FR3057778A1 - Nouvelles compositions actives sur les adipocytes - Google Patents

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Abstract

La présente invention concerne une composition aqueuse de chitosane, ladite composition aqueuse présentant par exemple un pH inférieur à 8,5, le chitosane comprenant un degré d'acétylation inférieur à 30%, caractérisée en ce que : - ladite composition contient entre 1,5 et 2 % en poids de chitosane par rapport au poids total de la composition, et/ou - la composition aqueuse comprend en outre au moins un composé de la matrice extracellulaire et/ou un substituant de la matrice extracellulaire, ainsi que ses utilisations en chirurgie, en médecine, en chirurgie esthétique, en angiologie, ou ses utilisations cosmétiques pour traiter ou lutter contre le vieillissement de la peau.

Description

® RÉPUBLIQUE FRANÇAISE
INSTITUT NATIONAL DE LA PROPRIÉTÉ INDUSTRIELLE © N° de publication :
(à n’utiliser que pour les commandes de reproduction)
©) N° d’enregistrement national
057 778
60346
COURBEVOIE
©) Int Cl8 : A 61 K47/36 (2017.01), A 61 K47/42, A 61 F2/02, A 61 P 17/00
DEMANDE DE BREVET D'INVENTION A1
(22) Date de dépôt : 25.10.16. © Demandeur(s) : BIOXIS PHARMACEUTICALS
©) Priorité : Société par actions simplifiée — FR.
©) Inventeur(s) : BERTAINA FREDERIC et GUERRY
ALEXANDRE.
(43) Date de mise à la disposition du public de la
demande : 27.04.18 Bulletin 18/17.
©) Liste des documents cités dans le rapport de
recherche préliminaire : Se reporter à la fin du
présent fascicule
(© Références à d’autres documents nationaux ©) Titulaire(s) : BIOXIS PHARMACEUTICALS Société
apparentés : par actions simplifiée.
©) Demande(s) d’extension : @) Mandataire(s) : CABINET PLASSERAUD.
FR 3 057 778 - A1 (□4) NOUVELLES COMPOSITIONS ACTIVES SUR LES ADIPOCYTES.
©) La présente invention concerne une composition aqueuse de chitosane, ladite composition aqueuse présentant par exemple un pH inférieur à 8,5, le chitosane comprenant un degré d'acétylation inférieur à 30%, caractérisée en ce que:
- ladite composition contient entre 1,5 et 2 % en poids de chitosane par rapport au poids total de la composition, et/ou
- la composition aqueuse comprend en outre au moins un composé de la matrice extracellulaire et/ou un substituant de la matrice extracellulaire, ainsi que ses utilisations en chirurgie, en médecine, en chirurgie esthétique, en angiologie, ou ses utilisations cosmétiques pour traiter ou lutter contre le vieillissement de la peau.
i
INTRODUCTION
La présente invention concerne le domaine technique des produits cosmétiques de comblement, des biomatériaux, des matériaux de reconstruction physiologique cutanée, de la médecine régénérative, de la chirurgie réparatrice en particulier de T antivieillissement cutané, chez l'homme ou éventuellement l'animal. En particulier, la présente invention concerne une composition aqueuse de chitosane permettant de viser spécifiquement les adipocytes. L'invention a également pour objet de telles compositions pour leur utilisation comme composition dermatologique, cosmétique, ou encore comme dispositif médical, avantageusement comme implant biorésorbable.
Différents produits de comblement injectables notamment chez l'être humain sont déjà connus.
Le collagène a longtemps été le produit de choix comme produit de comblement pour le visage, en particulier pour le comblement des rides et des ridules ou encore pour réourler les lèvres. Cependant, depuis la mise sur le marché des acides hyaluroniques, ces derniers sont les plus utilisés. En effet, à la biodégradabilité du collagène jugée trop rapide, s'ajoutent les problèmes de sécurité liés à l'origine animale (bovine ou porcine) de celui-ci. L'injection directe d'acide hyaluronique présente l’avantage d’avoir un effet de comblement immédiat associé à une réaction inflammatoire mineure, du fait de sa biocompatibilité. Toutefois, son implantation est associée à une biodégradation rapide qui rend le produit insatisfaisant, même si la durée de vie du produit injecté a pu être prolongée grâce à l'utilisation d'acides hyaluroniques réticulés. Néanmoins, les produits les plus utilisés aujourd'hui en médecine et chirurgie esthétique sont des produits résorbables dont la durée de vie est généralement inférieure à 12 mois. On trouve encore sur le marché des produits de comblement qualifiés de « permanents », dans le sens où leur biorésorption peut nécessiter plusieurs années. Ces produits contiennent entre autres des polymères synthétiques ou biosynthétiques, tels que des dérivés acryliques, des polyacrylamides, qui induisent une encapsulation fibreuse importante à l'origine de la longévité du comblement. Toutefois, la persistance du produit injecté dans les tissus présente un risque de complications à long terme ou de phénomènes inflammatoires à retardement, par exemple la formation de granulomes inflammatoires, kystes... plusieurs mois, voire plusieurs années, après leur injection.
D'autres produits synthétiques constituent une alternative intéressante : il s'agit de PLA (acide polylactique), un polymère dont la biodégradation est plus lente que celle des autres polymères naturels, tels que le collagène ou l'acide hyaluronique. On estime en effet que le comblement persiste jusqu'à deux ans après l'injection. Ces produits ont été commercialisés notamment sous le nom de New-Fill® (ou Sculptra®). Le principal défaut de cette technologie est que l'effet de comblement n'est visible qu'après un délai de huit semaines, ce qui n'apporte pas une complète satisfaction au patient. Par ailleurs, la fibrose observée lors de rutilisation de produits non dégradables est apparue de grand intérêt en terme d'effet esthétique à long terme, et c'est ainsi qu'ont été développés des produits de comblement qualifiés de « semi-permanents » qui, par leur composition hétérogène « particules-vecteurs » ont un effet pro-fibrotique tout en demeurant biodégradables. On citera par exemple le produit Atlean® qui propose une dispersion de particules de TCP (phosphate tricalcique) dans de l'acide hyaluronique et le produit Radiesse® qui propose une dispersion de particules d'hydroxyapatite de calcium dans un gel de carboxyméthyl cellulose. Dans tous les cas, le gel vecteur assure l'effet esthétique de comblement immédiat, tandis que les particules génèrent petit à petit une fibrose qui garantit l'effet à long terme. L'intérêt de ces produits, outre ce double mécanisme d'action (mécanique et inducteur de tissu), est qu'ils sont finalement totalement résorbés.
Dans ce contexte, le chitosane est une autre molécule ayant trouvé son intérêt dans le domaine. En effet, le chitosane, de par sa structure chimique unique et biomimétique, se comporte vis-à-vis de l'organisme comme un « leurre » du milieu biologique (A. Montembault, K. Tahiri, C. Korwin-Zmijowska, X, Chevalier, M. Corvol, A.Domard, Biochimie, 88 (2006), 551-64): d'une part, il est suffisamment « reconnu » pour ne pas induire de réaction inflammatoire dangereuse, et d'autre part suffisamment « méconnu » pour ne pas être dégradé trop rapidement.
La molécule est en effet constituée d'une succession de motifs N-acétyl-D-glucosamine et Dglucosamine, le premier étant un constituant de molécules de la matrice extracellulaire (on trouve ce résidu dans l'acide hyaluronique par exemple), et le second étant complètement absent de celle-ci, le chitosane est donc plus difficile à dégrader d'un point de vue biologique. Par ailleurs, le chitosane est connu dans la littérature pour stimuler certaines cellules immunitaires, telles que les macrophages, qui produisent en sa présence une quantité accrue de facteurs de croissance. Ces facteurs de croissance sont des médiateurs biologiques qui favorisent la production de matrice extracellulaire et la prolifération des fibroblastes, cellules productrices des fibres de collagène. Ainsi, le chitosane favorise la synthèse de tissu fibreux, ce qui permet un comblement « biologique » à long terme, notamment un comblement des défauts cutanés ou des cavités du corps humain ou du visage, telles que les rides. Le Demandeur s’était précédemment attaché au chitosane en vue de l’application susmentionnée, ce qui a fait l’objet d’une demande de brevet WO 2013/07964.
Néanmoins, malgré ces avancées, il existe toujours un besoin pour des molécules et des moyens pour traiter la peau, permettant le comblement, le traitement des rides et ridules et plus généralement ayant une action antivieillissement et/ou la reconstruction physiologique cutanée chez l'homme ou éventuellement l'animal. De plus, des compositions équivalentes capables de traiter des dépressions cutanées plus importantes, suite à une chirurgie ou une maladie sont demandées par les praticiens.
Ainsi, de manière totalement surprenante, le Demandeur s’est aperçu qu’un effet technique supplémentaire inattendu sur la peau apparaissait lorsqu’une composition aqueuse spécifique de chitosane, inconnue jusqu’à présent, était utilisée. En effet une étude plus méticuleuse a permis de mettre en évidence que lorsqu’un taux d’acétylation particulier du chitosane et une concentration particulière de ce composé étaient utilisées, il y avait une action directe sur les adipocytes présents dans les couches cutanées. Ainsi, les adipocytes soumis à ce traitement gonflent de manière contrôlée et permettent à la peau de se raffermir par comblement des rides et ridules ou alors que cela autorise le comblement de default(s) cutané(s) ou la reconstruction volumétrique de tissus. Ce constat a mené le Demandeur à s’intéresser plus particulièrement aux adipocytes. Ainsi, plusieurs points ont été dégagés par le Demandeur. Celui-ci s’est aperçu d’abord qu’une concentration trop élevée de chitosane, sans en retirer les autres bienfaits, est néanmoins toxique pour les adipocytes. Cette toxicité peut être régulée par l’ajout d’agents de la matrice extracellulaire, tels que le collagène, la fibronectine ou l’acide hyaluronique. En effet, il a été observé par le Demandeur que la présence d’au moins un composé de la matrice extracellulaire dans la composition aqueuse permet d’augmenter in vivo la capture d’acide gras des adipocytes. In vivo la composition de chitosane selon la présente invention induit la synthèse de ces fibres. Il semble vraisemblable au vu des éléments recueillis que l’ajout d’au moins un composant de la matrice extracellulaire (ou un substituant) permet de potentialiser l’action du chitosane.
Ainsi, le Demandeur propose des compositions aqueuses ayant une action directe sur les adipocytes au niveau cutané permettant d’ajouter une solution technique originale à l’art dans le domaine du traitement de la peau et de la chirurgie reconstructive.
RESUME DE L’INVENTION
L’objet de la présente invention concerne une composition aqueuse de chitosane, préférentiellement injectable, ladite composition aqueuse présentant par exemple un pH inférieur à 8,5, avantageusement compris entre 4 et 6,9, le chitosane comprenant un degré d'acétylation inférieur à 30%, avantageusement inférieur à 15%, caractérisée en ce que
- ladite composition contient entre 1,5 et 2 % en poids de chitosane par rapport au poids total de la composition, et/ou
- ladite composition aqueuse comprend en outre au moins un composé de la matrice extracellulaire, et/ou au moins un substituant de la matrice extracellulaire.
L’objet de la présente invention concerne en outre une composition aqueuse telle que décrite présentement, pour son utilisation comme composition dermatologique ou encore comme dispositif médical, avantageusement comme implant biorésorbable ou partiellement biorésorbable.
L’objet de la présente invention concerne également la composition telle que décrite présentement, pour son utilisation dans la réparation ou la reconstruction des tissus cutanés ou sous-cutanés du visage ou du corps.
La présente invention concerne également Tutilisation cosmétique d'une composition aqueuse telle que décrite présentement ou d’une composition aqueuse de chitosane comprenant entre 0,5 et 2 % en poids de chitosane par rapport au poids total de la composition (avec avantageusement un degré d'acétylation inférieur à 30% et/ou un pH inférieur à 8,5), pour augmenter le volume d’adipocytes, et préférentiellement pour traiter ou lutter contre le vieillissement de la peau.
DEFINITIONS
Par « composition aqueuse » on entend une composition comprenant au moins 1% en poids d’eau, avantageusement au moins 50% en poids d’eau, encore plus avantageusement au moins 80% en poids d’eau.
Les pourcentages, de manière générale pour la présente invention, lorsqu’ils ne sont pas précisés, correspondent à des pourcentages en poids par rapport au poids total de la composition considérée.
ίο
Le chitosane est un amino-polysaccaharide généralement obtenu par N-désacétylation de la chitine, polysaccharide aussi répandu dans la biomasse que la cellulose. La chitine est notamment présente dans les cuticules des arthropodes, l'endosquelette des céphalopodes, les parois cellulaires ou encore la matrice extracellularre de champignons, levures ou algues. Avantageusement selon la présente invention, le chitosane est un produit naturel qui provient d'une source animale, par exemple de crustacés du type crabes, crevettes ou calmars, ou d'une source végétale, telle que des champignons ou des algues. Le chitosane et la chitine sont des copolymères linéaires respectivement de 2-acetamido-2-desoxy-D-glucane et de 2-amino-2desoxy-D-glucane. On parle plus communément d'unités N-acétyl-D-glucosamine (GlcNAc) et D-Glucosamine (GlcN)), liées par des liaisons glycosidiques β(1—>4). Chitine et chitosane se différencient par la fraction molaire (exprimée en %) des unités GlcNAc présentes dans le copolymère, appelée aussi degré d'acétylation (DA).
Les structures chimiques du chitosane et de la chitine sont représentées schématiquement cidessous en fonction du degré d'acétylation (DA) :
Le DA se calcule grâce à la formule :
avec nGlcNAc = nombre de motifs acétylés et nGlcN = nombre de motifs désacétylés.
Le DA peut ainsi être déterminé selon les standards en vigueur actuellement (à savoir 20 « Standard Guide for Characterization and Testing of Chitosan Salts as Starting Materials
Intended for Use in Biomédical and Tissue-Engineered Medical Product Applications, Book of Standards Volume: volume 13.01 ; ASTM-L2103 »).
Avantageusement selon la présente invention, le chitosane a un degré d'acétylation (DA) inférieur à 30 %, encore plus avantageusement inférieur ou égal à 20 %, par exemple inférieur à 15%. De manière préférée, le chitosane selon l'invention a un degré d'acétylation DA inférieur ou égal à 15 %, avantageusement inférieur à 10%, plus avantageusement inférieur à 8%, encore par avantageusement inférieur à 5%. De manière encore préférée, le chitosane selon l'invention a un degré d'acétylation DA inférieur ou égal à 4 %, avantageusement inférieur à 3%, plus avantageusement inférieur à 2%, encore par avantageusement inférieur à 1%. Par exemple le chitosane selon l'invention a un degré d'acétylation DA compris entre 1 et 20%, avantageusement compris entre 2 et 15 %, avantageusement compris entre 3 et 10 %, par exemple entre 4 et 8%.
La « matrice extracellulaire » désigne typiquement l'ensemble de macromolécules extracellulaires du tissu conjonctif et des autres tissus. Un composé de la matrice extracellulaire selon la présente invention est avantageusement un polymère organique, par exemple d’une taille supérieure à 1000 Daltons (Da), ou encore supérieure 5000 Da. De manière avantageuse, les polymères organiques de la matrice extracellulaire selon la présente invention peuvent être de nature protéique, glucosidique, protéoglucosique ou encore glucoprotéique. Typiquement les polymères organiques de la matrice extracellulaire peuvent être le collagène, l’acide hyaluronique ou la fibronectine. Un « substituant de la matrice extracellulaire » est un composé non ubiquitaire (i.e. qui n’est pas trouvé naturellement chez l’homme pour cette fonction) permettant de remplir le rôle de matrice extracellulaire. Ce type de composé est connu dans l’art (Jayakumar, R., Menon, D., Manzoor, K., Nair, S. V., & Tamura, H. (2010). Biomédical applications of chitin and chitosan based nanomaterials—A short review. Carbohydrate Polymers, 82(2), 227-232).
Par « biorésorbable » ou « biorésorption », on entend une biodégradation qui aboutit à la dégradation totale ou essentiellement totale du produit injecté. De manière avantageuse selon la présente invention, la composition aqueuse présente une bonne biocompatibilité et est biorésorbable. En particulier, le produit selon l'invention a une durée de biorésorption plus longue que les produits à base d'acide hyaluronique du type acide hyaluronique réticulé, pour un effet prolongé, tel qu'un effet de comblement prolongé.
Les adipocytes sont communément connus pour être des cellules animales présentes dans les tissus adipeux, et spécialisées dans le stockage de la graisse. En outre les adipocytes sont également compris au niveau du tissu viscéral et dans l’hypoderme qui est la couche profonde de la peau, contenant plus ou moins de tissu adipeux, servant d’interface entre le derme et les structures mobiles situées en dessous de lui (organes, muscles etc.). Ainsi, les adipocytes sous-cutanés se situent à une profondeur variable de la surface de la peau, variant de quelques millimètres à plusieurs centimètres de profondeur. De manière préférée, par « adipocytes » dans le cadre de la présente invention, il est considéré les adipocytes humains.
DESCRIPTION DETAILLEE
Un mode de réalisation préféré de la présente invention concerne une composition aqueuse de chitosane, préférentiellement injectable, ladite composition aqueuse présentant par exemple un pH inférieur à 8,5, avantageusement compris entre 4 et 6,9, le chitosane comprenant un degré d'acétylation inférieur à 30%, avantageusement inférieur à 15%, caractérisée en ce que ladite composition contient entre 1,5 et 2 % en poids de chitosane par rapport au poids total de la composition.
Un autre mode de réalisation préféré de la présente invention concerne une composition aqueuse de chitosane préférentiellement injectable, ladite composition aqueuse présentant par exemple un pH inférieur à 8,5, avantageusement compris entre 4 et 6,9, le chitosane comprenant un degré d'acétylation inférieur à 30 %, avantageusement inférieur à 15%, caractérisée en ce que la composition aqueuse comprend en outre au moins un composé de la matrice extracellulaire et/ou au moins un substituant de la matrice extracellulaire.
Encore un autre mode de réalisation préféré de la présente invention concerne une composition aqueuse de chitosane, préférentiellement injectable, ladite composition aqueuse présentant par exemple un pH inférieur à 8,5, avantageusement compris entre 4 et 6,9, le chitosane comprenant un degré d'acétylation inférieur à 15%, avantageusement inférieur à 10%, caractérisée en ce que :
- ladite composition contient entre 1,5 et 2 % en poids de chitosane par rapport au poids total de la composition et
- ladite composition aqueuse comprend en outre au moins un composé de la matrice extracellulaire et/ou au moins un substituant de la matrice extracellulaire.
La composition aqueuse homogène de chitosane selon la présente invention, lorsqu’elle comprend un composé de la matrice extracellulaire et/ou un substituant de la matrice extracellulaire, cette composition contient de manière préférée une quantité de chitosane inférieure ou égale à 5% en poids par rapport au poids total de la composition aqueuse, avantageusement inférieure ou égale à 4% en poids par rapport au poids total de la composition aqueuse, plus inférieure ou égale à 3% en poids par rapport au poids total de la composition aqueuse, encore inférieure ou égale à 2% en poids par rapport au poids total de la composition aqueuse. De manière plus préférée, la composition aqueuse homogène de chitosane selon la présente invention, lorsqu’elle comprend un composé de la matrice extracellulaire et/ou un substituant de la matrice extracellulaire, cette composition contient entre 0,1 et 5 %, avantageusement entre 0,5 et 3,5 %, en particulier entre 1 et 2 %, en poids de chitosane, par rapport au poids total de la composition aqueuse. De manière plus préférée, la composition aqueuse homogène de chitosane selon la présente invention, lorsqu’elle comprend par exemple un composé de la matrice extracellulaire et/ou un substituant de la matrice extracellulaire, cette composition contient entre 1,5 et 2 %, avantageusement entre 1,6 et 1,9 %, en particulier entre 1,7 et 1,8 %, en poids de chitosane, par rapport au poids total de la composition aqueuse. De manière encore plus préférée, la composition aqueuse homogène de chitosane selon la présente invention, lorsqu’elle comprend par exemple un composé de la matrice extracellulaire et/ou un substituant de la matrice extracellulaire, cette composition contient moins de 2 %, avantageusement moins 1,9 %, en particulier moins de 1,8 %, plus avantageusement moins 1,7 %, encore plus avantageusement moins de 1,6 %, en poids de chitosane, par rapport au poids total de la composition aqueuse.
De manière préférée, l’objet de la présente invention concerne une composition aqueuse de chitosane injectable, ladite composition aqueuse présentant par exemple un pH inférieur à 8,5, avantageusement compris entre 4 et 6,9, ladite composition contenant entre 1,5 et 2 % en poids de chitosane par rapport au poids total de la composition, est caractérisée en ce que
- le chitosane comprend un degré d'acétylation inférieur à 30 %, avantageusement inférieur à 15%, et/ou
- la composition aqueuse comprend en outre au moins un composé de la matrice extracellulaire et/ou un composé se substituant à la matrice extracellulaire.
La composition aqueuse selon la présente invention est plus particulièrement caractérisée en ce que le composé de la matrice extracellulaire est choisi parmi le collagène, l’élastine, les glycoprotéines, les glycosaminoglycanes, les protéoglycanes et leurs mélanges.
De manière préférée, dans le cadre de la présente invention, une glycoprotéine est choisie parmi la fibronectine, la laminine ou un mélange des deux.
De manière préférée, dans le cadre de la présente invention, un glycosaminoglycane est choisi parmi l’acide hyaluronique la fibronectine, la laminine, la chondroïtine sulfate, l’héparane sulfate, la kératane sulfate ou un mélange d’au moins deux de ces glycosaminoglycanes.
De manière préférée, dans le cadre de la présente invention, un protéoglycane est choisi parmi l’aggrécane, le syndécane ou un mélange des deux.
La composition aqueuse selon la présente invention est plus particulièrement caractérisée en ce que le substituant de la matrice extracellulaire est choisi parmi la carboxymethylcellulose, l’ester de chitosane, l’ester de chitine ainsi que le mélange d’au moins deux substituants de la matrice extracellulaire.
La composition aqueuse selon la présente invention contient préférentiellement moins de 5% en poids par rapport au poids total de la composition d’au moins un composé de la matrice extracellulaire et/ou d’au moins un substituant de la matrice extracellulaire, avantageusement entre 0,1 et 4% en poids, plus avantageusement entre 0,2 et 3% en poids, encore plus avantageusement entre 0,3 et 2% en poids, voire entre 0,5 et 1% en poids.
Ainsi, la composition aqueuse selon la présente invention peut contenir préférentiellement moins de 5% en poids par rapport au poids total de la composition d’au moins un composé de la matrice extracellulaire, avantageusement entre 0,1 et 4% en poids, plus avantageusement entre 0,2 et 3% en poids, encore plus avantageusement entre 0,3 et 2% en poids, voire entre 0,5 et 1% en poids.
Ainsi, la composition aqueuse selon la présente invention peut contenir préférentiellement moins de 5% en poids par rapport au poids total de la composition d’au moins un substituant de la matrice extracellulaire, avantageusement entre 0,1 et 4% en poids, plus avantageusement entre 0,2 et 3% en poids, encore plus avantageusement entre 0,3 et 2% en poids, voire entre 0,5 et 1% en poids.
La composition aqueuse selon la présente invention est avantageusement une solution aqueuse de chitosane, une solution gélifiante aqueuse de chitosane ou un gel aqueux de chitosane.
Par « solution » il est communément compris dans l’art une phase liquide contenant au moins deux espèces chimiques. Une « solution aqueuse » comprend au moins 1% en poids d’eau, avantageusement au moins 50% en poids d’eau, encore plus avantageusement au moins 80% en poids d’eau. De manière préférée, une solution aqueuse selon la présente invention comprend majoritairement de l’eau, avec éventuellement d’autres composés. Avantageusement la solution aqueuse selon la présente invention est une solution aqueuse chitosane.
Une « solution aqueuse de chitosane » comprend au moins de l’eau dans les proportions mentionnées ci-dessus et du chitosane, Une solution aqueuse de chitosane peut donc comprendre d’autres composés que l’eau et le chitosane. Avantageusement la solution aqueuse selon la présente invention est une solution aqueuse homogène de chitosane.
Par « solution aqueuse homogène de chitosane », on entend au sens de la présente invention que tout le polymère de chitosane est solubilisé et que la solution ne contient pas de particules solides en suspension dans la phase liquide. La solution aqueuse ainsi constituée, comprend au moins de l’eau dans les proportions mentionnées ci-dessus et du chitosane avec éventuellement d’autres composés. La solution aqueuse homogène de chitosane selon la présente invention est typiquement transparente.
La solution aqueuse (qu’elle soit homogène ou pas) de chitosane selon la présente invention peut être utilisée pour former un gel.
Par « gel », il pourra être admis selon la présente invention qu’il s’agit d’un corps ayant un module de conservation supérieur au module de perte (cf. H.H. Winter, F. Chambon Analysis of linear viscoelasticity of a crosslinking polymer at the gel point J. Rheol., 30 (1986), pp. 367-382). La stabilité et l’intégrité de ce corps sont maintenues soit par des interactions non covalentes (gel physique) soit par une réticulation chimique covalente (gel chimique).
Ce gel peut être formé par toute technique connue dans l’art, par exemple par une variation de pH ou de température. De manière préférée, la solution aqueuse (qu’elle soit homogène ou pas) de chitosane est d’abord préparée puis gélifiée.
Par « solution gélifiante aqueuse de chitosane », il est compris dans le contexte de la présente invention une solution aqueuse de chitosane telle que définie ci-dessus, susceptible de fournir un gel aqueux de chitosane, en particulier lorsque la solution gélifiante aqueuse de chitosane est injectée dans le milieu biologique.
Ainsi, de manière préférée, la solution aqueuse de chitosane, qu’elle soit gélifiante ou non, présente un pH inférieur à 8, avantageusement compris entre 4 et 7,5. Toutefois, lorsqu’on souhaite injecter une solution de chitosane directement dans les tissus qui se trouvent au pH physiologique (entre 6,8 et 7,4), il serait souhaitable d’utiliser une solution présentant un pH le plus proche possible du pH physiologique afin d’éviter la nécrose des tissus du fait de l’acidité de la formulation injectée. Dans un mode de réalisation particulier selon la présente invention, le pH de ladite solution est supérieur ou égal à 6,2, avantageusement compris entre
6,2 et 7,6.
Ainsi, un objet selon la présente invention concerne un gel obtenu à partir de la solution aqueuse telle que décrite ci-dessus. Dans un mode de réalisation particulier de la présente invention, ce gel est formé avant son incorporation dans une composition telle que décrite présentement.
Dans un autre mode de réalisation particulier selon la présente invention, ce gel est formé après son incorporation dans une composition. Ceci peut être effectué par variation de température (passage à une température physiologique, i.e. entre 35 et 40°C, préférentiellement 37°C±1°C), ou variation de pH (passage à un pH physiologique, i.e. entre 6,8 et 7,8, préférentiellement à un pH de 7,4+0,2).
Par « composition gélifiante » il est compris dans le présent contexte que la composition est susceptible de fournir un gel, par exemple par une variation de pH ou de la température.
De manière particulièrement avantageuse, la composition aqueuse selon l'invention est injectable dans le corps humain ou animal, typiquement par injection intradermique, souscutanée ou intrapéritonéal. La composition peut être conditionnée dans une seringue telle qu'une seringue stérile.
Ainsi, la composition aqueuse présente une viscosité appropriée pour assurer une bonne seringuabilité (écoulement satisfaisant à travers une aiguille dans une seringue) et une facilité d'injection. Dans un mode de réalisation particulier, la composition aqueuse selon l'invention est stérilisée avant injection, par exemple par autoclave.
Dans un autre mode de réalisation particulier de la présente invention, la composition aqueuse contient un chitosane tel que défini précédemment en mélange avec un autre chitosane, tel qu'un oligosaccharide de chitosane encore appelé chito-oligosaccharide, ayant un degré d'acétylation inférieur à 30 %, avantageusement inférieur à 10%, le total des concentrations ne dépassant pas les gammes définies présentement.
Après stérilisation, le chitosane a typiquement une masse moléculaire moyenne en masse comprise entre 80 000 et 1 000 000 g/mol, et avantageusement comprise entre 120 000 et 300 000 g/mol.
De plus, la composition aqueuse selon la présente invention peut comprendre au moins un agent de dispersion du chitosane et/ou au moins un composé de la matrice extracellulaire (ou un substituant de celle-ci). Alternativement, la composition aqueuse selon la présente invention peut être suspendue dans au moins un agent de dispersion du chitosane et/ou dans le composé de la matrice extracellulaire (ou un substituant de celle-ci).
Ce type d’agent de dispersion est très bien connu dans l’art et peut par exemple être choisi parmi le mannitol, le glycérol, le sorbitol et leurs mélanges.
Ainsi, dans un mode de réalisation particulier, la composition aqueuse selon la présente invention, par exemple sous forme de gel, peut être suspendue dans un au moins un agent de dispersion du chitosane et/ou dans le composé de la matrice extracellulaire (ou un substituant de celle-ci). Ceci permet en effet de faciliter l’injection du gel (suspendu) dans le milieu biologique. De manière préférée, la suspension ainsi obtenue comprend en outre un tampon pH pour se placer au pH physiologique. Tout tampon pH communément utilisé à cette fin peut être utilisé, par exemple le PBS (« Phosphate Buffer Saline » - solution saline de tampon phosphate).
En outre, la composition aqueuse selon la présente invention est avantageusement apte à former des particules cristallines de chitosane après injection. En effet, de cette manière les effets tels que décrits précédemment dans WO201307964 sont cumulés aux effets liés à la présente invention.
Typiquement, la présente invention concerne une composition aqueuse comprenant un chitosane avec une masse moléculaire moyenne en masse (déterminée de manière classique comme rapporté dans Standard Guide for Characterization and Testing of Chitosan Salts as Starting Materials Intended for ETse in Biomédical and Tissue-Engineered Medical Product Applications, Book of Standards Volume: volume 13.01 ; ASTM-F2103) comprise entre 100 000 et 1 500 000 g/mol, avantageusement entre 250 000 et 1 000 000 g/mol, par exemple entre 250 000 et 500 000 g/mol, par exemple entre 250 000 et 400 000 g/mol.
La composition aqueuse de chitosane selon la présente invention peut en outre comprendre au moins un composé ou un excipent pharmaceutiquement, dermatologiquement, et/ou cosmétiquement acceptable.
L’objet de la présente invention concerne également une composition aqueuse telle que décrite présentement, caractérisée en ce qu'elle est susceptible d'être préparée par les étapes successives suivantes :
a. dissolution du chitosane dans de l'eau par ajout d'acide tel qu'un acide faible, ledit acide faible étant avantageusement choisi dans le groupe constitué par l'acide acétique, l'acide glycolique, l'acide lactique, l'acide glutamique, ou tel qu’un acide fort, ledit acide fort étant avantageusement l’acide chlorhydrique, et leurs mélanges,
b. ajout le cas échéant d’au moins un composé choisi parmi les composés de la matrice extracellulaire comme le collagène, l’élastine, les glycoprotéines (tel que la fibronectine, la laminine), les glycosaminoglycanes (tel que l’acide hyaluronique la fibronectine, la laminine, la chondroïtine sulfate, l’héparane sulfate, la kératane sulfate), les protéoglycanes (tel que l’aggrécane, le syndécane) et/ou par au moins un substituant de la matrice extracellulaire (tel que la carboxymethylcellulose, l’ester de chitosane, l’ester de chitine), etc. réajustement optionnel du pH pour obtenir une composition aqueuse présentant un pH inférieur à 8,5, préférentiellement un pH compris entre 4 et 7,5 ou l’un des pH plus précis décrits plus haut.
Dans un mode de réalisation particulier, la composition aqueuse de la présente invention, susceptible d’être obtenue par les étapes décrites ci-dessus, comprend une étape d’ajout d’un agent de dispersion, avantageusement choisi parmi le mannitol, le glycérol, le sorbitol et leurs mélanges. Cet ajout peut être préalable à l’étape (a) de dissolution, ou subséquemment à l’étape (a) par exemple avant l’étape (b) et/ou (c), ou après l’étape (c). De manière préférée, au moins un agent de dispersion (tel que le mannitol, le glycérol, le sorbitol...) est ajouté le cas échéant à l’une quelconque des étapes (a), (b), ou (c) ci-dessus. Alternativement, au moins un agent de dispersion (tel que le mannitol, le glycérol, le sorbitol...) est ajouté le cas échéant après l’une quelconque des étapes (a), (b), ou (c) ci-dessus. De manière préférée, au moins un agent de dispersion (tel que le mannitol, le glycérol, le sorbitol...) est ajouté à l’étape (b) cidessus. Dans un mode de réalisation particulier selon la présente invention, la composition aqueuse de chitosane, gélifiée peut être dispersée par l’ajout d’un agent de dispersion tel que présenté ci-dessus, éventuellement avec une étape de fragmentation mécanique du gel de ladite composition aqueuse de chitosane. La composition obtenue peut dans tous les cas être une suspension ou une solution, administrable par exemple par injection, préférentiellement gélifiante.
Le contrôle du pH des solutions est très important pour éviter d’une part la nécrose acide des tissus après injection comme expliqué ci-dessus, et également pour protéger les compositions de l'hydrolyse et la dégradation du chitosane si l'on met en œuvre une stérilisation (par exemple par autoclave à 121°C pendant 15 minutes). Le pH est réajusté si nécessaire avec un composé tel que le bicarbonate de sodium ou un tampon PBS, typiquement dans des quantités réduites. La valeur du pH est avantageusement contrôlée grâce à un pHmètre.
Dans un mode de réalisation particulier selon l'invention, le chitosane est dissous dans l'eau à l'aide d'un acide fort du type acide chlorhydrique. Dans ce cas, le pH est réajusté avec un composé de type bicarbonate de sodium ou d'ammonium ou PBS par exemple, et/ou une base de type NaOH ou KOH par exemple (toujours en contrôlant le pH de manière à ce qu'il reste inférieur à 8,5, préférentiellement inférieur à 6,9).
Dans un mode de réalisation particulier selon l'invention, lors de l'étape de dissolution, l'acide est ajouté en une quantité nécessaire à la dissolution du chitosane. On peut utiliser ainsi un excès d'acide pour certains chitosanes, par exemple les chitosane difficiles à solubiliser avec la quantité strictement nécessaire d'acide, puis on reprécipite le chitosane, à l'aide d'ammoniaque par exemple. Après une série de lavages destinés à éliminer l'excédent d'ammoniaque et les sels, on peut alors lyophiliser le chitosane pour récupérer la matière sèche. Celle-ci sera alors plus facile à solubiliser.
Dans un autre mode de réalisation particulier selon l'invention, lors de l'étape de dissolution, l'acide est ajouté en une quantité au moins nécessaire à la dissolution du chitosane, telle que la quantité stoechiométrique strictement nécessaire à la protonation des sites NH2. Dans un autre mode de réalisation particulier selon l'invention, lors de l'étape de dissolution, l'acide est ajouté en une quantité strictement nécessaire à la dissolution du chitosane, telle que la quantité stoechiométrique strictement nécessaire à la protonation des sites NH2.
De manière particulièrement avantageuse, le pH de la composition aqueuse selon la présente invention est inférieur à 6,9, et est typiquement compris entre 4 et 6,9. Dans le cadre de l'invention, le chitosane est solubilisé en solution aqueuse, telle que l'eau, dans un environnement acide dans les gammes de pH mentionnées précédemment, avantageusement par protonation des groupes amine du chitosane. Ces gammes de pH ont été en particulier choisies afin de maximiser la stabilité de la composition aqueuse selon l’invention.
Dans un autre mode de réalisation, la composition aqueuse selon la présente invention est gélifiée avec un pH inférieur à 8,5, avantageusement compris entre 4 et 7,5, plus avantageusement inférieur à 6,9, et encore plus avantageusement compris entre 4 et 6,9.
L’invention a également pour objet une méthode de préparation d’une solution aqueuse telle que décrite précédemment, comprenant au moins les étapes suivantes :
- la dissolution du chitosane dans l'eau par ajout d'acide tel qu'un acide faible, pour obtenir une solution aqueuse homogène de chitosane contenant, dans un milieu physiologiquement acceptable, entre 0,1 et 4,5 %, en poids d’un chitosane, préférentiellement entre 1,5 et 2% en poids, ayant un degré d'acétylation inférieur à 30%, ladite solution présentant un pH inférieur à 6,2, l’acide faible permettant l’ajustement du pH étant avantageusement choisi dans le groupe constitué par l'acide acétique, l'acide glycolique, l'acide lactique, l'acide glutamique, et leurs mélanges, et
- le réajustement du pH par dialyse, de préférence à température ambiante, pour obtenir une solution aqueuse présentant un pH supérieur ou égal à 6,2, avantageusement compris entre 6,2 et 7,2, de préférence entre 6,25 et 7,1.
Dans un mode de réalisation particulier, la composition aqueuse de la présente invention, susceptible d’être obtenue par les étapes décrites ci-dessus, est caractérisée en ce que, lors de l'étape de dissolution, l'acide est ajouté en une quantité strictement nécessaire à la dissolution du chitosane.
L’objet de la présente invention concerne en outre une composition aqueuse, telle que décrite ci-dessus, caractérisée en ce que ladite composition est liquide, sous forme de gel ou obtenue après dispersion de ladite composition aqueuse de chitosane dans un véhicule dermatologiquement et/ou cosmétiquement acceptable.
Par « véhicule dermatologiquement et/ou cosmétiquement acceptable », il est compris dans le cadre de la présente invention tout excipient dermatologiquement et/ou cosmétiquement acceptable, ou toute matrice ou dispositif dermatologiquement et/ou cosmétiquement acceptable, permettant l’administration de la composition aqueuse selon la présente invention.
La solution aqueuse de chitosane ci-dessus est une solution comprenant de l’eau et du chitosane, et éventuellement au moins un composé de la matrice extracellulaire ou substituant de celle-ci telle que décrite ci-dessus, dans laquelle l’eau est le composé majoritaire.
En outre la composition selon la présente invention peut comprendre au moins un composé actif tel qu'un composé analgésique, anesthésique local, tel que la lidocaïne, mépivacaïne, bupivacaïne ou ropivacaïne, un composé angiogénique, ou encore un composé actif du type facteur de croissance ou oligosaccharide bioactif.
Ainsi, la composition selon la présente invention peut être formulée pour être administrée par injection intradermique, par injection sous-cutanée ou intrapéritonéal.
Une injection intradermique est l'administration d'un médicament dans le derme de la peau, situé juste en dessous de l'épiderme. Une injection sous-cutanée consiste à introduire une aiguille dans la couche sous-cutanée de la peau, au niveau du bras, de la cuisse ou de l'abdomen, pour y injecter une molécule d’intérêt. Une injection intrapéritonéale est localisée au-delà du péritoine dans la cavité abdominale, i.e. dans le tissu adipo-viscéral.
Dans un mode de réalisation particulier, la composition aqueuse selon la présente invention est comprise ou consiste en un implant permettant de traiter les dépressions cutanées qui ne peuvent être comblées par des injections de faibles volumes (i.e. égale ou inférieurs à 5 mL équivalent environ à 5 gramme selon la densité de la composition). C’est le cas par exemple, du comblement de l’ablation d’un organe ou d’un tissu suite à un accident ou une maladie (e.g. une mammoplastie, lipodystrophie aigüe, lipoatrophie aigüe, traitement de comblement suite à une poliomyélite), en chirurgie réparatrice.
Selon une caractéristique particulière de la présente invention, la composition de chitosane présente un temps de résorption long une fois injectée, typiquement de quelques semaines à plusieurs mois, par exemple de l'ordre de 3 ou 4 semaines jusqu'à 12 à 18 mois. Le produit ou biomatériau constitué de ou contenant la composition aqueuse selon l'invention bénéficie du caractère bactério et fongistatique du chitosane, bien connu dans le monde de l'industrie agroalimentaire et des pansements cicatrisants. Ces propriétés facilitent la conservation du produit et contribuent à limiter les risques d'infection liés à l'injection ou les phénomènes inflammatoires à retardement pour d'autres produits tels qu'évoqués ci-dessus. Face aux molécules naturelles (collagène, acide hyaluronique) utilisées à ce jour pour le comblement de dépression ou la reconstruction de volume (e.g. rides, ridules, mamoplastie ou encore lipodystrophie), le chitosane est le seul à présenter de telles propriétés. Par ailleurs, le produit ou biomatériau constitué de ou contenant la composition aqueuse selon l'invention assure un comblement biologique efficace avantageusement immédiat. En outre, le chitosane peut favoriser la synthèse de collagène et permettre un comblement des défauts cutanés, tels que les rides, par stimulation de mécanismes naturels.
Dans un mode de réalisation particulier, la composition selon l'invention comprend un sel tel que le chlorure de sodium ou le chlorure de potassium, ou tout autre excipent acceptable avantageusement pour ajuster l'osmolarité de la composition. L'ajout d'un sel tel que le chlorure de sodium, ou de potassium, peut être intéressant pour obtenir une solution isotonique. Selon une caractéristique particulière de la présente invention, la composition peut comprendre en outre au moins un composé ayant une activité thérapeutique reconnue.
Lorsqu’une composition aqueuse telle que décrite présentement est comprise dans une composition avec éventuellement un composé ou un excipent pharmaceutiquement, dermatologiquement, et/ou cosmétiquement acceptable, son utilisation comme composition dermatologique ou encore comme dispositif médical, avantageusement comme implant biorésorbable ou partiellement biorésorbable peut être administré aux dosages suivants. La quantité de chitosane peut être comprise entre 0,1 et 5 % en poids, avantageusement entre 1 et 2% en poids, plus avantageusement entre 1,1 et 1,9 % en poids, encore plus avantageusement entre 1,2 et 1,8% en poids, et de manière encore plus avantageuse entre 1,3 et 1,7% en poids ou encore entre 1,4 et 1,6% en poids, par exemple à 1,5% ± 0,05% en poids de chitosane par rapport à la quantité totale de composition aqueuse administrée. En outre, la quantité de composition ou composition aqueuse administrée en une seule dose est comprise entre 0,01 et 20 grammes par injection, avantageusement comprise entre 0,05 et 10 grammes par injection, plus avantageusement comprise entre 0,1 et 5 grammes par injection, encore plus avantageusement entre 0,4 et 1 gramme par injection, par exemple 0,7 grammes ±0,1 gramme par injection. Le nombre d’injections peut varier de 1 à 20 fois dans les cas les plus extrêmes. De manière plus routinière, ce nombre d’injection est inférieur à 5 fois pour combler efficacement des cavités d’un volume inférieur à 50 mL (donc à température physiologique). Dans le cas de chirurgie réparatrices plus importantes tels qu’évoqués précédemment (e.g. mammoplastie, lipodystophie argüe, lipoatrophie argüe, etc.) les quantités de composition selon la présente invention pouvant être injecté et/ou implantés peuvent s’additionner à des masses égales ou inférieures à 500 grammes, plus communément égales ou inférieures à 350 grammes, encore plus communément égales ou inférieures à
200 grammes, ou encore égales ou inférieures à 100 grammes. De manière typique, la densité de la composition aqueuse administrée est comprise entre 0,9 et 1,2 à 25 °C (donc avant administration).
Les mêmes dosages que ci-dessus sont applicables lorsque l’objet de la présente invention concerne la composition telle que décrite présentement, pour son utilisation dans la réparation ou la reconstruction des tissus de la peau du visage ou du corps. Cette reconstruction des tissus de la peau du visage ou du corps peut être suite à un accident ou encore à une maladie, etc. ayant causé un traumatisme et des séquelles cutanés et/ou tissulaires nécessitant des soins médicaux de reconstruction.
Dans le cas de l’utilisation cosmétique selon la présente invention d'une composition aqueuse ou d'une composition telles que décrites présentement, le dosage suivant peut être administré.
L’utilisation cosmétique selon la présente invention est définie de fait comme n’étant pas invasive dans l’administration de la composition selon la présente invention. Ceci exclu tout acte chirurgical. Néanmoins, l’utilisation cosmétique selon la présente invention peut être effectuée avec des seringues et aiguilles de petit calibre, dans un acte comparable à l’application d’un tatouage. Ainsi de manière arbitraire, les quantités injectés de composition selon la présente invention supérieur à 5 grammes par injection sont exclus dans le cadre d’une utilisation cosmétique. Dans ce cadre, le nombre d’injections est limité arbitrairement à 5 fois au plus pour une quantité totale injectée de 10 grammes.
La quantité de chitosane dans une composition comprenant en outre au moins un composé de la matrice extracellulaire ou un substituant de celui-ci peut être comprise entre 0,1 et 1% en poids, avantageusement entre 0,5 et 0,9% en poids, plus avantageusement entre 0,6 et 0,8% en poids, par exemple à 0,7% ± 0,05% en poids de chitosane par rapport à la quantité totale de composition aqueuse administrée. En outre, la quantité de composition aqueuse administrée en une seule dose peut être comprise entre 0,001 et 1 gramme par cm2 de surface de peau, avantageusement comprise entre 0,01 et 0,5 gramme par cm2 de surface de peau. De manière typique, la densité de la composition aqueuse administrée est comprise entre 0,9 et 1,2 à 25°C.
En outre l’utilisation selon la présente invention peut être faite de manière in vitro ou in vivo.
L’utilisation in vitro est applicable à toutes les applications visées par la présente invention, et en particulier à des buts de détermination de concentrations/quantité d’actifs à administrer.
Ainsi, la présente invention concerne la composition telle que ci-dessus, pour son utilisation pour le comblement des cavités du visage, pour la création ou l'augmentation de volumes du visage ou du corps humain, ou encore pour la cicatrisation de la peau.
En effet, hormis le fait qu’une injection ou l’introduction d’un implant selon la présente invention va de fait combler un volume au niveau cutané ou sous-cutané de par le volume inhérent de la composition, ladite composition selon la présente invention va en outre générer un gonflement local grâce à son action sur les adipocytes aux alentours de cette composition.
Dans un mode de réalisation particulier, la composition aqueuse selon la présente invention est destinée à être utilisée dans la réparation ou la reconstruction des tissus de la peau du visage ou du corps.
La présente invention concerne une composition telle que décrite ci-dessus, par exemple comme implant biorésorbable ou partiellement biorésorbable, pour son utilisation en chirurgie, en médecine ou chirurgie esthétique ou en angiologie.
En effet, la composition aqueuse selon la présente invention peut être utilisée pour le comblement des cavités du corps ou du visage, telles que les rides ou les ridules, pour la création ou l'augmentation de volumes du visage ou du corps humain, ou encore pour la cicatrisation de la peau.
Enfin, la présente invention concerne l'utilisation cosmétique d'une composition aqueuse selon l'invention pour traiter ou lutter contre le vieillissement de la peau.
DESCRIPTIF DES FIGURES
Figure IA et IB : Effet sur la prolifération des 3T3L1. La figure 1 montre que pour toutes les concentrations, les cellules 3T3L1 sont capables de proliférer et d’atteindre la confluence en 5 jours bien que deux jours après ensemencement, la morphologie des cellules suggère un milieu agressif, voire toxique pour la condition à 2 %. La figure IB précise où sur les images expérimentales obtenues pouvait être vu le signal correspondant à l’Adipored (vert expérimentalement, vs. Rouge pour Hoecht).
Figures 2A, 2B et 2C : ces figures montrent l’influence de la concentration en chitosane sur le stockage d’acide oléique par les cellules 3T3L1 lors de la différenciation adipocytaire. Le marquage AdipoRed (Fig. 2A) montre une accumulation d’acides gras lorsque les cellules sont en présence de chitosane à 0.5 %, 0.75 % et 1 % par rapport aux conditions ne contenant pas de chitosane. La figure 2B précise où sur les images expérimentales obtenues pouvait être vu le signal correspondant à l’Adipored (vert expérimentalement). La quantification de cette accumulation (Fig. 2C) démontre qu’elle est maximale lorsque les cellules sont cultivées en présence de chitosane à 0.5%.
Figures 3A et 3B : Ces figures montrent une distribution des gouttelettes lipidiques (n>10000) A) des 3T3L1 exposés à différentes concentration de chitosane et B) des 3T3L1 exposés à des formulations de chitosane combinées à d’autres polymères naturels. La Figure 3B montre que (Col 2+ FN1) et (Col 2+FNl)+Chitosan2%) sont les meilleures formulations pour augmenter la taille moyenne des gouttelettes lipidiques
EXEMPLES
Exemple 1 : Préparation des solutions
Deux stratégies de préparation d’une gamme de concentration de solutions gélifiantes de chitosane sont utilisées.
Par dilution finale
Une solution de chitosane à 4 % (w/w) est préparée dans une solution saline (NaCl à 300 mOsmol.L’1) contenant 1 % (w/w) d’acide acétique. Cette solution est dialysée pour obtenir un pH proche de 6 et une concentration de 3% (w/w).
Classiquement, 4 g de chitosane sont agités dans 95 g de solution saline contenant 150 mM en 20 NaCl (équivalent à 300 mOsmol.L’1)· Une fois le chitosane complètement dispersé, 1 g de d’acide acétique est ajouté. L’agitation est maintenue jusqu’à dissolution complète du chitosane. Une solution limpide de chitosane concentrée à 4 % est alors obtenue avec un pH pouvant être compris entre 3 et 4.5 en fonction de l’origine du chitosane.
Le pH de la solution de acide de chitosane est rehaussé jusqu’à ce qu’il soit compris entre 6 et 25 6.5. Cette étape est réalisée par dialyse contre un tampon PBS présentant un pH compris entre 6.5 et 7. Lors de cette étape, le gonflement de la solution de chitosane est contrôlé pour atteindre une concentration finale de 3 % (w/w) (taux de gonflement de 33 %). Les solutions de chitosane sont généralement stérilisées (121 °C pendant 15 min dans un autoclave) pour être stockées avant utilisation.
Avant utilisation, la solution de chitosane à 3 % peut être diluée dans une solution saline à 150 mM en NaCl + 1 % en acide acétique pour accéder à des concentrations inferieures.
Les solutions obtenues peuvent gélifier en présence du milieu physiologique ou d’un milieu de culture.
Par dilution initiale
Une solution de chitosane à 4 % (w/w) est préparée dans une solution saline (NaCl à 300 mOsmol.L’1) contenant 1 % (w/w) d’acide acétique.
Classiquement, 4 g de chitosane sont agités dans 95 g de solution saline contenant 150 mM de NaCl (équivalent à 300 mOsmol.L’1). Une fois le chitosane complètement dispersé, 1 g de d’acide acétique est ajouté. L’agitation est maintenue jusqu’à dissolution complète du chitosane. Une solution limpide de chitosane concentrée à 4 % est alors obtenue avec un pH pouvant être compris entre 3 et 4.5 en fonction de l’origine du chitosane.
Cette solution mère (4 %) est ensuite diluée dans une solution saline (NaCl à 300 mOsmol.L ') contenant 1 % (w/w) d’acide acétique en différente concentration allant de 4 % à 0.1 %.
Chaque solution est alors dialysée contre un tampon PBS présentant un pH compris entre 6.5 et 7. Le taux de gonflement est mesuré afin de contrôler les concentrations finales de chaque solution. La dialyse est stoppée quand le pH des solutions est compris entre 6.0 et 7.4. Chaque solution est stérilisée par autoclave (121 °C pendant 15 min). Les solutions sont utilisées en l’état sans autre forme de dilution ce qui préserve leur pH.
Les solutions obtenues peuvent gélifier en présence du milieu physiologique ou d’un milieu de culture
Exemple 2 : Effet de différentes dilutions de chitosane sur la prolifération, la différenciation et la capture d’acide gras par la lignée adipocytaire murine 3T3L1
Matériels et Méthodes
Différentes solutions de chitosane (2 %, 1 % 0.75 % et 0.5 %) sont préparées comme décrit dans l’exemple 1.1.1.
Pour cela, une préparation de chitosane à 2 % (w/w) (DA : 2 %, Mw : 450000 g.mol’1, BIOXIS Pharmaceuticals S.A.S.) est diluée dans une solution saline (NaCl à 300 mOsmol.L’1) contenant 1 % (w/w) d’acide acétique dans un puits (en plaques 24 puits) puis distribuées sur la moitié des autres puits, séchées, rincées au PBS puis avec le milieu de culture avant ensemencement cellulaire (lignée adipocytaire murine 3T3L1 ATCC CL-173™). Lorsque les cellules sont à confluence, la différenciation est induite par ajout d’un milieu de différenciation. Les cellules sont alors traitées avec une faible dose d’acide oléique (OA, 2.5 μΜ) pendant 6 heures. Les cellules sont remises en milieu de culture sans OA jusqu’au lendemain afin d’éviter un bruit de fond éventuel de ΓΟΑ. La prolifération est analysée par microscopie à contraste de phase (x20) : les images sont prises à différents temps (2 jours et 5 jours post ensemencement), à une position identique pour chaque puits. La différenciation et le stockage d’acide oléique sont analysés en microscopie à fluorescence : les cellules sont fixées puis marquées avec AdipoRed (vert de manière expérimentale ou tel qu’identifié dans les figures) mettant en évidence la présence d’acides gras sous forme de triglycérides (TG) stockés dans plusieurs gouttelettes au cours de la différenciation, fusionnant en une seule gouttelette lorsque les adipocytes sont matures) et avec Hoechst 3352 (rouge de manière expérimentale) pour le marquage des noyaux. Le marquage est observé en microscopie à fluorescence et la quantification effectuée par imagerie. L'imagerie et la quantification de fluorescence sont effectuées sur une station d'imagerie en temps réel. Les contrôles sont fixés avant induction de différenciation (confluence, DO).
Résultats
Deux jours après ensemencement, la morphologie des cellules suggère un milieu agressif, voire toxique pour la condition à 2 %. Cependant, pour toutes les concentrations, les cellules 3T3L1 sont capables de proliférer et d’atteindre la confluence en 5 jours (Figure IA et IB).
La Figure 2 montre l’influence de la concentration en chitosane sur le stockage d’OA par les cellules 3T3L1 lors de la différenciation adipocytaire. Le marquage AdipoRed (Fig. 2A et 2B) montre une accumulation d’acides gras lorsque les cellules sont en présence de chitosane à 0.5 %, 0.75 % et 1 % par rapport aux conditions ne contenant pas de chitosane. La quantification de cette accumulation démontre qu’elle est maximale lorsque les cellules sont cultivées en présence de chitosane à 0.5%.
Conclusion
Après deux jours en culture, la présence de chitosane semble avoir un effet toxique sur la lignée 3T3L1 pour des concentrations supérieures ou égales à 2 %. Les 3T3L1 sont capables de proliférer en présence de chitosane. Le chitosane favorise la capture d’acides gras de manière dose-dépendante. Parmi les solutions testées, il semble que ce soit les solutions à 0.5 % qui présentent la meilleure efficacité. Cette capture permettrait une augmentation du volume des adipocytes et donc, par extrapolation, du tissus graisseux in vivo.
Exemple 3 : Effet de différentes dilutions de chitosane sur la capture d’acide gras en présence de fibronectine et de collagène par la lignée adipocytaire murine 3T3L1
Matériels et Méthodes
Différentes solutions de chitosane (2 %, 1 % 0.75 % et 0.5 %) sont préparées comme décrit dans l’exemple 1.1.2. Pour cela, une préparation de chitosane à 2 % (w/w) (DA : 2 %, Mw : 450000 g.mol’1, BIOXIS Pharmaceuticals S.A.S.) Les solutions ont été utilisées en l’état sans subir de pré dilution en solution saline acide. De plus, des matrices à base de Collagène I concentré à 3mg/mL et 2mg/mL (notées respectivement Col 3 et Col 2); ainsi que des matrices à base de Collagène I à 2mg/ml + Fibronectine I à lmg/mL (Notée Col 2 FN 1) et un double dépôt de Collagène I 2mg/ml + Fibronectine I lmg/mL + Chitosane à 2% (Noté Col FN Chi2) sont aussi évaluées. Les compositions sont distribuées en plaque 96 puits après ensemencement cellulaire (lignée adipocytaire murine 3T3L1, ref ATCC CL-173 ™). Lorsque les cellules sont à confluence, la différenciation est induite par ajout d’un milieu de différenciation. Les cellules sont alors traitées avec une faible dose d’acide oléique (OA, 2.5 μΜ) pendant 6 heures. Les cellules sont remises en milieu de culture sans OA jusqu’au lendemain avant observation sur Cytation 3. La distribution en taille des gouttelettes lipidiques est observée.
Résultats
La Figure 3B montre que (Col 2+ FN1) et (Col 2+FNl)+Chitosan2%) sont les meilleures compositions pour favoriser augmentation de la taille moyenne des gouttelettes lipidiques.
Conclusion
Le chitosane seul permet d’accroître la distribution des gouttelettes lipidiques. Cet effet est encore majoré en présence de fibronectine et de collagène. Les composés naturellement présents dans la matrice extracellulaire pourraient avoir les mêmes effets si ils sont eux aussi combinés à du chitosane.

Claims (16)

  1. REVENDICATIONS
    1. Composition aqueuse de chitosane, ladite composition aqueuse présentant avantageusement un pH inférieur à 8,5, le chitosane comprenant un degré d'acétylation inférieur à 30%,
    5 caractérisée en ce que :
    - ladite composition contient entre 1,5 et
  2. 2 % en poids de chitosane par rapport au poids total de la composition, et/ou
    - ladite composition aqueuse comprend en outre au moins un composé de la matrice extracellulaire, et/ou au moins un substituant de la matrice extracellulaire.
    10 2. Composition aqueuse selon la revendication 1, caractérisée en ce que le composé de la matrice extracellulaire est choisi parmi le collagène, l’élastine, les glycoprotéines, les glycosaminoglycanes, les protéoglycanes et leurs mélanges.
  3. 3. Composition aqueuse selon la revendication 1 ou 2, caractérisée en ce que ladite composition aqueuse contient moins de 5% en poids par rapport au poids total de la
    15 composition, avantageusement entre 0,1 et 4% en poids, d’au moins un composé de la matrice extracellulaire et/ou d’au moins un substituant de la matrice extracellulaire.
  4. 4. Composition aqueuse selon Tune quelconque des revendications précédentes, caractérisée en ce que ladite composition aqueuse est une solution aqueuse de chitosane, une solution gélifiante aqueuse de chitosane ou un gel aqueux de chitosane.
    20 5. Composition aqueuse selon Tune quelconque des revendications précédentes, caractérisée en ce que ladite composition aqueuse comprend en outre au moins un composé ou un excipent pharmaceutiquement, dermatologiquement, et/ou cosmétiquement acceptable.
    6. Composition aqueuse selon Tune quelconque des revendications précédentes, caractérisée en ce que l’eau est le composé majoritaire.
    25 7. Composition aqueuse selon Tune quelconque des revendications précédentes, caractérisée en ce qu'elle est susceptible d'être préparée par les étapes successives suivantes :
    a. dissolution du chitosane dans de l'eau par ajout d'acide tel qu'un acide faible, ledit acide faible étant avantageusement choisi dans le groupe constitué par l'acide acétique, l'acide glycolique, l'acide lactique, l'acide glutamique, ou tel qu’un acide fort, ledit acide fort étant avantageusement l’acide chlorhydrique, et leurs mélanges,
    b. ajout le cas échéant d’au moins un composé choisi parmi les composés de la matrice extracellulaire comme le collagène, l’élastine, les glycoprotéines, les glycosaminoglycanes,
  5. 5 les protéoglycanes et/ou par au moins un substituant de la matrice extracellulaire, et
    c. réajustement optionnel du pH pour obtenir une composition aqueuse présentant un pH inférieur à 8,5, préférentiellement un pH compris entre 4 et 7,5.
  6. 8. Composition aqueuse selon l’une quelconque des revendications précédentes, susceptible d’être obtenue selon la revendication 7, caractérisée en ce que, lors de l'étape de dissolution
    10 de la revendication 7, l'acide est ajouté en une quantité strictement nécessaire à la dissolution du chitosane.
  7. 9. Composition aqueuse selon l’une quelconque des revendications précédentes, susceptible d’être obtenue selon la revendication 7 ou 8, comprenant une étape d’ajout d’un agent de dispersion, avantageusement choisi parmi le mannitol, le glycérol, le sorbitol et leurs
    15 mélanges.
  8. 10. Composition aqueuse selon l’une quelconque des revendications précédentes, caractérisée en ce que ladite composition aqueuse est liquide, sous forme de gel ou obtenue après sa dispersion dans un véhicule dermatologiquement et/ou cosmétiquement acceptable.
  9. 11. Composition aqueuse selon l’une quelconque des revendications précédentes, caractérisée 20 en ce que ladite composition comprend au moins un composé actif tel qu'un composé analgésique, anesthésique local, tel que la lidocaïne, mépivacaïne, bupivacaïne ou ropivacaïne, un composé angiogénique, ou encore un composé actif du type facteur de croissance ou oligosaccharide bioactif.
  10. 12. Composition aqueuse selon l’une quelconque des revendications précédentes, formulée 25 pour être administrée par injection intradermique, par injection sous-cutanée ou intrapéritonéal.
  11. 13. Composition aqueuse selon l’une quelconque des revendications précédentes, pour son utilisation comme composition dermatologique ou encore comme dispositif médical.
  12. 14. Composition aqueuse selon l’une quelconque des revendications précédentes, pour son utilisation comme implant biorésorbable ou partiellement biorésorbable.
  13. 15. Composition aqueuse selon l’une quelconque des revendications précédentes, pour son utilisation dans la réparation ou la reconstruction des tissus cutanés ou sous-cutanés du visage
    5 ou du corps.
  14. 16. Composition aqueuse selon l’une quelconque des revendications précédentes, pour son utilisation pour le comblement des cavités du visage, pour la création ou l'augmentation de volumes du visage ou du corps humain, ou encore pour la cicatrisation de la peau.
  15. 17. Composition aqueuse selon l’une quelconque des revendications précédentes, pour son
    10 utilisation en chirurgie, en médecine ou chirurgie esthétique ou en angiologie.
  16. 18. Composition aqueuse selon l’une quelconque des revendications précédentes ou composition aqueuse de chitosane comprenant entre 0,5 et 2 % en poids de chitosane par rapport au poids total de la composition, pour son utilisation dans l’augmentation du volume d’adipocytes.
    15 19. Composition aqueuse selon l’une quelconque des revendications précédentes ou
    Composition aqueuse de chitosane comprenant entre 0,5 et 2 % en poids de chitosane par rapport au poids total de la composition, pour son utilisation dans le traitement ou la lutte contre le vieillissement de la peau.
    1/3
    A
    Contraste de phase
    Hoecht
    AdipoRed
    05% 0 75% 10% 2 0%
    AritpoRed
    AdipoRed
    AdipoRed
    AdipoRed
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