BG106478A - Ген на streptomyces avermitilis, модулиращ съотношението на авермектините в2:в1 - Google Patents

Description

ГЕН НА STREPTOMYCES AVERMITILIS МОДУЛИРАЩ СЪОТНОШЕНИЕТО НА АВЕРМЕКТИНИТЕ В2;В1

1. ОБЛАСТ НА ТЕХНИКАТА

Настоящето изобретение е насочено към състави и методи за продукция на авермектини, и първоначално към областта на здравеопазването при животните. По-специално настоящето изобретение се отнася до полинуклеотидни молекули, включващи нуклеотидни последователности, кодиращи продукта на AveC гена, който може да бъде използван за модулиране на съотношението клас 2:1 на авермектините, получени чрез ферметация от култури на Streptomyces avermitilis и до състави и методи за скриниране на такива полинуклеотидни молекули. Настоящето изобретение по-нататък се отнася до вектори, трансформирани клетки-гостоприемници и нови мутантни щамове на 5. avermitilis с мутации в aveC гена, които да модулират съотношението клас 2:1 на получените авермектини.

2. ПРЕДШЕСТВАЩО НИВО НА ТЕХНИКАТА

2.1, АВЕРМЕКТИНИ

Видовете Streptomyces продуцират голямо разнообразие от вторични метаболити, включително и авермектини които включват серия от осем от 16 членното семейство на макроцикличните лактони, които притежават силна противоглисгна и инсектицидна активност. Осемте различни, но близко родствени съединения се отнасят като Ala,

МйМММЙ1

Alb, А2а, A2b, Bia, Bib, B2a и B2b. Серията на съединения “а” се отнася до естествени авермектини където заместителя в позиция С25 е (S)-BTOp.-6ynm, а серията “б” се отнася до тези съединения, където заместителя в позиция С25. е изопропил. Означенията “А” и “В” се отнасят до авермектини, където заместителят в позиция С5 е съответно метокси и хидрокси. Номерацията “1” се отнася до авермектини, където двойната връзка присъства в позиция С22,С23 и номерацията “2” се отнася до авермектини които имат водород в позиция С22 и хидрокси в позиция С23. Между тези авермектини, авермектин от тип В1 е известен с това че притежава по-ефективна антипаразитна и пестицидна активност, и поради това е най-предпочитания авермектин с търговско значение.

Авермектините и тяхната продукция, чрез аеробна ферментация от щамове на 5. avermitilis са описани в United States Патенти 4,310,519 и 4,429,042. Счита се, че биосинтезата на естествени авермектини е инициирана ендогенно от СоА тиоестерни аналози на изомаслената киселина и S-(+)-2-метил маслената киселина.

Комбинацията от подобряването на щама, чрез случайна мутагенеза и използването на екзогенно приложени мастни киселини води до ефективна продукция на авермектинови аналози. Мутанти на S. avermitilis, които са дефицитни по отношение на киселата дехидрогеназа за 2-оксо разклонената верига могат да продуцират авермектини само когато при ферментациите се доставят мастни киселини. Скринингът и изолирането на мутанти дефицитни по отношение на дехидрогеназната активност за разклонената верига (напр. 5. avermitilis, АТСС 53567) са описани в Европейски Патент (ЕР) 276103. Ферментацията при такива мутанти в присъствието на екзогенно приложени мастни киселини води до продукцията само на четири авермектина, съответстващи на въведените мастни киселини.

• · 3 · ♦ ·· ··· ·· ·· ·· ····

Така ферментациите на S'. avermitilis (АТСС 53567) при прилагане на S(+)-2-метилмаслена киселина води до продукцията на естествените авермектини Ala, А2а, В1а и В2а, прилагането на изомаслена киселина, при ферментацията води до продукцията на естествените авермектини Alb, A2b, Bib и В2Ь, и когато при ферментацията се прилага циклопентанкарбоксилна киселина, това води до продукцията на четири нови циклични авермектини Al, А2, В1 и В2.

Ако се приложат други мастни киселнити се получават нови авермектини. Чрез скрининг на над 800 потенциални прекурсори са идентифицирани повече от 60 други нови авермектини (Виж напр. Dutton et al., 1991, J. Antibiot. 44:357-365; и Banks et al., 1994, Roy. Soc. Chem. 147:16-26). В допълнение, мутанти на S. avermitilis дефицитни по отношение на 5-О-метилтрансферазната активност продуцират най-вече само В аналозите на авермектините. В последствие, S’, avermitilis мутанти, при които липсват киселата дехидрогеназа на 2-оксо разклонената верига и 5-О-метилтрансферазната активност, продуцират само В авермектините отговарящи на мастните киселини, участващи във ферментацията. Така прилагането на 5-(+)-2-метилмаслена киселина при двойни мутанти, води до продукцията само на естествените авермектини В1а и В2а, докато прилагането на изомаслена киселина или циклопентанкарбоксилна киселина води до продукцията на естествените авермектини Bib и В2Ь или съответно до новите циююпентилови авермектини В1 и В2. Прилагането на циклохексан карбоксилна киселина при двойният мутантен щам е предпочитан метод за продукция на нов авермектин - авермектин циклохексил В1 (дормектин) с важно търговско значение. Изолирането и характеризирането на такива двойни мутанти, напр. 5. avermitilis (АТСС 53692) е описано в ЕР 276103.

• *

2,2. ГЕНИ АНГАЖИРАНИ В БИОСИНТЕЗАТА НА АВЕРМЕКТИНИТЕ.

В много случаи, гените ангажирани в продукцията на вторични метаболити и гените, кодиращи специфични антибиотици се намират групирани като клъстери в хромозомата. Такъв е случая например с гените, кодиращи поликетид синтетазата - PKS генния клъстер на Strepiomyces (виж. Hopwood и Sherman, 1990, Ann.Rev. Genet. 24:37-66). Така, една от стратегиите за кпониране на гени, ангажирани в биосинтетичния път е изолирането на гена за резистентност към лекарствени препарати и след това проверка на съседните райони на хромозомата за други гени отнасящи се към биосинтезата на този антибиотик. Друга стратегия за кпониране на гени, ангажирани в биосинтезата на важни метаболити е допълването на мутантите. Например, части от ДНК библиотека на организъм, способен да продуцира специфичен метаболит се въвежда в мутант, който не го продуцира и трансформантите се скринират за продукцията на метаболитите. Използва се също хибридизация на библиотеката със сонди, произхождащи от други видове Strepiomyces за идентифициране и кпониране на гени, ангажирани в биосинтетичните пътища.

Гените ангажирани в биосинтеза на авермектин (ave гените), също като гените, ангажирани в биосинтеза на други вторични метаболити на Strepiomyces (например PK.S) се намират групирани като клъстери в хромозомата. Известен брой ave гени са клонирани успешно, чрез използване на вектори за допълване на S', avermitilis мутантите, в които е блокирана авермектиновата биосинтеза. Клонирането на такива гени е описано в U.S. Патент 5,252,474. В допълнение, Ikeda et al., 1995, Antibiot. 48:532-534, описва районът на хромозомата, където е локализиран гена aveC, ангажиран в стъпката на

дехидратиране при С22,23, който е фрагмент с размери 4.82 КЬ, получен при рязане с Bam Н1 на ДНК от S. avermitilis, и също така мутации в aveC гена, които водят само до продукцията на компонент В2а. Тъй като ивермектинът, който притежава висока противоглистна активност може да бъде получен по химичен път от авермектин В2а, се счита че такъв продуцент който продуцира само авермектиновия компонент В2а, може да се използва специфично за получаването на ивермектин с търговска цел.

Идентифициране на мутации в aveC гена които свеждат до минимум кимплицираността на авермектиновата продукцията, каквито са например мутации, които намаляват съотношението В2.В1 на авермектините, ще опростят продукцията и пречистването на авермектини с търговско значение.

3. ТЕХНИЧЕСКА СЪЩНОСТ НА ИЗОБРЕТЕНИЕТО

Настоящето изобретение осигурява изолирана полинуклеотидна молекула, която включва пълната ORF на aveC гена на S. avermitilis или съществена част от нея, в която изолирана полинуклеотидна молекула липсва следващата пълна ORF, за която in situ е доказано, че се намира в хромозомата на S. avermitilis преди ORF на aveC гена. Изолираната полинуклеотидна молекула от настоящето изобретение за предпочитане включва нуклеотидна последователност, която е същата като тази на плазмид pSEl 86 (АТСС 209604), кодираща продукта на AveC гена на S. avermitilis или същата като нуклеотидната последователност на ORF на aveC показана на Фиг.1 (SEQ ID N0:1), или съществена част от нея. Настоящето изобретение по-нататък осигурява изолирана полинуклеотидна молекула, която включва нуклеотидна последователност SEQ ID N0:1 или изроден неин вариант.

Настоящето изобретение по-нататък осигурява изолирана полинуклеотидна молекула, която има нуклеотидна последователност, която е хомоложна на тази на плазмид pSE186 (АТСС 209604), кодираща продукта на AveC гена на S avermitilis, или на нуклеотидната последователност на ORF на aveC представена на ФИГУРА 1 (SEQ ID N0:1), или на съществена част от нея.

Настоящето изобретение по-нататък осигурява изолирана полинуклеотидна молекула, включваща нуклеотидната последователност, кодираща полипептид, който има аминокиселинна последователност, която е хомоложна на аминокиселинната последователност, кодирана от последователността на плазмид pSE186 (АТСС 209604), кодираща продукта на AveC гена, или аминокиселинна последователност на SEQ ID N0:2, показана на ФИГУРА 1, или съществена част от нея.

Настоящето изобретение по-нататък осигурява изолирана полинуклеотидна молекула, включваща последователност, кодираща продукта на хомолога на AveC гена. В предпочитан вариант, изолираната полинуклеотидна молекула включва нуклеотидна последователност от 5. hygroscopicus, кодираща продукта на хомолога на AveC гена, като продукта на хомолога на гена включва аминокиселинна последователност SEQ ID N0:4, или съществена част от нея. В предпочитан вариант, изолираната полинуклеотидна молекула от 5. hygroscopicus от настоящето изобретение, която кодира продукта на хомолога на AveC гена, включва нуклеотидната последователност SEQ ID N0:3, или съществена част от нея.

Настоящето изобретение по-нататък осигурява изолирана полинуклеотидна молекула, която включва нуклеотидна последователност, която е хомоложна на нуклеотидната последователност SEQ ID N0:3 на S. hygroscopicus. Настоящето • · ·· изобретение по-нататък осигурява изолирана полинуклеотидна молекула, включваща нуклеотидна последователност, която е хомоложна на гена на S. hygroscopicus, който е хомолог на гена кодиращ AveC генния продукт, кодираща полипептид който има аминокиселинна последователност SEQ ID N0:4.

Настоящето изобретение по-нататък осигурява

олигонуклеотиди, които хибридизират с полинуклеотидна молекула, която има нуклеотидната последователност от ФИГУРА 1 (SEQ ID N0:1) или SEQ 1D N0:3, или с полинуклеотидна молекула, която има нуклеотидна последователност, която е комплементарна на нуклеотидната последователност от ФИГУРА 1 (SEQ ID N0:1) или на SEQIDN0:3.

Настоящето изобретение по-нататък осигурява

рекомбинантни вектори за клониране или експресия, които се използват за клониране и експресия на полинуклеотид от настоящето изобретение, включващ полинуклеотидни молекули, включващи ORF на aveC на S. avermitilis или на хомолога на ORF на aveC. В неограничен вариант, настоящето изобретение осигурява плазмид pSE186 (АТСС 209604), който включва пълната ORF на aveC гена на 5. avermitilis. Настоящето изобретение по-нататък осигурява трансформирани кпеткигостоприемници, които включват полинуклеотидна молекула или рекомбинантен вектор от изобретението и нови щамове или клетъчни линии, произхождащи от тях.

Настоящето изобретение по-нататък осигурява рекомбинантно експресиран продукт на AveC гена или на продукта на хомолога на AveC гена, или на съществена част от него, който е значително пречистен или изолиран, както и неговите хомолози. Настоящето изобретение по-нататък осигулява метод за получаване на рекомбинантен продукт на AveC гена, включващ култивиране на

····

клетки-гостоприемници, трансформирани с рекомбинантния вектор за експресия, наречен рекоминантен експресионен вектор, включващ полинуклеотидна молекула, която има нуклеотидна последователност кодираща продукт на AveC гена, или продукта на хомолога на AveC гена, която полинуклеотидна молекула е в оперативна асоциация с един или повече регулаторни елементи, които контролират експресията на полинуклеотидната молекула в клетките-гостоприемници, при условия водещи до получаване на рекомбинантния продукт на AveC гена или на продукт на хомолога на AveC гена и до повторното получаване на продукта на AveC гена или на продукта на хомолога на AveC гена от клетъчната култура.

Настоящето изобретение по-нататък осигурява полинуклеотидна молекула, включваща нуклеотидна последователност, която в други случаи е същата като тази на AveC алела на S. avermitilis или като нуклеотидната последователност на плазмид pSE186 (АТСС 209604), кодираща продукта на AveC гена, или на изроден негов вариант, или като нуклеотидната последователност на ORF на aveC на

5. avermitilis щам, представена на ФИГУРА 1 (SEQ ID N0:1) или изроден неин вариант, но която по-нататък включва една или повече мутации, така че клетките на S. avermitilis щам АТСС 53692 в който дивия тип aveC алел е инактивиран и който експресира полинуклеотидната молекула, включваща мутиралата нуклеотидна последователност продуцират различно съотношение или количество на авермекгини, в сравнение с тези получени от клетки на S. avermitilis щам АТСС 53692, който вместо това експресира само дивия тип aveC алел. Що се отнася до настоящето изобретение, такива полинуклеотидни молекули могат да бъдат използвани за създаването на нови щамове на S. avermitilis, които показват видима промяна в продукцията на авермектини, в сравнение със същия щам, който вместо • · ···· • ·

Q·· ··

това експресира само дивия тип aveC алел. В предпочитан вариант, такива полинуклеотидни молекули се използват за създаване на нови щамове на S. avermitilis, с редуцирано съотношение клас 2:1 на получените авермектини, в сравнение с тези получени от същия щам, който вместо това експресира само дивия тип aveC алел. По-нататък в предпочитан вариант, такива полинуклеотидни молекули се използват за създаването на нови щамове на 5. avermitilis, които продуцират повишени нива от авермектини, в сравнение със същия щам, който вместо това експресира само единичен див тип aveC алел. По-нататък в предпочитан вариант такива полинуклеотидни молекули се използват за създаването на нови щамове, в които aveC генът е инактивиран.

Настоящето изобретение осигурява методи за идентифициране на мутации в ORF на aveC на S. avermitilis, способни да променят съотношението и/или количеството на получените авермектини. В предпочитан вариант, настоящето изобретение осигурява метод за идентифициране на мутации в ORF на aveC, способни да променят съотношението клас 2:1 на продукцираните авермектини, който включва: (а) определяне на съотношението клас 2:1 на авермектините, получени от клетки на щам S. avermitilis, в който е инактивиран нативният aveC алел и в който полинуклеотидна молекула, включваща нуклеотидна последователност, кодираща продукт на мутирал AveC ген е вкарана и експресирана; (б) определяне на съотношението клас 2:1 на авермектините, получени от клетки на същия щам на S. avermitilis от стъпка (а), но който вместо това експресира само дивия тип aveC алел или ORF от ФИГУРА 1 (SEQ ID N0:1) или хомоложна нуклеотидна последователност; и (в) сравняване на съотношението клас 2:1 на авермектините, получени от клетки на 5. avermitilis от стъпка (а) със съотношението клас 2:1 на авермектините, получени от клетки на S. avermitilis от стъпка (б); така че, когато ·· ···· • · · • · · · · • ··· ·» ··«· е ♦ « 9 • · · ·· ···· съотношението клас 2:1 на авермектините, получени от клетки на S. avermitilis от стъпка (а) е различно от съотношението клас 2:1 на авермектините, получени от клетки на S. avermitilis от стъпка (б), тогава е идентифицирана мутация в ORF на aveC способна да променя съотношението клас 2:1 на авермектините. В предпочитан вариант, съотношението клас 2:1 на авермектините се редуцира от мутацията.

По-нататък в предпочитан вариант, настоящето изобретение

осигурява метод за идентифициране на мутации в ORF на aveC или на генетични конструкти, включващи ORF на aveC, способни да променят количеството на получените авермектини, който включва: (а) определяне на количеството на авермектините, получени от клетки на S'. avermitilis щам, чийто нативен aveC алел е инактивиран, и в който е въведена и експресирана полинуклеотидна молекула, включваща нуклеотидна последователност, кодираща продукта на мутирал AveC ген или включваща генетичен конструкт, включващ нуклеотидна последователност, кодираща продукта на AveC гена; (б) определяне на количеството на получените авермектини от клетки на същия щам на S. avermitilis от стъпка (а), но който вместо това експресира само единичен aveC алел, който има нуклеотидна последователност на ORF от ФИГУРА 1 (SEQ ID N0:1) или нейна хомоложна нуклеотидна последователност; и (в) сравняване на количеството на получените авермектини от клетки на S. avermitilis от стъпка (а) с количеството на авермектините, получени от S. avermitilis от стъпка (б), като когато количеството на получените авермектини от клетки на S. avermitilis от стъпка (а) е различно от количеството на авермектините, получени от клетки на S. avermitilis от стъпка (б) тогава е идентифицирана мутация в ORF на aveC или генетичен конструкт, способен да променя количеството на получените авермектини. В предпочитан вариант, количеството на получените авермектини се повишава от мутацията.

йММК

«

Настоящето изобретение по-нататък осигурява рекомбинантни вектори, които се използват за създаването на нови щамове на S. avermitilis, с промененд авермектинова продукция. Например, настоящето изобретение осигурява вектори, които могат да бъдат използвани за въвеждането на която и да е от полинуклеотидните молекули, включващи мутирала нуклеотидна последователност от настоящето изобретение, на мястото на ORF на aveC гена в хромозомата на S. avermitilis, които могат да бъдат вкарани в или да заместят aveC алела или ORF или част от нея, чрез хомоложна рекомбинация. Съгласно настоящето изобретение обаче, полинуклеотидна молекула включваща мутирала нуклеотидна последователност на настоящето изобретение осигурена тук, може също да функционира, като модулира биосинтезата на авермектин, когато е вкарана в хромозомата на S. avermiiilis на различно място от aveC гена или когато е въведена епизомално в клетките на S. avermitilis. Така настоящето изобретение също осигурява вектори, включващи полинуклеотидна молекула, включваща мутирала нуклеотидна последователност от настоящето изобретение, които вектори могат да бъдат използвани за вкарване на полинуклеотидната молекула в място от хромозомата на 5. avermitilis различно от мястото за aveC гена, или да бъде въведена епизомално. В предпочитан вариант, настоящето изобретение осигурява вектори за заместване на гени, които могат да бъдат използвани за вкарване на мутирал aveC алел в хромозомата на S. avermitilis, за създаването на нови щамове от клетки, които продуцират авермектини с редуцирано съотношение клас 2:1, в сравнение с клетки на същия щам, които вместо това експресират само дивия тип aveC алел.

Настоящето изобретение по-нататък включва методи за създаване на нови щамове на S. avermitilis, включващи клетки, които експресират мутирал aveC алел и които продуцират променени

съотношения и/или количества на авермектини, в сравнение с клетки на същия щам на 8. avermitilis, който вместо това експресира само див тип aveC апел. В предпочитан вариант, настоящето изобретение осигурява метод за създаване на нови щамове на 8. avermitilis, включващи клетки, които експресират мутирал aveC алел и които продуцират авермектини с променено съотношение клас 2:1, в сравнение с клетки на същия щам на 8. avermitilis, който вместо това експресира само див тип aveC алел, включващ трансформирани клетки на 8. avermitilis щам с вектор, който носи мутирал aveC алел, който кодира продукта на ген, който променя съотношението клас 2:1 на авермектините, получени от клетки на 8. avermitilis щам, експресиращ мутирал алел, в сравнение с клетки от същия щам, които вместо това експресират само дивия тип aveC алел и селекция на трансформираните клетки, които продуцират авермектини с променено съотношение клас 2:1, в сравнение със съотношението клас 2:1 на авермектините, получени от клетки на щам, който вместо това експресира див тип aveC алел. В предпочитан вариант, съотношението клас 2:1 на получените авермектини е редуцирано в клетките на новия щам.

По-нататък, в предпочитан вариант, настоящето изобретение осигурява метод за създаване на нови щамове на 8. avermitilis, включващи клетки, които продуцират променено количество авермектини, който включва трансформация на клетки на 8. avermitilis щам, с вектор който носи мутирал aveC алел или с генетичен конструкт включващ aveC алела, експресията на който води до промяна в количеството на получените авермектини от клетките на 8. avermitilis щам, експресираши мутирал aveC алел или генетичен конструкт, в сравнение с клетки на същия щам, които вместо това експресират само дивия тип aveC алел, и селекция на трансформираните клетки, които продуцират променено количество на авермектини, в сравнение с • · ·

количеството на авермектините, получени от клетки на щам, който вместо това експресира само дивия тип aveC алел. В предпочитан вариант, количеството на получените авермектини е повишено в клетките на новия щам.

В друг предпочитан вариант, настоящето изобретение

осигурява метод за създаване на нови щамове на S. avermitilis, клетките на които включват инактивиран aveC алел, който включва трансформация на клетки на 5. avermitilis щам, които експресират който и да е aveC алел с вектор, който инактивира aveC алела и селекция на трансформираните клетки, в които aveC алела е инактивиран.

Настоящето изобретение по-нататък осигурява нови щамове

на S. avermitilis, включващи клетки, които са трансформирани с която и да е от полинуклеотидните молекули или вектори, включащи мутирала нуклеотидна последователност от ностоящето изобретение. В предпочитан вариант, настоящето изобретение осигурява нови щамове на 5. avermitilis включващи клетки, които експресират мутирал aveC алел на мястото на или в допълнение към дивия тип aveC алел, където клетките на новия щам продуцират авермектини с променено съотношение клас 2:1, в сравнение със клетки от същия щам, които вместо това експресират само дивия тип aveC алел. В още попредпочитан вариант, клетките от новия щам продуцират авермектини с редуцирано съотношение клас 2:1, в сравнение с клетки от същия щам, които вместо това експресират само дивия тип aveC алел. Такива нови щамове се използват за продукция на авермектини с търговско значение в широки мащаби, като например за дорамектин.

По-нататък в предпочитан вариант, настоящето изобретение осигурява нови щамове на 5. avermitilis, включващи клетки, които експресират мутирал aveC алел или генетичен конструкт, включващ aveC алела на мястото на или в допълнение към техния нативен aveC • · · · · · • · алел, което води до продукцията на променено количество на авермектини от тези клетки, в сравнение с количеството авермектини, получено от клетки на същия щам, които вместо това експресират само дивия тип aveC алел. В предпочитан вариант, новите клетки продуцират повишено количество авермектини.

По-нататък в предпочитан вариант, настоящето изобретение

осигурява нови щамове на S. avermitilis, включващи клетки в които aveC алела е инактивиран. Такива щамове се използват за определяне на разликите в спектъра на авермектините, които те продуцират, в сравнение с тези на щама на дивия тип и за допълване на скрининг анализите, които са описани тук, за установяване дали насочения или случаен мутагенезис на aveC гена се отразява върху продукцията на авермектините.

Настоящето изобретение по-нататък осигурява метод за

продукция на авермектини, включващ култивиране на клетки на S. avermitilis щам, които клетки експресират мутирал aveC алел, който кодира генен продукт, който променя съотношението клас 2:1 на авермектините, получени от клетки на S. avermitilis щам, експресиращи мутирал aveC алел, в сравнение с клетки от същия щам, които не експресират мутирал aveC алел, но вместо това експресират само дивия тип aveC алел в средата за култивиране, при условия, които позволяват или индуцират продукцията на авермектини от тях и повторното получаване на тези авермектини от културата. В предпочитан вариант, съотношението клас 2:1 на авермектините, получени от клетките експресиращи мутацията е редуцирано. Този метод осигурява повишена ефикасност в продукцията на авермектини с търговско значение, като дорамектин.

Настоящето изобретение по-нататък осигурява метод за продукцията на авермектини, включващ култивиране на клетки на S.

avermitilis щам, които клетки експресират мутирал aveC алел или генетичен конструкт, включващ aveC алел, който води до продукцията на променено количество авермектини, получени от клетки на S. avermitilis щам, експресиращ мутирал aveC алел или генетичен конструкт, в сравнение с клетки на същия щам, които не експресират мутирал aveC алел или генетичен конструкт, но вместо това експресират само дивия тип aveC алел, в културална среда, при условия, които позволяват или индуцират продукцията на авермектини от тях, и повторното получаване на тези авермектини от културата. В предпочитан вариант, количеството на авермектини, получени от клетките експресиращи мутацията или генетичния конструкт е повишено.

Настоящето изобретение по-нататък осигурява нов състав на

авермектини, получени от щам на 5. avermitilis, експресиращ мутирал aveC алал от настоящето изобретение, където авермекините се получават в редуцирано съотношение клас 2:1 в сравнение със съотношението на авермектините клас 2:1, получени от клетки на същия щам на S. avermitilis, които не експресират мутиралия aveC алел, но вместо това експресират само дивия тип aveC алел. Новия авермектинов състав може да присъства като продукт на ферментацията в културалната среда или може да бъде изолиран от нея, и може да бъде частично или значително пречистен от нея.

4. КРАТКО ОПИСАНИЕ НА ФИГУРИТЕ

ФИУГРА 1. ДНК последователност (SEQ ID N0:1), включваща ORF на aveC на £ avermitilis и нейната производна аминокиселинна последователност (SEQ ID N0:2).

♦ ♦ ···· ♦· ··«· ·· • · · · · · · ···· , » · · ·4 • · *i А · · · ·· • · 1 ν « · · ·· ·· ··· ·· ·· ··

ФИГУРА 2. Плазмиден вектор pSE186 (АТСС 209604), включващ пълната ORF на aveC гена на S. avermitilis.

ФИГУРА 3. Вектор за заместване на ген pSE180 (АТСС 209605), включващ еппЕ гена на Sacc. erythraea, вкаран в ORF на aveC на S', avermitilis.

ФИГУРА 4. Bam Н1 рестриктазна карта на авермектиновия поликетид синтетазен генен клъстер на «S', avermitilis с пет идентифицирани припокриващи се козмидни клона (т.е., pSE65, pSE66, pSE67, pSE68, pSE69). Показана е също връзката между pSE118 и pSEl 19.

ФИГУРА 5. HPLC анализ на продуктите на ферментацията, получени от щамове на 5. avermitilis. Количествения пик се получава чрез сравняване със стандартни количества на циклохексил В1. Времето на задържане на циклохексил В2 е 7.4-7.7 минути, на циклохексил В1 времето на задържане е 11.9-12.3 минути. ФИГ. 5А S. avermitilis щам SE180-11 с ORF на инактивиран aveC. ФИГ. 5Б S’. avermitilis щам SE180-11 трансформиран с pSE186 (АТСС 209604). ФИГ. 5В. S. avermitilis щам SE180-11, трансформиран с pSE187. ФИГ. 5Г. S. avermitilis щам SE 180-11, трансформиран с pSEl 88.

ФИГУРА 6. Сравнение на производните аминокиселинни последователности, кодирани от ORF на aveC на S. avermitilis ( SEQ ID N0:2), ORF на частичния хомолог на aveC от S.griseochromogenes (SEQ ID N0:5) и ORF на хомолога на aveC от 5. hygroscopicus (SEQ ID N0:4). Болдираният валиновия остатък е доплънителното старт място на белтъка. Хомоложните и за трите последователности консерватини остътъци са показани с главни букви, и с по-малки букви са посочени хомоложните участъци в две от трите секвенции. Аминокиселинните последователности притежават около 50 % идентичност на секвенциите.

• · · · · · • · ft ft ft ft • ft

ФИГУРА 7. Хибриден плазмиден конструкт, носещ фрагмент BsaAI/Kpnl от хомолога на aveC гена на S. hygroscopicus с размери 564 бд вкаран в ORF на aveC в мястото BsaAI/Kpnl на S. avermitilis.

5. ПОДРОБНО ОПИСАНИЕ НА ИЗОБРЕТЕНИЕТО

Настоящето изобретение се отнася до идентифицирането и характеризирането на полунуклеотидни молекули, които имат нуклеотидни последователности, кодиращи продукта на AveC гена на Streptomyces avermitilis, до конструирането на нови щамове на S. avermitilis, които могат да бъдат използвани за скриниране на продуктите на мутиралия AveC ген, за техния ефект върху продукцията на авермектини и за откритието че дадена мутация в AveC гена води до продукти с редуцирано съотношение В2:В 1 на авермектините, получени от 5. avermitilis. Чрез дадените примери, изобретението е описано в дадените по-долу глави, като полинуклеотидна молекула с нейната нуклеотидна последователност, като последователността на плазмид pSE186 (АТСС 209604), която кодира продукта на AveC гена на S. avermitilis или като нукпеотидната последователност на ORF от ФИГУРА 1 (SEQ ID N0:1), и като полинуклеотидни молекули, с произход от тях, които имат имат мутации в нуклеотидните последователности или в изродените техни варианти. Застъпените в настоящето изобретение принципи обаче могат да бъдат аналогично приложени към други полинуклеотидни молекули, включващи хомолози на aveC гените от други измежду видовете Streptomyces включително напр. 5. hygroscopicus и 5. griseochromogenes.

5.1. ПОЛИНУКЛЕОТИДНИ МОЛЕКУЛИ КОДИРАЩИ

AveC ГЕННИЯ ПРОДУКТ НА S.A VERMITIUS

Настоящето изобретение осигурява изолирана полинуклеотидна молекула, включваща пълната ORF на aveC на 5. avermitilis или съществена част от нея, за която изолирана полинуклеотидна молекула in situ е установено, че липсва следващата пълна ORF, която е локализирана в хромозомата на S. avermitilis преди © ORF на aveC.

Изолираната полинуклеотидна молекула от настоящето изобретение, за предпочитане включва нуклеотидна последователност, която да е същата като тази на плазмид pSE186 (АТСС 209604), кодираща продукта на AveC гена, или същата нуклеотидна последователност на ORF от ФИГУРА 1 (SEQ ID N0:1) или съществена част от нея. Както е използвана тук “съществена част” от изолирана полинуклеотидна молекула включваща нуклеотидна последователност, кодиращата продукта на AveC гена на S. avermitilis, означава изолирана полинуклеотидна молекула, включваща най-малко ^w 70 % от пълната последователност на ORF на aveC показана на

ФИГУРА 1 (SEQ ID N0:1) и която кодира функционален еквивалент на AveC генния продукт. В този смисъл “функционален еквивалент” на AveC генния продукт се дефинира като генен продукт който когато се експресира в S. avermitilis щам АТСС 53692, в който нативния aveC алел е инактивиран, води до продукция на съществено същото съотношение и количество на авермектините, получени от 5. avermitilis щам АТСС 53962, който вместо това експресира само дивия тип, нативен функционален aveC алел на S. avermitilis щам АТСС 53692.

В допълнение към нуклеотидната последователност на ORF на aveC, изолираната полинуклеотидна молекула от настоящето

изобретение може по-нататък да включва нуклеотидни последователности за които in situ е установено, че граничат с aveC гена на £ avermitilis, както съседните нуклеотидни последователности показани на ФИГУРА 1 (SEQ ID N0:1).

Настоящето изобретение по-нататък осигурява изолиране на полинуклеотидна молекула, включваща нуклеотидна последователност SEQ ID N0:1 или изроден неин вариянт.

Както се използват тук, термините “полинуклеотидна молекула”, “полинуклеотидна последователност”, “кодираща последователност”, “отворена рамка на четене” и “ORF” могат да бъдат отнесени до ДНК и РНК молекули, които могат да бъдат едноверижни или двуверижни, и които могат да бъдат транскрибирани или транслирани (ДНК) или транслирани (РНК) като продукт на AveC гените, или както е описано по-долу като продукт на гена хомоложен на AveC, или като полипептид който е продукт на гена хомоложен на Ave С, или като продукт на гена хомоложен на AveC експресиран в подходяща система от клетки-гостоприемници, когато е поставен под контрола на подходящи регулаторни елементи. Кодираща последователност без да се ограничава до, може да включва прокариотни последователности, кДНК последователности, геномни ДИК последователности и химично синтезирани ДНК и РНК последователности.

Нуклеотидната последователност, показана на ФИГУРА 1 (SEQ ID N0:1) включва четири различни GTG кодона и нуклеотидни двойки (нд) в позиции 42, 174, 177 и 180. Както е описано по-долу в Глава 9 конструирани са много делеции в 5’ района на ORF на aveC (ФИГУРА 1; SEQ ID N0:1) за да помогнат да се определи кой от тези кодони биха могли да функционират в ORF на aveC като стартови места за експресията на белтък. Делеция от първото GTG място в базова ·· ···· ·· ····

двойка (бд) 42 не подтиска активността на AveC. Допълнителна делеция на другите GTG кодони едновременно в позиции на бд 174, 177, 180 подтискат изцяло активността на AveC, което показва че този район е необходим за експресията на белтък. Така настоящето изобретение обхваща вариабълна област на ORFs на aveC.

Настоящето изобретение по-нататък осигурява полинуклеотидна молекула, която има нуклеотидна последователност, хомоложна на тази от плязмид pSE186 (АТСС 209604) кодираща продукта на AveC гена на 5. avermitilis, или на нуклеотидната последователност на ORF на aveC представена на ФИГУРА 1 (SEQ ID N0:1) или на съществена част от нея. Термина “хомоложен”, когато се използва за да се отнесе до полинуклеотидна молекула, хомоложна на нуклеотидната последователност, кодираща продукта на AveC гена, означава полинуклеотидна молекула, която има нуклеотидна последователност: (а) която кодира същия продукт на AveC гена, като нуклеотидната последователност на плазмид pSE186 (АТСС 209604), кодираща продукта на AveC гена на 5. avermitilis, или същия продукт като този на нуклеотидната последователност на ORF на aveC, представена на ФИГУРА 1 (SEQ ID N0:1), но който включва една или повече тихи мутации в нуклеотидната последователност, отнасящи се до изродеността на генетичния код (т.е. изроден вариант); или (б) която хибридизира с комплементарната част на полинуклеотидна молекула, която има нуклеотидна последователност кодираща аминокиселинна последователност, кодирана от последователността на плазмид pSEl 86 (АТСС 209604), кодираща пордукта на AveC ген, или която кодира аминокиселинната последователност, показана на ФИГУРА 1 (SEQ ID N0:2), в условия на умерено специфична хибридизация, т.е. хибридизация към ДНК пренесена върху филтър при условия - 0.5 М NaHPO.}, 7% натриев додецил сулфат (SDS), 1тМ ЕДТА при 65 ⁰ С и ♦ · 9999 ·· ····

промиване в 0.2xSSC/0.1 % SDS при 42 ⁰ С (виж Ausubel et al. (eds.), 1989, Current Protocols in Molecular Biology. Vol.l, Green Publishing Associates, Inc., and John Willey & Sons, Inc, New York, at p. 2.10.3) и кодираща функционален еквивалент на продукта на AveC гена, както е дефинирано по-горе. В предпочитан вариант, хомоложната полинуклеотидна молекула хибридизира към комплементарната нуклеотидна последователност на плазмид pSE186 (АТСС 209604), кодираща продукта на AveC гена или към комплементарната нуклеотидна последователност на ORF на aveC, представена на ФИГУРА 1 (SEQ ID N0:2) или към съществена част от нея, при условия на високо специфична хибридизация, т.е. към ДНК пренесена върху филтър при условия - 0.5 М NaHPO4, 7% SDS, ImM ЕДТА при 65 ⁰ С и промиване в 0.1 xSSC/0.1 % SDS при 68 ⁰ С (Ausubel et al., 1989 виж погоре) и кодираща функционален еквивалент на продукта на AveC гена, както е дефиниран по-горе.

Активността на продукта на AveC гена и неговите потенциални функционални еквиваленти могат да бъдат определени, чрез HPLC анализ на продуктите на ферментацията, както е описано в примерите по-долу. Полинуклеотидни молекули, които имат последователности, които кодират функционални еквиваленти на продукта на AveC гена на S’, avermitilis, включват естествено възникнали aveC гени, присъстващи в други щамове на S. avermitilis, хомоложни aveC гени, присъстващи в други видове на Streptomyces и мутирали aveC алели, независимо дали са възникнали спонтанно или са конструирани.

Настоящето изобретение по-нататък осигурява полинуклеотидна молекула, включваща нуклеотидна последователност, която кодира полипептид, койго има аминокиселинна последователност хомоложна на аминокиселинната последователност, кодирана от ·♦ ····

последователността на плазмид pSE186 (АТСС 209604), кодираща продукта на AveC гена или аминокиселинна последователност от ФИГУРА 1 (SEQ ID N0:2) или съществена част от нея. Както се използва тук “съществена част” от аминокиселинната последователност от ФИГУРА 1 (SEQ ID N0:2) означава полипептид включавщ наймалко около 70 % от аминокиселинната последователност, показана на ФИГУРА 1 (SEQ ID N0:2) и която представлява функционален еквивалент на продукта на AveC гена, както е дефиниран по-горе.

Както се използва тук терминът “хомоложен отнесен към аминокиселинните последователности, хомоложни на аминокиселинните последователности на продукта на AveC гена на 8. avermitilis, се отнася до полинуклеотид, който в други случаи има аминокиселинна последователност от ФИГУРА 1 (SEQ ID N0:2), но в който един или повече аминокиселинни остатъка са консервативно заместени с различнен аминокиселинен остатък, където тази аминокиселинна последователност има най-малко около 70 %, за предпочитане най-малко около 80 %, и още по-предпочитана с наймалко около 90 % идентичност на аминокиселинната последователност, кодирана от плазмид pSE186 (АТСС 209604), кодиращ продукта на AveC гена, или аминокиселинна последователност от ФИГУРА 1 (SEQ ID N0:2) както е определено от алгоритъма за идентичност на всяка стандартна аминокиселинна последоватленост, като BLASTP алгоритъма (GENBANK, NCBI) и където това консервативно заместване води до функционален еквивалент на генния продукт, както е дефинирано по-горе. Консервативните аминокиселинни замествания са добре познати в областта. Правилата за създаване на такива замествания включват сред другите и тези описани от Dayhof, M.D., 1978, Nat.Biomed.Res.Found, Washington, D.C., Vol. 5, Sup. 3. По-специално, консервативни аминокиселинни замествания са тези, които ·· ····

·· ··♦·

обикновенно се получават между семейство от амино киселини, близки по своята киселинност или полярност. Генетично кодираните аминокиселини обикновенно се разделят на четири групи: (1) кисели = аспартат, глутамат; (2) основни = лизин, аргинин, хистидин; (3) неполярни = аланин, валии, левцин, изолевцин, пролин, фенилаланин, метионин, триптофан; и (4) незаредени, полярни = глицин, аспаргин, глутамин, цистеин, серин, треонин, тирозин. Фенилаланина, триптофана и тирозина също се класифицират заедно, като ароматни аминокиселини. Едно или повече замествания във всяка една от групите, напр. левцин с изолевцин или валии, или аспартат с глутамат, или треонин със серин, или който и да е друг аминокиселинен остатък със структурно аналогичен аминокиселинен остатък, напр. аминокиселинен остатък с подобна киселинност или полярност, или със комбинация от тях, обикновенно ще има незначителен ефект върху функцията на полипептида.

Настоящето изобретение по-нататък осигурява изолирана полинуклеотидна молекула, включваща нуклеотидна последователност, кодираща продукта на AveC гена. Както се използва тук “Продукта на хомолога на AveC гена” се дефинира като генен продукт, имащ наймалко около 50% аминокиселинна идентичност с продукта на AveC гена на S. avermitilis, включващ аминокиселинна последователност, кодирана от последователността на плазмид pSE186 (АТСС 209604), кодираща продукта на AveC гена или аминокиселинна последователност, показана на ФИГУРА 1 (SEQ ID N0:2), както е определено от стандартен алгоритъм на идентичност за всяка една аминокиселинна последователност, какъвто е BLASTP алгоритъмът (GENBANK, NCBI). В неограничен вариант продуктът на хомолога на AveC гена е от X. hyyroscopicus (описан в ЕР приложение 0298423; депозит FERM - BP-1901) и включва аминокиселинна последователност ·· ···· ·· ····

SEQ ID N0:4 или съществена част от нея. “Съществена част” от аминокиселинната последователност SEQ ID N0:4 означава полипептид, включващ най-малко около 70 % от аминокиселинната последователност на SEQ ID N0:4 и която да представлява функционален еквивалент на продукта, на хомолога на AveC гена. “Функционален еквивалент” на продукта на хомолога на AveC гена е дефиниран като генен продукт, който когато се експресира в 5. hygroscopicus щам FERM ВР-1901 в който хомолога на нативния aveC алел е инактивиран, води до продукцията на съществено същото съотношение и количество на милбемицини, получени от S. hygroscopicus щам FERM ВР-1901, който вместо това експресира само дивия тип нативен функционален хомолог на aveC алела на S. hygroscopicus щам FERM ВР-1901. В неограничен вариант, изолираната полинуклеотидна молекула от настоящето изобретение, която кодира продукта на хомолога на AveC гена на 5. hygroscopicus включва нуклеотидната последователност SEQ ID N0:3 или съществена част от нея. В тази връзка “съществена част” от изолираната полинуклеотидна молекула, включваща нуклеотидната последователност SEQ ID N0:3 означава изолирана полинуклеотидна молекула, включваща най-малко 70 % от нуклеотидната последователност на SEQ ID N0:3 и която кодира функционален еквивалент на продукта на хомолога на AveC гена, както е дефинирано непосредствено по-горе.

Настоящето изобретение по-нататък осигурява полинуклеотидна молекула, включваща нуклеотидна последователност, която е хомоложна на нуклеотидната последователност SEQ ID N0:3 на

5. hygroscopicus. Терминът “хомоложен”, когато се използва за да се отнесе до полинуклеотидна молекула, включваща нуклеотидна последователност, която е хомоложна на хомолога на AveC гена на 5.

hygroscopicus, кодираща продукта на последователност SEQ ID N0:3 означава полинуклеотидна молекула, която има нуклеотидна последователност (а) която кодира същия генен продукт като нукпеотидната последователност SEQ ID N0:3, но която включва една или повече тихи мутации в нуклеотидната последователност, отнесени като изроденост на генетичния код (т.е. изроден вариант); или (б) която хибридизира с комплементарна полинуклеотидна молекула, която има нуклеотидна последователност, която кодира аминокиселинна последователност SEQ 1D N0:4 при условия на високо специфична хибридизация т.е. хибридизация на ДНК, прехвърлена върху филтър при следните условия - 0.5 М NaHP04, 7% SDS, ImM ЕДТА при 65 ⁰ С и промиване в 0.2xSSC/0.1 % SDS при 42 ⁰ С (виж Ausubel et al. по-горе) и кодираща функционален еквивалент на продукта на хомолога на AveC гена, както е дефинирано по-горе. В предпочитан вариант, хомоложната полинуклеотидна молекула хибридизира с комплементарната нуклеотидна последователност на хомолога на AveC гена SEQ ID N0:3, при условия на високо специфична хибридизация, т.е. хибридизация с ДНК прехвърлена върху филтър, при следните условия - 0.5 М NaHPO4, 7% SDS, ImM ЕДТА при 65 ⁰ С и промиване в O.lxSSC/O.l % SDS при 68 ⁰ С (Ausubel et al., 1989, по-горе) и кодираща функционален еквивалент на продукта на хомолога на AveC гена, както е дефиниран / по-горе.

Настоящето изобретение по-нататък осигурява полинуклеотидна молекула, включваща нуклеотидна последователност, кодираща полипептид, който е хомоложен на продукта на хомолога на AveC гена на 5. hygroscopicus. Както се използва тук, отнасящ се до полипептиди, които са хомоложни на продукта на хомолога на AveC гена от 5. hygroscopicus, SEQ ID N0:4, термина “хомоложен” се отнася до полипептид, който в други случаи има аминокиселинна последователност SEQ ID N0:4, но в който един или повече • · • · ·

аминокиселини и остатъка са. консервативно заместени с различни аминокиселинни остатъци, както е дефинирано по-горе, където тази аминокиселинна последователност има най-малко около 70 %, за предпочитане да бъде най-малко около 80 %, по-предпочитана да бъде с най-малко около 90 % аминокиселинна идентичност с полипептида от SEQ ID N0:4, която е определена чрез стандартен алгоритъм за идентичност на аминокиселинни последователности, като BLASTP алгоритъма (GENBANK, NCBI) и където такива консервативни замествания водят до функционален еквивалент на продукта на хомолога на AveC гена, както е дефиниран по-горе.

Настоящето изобретение по-нататък осигурява

олигонуклеотиди, които хибридизират с полинуклеотидна молекула, имаща нуклеотидна последователност от ФИГУРА 1 (SEQ ID N0:1) или SEQ ID N0:3, или с полинуклеотидна молекула имаща нуклеотидна последователност, която е комплементарната на нуклеотидната последователност от ФИГУРА 1 (SEQ ID N0:1) или SEQ ID N0:3. Такива олигонуклеотиди са с дължина най-малко около 10 нуклеотида, за предпочитане с дължина от около 15 нуклеотида до около 30 нуклеотида и хибридизират с една от споменатите полинуклеотидни молекули при условия на високо специфична хибридизация, т.е. промиване в 6xSSC/0.5% натриев пирофосфат при около 37 ⁰ С за около 14-базови олигонуклеотиди, при около 48 ⁰ С за 17-базови олигонуклеотиди и при около 55 ⁰ С за 20-базови олигонуклеотиди, и при 60 ⁰ С за 23-базови олигонуклеотиди. В предпочитан вариант олигонукпеотидите са комплементарни на част от гореспоменатите полинуклеотидни молекули. Тези олигонуклеотиди се използват за разнообразни цели, включително да кодират или да действат като антисенс молекули, използвани за генна регулация или като праймери за • · · · · ·

амплифициране на aveC или хомолози на aveC кодиращите полинуклеотидни молекули.

Допълнителен хомолог на aveC гена може да бъде идентифициран в други видови или щамове Strepiomyces, чрез използване на полинуклеотидни молекули или олигонукпеотиди описани тук във връзка с известните техники. Например, олигонуклеотидна молекула, включваща част от нуклеотидната последователност на S.avermitilis от ФИГУРА 1 (SEQ ГО N0:1) или част от нуклеотидната поселдователност SEQ ГО N0:3 на S. hygroscopicus може да бъде видимо белязана и да бъде използвана за скрининг на геномна библиотека, конструирана от ДНК с произход от изследвания организъм. Специфичността на условията на хибридицазия се избира на базата на родствени връзки между съответните организми, в този случай S.avermitilis или S. hygroscopicus и изследвания организъм. Изискванията за различните условия на специфичност са добре известни на специалистите в областта, и тези условия ще варират предвидимо, в зависимост от спецификата на организмите от които библиотеката и белязаните секвенции произхождат. Предпочитани са такива олигонукпеотиди с дължина най-малко 15 нуклеотида и включващи, например тези описани в примерите по-долу. Амплификация на хомоложни гени може да се осъществи, чрез използване на тези и други олигонукпеотиди, чрез прилагане на стандартни техники, като полимеразна верижна реакция (PCR), въпреки че и други техники за амплификация са известни в областта, например лигазната верижна реакция също може да бъде използвана.

Клонове идентифицирани, че съдържат хомоложни нуклеотидни последователности на aveC могат да бъдат тествани за тяхната способност да кодират функционални продукти на хомолога на AveC гена. За тази цел, клоновете могат да се анализират чрез ·· ···· •· ааа· • ·

секвениране, за да се идентифицират подходящите рамки на четене, както и сигналите за инициация и терминация. Обратно или в допълнение, клонираната ДНК секвенция може да бъде вкарана в подходящ експресионен вектор, т.е. вектор, който носи необходимите елементи за транскрипция и транслация на въведената белтък-кодираща последователност. Всякакви разнообразни системи гостоприемник/вектор могат да бъдат използвани, както е описано подолу, включващи но не и ограничени до бактериални системи, като плазмидни, бактериофагови, или козмидни експресионни вектори. Подходящи клетки-гостоприемници, трансформирани с такива вектори включват потенциален хомолог на aveC, кодиращ последователност, която може след това да бъде анализирана за AveC-тип активност, чрез използване на методи като HPLC анализ на продуктите на ферментацията, както е описано например в Глава 7, по-долу.

Получаването и манипулация на полинукеотидните молекули, описани тук са в обхвата на специалистите в областта и могат да бъдат извършени съгласно рекомбинантните техники описани, напр. в Maniatis, et al., 1989, Molecular Cloning, A Laboratiry Manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY; Ausbel, et al., 1989, Current Protocols in Molecular Biology. Green Publishing Associates & Wiley Interscience, NY; Sambrook, et al., 1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2d ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY; Innis et al. (eds), 1995. PCR Strategies. Academic Press, Inc., San Diego; and Erlich (ed), 1992. PCR Technology. Oxford University Press, New York, всички включени тук в литературната справка. Полинуклеотидни клонове, кодиращи гениите продуктите на AveC гена или продуктите на хомолога на AveC гена могат да бъдат идентифицирани, чрез използване на методи известни в областта, включващи, но не и ограничени до методите изложени в Глава 7 по• · · · · ·

долу. Геномни ДНК библиотеки могат да бъдат скринирани за aveC и хомоложни на aveC кодиращи последователности, чрез използване на техники, като методите изложени в Beneton and Davis, 1977, Science 196:180 за бактериофагови библиотеки и Proc. Natl., Acad, Sci. USA, 72:3961-3965 за плазмидни библиотеки. Полинуклеотидни молекули, имащи нуклеотидни последователности известни с това че включват ORF на aveC, представена например в плазмид pSEl86 (АТСС 209604), или в плазмид pSEl 19 (описан в Глава 7, по-долу) могат да бъдат използвани като сонди в тези скрининг експерименти. Обратно, олигонуклеотидни сонди могат да бъдат синтезирани, които отговарят на нуклеотидните последователности и частичните или пълни производни аминокиселинни последователности на пречистения пордукт на хомолога на AveC гена.

5.2. РЕКОМБИНАНТНИ СИСТЕМИ

5.2.1. ВЕКТОРИ ЗА КЛОНИРАНЕ И ЕКСПРЕСИЯ

Настоящето изобретение по-нататък осигурява рекомбинантни вектори за клониране и експресия, които се използват за клониране или експресия на пол и нуклеотидните молекули от настоящето изобретение, включващи например ORF на aveC на

S.avermitilis или който и да е хомолог на ORF на aveC. В неограничен вариант, настоящето изобретение осигурява плазмид pSE186 (АТСС 209604), който включва пълната ORF на aveC гена на S.avermitilis.

Всички следващи описания, се отнасят до ORF на aveC на S.avermitilis или на полинуклеотидна молекула включваща ORF на aveC на S.avermitilis или част от нея, или продукт на aveC гена на • · · · · · • · · · · ·

S.avermitilis, който също се отнася до хомолози на aveC гена и до продукти на хомолога на AveC гена, без да е посочен конкретно или в контекста.

Разнообразие от различни вектори са изработени за специфично използване в Slreplomyces, включващи фагови вектори, плазмиди мултиплициращи се в много копия, плазмиди мултиплициращи се в малко копия и E.coli-Streptomyces “shuttle”вектори сред другите, и всички те могат да бъдат използвани в практиката на настоящето изобретение. Голям брой гени за резистентност към лекарствени препарати също са клонирани от Streptomyces и някои от тези гени са въведени във вектори като маркери за селекция. Примери за понастоящем използвани вектори за използване в Slreplomyces са представени между другите в Hutchinson, 1980, Applied В iochem. Biotech. 16:169-190.

Рекомбинантни вектори от настоящето изобретение, поспециално експресионни вектори, за предпочитане са конструирани така, че кодиращата последователност на полинуклеотидната молекула от изобретението е ориентирана в оперативна асоциация с един или повече регулаторни елементи на транскрипция или транслация на кодиращата последователност за продукция на полипептид. Както е използван тук, терминът “регулаторен елемент” включва, но не се ограничава до нуклеотидни последователности, които кодират индуцируеми и не-индуцируеми промотори, енхансери, оператори и други елементи известни в областта, които служат за да осъществят и/или регулират експресията на полинуклеотидните кодиращи последователности. Също както се използва тук, кодиращата последователност е в “оперативна асоциация” с един или повече регулаторни елементи, където регулаторните елементи ефективно • · · · · · ·· ···· • ·

регулират и позволяват транскрипцията на кодиращата последователност или транслацията на нейната мРНК или и на двете.

Типични плазмидни вектори, които могат да бъдат конструирани така че да съдържат полинуклеотидна молекула от настоящето изобретение включват сред много други pCR-Blunt, pCR2.1 (Invitrogen), pGEM3Zf (Promega) и “shuttle’’-вектора pWHM3 (Vara et al., 1989, J. Bact. 171:5872-5881).

Методите за конструиране на рекомбинантни вектори, съдържащи специфична кодираща последователност в оперативна асоциация с подходящи регулаторни елементи са добре известни в областта и могат да бъдат използвани в практиката на настоящето изобретение. Тези методи включват in vitro рекомбинантни техники, техники за синтез и in vivo генетични рекомбинации. Виж например техниките описани в Maniatis et al., 1989, по-горе; Ausbel et al., 1989, погоре, Sambrook et al., 1989, по-горе, и Erlich, 1992, no-rope.

Регулаторните елементи на тези вектори могат да варират по тяхната сила и специфичност. В зависимост от това какво използва системата клетка-гостоприемник/вектор, всякакъв брой подходящи елементи на транскрипцията и транслацията могат да бъдат използвани. Неограничаващи примери за транскрипционни регулаторни райони или промотори на бактерии включват β-gal промотора, Т7 промотора, ТАС промотора, десния и левия λ промотор, trp и lac промоторите, trp-lac рекомбинантните промотори и по-специално промоторите на Streptomyces - ennE , melC и tip А, и т.н. В специфичен вариант, описан в Глава 11 по-долу, е създаден експресионен вектор, който съдържа ORF на aveC, кпониран в съседство със силно конститутивния еппЕ промотор от Saccharopolyspora erythraea. Векторът е трансформиран в S.avermitilis и последвалия HPLC анализ на продуктите на ферментацията показва увеличен титър на получените авермектини, в • · · · · ·

сравнение с продукцията от същия щам, но който вместо това експресира дивия тип aveC алел.

Експресионни вектори за рекомбинантен белтък могат да бъдат използвани за експресията на AveC генен продукт рекомбинантен белтък на AveC гена. Пречистеният рекомбинантен белтък може да бъде използван за да се увеличи количеството на продукта на AveC гена в антисерум, който се използва за изучаване на биохимичните характеристики на продукта на AveC гена, за конструиране на рекомбинантен белтък на AveC с различни биохимични активности или да се подпомогне идентифицирането или пречистването на експресирания продукт на AveC гена. Възможен експресионен вектор за рекомбинантен белтък включва, но не е ограничен до вектори в които са въведени секвенции, които кодират βгалактозидазния и trpE рекомбинантни белтъци, малтоза-свързаните рекомбинантни белтъци, глутатион-Б-трансферазните рекомбинантни белтъци и полихистидиновите рекомбинантни белтъци (в районите на носителя). Във друг вариант, генен продукт на AveC или част от него, може да бъде рекомбиниран към хомолог на генния продукт на AveC, или към част от него, произхождаща от други видове или щамове на Streptomyces, като например 8. hygroscopicus или S.griseochromogenes. В специфичен вариант описан в Глава 12 по-долу и показан на ФИГУРА 7, е конструиран химерен плазмид, който съдържа район от 564 нд на ORF на хомолога на aveC гена от S.hygroscopicus на мястото на хомоложния район от 564 нд на ORF на aveC гена на 8. avermitilis. Такива хибридни вектори могат да бъдат трансформирани в клетки на 8. avermitilis и тествани за да се установи техния ефект, например върху съотношението клас 2:1 на получените авермектини.

AveC рекомбинантните белтъци могат да бъдат конструирани така, че да включват район, който се използва при пречистването им.

• · · · · · ·· ····

Например, AveC-малтоза-свързаните рекомбинантни белтъци могат да бъдат пречистени като се използва амилозна смола, AveC-rnyTaTHOH-Sтрансферазните рекомбинантни белтъци могат да бъдат пречистени, като се използват глутатион-агарозни носители; и AveC-полихистидин рекомбинантните белтъци могат да бъдат пречистени, като се използва двувалентна никелова смола. От друга страна, антитела срещу белтъканосител или пептида могат да бъдат използвани за пречистване на рекомбинантните белтъци, чрез афинитетна хроматография. Например, нуклеотидна последователност, кодираща прицелния епитоп на моноклонално антитяло, може да бъде конструиран в експресионен вектор в оперативна асоциация с регулаторните елементи и да бъде разположен така че експресирания епитоп да се рекомбинира с полипептида на AveC. Например нуклеотидна последователност, кодираща tag епитопа на FLAG^IM (International Biotechnologies Inc.), който е хидрофилен пептиден маркер, може да бъде вкарана чрез стандартни техники в експресионен вектор в съответната точка, например към карбоксилния край на AveC полипептида. Експресирания ткл рекомбинантен продукт полипетид AveC-FLAG епитоп, може след това да бъде доказан и афинитетно пречистен, чрез използване на търговско достъпни анти-FLAG™ антитела.

Експресионен вектор, кодиращ AveC рекомбинантен белтък може също да бъде конструиран да съдържа полилинкерни последователности, които кодират специфични места за протеазно рязане, така че експресирания AveC полипептид може да се освободи от областта на носителя или рекомбинантния партньор, чрез третиране със специфична протеаза. Например, вектора носещ рекомбинантния белтък може да включва измежду другите ДНК последователност, кодираща протеазните места за тромбин или фактор Ха .

• · · · · · • · ····

Сигнална последователност, разположена след и в рамката на четене, заедно с ORF на aveC може да бъде конструирана в експресионния вектор, чрез познати методи, за да насочи трафика и секрецията на експресирания генен продукт. Неограничаващи примери за сигнални последователности включват измежду другите тези за афактор, за имуноглобулини, за протеини, разположени по външната повърхност на мембраната, за пелициниазата и за Т-клетъчни рецептори.

За да се подпомогне селекцията на клетки-гостоприемници, трансформирани или трансфектирани с вектори за клониране или експресия от настоящето изобретение, векторът може да бъде конструиран така, че по-нататък да включва кодираща последователност за продукт на “гени - маркери” или друг селективен маркер. Такава кодираща последователност е за предпочитане и е в оперативна асоциация с кодиращите последователности за регулаторени елементи, както е описано по-горе. “Гени - маркери”, които са използвани в изобретението са добре известни в областта и включват измежду другите тези, кодиращи зеления флуоресцентен белтък (GFP), гена за луциферазата, ху!Е и гена за тирозиназата. Нуклеотидни последователности, кодиращи маркери за селекция са добре известни в областта и включват тези, кодиращи генни продукти, отговарящи за резистентност към антибиотици или анти-метаболити, или тези отговорни за ауксотрофните изисквания. Примери за такива последователности, включват сред другите тези, кодиращи резистентност към еритромицин, тиострептон или канамицин.

5.2.2. ТРАНФОРМАЦИЯ HA КЛЕТКИ-ГОСТОПРИЕМНИЦИ

Настоящето изобретение по-нататък осигурява трансформирани клетки-гостоприемници, включващи полинуклеотидна молекула или рекомбинантен вектор от изобретението и нови щамове или клетъчни линии, произхождащи от тях. Клетките-гостоприемници, които се използват в практиката на изобретението за предпочитане са клетки на Streptomyces, въпреки че други прокариотни или еукариотни клетки могат също да бъдат използвани. За такива трансформирани клетки-гостоприемници, е типично че включват сред другите, но не се ограничават до микроорганизми, такива като бактерии трансформирани с рекомбинантна бактериофагова ДНК, плазмидна ДНК или козмидни ДНК-ови вектори, или дрожди трансформирани с рекомбинантни вектори.

Полинуклеотидните молекули от настоящето изобретение са предназначени да функционират в клетки на Streptomyces, но могат също така да бъдат трансформирани в други бактериални или еукариотни клетки, например с цел клониране или експресия. Като типичен може да се изпозва E.coli щам, като например щама DH5a, доставен от American Type Culture Collection (ATCC), Rockville, MD, USA (Номер за достъп № 31343) и от търговски източници (Strategene). Предпочитани еукариотни клетки-гостоприемници включват дрождеви клетки, въппреки че клетки на бозайници или клетки на насекоми могат също да бъдат използвани ефективно.

Рекомбинантният експресионен вектор от изобретението за предпочитане е трансформиран или трансфектиран в един или повече типове клетки-гостоприемници, представени от значително хомогенна култура от клетки. Експресионният вектор обикновенно е вкаран в клетки-гостоприемници, съгласно познати техники, като например чрез ·· ···· ·· ···· • · • · · · • · · · · · ♦ • · · · · · • * · * 36 · · · * · · ·* «· ··« «· ·· · · ···* протопластна трансформация, преципитация с калциев фосфат, третиране с калциев хлорид, микроинжектиране, електропорация, трансфекция чрез заразяване с рекомбинантен вирус, трансфекция медиирана от липозоми, трансфекция с DEAE-декстран, трансдукция, конюгация или чрез бомбандиране с микроскопични метални частици. Селекция на транформантите може да бъде направена чрез стандартни процедури, както селекцията на клетки, експресиращи селективен маркер, например за резистентност към антибиотик, свързан с рекомбинантния вектор, както е описано по-горе.

Веднъж вкаран експресионният вектор в клетката гостоприемник, интеграцията в хромозомата на клетката-гостоприемник или епизомално подържаната aveC кодираща последователност може да бъде потвърдена чрез стандартни техники, например чрез анализ със Southern блот хибридизация, анализ с рестриктазни ензими, PCR анализ, включително и обратно транскриптазен PCR (rt-PCR) или чрез имунологичен анализ за детекция на очакваните генни продукти. Клетките гостоприемници носещи и/или експресиращи рекомбинантна aveC кодираща последователност, която може да бъде идентифицирана чрез най-малко четири общоприети подхода, които са добре известни в областта, включително: (i) хибридизации на ДНК-ДНК, ДНК-РНК или РНК-антисенс-РНК; (й) функционална детекция на присъствието на “маркерните” генни; (iii) оценка на нивото на транскрипция, измерено чрез експресията на aveC-специфични мРНК транскрипти в клеткитегостоприемници; и (iv) детекция на присъствието на зрял полипептиден продукт, измерен например чрез имуноанализ или чрез наличието на AveC биологична активност (например продукцията на специфичните съотношения и количества на авермектини са показатели за активността на AveC, например в клетки-гостоприемници на S.avermitilis).

• ·

5.2.3. ЕКСПРЕСИЯ И ХАРАКТЕРИЗИРАНЕ

НА РЕКОМБИНАНТЕН AveC ГЕНЕН ПРОДУКТ.

Веднъж когато aveC кодиращата последователност е стабилно въведена в подходящи клетки-гостоприемници, транформираната клетка-гостоприемник се размножава и образува кологии, и получените клетки могат да бъдат оставени да растат при условия, водещи до максимална продукция на AveC генния продукт. Такива условия обикновенно включват отглеждане на клетките до достигане на висока плътност. Там където експресионният вектор включва индуцируем промотор, са ангажирани подходящи условия, необходими за индуцирането на експресия, като например температурна промяна, използване на среда, бедна на хранителните вещества, добавяне на индуциращи агенти, индуциращи получаването на “несъществени” продукти (например аналози на въглехидратите, като изопропил-Р-О-тиогалактопиранозид (IPTG)), акумулиране на крайни и вторични метаболити или други подобни.

Там където експресирания AveC генен продукт остава в клетките гостоприемници, клетките се събират и лизират, и продукта се изолира, пречиства се от лизата в условия за екстракция, известни в областта, които намаляват до минимум белтъчната деградация, като например при 4 ⁰ С или в присъствието на протеазни инхибитори, или и двете. Там където експресирания AveC генен продукт се секретира от клетките-гостоприемници, средата бедна на хранителните вещества може просто да бъде събрана и продукта да бъде изолиран от нея.

Експресираният AveC генен продукт може да бъде изолиран и значително пречистен от клетъчни лизати или от хранителната среда, в зависимост от подхода, чрез използване на стандартни методи, включващи но не и ограничени до каквато и да е комбинация от • · · · · · ϋ · · · · · • ·

следните методи: преципитация с амониев сулфат, разделяне в зависимост от размера, йонообменна хроматография, HPLC, центрофугиране в плътностен градиент и афинитетна хроматография. Където експресирания AveC генен продукт показва биологична активност, нарастващата чистотата на препарата може да се следи на всяка стъпка от процедурата на пречистване, чрез използване на подходящ анализ. Независимо дали AveC генният продукт показва биологична активност, той може да бъде детектиран например на базата на размера или реактивността с антитяло, специфично обаче за AveC или в зависимост от присъствието на рекомбинантен tag. Както се използва тук, AveC генният продукт е “значително пречистен”, където продукта представлява повече от около 20 тегловни % от протеина в един отделен препарат.

Настоящето изобретение по този начин осигурява рекомбинантно експресиран, изолиран или значително пречистен AveC генен продукт на 5. avermililis, включващ аминокиселинна последователност, кодирана ог последователността на плазмид pSE186 (АТСС 209604), кодираща продукта на AveC гена или аминокиселинната последователност от ФИГУРА 1 (SEQ ID N0:2) или съществена част от нея и нейните хомолози.

Настоящето изобретение по-нататък осигурява рекомбинантно експресиран изолиран или значително пречистен продукт на хомолога на Ave С гена, включващ аминокиселинна последователност със SEQ ID N0:4 или съществена част от нея и нейни хомолози.

Настоящето изобретение по-нататък осигурява метод за продукция на AveC генния продукт, включващ култивиране на клеткигостоприемници, трансформирани с рекомбинантен експресионен вектор, този вектор включва полинуклеотидна молекула, която има • · 99··

нуклеотидна последователност, кодираща AveC генния продукт, която полинуклеотидна молекула е в оперативна асоциация с един или повече регулаторни елементи, които контролират експресията на полинуклеотидната молекула в клетките-гостоприемници при условия, водещи до продукцията на рекомбинантен AveC генен продукт и до повторното получаване на AveC генния продукт от клетъчната култура.

Рекомбинантно експресирания AveC генен продукт на 5¹. avermitilis се използва за различни цели, включително и за скрининг на съединения, които функционират след продукцията на AveC генния продукт и следователно модулират биосинтезата на авермектини и за производство на антитела, насочени срещу AveC генния продукт.

Веднъж получен AveC генният продукт със значителна чистота, той може да бъде характеризиран по стандартни методи, включващи SDS-PAGE, хроматография на базата на размера, анализ чрез аминокиселинно секвениране, анализ на биологична активност при продукцията на подходящи продукти от авермектиновия биосинтетичен път и т.н. Например, аминокиселинната последователност на AveC генния продукт може да бъде определена, чрез използване на стандартни техинки за секвениране на пептиди. AveC генният продукт може да бъде по-нататък характеризиран, чрез анализ за хидрофилност (виж например Норр и Woods, 1981, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78:3824) или аналогични софтуеарни алгоритми, за определяне на хидрофобните и хидрофилните райони на AveC генния продукт. Структурен анализ може да бъде проведен, за идентифициране на райнои от AveC генния продукт които притежават специфични вторични структури. Биофизични методи като рентгенова кристалография (Engstrom, 1974, Biochem. Exp. Biol. 11:7-13), компютърно моделиране (Feltterick и Zoller (eds), 1986, в: Current Communications in Molecular Biology. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY) и ядрено магнитен резонанс • · ····

• · • ·

(NMR) могат да бъдат използван за картиране и изучаване на местата на взаимодействие между AveC генния продукт и неговия субстрат. Информацията получена от тези изследвания може да бъде използвана за селекция на нови места за мутации в ORF на aveC с цел да се подпомогне създаването на нови щамове на 5. avermitilis, с по-желана продукция на авермектини.

5.3. КОНСТРУИРАНЕ И ИЗПОЛЗВАНЕ НА AveC МУТАНТИ

Настоящето изобретение осигурява полинуклеотидна молекула, вкючваща нуклеотидна последователност, която и в други случаи е същата като тази на aveC алела на 5. avermitilis или изроден неин вариант, или последователността на плазмида pSE186 (АТСС 209604), кодираща продукт на AveC гена или изроден неин вариант, или нуклеотидната последователност на ORF на aveC на S.avermitilis, която е представена на ФИГУРА 1 (SEQ ID N0:1) или изроден неин вариант, но който по-нататък включва една или повече мутации, така че клетки от S.avermitilis щам АТСС 53692, в които дивия тип AveC алел е инактивиран, които експресират полинуклеотидната молекула, включваща мутирала нуклеотидна последователност или изроден неин вариант, водят до получаването на различно съотношение или количество на авермектини, в сравнение с тези получени от клетки на S.avermitilis щам АТСС 53692, които вместо това експресират само дивия тип AveC алел.

Съгласно настоящето изобретение, такива полинуклеотидни молекули могат да бъдат използвани за създаването на нови щамове S.avermitilis, които показват забележима промяна в продукцията на авермектини, в сравнение със същия щам, който вместо това експресира само дивият тип aveC алел. В предпочитан вариант, такива • ft ft ft ft ft полинуклеотидни молекули се използват за създаването на нови щамове на S.avermitilis, които водят до получаването на редуцирано съотношение клас 2:1 на авермектини, в сравнение със същия щам, който вместо това експресира само дивият тип aveC алел. По-нататък в предпочитан вариант, такива полинуклеотидни молекули се използват за съзвдаването на нови щамове S.avermitilis, които водят до получаването на повишени нива на авермектините, в сравнение със същия щам, който вместо това експресира само единичния диви тип aveC алел. По-нататък в предпочитан вариант, такива полинуклеотидни молекули се използват за създаването на нови щамове S.avermitilis, в които aveC алелът е инактивиран.

Мутации в aveC алела или в кодиращата последователност

включват всички мутации, които водят до въвеждането на една или повече аминокиселинни делеции, инсерции, или субституции (замествания) в продукта на AveC гена, или които водят до скъсяване на продукта на AveC гена, или всякакви техни комбинации и които водят до желания резултат. Предвидено е за такива мутирали последователности на AveC алела да включват всяка изродена тяхна форма. Например, настоящето изобретение осигурява полинуклеотидни молекули, включващи нуклеотидните последователности на AveC алела или изроден негов вариант, или последователността на плазмид pSEl 86 (АТСС 209604), кодираща AveC генния продукт или изроден вариант, или нуклеотидната последователност на ORF на AveC на S.avermitilis, представена на ФИГУРА 1 (SEQ ID N0:1) или изроден неин вариант, но която по-нататък включва една или повече мутации, които кодират заместването на един аминокиселинен остатък с различен аминокиселинен остатък в избрана позиция от продукта на AveC гена. В някои неограничени варианти, които са дадени по-долу в примерите, такива субституции могат да бъдат въведени във всяка една от ·· ···· ·· ···· ·· ·· • · · ·· · · · · · ····· · · · ·· ·

• · · · · · • ·· ·* · · · · аминокиселинните позиициите от продукта на AveC гена, които съответстват на аминокиселинните позиции 38, 48, 55, 89, 99, 111, 136, 138, 139, 154, 179, 228, 230, 238, 266, 275, 289 или 298 от SEQ ID N0:2 или някои техни комбинации.

Мутации в AveC кодиращата последователност се въвеждат, чрез всеки от разнообразните известни методи, включващи “errorprone” PCR или чрез сериен мутагенезис. Например, олигонуклеотиднасоченият мутагенезис може да бъде направен, за да промени последователността на aveC алела или на ORF по точно определен начин, като например чрез въвеждане на едно или повече рестриктазни места, или на стоп кодон в специфични райони на aveC алела или на ORF. Методи като тези описани в U.S. Патент 5.605.793. U.S. Патент 5,830,721 и U.S. Патент 5,837,458, които включват случайно фрагментиране, повторение на циклите на мутагенезиз и нуклеотидно изрязване, може също да бъдат използвани за да се създадат големи библиотеки от полинуклеотиди, които имат нуклеотидни последователности, кодиращи aveC мутации.

Насочените мутации, могат да бъдат използвани поспециално там където служат за да променят един или повече консервативни аминокиселинни остатъци на продукта на AveC гена. Например, сравнението на производните аминокиселинни последователности на AveC гениите продукти и на продуктите на хомолозите на AveC гена на S.avermitilis (SEQ ID N0:2), S. griseochromogenes (SEQ ID N0:5) и S.hygroscopicus (SEQ ID N0:4), представени на ФИГУРА 6, която показва местата с висока консервативност на аминокиселинните остатъци между тези три вида. Насочен мутагенезис, който води до промяна в един или повече от тези консервативни аминокиселинни остатъци, може да бъде специфично ·· ···· • · ···· • ·

ефективен за създаването на нови мутантни щамове, които показват желани промени в авермектиновата продукция.

Случаен мутагенезис може също да бъде използван и може да бъде направен чрез излагане на клетки на S.avermitilis на ултравиолетова радиация или рентгеново лъчение или на действието на химични мутагени, като Н-метил-№’-нитрозогуанидин, етил метан сулфонат, азотна киселина или азотен иперит. Виж например Ausubel, 1989, по-горе, за преглед на техниките на мутагенезис.

Един път създадени мутиралите полинуклеотидни молекули, те се скринират за да се потвърди дали могат да модулират биосинтезата на авермектините в S.avermitilis. В предпочитан вариант, една полинуклеотидна молекула, която има мутирала нуклеотидна последователност се въвежда в клетки на S.avermitilis щам, в които aveC гена е инактивиран за да се провери, чрез допълване aveC негативния (aveC~) фон. В не ограничаващ метод, мутиралата полинуклеотидна молекула е въведена за сплайсинг в експресионен плазмид, в оперативна връзка с еднин или повече регулаторни елементи, който плазмид за предпочитане също включва един или повече гени за резистентност, които да разрешат селекцията на трансформираните клетки Този вектор след това е трансформиран в aveC клеткигостоприемници, чрез използване на известни техники, и трансформираните клетки се избират и култивират в подходящи среди за ферментация, при условия, които позволяват да се индуцира продукцията на авермектини. Продуктите на ферментацията след това се анализират с HPLC за да се определи способността на мутиралите полинуклеотидни молекули да допълват клетките-гостоприемници. Някои вектори, носещи мутирали полинуклеотидни молекули, способни да редуцират съотношението В2:В1 на авермектините, включително

·· ···· • · • ·

pSE188, pSE199, pSE231, pSE239, pSE290 чрез pSE297 са дадени в примерите описани в Глава 8.3 по-долу.

Настоящето изобретение осигурява методи за идентифициране на мутации в ORF на aveC на S.avermitilis, способни да променят съотношението и/или количеството на получените авермектини. В предпочитан вариант, настоящето изобретение осигурява метод за идентифициране на мутации в ORF на aveC, водещи до промяна в съотношението клас 2:1 на получените авермектини, включващ: (а) определяне на съотношението клас 2:1 на получените авермектини от клетки на S.avermitilis щам, в които техния нативен aveC алел е инактивиран и в които полинуклеотидната молекула, включваща нуклеотидна последователност, кодираща мутантен AveC генен продукт е въведена и експресирана; (б) определяне на съотношението клас 2:1 на получените авермектини от клетки на S.avermitilis щам, от стъпка (а), но който вместо това експресира само дивия тип aveC алел или aveC алел, който има нуклеотидна последователност на ORF от ФИГУРА 1 (SEQ ID N0:1) или нейна хомоложна нуклеотидна последователност; и (в) сравнение на съотношението клас 2:1 на авермектините, получени от клетките на S.avermitilis от стъпка (а) със съотношението клас 2:1 на авермектините, получени от клетките на S.avermitilis от стъпка (б); като когато съотношението на клас 2:1 авермектините, получени от клетките на S.avermitilis от стъпка (а) е различно от съотношението клас 2:1 на авермектините, получени от клетките на S.avermitilis от стъпка (б), тогава е идентифицирана мутацията в ORF на aveC способна да промени съотношението клас 2:1 на авермектините. В предпочитан вариант, съотношението на авермектините клас 2:1 се редуцира от мутацията.

По-нататък в предпочитан вариант, настоящето изобретение осигурява метод за идентифициране на мутация в ORF на aveC или в генетични конструкти, включващи ORF на aveC, способни да променят количеството на получените авермектини, включващ (а) определяне на количеството на авермектините, получени от клетки на S.avermitilis, в които техния нативен aveC алел е инактивиран и в които полинуклеотидна молекула, включваща нуклеотидна последователност, кодираща мутантен продукт на AveC гена или включваща генетичен конструкт, включващ нуклеотидна последователност, кодираща мутантен AveC генен продукт е въведена и експресирана; (б) определяне на количеството на авермектините, получени от клетките на същия щам S.avermitilis от стъпка (а) но който вместо това експресира само дивия тип aveC алел или негова хомоложна нуклеотидна последователност; и (в) сравняване на количеството на авермектините, получени от щама на S.avermitilis от стъпка (а) и количеството на авермектините, получени от щама от стъпка (б); като ако количеството на авермектините получени от щама на S.avermitilis от стъпка (а) е различно от количеството на авермектините, получени от щама от стъпка (б), тогава е идентифицирана мутация в ORF на aveC или в генетичния конструкт, способна да променя количеството на авермектините. В предпочитан вариант, количеството на получените авермектини се повишава от мутацията.

Всеки от гореспоменатите методи за идентифициране на мутации се изпълнява, чрез използване на културална среда за ферментация, за предпочитане допълнена с циклохексан карбоксилна киселина, въпреки че други подходящи мастно киселинни прекурсори, като прекурсорите на всяка от мастните киселини посочени в ТАБЛИЦА 1, могат също да бъдат използвани.

·· ····

9···

Веднъж като е идентифицирана мутиралата пол и нуклеотидна молекула, която модулира продукцията на авермектини в желаната посока, може да бъде определено мястото на мутацията в нуклеотидната последователност. Например, полинуклеотидна молекула, която има нуклеотидна последователност, кодираща мутантен AveC генен продукт, може да бъда изолирана чрез PCR и анализирана чрез ДНК секвениране, чрез изплозване на известни методи. Чрез сравняване на ДНК последователността на мутиралия aveC алел и тази на дивия тип aveC алел, мутацията (мутациите) отговорни за промяна в продукцията на авермектините може да бъде определена. В специфични, но неорграничаващи варианти на настоящето изобретение, AveC генният продукт на S.avermitilis, включващ едничино аминокиселинно заместване във всеки един от остатъците 55(S55F), 138(S138T), 139(А139Т) или 230(G230D), или двойно заместване в позициите 138(S138T) и 139(А139Т или A139F), водещо до промни във функцията на AveC генния продукт, като промяна в съотношението на получените авермектини клас 2:1 (виж Глава 8, по-долу), където посочените аминокиселинни позиции, отговарят на тези, представени на ФИГУРА 1 (SEQ ID N0:2). В допълнение, за следващите седем комбинации от мутации (1) D48E/A89T; (2) S138Т/А139T/G179S; (3) Q38P/L136P/E238D; (4) F99S/S138Т/А139T/G179S; (5) А139Т/М228Т; (6) GH1V/P289L; (7) А139Т/К154Е/ Q298H е показано че ефективно редуцират съотношението на авермектините клас 2:1. Както се използва тук, споменатите означения, като А139Т, показват оригиналния аминокиселинен остатък с еднобуквено означение, който в този пример е аланин (А), в посочената позиция, която в този пример е 139 от полипептида (SEQ ID N0.2), следвана от аминокиселинния остатък, който замества оригиналния аминокиселинен остатък, който в този пример е треонин (Т). Съответно,

• · · ф ф ф фф ··♦·

полинуклеотидни молекули, които имат нуклеотидни последователности, кодиращи мутантня AveC генен продукт на

S.avermitilis, включват също аминокиселинни замествания или делеции в една или повече от аминокиселинните позиции 38, 48, 55, 89, 99, 111,

136, 138, 139, 154, 179, 228, 230, 238, 266, 275, 289 или 298 (виж ФИГУРА 1) или всички техни комбинации, които са в обхвата на настоящето изобретение.

В предпочитан вариант, такива мутации кодират аминокиселинни замествания в една или повече от групите включващи:

(а) аминокиселинен остатък Q в позиция 38, заместен от Р или от аминокиселина, която е консервативен заместител на Р;

(б) аминокиселинен остатък D в позиция 48, заместен от Е или от аминокиселина, която е консервативен заместител на Е;

(в) аминокиселинен остатък А в позиция 89, заместен от Т или от аминокиселина, която е консервативен заместител на Т;

(г) аминокиселинен остатък F в позиция 99, заместен от S или от аминокиселина, която е консервативен заместител на S;

(д) аминокиселинен остатък G в позиция 111, заместен от V или от аминокиселина, която е консервативен заместител на V;

(е) аминокиселинен остатък L в позиция 136, заместен от Р или оТ аминокиселина, която е консервативен заместител на Р;

(ж) аминокиселинен остатък S в позиция 138 , заместен от Т или от аминокиселина, която е консервативен заместител на Т;

(з) аминокиселинен остатък А в позиция 139, заместен от Т или F или от аминокиселина, която е консервативен заместител на Т или F;

(и) аминокиселинен остатък К в позиция 154, заместен от Е или от аминокиселина, която е консервативен заместител на Е;

(к) аминокиселинен остатък G в позиция 179, заместен от S или от аминокиселина, която е консервативен заместител на S;

• ·

(л) аминокиселинен остатък М в позиция 228, заместен от Т или от аминокиселина, която е консервативен заместител на Т;

(м) аминокиселинен остатък Е в позиция 238, заместен от D или от аминокиселина, която е консервативен заместител на D;

(н) аминокиселинен остатък Р в позиция 289, заместен от L или от аминокиселина, която е консервативен заместител на L;

(о) аминокиселинен остатък Q в позиция 298, заместен от Н или от аминокиселина, която е консервативен заместител на Н;

където консервативните аминокиселинни замествания са описани в Глава 5.1.

По-нататък, в предпочитан вариант, такива мутации, кодират комбинации от аминокиселинни замествания, където, комбинациите от заместените аминокиселинни остатъци са избрани от групата, състояща се от:

(а) аминокиселинни остатъци S138 и А139;

(б) аминокиселинни остатъци D48 и А89;

(в) аминокиселинни остатъци S138, А139 и G179;

(г) аминокиселинни остатъци Q38, L136 и Е238;

(д) аминокиселинни остатъци F99, S138, А139 и G179;

(е) аминокиселинни остатъци А139 и М228;

(ж) аминокиселинни остатъци G111 и Р289; и (з) аминокиселинни остатъци А139, К154 и Q298.

По-нататък в предпочитан вариант, специфични комбинации от мутации в aveC алела, които се използват за ефективно намаляване на съотношението на авермектините клас 2:1, в съответствие с настоящето изобретение са избрани от една или повече, от групата на:

(a) S138T/A139T;

• · · · · • · · • · · • · · · · (б) S138T/A139F;

(в) D48E/A89T;

(г) S138T/A139T/G179S;

(д) Q38P/L136P/E238D;

(е) F99S/S138T/A139T/G179S;

(ж) А139Т/М228Т;

(з) Gil 1V/P289L; и (и) A139T/K154E/Q298H.

Настоящето изобретение по-нататък осигурява конструкти за създаване на нови щамове S.avermililis, клетките на които съдържат мутирал aveC алел, който води до променена продукция на авермектини. Например, настоящето изобретение осигурява, рекомбинантни вектори, които могат да бъдат използвани за насочване на която и да е от полинкулеогидиите молекули, включващи мутирали нукпеотидни последователности на настоящето изобретение, към мястото на aveC гена от хромозомата на S.avermililis за да се вкара на мястото на ORF на aveC или на част от него, чрез хомоложна рекомбинация. Съгласно настоящето изобретение, обаче, полинуклеотидна молекула, включваща мутирала нуклеотидна последователност от настоящето изобретение, заедно с тази осигурена тук може да функционира, като модулира биосинтезата на авермектини, когато е вкарана в хромозомата на S.avermililis, на място различно от aveC гена или на друго място, или когато се поддържа епизомално в клетките на S.avermililis. Така, настоящето изобретение, също осигурява вектори, включващи полинуклеотидна молекула, включваща мутирала нуклеотидна последователност от настоящето изобретение, които вектори могат да бъдат използвани за да вкарат полинуклеотидната ·· ···· • · ··»·

молекула в хромозомата на S.avermitilis на мястото на aveC гена или на друго място, или да бъдат поддъжани епизомално.

В предпочитан вариант, настоящето изобретение осигурява вектори за заместване на гени, които могат да бъдат използвани да въведат мутирал aveC алел или изроден негов вариант в клетки на S.avermitilis щам и по този начин да се създаде нов S.avermitilis щам, клетките на който продуцират авермектини с променено съотношение клас 2:1, в сравнение с клетките на същия щам, които вместо това експресират само дивия тип aveC алел. В предпочитан вариант, съотношението клас 2:1 на получените от тези клетки авермектини, е редуцирано. Такива вектори, за заместване на гени могат да бъдат конструирани, чрез използване на мутирали полинуклеотидни молекули, присъстващи в експресионни вектори, осигурени тук, като например pSEl 88, pSE199 и pSE231, които експресионни вектори са описани в примерите в Глава 8 по-долу.

По-нататък в предпочитан вариант, настоящето изобретение осигурява вектори, които могат да бъдат използвани за вкарване на мутирал aveC алел или изроден негов вариант, в клетки на S.avermitilis щам, за да се създадат нови щамове, в клетките на които получените авермектини са с променено количество, в сравнение с клетки от същия щам, които вместо това експресират само дивия тип aveC алел. В предпочитан вариант, количеството на авермектините, получени от клетките се повишава. В специфичен, но не ограничен вариант, такъв вектор по-нататък включва силен промотор, който е известен в областта като например, силния конститутивен епп промотор от Saccharopolyspora erythraea, който е разположен преди aveC алела и е в оперативна връзка с него. Такъв вектор може да бъдае плазмида pSE189, описан в Пример 11 по-долу или може да бъде конструиран, чрез използване на мутирал aveC алел на плазмид pSEl 89.

·· ·♦»·

По-нататък в предпочитан вариант настоящето изобретение осигурява вектори за заместване на гени, които се използват да инактивират aveC гена на дивия тип S.avermitilis щам. В не ограничаващ вариант, такива вектори за заместване на гени могат да бъдат конструирани, чрез използване на мутирали полинуклеотидни молекули, присъстващи в плазмид pSEl 80 (АТСС209605), който е даден в примерите в Глава 8.1 по-долу (ФИГУРА 3). Настоящето изобретение, по-нататък осигурява вектори за заместване на гени, които включват полинкулеотидна молекула, включваща или състояща се от нуклеотидни последователности, за които чрез in situ хибридизация е показано, че естествено се припокриват с нуклеотидните последователности, на aveC гена, включващи тези нуклеотидни последователности, показани на ФИГУРА 1 (SEQ ID N0:1), които вектори могат да бъдат използави за да се елиминира ORF на aveC на S.avermitilis.

Настоящето изобретение по-нататък осигурява методи за създаване на нови щамове S.avermitilis, включващи клетки, които експресират мутирал aveC апел и които водят до получаването на авермектини с променено съотношение и/или в променено количество, в сравнение с клетки на същия щам S.avermitilis, които вместо това експресират само дивия тип aveC алел. В предпочитан вариант, настоящето изобретение осигурява метод за създаването на нови щамове S.avermitilis включващи клетки, които експресират мутирал aveC алел и които водят до получаването на авермектини в променено съотношение клас 2:1, в сравнение с клетки на същия щам S.avermitilis, които вместо това експресират само дивия тип aveC алел, включващ трансформация на клетки на S.avermitilis щам с вектор, който носи мутирал aveC алел, който кодира генни продукти, които променят съотношението клас 2:1 на авермектините, получени от клетките на щам

S.avermitilis, експресиращи техен мутирал aveC алел, в сравнение с клетки от щам S.avermitilis, които вместо това експресират само дивия тип aveC алел, и селекция на трансформираните клетки, които водят до получаването на авермектини с променено съотношение клас 2:1, в сравнение със съотношението на авермектините клас 2:1, получени от клетки на същия щам, но които вместо това експресират само дивия тип aveC алел. В още по-предпочитан вариант, настоящето изобретение осигурява метод за създаване на нов щам S.avermitilis, включващ трансформация на клетки от щам S.avermitilis с вектор, способен да въведе мутация в aveC алела на тези клетки, където мутацията в aveC алела води до заместване в AveC генния продукт на различни аминокиселинни остатъци в една или повече от аминокиселинните позиции, отговарящи на аминокиселинните остатъци 38, 48, 55, 89, 99, 111, 136, 138, 139, 154, 179, 228, 230, 238, 266, 275, 289 или 298 от SEQ ID N0:2, такива че клетките на S.avermitilis щама, в който aveC алела е мутирал и води до получаването на авермектини в съотношение клас 2:1, което е различно от съотношението на авермектините, получени от клетки на същия щам S.avermitilis, който вместо това експресира само дивия тип aveC алел. В предпочитан вариант, промененото съотношение клас 2:1 на авермектините е редуцирано.

Както се използва тук, аминокиселинен остатък, кодиран от aveC алел в хромозомата на S.avermitilis или от вектор или от изолирана полинуклеотидна молекула от настоящето изобретение, той се отнася до “сответстващ на” специфичен аминокиселинен остатък от SEQ ID N0:2 или където аминокиселинно заместване се отнася до появило се в специфична позиция “съответстваща на” специфичен аминокиселинен остатък от SEQ ID N0:2, с цел да бъде отнесен до аминокиселинен остатък от съответстващата локализация в AveC генния продукт, която може да бъде бързо определена от специалистите в областта, чрез • · · · · · • ·· • · · ·· • ·· ·· ··♦·

отнасяне към аминокиселинната секвенция, представена тук, като SEQ ID N0:2.

Настоящето изобретение по-нататък осигурява методи за създаване на нови щамове, където специфични мутации в aveC алела, кодиращ определени мутантни форми са цитирани като основни промени в специфични нуклеотидни позиции в aveC алела, “съответстващи на” специфични нуклеотидни позиции, показани в SEQ ID N0:1. Както по-горе, отнесени към съответстващи аминокиселинни позиции, където нуклеотидните позиции в aveC алела се отнасят като “съответстващи на” специфични нуклеотидни позиции от SEQ ID N0:1, с цел да се отнесат до нуклеотидите в съответстващите места от aveC нуклеотидната последователност, които могат бързо да бъдат определени от специалистите в областта, чрез отнасяния до нуклеотидни последователности, представени тук като SEQ ID N0:1.

По-нататък в предпочитан вариант, настоящето изобретение осигурява метод за създаване на нови щамове S.avermitilis, включващи клетки, които продуцират авермектини с променено количество, вклюващ трансформация на клетки от S.avermitilis щам с вектор, който носи мутирал aveC алел, или с генетичен конструкт, включващ aveC алела, експресията на който води до промяна в кпичеството на получените авермектини от клетките на S.avermitilis щам, експресиращи мутирал aveC алел или генетичен конструкт, в сравнение с клетките на същия щам, които вместо това експресират само единичния див тип aveC алел, и селекция на трансформираните клетки, които водят до получаването на авермектини с променено количество, в сравнение с количеството на авермектините, получени от клетки на щама, който вместо това експресира само единичен див тип aveC алел. В предпочитан вариант, количеството на авермектините, получени в трансформираните клетки е повишено.

• · • · · • · • · · · · ·

По-нататък в предпочитан вариант, настоящето изобретение осигурява метод за създаване на нови щамове S.avermitilis, клетките на които включват инактивиран aveC алел, включващ трансформация на клетки на S.avermitilis щам, които експресират всеки aveC алел, с вектор който инактивира aveC алела, и селекция на трансформираните клетки в които aveC алела е подтиснат. В предпочитан, но неограничаващ вариант, клетките на S.avermitilis щам са трансформирани с вектор за заместване на гени, който носи aveC алел, който е инактивиран от мутация или от заместване на част от aveC алела с хетероложна генна последователност и селекция на трансформантите, при които в други случаи нативния aveC алел е заместен с инактивиран aveC алел. Инактивацията на aveC алела, може да бъде определена, чрез HPLC анализ на продуктите на ферментацията, както е описано по-долу. В специфичен, но не и ограничаващ вариант, описан в Глава 8.1 по-долу, aveC алелът е инактивиран чрез въвеждане на еггпЕ ген от Saccharopolyspora erythraea в ORF на aveC.

Настоящето изобретение по-нататък осигурява нови щамове S.avermitilis, включващи клетки, трансформирани с която и да е от полинуклеотидните молекули или вектори от настоящето изобретение. В предпочитан вариант, настоящето изобретение осигурява нови щамове на S.avermitilis, включващи клетки, които експресират мутирал aveC алел или изроден негов вариант на мястото на, или в допълнение на дивия тип aveC алел, където клетките на новия щам водят до получаването на авермектини със променено съотношение клас 2:1, в сравнение със съотношението клас 2:1 на авермектините, получени от клетки на същия щам, който вместо това експресира само дивия тип aveC алел. В предпочитан вариант, промененото съотношение клас 2:1 на получените от новите клетки авермектини е редуцирано. Такива нови щамове се използват за продукция в широки мащаби, на авермектини с

търговско значение, като дорамектин. В още по-предпочитан вариант, настоящето изобретение осигурява клетки на S.avermitilis, включващи която и да е от гореспоменатите мутации или комбинации от мутации в aveC алела в нуклеотидни позиции, съответстващи на тези, представени тук по-горе или които в други случаи кодират което и да е от гореспоменатите аминокиселинни замествания в AveC генния продукт. Въпреки че такива мутации могат да присъстват в такива клетки в извън хромозомални елементи, като плазмид, за предпочитане е такива мутации да присъстват в aveC алел, локализиран в хромозомата на S.avermitilis. В предпочитан вариант, настоящето изобретение осигурява щам на Streptnomyces avermitilis, включващ клетки, които имат мутация в aveC алела, кодиращ Ave С генния продукт, които имат замествания в една или повече аминокиселинни позиции, съответстващи на аминокиселинните остатъци 38, 48, 55, 89, 99, 111, 136, 138, 139, 154, 179, 228, 230, 238, 266, 275, 289 или 298 от SEQ ID N0:2, където клетките водят до получаването на авермектини в съотношение клас 2:1, което е различно от съотношението на авермектините, получени от клетките на същия щам S.avermitilis, които експресират само дивия тип aveC алел.

Първата задача на скрининг анализите описани тук е да се идентифицират мутиралите алели на aveC гена, експресията на които в S.avermitilis клетки променя и още по-специално редуцира съотношението клас 2:1 на получените авермектини. В предпочитан вариант, съотношението на авермектините В2:В1, получени от клетките на нов S.avermitilis щам от настоящето изобретение, експресиращи мутирал aveC алел или изроден негов вариант от настоящето изобретение е около 1.6:1 или по-малко. В още по-предпочитан вариант, съотношението е около 1:1 или по-малко. В още по-предпочитан вариант, съотношението е около 0.84:1 или по-малко. В оше по-

·· ····

предпочитан вариант, съотношението е около 0.80:1 или по-малко. В още по-предпочитан вариант, съотношението е около 0.75:1 или помалко. В още по-предпочитан вариант, съотношението е около 0.73:1 или по-малко. В още по-предпочитан вариант, съотношението е около 0.68:1 или по-малко. И даже в още по-предпочитан вариант, съотношението е около 0.67:1 или по-малко. В още по-предпочитан вариант, съотношението е около 0.57:1 или по-малко. И даже в още попредпочитан вариант, съотношението е около 0.53:1 или по-малко. Даже в още по-предпочитан вариант, съотношението е около 0.42:1 или помалко. Даже в още по-предпочитан вариант, съотношението е около 0.40.1 или по-малко.

В специфичен вариант, описан по-долу, новите клетки от настоящето изобретение продуцират авермектините циклохексил В2:циклохексил В1 в съотношение по-малко от 1.6:1. В различен специфичен вариант, описан по-долу, новите клетки от настоящето изобретение продуцират авермектините циклохексил В2:циклохексил В1 в съотношение около 0.94:1. По-нататък в друг специфичен вариант, описан по-долу, новите клетки от настоящето изобретение продуцират авермектините циклохексил В2:циклохексил В1 в съотношение около 0.88:1. По-нататък в друг специфичен вариант, описан по-долу, новите клетки от настоящето изобретение продуцират авермектините циклохексил В2:циклохексил В1 в съотношение около 0.84:1. Също понататък в друг специфичен вариант, описан по-долу, новите клетки от настоящето изобретение продуцират авермектините циклохексил В2:циклохексил В1 в съотношение около 0.75:1. Също по-нататък в друг специфичен вариант, описан по-долу, новите клетки от настоящето изобретение продуцират авермектините циклохексил В2:циклохексил В1 в съотношение около 0.73:1. Също по-нататък в друг специфичен вариант, описан по-долу, новите клетки от настоящето изобретение ·· ····

продуцират авермектините цикпохексил В2:цикпохексил В1 в съотношение около 0.68:1. Също по-нататък в друг специфичен вариант, описан по-долу, новите клетки от настоящето изобретение продуцират авермектините циклохексил В2: циклохексил В1 в съотношение около 0.67:1. Също по-нататък в друг специфичен вариант, описан по-долу, новите клетки от настоящето изобретение продуцират авермектините циклохексил В 2 .циклохексил В1 в съотношение около 0.57:1. Също по-нататък в друг специфичен вариант, описан по-долу, новите клетки от настоящето изобретение продуцират авермектините циклохексил В2: циклохексил В1 в съотношение около 0.53:1. Също по-нататък в друг специфичен вариант, описан по-долу, новите клетки от настоящето изобретение продуцират авермектините циклохексил В2:циклохексил В1 в съотношение около 0.42:1. И още по-нататък в друг специфичен вариант, описан по-долу, новите клетки от настоящето изобретение продуцират авермектините циклохексил В2 .циклохексил В1 в съотношение около 0.40:1.

По-нататък в предпочитан вариант, настоящето изобретение осигурява нови щамове на S.avermitilis, включващи клетки, които експресират мутирал aveC алел или изроден негов вариант, или генетичен конструкт включващ aveC алел или изроден негов вариант, на мястото на или в допълнение на дивия тип aveC алел, където клетките от новия щам продуцират авермектини в променено количество, в сравнение с клетките от същия щам, които вместо това експресират само дивия тип aveC алел. В предпочитан вариант, новия щам продуцира повишено количество от авермектини. В неограничаващ вариант, генетичния конструкт по-нататък включва силен промотор, като силния конститутивния ermE промотор от Saccharopolyspora ·· ♦ ··· • · ·· « · · • · · • · • · • · • · · · · erythraea, който е разположен след ORF на aveC и е в оперативна асоциация с него.

По-нататък в предпочитан вариант, настоящето изобретение осигурява нови щамове на S.avermitilis, включващи клетки в които aveC гена е инактивиран. Такива щамове се използват за определяне на разликите в спектъра на авермектините, които те продуцират в сравнение с дивия тип щам, и за допълване на скрининг анализа, както е описано тук, за определяне дали насочения или случаен мутагенезис на aveC гена се отразява върху авермектиновата продукция. В специфичен вариант описан по-долу, клетките-гостоприемници на S.avermitilis са генетично конструирани да съдържат инактивиран aveC ген. Например създаден е щам SE180-11, описан в примерите по-долу, чрез използване на плазмид за заместване на гени pSEl 80 (АТСС209605) (ФИГУРА 3), който е конструиран да инактивира aveC гена на S.avermitilis, чрез въвеждане на ген за резистентност erm Е в кодиращата област на aveC.

Настоящето изобретение рекомбинантно експресирани мутантни S.avermitilis, кодирани от която и полинуклеотидни молекули от настоящето изобретение и по-нататък осигурява

AveC генни продукти на да е от гореспоменатите методи за изготвяне на препарати от тях.

Настоящето изобретение по-нататък осигурява метод за клетки от продукция на авермектини, включващ култивиране на

S.avermitilis щам, които клетки експресират мутирал aveC алел, който кодира генен продукт, който променя съотношението клас 2:1 на авермектините, получени в средата на култивираните клетки на S.avermitilis щам, експресиращи мутирал aveC алел, в сравнение с клетки на същия щам, които вместо това експресират само дивия тип aveC алел, при условия които позволяват или индуцират продукцията на авермектини в нея и получаване на тези авермектини от културата. В

предпочитан вариант, съотношението на авермектините клас 2:1, получени от културата от клетки експресиращи мутирал aveC алел се редуцира. Този метод, осигурява повишена ефикасност в продукцията на авермектини с търговско значение, като дорамектина.

Настоящето изобретение по-нататък осигурява метод за продукция на авермектини, включващ култивиране на клетки на S.avermitilis щам, които клетки експресират мутирал aveC алел или генетичен конструкт, включващ aveC алела, който води до продукцията на променено количество на авермектини, получени в средата за култивираните клетки на S.avermitilis щам, експресиращи мутирал aveC алел или генетичен конструкт, в сравнение с клетки от същия щам, които не експресират мутирал aveC алел или генетичен конструкт, но вместо това експресират само дивия тип aveC алел, при условия, които позволяват или индуцират продукцията на авермектини в средата, и повторното получаване на тези авермектини от културата. В предпочитан вариант, количеството на получените авермектини в културата от клетките, експресиращи мутиралия aveC алел, изроден негов вариант или генетичен конструкт е повишено.

Настоящето изобретение по-нататък осигурява нови авермектинови състави, получени от S.avermitilis щам, експресиращ мутирал aveC алел или изроден негов вариант, който кодира генен продукт, който редуцира съотношението клас 2:1 на авермектините, получени от клетките на S.avermitilis щам, експресиращ мутирал aveC алел или изроден негов вариант, в сравнение с клетки от същия щам, който вместо това експресира само дивия тип aveC алел, където новия авермектинов състав се получава в редуцирано съотношение клас 2:1, в сравнение със съотношението клас 2:1 на авермектините, получен от клетки на същия щам S.avermitilis, който вместо това експресира само дивия тип aveC алел. Новият авермектинов състав, може да присъства • · · · · · • * Λ. * Λ. Λ.

като продукт на ферментацията, в бедната на хранителни вещества среда, или може да бъде изолиран от нея. Новият авермектинов състав може да бъде частично или значително пречистен от културалната течност, чрез известни биохимични техники за пречистване, като преципитация с амониев сулфат, диализа, фракциониране на базата на молекулни размери, йонообменна хроматография, HPLC и т.н.

5.4. ПРИЛОЖЕНИЕ НА АВЕРМЕКТИНИТЕ

Авермектините са високо активни антипаразитни агенти, които се използат специфично като противоглистни агенти, като агенти срещу ектопаразити, инсектицити и агенти срещу акари. Авермектинови съединения, получени съгласно методите от настоящето изобретение, се използват за всяка една то тези цели. Например, авермектинови съединения, получени съгласно настоящето изобретение се използват при лечението на различни заболявания или състояния при хората, поспециално, когато тези заболявания или състояния са причинени от паразитни инфекции, известни в областта. Виж например Ikeda и Omura, 1997. Chem. Rev. 97(7):2591-2609. По-специално авермектинови съединения получени съгласно настоящето изобретение са ефективни при лечение на различни заболявания или състояния, причинени от ендопаразити, каквито са нематодните паразити, които могат да инфектират хората, домашните животни, свинете, овцете, домашните птици, конете или говедата.

По-специално, авермектинови съединения, получени съгласно настоящето изобретение са ефективни срещу нематоди, които инфектират хората, както и тези които инфектират различни видове животни. Такива нематоди включват гастроинтестинални паразити, като Ancylostonici. Necator. Ascaris, Strongyloides, Trichinella, Capillaria, ·· ··♦·

Trichuris, Enterobius, Dirofilaria и паразити, които се намират в кръвта или други тъкани или органи, като глистите и извънчревните форми на Strongyloides и Trichinella.

Авермектиновите съединения, получени съгласно настоящето изобретение също се използват за лечение на ектопаразитни инфекции, включващи например зарази на бозайници и птици с артроподи, зарази причинени от кърлежи, дребни червеи, въшки, бълхи, мухи-месарки, жилещи насекоми или ларви на мигриращи двукрили, които измежду другите могат да засегнат говедата и конете.

Авермектиновите съединения, получени съгласно настоящето изобретение, също се използват като инсектициди срещу “домакински” насекоми, като например хлебарки, молци по дрехите и килимите и други, както и срещу насекоми по храни от зърнени растения, които насекоми включват паяци, червеи, листни въшки, гъсеници и сред другите и правокрили насекоми, като скакалци.

Животните, които могат да бъдат лекувани с авермектинови

съединения, получени съгласно настоящето изобретение, включват овце, говеда, коне, сърни, кози, свине, птици, включително и домашни птици, и кучета и котки.

Авермектиново съединение, получено съгласно настоящето изобретение се въвежда като препарат, подходящ за предвиденото специфично използване, в зависимост от спецификата на вида на животното-гостоприемник, което е лекувано и паразита или насекомото - причинител на заразата. Като агент срещу паразит, авермектиновото съединение, получено съгласно настоящето изобретение може да бъде въведен орално под формата па капсула, болус, таблетка или като течна съставка или също така може да бъде въведено под формата на течност, или чрез инжекция или като имплант. Такива препарати се приготвят по общоприет начин в съответствие със стандартите на ветеринарната

практика.Така капсулите, болусите или таблетите могат да бъдат приготвени чрез смесване на активни компоненти с подходящ добре разделящ дилуент или носител допълнително съдържащ дезинтегриращ и/или свързващ агент, като нишесте, лактоза, талк, магнезиев стерат и т.н. Течните състави, могат да бъдат приготвени, чрез дисперсия на активните компоненти във воден разтвор, заедно със диспергиращия или втечняващ агент и т.н. Съставите за инжектиране могат да бъдат приготвени под формата на стерилни разтвори, които могат да съдържат други субстанции, като например съществени соли и/или глюкоза, които правят разтвора изотоничен на кръвта.

Такива състави ще варират в зависимост от теглото на активното съединение, в зависимост от лекувания пациент или вида на лекуваното животното-гостоприемник, от остротата и типа на инфекцията, и от телесното тегло на гостоприемника. Обикновено за орално приложение ще бъде задоволителна доза от активно съединение от около 0.001 до 10 mg на kg от теглото на пациент или от теглото на животното, дадени като единична доза или разделни дози за период от 1 до 5 дни. Може да има случаи обаче, където са посочени по-високи или по-ниски вариации в дозировките, определени например от лекар или ветеринар, на базата на клинични симптоми.

Като алтернатива, авермектиновото съединение получено съгласно настоящето изобретение, може да бъде въведен в комбинация с храни за животни и за тази цел, концентрирана хранителна добавка или смес може да се приготви за смесване с нормалната храна на животните.

За използване като инсектицид в борбата срещу насекоми по зърнените култури, авермектиновото съединение, получено съгласно настоящето изобретение, може да бъде приложена под формата на ·· ···· • · • ··· ·· ····

спрей, на прах или като емулсия и според изискванията, и в съгласие със стандартите на селскостопанската практика.

6, ПРИМЕР ЗА ИЗПЪЛНЕНИЕ НА ИЗОБРЕТЕНИЕТО: ФЕРМЕНТАЦИЯ ПРИ STREPTOMYCESAVERM1TILIS И АНАЛИЗ НА АВЕРМЕКТИНИТЕ В2:В1

Щамове при които липсва киселата дехидрогеназна активност за 2-оксо разклонената верига и 5-О-метилтранферазната активност не водят до получаването на авермектини, ако средата за ферментация не е допълнена с мастни киселини. Този пример демонстрира, че в такива мутанти могат да бъдат получени авермектини с големи вариации в съотношението В2:В1, когато биосинтезата е инициирана в присъствие на различни мастни киселини.

6.1. МАТЕРИАЛИ И МЕТОДИ

Streptomyces avermililis ATCC 53692 се съхранява при -70 ⁰ С, в течна среда, включваща: Strach (Nadex, Laing National) - 20 g, Pharmamedia (Trader’s Protein, Memphis, TN) - 15g; Ardamine pH (Yeast Products Inc) - 5g; Калциев карбонат - lg. Крайния обем е нагласен до 1 литър с чешмяна вода, pH е нагласено до 7.2 и средата се автоклавира при 121 ⁰ С за 25 минути.

Два милилитра от размразената суспензия, приготвянето на която е описано по-горе се инокулира в колба, съдържаща 50 ml от същата среда. След 48 часа инкубация на 28 ⁰ С на ротационен клатач, при 180 rpm, 2 ml от течната среда се използва за инокулиране на колба, съдържаща 50 ml от среда за продукция, състояща се от: Strach (Nadex, Laing National) - 80 g, Калциев карбонат - 7g, .Pharmamedia - 5g;

• · ··♦· • ·· • ·· · · • ·· • ·· • · · · · • ·9 • ·· • · ·· • · ··

64“ *·

дикалиев хидроген фосфат - lg, магнезиев сулфат - lg, глутамова киселина - 0.6 g; железен сулфат хептахидрат - 0.01 g; цинков сулфат 0.001 g; манганов сулфат - 0.00lg. Крайния обем се нагласява до 1 литър с чешмяна вода, pH се нагласява до 7.2 и средата се автоклавира при 121 °C за25 минути.

Различни субстрати на карбоксилови киселини (виж ТАБЛИЦА 1) се разтварят в метанол и се добавят към течната среда за ферментация 24 часа след инокулирането, като крайната им концентрация е 0.2 g/литър. Средата за ферментация се инкубира 14 дни на 28 ⁰ С, след което средата се центрофугира (2500 грш за 2 минути) и супернатантата се отстранява. Мицелната утайка се екстрахира с ацетон (15 ml), след което с дихлорометан (30 ml) и органичната фаза се разделя, филтрува се, след което се продухва докато се изсуши. Остатъка се взима в метанол (1ml) и се анализира с HPLC с HewlettPackard 1090А течен хроматограф, оборудван със диоден лъчев сканиращ детектор, настроен на 240 nm. Използваната колона е Beckman Ultrasphere С-18, 5 μιη, 4.6 mm х 25 cm колона подържана при 40 ⁰ С. Двадесет и пет μΐ от горепосочения метанолов разтрвор се инжектират в колоната. Елуирането става чрез линеен градиент на метанол-вода от 80:20 до 95:5 за повече от 40 минути със скорост 0.85т1/минута. Две стандартни концентрации на циклохексил В1 се използват за калибриране на детекторния отговор и се измерва площта под кюветите за В2 и В1 авермектините.

6.2. РЕЗУЛТАТИ

Времето на задържане при HPLC на В2 и Bl и съотношенията 2:1 са показани в ТАБЛИЦА 1.

·· ··· ·· ·· ·· ····

ТАБЛИЦА 1

	HPLC Време на задържане (минути)	Съотношение
Субстрати	В2	В1	В2:В1
4-Тетрахидропиран карбоксилна киселина	8.1	14.5	0.25
Изомасленакиселина	10.8	18.9	0.5
З-Фуран-карбоксилна киселина	7.6	14.6	0.62
8-(+)-2-метилмаслена Киселина	12.8	21.6	1.0
Циклохексанкарбоксилна киселина	16.9	26.0	1.6
З-Тиофенкарбоксилна киселина	8.8	16.0	1.8
Циклопентанкарбоксилна Киселина	14.2	23.0	2.0
З-Трифлорометилмаслена киселина	10.9	18.8	3.9
2-Метилпентанова киселина	14.5	24.9	4.2
Циклохептанкарбоксилна киселина	18.6	29.0	15.0

Данните представени в ТАБЛИЦА 1 показват много широк обхват на вариациите в съотношенията В2:В1 на получените авермектини, показващи значителни различия в резултатите при i

• · · · · · ·· ····

прехода на дехидратиране от клас 2 съединенията към клас 1 съединенията, в зависимост от природата на странична верига на първоначално приложената мастна киселина. Това показва, че промените в съотношението В2:В1, дължащи се на променения AveC протеин, могат да бъдат специфични за даден субстрат. Следователно скринингът на мутанти, показващи промени в съотношението В2.В1, получено за даден субстрат изисква той да бъде направен в присъствие на този субстрат. В последващите примери, описани по-долу се използва циклохексанакарбоксилна киселина, като субстрат за скрининг. Субстрата обаче се използва само като пример за потенциален субстрат и не цели да огранчи приложимостта в настоящето изобретение.

7. ПРИМЕР ЗА ИЗПЪЛНЕНИЕ НА ИЗОБРЕТЕНИЕТО: ИЗОЛИРАНЕ НА aveC ГЕНА.

Този пример описва изолирането и характеризирането на район от хромозомата на Streptomyces avermitilis, който кодира AveC генния продукт. Както е показано по-долу, aveC гена е идентифициран като способен да модифицира съотношението циклохексил-В2 и циклохексил-В1 (В2:В1) на получените авермектини.

7.1. МАТЕРИАЛИ И МЕТОДИ

7.1,1, КУЛТИВИРАНЕ НА STREPTOMYCES ЗА ДНК ИЗОЛИРАНЕ

Следващите методи се използват за култивиране на

Streptomyces. Единични колонии от S.avermitilis АТСС 31272 (изолирана единична колония #2) са изолирани върху 1/2 подсилена YPO-6 среда

включваща: Difko Yeast Extract - 5g; Difco Bacto-peptone - 5g; декстроза - 2.5g; MOPS - 5 g; Difco Bacto arap - 15 g. Крайния обем се нагласява до 1 литър с дестилирана вода, pH се нагласява до 7.0 и средата се автоклавира при 121 °C за 25 минути.

Получения мицел върху гореописаната среда се използва за

инокулиране на 10 ml в TSB среда (Difco Tryptic Soy Broth - 30 g в 1 литър дестилирана вода, автоклавирана при 121 ⁰ С за 25 минути) в 25 mm х 150 mm епруветка, която се поддържа на кпатач (300 rpm) при 28 ⁰ С за 48 -72 часа.

7.1.2. ИЗОЛИРАНЕ НА ХРОМОЗОМНАТА ДНК НА STREPTOMYCES

Аликвоти (0.25 ml или 0.5 ml) от мицела, получен както е

описано по-горе се поставят в 1.5 ml микроцентрофужни епруветки и клетките се концентрират чрез центрофугиране при 12,000 g за 60 секунди. Супернатантите се отстраняват и клетките се ресуспендират в 0.25 ml TSE буфер (20 ml 1.5М захароза, 2.5 ml 1М Трис-HCl, pH 8.0, 2.5 ml 1М ЕДТА pH 8.0 и 75 ml dH₂O), съдържащ 2 mg/ml лизозим. Пробите се инкубират на 37 ⁰ С за 20 минути, като се клатят, поставени в автоматичен апарат за изолиране на нуклеинови киселини AutoGen 540 ™ (Integrated Separation System, Natick, МА) и изолираната геномна ДНК, чрез използване на Цикъл 159 (нагласен чрез софтуеарно оборудване) съгласно инструкциите на производителя.

Освен това 5 ml от мицелите се поставят в 17 mm х 100 mm епруветка, клетките се концентрират чрез центрофугиране при 3,000 rpm за 5 минути и супернатантите се отстраняват. Клетике се ресуспендират в 1 ml TSE буфер, концентрират се чрез центрофугиране на 3, 000 rpm за 5 минути и супернатантите се отстраняват. Клетките се ресуспендират в 1 ml TSE буфер, съдържащ 2mg/ml лизозим и се • 4 ··

• · · · • · · * • · · инкубират на 37 ⁰ С на кпатач, за 30-60 минути. След инкубацията се добавя 0.5 ml 10 % натриев додецил сулфат (SDS) и клетките се инкубират на 37 °C докато не се лизират напълно. Лизатът се инкубира на 65 ⁰ С за 10 минути, охлажда се до стайна температура, разделя се в две 1.5 ml Епендорф епруветки и се екстрахира 1х с 0.5 ml фенол/хлороформ (50 % фенол предварително еквилибриран с 0.5 М Трие, pH 8.0; 50 % хлороформ). Водната фаза се отстранява и се екстрахира от 2 до 5 х хлороформ.изоамилов алкохол (24:1). ДНК се преципитира чрез добавяне на 1/10 от обема ЗМ натриев ацетат, pH 4.8, сместта се инкубира на лед за 10 минути, центрофугира се сместта при 15,000 rpm на 5 ¹¹ С за 10 минути и се отстранява супернатантата в чиста епруветка, в която е добавен 1 обем изопропанол. Супернатантата плюс изопропаноловата смес след това се инкубират на лед за 20 минути, центрофугират се на 15, 000 rpm за 20 минути при 5 ⁰ С, супернатантата се отстранява и ДНК утайката се промива 1х със 70 % етанол. След като се изсуши утайката, ДНК се ресуспендира в ТЕ буфер (10 шМ Трие, 1 тМ ЕДТА, pH 8.0).

7.1.3, ИЗОЛИРАНЕ НА ПЛАЗМИДНА ДНК ΟΎ STREPTOMYCES

Аликвоти (1.0 ml) от мицелите се поставят в 1.5 ml микроцентрофужни епруветки и клетките се концентрират чрез центрофугиране при 12,000 х g за 60 секунди. Супернатантите се отстраняват, клетките се ресуспендират в 1.0 ml 10.3 % захароза и се концентрират чрез центрофугиране при 12, 000 х g за 60 секунди и супернатантите се отстраняват. Клетките след това се ресуспендират в 0.25 ml TSE буфер, съдържащ 2 mg/ml лизозим и се инкубират на 37 ⁰ С за 20 минути на кпатач и се поставят в автоматичен апарат за изолиране на нукеинови киселини AutoGen 540™. Плазмидната ДНК се изолира • · · · • · • · • «

чрез използване на Cycle 106 (нагласен чрез софтуеарно оборудване) съгласно инструкциите на производителя.

Освен това, 1.5 ml от мицелите се поставя в 1.5 ml

микроцентрофужни епруветки и клетките се концентрират, чрез центрофугиране при 12, 000 х g за 60 секунди. Супернатантата се отстранява, клетките се ресуспендират в 1.0 ml 10.3 % захароза и се концентрират, чрез центрофугиране при 12, 000 х g за 60 секунди и супернатантата се отстранява. Клетките се ресуспендират в 0.5 ml TSE буфер, съдържащ 2 mg/ml лизозим и се инкубират на 37 ⁰ С за 15-30 минути. След инкубацията 0.5 ml алкален SDS (0.3N NaOH, 2% SDS) се добавя и клетките се инкубират на 55 ⁰ С за 15-30 минути или докато не се избистри разтвора. Натриев ацетат (0.1 ml, ЗМ, pH 4.8) се добавя към ДНК разтвора, който след това се инкубира на лед за 10 минути. ДНК пробите се центрофугират при 14,000 rpm за 10 минукти на 5 ⁰ С. Супернатантите се прехвърлят в чиста епруветка и 0.2 ml фенол/хлороформ (50 % фенол: 50 % хлороформ) се добавят и се смесват внимателно. ДНК разтвора се центрофугира при 14, 000 rpm за 10 минкути на 5 ⁰ С и горния слой се прехвърля в чиста Епендорф епруветка. Добавя се изопропанол (0.75 ml) и разтвора внимателно се смесва, и след това се инкубира на стайна температура за 20 минути. ДНК разтвора се центрофугира на 14, 000 rpm за 15 минути на 5 ⁰ С, супернатантата се отстранява и ДНК утайката се промива със 70 % етанол, изсушава се и се ресуспендира в ТЕ буфер.

7.1.4. ИЗОЛИРАНЕ НА ПЛАЗМИДНА ДНК ОТ Е. CPU

Единична трансформирана колония на E.coli се инокулира в 5 ml. Luria-Bertani (LB) среда (Bacto-Tryptone - 10 g, Bacto-yeast extract - 5 g и NaCl-10 g в 1 литър dH₂O, pH 7.0, автоклавирана при 121 ⁰ C за 25 • · * ··»

минути и допълнена със 100 pg/ml ампицилин). Културите се инкубират цяла нощ и аликвота от 1ml се поставя в 1.5 ml микроцентрофужна епруветка. Пробите от културата се поставят в автоматичен апарат за изолиране на нуклеинови киселини AutoGen 540 ™ и плазмидната ДНК се изолира, като се използва Cycle 3 (нагласен чрез софтуеарно оборудване) съгласно инструкциите на производителя.

7.1.5. ПРИГОТВЯНЕ И ТРАНСФОРМАЦИЯ НА ПРОТОПЛАСТИ НА # S.A VERMITIL1S

Единични колонии от S.avermitlis се изолират от 1/2 устойчив YPD-6. Мицелите се използват за инокулиране в 10 ml TSB среда в 25 mm х 150 mm епруветка, която след това се инкубира на клатач (300 грт) на 28 ⁰ С за 48 часа. Един ml от мицелите се използва за инокулиране в 50 ml YEME среда. Един литър YEME среда съдържа: Difco Yeast Extract - 3 g; Difco Bacto-peptone - 5 g; Difco Malt Extract - 3 g; захароза - 300 g. След автоклавиране при 121 ⁰ C за 25 минути, се добавят още: 2.5 М MgCl₂.6H₂O (отделно автокпавиран при 121 ⁰ С за 25 в ^w минути) - 2 ml и глицин (20 %) (стерилизиран чрез филтруване) - 25 ml.

Мицелите се култивират на 30 ⁰ С за 48-72 часа и се събират, чрез центрофугиране в 50 ml центрофужни епруветки (Falcon) при 3,000 грт за 20 минути. Супернатантите се отстраняват и мицелите се ресуспендират в Р буфер, който съдържа: захароза - 205 g; K₂SO₄ - 0.25 g; MgCl₂.6H₂O - 2.02 g; H₂O - 600 ml; K₂PO₄ (0.5 %) - 10 ml, “разтвор на микроелементи ” - 20ml, СаС1₂.2Н₂О - 100 ml и MES буфер (1.0 М pH 6.5) - 10 ml .“Разтвор на Микроелементи” в един литър съдържа: ZnCl₂ 40 mg; FeCh .6Н₂О - 200 mg; CuC1₂.2H₂O - 10 mg; MnCl₂.4H₂O - 10 mg; Na₂B₄O7.10H₂O - 10 mg; (ΝΗ₄)₆Μθ7θ₂₄.4Η₂Ο - 10 mg). pH се нагласява до

Μ

« · · · • · ·

····

6.5, крайния обем се нагласява до 1 литър и средата се филтрува затоплена през 0.45 микронов филтър.

Мицелите се утаяват при 3,000 rpm за 20 минути, супернатантата се отстранява и мицелите се ресуспендират в 20 ml буфер Р, който съдържа 2 mg/ml лизозим. Мицелите се инкубират на 35 ⁰ С за 15 минути на клатач, и се проверяват микроскопски за да се установи степента на формиране на протопласт. Когато протопластът се е уформил напълно, протопластите се центрофугират при 8, 000 rpm за 10 минути. Супернататата се отстранява и протопластите се ресуспендират в 10 ml буфер Р. Протопластите се центрофугират при 8, 000 rpm за 10 минути, супернатантите се отстраняват, протопластите се ресуспендират в 2 ml буфер Р и около 1 xl 0⁹ протопласти се разпределят в 2.0 ml криогенни фиолки (Nalgene).

Фиолка с 1 х 10⁹ протопласти се центрофугира при 8, 000 rpm за 10 минути, супернатантата се отстранява и протопластите се ресуспендират в 0.1 ml буфер Р. Два до пет pg от трансформираната ДНК се добавя към протопластите, веднага последвана от добавянето на 0.5 ml работен Т буфер. Основният Т буфер съдържа: PEG-1000 (Sigma) - 25 g; захароза - 2.5 g; Н2О - 83 ml. pH се нагласява до 8.8 с IN NaOH (стерилизирана, чрез филтруване) и основния Т буфер се стерилизира чрез филтруване и се съхранява на 4 ⁰ С. Работния Т буфер, използван и приготвен същия ден, е: основен Т буфер - 8.3 ml; К2РО4 (4mM) -1.0 ml; СаС12. 2Н₂О (5М) - 0.2 ml и TES (IM, pH 8) - 0.5 ml. Всеки компонент на работния Т буфер се стерилизира индивидуално чрез филтруване.

До 20 секунди след добавяне на Т буфера, към протопластите също се добавя 1.0 ml Р буфер и протопластите се центрофугират при 8,000 rpm за 10 минути. Супернатантата се отстранява и протопластите се ресуспендират в 0.1 ml буфер Р. Протопластите след това се поставят в RM 14 среда, която съдържа захароза - 205 g; K₂SC>4 - 0.25 g;

ИМММЙВ ·· · · · · ·· · ··· • · · · · · • · · · · · · ·

MgCl₂.6H₂O - 10.12 g; глюкоза - 10 g; Difco casamino acids - O.lg, Difco Yeast Extract - 5g, Difco Oatmeal Agar - 3g, Difco Bacto Agar - 22 g; dH₂O - 800 ml. Разтворът се автоклавира при 121 ⁰ С за 25 минути. Към стерилните стокове след автоклавиране се добавят: К₂РО₄ (0.5 %) - 10 ml; СаС1₂.2Н₂О (5М) - 5 ml; L- пролин (20 %) - 15 ml; MES буфер (1.0 М pH 6.5) - 10 ml, Разтвор на Микроелементи (същите като горепосочените) - 2 ml, сток на циклохексамид (25 mg/ml) - 40 ml и IN NaOH - 2ml. Двадесет и пет ml от RM 14 средата се разпределя на аликвоти за петри и петритата се сушат 24 часа преди използване.

Протопластите се инкубират при 95 % влажност на 30 ⁰ С за 20-24 часа. За селекция на тиострептон резистентни трансформанти, се добавя 1 ml постилащ буфер, към всички RM 14 петрита, съдържащ 125 pg/ml тиострептон. Постилащият буфер съдържа на 100 ml: захароза 10.3 g, разтвор на микроелементи (същите като горепосочените) - 0.2 ml и MES (IM, pH 6.5) - 1 ml. Протопластите се инкубират на 95 % влажност на 30 ⁰ С за 7-14 дни, докато тиострептон резистентните (Thio¹) колонии не станат видими.

7.1.6 ТРАНСФОРМАЦИЯ НА ПРОТОПЛЛСТИ НА STREPTOMYCES LIVIDANS

S. lividans ТК64 (доставен от John Innes Institute, Norwich, U.K) се използват за трансформации в някои случаи. Методи и състави за култивиране, получаване на протопласти и трансформиране на S'. lividans са описани в Hopwood et al., 1985, Genetic Manipulation of Streptomyces, A Laboratory Manual, John Innes Foundation, Norwich, U.K. и се приготвят както е описано тук. Плазмидната ДНК се изолира от транформанти на S. lividans както е описано в Глава 7.1.3, по-горе.

7.1,7. АНАЛИЗ НА ФЕРМЕНТАЦИЯТА ПРИ ЩАМОВЕ НА S.AVERMITILIS

Мицелите на S.avermitilis, образувани върху 1/2 устойчива YPD-6 среда за 4-7 дни се инокулират в 1 х 6 инчови епруветки, съдържащи 8 ml от предварително приготвената среда и върху 2 5 mm стъклени топчета. Предварително приготвената среда съдържа: разтворено нишесте (тъкнослойно сварено нишесте или KOSO, Japan Com Starch Co Nagoya) - 20 g/L; Pharmamedia - 15 g/L; Ardamine pH - 5 g/L (Champlain Ind., Clifton, NJ); СаСОз - 2 g/L; 2 x bcfa (“bcfa” се отнася до разклонената мастнокиселинна верига, съдържаща крайна концентрация в средата от 50 ppm 2-(+)-метил маслена киселина, 60 ppm изомаслена киселина и 20 ppm изовалерианова киселина. pH се нагласява до 7.2 и средата се автоклавира на 121 ⁰ С за 25 минути.

Епруветката се оставя на клатач при 215 rpm поставена под ъгъл 17 ⁰ на 29 ⁰ С за 3 дена. Аликвоти от по 2 ml от културата се използват за инокулиране в 300 ml Ерленмайерова колба, съдържаща 25 ml от среда за продукция, която съдържа: нишесте (тънкослойно сварено или KOSO) - 160 g/L; Nutrisoy (Archer Daniels Midland, Decatur, IL) - 10 g/L; K₂PO₄ - 2 g/L; MgSO₄.4H₂O - 2g/L; FeSO₄.7H₂O - 0.02 g/L; MnCl₂ - 0.002 g/L; ZnSO₄.7H₂O - 0.002 g/L; CaCO₃ - 14 g/L; 2 x bcfa (както е посочено по-горе); и циклохексан карбоксилона киселина (СНС) (приготвена като 20 % разтвор с pH 7.0) - 800 ppm. pH се нагласява до 6.9 и средата се автоклавира при 121 ⁰ С за 25 минути.

След инокулирането, колбата се инкубира на 29 ⁰ С за 12 дена на клатач при 200 rpm. След инкубацията, 2 ml от пробата се взема от колбата, разтваря до 8 ml в метанол, смесва се и сместа се центрофугира при 1,250 х g за 10 минути докато се утаи. Супернатантата се анализира чрез HPLC, чрез използване на Beckman Ultrasphere ODS колона (25 cm х 4.6 mm ID) със скорост на потока 0.75ml/min и се детектира чрез

9 999 9

99

абсорбция при 240 nm. Подвижната фаза е 86/8.9/5.1 метанол/вода/ацетонитрил.

7.1.8 ИЗОЛИРАНЕ НА PKS ГЕНИ НА S.A VERMITIUS

Козмидна библиотека на хромозомната ДНК на S.avermitlis (АТСС 31272, SC-2) е направена, чрез хибридизация с кетосинтетазна (KS) сонда, направена от фрагмент на поликетидния синтетазен ген (PKS) на Saccharopolyspora erythraea. Подробно описание на изготвянето на козмидни библиотеки може да бъде намерено в Sambrook et al., 1989, по-горе. Подробно описание на приготвянето на хромозомни ДНК библиотеки на Streptomyces е представено в Hopwood et al., 1985, по-горе. Козмидни клонове, съдържащи кетосинтетазния район за хибридизацията са идентифицирани чрез хибридизация към 2.7 Kb Ndel/Eco471II фрагмент от рЕХ26 (любезно предоставен от Dr. Р. Leadlay, Cambridge, UK). Приблизително 5 ng от рЕХ26 се подлага на рязане с Ndel и Есо47Ш. Реакционната смес се поставя в 0.8 % SeaPlaque GTG агарозен гел (FMC BioProducts, Rockland, ME). 2.7 Kb Ndel/Eco47III фрагмент се изрязва от гела след електрофорезата и ДНК се изолира от гела, чрез използване на GELase™ от Epicentre Technologies, чрез използване на “Бърз протокол”. 2.7 Kb Ndel/Eco47III фрагмент се бележи с [a- P]dCTP (дезоксицитидин 5’-трифосфат, тетра (триетиламониева) сол [алфа-' Р]-) (NEN-Dupont, Boston, МА), чрез използване на BRL Nick Translation System (BRL Life Technologies, Inc. Gaihersburg, MD) следвайки инструкциите на доставчика. Типичната реакция се осъществява в 0.05 ml обем. След добавяне на 5 μΐ Stop буфер, белязаната ДНК се отделя от неинкорпорираните нуклеотиди, чрез използване на G-25 Sephadex Quick Spin™ Колона (Beohringer Mannheim) следвайки инструкциите на доставчика.

···· ·« · · • · · · • · ·

Приблизително около 1,800 козмидни клона се скринират чрез колонна хибридизация. Десет колонии се идентифиират по високата си степен на хибридизация към KS сондата от Sacc. erythraea. E.coli колониите, съдържащи козмидната ДНК се култивират в LB течна среда и козмидната ДНК се изолира от всяка култура в автоматичен апарат за изолиране на нуклеинови киселини AutoGen 540™, чрез използване на Cycle 3 (нагласен чрез софтуеарно оборудване) съгласно инструкциите на производителя. Ендонуклеазно рестазно картиране и анализ чрез Southern блот хибридизация се провеждат, така че пет от клоновете, да съдаржат припокриващи се хромозомални участъци. Ват Н1 геномната рестазна карта на S.avermitilis на пет козмида (т.е. pSE65, pSE66, pSE67, pSE68, pSE69) е конструирана чрез анализ на припокриващите се козм иди и хибридизиращи райони (ФИГУРА 4).

7.1.9 ИДЕНТИФИЦИРАНЕ НА ДНК, КОЯТО МОДУЛИРА

СЪОТНОШЕНИЕТО В2:В1 НА АВЕРМЕКТИНИТЕ И ИДЕНТИФИЦИРАНЕ НА ORF НА aveC

Следващите методи се използват за проверка на субкпонирани фрагменти, с произход от pSE66 козмидния клон, за тяхната способност да модулират авермектиновото съотношение В2:В1 в AveC мутанти. pSE66 (5pg) се изрязва с SacI и BamHl. Реакционната смес се нанася върху 0.8 % SeaPlaque™ GTG агарозен гел (FMC BioProducts), 2.9 Kb SacI/ BamHl фрагмент се изрязва от електрофоретичния гел и ДНК се изолира от гела, чрез GELase™ (Eprcentre Technologies), чрез използване на “Бърз Протокол”. Приблизително 5 pg от “shuttle” вектора pWHM3 (Vara et al., 1989, J.Bacteriol. 171:5872-5881) се подлага на рязане със SacI и BamHl. Около 0.5 pg от “insert’’-а с размери 2.9 КЬ и 0.5 pg от линеализирания ·· ····

pWHM3 се смесват заедно и се инкубират за една нощ с 1 единица лигаза (New England Biolabs, Inc., Beverly, МА) при 15 ⁰ C в краен обем от 20 μΐ, съгласно инструкциите на доставчика. След инкубацията 5 μΐ от лигазната смес се инкубират на 70 ⁰ С за 10 минути, охлаждат се на стайна температура и се използват за трансформиране на компетентни клетки E.coli DH5a (BRL), съгласно инструкциите на производителя. Плазмидната ДНК се изолира от ампицилин резистентните трансформанти и присъствието на 2.9 Kb SacI/BamHl “insert” се потвърждава, чрез рестриктазен анализ. Плазмидът се означава като pSE119.

Протопласти на S.avermillis щам 1100-SC38 (Pfizer in-house щам) се приготвят и трансформират с pSEl 19 както е описано в Глава 7.1.5 по-горе. Щам 1100-SC38 е мутантен и продуцира значително повече от авермектин циклохексил В2 в сравнение с авермектин циклохексил В1, когато е добавена циклохекан карбоксилна киселина (В2:В1 около 30:1). pSE 119, използван за трансформиране на протопласти от S.avennitlis, се изолира от E.coli щам GM2163, получен от Dr. B.J. Bachman, Curator, E.coli Genetic Stock Center, Yale University, E.coli щам DM I (BRL) или от S.livickms щам TK64. Трансформантите, резистенти към тиострептон от щам 1100-SC38 са изолирани и анализирани, чрез HPLC анализ на продуктите на ферментацията. Трансформантите на S.avermitlis щам 1100-SC38 носещи pSE119, продуцират авермектини с променено съотношение циклохексил-В2 : циклохексил В1 от около 3.7:1 (ТАБЛИЦА 2).

Веднъж установено че pSE119 е способен да модулира съотношенето В2:В 1 на авермектините в AveC мутант, въведената ДНК е секвенирана. Около 10 pg от pSEl 19 са изолирани, чрез използване на кит за изолиране на плазмидна ДНК (Qiagen, Valenca, СА) следвайки инструкциите на производителя и ДНК е секвенирана, чрез използване ·♦ ····

на ABI 373А Автоматичен ДНК секвенатор (Perkin Elmer, Foster City, СА). Данните от секвенирането се събират и редактират чрез изплозване на Genetic Computer Group програми (GCG, Madison, WI). ДНК секвенцията и ORF на aveC са представени на ФИГУРА 1 (SEQ ID NO: 1)·

Нов плазмид, означен като pSE118 е конструиран както следва. Приблизително 5 pg от pSE66 се подлагат на рязане със SphI и Bam Н1. Реакционната смес се нанася върху 0.8 % SeaPIaque™ GTG агарозен гел (FMC BioProducts), 2.8 Kb SphI/ BamHl фрагмент се изрязва от електрофоретичния гел и ДНК се изолира от гела, чрез използване на GELase™ (Eprcentre Technologies), чрез използване на “Бърз Протокол”. Приблизително 5 pg от “shuttle” вектора pWHM3 се подлага на рязане със SphI и BamHl. Около 0.5 pg от 2.8 Kb “insert” и 0.5 pg от линеализирания pWHM3 се смесват заедно и се инкубират за една нощ с 1 единица лигаза (New England Biolabs) при 15 ^!ί С в краен обем от 20 pl, съгласно с инструкциите на доставчика. След инкубацията 5 pl от лигазната смес се инкубират на 70 ⁰ С за 10 минути, охлаждат се на стайна температура и се използват за трансформиране на компетентни клетки E.coli DH5a, съгласно инструкциите на производителя. Плазмидната ДНК се изолира от ампицилин резистентните транфрорманти и присъствието на 2.8 Kb SphI/ BamHl “insert” се потвърждава, чрез рестриктазен анализ. Плазмидът се означава като pSE118. Въведените ДНК във pSEl 18 и pSE119 се припокриват в област от 838 нуклеотида (ФИГУРА 4).

Протопласти на S.avermitlis щам 1100-SC38 са транформирани с pSEl 18, както е описано по-горе. Трансформантите, рсзистенти към тиострептон от щам 1100-SC38 са изолирани и анализирани, чрез HPLC анализ на продуктите на ферментацията. Трансформантите отS.avermitlis щам 1100-SC38, носещи pSEl 18 нямат

променено съотношение авермектини циклохексил-В2 : авермектин циклохексил-Bl, в сравнение със щам 1100-SC38 (ТАБЛИЦА 2).

7.1.10 PCR АМПЛИФИКАЦИЯ НА AVEC ГЕНА ОТ ХРОМОЗОМНАТА ДНК НА S.A VERMITILIS

Около ~ 1.2 КЬ фрагмент, съдържащ ORF на aveC е изолиран от хромозмната ДНК на S.avermitilis, чрез PCR амплификация с използване на праймерите, приготвени на базата на aveC нуклеотидната последователност, получена по-горе. PCR праймерите са доставени от Genosys Biotechnologies, Inc. (Техах). Праймерът за четене отдясно на ляво (5’-3’) праймерът е: 5’-TCACGAAACCGGACACAC-3’ (SEQ ID N0:6); и праймерът за четене отляво на дясно (3’-5’) е 5’CATGATCGCTGAACCGAG-3’ (SEQ ID N0:7). PCR реакцията се осъществява с DeepVent™ полимераза (New England Biolabs) в буфер, доставен от производителя, и в присъствието на 300 μΜ dNTP, 10 % глицерол, 200 pmol от всеки праймер, 0.1 pg матрица и 2.5 единици ензим, в краен обем 100 μΐ, чрез използване на Perkin-Elmer Cetus PCR апарат. Температурният профил на всеки цикъл е 95 ⁰ С за 5 минути (стъпка на денатурация), 60⁰ С за 2 минути (стъпка на хибридицация) и 72 ⁰ С за 2 минути (стъпка на елонгация). Следващите 24 цикъла имат подобен температурен профил, с изключение на стъпката на денатурация, която е скъсена до 45 секунди и стъпката на хибридизация скъсена до 1 минута.

PCR продуктът се разделя чрез електрофореза в 1 % агарозен гел и се детектира като единична ДНК ивица с размери ~ 1.2 кВ. Тази ДНК се пречиства от гела и се подлага на лигазна реакция с 25 ng от линеализиран pCR-Blunt вектор (Invitrogen) в моларно съотношение между вектора и “insert”-a 1:10, следвайки инструкциите на

производителя. Лигазната смес се използва за трансформация на One Shot™ Е.coli компетентни клетки (Invitrogen), следвайки инструкциите на производителя. Плазмидната ДНК се изолира от ампицилин резистентните трансформанти и присъствието на ~ 1.2 kB “insert” се потвърждава от рестриктазен анализ. Този плазмид се означава, като pSE179.

ДНК “insert’’-ът от pSE179 е изолиран, чрез рязане с Ват Hl/Xba I, разделен е електрофоретично, пречистен е от тела и е подложен на лигазна реакция с “shuttle” вектора pWHM3, който е линеализиран в местата Bam Hl/Xba I, като крайната концентрация на ДНК при лигазната реакция е 1 pg, а моларните съотношения “insert”вектор са 1:5. Лигазната смес се използва за трансформация на компетентни E.coli DH5a клетки, съгласно инструкциите на производителя. Плазмидната ДНК е изолирана от ампицилин резистентните трансформанти и наличието на 1.2 Kb “insert” се потвърждава чрез рестриктазен анализ. Този плазмид, означен като pSE 186 (ФИГУРА 2, АТСС 209604) е трансформиран в E.coli DM1 и плазмидната ДНК се изолира от ампицилин резистентните трансформанти.

7.2. РЕЗУЛТАТИ

2.9 Kb SacI/BamHl фрагмент от pSEl 19 е идентифициран, когато е транформиран в S.avermitlis щам 1100-SC38 по това че значително променя съотношението В2:В1 на получените авермектини.

S.avermitlis щам 1100-SC38 нормално продуцира В2:В1 в съотношение около 30 : 1, но когато е транформиран с вектор, вкючващ 2.9 Kb SacI/

BamHl фрагмент, съотношение на авермектините В2:В1 намалява до ·· »···

Λ Λ λ λ λ λ

3.7:1. Пост-ферментационен анализ на транформираните култури потвърждава присъствието на трансформирана ДНК.

Фрагментът с размери 2.9 КЬ на pSEl 19 е секвениран и е идентифицирана ORF, която е ~ 0.9 КЬ (ФИГУРА 1)(SEQ ID N0:1), която обхваща фрагмента Pstl/SphI който е предварително мутирал, на такова място, че да води само до продукцията на В2 продукти (Ikeda et al., 1995, по-горе). Сравняването на ORF или на съответстващ на него производен полипептид с известни такива от базата данни (GenEMBL, SWISS-PROT) не показва никаква значителна хомоложност с известните ДНК-ови или белтъчни последователността.

ТАБЛИЦА 2 показва анализа на ферментацията на S.avermillis щам 1100-SC38, транформиран с различни плазмиди.

ТАБЛИЦА 2

S.averniitiis щам (трансформиран с плазмиди)	Брой на проверените трансформанти	Средно съотношение В2:В1
1100-SC38 (нетрансформиран)	9	30.66
1100-SC38 (pWHM3)	21	31.3
1100-SC38 (pSEl 19)	12	3.7
1100-SC38 (pSEl 18)	12	30.4
1100-SC38 (pSE185)	14	27.9

·· ··♦· ·«··

• · ·· ·· ····

8. ПРИМЕР ЗА ИЗПЪЛНЕНИЕ НА ИЗОБРЕТЕНИЕТО : КОНСТРУИРАНЕ

НА AveC МУТАНТИ НА S.A VERMITILIS

Този пример описва конструирането на няколко различни AveC мутанта на S.avermitlis, чрез използване на състави и методи описани по-горе. Общото описание на техниките за въвеждане на мутации в ген на Slreplomyces са описани от Keiser и Hopwood, 1991, Meth. Enzym. 204:430-458. По-подробно описание е осигурено от Anzai et al., 1988, J.Antibiot. XLI(2):226-233 и от Stutzman-Engwall et al., 1992, J.Bacteriol. 174 (1):144-154. Тези справки са включени като цяло тук в литературната справка.

8.1. ПНАКТИВИРАНЕ НА AveC ГЕНА НА S. AVERMITHJS.

Конструирани са AveC мутанти, носещи инактивирани aveC гени, чрез използване на няколко метода, описани по-долу.

В първия метод, Sphl/PstI фрагментът с големина 640 нд, който е в областта на aveC гена на pSEl 19 (плазмид описан в Глава 7.1.9., по-горе) се замества с ЕппЕ гена (отговарящ за резистентност към еритромицин) на Sacc. erythraea. ЕппЕ генът е изолиран от pIJ4026 (доставен от John Innes Institute, Norwich, U.K; виж също Bibb et. al., 1985, Gene 41:357-368), чрез рестриктазно рязане c Bglll и EcoRI, последвано от електрофореза, след което е пречистен от гела. Този фрагмент, с размери - 1.7 КЬ е положен на лигазна реакция с pGEM72f (Promega), който е линеализиран с Bam Н1 и Eco R1 и местата и продуктът на лигазната реакция е трансформиран в компетентни клетки на E.coli DH5a, съгласно инструкциите на производителя. Плазмидната ДНК е изолирана от ампицилин резистентните трансформанти и ·· ····

присъствието на-1.7 Kb “insert” се потвърждава с рестриктазен анализ. Този плазмид се означава като pSE27.

pSEl 18 (описан в Глава 7.1.9, по-горе) е подложен на рязане с SphI и Bam Н1, продуктите на рязането се разделят електрофоретично и “insert’’-ът с размери - 2.8 Kb Sphl/Bam Hl е изолиран от гела. pSEl 19 е подложен на рязане с PstI и Eco RI, продуктите на рязането се разделят електрофоретично и “insert’’-ъг с размери - 1.5 Kb Pstl/Eco RI е изолиран от гела. “Shuttle” векторът pWHM3 е линеализиран с Bam Н1 и Eco RI. pSE27 е подложен на рязане с PstI и SphI, продуктите на рязане се разделят електрофоретично и “insert’’-ът с размери -1.7 Kb Pstl/SphI е изолиран от гела. И четирите фрагмента (т.е. тези с размери - 2.8 КЬ, 1.5 КЬ, - 7.2 КЬ и -1.7 КЬ) се подлагат на лигазна реакци за свързване на четири фрагмента. Продукът на лигазната реакция се трансформира в компетентни клетки на Е.coli DH5a, следвайки инструкциите на производителя. Плазмидната ДНК се изолира от ампицилин резистентните трансформанти и присъствието на правилно ориентиран “insert” се потвърждава от рестриктазен анализ. Този плазмид е означен с pSEl80 (ФИГУРА 3; АТСС 209605).

pSEI80 се трансформира в S.lividans ТК64 и трансформираните колонии се идентифицират на база на тяхната резистентност към тиострептон и еритромицин. pSE180 е изолиран от S.lividans и се използва за трансформация на протопласти на 8. avermitilis. Четири тиострептон резистентни трансформанта на 8. avermitilis са идентифицирани и протопластите са приготвени като посявка в RM 14 среда при неселективни условия. След като се образуват, протопластиите единични колонии са скринирани за наличието на резистентност към еритромицин и отсъствието на резистентност към тиострептон, което показва интегрирането на инактивирания aveC ген в хромозомата и загубата на свободен ·· ····

репликон. Един Erm^rThio^s трансформант е идентифициран и означен като щам SE180-11. Тоталната хромозомна ДНК се изолира от щам SE180-11, подлага се на рестриктазно рязане с ензимите Bam Hl, Hind III, PstI, или SphI, след което продуктите на рязането се разделят електрофоретично в 0.8 % агарозен гел, прехвърлят се върху найлонови мембрани и се подлагат на хибридизация с ermE сонда. Тези анализи показват, че интегрирането на ermE гена за резистентност и съпътстващата делеция на фрагмент Pstl/SphI с размери 640 нд са се появили в резултат на двойно прекръстосване. HPLC анализът на продуктите на ферментацията на щам SE180-11 показва, че нормалните авермектини повече не се получават (ФИГУРА 5А).

Във втори метод за инактивиране на aveC гена, 1.7 Kb ermE ген е отстранен от хромозомата на S.avermitilis щам SE180-11, оставяйки делецията на фрагмента Pstl/SphI с размери 640 нд в aveC гена Конструиран е плазмид за заместване на гени, както следва: pSE 180 се подлага на частично рестриктазно рязане с Xba I и фрагментът с размери ~ 11.4 КЬ се изолира от гела. В този ~ 11.4 КЬ фрагмент липсва генът за резистентност ermE, който е с размери 1.7 КЬ. След това ДНК се подлага на лигазна реакция и се трансформира в компетентни клетки на E.coli DH5a. Плазмидната ДНК се изолира от ампицилин резистентните трансформанти и присъствието на правилен “insert” се потвърждава от рестриктазния анализ. Този плазмид, който се означава като pSE184, се трансформира в E.coli DM1 компетентни клетки, и плазмидната ДНК се изолира от ампицилин резистентните трансформанти. Този плазмид се използва за трансформация на протопласти на S.avermitilis щам SE180-11. Протопластите се приготвят от тиострептон резистентните трансформанти на щам SE180-11 като посявка, като единични колонии в RM 14 среда. След като се образуват, протопластните единични колонии са скринирани за отсъствието на

резистентност към еритромицин и отсъствието на резистентност към тиострептон, което показва интегрирането на инактивирания aveC ген в хромозомата и загубата на свободния репликон, носещ ErmE гена. Един Erm^sThio^s трансформант е идентифициран и означен като щам SE184-1-

13. Анализът на ферментацията на щам SE184-1-13, показва, че нормалните авермектини не се получават и че SE184-1-13 има същия профил на ферментация, както като SE180-11.

В трети метод за инактивиране на aveC гена, в хромозомалния aveC ген се въвежда променена рамка на четене, чрез добавяне на два Гуанина (Gs) след Цитозина (С) в нуклеотиден тип (нт) позиция 471, чрез използване на PCR, като по този начин се създава ново BspEl място. Присъствието на конструираното BspEl място се използва за насочването на генното заместване. PCR праймерите са доставени от Genosys Biotechnologies, Inc. Праймерът за четене от дясно наляво (5’-3’) е: 5’-GGTTCCGGATGCCGTTCTCG-3’ (SEQ ID N0:8) и праймерът за четене отляво надясно (3’-5’) е 5’AACTCCGGTCGACTCCCCTTC-3’(SEQ ID N0:9). Условията на PCR са описани в Глава 7.1.10 по-горе. PCR продуктът с размери 666 н.д. се подлага на рязане с SphI за да се получат два фрагмента с размери 278 нд и съответно 388 нд. Фрагментът с размери 388 нд се изолира от гела.

Плазмидът за заместване на гени е конструиран, както следва: “shuttle” векторът pWHM3 се линеализира с EcoRl и Bam Н1. pSE 119 се подлага на рязане с Ват Н1 и SphI, продуктите на рязането се разделят електрофоретично и фрагментът от 840 нд се пречиства от гела. pSE119 се подлага на рязане с Eco RI и XmnI, продуктите на рязане се разделят електрофоретично и - 1,7КЬ фрагмент се изолира от гела. И четирите фрагмента (т.е. - 7.2 КЬ, -840 нд, -1.7 КЬ и -388 нд) се подлагат на лигазна реакци за свързване на четири фрагмента. Лигазната смес се трансформира в компетентни клетки на E.coli DH5a.

·· • е

Плазмидната ДНК се изолира от ампицилин резистентните трансформанти и присъствието на правилно ориентиран “insert” се потвърждава от рестриктазен анализ и анализ чрез ДНК секвениране. Този плазмид, който е означен като pSEl 85 се трансформира в E.coli DM1 компетентни клетки, и плазмидната ДНК се изолира от ампицилин резистентните трансформанти. Този плазмид се използва за трансформация на протопласти на S.avermitilis щам 1100-SC38. Тиострептон резистентните трансформанти на щам 1100-SC38 се изолират и се анализират, чрез HPLC анализ на продуктите на ферментацията. pSE185 не променя значително съотношенията В2:В1 на авермектините, когато е трансформиран в S.avermetilis щам 1100SC38 (ТАБЛИЦА 2).

pSEl 85 се използва за трансформиране на протопласти на S.avermitilis, с цел съсздаването на мутация, която променя рамката на четене на aveC гена в хромозомата. Протопластите се приготвят от тиострептон резистентните трансформанти като посявка, като единични колонии в RM 14 среда. След образуването им, протопластните единични колонии се скринират за отсъствието на резистентност към тиострептон. Храмозомната ДНК от тиострептон чувствителните колонии се изолира и се скринира чрез PCR за присъствието на мутация, която води до промяна на рамката на четене, интегрирана в хромозомата. PCR праймерите са приготвени на базата на aveC нукелотидната последователност, и са доставени от Genosys Biotechnologies, Inc. (Texas). Праймерът за четене отдясно наляво (5’-3’) е 5’- GCAAGGATACGGGGACTAC-3’ (SEQ ID N0:10) и праймерът за четене отляво надясно (3’-5’) е 5’-GAACCGACCGCCTGATAC -3’(SEQ ID N0:11), като условията на PCR са описани в Глава 7.1.10 по-горе. Полученият PCR продукт е с размери 543 нд и при рязане с BspEl се получават три фрагмента с размери 368 нд, 96 нд и 79 нд., което показва • · · · · · • · · · · · • · • · $6 •·· ·· ·· интегриране на инактивирания aveC ген в хромозомата и загуба на трите репл икона.

Анализа на ферментацията на мутанти на S.avermitilis, носещи мутация, която променя рамката на четене в aveC гена, показва че нормалните авермектини вече не се получават и че тези мутанти имат същия HPLC профил, като щамовете SE180-11 и SE184-1-13. Един Thio^s трансформант е идентифициран и означен, като щам SE185-5a.

В допълнение, създадена е мутация в aveC гена, която променя нт позиция 520 от G в А, което води до промяна на кодона кодиращ триптофан (W) в позиция 116 в кодон за терминация. Щам на S.avermitilis, който носи тази мутация не продуцира нормални авермектини и има същия профил на ферментация, като този на щамовете SEI 80-11, SE184-1-13 и SE 185-5а.

В допълнение, мутациите в AveC гена, които променят: (i) нт

позиция 970 от G в А, която променя аминокиселинната позиция 266 от глицин (G) в аспартат (D) и (й) нт позиция 996 от Т в С, която променя аминокиселинна позиция 275 от тирозин (Y) в хистидин (Н). Щам на S.avermitlis с тези мутации (G256D/Y275H) не продуцира нормални авермектини и има същия профил на ферментация като щамове SE 18011, SE 184-1-13 SE и SE 185-5а.

Мутантите на щамове на S.avermitlis щамове, с инактивиран aveC - SE 180-11, SE 184-1-13 SE и 185-185-5a и други осигурени тук, осигуряват скрининг пособия за изследване на влиянието на други мутации в aveC гена. pSE 186, който съдържа копие от дивия тип aveC ген, е трансформиран в E.coli DM1 и плазмидната ДНК е изолирана от ампицилин резистентните трансформанти. Тази pSE 186 ДНК се използва за трансформиране на протопласти на S.avermitlis щам SE 180-

11. Тиострептон резистентните трансформанти на протопластите на щам SE 180-11 са изолирани, и се определя наличието на резистентност • · ···· · I·· • · · · · · • · · · · 9 9 · ·· • · · ·ϊτ/ · · · · ·· ·· ··· 99 99 999999 към еритромицин, и Thio^r Erm^r трансформантите се анализират чрез HPLC анализ на продуктите на ферментацията. Наличието на функционален aveC ген в трансформантите дава възможност за възстановяване на нормалната авермектинова продукцията от щам SE 180-11 (ФИГУРА 5В).

8.2. АНАЛИЗ НА МУТАЦИИТЕ В aveC ГЕНА, КОИТО ПРОМЕНЯТ СЪОТНОШЕНИЯТА КЛАС В2:В1

Както е описано по-горе, S.avermitlis щам SE 180-11 съдържа инактивиран aveC ген, който се допълва чрез трансформация с плазмид съдържащ функционален aveC ген (pSEl 86). Щамът SE 180-11 също е пригоден като щам-гостоприемник за характеризиране на други мутации в aveC гена, както е описано по-долу.

Хромозомната ДНК е изолирана от щам 1100-SC38 и използвана като матрица за PCR амплификация на aveC гена. 1.2 КЬ ORF е изолирана, чрез PCR амплификация, чрез използване на праймери, създадени на базата на за aveC нуклеотидната последователност. Праймерът за четене отдясно на ляво (5’-3’) е SEQ ID N0:6 ипраймерътза четене отляво на дясно (3’-5’) е SEQ ID N0:7 (виж Глава 7.1.10 по-горе). Условията за PCR и субклонирането са описани в Глава 7.1.10. Анализът чрез ДНК секвениране на 1.2 Kb ORF показва мутация в aveC гена, която променя нуклеотиден тип позиция 337 от С в Т, което води до промяна в аминокиселинна позиция 55 от серин (S) във фенилаланин (F). AveC гена, съдържащ S55F мутацията е субклониран в pWHM3 с цел създаване на плазмид, който е означен като pSE187 и който се използва за трансформация на протопласти на S.avermitlis щам SE 180-11. Тиострептон резистентните трансформанти на протопластите на щам SE 180-11 са изолирани, и се определя наличието на • · · · · · • · · · · · • ·

резистентност към еритромицин, и Thio^r Erm^r трансформантите се анализират чрез HPLC анализ на продуктите на ферментацията. Наличието на aveC ген, кодиращ промяната в аминокиселиннйя остатък 55 (S55F) дава възможност да се възстанови нормалната авермектинова продукция на щам SE 180-11 (Фиг. 5С); обаче съотношението между циююхексил В2 : циклохексил В1 е около 26:1, в сравнение със щам SE 180-11, трансформиран с pSE186, при който съотношението В2:В1 е около 1.6:6 (ТАБЛИЦА 3), което показва че единичната мутация (S55F) модулира количеството на циклохексил-В2 отнесено към количеството на циклохексил-В 1.

Друга мутация в aveC гена е идентифицирана, че променя нуклеотиден тип позиция 862 от G в А, като това променя аминокиселината в позиция 230 от глицин (G) в аспартат (D). S.avermitlis щам, който има тази мутация (G230D) продуцира авермектини със съотношение В2:В1 около 30:1.

8.3. МУТАЦИИ, КОИТО РЕДУЦИРАТ СЪОТНОШЕНИЕТО В2:В1

Конструирани са няколко мутации, които редуцират количеството на циклохексил-В2 отнесено към количеството на циююхексил-В1, както следва.

Мутация в aveC гена е идентифицирана, че променя нуклеотиден тип в позиция 588 от G в А, като тази промяна води до заместване на аминокиселината в позиция 139 от аланин (А) в треонин (Т). AveC генът, който съдържа мутацията А139Т е субклониран в pWHM3, за да се създаде плазмид, който е означен като pSEl 88 и който се използва за трансформация на S.avermitlis щам SE 180-11. Тиострептон резистентните трансформанти на щам SE 180-11 са изолирани, и се определя наличието на резистентност към еритромицин, • · · · · · • « · · · · • ·

и Thio^r Erm^r трансформантите се анализират чрез HPLC анализ на продуктите на ферментацията. Наличието на мутирал aveC ген, кодиращ промяната в аминнокиселинния остатък 139 (А139Т) дава възможност да се възстанови нормалната авермектинова продукция от щам SE 180-11 (Фиг. 5D); обаче съотношението между В2 : В1 е около 0.94:1, показващо че единичната мутация (А139Т) редуцира количеството на циклохексил-В2 отнесено към количеството на циклохексил-В 1. Този резултат е неочакван, тъй като публикуваните резултати, както и резултатите за мутациите описани по-горе показват само инактивиране на aveC гена или увеличена продукция на авермектин В2 отнесена към В1 формата (ТАБЛИЦА 3).

Тъй като мутацията А139Т променя съотношенията В2:В1 в по-благоприятна за В1 посока, конструирана е мутация, която кодира треонин вместо серин в аминокиселинна позиция 138. Така pSE186 е подложен на рязане с EcoRI и е клониран в pGEM3Zf (Promega) който е линеализиран с EcoRI. Този плазмид, означен като pSE186a, е подложен на рязане с Apal и ΚρηΙ, получените ДНК фрагменти са разделени в агарозен гел и двата фрагмента с размери ~ 3.8 КЬ и от ~ 0.4 КЬ са изолирани от гела. Фрагментът с размер ~ 1.2 КЬ, въведен като ДНК от pSE186 се използва за PCR матрица, за въвеждане на единична базова промяна в нуклеотиден тип позиция 585. PCR праймерите са създадени да въведат мутация в нуклеотиден тип позиция 585 и са доставени от Genosys Biotechnologies, Inc. (Texas). Праймера за четене отдясно на ляво (5’-3’) праймерът е: 5’GGGGGCGGGCCCGGGTGCGGAGGCGGAAATGCCCCTGGCGACG 3’ (SEQ ID N0:12); и праймерът за четене отляво на дясно (3’-5’) е 5’GGAACCGACCGCCTGATACA -3’ (SEQ ID N0:13). PCR реакцията се осъществява чрез използването на Advantage GC genomic PCR кит (Clontech Laboratories, Palo Alto, СА) в буфер, доставен от • · · · · · • · · · · · * ·

производителя, и в присъствието на 200 μΜ dNTPs, 200 pmol от всеки праймер, 50 ng ДНК матрица, 1.0М GC-Melt и 1 единица Klen Taq полимеразна смес, в краен обем 50 μΐ. Температурния профил на първия цикъл е 94 ⁰ С за 1 минута, следван от 25 цикъла на 94 ⁰ С за 30 секунди и 68 ⁰ С за 2 минути и един цикъл 68 ⁰ С за 3 минути. PCR продукта с размери 295 нд се подлага на рязане с Apal и ΚρηΙ, за да се получи фрагмент с размери 254 нд, който се разделя чрез електрофореза и се пречиства от гела. Всичките три фрагмента (~3.8 КЬ, - 0.4 КЬ и 254 нд) се подлагат на лигазна реакция за свързване на три фрагмента. Продуктът на лигазната реакция се трансформира в компетентни E.coli DH5a клетки. Плазм идната ДНК се изолира от ампицилин резистентните трансформанти и наличието на правилен “insert” се потвърждава от рестриктазен анализ. Този плазмид се означава като pSE198.

pSE 198 се подлага на рязане с Eco R1, и е кпониран в pWHM3, който е линеализиран с Eco R1 и е трансформиран в клетки на E.coli DH5a. Плазмидната ДНК се изолира от ампицилин резистентните трансформанти и наличието на правилен “insert” се потвърждава от рестриктазен анализ и анализ чрез ДНК секвениране. Плазмидната ДНК се трансформира в E.coli DMI, плазмидната ДНК се изолира от ампицилин резистентните трансформанти и наличието на правилен “inserf’ce потвърждава от рестриктазен анализ. Плазмидът означен като pSEl99 се използва за трансформиране на протопласти на S.avermitlis щам SE 180-11. Тиострептон резистентните трансформанти на щам SE 180-11 са изолирани, и се определя наличието на резистентност към еритромицин, и Thio^r Епп^г трансформантите се анализират чрез HPLC анализ на продуктите на ферментацията. Наличието на мутирал aveC ген, кодиращ промяната в аминнокиселинния остатък 138 (S138T) дава възможност да се възстанови нормалната авермектинова продукция от • · · · · · • · · · · ·

щам SE 180-11; обаче съотношението между В2 : В1 е около 0.88:1, показващо че единичната мутация (S138T) редуцира количеството на получения циклохексил-В2 отнесено към количеството на циклохексил-В1 (ТАБЛИЦА 3). Това съотношение В2:В1 е даже още по-ниско от съотношението 0.94:1, което се наблюдава при мутацията А139Т, създадена от трансформацията на щам SE 180-11 с pSE188, както е описано по-горе.

Друга мутация е конструирана за едновременното въвеждане на треонин в двете аминокиселинни позиции 138 и 139. “Insert’’-ът с размери 1.2 КЬ от ДНК на pSE186 се използва за PCR матрица. PCR праймерите са създадени да въведат мутации в нуклеотиден тип позиции 585 и 588 и са доставени от Genosys Biotechnologies, Inc. (Texas). Праймерът за четене отдясно на ляво (5’-3’) е: 5’GGGGGCGGGCCCGGGTGCGGAGGCGGAAATGCCGCTGGCGACGA СС -3’ (SEQ ID N0:14); и праймерът за четене отляво на дясно (3’-5’) е 5’-GGAACATCACGGCATTCACC -3’ (SEQ ID ΝΟ.Ί5). PCR реакцията се осъществява при условия, описани непосредствено по-горе в тази Глава. PCR продукта, получен като от 449 нд се подлага на рязане с Apal и ΚρηΙ, за да се освободи фрагмент с размери 254 нд, който се разделя чрез електрофореза и се изолира от гела. pSE186a, след което се подлага на рязане с Apal и ΚρηΙ, ДНК фрагментите се разделят в агарозен гел и двата фрагмента с размери ~ 3.8 КЬ и ~ 0.4 КЬ се изолират от гела. Всичките три фрагмента (~3.8 КЬ,~ 0.4 КЬ и 254 КЬ) се подлагат на лигазна реакция за свързване на три фрагмента и продуктът от лигазната реакция се трансформира в компетентни клетки на E.coli DH5a. Плазмидната ДНК се изолира от ампицилин резистентните трансформанти и наличието на правилен “insert” се • · · · · · • · · · · ·

потвърждава от рестриктазния анализ. Плазмидът се означава като pSE230.

pSE23O се подлага на рязане с Eco R1, и е клониран в pWHM3, който е линеализиран с Eco R1 и е трансформиран в клетки на E.coli DH5a. Плазмидната ДНК се изолира от ампицилин резистентните трансформанти и наличието на правилен “insert” се потвърждава от рестриктазния анализ и анализ чрез ДНК секвениране. Плазмидната ДНК се трансформира в E.coli DM1, плазмидната ДНК се изолира от ампицилин резистентните трансформанти, и наличието на правилен “insert” се потвърждава от рестриктазния анализ. Плазмидът означен като pSE231 се използва за трансформиране на протопласти на S.avermitlis щам SE 180-11. Тиострептон резистентните трансформанти на щам SE 180-11 са изолирани, и се определя наличието на резистентност към еритромицин, и Thio^r Епп^г трансформантите се анализират за продукти на ферментацията. Наличието на двойно мутирал aveC ген, кодиращ S138T/A139T дава възможност да се възстанови нормалната авермектинова продукция от щам SE 180-11; обаче съотношението между В2 : В1 е 0.84:1, показващо че тази мутация по-нататък редуцира количеството на получения циклохексилВ2 отнесено към количеството на циклохексил-В1 (ТАБЛИЦА 3) още повече от редукциите осигурени от трансформирания с pSE188 или pSE189 щам SE 180-11 с, които са описани по-горе.

Друга мутация е конструирана по-нататък да редуцира съотношението на циклохексил-В2 отнесено към количеството на циклохексил-В 1. Тъй като мутациите S138T/A139T променят съотношенията В2:В1 в още по-благоприятна за В1 посока, конструирана е мутация за въвеждане на треонин в позиция 138 и фенилаланин в позиция 139. “Insert’’-ът с размери ~ 1.2 КЬ от pSEl86 се използва за PCR матрица. PCR праймерите са създадени да въведат ·· ···· ·· ···· мутации в нуклеотиден тип позиции 585 (променяща Т в А), 588 (променяща G в Т) и 589 позиция (променяща С в Т) и са доставени от Genosys Biotechnologies, Inc. (Texas). Праймерът за четене отдясно на ляво (5’-3’) е: 5’GGGGGCGGGCCCGGGTGCGGAGGCGGAAATGCCGCTGGCGACGT ТС -3’ (SEQ ID N0:25); и праймерът за четене отляво на дясно (3’-5’) е 5’-GGAACATCACGGCATTCACC -3’ (SEQ ID N0:15). PCR реакцията се осъществява чрез използването на Advantage GC genomic PCR кит (Clontech Laboratories, Palo Alto, СА) в буфер, доставен от производителя, и в присъствието на 200 μΜ dNTPs, 200 pmol от всеки праймер, 50 ng ДНК матрица, 1.1 mM Mg ацетат, l.OM GC-Melt и 1 единица Tth ДНК Полимераза в краен обем 50 μΐ. Температурния профил на първия цикъл е 94 ⁰ С за 1 минута, следван от 25 цикъла от 94 ⁰ С за 30 секунди и 68 ⁰ С за 2 минути и един цикъл 68 ⁰ С за 3 минути. PCR продукта с размери 449 нд се подлага на рязане с Apal и ΚρηΙ, за да се освободи 254 нд фрагмент, който се изолира чрез електрофореза и се пречиства от гела. Всичките три фрагмента (~ 3.8 КЬ, ~ 0.4 КЬ и 254 нд) се подлагат на лигазна реакция за свързване на три фрагмента. Продуктът на лигазната реакция се трансформира в компетентни E.coli DH5a клетки. Плазмидната ДНК се изолира от ампицилин резистентните трансформанти и наличието на правилен “insert”ce потвърждава от рестриктазния анализ. Този плазмид се означава като pSE238.

pSE238 се подлага на рязане с Eco R1, и е клониран в pWHM3, който е линеализиран с Eco R1 и е трансформиран в клетки на E.coli DH5a. Плазмидната ДНК се изолира от ампицилин резистентните трансформанти и наличието на правилен “insert” се потвърждава от рестриктазния анализ и анализ чрез ДНК секвениране. Плазмидната ДНК се трансформира в E.coli DM1, плазмидната ДНК се изолира от • ·

·· ··· ·· ·· ·· ···· ампицилин резистентните трансформанти и наличието на правилен “insert” се потвърждава от рестриктазния анализ. Плазмидът означен като pSE239 се използва за трансформиране на протопласти на S.avermitlis щам SE 180-11. Тиострептон резистентните трансформанти на щам SE 180-11 са изолирани, и се определя наличието на резистентност към еритромицин, и Thio^r Erm^r трансформантите се анализират чрез HPLC анализ на продуктите на ферментацията. Наличието на двойно мутирал aveC ген, кодиращ S138T/A139F дава възможност да се възстанови нормалната авермектинова продукция на щам SE 180-11; обаче съотношението между В2 : В1 е 0.75:1, показващо че тази мутация по-нататък редуцира количеството на получения циклохексил-В2 отнесено към количеството на циклохексил-В1 (ТАБЛИЦА 3) още повече от редукциите осигурени от трансформациите с pSEl88 или pSE199, pSE231 на щам SE 180-11 с, които са описани по-горе.

ТАБЛИЦА 3

S.avermitlis щам	Брой на	Относит.	Относит.	Средно
(трансформиран с	проверените	конц. на	конц. на	съотношение
плазмиди)	трансформанти	В2	В1	В2:В1
SE180-11
(нетрансформиран)	30	0	0	0
SE18O-11 (pWHM3)	30	0	0	0
SE18O-11 (pSE186)	26	222	140	1.59
SEI 80-11 (pSE187)	12	283	11	26.3
SEI 80-11 (pSE188)	24	193	206	0.94
SEI 80-11 (pSE199)	18	155	171	0.88
SEI 80-11 (pSE231)	6	259	309	0.84
SEI 80-11 (pSE239)	20	184	242	0.75

• · · · ♦ · ·· ·»··

Допълнителни мутации са конструирани, които по-нататък да редуцират количеството на циклохексил-В2 отнесено към количеството на циклохексил-Bl, чрез използване на техники за ДНК пренасяне, както е описано в Stemmer, 1994, Nature 370:389-391; и Stemmer, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:10747-10751; и по-нататък е описано в United States Патенти 5605793, 5811238, 5830721, и 5837458.

ДНК пренасящи плазмиди, носещи мутирали aveC гени са трансформирани в компетентни dam dem E.coli клетки. Плазмидната ДНК е изолирана от ампицилин резистентните трансформанти и се използва за трансформиране на протопласти на S.averniitlis щам SE 180-

11. Тиострептон резистентните трансформанти на щам SE 180-11 са изолирани и скринирани дали съотношението на получените авермектини циклохексил-В2 : циклохексил-В 1 е 1:1 или по-малко. Определена е ДНК последователността на плазмида от трансформантите на SE180-11, продуциращи авермектини със съотношение В2:В1 1:1 или по-малко.

Осем трансформанта, са идентифицирани че продуцират на циклохексил-В 1. Най-ниското В2:В1 редуцирани количества на циклохексил-В2 отнесено към количеството съотношение, постигнато измежду тези трансформанти е 0.4:1 (ТАБЛИЦА 4). Плазмидната ДНК е изолирана от всеки от осемте трансформанта и ДНК последователността е определена чрез идентичността на мутациите в aveC гена. Мутациите са както следва.

pSE290 съдържа 4 нуклеотидни мутации в нуклеотиден тип позиция 317 в който е станала промяна от Т в А, в нуклеотиден тип позиция 353 в която е станала промяна от С в А, в нуклеотиден тип позиция 438 в която е станала промяна от G в А и в нуклеотиден тип позиция 1155, в която е станала промяна от Т в А. Нуклеотидните ·· ···· • · • ··· ·· ····

промени в нуклеотиден тип позиция 317, променят аминокиселината в АК позиция 48 от D в Е и нуклеотидните промени в нуклеотидния тип позиция 438, променя АК позиция 89 от А в Т. Съотношението В2:В1 получено от клетки, носещи този плазмид е 0.42:1 (ТАБЛИЦА 4).

pSE291 съдържа 4 нуклеотидни мутации в нуклеотиден тип позиция 272 в който е станала промяна от G в А, в нуклеотиден тип позиция 585 в която е станала промяна от Т в А, в нуклеотиден тип позиция 588 в която е станала промяна от G в А и в нуклеотиден тип позиция 708, в която е станала промяна от G в А. Нуклеотидните промени в нуклеотиден тип тип позиция 585, променят аминокиселината в АК позиция 138 от S в Т и нуклеотидните промени в нуклеотидния тип позиция 588, променая АК позиция 139 от А в Т и нуклеотидните промени в нуклеотиден тип позиция 708, променя АК позиция 179 от G в S.. Съотношението В2:В1 получено от клетки, носещи този плазмид е 0.57:1 (ТАБЛИЦА 4).

pSE292 съдържа същите четири нуклеотидни мутации, като pSE290. Съотношението В2:В1 получени от клетки, носещи този плазмид е 0.40:1 (ТАБЛИЦА 4).

pSE293 съдържа 6 нуклеотидни мутации в нуклеотиден тип позиция 24 в който е станала промяна от А в G, в нуклеотиден тип позиция 580, в която е станала промяна от Т в С, в тип позиция 282 в която е станала промяна от А в С, в нуклеотиден тип позиция 497 в която е станала промяна от С в Т, в нуклеотиден нуклеотиден тип позиция 886, в която е станала промяна от А в Т. Нуклеотидните промени в нуклеотиден тип позиция 286, променят аминокиселината в АК промяна от Т в С, в нуклеотиден тип позиция 554, в която е станала позиция 38 от Q в Р и нуклеотидните промени в нуклеотидния тип позиция 580, променая АК позиция 136 от L в Р и нуклеотидните промени в нуклеотиден тип позиция 886, променя АК позиция 238 от Е • ft »··· • · • ··· ·· ft··· • ft ft ft ft • ft ft ft ft ft ft ft ft • · · ft*7· · · · · · · • · · 7/· · · · · · · ·· ··· ·· ·· ·« ·«·· в D. Съотношението B2:B1 получени от клетки, носещи този плазмид е 0.68:1 (ТАБЛИЦА 4).

pSE294 съдържа 6 нуклеотидни мутации в нуклеотиден тип позиция 469 в който е станала промяна от Т в С, в нуклеотиден тип позиция 585 в която е станала промяна от Т в А, в нуклеотиден тип позиция 588 в която е станала промяна от G в А, в нуклеотиден тип позиция 708, в която е станала промяна от G в А, в нуклеотиден тип позиция 833, в която е станала промяна от С в Т, в нуклеотиден тип в нуклеотиден тип позиция 469, променят позиция 1184, в която е станала промяна от G в А. Нуклеотидните промени аминокиселината в АК позиция 99 от F в S и нуклеотидните промени в нуклеотидния тип позиция 585, променая АК 588, променя АК позиция 139 от А в Т и нуклеотидните промени позиция 138 от S в Т и нуклеотидните промени в нуклеотиден тип позиция в нуклеотиден тип позиция 708, променя АК позиция 179 от G в S. Съотношението В2:В1 получени от клетки, носещи този плазмид е 0.53:1 (ТАБЛИЦА 4).

pSE295 съдържа 2 нуклеотидни мутации в нуклеотиден тип позиция 588 в който е станала промяна от G в А и в нуклеотиден тип позиция 856 в която е станала промяна от Т в С. Нуклеотидните промени в нуклеотиден тип позиция 588, променят аминокиселината в АК позиция 139 от А в Т и нуклеотидните промени в нуклеотидния тип позиция 856, променая АК позиция 228 от М в Т. Съотношението В2:В1 получени от клетки, носещи този плазмид е 0.80:1 (ТАБЛИЦА 4).

pSE296 съдържа 5 нуклеотидни мутации в нуклеотиден тип позиция 155 в който е станала промяна от Т в С, в нуклеотиден тип позиция 505 в която е станала промяна от G в Т, в нуклеотиден тип позиция 1039 в която е станала промяна от С в Т, в нуклеотиден тип позиция 1202, в която е станала промяна от С в Т, в нуклеотиден тип позиция 1210, в която е станала промяна от Т в С. Нуклеотидните

• · · ·

• · · · · · промени в нуклеотиден тип позиция 505, променят аминокиселината в АК позиция 111 от G в V и нуклеотидните промени в нуклеотидиия тип позиция 1039, променая АК позиция 289 от Р в L. Съотношението В2:В1 получени от клетки, носещи този плазмид е 0.73:1 (ТАБЛИЦА 4).

pSE297 съдържа 4 нуклеотидни мутации в нуклеотиден тип позиция 377 в който е станала промяна от G в Т, в нуклеотиден тип позиция 588 в която е станала промяна от G в А, в нуклеотиден тип позиция 633 в която е станала промяна от А в G, в нуклеотиден тип позиция 1067, в която е станала промяна от А в Т. Нуклеотидните промени в нуклеотиден тип позиция 588, променя АК позиция 139 от А в Т, нуклеотидните промени в нуклеотиден тип позиция 633, променя АК позиция 154 от К в Е и нуклеотидните промени в нуклеотиден тип позиция 1067, променя АК позиция 298 от Q в Н. Съотношението В2:В1 получени от клетки, носещи този плазмид е 0.67:1 (ТАБЛИЦА 4).

ТАБЛИЦА 4

S.avermillis щам	Брой на	Относит.	Относит.	Средно
(трансформиран с	проверените	конц. на	конц. на	съотношение
плазмиди)	трансформанти	В2	В1	В2В1
SE18O-11
(нетрансформиран)	4	0	0	0
SE18O-11
(pWHM3)	4	0	0	0
SE180-11 (pSE290)	4	87	208	0.42
SE18O-11 (pSE291)	4	106	185	0.57
SEI 80-11 (pSE292)	4	91	231	0.40
SEI 80-11 (pSE293)	4	123	180	0.68
SEI 80-11 (pSE294)	4	68	129	0.53

SE180-11 (pSE295)	4	217	271	0.80
SE180-11 (pSE296)	1	135	186	0.73
SEI 80-11 (pSE297)	1	148	221	0.67

9. ПРИМЕР ЗА ИЗПЪЛНЕНИЕ НА ИЗОБРЕТЕНИЕТО: КОНСТРУИРАНЕ НА 5’ ДЕЛЕЦИОННИ МУТАНТИ

Както е обяснено в Глава 5.1, по-горе нуклеотидните последователности на S.avermillis, показани на ФИГУРА 1 (SEQ ID NO: 1) включват 4 различни GTG кодона в позиции на нд 42, 174, 177 и 180, които са потенциални стартови места. Тази глава описва конструирането на много делеции в 5’ района на ORF на aveC (ФИГУРА 1, SEQ ID NO: 1) за да се подпомогне определянето кои от тези кодони биха могли да функционират като стартови места на ORF на aveC за експресия на белтък.

Фрагменти, изрязани по различен начин от 5’ района на aveC гена са изолирани от хромозомната ДНК на S.avermitlis чрез PCR амплификация. PCR праймерите са изготвени на базата на ДНК последователността на aveC гена и са доставени от Genosys Biotechnologies, Inc. Праймерите за четене отдясно на ляво (5’-3’) са: 5’AACCCATCCGAGCCGCTC-3’ (SEQ ID N0:16) (D1F1); 5’TCGGCCTGCCAACGAAC-3’ (SEQ ID N0:17) (D1F2); 5’CCAACGAACGTGTAGTAG-3’ (SEQ ID N0:18) (D1F3); и 5’TGCAGGCGTACGTGTTCAGC-3’ (SEQ ID N0:19) (D2F2). Праймерите за четене отляво на дясно (3’-5’) са 5’-CATGATCGCTGAACCGA-3’ (SEQ ID N0:20), 5’-CATGATCGCTGAACCGAGGA-3’ (SEQ ID N0:21) и 5’-AGGAGTGTGGTGCGTCTGGA-3’ (SEQ ID N0:22). PCR реакцията се осъществява както е описано в Глава 8.3 по-горе.

• · • · · ·

PCR продуктите се разделят в 1% агарозен гел и се установяват единичните ДНК ивици, отговарящи на размери ~ 1.0 КЬ или ~ 1.1 Kb. PCR продуктите се изолират от гела и се подлагат на лигазна реакция с 25 ng от линеализиран pCR2.1 вектор (Invitrogen), като моларното съотношение вектор : “insert” е 1:10, следвайки инструкциите на производителя. Лигазната смес се използва за трансформиране на One Shot™ Е. coli компетентни клетки (Invitrogen), следвайки инструкциите на производителя. Плазмидната ДНК се изолира от ампицилин резистентните трансформанти и наличието на “insert” се потвърждава, чрез рестриктазен анализ и анализ чрез ДНК секвениране. Тези плазмиди се означават като pSE190 (получени с праймер D1F1), pSEl 91 (получени с праймер D1F2), pSEl92 (получени с праймер D1F3) и pSEl 93 (получени с праймер D2F2).

Всички ДНК “insert’’-и се подлагат на рестриктазно рязане с BamHl/Xbal, разделят се електрофоретично, пречистват се от гела и се подлагат на лигазни реакции поотделно с “shuttle” вектора pWHM3, който е линеализиран с BamHl/Xbal, като концентрацията на цялото количество ДНК за една реакция е 1 pg, а моларнито съотношение вектор : “insert” е 1:5. Продуктите от лигазните реакции се използват за трансформиране на компетентни клетки на E.coli DH5a и наличието на “insert” се потвърждава, чрез рестриктазен анализ. Тези плазмиди означени като pSEl94 (D1F1), pSEl95 (D1F2), pSEl96 (D1F3) и pSEl97 (D2F2) се трансформират поотделно в E.coli DM1, плазмидната ДНК се изолира от ампицилин резистентните трансформанти и наличието на правилен “insert” се потвърждава чрез рестриктазен анализ. Тази ДНК се използва за трансформиране на протопласти на S.avermitlis щам SE 180-11. Тиострептон резистентните трансформанти на щам SE 180-11 са изолирани, и се определя наличието на резистентност към еритромицин, и Thio^r Erm^r трансформантите се анализират чрез HPLC анализ на

• · продуктите на ферментацията, с цел определяне кои от GTG местата са необходими за експресията на aveC. Резултатите показват, че GTG кодона в позиция 42 може да бъде елиминиран без това да се отрази на експресията на aveC, докато pSE194, pSE195 и pSE196, във всеки от който липсва GTG място в позиция 42, но който съдържа останалите три GTG места в позиции 174, 177 и 180, са способни да възстановят нормалната авермектинова продукция, когато са трансфомирани в SE 180-11. Нормалната авермектинова продукция не се възстановява, когато щам щам SE 180-11 е трансформиран с pSEl 97, в който липсват всичките 4 GTG места (ТАБЛИЦА 5).

ТАБЛИЦА 5

S.avermitlis щам	Брой на	Относит.	Относит.	Средно
(трансформиран с	проверените	конц. на	конц. на	съотнош.
плазмиди)	трансформанти	В2	В1	В2:В1
SE180-11
(нетрансформиран)	6	0	0	0
SE180-11 (pWHM3)	6	0	0	0
SE18O-11 (pSE186)	6	241	152	1.58
SEI 80-11 (pSE194)	6	35	15	2.43
SE180-11 (pSE195)	6	74	38	1.97
SEI 80-11 (pSE196)	6	328	208	1.58
SEI 80-11 (pSE197)	12	0	0	0

• · · · · · • · · · · · • ·

ПРИМЕР ЗА ИЗПЪЛНЕНИЕ НА ИЗОБРЕТЕНИЕТО: КЛОНИРАНЕ НА aveC ХОМОЛОЗИ ОТ

S. HYGROSCOPICUS И S.GRISEOCHROMOGENES

Настоящето изобретение позволява да бъдат идентифицирани и клонирани хомолози на aveC гена от други авермектин- или милбемицин- продуциращи видове на Strepiomyces. Например, козмидна библиотека на геномната ДНК на S.hygroscopicus (FERM ВР-1901) може да хибридизира с 1.2 Kb aveC сонда от S.avermitilis описана погоре. Идентифицирани са няколко козмидни клона, които притежават висока степен на хибридизация. Хромозомната ДНК е изолирана от тези козмиди и 4.9 Kb ΚρηΙ фрагмент е идентифициран, чрез хибридизация с aveC сондата. Тази ДНК е секвенирана и е идентифицирана ORF на aveC (SEQ ID N0:3), която има значителна хомология с ORF на aveC на S.avermitilis. Аминокиселинна последователност (SEQ ID N0:4) производна на хомолога на ORF на aveC на S.hygroscopicus, представена на ФИГУРА 6.

В допълнение, козмидна библиотека на геномната ДНК на S.griseochromogenes хибридизира с 1.2 Kb aveC сонда от S.avermitilis описана по-горе. Идентифицирани са няколко козмидни клона, които притежават висока степен на хибридизация. Хромозомната ДНК е изолирана от тези козмиди и 5.4 Kb PstI фрагмент е идентифициран, чрез хибридизация с aveC сондата. Тази ДНК е секвенирана и е идентифициран частичен хомолог на ORF на aveC, който има значителна хомология с ORF на aveC на S.avermitilis. Производната аминокиселинна секвенция (SEQ ID N0:5) е представена на ФИГУРА 6.

Анализ на ДНК и аминокиселинните последователности на aveC хомолозите от S.hygroscopicus и S.griseochromogenes показва, че тези ройони притежават значителна хомоложност (~ 50 % идентичност

• · • *

на аминокиселините последователности) както един спрямо друг, така и със ORF на AveC генния продукт на S.avermitilis (ФИГУРА 6).

11. ПРИМЕР ЗА ИЗПЪЛНЕНИЕ НА ИЗОБРЕТЕНИЕТО: КОНСТРУИРАНЕ НА ПЛАЗМИД С aveC ГЕН, РАЗПОЛОЖЕН ЗАД ermE ПРОМОТОРА

ORF на aveC с големина 1.2 КЬ от pSE186 е субклониран в pSE34, който е “shuttle” векторът pWHM3, който притежава еппЕ промотора, с големина 300 нд, въведен като Kpnl/BamHl фрагмент в Kpnl/BamHl мястото на pWHM3 (виж Ward et al., 1986, Mol.Gen.Genet.203:468-478). pSE186 се подлага на рестриктазно рязане с Bam Hl и Hind III, продукта на рязането се разделя електрофоретично и

1.2 КЬ фрагмент се изолира от агарозния гел и се подлага на лигазна реакция с pSE34, който е линеализиран с Bam Н1 и Hind III. Лигазната смес се трансформира в компетентни E.coli DH5a клетки, съгласно с инструкциите на трансформанти и наличието на 1.2 Kb “insert” се потвърждава производителя. Плазмидната ДНК се изолира от ампицилин резистентните чрез рестриктазен анализ. Плазмидът, означен като pSE189 който е подложен на рестриктазно рязане се трансформира в E.coli DM1 и плазмидната ДНК се изолира от ампицилин резистентните трансформанти. Протопласти на S.avermitlis щам 1100-SC38 се трансформират с pSEl 89. Тиострептон резистентните трансформанти на щам 1100-SC38 са изолирани и анализирани чрез HPLC анализ на продуктите на ферментацията.

Трансформантите на S.avermitlis 1100-SC38 щам съдържащи pSE189 се характеризират с това, че получените авермектини имат променено съотношение циклохексил-В2: авермектин циклохексил-В1 (около 1:3) в сравнение със щам 1100-SC38 (около 34:1) и като цяло

авермектиновата продукция се повишава около 2.4 пъти, в сравнение със щам U00-SC38, трансформиран с pSEl 19 (ТАБЛИЦА 6).

pSEl 89 е трансформиран също в протопласти на щам на див тип S.avermitlis. Тиострептон резистентните трансформанти са изолирани и анализирани чрез HPLC анализ на продуктите на ферментацията. Като цяло авермектиновата продукция от дивия тип S.avermitlis, трансформиран с pSE189 се повишава около 2.2 пъти, в сравнение с дивия тип S.avermitlis, трансформиран с pSEl 19 (ТАБЛИЦА 6).

ТАБЛИЦА 6

S.avermitlis щам (трансформиран с плазмиди)	Брой на проверените трансформанти	Относит. [В2]	Относит. [В1]	Относит. количество на авермектините	Средно съотнош. В2:В1
11OO-SC38	6	155	4.8	176	33.9
(J 11OO-SC38 (pSE119)	9	239	50.3	357	4.7
11OO-SC38 (pSE189)	16	564	166	849	3.3
Див тип	6	59	42	113	1.41
Див тип (pSEl 19)	6	248	151	481	1.64
Див тип (pSE189)	5	545	345	1.071	1.58

...^:105 β ·

12. ПРИМЕР ЗА ИЗПЪЛНЕНИЕ НА ИЗОБРЕТЕНИЕТО: ХИМЕРЕН ПЛАЗМИД, СЪДЪРЖАЩ ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТИ ОТ ORF НА aveC НА S.A VERMJTILIS И ОТ aveC ХОМОЛОГА НА S.HVGROSCOPICUS

Конструиран е хибриден плазмид, означаван като pSE350, който носи участъка от 564 нд на aveC хомолога на S. hygroscopicus вместо 564 нд от хомоложния участък на ORF на aveC на S.avermitlis (ФИГУРА 7), както следва. pSE350 е конструиран, като е използвано рестриктазното място BsaAI (aveC в позиция 225), което е консервативно и за двете последователности и ΚρηΙ рестриктазното място (aveC в позиция 810), което присъства в aveC гена на S.avermitlis. ΚρηΙ мястото е въведено в ДНК на S.hygroscopicus чрез PCR, чрез използване на праймера за четене отдясно на ляво (5’-3’): 5’CTTCAGGTGTACGTGTTCG -3’ (SEQ ID N0:23); и праймера за четене отляво на дясно (3’-5’) : 5’-GAACTGGTACCAGTGCCC-3’ (SEQ ID N0:24) (доставени от Genosys Biotechnolgies), при PCR условията, описани в Глава 7.1.10, по-горе. PCR продукта, се подлага на рязане с BsaAI и ΚρηΙ, фрагментите се разделят електрофоретично в 1 % агарозен гел и фрагментът BsaAI/ΚρηΙ с големина 564 нд се изолира от гела. Плазмидът pSE179 (описан в Глава 7.1.10 по-горе) се отваря с ΚρηΙ и Hind III, и фрагментите се разделят чрез електрофореза в 1% агарозен гел, и фрагменитът с размери ~ 4.5 КЬ се изолира от гела. pSEl79 се линеализира с Hind III и BsaAI, фрагментите се разделят чрез електрофореза в 1% агарозен гел и BsaAI/Hind III фрагмента с размери ~ 0.2 КЬ се изолира от гела. Фрагмента Hindlll/Kpnl с размери ~ 4.5 КЬ, фрагмента BsaAI/Hind III с размери ~ 0.2 КЬ и фрагмента BsaAI/ΚρηΙ с размери 564 нд от S.hygroscopicus се подлагат заедно на лигазна реакция за свързване на 3 фрагмента и продуктът на лигазната реакция се трансформира в компетентни клетки на E.coli DH5a. Плазмидната ДНК

Λ· »·.

«

···· • ·

се изолира от ампицилин резистентните трансформанти и наличието на правилен “insert” се потвърждава чрез рестриктазен анализ с ΚρηΙ и Aval . Този плазмид се подлага на рестриктазно рязане с Hind III и Xbal за да се получи 1.2 Kb “insert”, който след това се свързва чрез лигазна реакция с pWHM3, който е линеализиран с Hind III и Xbal. Лигазната смес се трансформира в компетентни клетки на E.coli DH5a, плазмидната ДНК се изолира от ампицилин резистентните трансформанти и наличието на правилен “insert” се потвърждава чрез рестриктазен анализ с Hind III и Aval. Тази плазмидна ДНК се трансформира в E.coli DM1, плазмидната ДНК се изолира от ампицилин резистентите трансформанти и наличието на правилен “insert” се потвърждава чрез рестриктазен анализ и анализ чрез ДНК секвениране.. Този плазмид се означава, като pSE350 и се използва за трансформация на протопласти на S.avermitlis щам SE180-11. Тиострептон резистентните трансформанти на щам SE180-11 са изолирани и се определя наличието на разистентност към еритромицин, и Thio^r и Епп^г трансформантите се анализират чрез HPLC анализ на продуктите на ферментацията. Резултатите показват, че трансформантите носят хибриден плазмид на S.avermitilis/S.hygroscopicus, който има средно съотношение на В2:В1 около 109:1 (ТАБЛИЦА 7).

ТАБЛИЦА 7

S.avermitlis щам (трансформиран с плазмиди)	Брой на проверените трансформанти	Относит. конц. на В2	Относит. конц. на В1	Средно съотнош. В2:В1
SE180-11 (нетрансформиран)	8	0	0	0
SE180-11 (pWHM3)	8	0	0	0
SE180-11 (pSE35O)	16	233	2	109

* ·

ДЕПОЗИРАНЕ НА БИОЛОГИЧНИТЕ МАТЕРИАЛИ

Следните биологични материали са депозирани в American Type Culture Collection (АТСС), 12301 Parklawn Drive, Rockville, MD, 20852, USA на 29’^IH Януари, 1998 и имат следните номера за достъп:

Плазмид плазмид pSEl80 плазмид pSE 186

Номер за Достъп:

209605

209604

Всички патенти, патентни приложения, и публикации цитирани по-горе са изцяло въведени тук в литературната справка.

Настоящето изобретение не се ограничава в обхвата на специфичните варианти, описани тук, които са с цел илюстриране на индивидуалните аспекти на изобретението и на функционално еквивалентните методи и компоненти, които са в обхвата на изобретението. Действително, разнообразните модификации на изобретението, в допълнение на тези показани и описани тук ще станат очевидни на специалистите в областта от предшестващите описания и придружаващите ги илюстрации. Тези модификации имат за цел да попаднат в обхвата на приложените патентни претенции.

9999 • · • · · · • · • · • · · · ·

е ·

Claims (17)

1. НОВИ ПАТЕНТНИ ПРЕТЕНЦИИ:

   1. Полинуклеотидна молекула, включваща нуклеотидна последователност на aveC алела на Streptomyces avermitilis или последователност на плазмид pSEl 86 (АТСС 209604), кодираща AveC генен продукт или нуклеотидна последователност на ORF на aveC на S.avermitilis, която е представена на ФИГУРА 1 (SEQ ID N0:1), или изроден неин вариант, но която по-нататък включва най малко първа мутация, кодираща аминокиселинно заместване на серии с треонин на аминокиселинен остатък на AveC генния продукт, отговарящ на аминокиселинна позиция 138 от SEQ ID N0:2 и втора мутация, кодираща аминокиселинно заместване на аланин с фенилаланин на аминокиселинен остатък на AveC генния продукт, отговарящ на аминокиселинна позиция 139 от SEQ ID N0: 2, като тези клетки на S.avermitilis щам АТСС 53692, в които дивият тип aveC алел е инактивиран и които експресират полинуклеотидна молекула, включваща мутиралата нуклеотидна последователност, продуцират авермектини със съотношение клас 2:1, което е редуцирано, в сравнение със съотношението клас 2:1 на авермектини, продуцирани от клетки на S.avermitilis щам АТСС 53692, които вместо това експресират само див тип aveC алел.
2. 2. Полинуклеотидна молекула съгласно претенция 1, където авермектини клас 2:1 са авермектини циклохексил В2 : циклохексил В1.
3. 3. Полинуклеотидна молекула съгласно претенция 2, където редуцираното съотношение циклохексил В2 : циклохексил В1 е 0.75 : 1 или по-малко.
4. 4. Рекомбинантен вектор, включващ полинуклеотидна молекула съгласно претенция 1.
5. 5. Рекомбинантен вектор, способен да доведе до мутурал aveC алел на Streptomyces avermitilis, чрез въвеждане най-малко на първа • ft ft · · · ft ft ft ft ft ft ft ft ft ft ft ft ft ft ft ft ft мутация, кодираща аминокиселинно заместване на серин с треонин в аминокиселинен остатък на AveC генния продукт, отговарящ на аминокиселинна позиция 138 от SEQ ID N0:2 и втора мутация, кодираща аминокиселинно заместване на аланин с фенилаланин на аминокиселинен остатък на AveC генния продукт, отговарящ на аминокиселинна позиция 139 от SEQ ID N0: 2, включващ полинуклеотидна молекула, която има нуклеотидна последователност, кодираща такава мутация.
6. 6. Рекомбинантен вектор, съгласно претенция 5, включващ полинуклеотидна молекула, съгласно претенция 1
7. 7. Клетка гостоприемник на Streptomyces, включваща полинуклеотидна молекула съгласно претенция 1 или рекомбинантен вектор, съгласно претенция 4 или 5.
8. 8. Метод за създаване на нов щам на Streptomyces avermitilis, включващ клетки, които експресират мутирал aveC алел и продуцират авермектини с редуцирано съотношение клас 2:1, в сравнение с клетки на същия щам на S.avermillis, които вместо това експресират само див тип aveC алел, характеризиращ се с това, че включва: (а) въвеждане на полинукеотидна молекула в клетка на S.avermitilis щам, която полинуклеотидна молекула носи мутирал aveC алел или изроден негов вариант, който кодира AveC генен продукт, характеризиращ се с това, че включва най-малко първо аминокиселинно заместване на серин с треонин на аминокиселинен остатък, отговарящ на аминокиселинна позиция 138 от SEQ ID N0:2 и втора мутация, кодираща аминокиселинно заместване на аланин с фенилаланин на аминокиселинен остатък, отговарящ на аминокиселинна позиция 139 от SEQ ID N0: 2, където експресията на споменатия генен продукт води до редукция на съотношението клас 2:1 на авермектини, получени от клетки на S.avermitilis щам, експресиращи мутирал aveC алел или изроден негов вариант, в сравнение с клетки на същия щам, които вместо това експресират само див тип aveC алел и селекция на клетки, които продуцират авермектини с редуцирано съотношение клас 2:1, в сравнение със съотношението клас 2:1 на авермектините, получени от клетки на същия щам, които вместо това експресират само дивия тип aveC алел, или (б) въвеждане на една или повече полинуклеотидни молекули в клетка на S.avermitlis щам, които полинуклеотидни молекули са способни да въведат една или повече мутации в aveC алела, така че тези клетки, кодират AveC генен продукт, който има най-малко първо аминокиселинно заместване на серин с треонин на аминокиселинен остатък, отговарящ на аминокиселинна позиция 138 от SEQ ID N0:2 и второ аминокиселинно заместване на аланин с фенилаланин на аминокиселинен остатък, отговарящ на аминокиселинна позиция 139 от SEQ ID N0: 2, където експресията на получения генен продукт, води до редукция на съотношението клас 2:1 на авермектини, получени от клетки на S.avermitilis щам, експресиращи мутирал aveC алел, в сравнение с клетки на същия щам, които вместо това експресират само див тип aveC алел и селекция на клетки, които продуцират авермектини с редуцирано съотношение клас 2:1, в сравнение със съотношението клас 2:1 на авермектини получени от клетки на щам, които вместо това експресират само див тип aveC алел.
9. 9. Метод, съгласно претенция 8, характеризиращ се с това, че авермектини клас 2:1 са авермектини циклохексил В2 : циклохексил В1.
10. 10. Метод, съгласно претенция 9, характеризиращ се с това, че редуцираното съотношение циклохексил В2 : циклохексил В1 е 0.75 : 1 или по-малко.
11. 11. Клетка на Slreptomyces avermitlis, включваща мутирал aveC алел, включващ първа мутация, кодираща аминокиселинно заместване на серин с треонин на аминокиселинен остатък, отговарящ на аминокиселинна позиция 138 от SEQ ID N0:2 и втора мутация, кодираща аминокиселинно заместване на аланин с фенилаланин на

    Чомргтпатття етпаппття ί* · ·«· аминокиселинен остатък, Отговарящ на аминокиселинна позиция 139 от SEQ ID N0:2.
12. 12. Клетка, съгласно претенция 11, която продуцира авермектини в редуцирано съотношение клас 2:1, в сравнение с клетка от същия щам на Streptomyces avermililis, която вместо това включва само дивия тип aveC алел.
13. 13. Клетка, съгласно претенция 12, където авермектините клас 2:1 са циклохексил В2 : циклохексил В1.
14. 14. Клетка съгласно претенция 13, където редуцираното съотношение циклохексил В2:циклохексил В1 е 0.75:1 или по-малко.
15. 15. Метод за получаване на авермектини, характеризиращ се с това че включва култивиране на клетки, съгласно претенция 11, в среда за култивиране, при условия, които позволяват или индуцират продукцията на авермектини от тях и повторно получаване на споменатите авермектини от културата.
16. 16. Състав на авермектини циклохексил В2:циклохексил В1, получени от клетки на Streptomyces avermitilis, характеризиращ се с това че включва авермектините със съотношение циклохексил В2 : циклохексил В1, което е 0.75:1 или по-малко, в среда в която са култивирани клетките.
17. 17. Състав на авермектини циклохексил В2:циклохексил В1, получени от клетки на Streptomyces avermililis щам, които експресират мутирал aveC алел, който кодира генен продукт, който води до съотношение клас 2:1 на авермектини циклохексил В2 : циклохексил В1, получени от клетки, в сравнение с клетки на същия щам на S.avermitilis, които не експресират мутирал aveC алел, но които вместо това експресират само дивия тип aveC алел, който състав се характеризира с това, че включва авермектини циклохексил В2:циклохексил В1 със съотношение около 0.75:1 или по-малко, които присъстват в средата, в която са култивирани клетките.