0 M GC-Melt i 1 jedinice KlenTaq Polymerase Mix (smjesa s Taq-polimerazom (iz bakterije Thermus aquaticus)) u konačnom volumenu od 50 µl. Toplinski profil prvog ciklusa bio je 1 minuta na 94 °C; zatim 25 ciklusa od 30 sekundi na 94 °C i 2 minute na 68 °C; te 1 ciklus od 3 minute na 68 °C. PCR produkt od 295 bp obradi se s ApaI i KpnI, kako bi se oslobodilo 254 bp fragment, koji se odvoji elektroforezom i pročisti iz gela. Sva tri fragmenta (oko ,8 kb, oko 0,4 kb i 254 bp) ligira se zajedno u ligiranju na 3 načina. Ligacijsku smjesu transformira se u kompetentne E. coli DH5α stanice. Plazmidnu DNA izolira se iz transformanata otpornih na ampicilin, a prisustvo ispravnog inserta potvrdi restrikcijskom analizom. Ovaj plazmid označen je kao pSE198.

pSE198 obradi se s EcoRI, klonira u pWHM3 obrađen s EcoRI, te transformira u E. coli DH5α stanice. Plazmidnu DNA izolira se iz transformanata otpornih na ampicilin, a prisustvo ispravnog inserta potvrdi restrikcijskom analizom i analizom slijeda DNA. Ovu plazmidnu DNA transformira se u bakteriju E. coli DM1, plazmidnu DNA izolira iz transformanata otpornih na ampicilin, a prisustvo ispravnog inserta potvrdi restrikcijskom analizom. Ovaj plazmid, označen kao pSE199, upotrebljava se za transformiranje protoplasta S. avermitilis soja SE180-11. Izolira se transformante soja SE180-11 otporne na tiostrepton, odredi prisustvo otpornosti na eritromicin, a Thior Ermr transformante analizira HPLC analizom produkata fermentacije. Prisustvo mutiranog aveC gena koji kodira promjenu na aminokiselinskom ostatku 138 (S138T) može obnoviti normalnu proizvodnju avermektina u soju SE180-11; međutim, odnos B2:B1 bio je 0,88:1, što ukazuje da ova mutacija smanjuje proizvedenu količinu cikloheksil-B2 u odnosu na cikloheksil-B1 (Tablica 3). Ovaj odnos B2:B1 je čak manji od odnosa 0,94:1 opaženog kod mutacije A139T, dobivene transformacijom soja SE180-11 s pSE188, kao što je opisano gore.

Konstruirana je druga mutacija radi uvođenja treonina na aminokiselinske položaje 138 i 139. Oko 1,2 kb DNA insert iz pSE185 upotrebljava se kao kalup za PCR. Konstruirane su klice za PCR radi uvođenja mutacija na nt položaje 585 i 588, a dobavlja ih Genosys Biotechnologies, Inc. (Texas). Desno usmjerena klica za PCR je: 5'GGGGGCGGGCCCGGGTGCGGAGGCGGAAATGCCGCTGGCGACGACC-3' (SEQ ID NO: 14); a lijevo usmjerena klica za PCR je: 5'-GGAACATCACGGCATTCACC-3' (SEQ ID NO: 15). PCR reakciju provodi se uz uvjete opisane u ovom poglavlju, neposredno gore. PCR produkt od 449 bp obradi se s ApaI i KpnI, kako bi se oslobodilo 254 bp fragment, koji se odvoji elektroforezom i pročisti iz gela. pSE186a obradi se s ApaI i KpnI, DNA fragmente razdvoji na agaroznom gelu, a dva fragmenta od po oko 3,8 kb i oko 0,4 kb pročisti iz gela. Sva tri fragmenta (oko 3,8 kb, oko 0,4 kb i 254 bp) ligira se zajedno u ligiranju na 3 načina, a ligacijsku smjesu transformira se u kompetentne E. coli DH5α stanice. Plazmidnu DNA izolira se iz transformanata otpornih na ampicilin, a prisustvo ispravnog inserta potvrdi restrikcijskom analizom. Ovaj plazmid označen je kao pSE230.

pSE230 obradi se s EcoRI, klonira u pWHM3 obrađen s EcoRI, te transformira u E. coli DH5α stanice. Plazmidnu DNA izolira se iz transformanata otpornih na ampicilin, a prisustvo ispravnog inserta potvrdi restrikcijskom analizom i analizom slijeda DNA. Ovu plazmidnu DNA transformira se u bakteriju E. coli DM1, plazmidnu DNA izolira iz transformanata otpornih na ampicilin, a prisustvo ispravnog inserta potvrdi restrikcijskom analizom. Ovaj plazmid, označen kao pSE231, upotrebljava se za transformiranje protoplasta S. avermitilis soja SE180-11. Izolira se transformante SE180-11 otporne na tiostrepton, odredi prisustvo otpornosti na eritromicin, a Thior Ermr transformante analizira fermentacijom. Prisustvo dvostruko mutiranog aveC gena, koji kodira S138T/A139T, može obnoviti normalnu proizvodnju avermektina od strane soja SE180-11; međutim, odnos B2:B1 bio je 0,84:1 što ukazuje da ta mutacija također smanjuje proizvedenu količinu cikloheksilB2 u dnosu na cikloheksil-B1 (Tablica 3), uz smanjenja omogućena transformacijom soja SE180-11 s pSE188 ili pSE199, kao što je opisano gore.

Konstruirana je druga mutacija radi daljnjeg smanjenja proizvedene količine cikloheksil-B2 u odnosu na cikloheksil-B1. Stoga što mutacije S138T/A139T mijenjaju odnose B2:B1 u povoljnijem B1 smjeru, konstruirana je mutacija radi uvođenja treonina na aminokiselinski položaj 138, te fenilalanina na aminokiselinski položaj 139. Oko 1,2 kb DNA insert s pSE186 upotrebljava se kao kalup za PCR. Konstruirane su klice za PCR radi uvođenja mutacija na nt položaje 585 (promjena T u A), 588 (promjena G u T), te 589 (promjena G u T), a dobavlja ih Genosys Biotchnologies, Inc. (Texas). Desno usmjerena klica za PCR je: 5'GGGGGCGGGCCCGGGTGCGGAGGCGGAAATGCCGCTGGCGACGTTC-3' (SEQ ID NO: 25); i lijevo usmjerena klica za PCR je: 5'-GGAACATCACGGCATTCACC-3' (SEQ ID NO: 15). PCR reakciju provodi se Advantage GC genomic PCR kompletom (Clonetech Laboratories, Palo Alto, CA), u puferu koji dobavlja proizvođač, u prisustvu 200 µM dNTP, 200 pmol obje klice, 50 ng DNA kalupa, 1,1 mM Mg-acetata, 1,0 M GC-Melt i 1 jedinice Tth DNA Polymerase (Thermus thermophilus DNA-polimeraza) u konačnom volumenu od 50 µl. Toplinski profil prvog ciklusa bio je: 1 minuta na 94 °C; zatim 25 ciklusa od 30 sekundi na 94 °C i 2 minute na 68 °C; te 1 ciklus od 3 minute na 68 °C. PCR produkt od 449 bp obradi se s ApaI i KpnI, kako bi se oslobodilo 254 bp fragment, koji se odvoji elektroforezom i pročisti iz gela. Sva tri fragmenta (oko 3,8 kb, oko 0,4 kb i 254 bp) ligira se zajedno u ligiranju na 3 načina. Ligacijsku smjesu transformira se u kompetentne E. coli DH5α stanice. Plazmidnu DNA izolira se iz transformanata otpornih na ampicilin, a prisustvo ispravnog inserta potvrdi restrikcijskom analizom. Ovaj plazmid označen je kao pSE238.

pSE238 obradi se s EcoRI, klonira u pWHM3 obrađen s EcoRI, te transformira u E. coli DH5α stanice. Plazmidnu DNA izolira se iz transformanata otpornih na ampicilin, a prisustvo ispravnog inserta potvrdi restrikcijskom analizom i analizom slijeda DNA. Ovu plazmidnu DNA transformira se u bakteriju E. coli DM1, plazmidnu DNA izolira iz transformanata otpornih na ampicilin, a prisustvo ispravnog inserta potvrdi restrikcijskom analizom. Ovaj plazmid, označen kao pSE239, upotrebljava se za transformiranje protoplasta S. avermitilis soja SE180-11. Izolira se transformante soja SE180-11 otporne na tiostrepton, odredi prisustvo otpornosti na eritromicin, a Thior Ermr transformante analizira HPLC analizom produkata fermentacije. Prisustvo dvostruko mutiranog aveC gena, koji kodira S138T/A139F, može obnoviti normalnu proizvodnju avermektina u soju SE180-11; međutim, odnos B2:B1 bio je 0,75:1 što ukazuje da ova mutacija također smanjuje proizvedenu količinu cikloheksil-B2 u odnosu na cikloheksil-B1 (Tablica 3), uz smanjenja omogućena transformacijom soja SE180-11 s pSE188, pSE199, ili pSE231, kao što je opisano gore.

Tablica 3

[image]

Tehnikama preslagivanja DNA, kao što je opisano u Stemmer: "Nature", 370:389-391, (1994.); i Stemmer: "Proc. Natl. Acad. Sci. USA", 91: 10747-10751, (1994.); i također opisano u US patentima br. 5605793, 5811238, 5830721 i 5837458, konstruirane su dodatne mutacije radi daljnjeg smanjenja proizvedene količine cikloheksilB2 u odnosu na cikloheksil-B1.

Plazmide s presloženom DNA, koji sadrže mutirane aveC gene transformira se u kompetentne dam dcm E. coli stanice. Plazmidnu DNA izolira se iz transformanata otpornih na ampicilin, te upotrebljava za transformiranje protoplasta S. avermitilis soja SE180-11. Izolira se transformante soja SE180-11 otporne na tiostrepton i pregledava na proizvodnju avermektina, uz odnos cikloheksil-B2:cikloheksil-B1 od 1:1 ili manji. Odredi se DNA slijed plazmidne DNA iz SE180-11 transformanata koji proizvode avermektine uz odnos B2:B1 od 1:1 ili manji.

Određeno je osam transformanata koji proizvode smanjene količine cikloheksil-B2 u odnosu na cikloheksil-B1. Najniži odnos B2:B1 postignut kod ovih transformanata bio je 0,4:1 (Tablica 4). Plazmidnu DNA izolira se iz svakog od tih osam transformanata, te je određen slijed DNA, radi određivanja mutacija u aveC genu. Mutacije su slijedeće:

pSE290 sadrži 4 nukleotidne mutacije na nt položaju 317 s T u A, na nt položaju 353 s C u A, na nt položaju 438 s G u A, te na nt položaju 1155 s T u A. Promjena nukleotida na nt položaju 317 mijenja aminokiselinu na AA položaju (aminokiselinski položaj (amino acid)) 48 s D u E, a promjena nukleotida na nt položaju 438 mijenja aminokiselinu na AA položaju 89 s A u T. Odnos B2:B1, koje proizvode stanice koje nose ovaj plazmid bio je 0,42:1 (Tablica 4).

pSE291 sadrži 4 nukleotidne mutacije na nt položaju 272 s G u A, na nt položaju 585 s T u A, na nt položaju 588 s G u A, te na nt položaju 708 s G u A. Promjena nukleotida na nt položaju 585 mijenja aminokiselinu na AA položaju 138 sa S u T, promjena nukleotida na nt položaju 588 mijenja aminokiselinu na AA položaju 139 s A u T, te promjena nukleotida na nt položaju 708 mijenja aminokiselinu na AA položaju 179 s G u S. Odnos B2:B1, koje proizvode stanice koje nose ovaj plazmid bio je 0,57:1 (Tablica 4).

pSE292 sadrži iste četiri nukleotidne mutacije kao pSE290. Odnos B2:B1, koje proizvode stanice koje nose ovaj plazmid bio je 0,40:1 (Tablica 4).

pSE293 sadrži 6 nukleotidnih mutacija na nt 24 s A u G, na nt položaju 286 s A u C, na nt položaju 497 s T u C, na nt položaju 554 s C u T, na nt položaju 580 s T u C, te na nt položaju 886 s A u T. Promjena nukleotida na nt položaju 286 mijenja aminokiselinu na AA položaju 38 s Q u P, promjena nukleotida na nt položaju 580 mijenja aminokiselinu na AA položaju 136 s L u P, te promjena nukleotida na nt položaju 886 mijenja aminokiselinu na AA položaju 238 s E u D. Odnos B2:B1, koje proizvode stanice koje nose ovaj plazmid bio je 0,68:1 (Tablica 4).

pSE294 sadrži 6 nukleotidnih mutacija na nt 469 s T u C, na nt položaju 585 s T u A, na nt položaju 588 s G u A, na nt položaju 708 s G u A, na nt položaju 833 s C u T, te na nt položaju 1184 s G u A. Osim toga, nt na položajima 173, 174 i 175 su deletirani. Promjena nukleotida na nt položaju 469 mijenja aminokiselinu na AA položaju 99 s F u S, promjena nukleotida na nt položaju 585 mijenja aminokiselinu na AA položaju 138 sa S u T, promjena nukleotida na nt položaju 588 mijenja aminokiselinu na AA položaju 139 s A u T, te promjena nukleotida na nt položaju 708 mijenja aminokiselinu na AA položaju 179 s G u S. Odnos B2:B1, koje proizvode stanice koje nose ovaj plazmid bio je 0,53:1 (Tablica 4).

pSE295 sadrži 2 nukleotidne mutacije na nt 588 s G u A i na nt 856 s T u C. Promjena nukleotida na nt položaju 588 mijenja aminokiselinu na AA položaju 139 s A u T i promjena nukleotida na nt položaju 856 mijenja aminokiselinu na AA položaju 228 s M u T. Odnos B2:B1, koje proizvode stanice koje nose ovaj plazmid bio je 0,80:1 (Tablica 4).

pSE296 sadrži 5 nukleotidnih mutacija na nt položaju 155 s T u C, na nt položaju 505 s G u T, na nt položaju 1039 s C u T, na nt položaju 1202 s C u T, te na nt položaju 1210 s T u C. Promjena nukleotida na nt položaju 505 mijenja aminokiselinu na AA položaju 111 s G u V, a promjena nukleotida na nt položaju 1039 mijenja aminokiselinu na AA položaju 289 s P u L. Odnos B2:B1, koje proizvode stanice koje nose ovaj plazmid bio je 0,73:1 (Tablica 4).

pSE297 sadrži 4 nukleotidne mutacije na nt položaju 377 od G u T, na nt položaju 588 od G u A, na nt položaju 633 od A u G, te na nt položaju 1067 od A u T. Promjena nukleotida na nt položaju 588 mijenja aminokiselinu na AA položaju 139 od A u T, promjena nukleotida na nt položaju 633 mijenja aminokiselinu na AA položaju 154 od K u E, te promjena nukleotida na nt položaju 1067 mijenja aminokiselinu na AA položaju 298 od Q u H. Odnos B2:B1, koje proizvode stanice koje nose ovaj plazmid bio je 0,67:1 (Tablica 4).

Tablica 4

[image]

PRIMJER: KONSTRUKCIJA 5' DELECIJSKIH MUTANATA

Kao što je objašnjeno u Poglavlju 5.1, gore, S. avermitilis nukleotidni slijed prikazan na Slici 1 (SEQ ID NO: 1) sadrži četiri različita GTG kodona na bp položajima 42, 174, 177 i 180 koji su potencijalna startna mjesta. Ovo poglavlje opisuje konstrukciju višestrukih delecija u 5'-regiji aveC ORF-a (Slika 1; SEQ ID NO: 1), kako bi se omogućilo određivanje koji bi od ovih kodona mogli funkcionirati kao startna mjesta u aveC ORF-u za ekspresiju proteina.

Umnažanjem pomoću PCR, izolirani su fragmenti aveC gena, različito deletirani na 5'-kraju, iz S. avermitilis kromosomske DNA. Konstruirane su klice za PCR na osnovu slijeda aveC DNA, a dobavlja ih Genosys Biotechnologies, Inc. Desno usmjerene klice su 5'-AACCCATCCGAGCCGCTC-3' (SEQ ID NO: 16) (D1F1); 5'-TCGGCCTGCCAACGAAC-3' (SEQ ID NO: 17) (D1F2); 5'-CCAACGAACGTGTAGTAG-3' (SEQ ID NO: 18) (D1F3); te 5'-TGCAGGCGTACGTGTTCAGC-3' (SEQ ID NO: 19) (D2F2). Lijevo usmjerene klice su 5'CATGATCGCTGAACCGA-3' (SEQ ID NO: 20); 5'-CATGATCGCTGAACCGAGGA-3' (SEQ ID NO: 21); te 5'-AGGAGTGTGGTGCGTCTGGA-3' (SEQ ID NO: 22). PCR reakciju provodi se kao što je opisano u Poglavlju 8.3, gore.

PCR produkte razdvoji se elektroforezom u 1 % agaroznom gelu, te se odredi pojedinačne DNA vrpce od oko 1,0 kb ili oko 1,1 kb. PCR produkte pročisti se iz gela i ligira s 25 ng lineariziranog pCR2.1 vektora (Invitrogen) u 1:10 molarnom odnosu vektor:insert, u skladu s uputama proizvođača. Ligacijske smjese upotrebljava se za transformiranje One ShotTM Competent E. coli stanica (Invitrogen), u skladu s uputama proizvođača. Plazmidnu DNA izolira se iz transformanata otpornih na ampicilin, a prisustvo inserta potvrdi restrikcijskom analizom i analizom slijeda DNA. Ovi plazmidi označeni su kao pSE190 (dobiven pomoću klice D1F1), pSE191 (dobiven pomoću klice D1F2), pSE192 (dobiven pomoću klice D1F3), te pSE193 (dobiven pomoću klice D2F2).

DNA inserte se svakog obradi s BamHI/XbaI, razdvoji elektroforezom, pročisti iz gela, te svaki za sebe ligira s taksi-vektorom pWHM3 obrađenim s BamHI/XbaI, uz koncentraciju ukupne DNA od 1 µg u 1:5 molarnom odnosu vektor:insert. Ligacijske smjese upotrebljava se za transformiranje kompetentnih E. coli DH5α stanica. Plazmidnu DNA izolira se iz transformanata otpornih na ampicilin, a prisustvo inserta potvrdi restrikcijskom analizom. Ove plazmide, označene kao pSE194 (D1F1), pSE195 (D1F2), pSE196 (D1F3), te pSE197 (D2F2), svakog zasebno se transformira u E. coli soj DM1, plazmidnu DNA izolira iz transformanata otpornih na ampicilin, a prisustvo ispravnog inserta potvrdi restrikcijskom analizom. Ovu DNA upotrebljava se za transformiranje protoplasta S. avermitilis soja SE180-11. Izolira se transformante soja SE180-11 otporne na tiostrepton, odredi prisustvo otpornosti na eritromicin, te Thior Ermr transformante analizira HPLC analizom produkata fermentacije, kako bi se odredilo koja su GTG mjesta nužna za ekspresiju aveC. Rezultati ukazuju da se GTG kodon na položaju 42 može ukloniti bez utjecaja na ekspresiju aveC, stoga što svaki od pSE194, pSE195 i pSE196, od kojih svakom nedostaje GTG mjesto na položaju 42, ali koji svi sadrže tri GTG mjesta na položajima 174, 177 i 180, može obnoviti normalnu proizvodnju avermektina kada ih se transformira u SE18011. Normalnu proizvodnju avermektina ne obnavlja se kada se soj SE180-11 transformira s pSE197, kojem nedostaju sva četiri GTG mjesta (Tablica 5).

Tablica 5

[image]

PRIMJER: KLONIRANJE HOMOLOGA aveC IZ BAKTERIJA S. HYGROSCOPICUS I S. GRISEOCHROMOGENEs

Ovaj izum dopušta određivanje i kloniranje homologa gena aveC iz drugih vrsta roda Streptomyces koje proizvode avermektin ili milbemicin. Primjerice, kozmidne biblioteke S. hygroscopicus (FERM BR-1901) genomske DNA hibridizira se s 1,2 kb sondom iz bakterije S. avermitilis, opisanom gore. Opaženo je da se neki kozmidni klonovi snažno hibridiziraju. Kromosomsku DNA izolira se iz ovih kozmida, te se odredi 4,9 kb KpnI fragment koji hibridizira s aveC sondom. Određen je slijed DNA, te je opaženo da ORF (SEQ ID NO: 3) ima bitnu homologiju s aveC ORF-om iz bakterije S. avermitilis. Aminokiselinski slijed (SEQ ID NO: 4), izveden iz S. hygroscopicus homologa aveC ORF-a, prikazan je na Slici 8.

Osim toga, kozmidna biblioteka S. griseochromogenes genomske DNA hibridizira se s 1,2 kb aveC sondom iz bakterije S. avermitilis, opisanom gore. Opaženo je da se neki kozmidni klonovi snažno hibridiziraju. Iz ovih kozmida izolira se kromosomska DNA, te se odredi 5,4 kb PstI fragment koji hibridizira s aveC sondom. Ovoj DNA odredi se slijed, te se odredi djelomični ORF homologa aveC, koji ima bitnu homologiju s aveC ORF-om iz bakterije S. avermitilis. Izvedeni djelomični aminokiselinski slijed (SEQ ID NO: 5) prikazan je na Slici 6.

Analiza DNA i aminokiselinskog slijeda homologa aveC iz bakterija S. hygroscopicus i S. griseochromogenes ukazuje da ova područja dijele bitnu homologiju (oko 50 % istovjetnosti slijeda na aminokiselinskoj razini), kako međusobno, tako i s S. avermitilis aveC ORF-om i genskim produktom AveC (Slika 6).

PRIMJER: KONSTRUKCIJA PLAZMIDA S aveC GENOM IZA ermE PROMOTORA

1,2 kb aveC ORF iz pSE186 supklonira se u pSE34, koji je taksi-vektor pWHM3 s 300 bp ermE promotorom insertiranim kao KpnI/BamHI fragment na KpnI/BamHI mjesto na pWHM3 (vidjeti Ward i drugi: "Mol. Gen. Genet.", 203: 468-478, (1986.)). pSE186 obradi se s BamHI i HindIII, obradak podvrgne elektroforezi, a 1,2 kb fragment izolira iz agaroznog gela i ligira s pSE34 obrađenim s BamHI i HindIII. Ligacijsku smjesu transformira se u kompetentne E. coli DH5α stanice, u skladu s uputama proizvođača. Plazmidnu DNA izolira se iz transformanata otpornih na ampicilin, a prisustvo 1,2 kb inserta potvrdi restrikcijskom analizom. Ovaj plazmid, označen kao pSE189, transformira se u bakteriju E. coli DM1, a plazmidnu DNA izolira iz transformanata otpornih na ampicilin. Protoplaste S. avermitilis soja 1100-SC38 transformira se s pSE189. Izolira se transformante soja 1100-SC38 otporne na tiostrepton, te analizira HPLC analizom produkata fermentacije.

Transformanti S. avermitilis soja 1100-SC38 koji sadrže pSE139 imali su izmijenjene odnose proizvedenih cikloheksil-B2:cikloheksil-B1 avermektina (oko 3:1), u usporedbi sa sojem 1100-SC38 (oko 34:1), a ukupno dobivanje avermektina povećano je približno 2,4 puta u usporedbi sa sojem 1100-SC38 transformiranim s pSE119 (Tablica 6).

pSE189 se također transformira u protoplaste S. avermitilis soja divljeg tipa. Izolira se transformante otporne na tiostrepton, te analizira HPLC analizom produkata fermentacije. Ukupni avermektini koje proizvodi divlji tip bakterije S. avermitilis, transformiran s pSE189 povećani su približno 2,2 puta, u usporedbi sa divljim tipom bakterije S. avermitilis transformiranim s pSE119 (Tablica 6).

Tablica 6

[image]

PRIMJER: KIMERNI PLAZMID KOJI SADRŽI SLJEDOVE KAKO S. AVERMITILIS aveC ORF, TAKO I S. HYGROSCOPICUS HOMOLOGA aveC

Konstruiran je hibridni plazmid, označen kao pSE350, koji sadrži 564 bp dio S. hygroscopicus homologa aveC, koji zamjenjuje 564 bp homologni dio S. avermitilis aveC ORF-a (Slika 7), kao što slijedi. pSE350 je konstruiran pomoću BsaAI restrikcijskog mjesta, konzerviranog u oba slijeda (aveC položaj 225), te KpnI restrikcijskog mjesta, prisutnog u S. avermitilis aveC genu (aveC položaj 810). Mjesto KpnI uvede se u S. hygroscopicus DNA pomoću PCR, uz upotrebu desno usmjerene klice 5'-CTTCAGGTGTACGTGTTCG-3' (SEQ ID NO: 23) i lijevo usmjerene klice 5'-GAACTGGTACCAGTGCCC-3' (SEQ ID NO: 24) (dobavljač Genosys Biotechnologies), uz uvjete za PCR opisane u Poglavlju 7.1.10, gore. PCR produkt obradi se s BsaAI i KpnI, fragmente razdvoji elektroforezom u 1 % agaroznom gelu, a 564 bp BsaAI/KpnI fragment izolira iz gela. pSE179 (opisan u Poglavlju 7.1.10, gore) obradi se s KpnI i HindIII, fragmente razdvoji elektroforezom u 1 % agaroznom gelu, a fragment od oko 4,5 kb izolira iz gela. pSE179 obradi se s HindIII i BsaAI, fragmente razdvoji elektroforezom u 1 % agaroznom gelu, a oko 0,2 kb BsaAI/HindIII fragment izolira se iz gela. Oko 4,5 kb HindIII/KpnI fragment, oko 0,2 kb BsaAI/HindIII fragment, te 564 bp BsaAI/KpnI fragment iz bakterije S. hygroscopicus ligira se zajedno u ligiranju na 3 načina, a ligacijsku smjesu transformira u kompetentne E. coli DH5α stanice. Plazmidnu DNA izolira se iz transformanata otpornih na ampicilin, a prisustvo ispravnog inserta potvrdi restrikcijskom analizom pomoću KpnI i AvaI. Ovaj plazmid obradi se s HindIII i XbaI, kako bi se oslobodilo 1,2 kb insert, koji se zatim ligira s pWHM3 obrađenim s HindIII i XbaI. Ligacijsku smjesu transformira se u kompetentne E. coli DH5α stanice, plazmidnu DNA izolira iz transformanata otpornih na ampicilin, a prisustvo ispravnog inserta potvrdi restrikcijskom analizom pomoću HindIII i AvaI. Ovu plazmidnu DNA transformira se u bakteriju E. coli DM1, plazmidnu DNA izolira iz transformanata otpornih na ampicilin, a prisustvo ispravnog inserta potvrdi restrikcijskom analizom i analizom slijeda DNA. Ovaj plazmid označen je kao pSE350 i upotrebljava se za transformiranje protoplasta S. avermitilis soja SE180-11. Izolira se transformante soja SE180-11 otporne na tiostrepton, odredi prisustvo otpornosti na eritromicin, a Thior Ermr transformante analizira HPLC analizom produkata fermentacije. Rezultati ukazuju da transformanti koji sadrže S. avermitilis/S. hygroscopicus hibridni plazmid imaju prosječni odnos B2:B1 od oko 109:1 (Tablica 7).

Tablica 7

[image]

DEPOZIT BIOLOŠKIH MATERIJALA

Slijedeći biološki materijal deponiran je u American Type Culture Collection (ATCC) (Kolekcija američkog tipa kultura), 12301 Parklawn Drive, Rockville, MD, 20852, USA, 29. siječnja 1998., uz dodjelu slijedećih pristupnih brojeva:

Plazmid Pristupni br.

plazmid pSE180 209605

plazmid pSE186 209604

Svi ovdje navedeni patenti, patentne prijave i patentne objave uključeni su kao referenca u svojoj cijelosti.

Opseg ovog izuma nije ograničen specifičnim ovdje opisanim izvedbama, čija je namjena pojedinačna ilustracija pojedinačnih aspekata ovog izuma, a funkcionalno ekvivalentni postupci i komponente ulaze u opseg ovog izuma. Odista, različite modifikacije izuma, uz one prikazane i opisane ovdje biti će jasne stručnjacima iz ove specifikacije i pratećih slika. Namjera je da takve modifikacije uđu u opseg pridruženih patentnih zahtjeva.

Claims

1. Polinukleotidna molekula, naznačena time što sadrži nukleotidni slijed S. avermitilis aveC alela ili slijed iz plazmida pSE186 (ATCC 209604), koji kodira genski produkt AveC, ili nukleotidni slijed aveC ORF-a iz bakterije S. avermitilis, kao što je prikazano na Slici 1 (SEQ ID NO: 1), ili njegovu degeneriranu varijantu, ali gdje taj nukleotidni slijed također sadrži najmanje prvu mutaciju, koja kodira aminokiselinsku supstituciju od serina u treonin, na aminokiselinskom ostatku genskog produkta AveC, koji odgovara aminokiselinskom položaju 138 u SEQ ID NO: 2 i drugu mutaciju, koja kodira aminokiselinsku supstituciju od alanina u fenilalanin, na aminokiselinskom ostatku genskog produkta AveC, koji odgovara aminokiselinskom položaju 139 u SEQ ID NO: 2, tako da stanice S. avermitilis soja ATCC 53692, kod kojih je divlji tip aveC alela inaktiviran i koje eksprimiraju polinukleotidnu molekulu s mutiranim nukleotidnim slijedom, proizvode odnos klase 2:1 avermektina, smanjen u usporedbi s odnosom klase 2:1 avermektina koje proizvode stanice S. avermitilis soja ATCC 53692, koje umjesto toga eksprimiraju samo divlji tip aveC alela.

2. Polinukleotidna molekula prema patentnom zahtjevu 1, naznačena time što klasa 2:1 avermektina su cikloheksil B2:cikloheksil B1 avermektini.

3. Polinukleotidna molekula prema patentnom zahtjevu 2, naznačena time što smanjeni odnos cikloheksil B2:cikloheksil B1 je oko 0,75:1 ili manji.

4. Rekombinantni vektor, naznačen time što sadrži polinukleotidnu molekulu prema patentnom zahtjevu 1.

5. Rekombinantni vektor koji može mutirati aveC alel iz bakterije Streptomyces avermitilis uvođenjem najmanje prve mutacije, koja kodira aminokiselinsku supstituciju od serina u treonin, na aminokiselinskom ostatku genskog produkta AveC, koji odgovara aminokiselinskom položaju 138 u SEQ ID NO: 2 i druge mutacije, koja kodira aminokiselinsku supstituciju od alanina u fenilalanin, na aminokiselinskom ostatku genskog produkta AveC, koji odgovara aminokiselinskom položaju 139 u SEQ ID NO: 2, naznačen time što sadrži polinukleotidnu molekulu s nukleotidnim slijedom koji kodira takvu mutaciju.

6. Rekombinantni vektor prema patentnom zahtjevu 5, naznačen time što sadrži polinukleotidnu molekulu prema patentnom zahtjevu 1.

7. Stanica domaćina roda Streptomyces, naznačena time što sadrži polinukleotidnu molekulu prema patentnom zahtjevu 1, ili rekombinantni vektor prema patentnom zahtjevu 4 ili 5.

8. Postupak dobivanja novog soja bakterije S. avermitilis, kojeg čine stanice koje eksprimiraju mutirani aveC alel i koje proizvode smanjeni odnos klase 2:1 avermektina, u usporedbi sa stanicama istog soja bakterije S. avermitilis, koje umjesto toga eksprimiraju samo divlji tip aveC alela, naznačen time što se sastoji u: (a) uvođenju polinukleotidne molekule u stanicu soja bakterije S. avermitilis, gdje ta polinukleotidna molekula nosi mutirani aveC alel ili njegovu degeneriranu varijantu, koja kodira genski produkt AveC koji ima najmanje prvu aminokiselinsku supstituciju od serina u treonin, na aminokiselinskom ostatku koji odgovara aminokiselinskom položaju 138 u SEQ ID NO: 2 i drugu aminokiselinsku supstituciju, od alanina u fenilalanin na aminokiselinskom ostatku koji odgovara aminokiselinskom položaju 139 u SEQ ID NO: 2, gdje ekspresija navedenog genskog produkta rezultira smanjenjem odnosa klase 2:1 avermektina koje proizvode stanice soja bakterije S. avermitilis, koje eksprimiraju mutirani aveC alel ili njegovu degeneriranu varijantu, u usporedbi sa stanicama istog soja, koje umjesto toga eksprimiraju samo divlji tip aveC alela, i selekciji stanica koje proizvode avermektine u smanjenom odnosu klase 2:1, u usporedbi s odnosom klase 2:1 koje proizvode stanice soja koje umjesto toga eksprimiraju samo divlji tip aveC alela; ili (b) uvođenju jedne ili više polinukleotidnih molekula u stanice soja bakterije S. avermitilis, gdje te polinukleotidne molekule mogu uvesti jednu ili više mutacija u aveC alel na taj način da takve stanice kodiraju genski produkt AveC koji ima najmanje prvu aminokiselinsku supstituciju od serina u treonin, na aminokiselinskom ostatku koji odgovara aminokiselinskom položaju 138 u SEQ ID NO: 2 i drugu aminokiselinsku supstituciju od alanina u fenilalanin na aminokiselinskom ostatku, koji odgovara aminokiselinskom položaju 139 u SEQ ID NO: 2, gdje ekspresija genskog produkta rezultira smanjenjem odnosa klase 2:1 avermektina koje proizvode stanice soja bakterije S. avermitilis, koje eksprimiraju mutirani aveC alel, u usporedbi sa stanicama istog soja koje umjesto toga eksprimiraju samo divlji tip aveC alela, i selekciji stanica koje proizvode avermektine u smanjenom odnosu klase 2:1, u usporedbi s odnosom klase 2:1 kako ga proizvode stanice soja koje umjesto toga eksprimiraju samo divlji tip aveC alela.

9. Postupak prema patentnom zahtjevu 8, naznačen time što klasa 2:1 avermektina su cikloheksil B2:cikloheksil B1 avermektini.

10. Postupak prema patentnom zahtjevu 9, naznačen time što smanjeni odnos cikloheksil B2:cikloheksil B1 je oko 0,75:1 ili manji.

11. Streptomyces avermitilis stanica, naznačena time što sadrži mutirani aveC alel, koji sadrži prvu mutaciju koja kodira aminokiselinsku supstituciju od serina u treonin, na aminokiselinskom ostatku genskog produkta AveC koji odgovara aminokiselinskom položaju 138 u SEQ ID NO: 2 i drugu mutaciju, koja kodira aminokiselinsku supstituciju od alanina u fenilalanin na aminokiselinskom ostatku genskog produkta AveC koji odgovara aminokiselinskom položaju 139 u SEQ ID NO: 2.

12. Stanica prema patentnom zahtjevu 11, naznačena time što proizvodi smanjeni odnos klase 2:1 avermektina, u usporedbi sa stanicom istog soja bakterije Streptomyces avermitilis, koja umjesto toga sadrži samo divlji tip aveC alela.

13. Stanica prema patentnom zahtjevu 12, naznačena time što klasa 2:1 avermektina su cikloheksil B2:cikloheksil B1 avermektini.

14. Stanica prema patentnom zahtjevu 13, naznačena time što smanjeni odnos cikloheksil B2:cikloheksil B1 avermektina je od oko 0,75:1 ili manji.

15. Postupak proizvodnje avermektina, naznačen time što se sastoji u uzgoju stanica prema patentnom zahtjevu 11 u medijima za kulturu, pod uvjetima koji omogućuju ili induciraju proizvodnju avermektina u toj kulturi, i prikupljanju navedenih avermektina iz kulture.

16. Smjesa cikloheksil B2:cikloheksil B1 avermektina koje proizvode stanice bakterije Streptomyces avermitilis, naznačena time što sadrži cikloheksil B2:cikloheksil B1 avermektine u odnosu od oko 0,75:1 ili manjem, u mediju u kojem su stanice kultivirane.

17. Smjesa cikloheksil B2:cikloheksil B1 avermektina koje proizvode stanice soja bakterije Streptomyces avermitilis, koje eksprimiraju mutirani aveC alel koji kodira genski produkt koji rezultira smanjenjem odnosa klase 2:1 cikloheksil B2:cikloheksil B1 avermektina koje proizvode stanice, u usporedbi sa stanicama istog soja bakterije S. avermitilis, koje ne eksprimiraju mutirani aveC alel, već umjesto toga eksprimiraju samo divlji tip aveC alela, naznačena time što sadrži cikloheksil B2:cikloheksil B1 avermektine u odnosu od oko 0,75:1 ili manjem u mediju, u kojem su stanice kultivirane.