ACIDE HYALURONIQUE RETICULE SOLUBLE DANS L'EAU, SON
PROCEDE DE PREPARATION, IMPLANT CONTENANT LEDIT ACIDE
HYALURONIQUE RETICULE, ET SON UTILISATION
L' invention concerne un acide hyaluronique réticulé, généralement soluble dans l'eau, un procédé de préparation dudit acide hyaluronique réticulé, et un implant contenant ledit acide hyaluronique réticulé. Ledit acide hyaluronique réticulé est destiné à être utilisé en médecine humaine ou vétérinaire, et en particulier en chirurgie principalement réparatrice et/ou esthétique.
L'acide hyaluronique est un polysaccharide qui présente l'avantage de se trouver sous la même forme chimique quelle que- soit sa source. Il est constitué d'une alternance d'unités de monosaccharides d'acides N-acétyl-D-glucosamides et D-glucoroniques reliées par des liaisons glycolides β 1-3. L'acide hyalurqnique se rencontre habituellement sous la forme d' un gel de hyaluronate de sodium. Le poids moléculaire de
; l'acide hyaluronique se situe généralement dans la gamme de 500.000 à 7 millions g/mol et même au-delà. La formule développée de l'acide hyaluronique est donnée ci-après, où n est généralement de 1.200 à 18.000. Ceci correspond à une gamme de l'acide hyaluronique de- 500.000 à 7.000.000 g/mol. Les groupements terminaux sont tels que connus de l'homme du métier.
Acide hyaluronique
L' acide hyaluronique est présent dans le corps humain, dans l'humeur vitrée en forte concentration/ dans les tissus mous où il forme l'un des composants majeurs de la matrice extracellulaire, dans le cartilage hyalin et dans le liquide synovial où il joue le rôle de lubrifiant et d'amortisseur vis-à-vis des chocs, ainsi que dans le tissu dermique et épidermique où il joue un rôle d'hydratation et contribue à l'élasticité des tissus.
L' acide hyaluronique peut également être obtenu par plusieurs procédés, parmi lesquels on peut citer une extraction à partir de crête de coq ou une production par fermentation bactérienne. Ces deux origines présentent chacune des avantages et des inconvénients. En effet, l'acide hyaluronique extrait de la crête de coq présente des masses moléculaires très élevées mais contient des protéines animales responsables de phénomènes allergisants. En revanche, l'acide hyaluronique obtenu par fermentation bactériennne {streptococcus) présente
des masses moléculaires moins élevées même si il est dépourvu de protéines animales.
Les applications de l'acide hyaluronique dans plusieurs domaines ont été largement référencées comme par exemple dans le domaine médical, par exemple en chirurgie oculaire, en rhumatologie, ou en pharmacologie, ou bien dans le domaine chirurgical et dermatologique (chirurgie réparatrice et/ou esthétique) , ou encore dans le domaine de la cosmétique. En effet, sa facilité d'injection et sa sécurité d'emploi, mais surtout sa biocompatibilité et son absence de toxicité, ainsi que ses propriétés physico-chmiques, en font un composé de choix dans diverses applications biomédicales. Les gels de hyaluronate de sodium sont particulièrement appréciés et largement utilisés en chirurgie oculaire. De tels gels présentent de façon remarquable une viscoélasticité intéressante dans les interventions de la chirurgie de la cataracte. Ces mêmes gels sont utilisés en dermatologie et chirurgie plastique dans le ' traitement du vieillissement cutané comme produit de comblement, mais - présentent l'inconvénient de se dégrader rapidement, d'où la nécessité de remédier à des injections répétées.
Il a été démontré que les concentrations ainsi que la qualité de l'acide hyaluronique dans les différents tissus de l'organisme diminuent au cours de la vie, que ce soit de façon naturelle ou par le biais de facteurs extérieurs tels qu'une exposition solaire ou une pathologie inflammatoire. Par exemple, dans les problèmes de gonarthrose (pathologie inflammatoire du genou) , il a été observé une diminution de la concentration et du poids moléculaire de l'acide hyaluronique présent dans le liquide synovial. Ce phénomène s'explique d'une part par
une baisse de la synthèse endogène d'acide hyaluronique et d'autre part par l'inflammation qui génère des radicaux libres responsables de la dégradation de l'acide hyaluronique. • La supplémentation en acide hyaluronique donne d'excellents résultats, en terme de tolérance et d'efficacité, mais reste très éphémère. En effet, l'acide hyaluronique est très sensible à la dégradation par différents facteurs tels que les facteurs thermique, enzymatique, radicalaire et/ou bactérien. C'est pourquoi les différentes modifications chimiques de l'acide hyaluronique connues à ce jour, qui sont principalement des réticulations consolidant son réseau tridimensionnel vis-à-vis des attaques enzymatiques, ont pour objectif de mettre à la disposition du . corps médical un acide hyaluronique modifié qui conserve ses propriétés originelles en améliorant seulement sa résistance à la dégradation in vivo. 1
Ainsi, il a été largement décrit dans la littérature différentes méthodes pour synthétiser des dérivés réticulés de l'acide hyaluronique, le plus souvent soit par étherification, soit par amidification. Si la réticulation se fait par étherification, on peut utiliser au moins un agent réticulant tel que la divinylsulfone, le formaldéhyde, un bis-époxyde, un composé bis-halogéné ou encore un alcool. Si la réticulation se fait par amidification, on peut utiliser au moins un agent réticulant tel que un amino-acide fonctionnel ou un oligomère ou polymère ayant deux ou plus groupements aminés. Dans tous les cas, l'état de la technique fait référence à des méthodes de préparation donnant des produits réticulés insolubles dans l'eau.
l'
Quelle que soit la méthode utilisée, le degré de réticulation et le choix de l'agent réticulant (plus ou moins hydrophile) déterminent l'insolubilité du gel dans 1 ' eau. Ainsi, la demande de brevet WO 01/58.961' décrit un procédé de réticulation d'acide hyaluronique par un mono-acide aminé bifonctionnel dont la L-Lysine. Mais les liaisons ainsi établies, par réticulation entre l'acide hyaluronique et amino-acide, principalement par 1' amidification de la liaison aminé en chaîne latérale, sont trop faibles pour résister longtemps aux phénomènes d'hydrolyse enzymatique qui se produisent in vivo. De plus, les agents de réticulation comme la L-Lysine ne présentent qu'un nombre limité de groupements aminés susceptibles de réagir, ce qui limite les possibilités de formation du réseau recherché. •
La demande de' brevet WO '00/46.252 décrit un procédé de réticulation d'acide hyaluronique et d'au moins un autre polymère. Ce procédé de réticulation fait intervenir au moins deux groupements fonctionnels différents dudit polymère et les fonctions hydroxyles et/ou carboxyles de l'acide hyaluronique. Parmi une nombreuse liste desdits polymères, les polypeptides sont cités de façon générale, sans identification de la nature précise de ces polypeptides. Or, à l'exception de la poly-L-lysine qui n'est pas mentionnée dans ladite demande de brevet, les polypeptides n'ont de façon générale pas de groupement aminé en chaîne latérale, et ne sont pas pas susceptibles de réticuler l'acide hyaluronique par amidification.
La demande de brevet WO 02/30.990 décrit un procédé- de réticulation d'acide hyaluronique et d'au
l'
moins un autre polymère ayant deux ou plus groupements aminés donnant des produits insolubles dans l'eau. Ce procédé de réticulation fait intervenir lesdits deux groupements aminés dudit polymère et la fonction carboxyle de l'acide hyaluronique. Parmi lesdits polymères, les peptides sont cités de façon générale, sans indication de la possibilité que ledit polymère soit de oligo-L-lysine. Parmi les polymères cités, seul le chitosan est exemplifié. Enfin, les acides hyaluroniques réticulés de ces trois demandes de brevet WO 01/58.961, WO 00/46.9252 et WO 02/30.990 présentent l'inconvénient d'être insolubles dans l'eau et très sensibles à une dégradation par voie bactérienne. Le but de la présente invention est de remédier aux inconvénients des produits connus à base d'acide hyaluronique réticulé. ' En particulier ces inconvénients sont une durée de vie trop courte, une difficulté de remettre ledit acide hyaluronique réticulé en solution aqueuse voire une sensibilité bactérienne élevée. L'invention y remédie principalement par l'élaboration d' un procédé de préparation original qui conduit à des acides hyaluroniques réticulés originaux, tant en terme d' homogénéité en solution aqueuse que de résistance éventuelle vis-à-vis du développement bactérien.
L' invention concerne donc un acide hyaluronique réticulé présentant une solubilité dans l'eau et susceptible d' être obtenu par un procédé de préparation comprenant la mise en contact en milieu aqueux d'au moins un acide hyaluronique ou un de ses sels, et d'au moins un agent réticulant comprenant au moins un oligopeptide ou polypeptide possédant au moins deux, de préférence au
moins cinq, de façon encore plus préférée au moins six unités lysine, ladite mise en contact s' effectuant en présence d'au moins un agent de couplage hydrosoluble, et d'au moins un catalyseur. Le milieu réactionnel de mise en contact est généralement et de préférence régulièrement agité.
Dans un mode de réalisation préféré, l'agent de couplage hydrosoluble est choisi parmi les carbodiimides hydrosolubles, de préférence dans le groupe formé par le l-éthyl-3- (3-dimethylaminopropyl) carbodiimide (EDC), le l-éthyl-3- (3-trimethylaminopropyl) carbodiimide (ETC) et le l-cyclohexyl-3- (2-morphilinoéthyl) carbodiimide (CMC), leurs sels dérivés et leurs mélanges. Dans un mode de réalisation préféré, indépendant ou non du mode de réalisation précédent, le catalyseur est choisi parmi les catalyseurs d' amidification permettant la formation d'esters activés, de préférence dans le groupe formé par le N-Hydroxy Succinimide (NHS) , le N-hydroxy benzotriazole (HOBt), le 3, 4-dihydro-3-hydroχy-4-oxo- 1,2,3-bènzo triazole (HOOBt), le l-hydroxy-7- azabenzotriazole (HAt) , et le N-hydroxysulfosuccinimide (Sulfo-NHS) , et leurs mélanges.
Les unités lysine de l'agent réticulant sont généralement et le plus souvent sous forme de sel (tel que bromhydrate, chlorydrate, trifluoracétate, etc..) afin qu'elles puissent être pratiquement totalement solubles dans l'eau.
L'acide hyaluronique ou un de ses sels mis en jeu pour cette phase de réticulation est généralement et de préférence à l'état natif (c'est-à-dire, tel qu'il est présent dans l'organisme à l'état physiologique et 'ou tel qu' il est excrété par les bactéries lors de sa production
par fermentation bactérienne), c'est-à-dire non modifié. Ledit acide hyaluronique mis en œuvre dans le procédé de la présente invention a généralement une masse moléculaire de 500.000 à 7.000.000 de daltons, de préférence de 1.000.000 à 5.000.000 de daltons. IT' est le plus souvent utilisé sous la forme d' hyaluronate de sodium . de concentration de 0,1 à 5% en poids, de préférence de 0,5 à 3% en poids. Plusieurs acides hyaluroniques de source ou de concentration différentes peuvent être utilisés pour la mise en contact avec l'agent réticulant, bien qu'une seule source d'acide hyaluronique soit généralement préférée. Par «un de ses sels », on entend selon l'invention un sel d'acide hyaluronique tel que le hyaluronate de sodium dont la fonction acide a été protégée par un chlorure de sodium.
L'agent réticulant 'comprenant au moins un oligopeptide ou polypeptide possédant au moins deux, de préférence au moins cinq, unités lysine est généralement et de préférence de la polylysine, de préférence sous la forme d'un sel de polylysine, tel que un trifluoroacétate de polylysine, un bromhydrate de polylysine, ou un chlorhydrate de polylysine. Avantageusement, un tel sel est hydrosoluble. Les unités lysine de la polylysine mise
• en jeu peuvent être sous forme Lévogyre (L-Lysine ou Poly-L-Lysine) ou sous forme dextrogyre (D-Lysine ou Poly-D-Lysine) , la forme lévogyre étant celle considérée le plus souvent à cause de sa présence dans la nature. La formule de la polylysine est donnée ci-après, où m est généralement de 2 à 50. La formule d'une unité lysine, elle, correspond à m = 1. Les groupements terminaux de cette polylysine sont : -COOH à une extrémité et -NH2 à l'autre extrémité ou sous forme de leurs sels.
La formule de l'acide hyaluronique réticulé
• selon l'invention est partiellement donnée ci-après, où n est généralement de 1.200 à 18.000, et m est généralement de 2 à 50 et préférentiellement de 2 à 15 La polylysine est, par un autre de ses groupements - NH2, reliée 'à une fonction carboxylique d'une unité d'acide hyaluronique/ donnant ainsi une liaison amide (non représentée' dans1 la formule ci-après) . A nombre de moles mises en jeu équivalentes, plus le nombre d'unités lysine augmente plus le produit final est réticulé. Si l'on choisit une polylysine ayant (n) unités lysine, elle a (n+1) groupements aminé susceptibles de réagir. De façon générale, c'est l'une des fonctions aminés pendantes (cf. celle (s) située (s) en epsilone, sur la chaîne pendante) qui a une plus forte réactivité que celle située sur le carbone en alpha de la fonction acide de la polylysine (voir shéma ci-après) . Pour simpifier, on parle ici et on exemplifie seulement la polylysine mais ceci s'applique plus généralement pour un agent réticulant selon l'invention tel qu'un polymère comprenant des unités lysine.
Acide hyaluronique réticulé
Une autre représentation dudit acide hyaluronique réticulé peut être :
HA — [poiyLys] — HA
I I
[HA]χ*
Où * : molécules d'acide hyaluronique susceptible de réagir avec une ou des fonctions aminés restées libres de la polylysine ; HA : unité d'acide hyaluronique ; et poiyLys = polylysine.
De préférence, ledit agent réticulant comprend au moins 50% en poids dudit oligopeptide ou polypeptide.
Les polypeptides ' peuvent être des homopolypeptides ou copolypeptides à base de lysine statistiques, blocs, segmentés, greffés, en étoile ; ou copolymères blocs dont l'un au moins des polymères est de structure peptidique à base de lysine, i.e. est un oligopeptide ou polypeptide comprenant au moins -50% en poids d'unités lysine.
Selon un mode de réalisation préféré de l'invention, ledit oligopeptide ou polypeptide est à base de polylysine. On entend ainsi selon l'invention que ledit oligopeptide ou polypeptide comprend au moins 50% en poids de polylysine.
Avantageusement selon l'invention, l'agent réticulant présente des propriétés de biocompatibilité, de biodégradabilité et éventuellement des propriétés bactériostatiques.
Les oligopeptides poly-cationiques sont reconnus
' pour leur pouvoir bactériostatique sur les germes Grand¬ et Gram-. Par exemple la polylysine est bactériostatique à des concentrations inférieures à 5μg/ml {Liang, JF&Kim, SC. Not only the nature of peptide but also the characteristics of cell membrane détermine the antimicroblal mechanism of a peptide. J. Peptide Res. , 1999, 53, 518-522; Nicholas Delihas, Lee W.Riley, Winnie Loor Jonathan Berkowitzr Natalia Poltoratzskaia . High sensitivity of mycobacterium species to the bactericidal activity by Polylysine. Fems Microbiology letters 132 (1995) 233-237) . Ces propriétés de biocompatibilité et ces propriétés bactériostatiques avantageuses peuvent se retrouver avantageusement au cours de la synthèse de . l'acide hyaluronique réticulé à l'aide de ces agents. De telles propriétés bactériostatiques sont généralement vérifiées par une mise en œuvre du' test d'épreuve, connu de l'homme du métier et' brièvement explicité ci-aprës.
Le principe général du « challenge-test » est de contaminer volontairement avec un taux déterminé, une matrice (Matière première, un implant, un hydrogel, etc..) à l'aide d'un inoculum préalablement sélectionné (Homogénéité et choix des souches) . On recherche et on suit au cours du temps le microorganisme inoculé.
De préférence, l'agent réticulant possède des propriétés bactériostatiques. En particulier, il possède généralement des fonctions NH3 + (issues de groupements
NH2) responsables de l'activité bactériostatique vis-à-
• vis des germes Gram+ et Gram-.
En particulier, la polylysine possède avantageusement des propriétés bactériostatiques (aux concentrations et au pH utilisées dans le milieu réactionnel) qui peuvent être intéressantes pendant le
procédé de préparation de l'acide hyaluronique réticulé selon l'invention, ce qui permet de limiter une éventuelle contamination bactérienne du milieu réactionnel.
De plus, la polylysine possède une excellente tolérance vis-à-vis de l'organisme comparée aux agents couramment utilisés. En effet, la DL50 chez le rat par voie orale d'après les « material safety data sheet » donne les éléments suivants pour différents agents réticulants potentiels de l'acide hyaluronique. La DL 50 (Dose Léthale 50) correspond à la quantité administrée d'une substance déterminée qui va entraîner la mort chez 50% de animaux testés.
La mise en contact selon l'invention est généralement principalement une mise en réaction d' amidification, qui est la réaction visée. Par "mise en contact", on entend selon l'invention, la création de liaisons ioniques et/ou hydrogènes. Par "mise en réaction", on entend selon l'invention la création de liaisons covalentes.
Avantageusement selon l'invention, l'agent réticulant comprend plusieurs unités cationiques qui interviennent pour établir des liaisons covalentes avec
l'acide hyaluronique par amidification et des liaisons non covalentes (hydrogènes, ioniques) avec le même acide
- hyaluronique. Un réseau se forme alors par des réactions de réticulation chimiques et physiques. C'est la présence d' au moins trois groupements aminé dans chacun des polymères à base de polylysine, susceptibles de générer ces réactions d' amidification, qui fait que ces composés sont tout à fait particuliers au sein de cette famille de polypeptides. Ainsi, la réticulation par un oligomère ou un polymère (oligopeptide ou polypeptide) , contenant au moins deux unités lysine, et de préférence à base de polylysine, ne fait intervenir qu'un seul type de groupement fonctionnel, les fonctions aminé. De plus, il se produit au moins 50% de plus de réactions covalentes ou ioniques qu'avec de la lysine, ce qui rend le réseau ainsi créé beaucoup plus résistant aux phénomènes d'hydrolyse enzymatique qui se produisent in vivo. Enfin, le nombre de réactions est maximisé de façon à créer un véritable réseau tridimensionnel tout en conservant des propriétés de solubilité dans l'eau, pratiquement identiques à celles de l'acide hyaluronique natif.
Les différents travaux effectués par la Société Demanderesse sur l'acide hyaluronique réticulé selon l'invention ont permis avantageusement de déterminer d' une part un rapport idéal entre le nombre de fonctions aminés 'de la polylysine mis en jeu et le nombre de fonctions carboxyliques de l'acide hyaluronique susceptible de réagir ; et d'autre part un rapport entre le nombre d'équivalent mis en jeu de polylysine et le nombre d'équivalent de catalyseur.
Ainsi, le nombre de fonctions aminés mises en jeu de l'oligo ou polypeptide doit généralement
représenter de 2 à 7% du nombre de fonctions carboxyliques de l'acide hyaluronique susceptibles de réagir. De plus, le nombre d'équivalent de polylysine mis en jeu doit généralement représenter de 1 à 8 fois et de façon préféré de 3 à 7 fois le nombre équivalent de catalyseur.
Quelle que soit la taille de la polylysine mise en jeu, il est généralement important pour obtenir l'acide hyaluronique réticulé selon l'invention de conserver les rapport entre le nombre de fonction aminé et nombre de fonction carboxyle ainsi que le rapport entre le nombre d' équivalent catalyseur et le nombre de fonction carboxyle de l'acide hyaluronique.
Par «acide hyaluronique réticulé », on entend selon l'invention un réseau moléculaire constitué par des molécules d' acide hyaluronique • liées entre elles par des liaisons covalentes et/ou ioniques. Ce réseau tridimensionnel ainsi formé est avantageusement dense selon l'invention, et par conséquent résistant vis-à-vis de différents facteurs de dégradation. En effet, le réseau formé par l'acide hyaluronique réticulé est rendu particulièrement dense, ce qui permet par conséquence avantageusement de le rendre moins sensible aux différents facteurs de dégradation in vivo tels que facteur thermique, facteur enzymatique, facteur bactérien et . oxydation, et différent facteurs enzymatiques non spécifiques de l'acide hyaluronique tels que peptidases, transglutaminase, etc..
En effet l'encombrement stérique du réseau ainsi formé ne permet pas à ces différents facteurs d'accéder aisément à la structure interne du réseau.
Cette modification chimique entre l'acide hyaluronique, généralement à l'état natif, de départ et l'acide hyaluronique réticulé selon l'invention peut se quantifier à concentration équivalente par des mesures rhéologiques comparatives entre l'état natif de l'acide hyaluronique et le même acide hyaluronique réticulé. Ainsi, on mesure les modules visqueux, les modules élastiques, l'angle de perte (donnant la force du gel ainsi obtenu) , ainsi que sa viscosité, à une vitesse de cisaillement donnée. Cela est réalisé selon le protocole suivant :
L'acide hyaluronique réticulé est mis en solution à une concentration de 2,4% poids/volume dans un liquide tel que du sérum physiologique (l'homme du métier est généralement • à même de choisir ledit liquide de façon adéquate) . Il est traité avec une géométrie cône-plan 4cm, 4°, à une température d'environ 25°C. Il subit d'abord bn test viscoélastique non destructif à IHz, avec une déformation imposée de 1%. Le module élastique
(G'), le module visqueux (G''), ainsi quet l'angle de perte (δ) [= Inv Tan (G' ' /G' ) ] peuvent ainsi être mesurés .
Après ce test viscoélastique, l'échantillon subit aussitôt à environ 250C un gradient de cisaillement qui permet de constater l'évolution de la viscosité (η) en fonction du cisaillement. Les mesures ont toutes été réalisées à l'aide d'un rhéomètre de type AR 2000 de la société TA Instruments. Les valeurs obtenues pour l'acide hyaluronique réticulé selon l'invention sont généralement et de préférence les suivantes :
Module élastique Module visqueux δ (Angle de Viscosité η Pa.s G' (Pa) G' ' (Pa) perte) en ° (0,05 s"1)
• 550 à 1000 100 à 200 10 à 20 2600 à 7000
Ainsi l'acide hyaluronique réticulé selon l'invention a des caractéristiques rhéologiques, une fois mis en solution, très différentes de l'acide hyaluronique (pour lequel, à titre d'exemple on peut donner dans les mêmes conditions de mesure des valeurs • du module élastique de 382, de module visqueux de 153, d'angle de perte δ de 22 et de viscosité η de 894) . Néanmoins, l'acide hyaluronique réticulé selon l'invention présente avantageusement de nombreuses propriétés de l'acide hyaluronique dont il est issu, à savoir entre autres biocompatibilité, solubilité dans l'eau, et conservation sous forme déshydratée.
Le catalyseur est généralement soluble1 dans l'eau.
L' invention concerne aussi le procédé de préparation tel que décrit plus haut et dont les conditions sont détaillées ci-dessous, qui permet d'obtenir l'acide hyaluronique réticulé selon l'invention.
La mise en contact s'effectue généralement à une température de 0 à 450C, de préférence de 5 à 250C, pour une durée de 0,5 à 10 heures, de préférence de 1 à 6 heures,, et à un pH de 4 à 10, de préférence de 4 à 8, de façon plus préférée de 5 à 8. Une fourchette de pH de 4 à 6 est aussi appréciée.
De préférence, le pH du milieu réactionnel est généralement maintenu pendant la mise en réaction de 4 à 6 et de façon plus préférée de 5 à 6 afin d'obtenir
avantageusement le meilleur compromis entre le rendement de la réticulation et la moindre dégradation de l'acide hyaluronique par hydrolyse acide. En effet, plus le pH est bas, plus cette cinétique de dégradation est grande. En fin de réaction seulement, le pH du milieu réac'tionnel est éventuellement remonté à une valeur de 6 'à 7 afin d'augmenter le rendement de l'extraction pendant la phase de précipitation.
Le procédé de préparation s'effectue généralement en présence d'un solvant, par exemple constitué d'une solution aqueuse de NaCl (typiquement à 1% en poids) . L'agent réticulant est généralement utilisé à raison de 0,02 à 0,2 équivalent d'unité aminé par équivalent d'unité monomère d'acide hyaluronique et de façon préférée de 0,02 à 0,07. équivalent d'unité aminé par équivalent d'unité monomère d'acide hyaluronique. Le catalyseur est généralement utilisé à raison de 0,003 à 0, 025, de préférence de 0,015 à 0,025, équivalent par équivalent d'unité monomère d'acide hyaluronique. Le pH est généralement établi et maintenu à sa valeur
•(sensiblement la même ou une valeur sensiblement dans la
(les) fourchette (s) indiquée (s) ), à l'aide par exemple d'une solution d'acide chlorhydrique diluée. Pendant la mise en contact, le milieu réactionnel est généralement laissé sous agitation.
Après le temps nécessaire à la réaction, l'acide hyaluronique réticulé obtenu étant généralement et pratiquement totalement soluble dans l'eau, le mélange réactionnel est généralement précipité dans un solvant organique type éthanol, isopropanol, acétone, éther ou
' autre, puis généralement séché sous vide puis éventuellement lyophilisé. Le solvant organique permet
avantageusement d'éliminer, d'une part, toute trace de catalyseur n' ayant pas réagi au cours de la réaction chimique de réticulation, toute trace d'agent réticulant n'ayant pas réagi et, d'autre part, tout type de sous- produit de réaction comme l'urée. Ceci permet de garantir un produit final pratiquement totalement pur, biocompatible et aseptisé par l'action du solvant organique de type éthanol, isopropanol, acétone, éther ou autre. On obtient ainsi au final un produit, qui est de l'acide hyaluronique réticulé selon l'invention, sous forme déshydratée, soluble dans l'eau, ce qui avantageusement le rend plus manipulable pour une formulation ultérieure, et ce qui améliore sa durée de conservation. Une telle forme* déshydratée permet ainsi d' optimiser la manutention et le stockage en vue de son utilisation.
Le caractère reproductible du procédé de préparation a été démontré par la détermination des mesures rhéologiques (G', G'', δ et η) ou ; par la détermination de la masse moléculaire de l'acide hyaluronique réticulé obtenu, masse moléculaire généralement obtenue par chromatographie d'exclusion sérique, ainsi qu'il sera explicité par la suite. En effet, il a été possible d'obtenir ainsi de façon régulière des fractions solubles dudit polymère d' acide hyaluronique réticulé.
L'invention concerne donc également tout acide hyaluronique réticulé susceptible d'être obtenu selon l'invention, présentant, généralement et le plus souvent, une solubilité dans l'eau révélée généralement en ce que la totalité des Ig de fibres du polymère déshydraté
obtenu selon l'invention se désagrègent en quelques minutes et se solubilisent totalement dans un litre de solution de sérum physiologique après quelques heures, sans agitation. La solubilité dans l'eau peut aussi être montrée, par la possibilité de calcul de la1 masse moléculaire par chromatographie d'exclusion sérique qui montre généralement une fraction soluble dudit acide hyaluronique réticulé de 100 à 5%, de préférence de 100 à
• 30%. Un acide hyaluronique réticulé présentant une telle solubilité dans l'eau est qualifié indifféremment de « soluble dans l'eau » ou d' « hydrosoluble ». Un tel acide hyaluronique réticulé n'avait jusqu'alors pas été décrit. En effet, dans les demandes de brevet WO 00/46.252 et WO 02/30.990 précédemment citées, il est précisé que, de toutes les façons, le produit obtenu n'est pas soluble dans l'eau (cf. page 20 lignes 1 à 5 de ladite demande de brevet WO 00/46.252 et cf. tout le texte de la demande de brevet WO 02/30.990) . La détermination de masse moléculaire de l'acide hyaluronique réticulé selon l'invention est
• généralement obtenue par chromatographie d'exclusion sérique. Cette méthode d'analyse de masse moléculaire permet généralement de déterminer la masse moléculaire moyenne de l'acide hyaluronique réticulé, englobant des fractions les plus petites aux fractions les plus grosses. Les fractions solubles dudit acide hyaluronique réticulé polymère ainsi mesurées sont toujours de 100% à 5%, préférentiellement de 100% à 30%. Avantageusement, une telle propriété de solubilité de l'acide hyaluronique réticulé selon l'invention permet de le formuler un hydrogel.
l'
L'invention concerne aussi un hydrogel comprenant au moins ledit acide hyaluronique réticulé selon l'invention et au moins un solvant aqueux. De préférence un tel solvant aqueux est une solution de chlorure de sodium, du sérum physiologique, une solution tampon injectable telle qu'une solution de tampon phosphate ou de l'Eau Pour Préparation Injectable (ou E. P. P. I), généralement additionnée d'un sel.
Selon invention, on entend par « hydrogel » un gel d' acide hyaluronique réticulé obtenu par solubilisation dans de l'eau (par exemple par l'intermédiaire d'un solvant aqueux) dudit acide
• hyaluronique réticulé. La concentration d'acide hyaluronique réticulé dans un tel hydrogel est généralement et de préférence de 1 à 4%, de préférence de 1,8 à 3%, poids / volume.
L'invention concerne de plus un implant comprenant au moins un acide hyaluronique réticulé conforme à l'invention. En particulier, l'invention concerne un implant comprenant au moins un hydrogel conforme à l'invention, tel que précisé ci-dessus. Ainsi l'invention concerne tout implant comprenant au moins un acide hyaluronique réticulé conforme à l'invention, et éventuellement au moins un solvant aqueux. ' Un tel implant subit en général au moins un cycle de stérilisation tel que connu de l'homme du métier avant d'être utilisé en tant qu'implant. L'acide hyaluronique réticulé selon l'invention possède des caractéristiques physicochimiques particulièrement intéressantes notamment vis-à-vis de sa sensibilité à la température dans le cadre de l'au moins un cycle de stérilisation recommandé par la Pharmacopée Européenne. En effet ses paramètres
rhéologiques selon l'invention (à savoir : module élastique G' , module visqueux G' ' , angle de perte δ et viscosité η) sont moins affectés qu'un acide hyaluronique natif par un tel cycle, i.e. l'angle de perte varie généralement au cours d'un tel cycle de moins de 50% et la viscosité varie généralement au cours d'un tel cycle de moins de 30%. Typiquement un tel cycle est un cycle de stérilisation par la chaleur, de 1180C à 1300C pour une durée de deux à trente minutes. Ceci est particulièrement avantageux.
La concentration d' acide hyaluronique réticulé dans un tel implant est généralement et de préférence d'environ 1 à environ 4%, de préférence d'environ 1,8 à environ 3%, poids / volume. Généralement, pour une concentration inférieure à 1%,' l'efficacité de l'implant dans le temps n'est pas suffisante,, et au-delà de 4%, les valeurs des paramètres rhéologiques mesurées i stagnent tandis que l'on est confronté à un souci d' injectabilité au travers d'aiguille de fine Gauge (> 26G) . ' Avantageusement et selon l'invention, ledit implant est injectable, hydrosoluble, et présente généralement une viscosité intrinsèque suffisante pour être injecté à travers une aiguille de gauge 25 à 30, par exemple de 800 à 4000 m3/kg à 25°C. L'invention concerne enfin l'utilisation dudit implant. en médecine humaine ou vétérinaire, en particulier en chirurgie réparatrice et/ou esthétique. Dans le cadre de son utilisation en chirurgie esthétique et/ou réparatrice, de préférence esthétique, ledit ' implant selon l'invention est utilisé en tant que matériau de comblement. Ces implantations pourront avoir pour but :
_ la supplémentation d'une cavité ou organe déficitaire en acide hyaluronique (typiquement en dermatologie, en médecine esthétique, ou dans les traitements orthopédiques) ; ' la reconstitution d' un volume épanché lors d' interventions chirurgicales (typiquement en chirurgie oculaire) ;
_ l'application topique sur le derme sain ou lésé (typiquement en cosmétologie et dermatologie) ; _ ou encore la participation, en tant que fluide vecteur, à l'implantation d'un matériau ou d'un principe actif pharmaceutique.
En dermatologie esthétique, par exemple, un tel implant pourra être utilisé à des fins de comblement. Un tel comblement comprend le comblement des rides, ridules, dépressions cutanées et cicatrices du corps humain ou animal, y compris le comblement des défects 'cutanés secondaires à la prise d'un traitement pouvant entraîner une lipodystrophie se caractérisant le plus sourvent par une lipoatrophie faciale. Une telle utilisation se situe donc principalement dans le domaine de la chirurgie réparatrice ou plastique, ou dans le domaine de la dermatologie esthétique.
Ledit implant est généralement injectable par voie sous-cutanée ou intradermique dans le tissu fibreux. Ledit implant peut également être injecté directement par voie intra-articulaire synovial afin de restaurer les fonctions physiologiques du liquide synovial, dans le domaine orthopédique, et plus précisément dans lé traitement de la gonarthrose.
Avantageusement, l'implant selon l'invention pallie les inconvénients de l'art antérieur, puisque
ledit implant est avantageusement un produit soluble dans l'eau et pratiquement totalement biocompatible avec le corps humain ou animal. Il permet, par exemple, de combler les rides, ridules, citatrices ou dépressions cutanées par un produit simple et efficace, à biorésorbabilité pratiquement totale, et ce sans libération de produits secondaires toxiques. En effet, les produits de dégradation d'un tel implant in vivo sont d'une part les monomères d'acide hyaluronique et d'autre part les unités de lysine, amino-acide hydrosolouble, biocompatible et atoxique.
Par « implant », on entend selon l'invention aussi bien une composition destinée à être implantée qu'une composition qui a été implantée, dans le corps humain ou animal.
L'implant selon l'invention peut comprendre en outre au moins un fluide vecteur, différent de l'hydrogel selon l'invention. Dans un mode de réalisation de l'invention, l'implant comprend ainsi en outre au moins un élément choisi dans le groupe formé par les dérivés cellulosiques tels que la Carboxy Méthyl Cellulose, l'HPMC (Hydroxy Propyl Méthyl Cellulose), l'HPC (Hydroxy Propyl Cellulose) et les glycosaminoglycannes tel qu'un hyaluronate de sodium ou encore les polysaccharides branchés de type xanthane. De préférence dans un tel cas, l'implant est un gel comprenant au moins un élément choisi dans la famille des glycosaminoglycannes tel qu'un acide hyaluronique ou un de ses sels ou un dérivé d'un de ses sels, plus ou moins visqueux, réticulé ou non, en plus de l'acide hyaluronique réticulé conforme à l'invention.
On entend par « fluide vecteur » selon
l'invention un composé qui coexiste avec l'acide hyaluronique réticulé de l'invention et qui peut véhiculer un autre composé éventuel, par exemple sous forme de poudre solide, et qui est sous forme fluide. Le terme « fluide » comprend ici aussi un gel par exemple viscoélastique. On entend par « gel » selon l'invention une structure physique tridimensionnelle ayant des propriétés viscosifiantes et thixotropiques intéressantes. Par « tissu fibreux », on entend selon l'invention un espace sous-cutané de nature essentiellement fibreuse, et apte à être rempli par des produits de comblement. Par « sous-cutanée », on -entend selon l'invention hypodermique, donc sous le derme. Par « intradermique », on entend selon l'invention dans l'épaisseur du derme. Par •« intra-articulaire », on entend selon l'invention dans l'espace compris entre deux articulations dans le liquide synovial'. Par
« biocompatible », on entend selon l'invention c împatible avec le corps humain ou animal. En partie ilier un matériau biocompatible est, selon l'invention, un matériau répondant aux critères donnés par la norme ISO 10993 relative aux dispositifs médicaux.
La mise en place (ou implantation) de l'implant dans l'organisme a essentiellement pour but de pallier à un déficit en acide hyaluronique, notamment dans le traitement de l'arthrose du genou, mais aussi de combler un défect cutané d' origine naturel dans le cas du vieillissement cutané ou d'origine iatrogène et/ou dans le cas de lipoatrophie faciale chez les patients infectés par le V. I.H. La démarche suivie est de supplémenter l'organisme par un implant chimiquement modifié totalement biocompatible respectant les propriétés
physicochimiques de l'acide hyaluronique endogène en possédant une durée de vie dans l'organisme suffisante pour pallier ce déficit. Le choix d'un implant comprenant au moins un acide hyaluronique réticulé selon l'invention permet avantageusement d'allier le maximum d'efficacité avec un minimum de risques.
En effet, aucun implant non résorbable ne parait généralement souhaitable. Ainsi, avantageusement selon l'invention, l'acide hyaluronique réticulé conforme à l'invention se dégrade ou se solubilise pratiquement totalement après injection sous-cutanée ou intradermique ou intra-articulaire, puis est pratiquement totalement éliminé de l'organisme par les processus naturels tels que l'hydrolyse enzymatique. Un implant selon l'invention sous forme d'hydrogel d'acide hyaluronique réticulé selon l'invention, ne doit généralement pas se dégrader en moins de 6 mois et doit généralement être dégradé en moins de 18 mois. I
En outre, l'implant selon l'invention, ' lorsqu'il est injectable, allie avantageusement la commodité d'emploi, la seringabilité du produit, la résorbabilité en un temps contrôlé.
L'implant selon l'invention est de façon particulièrement préférée un hydrogel biocompatible, soluble dans de l'eau pour préparation injectable additionnée d' un chlorure de sodium ou directement une solution de chlorure de sodium isotonique ou dans une solution tampon de qualité injectable.
Les exemples suivants illustrent l'invention sans pour autant en limiter la portée.
Exemples
Vingt-six exemples (de 1 à 16) d'acides hyaluroniques réticulés selon l'invention et douze exemples d'implants (de 27 à 38) sont donnés ci-après.
Les exemples donnés ci-après ont permis d' obtenir un polymère d'acide hyaluronique réticulé qui, une fois formulé à 2,4% dans une solution de chlorure de sodium isotonique, a des valeurs rhéologiques comprises comme suit :
Module élastique Module visqueux δ (Angle de Viscosité η Pa.s G' (Pa) G' ' (Pa) perte) en ° (0,05 s"1)
550 à 1000 100 à 200 10 à 20 2600 à 7000
Tous les exemples cités ci-après sont donnés avec des polylysines disponibles dans le catalogue SIGMA ALDRICH.
Exemple 1
1 g (2,49 mmol d'unités disaccharidiques de hyaluronate de sodium (Mw=2500000-3000000 g/mol) a été dissous dans 150 mL -d'une solution aqueuse de NaCl à 1 % en poids. A cette solution, ont été additionnés à 5 0C successivement 7., 17 mg (62,35. μmol) de N-hydroxysuccinimide (M = 115 g/mol), 66,38 mg (274,30 μmol) de trifluoroacétate de poly-L-lysine (Mw=2700 g/mol, comprend 11 unités lysine) et 0,44 mL ' d' EDC (l-éthyl-3- (3-dimethylaminopropyl) carbodiimide) (M = 155 g/mol) (2,49 mmol) . A 5 0C, le pH de la solution a ensuite été ajusté à 5 à l'aide d'une solution d'acide chlorhydrique 1 .N. Après 15 minutes
d'agitation à 5 0C, le mélange réactionnel a été précipité dans 1,5 L d'éthanol. Le précipité obtenu a alors été filtré, puis séché sous pression réduite en présence de P2O5 pendant 24 heures pour donner 1 g de d'acide hyaluronique réticulé.
Ce produit a alors été mis en solution à concentration de 2,4% Poids / volume dans du sérum physiologique.
Cette solution a été traitée avec une géométrie cône- plan 4cm, 4° à environ 25°C. Elle a d'abord subi un test viscoélastique non destructif à IHz, avec une déformation imposée de 1%. Les modules élastiques (G') et visqueux
(G''), ainsi que l'angle de perte (δ) ont pu être ainsi mesurés . Ces- mesures rendent compte, vraiment des performances d'un gel, par exemple une valeur de G' élevée couplée à une valeur de G'' faible rendent compte d'un gel fort.
Après le test viscoélastique, la solution! a subi aussitôt à 25°C un gradient de cisaillement qui permet de constater l'évolution de la viscosité en fonc 1tion du cisaillement.
Les mêmes mesures ont été réalisées pour l'acide hyaluronique natif de départ.
Les mesures, réalisées à l'aide d'un Rhéomètre type AR 2000 de la société TA Instruments, ont donné les résultats suivants :
Nous pouvons voir que l'acide hyaluronique réticulé selon l'invention possède un angle de perte (δ) plus faible ainsi qu'une viscosité (η) plus élevée que l'acide ' hyaluronique natif de départ. Cela démontre que la réticulation selon le procédé de l'invention a rendu le gel plus dense et plus fort, ce qui lui permet avantageusement de mieux résister aux facteurs de dégradation in vivo, et donc d'être plus efficace lorsqu'il est utilisé dans un implant.
' Les acides hyaluroniques réticulés des exemples 2 à 27 ci-après présentent tous des valeurs des paramètres de mesure rhéologiques sensiblement semblables à ceux de l'acide hyaluronique réticulé de l'exemple 1.
Exemple 2
La même procédure que dans l'exemple 1 a été utilisée avec 1 g (2,49 mmol d'unités disaccharidiques) de hyaluronate de sodium (Mw=2500000-3000000 g/mol), '7,17 mg
(62,35 μmol) de N-hydroxysuccinimide (M = 115 g/mol),
16,6 mg (68,6 μmol) de trifluoroacétate de poly-L-lysine
(Mw=2700 g/mol) et 0,44 mL d'EDC (M = 155 g/mol) (2,49 mmol) . Après filtration et séchage, 1 g d'acide hyaluronique réticulé sous là forme d'un solide blanc a été obtenu.
Exemple 3
La même procédure que dans l'exemple 1 a été utilisée ' avec 1 g (2,49 mmol d'unités disaccharidiques) de hyaluronate de sodium (Mw=2500000-3000000 g/mol), 7,17 mg (62,35 μmol) de N-hydroxysuccinimide '(M = 115 g/mol), 33,19 mg (137,15 μmol) de trifluoroacétate de poly-L- lysine (Mw=2700 g/mol) et 0,44 mL d'EDC (M = 155 g/mol) (2,49 mmol) . Après filtration et séchage, 1 g d'acide hyaluronique réticulé sous la forme d' un solide blanc a été obtenu.
Exemple 4 La même procédure que dans l'exemple 1 a été utilisée avec 1 g (2,49 mmol d'unités disaccharidiques) de hyaluronate de sodium (Mw=2500000-3000000 g/mol), 7,17 mg • (62,35 μmol) de N-hydroxysuccinimide (M = 115 g/mol),
49,79 mg- (205,74 μmol) de trifluoroacétate de poly-L- lysine (Mw=2700 g/mol) et 0,44 mL d'EDC (M = 155 g/mol)
(2,49 mmol) . Après filtration et séchage, 1 g d'acide
hyaluronique réticulé sous la forme d' un solide blanc a été obtenu.
Exemple 5 La même procédure que dans l'exemple 1 a été utilisée avec 1 g (2,49 mmol d'unités disaccharidiques) de hyaluronate de sodium (Mw=2500000-3000000 g/mol), 7,17 mg (62,35 μmol) de N-hydroxysuccinimide (M = 115 g/mol), 165,96 mg (685,79 μmol) de trifluoroacétate de poly-L- lysine (Mw=2700 g/mol) et 0,44 mL d' EDC (M = 155 g/mol) (2,49 mmol) . 1 g d'acide hyaluronique réticulé sous la forme d'un solide blanc a été obtenu.
Exemple 6 La même procédure que dans l'exemple 1 a été utilisée avec 1- g (2,49 mmol d'unités disaccharidiques) de' hyaluronate de sodium (Mw=250000'0-3000000 g/mol)',' ' 4', 3 ' mg
(37,41 μmol) de N-hydroxysuccinimide (M = 115 g/mol) ,
66,38 mg (274,3 μmol) de trifluoroacétate de poly-L- lysine (Mw=2700 g/mol) et 0,44 mL d'EDC (M = 155 g/mol)
(2,49 mmol) . Après filtration et séchage, 1 g d'acide hyaluronique réticulé sous la forme d'un solide blanc a été obtenu.
Exemple 7
La même procédure que dans l'exemple 1 a été utilisée avec 1 g (2,49 mmol d'unités disaccharidiques) de hyaluronate de sodium (Mw=2500000-3000000 g/mol), 4,3 mg (37,41 .μmol) de N-hydroxysuccinimide (M = 115 g/mol), 16,6 mg (68,6 μmol) de trifluoroacétate de poly-L-lysine
(Mw=2700 g/mol) et 0,44 mL d'EDC ' (M = 155 g/mol) (2,49 mmol) . Après filtration et séchage, 1 g d'acide
hyaluronique réticulé sous la forme d'un solide blanc a été obtenu.
Exemple 8 La même procédure que dans l'exemple 1 a été utilisée avec 1 g (2,49 mmol d'unités disaccharidiques) de hyaluronate de sodium (Mw=2500000-3000000 g/mol), 28,68 mg (249,38 μmol) de N-hydroxysuccinimide (M = 115 g/mol),
16,6 mg (68,6 μmol) de trifluoroacétate de poly-L-lysine (Mw=2700 g/mol) et 0,44 mL d'EDC (M = 155 g/mol) (2,49
• mmol) . Après filtration et séchage, 1 g d'acide hyaluronique réticulé sous la forme d'un solide blanc a été obtenu.
Exemple 9
La même procédure que dans l'exemple 1 a été utilisée avec 1 g (2,49 mmol d'unités disaccharidigues) de hyaluronate de sodium (Mw=2500000-3000000 g/mol)^, 114,71 mg (1 mmol) de N-hydroxysuccinimide (M = 115 g/mφl) , 16,6 mg (68,6 μmol) de trifluoroacétate de poly-rL-lysine
(Mw=2700 g/mol) et 0,44 mL d'EDC (M = 155 g/mol) (2,49 mmol) . Après filtration et séchage, 1 g d'acide hyaluronique réticulé sous la forme d'un solide blanc a été obtenu.
Exemple 10
La même procédure que dans l'exemple 1 a été utilisée avec 1 g (2,49 mmol d'unités disaccharidiques) de hyaluronate de sodium (Mw=2500000-3000000 g/mol), 16,6 mg (68,6 μmol) de trifluoroacétate de poly-L-lysine (Mw=2700 g/mol), 0,44 mL d'EDC (M = 155 g/mol) (2,49 mmol) et sans ajout de N-hydroxysuccinimide (M = 115 g/mol) . Après
f.iltration et séchage, 1 g d'acide hyaluronique réticulé sous la forme d'un solide blanc a été obtenu.
Exemple 11 La même procédure que dans l'exemple 1 a été utilisée avec 1 g (2,49 mmol d'unités disaccharidi'ques) de hyaluronate de sodium (Mw=2500000-3000000 g/mol) , 66,38 mg (274,30 μmol) de trifluoroacétate de poly-L-lysine
(Mw=2700 g/mol), 0,44 mL d'EDC (M = 155 g/mol) (2,49 mmol) et sans ajout de N-hydroxysuccinimide (M - = 115 g/mol) . Après filtration et séchage, 1 g d'acide hyaluronique réticulé sous la forme d'un solide blanc a été obtenu.
Exemple 12
1 g (2,49 mmol d'unités disaccharidique) de hyaluronate de sodium (Mw=2500000-3000000 g/mol) a' été dissous d'ans 150 mL d'une solution aqueuse de NaCl à 1 % en poids. A cette solution, ont été additionnés à 5 0C successivement 7,17 mg (62,35 μmol) de N-hydroxysuccinimide (M = 115 g/mol), 66,38 mg (274,30 μmol) de trifluoroacétate de poly-L-lysine (Mw=2700 g/mol) et 478 mg d'EDC.HCl (M = 191,5 g/mol) (2,49 mmol) . Durant la réaction le pH a été stable aux alentours de 5. Après 4 heures d'agitation à température ambiante, le pH du mélange réactionnel a été ajusté à 6,5 puis on a précipité ce mélange réactionnel dans 1,5 L d'éthanol. Le précipité obtenu a alors été filtré, puis séché sous pression réduite en présence de
• P2O5 pendant 24 heures pour donner 1 g de d'acide hyaluronique réticulé. La solubilité du polymère réticulé obtenu selon l'invention s'est trouvée confirmée par une dissolution rapide et complète sans agitation des Ig de
fibres obtenues dans 1 litre de solution de sérum physiologique.
Exemple 13 La même procédure que dans l'exemple 12 a été utilisée avec 1 g (2,49 mmol d'unités disaccharidiques) de hyaluronate de sodium (Mw=2500000-3000000 g/mol), 66,38 mg (274,30 μmol) de trifluoroacétate de poly-L-lysine
(Mw=2700 g/mol), 478 mg d'EDC.HCl (M = 191,5 g/mol) (2,49 mmol) et sans ajout de N-hydroxysuccinimide (M = 115 g/mol) . Après filtration et séchage, 1 g d'acide hyaluronique réticulé sous la forme d' un solide blanc a été obtenu.
Exemple 14
La même procédure que dans l'exemple 12 a été utilisée avec 1- g (2,49 mmol d'unités disaccharidiques) de hyaluronate de sodium (Mw=2500000-3000000 g/mol), 16,6 mg
(68,6 μmol) de trifluoroacétate de poly-L-lysine (Mw=2700 g/mol), 478 mg d'EDC.HCl (M = 191,5 g/mol) (2,49 mmol) et sans ajout de N-hydroxysuccinimide (M = 115 g/mol) . Après filtration et séchage, 1 g d'acide hyaluronique réticulé sous la forme d'un solide blanc a été obtenu.
Exemple 15
La même procédure que dans l'exemple 12 a été utilisée avec 1 g (2,49 mmol d'unités disaccharidiques) de hyaluronate de sodium (Mw=2500000-3000000 g/mol), 7,17 mg
(62,35 μmol) de N-hydroxysuccinimide (M = 115 g/mol), 16,6 mg. (68,6 μmol) de trifluoroacétate de poly-L-lysine
(Mw=2700 g/mol) et 478 mg d'EDC.HCl (2,49 mmol) . Après
filtration et séchage, 1 g d' acide hyaluronique réticulé sous la forme d'un solide blanc a été obtenu.
Exemple 16 La même procédure que dans l' exemple 12 a été utilisée avec 1 g (2,49 mmol d'unités disaccharidiques) de hyaluronate de sodium (Mw=2500000-3000000 g/mol), 7,17 mg
(62,35 μmol) de N-hydroxysuccinimide (M = 115 g/mol),
33,19 mg (137,15 μmol) de trifluoroacétate de poly-L- lysine (Mw=2700 g/mol) et 478 mg d'EDC.HCl (M = 191,5 g/mol) (2,49 mmol) . Après filtration et séchage, 1 g d'acide hyaluronique réticulé sous la forme d'un solide blanc a été obtenu.
Exemple 17
La même procédure que dans l'exemple 12 a été utilisée avec 1 g (2,49 mmol d'unités disaccharidiques) de hyaluronate de sodium (Mw=2500000-3000000 g/mol)L 4,3 mg (37,41 μmol) de N-hydroxysuccinimide (M = 115| g/mol), 66,38 mg (274,3 μmol) de trifluoroacétate de poly-L- lysine (Mw=2700 g/mol) et 478 mg d'EDC.HCl (M = 191,5 g/mol) ' (2,49 mmol) . Après filtration et séchage, 1 g d'acide hyaluronique réticulé sous la forme d'un solide blanc a été obtenu.
Exemple 18
La même procédure que dans l'exemple 12 a été utilisée avec 1 g (2,49 mmol d'unités disaccharidiques) de hyaluronate de sodium (Mw=2500000-3000000 g/mol), 4,3 mg (37,41 μmol) de N-hydroxysuccinimide (M = 115 g/mol), 16,6 mg (68,6 μmol) de trifluoroacétate de poly-L-lysine (Mw=2700 g/mol) et 478 mg d'EDC.HCl (M = 191,5 g/mol)
(2,49 mmol) . Après filtration et séchage, 1 g d'acide hyaluronique réticulé sous la forme d'un solide blanc a été obtenu.
Exemple 19
La même procédure que dans l'exemple 12 a été' utilisée avec 1 g (2,49 mmol d'unités disaccharidiques) de hyaluronate de sodium (Mw=2500000-3000000 g/mol), 7,17 mg (62,35 μmol) de N-hydroxysuccinimide (M = 115 g/mol), 3,32 mg (13,72 μmol) de trifluoroacétate de poly-L-lysine (Mw=2700 g/mol) et 478 mg d'EDC.HCl (M = 191, 5 . g/mol) (2,49 mmol) . Après filtration et séchage, 1 g d'acide hyaluronique réticulé sous la forme d'un solide blanc a été obtenu.
Exemple 20
2,49 mmol d'unités disaccharidiques de hyaluronate de sodium (Mw=2500000-3000000 g/mol) ont été dissoutes dans
150 mL d'une solution aqueuse de NaCl à 1 % en poids. A cette solution, ont été .additionnés à 5 0C successivement
(62,35 μmol) de N-hydroxysuccinimide (M = 115 g/mol,
(274,30 μmol) de chlorydrate de poly-L-lysine
(347,28g/mol soit 2 unités lysine) et 0,44 mL d'EDC (1- éthyl-3- (3-dimethylaminopropyl) carbodiimide) (M = 155 g/mol) (2,49 mmol) . A 5 0C, le pH de la solution a ensuite été ajusté à 5 à l'aide d'une solution d'acide chlorhydrique 1 N. Après 15 minutes d'agitation à 5 °C, le mélange réactionnel a été précipité dans 1,5 L d'éthanol. Le précipité obtenu a alors été filtré, puis séché sous pression réduite en présence de P2O5 pendant
24 heures pour donner 1 g de d'acide hyaluronique réticulé.
Exemple 21
2,49 mmol d'unités disaccharidiques de hyaluronate de sodium (Mw=2500000-3000000 g/mol) ont été dissoutes dans 150 mL 'd'une solution aqueuse de NaCl à 1 % en poids. A cette solution, ont été additionnés à ' 25 0C successivement (62,35 μmol) de N-hydroxysuccinimide (M = 115 g/mol), (274,30 μmol) de chlorydrate de poly-L-lysine (347,28g/mol soit 2 unités lysine) et d'EDC.HCL (M = 191,5 g/mol) (2,49 mmol) . Le pH devait se situer de 4 à 6. Après 4 heures d'agitation à 25 0C, le mélange réactionnel a été précipité dans 1,5 L d'éthanol. Le précipité obtenu a alors été filtré, puis séché sous pression réduite en présence de P2O5 pendant 24 heures pour donner 1 g de d'acide hyaluronique réticulé.
Exemple 22
2,49 mmol d'unités disaccharidiques de hyaluronate de sodium (Mw=2500000-3000000 g/mol) ont été dissoutes dans 150 mL d'une solution aqueuse de NaCl à 1 % en poids. A cette solution, ont été additionnés à 25 0C successivement (62,35 μmol) de N-hydroxysuccinimide (M = 115 g/mol), (411,45 μmol) de chlorydrate de poly-L-lysine (347,28g/mol soit 2 unités lysine) et d'EDC.HCL (M = 191,5 g/mol) (2,49 mmol) . Le pH devait se situer de 4 à 6. Après 4 heures d'agitation à 25 0C, le mélange réactionnel a été précipité dans 1,5 L d'éthanol. Le précipité obtenu a alors été filtré, puis séché sous pression réduite en présence de P2O5 pendant 24 -heures pour donner 1 g de d'acide hyaluronique réticulé.
Exemple 23
2,49 mmol d'unités disaccharidiques de hyaluronate de sodium (Mw=2500000-3000000 g/mol) ont été dissoutes dans 150 mL d'une solution aqueuse de NaCl à 1 % en poids. A cette solution, ont été additionnés à 25 °C successivement (62,35 μmol) de N-hydroxysuccinimide (M = 115 g/mol), (548,60 μmol) de chlorydrate de poly-L-lysine (347,28g/mol, soit 2 unités lysine) et d'EDC.HCL (M = 191,5 g/mol) (2,49 mmol) . Le pH devait se situer de 4 à 6. Après 4 heures d'agitation à 25 0C, le mélange réactionnel a été précipité dans 1,5 L d'éthanol. Le précipité obtenu a alors été filtré, puis séché sous pression réduite en présence de P2O5 pendant 24 heures pour donner 1 g de d'acide hyaluronique réticulé.
Exemple 24
2,49 mmol d'unités disaccharidiques de hyaluronate de sodium (Mw=2500000-3000000 g/mol) ont été dissoώtes dans 150 mL d'une solution aqueuse de NaCl à 1 % en Ipoids . A cette solution, ont été additionnés à 25 °C successivement (62,35 μmol) de N-hydroxysuccinimide (M =
115 g/mol), (274,30 μmol) de bromhydrate de poly-L-lysine
(500-10'OOg/mol, soit entre 3.et 8 unités lysine) et d'EDC.HCL (M = 191,5 g/mol) (2,49 mmol) . Le pH devait se situer de 4 à 6. Après 4 heures d'agitation à 25 0C, le mélange réactionnel a été précipité dans 1,5 L d'éthanol. Le précipité obtenu a alors été filtré, puis séché sous pression réduite en présence de P2O5 pendant 24 heures pour donner 1 g de d'acide hyaluronique réticulé.
Exemple- 25
2,49 mmol d'unités disaccharidiques de hyaluronate de sodium (Mw=2500000-3000000 g/mol) ont été dissoutes dans 150 mL d'une solution aqueuse de NaCl à 1 % en poids. A cette solution, ont été additionnés à 25 0C successivement (62,35 μmol) de N-hydroxysuccinimide (M = 115 g/mol), (411,45 μmol) de bromhydrate de poly-L-lysine -(500-1000g/mol soit entre 3.et 8 unités lysine) et d'EDC.HCL (M = 191,5 g/mol) (2,49 mmol) . Le pH devait se situer de 4 à 6. Après 4 heures d'agitation à 25 0C, le mélange réactionnel a été précipité dans 1,5 L d'éthanol. Le précipité obtenu a alors été filtré, puis séché sous pression réduite en présence de P2O5 pendant 24 heures pour donner 1 g de d'acide hyaluronique réticulé.
Exemple 26
2,49 mmol d'unités disaccharidiques de hyaluronate de
• sodium (Mw=2500000-3000000 g/mol) ont été dissoμtes dans
150 mL d'une solution aqueuse de NaCl à 1 % en Ipoids. A cette solution, ont été additionnés à 25 °C successivement (62,35 μmol) de N-hydroxysuccinimide (M = 115 g/mol), (548,60 μmol) de bromhydrate de
(500-1000g/mol soit entre 3.et 8 unités lysine) et d'EDC.HCL (M = 191,5 g/mol) (2,49 mmol) . Le pH devait se situer de 4 à 6. Après 4 heures d'agitation à 25 °C, le mélange réactionnel a été précipité dans 1,5 L d'éthanol. Le précipité obtenu a alors été filtré, puis séché sous pression réduite en présence de P2O5 pendant 24 heures pour donner 1 g de d'acide hyaluronique réticulé.
. Quelques exemples de formulation d' implants à base d'hydrogel réticulé sont donnés ci-après.
Exemple 27
On a dissous sous agitation, dans 10 ml d'EPPI, 240 mg d'acide hyaluronique réticulé selon l'invention tel que celui de l'exemple 1, puis on a dissous 90mg de NaCl. On a réparti en seringues, on a bouché puis on a 'autoclave 15 minutes à 121°C (ce qui représente un cycle de stérilisation) .
Exemple 28
On a dissous sous agitation, dans 10 ml d'EPPI, 240 mg d'acide hyaluronique réticulé selon l'invention tel que celui de l'exemple 1, puis on a dissous 76mg de Na2HP04 et 18 mg de KH2PO4. On a réparti en seringues, on a bouché puis on a autoclave 15 minutes à 121°C.
Exemple 29
On a dissous sous agitation, dans 6 ml d'EPPI, 240 mg d'acide- hyaluronique réticulé selon l'invention tel que celui de l'exemple 1, puis on a dissous 76mg de Na2HPθ4 et 18 mg de KH2PO4 dans 4 ml d'EPPI. On a rajouté sous agitation les 4 ml de solution tampon ainsi préparée dans les 6 ml d'hydrogel préparé précédemment. On a réparti en seringues, on a bouché puis on a autoclave 15 minutes à 121°C.
Exemple 30
On a dissous sous agitation, dans 10 ml d'EPPI, 76mg de
Na2HPO4 et 18 mg de KH2PO4 puis on a dissous progressivement 240 mg d'acide hyaluronique réticulé selon l'invention tel que celui de l'exemple 1. On a
reparti en seringues, on a bouché puis on a autoclave 15 minutes à 121°C.
Exemple 31 On a dissous sous agitation, dans 10 ml d'EPPI, 180 mg d'acide hyaluronique réticulé selon l'invention tel que celui de l'exemple 1, puis on a dissous 90mg de NaCl. On a réparti en seringues, on a bouché puis on a autoclave 15 minutes à 121°C.
Exemple 32
On a dissous sous agitation, dans 10 ml d'EPPI, 180 mg d'acide hyaluronique réticulé selon l'invention tel que
• celui de l'exemple 1, puis on a dissous 76mg de Na2HP04 et 18 mg de KH2PO4. On a réparti en seringues, on a bouché puis on a autoclave 15 minutes à 1210C.
Exemple 33
On a dissous sous agitation, dans 6 ml d'EPPI,, 180 mg d'acide hyaluronique réticulé selon l'invention tel que celui de l'exemple 1, puis on a dissous 7βmg de Na2HPO4 et 18 mg de KH2PO4 dans 4 ml d'EPPI. On a rajouté sous agitation les 4 ml de solution tampon ainsi préparée dans les 6 ml d'hydrogel préparé précédemment. On a réparti en seringues, on a bouché puis on a autoclave 15 minutes à 1-21°C.
Exemple 34
On a dissous sous agitation, dans 10 ml d'EPPI, 7βmg de Na2HPO4 et 18 mg de KH2PO4 puis on a dissous progressivement 180 mg d'acide hyaluronique réticulé selon l'invention tel que celui de l'exemple 1. On a
réparti en seringues, on a bouché puis on a autoclave 15 minutes- à 121°C.
Exemple 35 On a dissous sous agitation, dans 10 ml d'EPPI, 300 mg d'acide hyaluronique réticulé selon l'invention tel que celui de l'exemple 1, puis on a dissous 90mg de NaCl. On a réparti en seringues, on a bouché puis on a autoclave 15 minutes à 121°C.
Exemple 36
On a dissous sous agitation, dans 10 ml d'EPPI, 300 mg d'acide hyaluronique réticulé selon l'invention tel que celui de l'exemple 1, puis on a dissous 76mg de Na2HPθ4 et 18 mg de KH2PO4. On a réparti en seringues, on a bouché puis on a autoclave 15 minutes à 121°C.
Exemple 37 • On a dissous sous agitation, dans 6 ml d'EPPll 300 mg d'acide hyaluronique réticulé selon l'invention; tel que celui de l'exemple 1, puis on a dissous 7βmg de Na2HPO4 et 18 mg de KH2PO4 dans 4 ml d'EPPI. On a rajouté sous agitation les 4 ml de solution tampon ainsi préparée dans les 6 ml d'hydrogel préparé précédemment. On a réparti en seringues, on a bouché puis on a autoclave 15 minutes à 121°C.
Exemple 38
On a dissous sous agitation, dans 10 ml d'EPPI, 7βmg de Na2HPO4 et 18 mg de KH2PO4 puis on a dissous progressivement 300 mg d'acide hyaluronique réticulé
. selon l'invention tel que celui de l'exemple 1. On a
réparti en seringues, on a bouché puis on a autoclave 15 minutes à 1210C.
Tous les implants ci-dessus (exemples 27 à 38) peuvent être formulés de la même façon mais stérilisés avec des cycles de stérilisation différents, par exemple ':
• 1150C, 60 minutes,
• 1180C, 30 minutes,
• 1250C, 6 minutes, • 1280C, 3 minutes, ou
• 1300C, 2 minutes.