EP3532113A1 - Nouvelles compositions actives sur les adipocytes - Google Patents

Nouvelles compositions actives sur les adipocytes

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Publication number
EP3532113A1
EP3532113A1 EP17804223.0A EP17804223A EP3532113A1 EP 3532113 A1 EP3532113 A1 EP 3532113A1 EP 17804223 A EP17804223 A EP 17804223A EP 3532113 A1 EP3532113 A1 EP 3532113A1
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
chitosan
aqueous composition
weight
composition according
extracellular matrix
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Withdrawn
Application number
EP17804223.0A
Other languages
German (de)
English (en)
Inventor
Frédéric BERTAINA
Alexandre GUERRY
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Bioxis Pharmaceuticals
Original Assignee
Bioxis Pharmaceuticals
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Bioxis Pharmaceuticals filed Critical Bioxis Pharmaceuticals
Publication of EP3532113A1 publication Critical patent/EP3532113A1/fr
Withdrawn legal-status Critical Current

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    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/04—Centrally acting analgesics, e.g. opioids

Definitions

  • the present invention relates to the technical field of cosmetic fillers, biomaterials, skin physiological reconstruction materials, regenerative medicine, reconstructive surgery, especially anti-aging skin, in humans or possibly animals.
  • the present invention relates to an aqueous chitosan composition for specifically targeting adipocytes.
  • the invention also relates to such compositions for use as a dermatological composition, a cosmetic, or as a medical device, advantageously as a bioabsorbable implant.
  • Various injectable fillers, especially in humans, are already known.
  • Collagen has long been the product of choice as a filling product for the face, especially for filling wrinkles and fine lines or even for lip repointing.
  • hyaluronic acids since the placing on the market of hyaluronic acids, the latter are the most used.
  • the direct injection of hyaluronic acid has the advantage of having an immediate filling effect associated with a minor inflammatory reaction, because of its biocompatibility.
  • its implantation is associated with a rapid biodegradation which makes the product unsatisfactory, even if the life of the product injected could be prolonged through the use of crosslinked hyaluronic acids.
  • PLA polylactic acid
  • a polymer whose biodegradation is slower than the others natural polymers, such as collagen or hyaluronic acid It is estimated that the filling persists until two years after the injection.
  • These products have been marketed in particular under the name of New-Fill® (or Sculptra®).
  • New-Fill® or Sculptra®
  • the main disadvantage of this technology is that the filling effect is visible only after a period of eight weeks, which does not bring complete satisfaction to the patient.
  • the fibrosis observed during the use of non-degradable products appeared of great interest in terms of long-term aesthetic effect, and this is how "semi-permanent" filling products were developed.
  • Atlean® product which offers a dispersion of particles of TCP (tricalcium phosphate) in hyaluronic acid
  • Radiesse® product which provides a dispersion of calcium hydroxyapatite particles in a carboxymethyl cellulose gel.
  • the vector gel ensures the aesthetic effect of immediate filling, while the particles gradually generate a fibrosis that guarantees the long-term effect.
  • the interest of these products, besides this double mechanism of action (mechanical and inductive tissue) is that they are finally completely resorbed.
  • chitosan is another molecule that has found its interest in the field. Indeed, because of its unique chemical and biomimetic structure, chitosan behaves vis-à-vis the organism as a "decoy" of the biological environment (Montembault A., Tahiri K., Korwin-Zmijowska C., X , Knight, M. Corvol, A.Domard, Biochemistry, 88 (2006), 551-64): on the one hand, it is sufficiently “recognized” not to induce a dangerous inflammatory reaction, and on the other hand sufficiently “ unknown "to not be degraded too quickly.
  • the molecule consists in fact of a succession of N-acetyl-D-glucosamine and D-glucosamine units, the former being a component of extracellular matrix molecules (this residue is found in hyaluronic acid for example), and the latter being completely absent from it, chitosan is therefore more difficult to degrade from a biological point of view.
  • chitosan is known in the literature for stimulating certain immune cells, such as macrophages, which produce in its presence an increased amount of growth factors. These growth factors are biological mediators that promote the production of extracellular matrix and the proliferation of fibroblasts, cells that produce collagen fibers.
  • chitosan promotes the synthesis of fibrous tissue, which allows a "biological" filling in the long term, including a filling of cutaneous defects or cavities of the human body or face, such as wrinkles.
  • the Applicant had previously attached to chitosan for the above application, which was the subject of a patent application WO 2013/07964.
  • the adipocytes subjected to this treatment proliferate and swell in a controlled manner, and allow the skin to firm up by filling wrinkles and fine lines or to allow the filling of default skin (s) or the volumetric reconstruction of tissues.
  • This observation led the Applicant to focus more particularly on the adipocytes.
  • several points were identified by the Applicant. He first noticed that too high concentration of chitosan, without removing the other benefits, could nevertheless be toxic to the adipocytes. It has also been observed by the Applicant that the presence of at least one compound of the extracellular matrix in the aqueous composition makes it possible to increase the fatty acid capture of the adipocytes.
  • the chitosan composition according to the present invention induces the synthesis of collagen fibers.
  • the addition of at least one component of the extracellular matrix (or a substituent) makes it possible to potentiate the action of chitosan.
  • the Applicant proposes aqueous compositions having a direct action on the adipocytes at (sub) -cutaneous level to add an original technical solution to the art in the field of skin treatment and reconstructive surgery.
  • the object of the present invention relates to an aqueous composition of chitosan comprising between 0.1 and 5% by weight of chitosan relative to the total weight of the composition, for its use in increasing the volume and / or the number of adipocytes.
  • the increase in the volume and / or the number of adipocytes thus obtained makes it possible to use in the treatment or fight against aging of the skin, for filling skin defects such as wrinkles or for repairing or repairing the skin. reconstruction of cutaneous or subcutaneous tissues.
  • the present invention relates to the use of an aqueous composition of chitosan comprising between 0.1 and 5% by weight of chitosan relative to the total weight of the composition, to increase the volume and / or the number of adipocytes.
  • this use is preferably cosmetic, and non-therapeutic.
  • the aqueous composition according to the present invention can be used for filling the cavities of the body or face, such as wrinkles or fine lines, for creating or increasing volumes of the face or the human body, or for scarring of the skin.
  • Adipocytes are commonly known to be animal cells present in adipose tissue, and specialized in storing fat.
  • adipocytes are also included in the visceral tissue and in the hypodermis which is the deep layer of the skin, containing more or less adipose tissue, serving as an interface between the dermis and the mobile structures below him (organs, muscles etc.).
  • the subcutaneous adipocytes are located at a variable depth of the surface of the skin, varying from a few millimeters to several centimeters deep.
  • adipocytes in the context of the present invention, it is considered human adipocytes.
  • the object of the present invention further relates to an aqueous composition as described herein, for its use as a dermatological composition or as a medical device, advantageously as a bioabsorbable or partially bioabsorbable implant for increasing the volume and / or the number of adipocytes.
  • bioabsorbable or “bioresorption” is meant biodegradation which results in total or substantially total degradation of the injected product.
  • the aqueous composition has good biocompatibility and is bioabsorbable.
  • the product according to the invention has a longer bioresorption time than products based on hyaluronic acid of the crosslinked hyaluronic acid type, for a prolonged effect, such as a prolonged filling effect.
  • the present invention also relates to the use of at least one extracellular matrix compound, and / or at least one substitute of the extracellular matrix for reducing the toxicity to adipocytes of an aqueous composition of chitosan comprising between 0.1 and 5% by weight of chitosan relative to the total weight of the composition.
  • the present invention relates to an aqueous composition of chitosan.
  • aqueous composition is meant a composition comprising at least 1% by weight of water, preferably at least 50% by weight of water, more preferably at least 80% by weight of water.
  • the percentages, generally for the present invention, when they are not specified, correspond to percentages by weight relative to the total weight of the composition under consideration.
  • the aqueous chitosan composition according to the invention has a pH of less than 8.5, advantageously between 4 and 7.6.
  • the pH of said solution is greater than or equal to 5.5, advantageously between 5.5 and 7.5, preferably between 6.2 and 6.8.
  • the aqueous composition according to the present invention is advantageously an aqueous solution of chitosan, an aqueous gelling solution of chitosan or an aqueous gel of chitosan.
  • solution is meant in the sense of the present invention a composition in liquid form, as opposed to a gelled composition.
  • a solution has a liquid phase containing at least two chemical species.
  • An "aqueous solution” comprises at least 1% by weight of water, preferably at least 50% by weight of water, still more preferably at least 80% by weight of water.
  • an aqueous solution according to the present invention mainly comprises water, with possibly other compounds.
  • the aqueous solution according to the present invention is an aqueous chitosan solution.
  • the aqueous solution according to the present invention is a homogeneous aqueous solution of chitosan.
  • the term "homogeneous aqueous solution of chitosan” means that all the chitosan polymer is solubilized and that the solution does not contain solid particles of chitosan suspended in the liquid phase.
  • the aqueous solution thus formed comprises at least water in the proportions mentioned above and chitosan with optionally other compounds.
  • the homogeneous aqueous chitosan solution according to the present invention is typically transparent.
  • aqueous chitosan composition according to the present invention can be used to form a gel.
  • gel it may be admitted according to the present invention that it is a body having a conservation modulus greater than the loss modulus (see HH Winter, F. Chambon Analysis of linear viscoelasticity of a crosslinking polymer at the gel point J. Rheol., 30 (1986), pp. 367-382).
  • the stability and integrity of this body are maintained either by non-covalent interactions (physical gel) or by covalent chemical crosslinking (chemical gel).
  • composition or aqueous “gelling" solution of chitosan it is understood in the context of the present invention a composition or an aqueous solution of chitosan as defined above, capable of providing an aqueous gel of chitosan, in particular when is injected into the biological medium.
  • an object according to the present invention relates to a gel obtained from the composition or aqueous solution as described above. In a particular embodiment of the present invention, this gel is formed before incorporation into a composition as described herein.
  • this gel is formed after incorporation into a composition. This can be done by varying pH (changing to a physiological pH, i.e. between 6.8 and 7.8, preferably at a pH of 7.4 + 0.2).
  • the aqueous composition according to the invention is injectable in the human or animal body, typically by intradermal, subcutaneous or intraperitoneal injection.
  • the composition may be packaged in a syringe such as a sterile syringe.
  • the aqueous composition has a suitable viscosity to ensure good syringability (satisfactory flow through a needle in a syringe) and ease of injection.
  • the aqueous composition according to the invention is sterilized before injection, for example by autoclaving.
  • the composition according to the present invention can be formulated to be administered by intradermal injection, subcutaneous injection or intraperitoneal injection.
  • An intradermal injection is the administration of a compound into the dermis of the skin, located just below the epidermis.
  • a subcutaneous injection is to introduce a needle into the subcutaneous layer of the skin, to inject a molecule of interest.
  • An intraperitoneal injection is located beyond the peritoneum in the abdominal cavity, i.e. in the adipo-visceral tissue.
  • the aqueous composition according to the present invention is comprised or consists of an implant for treating cutaneous depressions. It may be skin depressions of small volumes (ie equal to or less than 5 mL equivalent to about 5 grams depending on the density of the composition) or which can not be filled by injections of small volumes. This is the case, for example, of the filling of the removal of an organ or tissue following an accident or a disease (eg mammoplasty, acute lipodystrophy, acute lipoatrophy, polio-filling treatment), in reconstructive surgery.
  • a disease eg mammoplasty, acute lipodystrophy, acute lipoatrophy, polio-filling treatment
  • the chitosan composition has a long resorption time once injected, typically from a few weeks to several months, for example of the order of 3 or 4 weeks up to 12 to 18 months.
  • the product or biomaterial consisting of or containing the aqueous composition according to the invention benefits from the bacteriological and fungistatic character of chitosan, well known in the world of the food industry and healing dressings. These properties facilitate the preservation of the product and help to reduce the risk of infection related to injection or delayed inflammatory phenomena for other products as mentioned above.
  • chitosan Faced with natural molecules (collagen, hyaluronic acid) used to date for the filling of depression or volume reconstruction (eg wrinkles, fine lines, mamoplasty or lipodystrophy), chitosan is the only one to have such properties. Furthermore, the product or biomaterial consisting of or containing the aqueous composition according to the invention provides effective biological filling advantageously immediate. In addition, chitosan can promote the synthesis of collagen and allow a filling of skin defects, such as wrinkles, by stimulating natural mechanisms. In addition, the aqueous composition according to the present invention is advantageously capable of forming crystalline particles of chitosan after injection. Indeed, in this way the effects as described previously in WO201307964 are cumulative effects related to the present invention.
  • composition according to the invention comprises at least one chitosan.
  • Chitosan is an amino-polysaccaharide generally obtained by N-deacetylation of chitin, a polysaccharide as common in biomass as cellulose. Chitin is particularly present in the cuticles of arthropods, the endo skeleton of cephalopods, the cell walls of fungi, yeasts or algae.
  • chitosan is a natural product which comes from an animal source, for example crustaceans of the crab, shrimp or squid type, or from a vegetable source, such as mushrooms or seaweed.
  • Chitosan and chitin are linear copolymers of 2-acetamido-2-desoxy-D-glucan and 2-amino-2-desoxy-D-glucan, respectively. More commonly known are N-acetyl-D-glucosamine (GlcNAc) and D-Glucosamine (GlcN) units, linked by ⁇ (1 ⁇ 4) glycosidic linkages. Chitin and chitosan are differentiated by the molar fraction (expressed in%) of the GlcNAc units present in the copolymer, also called degree of acetylation (DA).
  • DA degree of acetylation
  • the DA is calculated using the formula
  • the AD can thus be determined according to current standards (ie, "Standard Guide for Characterization and Testing of Chitosan Salts as Starting Materials Intended for Use in Biomedical and Tissue-Engineered Medical Product Applications, Book of Standards Volume: Volume 13.01; -F2103 ").
  • the chitosan has a degree of acetylation (DA) of less than 30%, even more advantageously less than or equal to 20%, for example less than 15%.
  • DA degree of acetylation
  • the chitosan according to the invention has a degree of acetylation DA less than or equal to 15%, advantageously less than 10%, more preferably less than 8%, and still advantageously less than 5%.
  • the chitosan according to the invention has a degree of acetylation DA less than or equal to 4%, advantageously less than 3%, more preferably less than 2%, still more preferably less than 1%.
  • the chitosan according to the invention has a degree of acetylation DA of between 1 and 20%, advantageously between 2 and 15%, advantageously between 3 and 10%, for example between 4 and 8%.
  • the degree of acetylation is preferably measured according to the method described in the publication "Physico-chemical studies of the gelation of chitosan in a hydroalcoholic medium" A. MONTEMBAULT, C. VITON, A. DOMARD Biomaterials, 26 (8), 933 -943, 2005).
  • the chitosan used in the solutions of the invention preferably has a mass average molecular weight (determined before sterilization according to the method described in "Physico-chemical studies of the gelation of chitosan in a hydroalcoholic medium" A. MONTEMBAULT, C VITON, A. DOMARD Biomaterials, 26 (8), 933-943, 2005) between 100,000 and 1,500,000 g / mol, advantageously between 200,000 and 1,000,000 g / mol, more preferably between 250,000 and 500,000. 000 g / mol, and even more preferably between 300 000 and 400 000 g / mol.
  • chitosan typically has a weight average molecular weight of between 80,000 and 1,000,000 g / mol, and advantageously between 120,000 and 300,000 g / mol.
  • a chitosan with a molar mass of between 100,000 and 1,000,000 g.mol -1 may also be characterized by its viscosity (typically at a concentration of 1% in a 1% aqueous solution of acetic acid at 25 ° C).
  • the molar mass of chitosan can also be defined by a viscosity of between 5 Pa.s and 20 Pa.s.
  • the viscosity of the composition is measured at 25 ° C. using a DHR1 rheometer (TA Industries) and a planar geometry of 40 mm in a dynamic mode with an applied shear rate of 0.01 to 1 s -1 .
  • the chitosan used in the solutions according to the invention is not chemically modified, and in particular, is not grafted to promote its solubility in aqueous solution at near neutral pH ( between 6.2 and 7.2) It is distinguished in this sense chitosan implemented in the application WO03 / 042250 or the application JP-H02-69502, in the publication "Synthesis and char act of the sugar-bearing chitosan derivatives: aqueous solubility and biodegradability ", Jae Hyung Park et al., Biomacromolecules 2003, 4, 1087-1091, and in the publication" Water solubility of N-acetylated chitosans as a function of pH: ejfect
  • this other chitosan may be in the form of crosslinked chitosan particles.
  • the composition according to the invention is free of chitosan having a high degree of acetylation, in particular greater than 20% and more specifically between 40 and 60%.
  • the composition according to the invention is free of an additional oligomer, in particular a chitosan oligomer, of low average molecular weight, especially less than 20,000 g / mol.
  • aqueous composition of chitosan comprises less than 1% by weight of these compounds, in particular less than 0 , 5% by weight, and more preferably, does not contain these compounds.
  • the aqueous composition according to the present invention may comprise at least one chitosan dispersing agent.
  • This type of dispersing agent is very well known in the art and may for example be selected from mannitol, glycerol, sorbitol and mixtures thereof.
  • composition according to the invention may also comprise a pH buffer to set at physiological pH.
  • a pH buffer to set at physiological pH.
  • Any pH buffer commonly used for this purpose can be used, for example PBS ("Phosphate Buffer Saline” - phosphate buffer saline solution).
  • the composition according to the invention comprises a salt such as sodium chloride or potassium chloride, or any other excipent acceptable advantageously to adjust the osmolarity of the composition.
  • a salt such as sodium chloride, or potassium, can be interesting to get a solution isotonic.
  • the composition may further comprise at least one compound having a recognized therapeutic activity.
  • aqueous chitosan composition according to the present invention may further comprise at least one pharmaceutically, dermatologically and / or cosmetically acceptable compound or excipient.
  • composition according to the present invention may comprise at least one active compound such as an analgesic compound, a local anesthetic, such as lidocaine, mepivacaine, bupivacaine or ropivacaine, an angiogenic compound, or an active compound of the growth factor type. or bioactive oligosaccharide.
  • active compound such as an analgesic compound, a local anesthetic, such as lidocaine, mepivacaine, bupivacaine or ropivacaine, an angiogenic compound, or an active compound of the growth factor type. or bioactive oligosaccharide.
  • the composition according to the invention may comprise a compound or a substituent of the extracellular matrix.
  • Extracellular matrix typically refers to the set of extracellular macromolecules of connective tissue and other tissues.
  • a compound of the extracellular matrix according to the present invention is advantageously an organic polymer, for example of a size greater than 1000 Daltons (Da), or even greater than 5000 Da.
  • the organic polymers of the extracellular matrix according to the present invention may be of a proteinic, glucosidic, proteoglucosic or glucoproteic nature.
  • the organic polymers of the extracellular matrix may be collagen, hyaluronic acid or fibronectin.
  • extracellular matrix substituent is a non-ubiquitous compound (i.e. not found naturally in humans for this function) to fulfill the role of extracellular matrix.
  • This type of compound is known in the art (Jayakumar, R., Menon, D., Manzoor, K., Nair, SV, & Tamura, H. (2010) Biomedical applications of chitin and chitosan based nanomaterials- A short Carbohydrate Polymers, 82 (2), 227-232).
  • the compound of the extracellular matrix is preferably selected from proteins, glycosaminoglycans and mixtures thereof.
  • the proteins and their glycosylated derivatives may preferably be selected from collagen, elastin, fibronectin, laminin or mixtures thereof.
  • glycosaminoglycans may preferably be chosen from hyaluronic acid, chondroitin sulfate, heparan sulfate, keratan sulfate or a mixture of at least two of these glycosaminoglycans.
  • the compound of the extracellular matrix is chosen from proteins and their glycosylated derivatives, preferably from collagen, fibronectin, and a mixture of collagen and fibronectin.
  • the substituent of the extracellular matrix may for its part be chosen from carboxymethylcellulose, chitosan ester, chitin ester and the mixture of at least two substituents of the extracellular matrix.
  • composition according to the invention when the composition according to the invention comprises a compound or a substituent of the extracellular matrix, it is free of an additional oligomer, in particular a chitosan oligomer of low average molecular weight, in particular less than 20 000 g / mol.
  • the aqueous composition according to the present invention preferably contains less than 5% by weight, relative to the total weight of the composition of at least one compound of the extracellular matrix and / or at least one substitute of the extracellular matrix, in particular between 0.01 and 5% by weight, advantageously between 0.1 and 4% by weight, more advantageously between 0.2 and 3% by weight, still more advantageously between 0.3 and 2% by weight, or even between 0, 5 and 1% by weight.
  • the homogeneous aqueous composition of chitosan according to the present invention when it comprises a compound of the extracellular matrix and / or a substitute of the extracellular matrix, preferably contains a quantity of chitosan less than or equal to 5% by weight with respect to total weight of the aqueous composition, advantageously less than or equal to 4% by weight relative to the total weight of the aqueous composition, less than or equal to 3% by weight relative to the total weight of the aqueous composition, still less than or equal to 2% by weight relative to the total weight of the aqueous composition.
  • the homogeneous aqueous chitosan composition according to the present invention when it comprises a compound of the extracellular matrix and / or a substitute of the extracellular matrix, contains between 0.1 and 5, advantageously between 0.5 and 3.5, in especially between 1 and 2, by weight of chitosan, relative to the total weight of the aqueous composition. More preferably, the homogeneous aqueous chitosan composition according to the present invention, when it comprises a compound of the extracellular matrix and / or a substitute of the extracellular matrix, contains between 1.5 and 2, advantageously between 1.6 and 1.9, in particular between 1.7 and 1.8, by weight of chitosan, relative to the total weight of the aqueous composition.
  • the homogeneous aqueous chitosan composition according to the present invention when it comprises a compound of the extracellular matrix and / or a substitute of the extracellular matrix, contains less than 2, advantageously less than 1.9, in particular less than 1.8, more preferably less than 1.7, still more preferably less than 1.6, by weight of chitosan, based on the total weight of the aqueous composition.
  • the aqueous composition of chitosan according to the invention can in particular be prepared by the following successive steps: a. dissolving the chitosan in water by adding acid such as a weak acid, said weak acid being advantageously chosen from the group consisting of acetic acid, glycolic acid, lactic acid, acid glutamic acid, or such as a strong acid, said strong acid being advantageously hydrochloric acid, and mixtures thereof, b. the addition, if appropriate, of at least one compound and / or a substitute of the extracellular matrix and c. the optional readjustment of the pH to obtain an aqueous composition having a pH of less than 8.5.
  • acid such as a weak acid
  • said weak acid being advantageously chosen from the group consisting of acetic acid, glycolic acid, lactic acid, acid glutamic acid, or such as a strong acid, said strong acid being advantageously hydrochloric acid, and mixtures thereof
  • the gelled aqueous chitosan composition may be dispersed by adding a dispersing agent as presented above, optionally with a step of mechanical fragmentation of the gel of said composition.
  • aqueous chitosan aqueous chitosan.
  • the composition obtained can in all cases be a suspension or a solution, which can be administered for example by injection, preferably gelling.
  • the aqueous composition of the present invention obtainable by the steps described above.
  • the pH control of the solutions is very important to avoid, on the one hand, the acid necrosis of the tissues after injection as explained above, and also to protect the compositions from hydrolysis and the degradation of chitosan if one implements sterilization (for example by autoclaving at 121 ° C for 15 minutes).
  • the pH is readjusted if necessary with a compound such as sodium bicarbonate or PBS buffer, typically in reduced amounts.
  • the pH value is advantageously controlled by a pH meter.
  • the pH adjustment can preferably be carried out very gradually by dialysis.
  • Dialysis is a process of membrane separation of molecules or ions in solution.
  • the aqueous chitosan solution according to the invention can be dialyzed against a buffer solution having a pH equal to the desired final pH for the chitosan solution (target pH), that is to say at least greater than 6.2, advantageously between 6.2 and 7.2, preferably between 6.25 and 7.1.
  • target pH desired final pH for the chitosan solution
  • target pH target pH
  • the buffer solution has a pH greater than the gelation pH of the solution (eg 7.5)
  • dialysis should then be monitored to avoid gelation of the solution.
  • the buffer solution may, for example, be a saline solution of phosphate buffer (PBS, TBS, PBS-lactic acid), tris (tris (hydroxymethyl) methylamine), 4-2-hydroxyethyl-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES), 2- ⁇ [tris (hydroxymethyl) methyl] amino ⁇ ethanesulfonic acid (TES), 3- (N-morpholino) propanesulfonic acid (MOPS), piperazine-N, N'-bis (2-ethanesulfonic acid)), MES ( 2- (N-morpholino) ethanesulfonic acid (PIPES), sodium chloride (NaCl).
  • PBS phosphate buffer
  • TBS PBS-lactic acid
  • tris tris (tris (hydroxymethyl) methylamine
  • HEPES 4-2-hydroxyethyl-1-piperazineethanesulfonic acid
  • TES 2- ⁇ [tris (hydroxymethyl) methyl] amino ⁇ ethane
  • the buffer solution is a solution of phosphate buffer PBS (phosphate buffered saline) composed of an acid salt NaH 2 PO 4 , a "basic” salt. Na 2 HPO 4 and NaCl.
  • PBS phosphate buffered saline
  • the buffer is physiologically acceptable, that is to say that it presents no risk of intolerance or toxicity during injection into the tissues of the injectable solution according to the invention.
  • the buffer is preferably different from glycerophosphate, and in particular ⁇ -glycerophosphate which, although not irritating to the skin, causes calcification problems when it is injected into the tissues.
  • the dialysis can be performed statically in a single bath against a buffer solution as described above. When the dialysis is performed statically in a single bath against a buffer solution, it is preferable that said buffer solution has a pH equal to the desired final pH for the chitosan solution (target pH), for example between 6.5 and 6. 9.
  • the dialysis can be performed statically in several successive baths against buffer solutions having different pHs closer and closer to the desired final pH for the chitosan solution (target pH).
  • the dialysis is carried out dynamically, that is to say by continuously circulating at least one solution allowing the gradual increase in pH through one or more dialysis bags constituted a dialysis membrane containing the aqueous solution of chitosan.
  • This type of dialysis is for example described in patent application WO 2016/170284 of the Applicant.
  • the chitosan is dissolved in water using a strong acid of the hydrochloric acid type.
  • the pH is readjusted with a compound of the sodium bicarbonate or ammonium or PBS type, for example, and / or a base of the NaOH or KOH type for example (always by controlling the pH so that it is remains less than 8.5, preferably less than 6.9).
  • the acid is added in an amount necessary for the dissolution of chitosan.
  • An excess of acid can thus be used for certain chitosans, for example chitosans which are difficult to solubilize with the strictly necessary amount of acid, and then the chitosan is reprecipitated with ammonia for example. After a series of washes to remove excess ammonia and salts, the chitosan can be lyophilized to recover the dry matter. This will then be easier to solubilize.
  • the acid is added in an amount at least necessary for the dissolution of chitosan, such as the stoichiometric amount strictly necessary for the protonation of the NH sites. 2 .
  • the pH of the aqueous composition according to the present invention is less than 8.5, and is typically between 4 and 7.6.
  • chitosan is solubilized in aqueous solution, such as water, in a acidic environment in the above-mentioned pH ranges, advantageously by protonation of the amine groups of chitosan. These pH ranges have been chosen in particular to maximize the stability of the aqueous composition according to the invention.
  • the object of the present invention further relates to an aqueous composition, as described above, characterized in that said composition is liquid, in gel form or obtained after dispersion of said aqueous chitosan composition in a vehicle dermatologically and / or cosmetically acceptable.
  • dermatologically and / or cosmetically acceptable vehicle it is within the scope of the present invention any dermatologically and / or cosmetically acceptable excipient, or any dermatologically and / or cosmetically acceptable matrix or device, allowing the administration of the aqueous composition. according to the present invention.
  • an aqueous composition as described herein is included in a composition with a possibly a pharmaceutically, dermatologically, and / or cosmetically acceptable compound or excipient, its use as a dermatological composition or as a medical device, advantageously as a bioresorbable or partially bioabsorbable implant may to be administered at the following dosages.
  • the amount of chitosan may be from 0.1 to 5% by weight, preferably from 1 to 2% by weight, more preferably from 1.1 to 1.9% by weight, still more preferably from 1.2 to 1, 8% by weight, and even more advantageously between 1.3 and 1.7% by weight or between 1.4 and 1.6% by weight, for example at 1.5% ⁇ 0.05% by weight of chitosan relative to the total amount of aqueous composition administered.
  • the quantity of composition or aqueous composition administered in a single dose is between 0.01 and 20 grams per injection, advantageously between 0.05 and 10 grams per injection, more advantageously between 0.1 and 5 grams per injection, more advantageously between 0.4 and 1 gram per injection, for example 0.7 grams ⁇ 0.1 gram per injection.
  • the number of injections can vary from 1 to 20 times in the most extreme cases. More routinely, this number of injection is less than 5 times to effectively fill cavities with a volume less than 50 ml (therefore at physiological temperature).
  • the amounts of composition according to the present invention that can be injected and / or implanted can be added to equal masses or less than 500 grams, more commonly equal or less than 350 grams, still more commonly equal to or less than 200 grams, or equal to or less than 100 grams.
  • the density of the aqueous composition administered is between 0.9 and 1.2 at 25 ° C (thus before administration).
  • the cosmetic use according to the present invention is de facto defined as not being invasive in the administration of the composition according to the present invention. This precludes any surgical procedure. Nevertheless, the cosmetic use according to the present invention can be carried out with small syringes and needles, in an act comparable to the application of a tattoo.
  • the quantities injected composition according to the present invention greater than 5 grams per injection are excluded in the context of a cosmetic use. In this context, the number of injections is arbitrarily limited to 5 times at most for a total amount injected of 10 grams.
  • the amount of aqueous composition administered in a single dose may be between 0.001 and 1 gram per cm 2 of skin area, advantageously between 0.01 and 0.5 gram per cm 2 of skin area.
  • the density of the aqueous composition administered is from 0.9 to 1.2 at 25 ° C.
  • Figure 1A and 1B Effect on the proliferation of 3T3L1.
  • Figure 1 shows that for all concentrations, the 3T3L1 cells are able to proliferate and reach confluency in 5 days, although two days after seeding, the morphology of the cells suggests an aggressive medium, even toxic for the 2% condition.
  • Figure 1B specifies where on the experimental images obtained could be seen the signal corresponding to the Adipored (green experimentally, vs. Red for Hoecht).
  • FIGS. 2A, 2B and 2C show the influence of the chitosan concentration on the storage of oleic acid by 3T3L1 cells during adipocyte differentiation.
  • AdipoRed labeling (Fig 2A) shows an accumulation of fatty acids when the cells are in the presence of 0.5%, 0.75% and 1% chitosan with respect to conditions containing no chitosan.
  • Figure 2B specifies where on the experimental images obtained could be seen the signal corresponding to the Adipored (green experimentally). Quantification of this accumulation (FIG 2C) demonstrates that it is maximal when the cells are cultured in the presence of 0.5% chitosan.
  • Figure 3 This figure shows a distribution of lipid droplets (n> 10,000) of 3T3L1 exposed a chitosan composition and a formulation comprising chitosan combined with collagen and fibronectin.
  • Figure 3 shows that (Col 2 + FNl) + Chitosan2%) are the best formulations to increase the number and average size (volume) of lipid droplets.
  • chitosan 4 g are stirred in 95 g of saline solution containing 150 mM NaCl (equivalent to 300 mOsmol.L 1 ). Once the chitosan is completely dispersed, 1 g of acetic acid is added. Stirring is maintained until complete dissolution of the chitosan. A clear solution of chitosan concentrated at 4% is then obtained with a pH which can be between 3 and 4.5 depending on the origin of the chitosan.
  • a solution of 4% chitosan (w / w) is obtained in a saline solution (NaCl at 300 mOsmol.L -1 ) containing 1% (w / w) of acetic acid.
  • the pH of the chitosan acid solution is raised to between 6 and 6.5. This step is carried out by dialysis against a PBS buffer having a pH of between 6.5 and 7. During this step, the swelling of the chitosan solution is controlled to reach a final concentration of 3% (w / w) (swelling rate). 33%).
  • Chitosan solutions are usually sterilized (121 ° C for 15 min in an autoclave) to be stored before use. This solution is dialyzed to obtain a pH close to 6 and a concentration of 3% (w / w).
  • the 3% chitosan solution can be diluted in 150 mM NaCl + 1% acetic acid salt solution to lower concentrations.
  • the solutions obtained can gel in the presence of the physiological medium or a culture medium.
  • chitosan 4 g are stirred in 95 g of saline solution containing 150 mM NaCl (equivalent to 300 mOsmol.L -1 ) Once the chitosan has been completely dispersed, 1 g of acetic acid is added. until complete dissolution of the chitosan A clear solution of chitosan concentrated to 4% is then obtained with a pH which can be between 3 and 4.5 depending on the origin of the chitosan.
  • a solution of 4% chitosan (w / w) is obtained in a saline solution (NaCl at 300 mOsmol.L -1 ) containing 1% (w / w) of acetic acid.
  • This stock solution (4%) was then diluted in a saline solution (NaCl 300 mOsmol.L "l) containing 1% (w / w) acetic acid in different concentrations ranging from 4% to 0.1%.
  • a saline solution NaCl 300 mOsmol.L "l) containing 1% (w / w) acetic acid in different concentrations ranging from 4% to 0.1%.
  • Each solution is then dialyzed against a PBS buffer having a pH between 6.5 and 7. The swelling rate is measured to control the final concentrations of each solution.
  • the dialysis is stopped when the pH of the solutions is between 6.0 and 7.4. sterilized by autoclave (121 ° C. for 15 minutes)
  • the solutions are used as they are without any other form of dilution, which preserves their pH.
  • the solutions obtained can gel in the presence of the physiological medium or of a culture medium
  • chitosan 2%, 1%, 0.75% and 0.5%) are prepared by diluting the solutions obtained in Example 1.
  • a preparation of chitosan 2% (w / w) obtained in Example 1 (DA: 2, Mw: 450000 g.mol 1 BIOXIS SAS Pharmaceuticals) was diluted in a saline solution (NaCl 300 mOsmol. L "1 ) containing 1% (w / w) of acetic acid in a well (in 24-well plates) and then distributed on half of the other wells, dried, rinsed with PBS and then with the culture medium before seeding cell (line 3.
  • phase contrast microscopy x20: the images are taken at different times (2 days and 5 days after seeding), at an identical position for each well
  • Differentiation and storage of oleic acid are analyzed by fluorescence microscopy: the cells are fixed and then labeled with AdipoRed (green experimentally or as identified in the figures) highlighting the presence of fatty acids in the form of triglycerides (TG) stored in several droplets during differentiation, fusing into a single droplet when the adipocytes are mature) and with Hoechst 3352 (red in an experimental manner) for the labeling of nuclei.
  • the labeling is observed by fluorescence microscopy and the quantification performed by imaging. Imaging and fluorescence quantification are performed on
  • 3T3L1 cells Two days after inoculation, for all concentrations, 3T3L1 cells are able to proliferate and reach confluency in 5 days ( Figure 1A and 1B). Thus, at the concentrations tested, the adipocytes increase in number and in volume. The morphology of the cells, however, suggests an aggressive environment, even toxic for the 2% condition.
  • Figure 2 shows the influence of chitosan concentration on oleic acid storage by 3T3L1 cells during adipocyte differentiation.
  • oleic acid fatty acid that the adipocyte cells have the capacity to capture.
  • AdipoRed labeling shows fatty acid accumulation when the cells are in the presence of 0.5, 0.75% and 1% chitosan with respect to conditions containing no chitosan.
  • 3T3L1 cells capture more oleic acid than the witness. Quantification of this accumulation demonstrates that it is maximal when the cells are cultured in the presence of 0.5% chitosan (FIG. 2C).
  • 3T3L1 cells are able to proliferate in the presence of chitosan. After two days in culture, the presence of chitosan seems to have a toxic effect on the 3T3L1 line for concentrations greater than or equal to 2%. Chitosan promotes the capture of fatty acids in a dose-dependent manner. Among the tested solutions, it seems that it is the solutions with 0.5% which present the best efficiency. This capture would allow an increase of the volume of the adipocytes and thus, by extrapolation, of the fatty tissue in vivo.
  • a 2% (w / w) chitosan preparation obtained in Example 1 For this, a 2% (w / w) chitosan preparation (DA: 2%, Mw: 450000 g.mol -1 , BIOXIS Pharmaceuticals SAS)
  • the solutions were used as is without pre-dilution in acidic saline solution and a solution based on Collagen I 2mg / ml + Fibronectin I 1mg / mL + Chitosan 2% (Noted Col FN Chi2) is also evaluated
  • the compositions are distributed in 96-well plate after cell seeding (murine adipocyte line 3T3L1, ref ATCC CL-173 TM) When the cells are at confluence, the differentiation is induced by adding a medium The cells are then treated with a low dose of oleic acid (OA, 2.5 ⁇ l) for 6 hours The cells are put back in culture medium without oleic acid until the next day before observation on Cytation 3.
  • FIG. 3 shows that the solution Collagen I 2 mg / ml + Fibronectin I 1 mg / ml + Chitosan at 2% (Noted Col FN Chi 2) has less adipocytes of size less than 15 ⁇ m and more adipocytes with a size of between 15 and 55 ⁇ as the chitosan solution at 2%.
  • adding extracellular matrix compounds such as collagen or fibronectin therefore makes it possible to promote the increase in the number and the average size (and thus the volume) of the lipid droplets.

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Abstract

La présente invention concerne une composition aqueuse de chitosane comprenant entre 0,1 et 5 5 % en poids de chitosane par rapport au poids total de la composition, pour son utilisation dans l'augmentation du volume et/ou du nombre d'adipocytes.

Description

NOUVELLES COMPOSITIONS ACTIVES SUR LES ADIPOCYTES
La présente invention concerne le domaine technique des produits cosmétiques de comblement, des biomatériaux, des matériaux de reconstruction physiologique cutanée, de la médecine régénérative, de la chirurgie réparatrice en particulier de antivieillissement cutané, chez l'Homme ou éventuellement l'animal. En particulier, la présente invention concerne une composition aqueuse de chitosane permettant de viser spécifiquement les adipocytes. L'invention a également pour objet de telles compositions pour leur utilisation comme composition dermatologique, cosmétique, ou encore comme dispositif médical, avantageusement comme implant biorésorbable. Différents produits de comblement injectables notamment chez l'être humain sont déjà connus.
Le collagène a longtemps été le produit de choix comme produit de comblement pour le visage, en particulier pour le comblement des rides et des ridules ou encore pour réourler les lèvres. Cependant, depuis la mise sur le marché des acides hyaluroniques, ces derniers sont les plus utilisés. En effet, à la biodégradabilité du collagène jugée trop rapide, s'ajoutent les problèmes de sécurité liés à l'origine animale (bovine ou porcine) de celui-ci. L'injection directe d'acide hyaluronique présente l'avantage d'avoir un effet de comblement immédiat associé à une réaction inflammatoire mineure, du fait de sa biocompatibilité. Toutefois, son implantation est associée à une biodégradation rapide qui rend le produit insatisfaisant, même si la durée de vie du produit injecté a pu être prolongée grâce à l'utilisation d'acides hyaluroniques réticulés. Néanmoins, les produits les plus utilisés aujourd'hui en médecine et chirurgie esthétique sont des produits résorbables dont la durée de vie est généralement inférieure à 12 mois. On trouve encore sur le marché des produits de comblement qualifiés de « permanents », dans le sens où leur biorésorption peut nécessiter plusieurs années. Ces produits contiennent entre autres des polymères synthétiques ou biosynthétiques, tels que des dérivés acryliques, des polyacrylamides, qui induisent une encapsulation fibreuse importante à l'origine de la longévité du comblement. Toutefois, la persistance du produit injecté dans les tissus présente un risque de complications à long terme ou de phénomènes inflammatoires à retardement, par exemple la formation de granulomes inflammatoires, kystes... plusieurs mois, voire plusieurs années, après leur injection.
D'autres produits synthétiques constituent une alternative intéressante : il s'agit de PLA (acide polylactique), un polymère dont la biodégradation est plus lente que celle des autres polymères naturels, tels que le collagène ou l'acide hyaluronique. On estime en effet que le comblement persiste jusqu'à deux ans après l'injection. Ces produits ont été commercialisés notamment sous le nom de New-Fill® (ou Sculptra®). Le principal défaut de cette technologie est que l'effet de comblement n'est visible qu'après un délai de huit semaines, ce qui n'apporte pas une complète satisfaction au patient. Par ailleurs, la fibrose observée lors de l'utilisation de produits non dégradables est apparue de grand intérêt en terme d'effet esthétique à long terme, et c'est ainsi qu'ont été développés des produits de comblement qualifiés de « semi-permanents » qui, par leur composition hétérogène « particules-vecteurs » ont un effet pro-fibro tique tout en demeurant biodégradables. On citera par exemple le produit Atlean® qui propose une dispersion de particules de TCP (phosphate tricalcique) dans de l'acide hyaluronique et le produit Radiesse® qui propose une dispersion de particules d'hydroxyapatite de calcium dans un gel de carboxyméthyl cellulose. Dans tous les cas, le gel vecteur assure l'effet esthétique de comblement immédiat, tandis que les particules génèrent petit à petit une fibrose qui garantit l'effet à long terme. L'intérêt de ces produits, outre ce double mécanisme d'action (mécanique et inducteur de tissu), est qu'ils sont finalement totalement résorbés.
Dans ce contexte, le chitosane est une autre molécule ayant trouvé son intérêt dans le domaine. En effet, le chitosane, de par sa structure chimique unique et biomimétique, se comporte vis-à-vis de l'organisme comme un « leurre » du milieu biologique (A. Montembault, K. Tahiri, C. Korwin-Zmijowska, X, Chevalier, M. Corvol, A.Domard, Biochimie, 88 (2006), 551-64): d'une part, il est suffisamment « reconnu » pour ne pas induire de réaction inflammatoire dangereuse, et d'autre part suffisamment « méconnu » pour ne pas être dégradé trop rapidement.
La molécule est en effet constituée d'une succession de motifs N-acétyl-D-glucosamine et D- glucosamine, le premier étant un constituant de molécules de la matrice extracellulaire (on trouve ce résidu dans l'acide hyaluronique par exemple), et le second étant complètement absent de celle-ci, le chitosane est donc plus difficile à dégrader d'un point de vue biologique. Par ailleurs, le chitosane est connu dans la littérature pour stimuler certaines cellules immunitaires, telles que les macrophages, qui produisent en sa présence une quantité accrue de facteurs de croissance. Ces facteurs de croissance sont des médiateurs biologiques qui favorisent la production de matrice extracellulaire et la prolifération des fibroblastes, cellules productrices des fibres de collagène. Ainsi, le chitosane favorise la synthèse de tissu fibreux, ce qui permet un comblement « biologique » à long terme, notamment un comblement des défauts cutanés ou des cavités du corps humain ou du visage, telles que les rides. Le Demandeur s'était précédemment attaché au chitosane en vue de l'application susmentionnée, ce qui a fait l'objet d'une demande de brevet WO 2013/07964.
Néanmoins, malgré ces avancées, il existe toujours un besoin pour des molécules et des moyens pour traiter la peau, permettant le comblement, le traitement des rides et ridules et plus généralement ayant une action anti vieillis sèment et/ou la reconstruction physiologique cutanée chez l'homme ou éventuellement l'animal. De plus, des compositions équivalentes capables de traiter des dépressions cutanées plus importantes, suite à une chirurgie ou une maladie sont demandées par les praticiens. Ainsi, de manière totalement surprenante, le Demandeur s'est aperçu qu'un effet technique supplémentaire inattendu sur la peau apparaissait lorsqu'une composition aqueuse spécifique de chitosane, inconnue jusqu'à présent, était utilisée. En effet une étude plus méticuleuse a permis de mettre en évidence que lorsqu'une solution de chitosane à une concentration particulière de ce composé était utilisée, il y avait une action directe sur les adipocytes présents dans les couches cutanées. Ainsi, les adipocytes soumis à ce traitement prolifèrent et gonflent de manière contrôlée, et permettent à la peau de se raffermir par comblement des rides et ridules ou de permettre le comblement de default(s) cutané(s) ou la reconstruction volumétrique de tissus. Ce constat a mené le Demandeur à s'intéresser plus particulièrement aux adipocytes. Ainsi, plusieurs points ont été dégagés par le Demandeur. Celui-ci s'est aperçu d'abord qu'une concentration trop élevée de chitosane, sans en retirer les autres bienfaits, pouvait néanmoins s'avérer toxique pour les adipocytes. Il a également été observé par le Demandeur que la présence d'au moins un composé de la matrice extracellulaire dans la composition aqueuse permet d'augmenter la capture d'acide gras des adipocytes. In vivo la composition de chitosane selon la présente invention induit la synthèse de fibres de collagène. Au vu des éléments recueillis par le Demandeur, l'ajout d'au moins un composant de la matrice extracellulaire (ou un substituant) permet de potentialiser l'action du chitosane.
Ainsi, le Demandeur propose des compositions aqueuses ayant une action directe sur les adipocytes au niveau (sous)-cutané permettant d'ajouter une solution technique originale à l'art dans le domaine du traitement de la peau et de la chirurgie reconstructive. RESUME DE L'INVENTION
L'objet de la présente invention concerne une composition aqueuse de chitosane comprenant entre 0,1 et 5 % en poids de chitosane par rapport au poids total de la composition, pour son utilisation dans l'augmentation du volume et/ou du nombre d' adipocytes. En particulier, l'augmentation du volume et/ou du nombre d' adipocytes ainsi obtenue permet une utilisation dans le traitement ou la lutte contre le vieillissement de la peau, pour le comblement des défauts cutanés tels que les rides ou pour la réparation ou la reconstruction des tissus cutanés ou sous-cutanés.
En d'autres termes, la présente invention a pour objet l'utilisation d'une composition aqueuse de chitosane comprenant entre 0,1 et 5 % en poids de chitosane par rapport au poids total de la composition, pour augmenter le volume et/ou le nombre d' adipocytes. En particulier, cette utilisation est de préférence cosmétique, et non-thérapeutique.
En effet, hormis le fait qu'une injection ou l'introduction d'un implant selon la présente invention va de fait combler un volume au niveau cutané ou sous-cutané de par le volume inhérent de la composition, ladite composition selon la présente invention va en outre générer un gonflement local grâce à son action sur les adipocytes (augmentation du nombre et/ou du volume) aux alentours de cette composition. Ainsi, la composition aqueuse selon la présente invention peut être utilisée pour le comblement des cavités du corps ou du visage, telles que les rides ou les ridules, pour la création ou l'augmentation de volumes du visage ou du corps humain, ou encore pour la cicatrisation de la peau.
Les adipocytes sont communément connus pour être des cellules animales présentes dans les tissus adipeux, et spécialisées dans le stockage de la graisse. En outre, les adipocytes sont également compris au niveau du tissu viscéral et dans l'hypoderme qui est la couche profonde de la peau, contenant plus ou moins de tissu adipeux, servant d'interface entre le derme et les structures mobiles situées en dessous de lui (organes, muscles etc.). Ainsi, les adipocytes sous-cutanés se situent à une profondeur variable de la surface de la peau, variant de quelques millimètres à plusieurs centimètres de profondeur. De manière préférée, par « adipocytes » dans le cadre de la présente invention, il est considéré les adipocytes humains.
L'objet de la présente invention concerne en outre une composition aqueuse telle que décrite présentement, pour son utilisation comme composition dermatologique ou encore comme dispositif médical, avantageusement comme implant biorésorbable ou partiellement biorésorbable pour l'augmentation du volume et/ou du nombre d'adipocytes.
Par « biorésorbable » ou « biorésorption », on entend une biodégradation qui aboutit à la dégradation totale ou essentiellement totale du produit injecté. De manière avantageuse selon la présente invention, la composition aqueuse présente une bonne biocompatibilité et est biorésorbable. En particulier, le produit selon l'invention a une durée de biorésorption plus longue que les produits à base d'acide hyaluronique du type acide hyaluronique réticulé, pour un effet prolongé, tel qu'un effet de comblement prolongé.
La présente invention a également pour objet l'utilisation d'au moins un composé de la matrice extracellulaire, et/ou au moins un substituant de la matrice extracellulaire pour diminuer la toxicité à l'égard des adipocytes d'une composition aqueuse de chitosane comprenant entre 0,1 et 5 % en poids de chitosane par rapport au poids total de la composition.
Composition
La présente invention a pour objet une composition aqueuse de chitosane.
Par « composition aqueuse » on entend une composition comprenant au moins 1% en poids d'eau, avantageusement au moins 50% en poids d'eau, encore plus avantageusement au moins 80% en poids d'eau.
Les pourcentages, de manière générale pour la présente invention, lorsqu'ils ne sont pas précisés, correspondent à des pourcentages en poids par rapport au poids total de la composition considérée.
De manière préférée, la composition aqueuse de chitosane selon l'invention présente un pH inférieur à 8,5, avantageusement compris entre 4 et 7,6. Toutefois, lorsqu'on souhaite injecter la composition de chitosane directement dans les tissus qui se trouvent au pH physiologique (entre 6,8 et 7,4), il serait souhaitable d'utiliser une composition présentant un pH le plus proche possible du pH physiologique afin d'éviter la nécrose des tissus du fait de l'acidité de la formulation injectée. Dans un mode de réalisation particulier selon la présente invention, le pH de ladite solution est supérieur ou égal à 5,5, avantageusement compris entre 5,5 et 7,5, de préférence entre 6,2 et 6,8. La composition aqueuse selon la présente invention est avantageusement une solution aqueuse de chitosane, une solution gélifiante aqueuse de chitosane ou un gel aqueux de chitosane.
Par « solution », on entend au sens de la présente invention une composition se présentant sous forme liquide, par opposition à une composition gélifiée. Une solution présente une phase liquide contenant au moins deux espèces chimiques. Une « solution aqueuse » comprend au moins 1% en poids d'eau, avantageusement au moins 50% en poids d'eau, encore plus avantageusement au moins 80% en poids d'eau. De manière préférée, une solution aqueuse selon la présente invention comprend majoritairement de l'eau, avec éventuellement d'autres composés. Avantageusement la solution aqueuse selon la présente invention est une solution aqueuse chitosane.
Avantageusement la solution aqueuse selon la présente invention est une solution aqueuse homogène de chitosane. Par « solution aqueuse homogène de chitosane », on entend au sens de la présente invention que tout le polymère de chitosane est solubilisé et que la solution ne contient pas de particules solides de chitosane en suspension dans la phase liquide. La solution aqueuse ainsi constituée, comprend au moins de l'eau dans les proportions mentionnées ci-dessus et du chitosane avec éventuellement d'autres composés. La solution aqueuse homogène de chitosane selon la présente invention est typiquement transparente.
La composition aqueuse de chitosane selon la présente invention peut être utilisée pour former un gel.
Par « gel », il pourra être admis selon la présente invention qu'il s'agit d'un corps ayant un module de conservation supérieur au module de perte (cf. H. H. Winter, F. Chambon Analysis of linear viscoelasticity of a crosslinking polymer at the gel point J. Rheol., 30 (1986), pp. 367-382). La stabilité et l'intégrité de ce corps sont maintenues soit par des interactions non covalentes (gel physique) soit par une réticulation chimique covalente (gel chimique).
Ce gel peut être formé par toute technique connue dans l'art, par exemple par une variation de pH ou de température. Dans un mode de réalisation particulier, la composition aqueuse selon la présente invention est gélifiée à un pH compris entre 6 et 9, avantageusement compris entre 6,5 et 8,5, plus avantageusement compris entre 7 et 8. De manière préférée, la solution aqueuse (qu'elle soit homogène ou pas) de chitosane est d'abord préparée puis gélifiée. Par composition ou solution « gélifiante » aqueuse de chitosane, il est compris dans le contexte de la présente invention une composition ou une solution aqueuse de chitosane telle que définie ci-dessus, susceptible de fournir un gel aqueux de chitosane, en particulier lorsqu'elle est injectée dans le milieu biologique. Ainsi, un objet selon la présente invention concerne un gel obtenu à partir de la composition ou solution aqueuse telle que décrite ci-dessus. Dans un mode de réalisation particulier de la présente invention, ce gel est formé avant son incorporation dans une composition telle que décrite présentement.
Dans un autre mode de réalisation particulier selon la présente invention, ce gel est formé après son incorporation dans une composition. Ceci peut être effectué par variation de pH (passage à un pH physiologique, i.e. entre 6,8 et 7,8, préférentiellement à un pH de 7,4+0,2).
De manière particulièrement avantageuse, la composition aqueuse selon l'invention est injectable dans le corps humain ou animal, typiquement par injection intradermique, sous- cutanée ou intrapéritonéal. La composition peut être conditionnée dans une seringue telle qu'une seringue stérile.
Ainsi, la composition aqueuse présente une viscosité appropriée pour assurer une bonne seringuabilité (écoulement satisfaisant à travers une aiguille dans une seringue) et une facilité d'injection. Dans un mode de réalisation particulier, la composition aqueuse selon l'invention est stérilisée avant injection, par exemple par autoclavage. Ainsi, la composition selon la présente invention peut être formulée pour être administrée par injection intradermique, par injection sous-cutanée ou intrapéritonéal.
Une injection intradermique est l'administration d'un composé dans le derme de la peau, situé juste en dessous de l'épiderme. Une injection sous-cutanée consiste à introduire une aiguille dans la couche sous-cutanée de la peau, pour y injecter une molécule d'intérêt. Une injection intrapéritonéale est localisée au-delà du péritoine dans la cavité abdominale, i.e. dans le tissu adipo-viscéral.
Dans un mode de réalisation particulier, la composition aqueuse selon la présente invention est comprise ou consiste en un implant permettant de traiter les dépressions cutanées. Il peut s'agir de dépressions cutanées de faibles volumes (i.e. égale ou inférieurs à 5 mL équivalent environ à 5 gramme selon la densité de la composition) ou qui ne peuvent être comblées par des injections de faibles volumes. C'est le cas par exemple, du comblement de l'ablation d'un organe ou d'un tissu suite à un accident ou une maladie (e.g. une mammoplastie, lipodystrophie aiguë, lipoatrophie aiguë, traitement de comblement suite à une poliomyélite), en chirurgie réparatrice. Selon une caractéristique particulière de la présente invention, la composition de chitosane présente un temps de résorption long une fois injectée, typiquement de quelques semaines à plusieurs mois, par exemple de l'ordre de 3 ou 4 semaines jusqu'à 12 à 18 mois. Le produit ou biomatériau constitué de ou contenant la composition aqueuse selon l'invention bénéficie du caractère bactério- et fongistatique du chitosane, bien connu dans le monde de l'industrie agro-alimentaire et des pansements cicatrisants. Ces propriétés facilitent la conservation du produit et contribuent à limiter les risques d'infection liés à l'injection ou les phénomènes inflammatoires à retardement pour d'autres produits tels qu'évoqués ci-dessus. Face aux molécules naturelles (collagène, acide hyaluronique) utilisées à ce jour pour le comblement de dépression ou la reconstruction de volume (e.g. rides, ridules, mamoplastie ou encore lipodystrophie), le chitosane est le seul à présenter de telles propriétés. Par ailleurs, le produit ou biomatériau constitué de ou contenant la composition aqueuse selon l'invention assure un comblement biologique efficace avantageusement immédiat. En outre, le chitosane peut favoriser la synthèse de collagène et permettre un comblement des défauts cutanés, tels que les rides, par stimulation de mécanismes naturels. En outre, la composition aqueuse selon la présente invention est avantageusement apte à former des particules cristallines de chitosane après injection. En effet, de cette manière les effets tels que décrits précédemment dans WO201307964 sont cumulés aux effets liés à la présente invention.
Chitosane
La composition selon l'invention comprend au moins un chitosane.
Le chitosane est un amino-polysaccaharide généralement obtenu par N-désacétylation de la chitine, polysaccharide aussi répandu dans la biomasse que la cellulose. La chitine est notamment présente dans les cuticules des arthropodes, l'endo squelette des céphalopodes, les parois cellulaires de champignons, levures ou algues. Avantageusement selon la présente invention, le chitosane est un produit naturel qui provient d'une source animale, par exemple de crustacés du type crabes, crevettes ou calmars, ou d'une source végétale, telle que des champignons ou des algues. Le chitosane et la chitine sont des copolymères linéaires respectivement de 2-acetamido-2-desoxy-D-glucane et de 2-amino-2-desoxy-D-glucane. On parle plus communément d'unités N-acétyl-D-glucosamine (GlcNAc) et D-Glucosamine (GlcN)), liées par des liaisons glycosidiques β(1→4). Chitine et chitosane se différencient par la fraction molaire (exprimée en %) des unités GlcNAc présentes dans le copolymère, appelée aussi degré d'acétylation (DA).
Les structures chimiques du chitosane et de la chitine sont représentées schématiquement ci- dessous en fonction du degré d'acétylation (DA) :
Le DA se calcule grâce à la formule
... , aOkNA
avec nGlcNAc = nombre de motifs acétylés et nGlcN = nombre de motifs désacétylés.
Le DA peut ainsi être déterminé selon les standards en vigueur actuellement (à savoir « Standard Guide for Characterization and Testing of Chitosan Salts as Starting Materials Intended for Use in Biomédical and Tissue-Engineered Médical Product Applications, Book of Standards Volume: volume 13.01 ; ASTM-F2103 »).
Avantageusement selon la présente invention, le chitosane a un degré d'acétylation (DA) inférieur à 30 %, encore plus avantageusement inférieur ou égal à 20 %, par exemple inférieur à 15%. De manière préférée, le chitosane selon l'invention a un degré d'acétylation DA inférieur ou égal à 15 %, avantageusement inférieur à 10%, plus avantageusement inférieur à 8%, encore par avantageusement inférieur à 5%. De manière encore préférée, le chitosane selon l'invention a un degré d'acétylation DA inférieur ou égal à 4 %, avantageusement inférieur à 3%, plus avantageusement inférieur à 2%, encore par avantageusement inférieur à 1%. Par exemple le chitosane selon l'invention a un degré d'acétylation DA compris entre 1 et 20%, avantageusement compris entre 2 et 15 %, avantageusement compris entre 3 et 10 %, par exemple entre 4 et 8%. Le degré d'acétylation est de préférence mesuré selon la méthode décrite dans la publication «Physico-chemical studies of the gelation of chitosan in a hydroalcoholic médium » A. MONTEMBAULT, C. VITON, A. DOMARD Biomaterials, 26(8), 933-943, 2005).
Le chitosane mis en œuvre dans les solutions de l'invention a de préférence une masse moléculaire moyenne en masse (déterminée avant stérilisation selon la méthode décrite dans «Physico-chemical studies of the gelation of chitosan in a hydroalcoholic médium » A. MONTEMBAULT, C. VITON, A. DOMARD Biomaterials, 26(8), 933-943, 2005) comprise entre 100 000 et 1 500 000 g/mol, avantageusement entre 200 000 et 1 000 000 g/mol, plus avantageusement entre 250 000 et 500 000 g/mol, et encore plus avantageusement entre 300 000 et 400 000 g/mol. Après stérilisation, le chitosane a typiquement une masse moléculaire moyenne en masse comprise entre 80 000 et 1 000 000 g/mol, et avantageusement comprise entre 120 000 et 300 000 g/mol.
Classiquement un chitosane de masse molaire comprise entre 100 000 à 1 000 000 g.mol"1 peut aussi être caractérisé par sa viscosité (Classiquement à une concentration de 1% dans une solution aqueuse à 1% en acide acétique à 25°C). Avec cette considération, la masse molaire du chitosane peut aussi être définie par une viscosité comprise entre 5 Pa.s et 20 Pa.s.
La viscosité de la composition est mesurée à 25 °C à l'aide d'un rhéomètre DHR1 (TA Industries) et une géométrie plan de 40 mm selon un mode dynamique avec taux de cisaillement appliqué de 0,01 à 1 s"1. Selon un mode préféré de réalisation, le chitosane mis en œuvre dans les solutions selon l'invention n'est pas modifié chimiquement, et en particulier, n'est pas greffé pour favoriser sa solubilité en solution aqueuse à des pH proches de la neutralité (entre 6,2 et 7,2). Il se distingue en ce sens des chitosanes mis en œuvre dans la demande WO03/042250 ou la demande JP-H02-69502, dans la publication « Synthesis and char acte rization of sugar- bearing chitosan derivatives : aqueous solubility and biodegradability », Jae Hyung Park et al., Biomacromolecules 2003, 4, 1087-1091, et dans la publication « Water solubility of partially N-acetylated chitosans as a function of pH : ejfect of chemical composition and depolymerization » Varum K. M. et al., Carbohydrate polymers 25 (1994), 65-70.
Dans ce mode de réalisation, cet autre chitosane peut se présenter sous forme de particules de chitosane réticulé. Selon un mode particulier de réalisation, la composition selon l'invention est exempte de chitosane présentant un degré d'acétylation élevé, en particulier supérieur à 20% et plus spécifiquement compris entre 40 et 60%.
Selon un mode autre particulier de réalisation, la composition selon l'invention est exempte d'un oligomère additionnel, en particulier d'un oligomère de chitosane, de faible masse moléculaire moyenne, notamment inférieure à 20 000 g/mol.
Par « exempte » de chitosane présentant un degré d'acétylation élevé ou d'un oligomère additionnel, on entend au sens de la présente invention que la composition aqueuse de chitosane comprend moins de 1% en poids de ces composés, en particulier moins de 0,5% en poids, et plus préférentiellement, ne contient pas ces composés. Agent de dispersion
Outre le chitosane, la composition aqueuse selon la présente invention peut comprendre au moins un agent de dispersion du chitosane. Ce type d'agent de dispersion est très bien connu dans l'art et peut par exemple être choisi parmi le mannitol, le glycérol, le sorbitol et leurs mélanges. Tampon
La composition selon l'invention peut également comprendre un tampon pH pour se placer au pH physiologique. Tout tampon pH communément utilisé à cette fin peut être utilisé, par exemple le PBS (« Phosphate Buffer Saline » - solution saline de tampon phosphate).
Sel Dans un mode de réalisation particulier, la composition selon l'invention comprend un sel tel que le chlorure de sodium ou le chlorure de potassium, ou tout autre excipent acceptable avantageusement pour ajuster l'osmolarité de la composition. L'ajout d'un sel tel que le chlorure de sodium, ou de potassium, peut être intéressant pour obtenir une solution isotonique. Selon une caractéristique particulière de la présente invention, la composition peut comprendre en outre au moins un composé ayant une activité thérapeutique reconnue.
Composé ou un excipent additionnels
La composition aqueuse de chitosane selon la présente invention peut en outre comprendre au moins un composé ou un excipent pharmaceutiquement, dermatologiquement, et/ou cosmétiquement acceptable.
Actifs
En outre la composition selon la présente invention peut comprendre au moins un composé actif tel qu'un composé analgésique, anesthésique local, tel que la lidocaïne, mépivacaïne, bupivacaïne ou ropivacaïne, un composé angiogénique, ou encore un composé actif du type facteur de croissance ou oligosaccharide bioactif.
Composé ou substituant de la matrice extracellulaire
Selon un mode particulier de réalisation, la composition selon l'invention peut comprendre un composé ou un substituant de la matrice extracellulaire. La « matrice extracellulaire » désigne typiquement l'ensemble de macromolécules extracellulaires du tissu conjonctif et des autres tissus. Un composé de la matrice extracellulaire selon la présente invention est avantageusement un polymère organique, par exemple d'une taille supérieure à 1000 Daltons (Da), ou encore supérieure 5000 Da. De manière avantageuse, les polymères organiques de la matrice extracellulaire selon la présente invention peuvent être de nature protéique, glucosidique, protéoglucosique ou encore glucoprotéique. Typiquement les polymères organiques de la matrice extracellulaire peuvent être le collagène, l'acide hyaluronique ou la fibronectine. Un « substituant de la matrice extracellulaire » est un composé non ubiquitaire (i.e. qui n'est pas trouvé naturellement chez l'homme pour cette fonction) permettant de remplir le rôle de matrice extracellulaire. Ce type de composé est connu dans l'art (Jayakumar, R., Menon, D., Manzoor, K., Nair, S. V., & Tamura, H. (2010). Biomédical applications of chitin and chitosan based nanomaterials— A short review. Carbohydrate Polymers, 82(2), 227-232).
Le composé de la matrice extracellulaire est de préférence choisi parmi les protéines, les glycosaminoglycanes et leurs mélanges. Les protéines et leurs dérivés glycosylés peuvent de préférence être choisies parmi le collagène, l'élastine, la fibronectine, la laminine ou leurs mélanges.
Les glycosaminoglycanes peuvent de préférence être choisis parmi l'acide hyaluronique, la chondroïtine sulfate, l'héparane sulfate, la kératane sulfate ou un mélange d'au moins deux de ces glycosaminoglycanes.
Selon un mode préféré de réalisation, le composé de la matrice extracellulaire est choisi parmi les protéines et leurs dérivés glycosylés, de préférence parmi le collagène, la fibronectine, et un mélange de collagène et de fibronectine.
Le substituant de la matrice extracellulaire peut quant à lui être choisi parmi la carboxymethylcellulose, l'ester de chitosane, l'ester de chitine ainsi que le mélange d'au moins deux substituants de la matrice extracellulaire.
Selon un mode préféré de réalisation, lorsque la composition selon l'invention comprend un composé ou un substituant de la matrice extracellulaire, elle est exempte d'un oligomère additionnel, en particulier d'un oligomère de chitosane, de faible masse moléculaire moyenne, notamment inférieure à 20 000 g/mol.
La composition aqueuse selon la présente invention contient préférentiellement moins de 5% en poids, par rapport au poids total de la composition d'au moins un composé de la matrice extracellulaire et/ou d'au moins un substituant de la matrice extracellulaire, en particulier entre 0,01 et 5% en poids, avantageusement entre 0,1 et 4% en poids, plus avantageusement entre 0,2 et 3% en poids, encore plus avantageusement entre 0,3 et 2% en poids, voire entre 0,5 et 1% en poids.
La composition aqueuse homogène de chitosane selon la présente invention, lorsqu'elle comprend un composé de la matrice extracellulaire et/ou un substituant de la matrice extracellulaire, contient de manière préférée une quantité de chitosane inférieure ou égale à 5% en poids par rapport au poids total de la composition aqueuse, avantageusement inférieure ou égale à 4% en poids par rapport au poids total de la composition aqueuse, plus inférieure ou égale à 3% en poids par rapport au poids total de la composition aqueuse, encore inférieure ou égale à 2% en poids par rapport au poids total de la composition aqueuse. De manière plus préférée, la composition aqueuse homogène de chitosane selon la présente invention, lorsqu'elle comprend un composé de la matrice extracellulaire et/ou un substituant de la matrice extracellulaire, contient entre 0,1 et 5 , avantageusement entre 0,5 et 3,5 , en particulier entre 1 et 2 , en poids de chitosane, par rapport au poids total de la composition aqueuse. De manière plus préférée, la composition aqueuse homogène de chitosane selon la présente invention, lorsqu'elle comprend un composé de la matrice extracellulaire et/ou un substituant de la matrice extracellulaire, contient entre 1,5 et 2 , avantageusement entre 1,6 et 1,9 , en particulier entre 1,7 et 1,8 , en poids de chitosane, par rapport au poids total de la composition aqueuse. De manière encore plus préférée, la composition aqueuse homogène de chitosane selon la présente invention, lorsqu'elle comprend un composé de la matrice extracellulaire et/ou un substituant de la matrice extracellulaire, contient moins de 2 , avantageusement moins 1,9 , en particulier moins de 1,8 , plus avantageusement moins 1,7 , encore plus avantageusement moins de 1,6 , en poids de chitosane, par rapport au poids total de la composition aqueuse.
Procédé de préparation des compositions
La composition aqueuse de chitosane selon l'invention, telle que décrite présentement, peut notamment être préparée par les étapes successives suivantes : a. la dissolution du chitosane dans de l'eau par ajout d'acide tel qu'un acide faible, ledit acide faible étant avantageusement choisi dans le groupe constitué par l'acide acétique, l'acide glycolique, l'acide lactique, l'acide glutamique, ou tel qu'un acide fort, ledit acide fort étant avantageusement l'acide chlorhydrique, et leurs mélanges, b. l'ajout le cas échéant d'au moins un composé et/ou un substituant de la matrice extracellulaire et c. le réajustement optionnel du pH pour obtenir une composition aqueuse présentant un pH inférieur à 8,5.
De manière préférée, au moins un agent de dispersion (tel que le mannitol, le glycérol, le sorbitol...) est ajouté le cas échéant à l'une quelconque des étapes (a), (b), ou (c) ou après l'une quelconque des étapes (a), (b), ou (c) ci-dessus. Dans un mode de réalisation particulier selon la présente invention, la composition aqueuse de chitosane, gélifiée peut être dispersée par l'ajout d'un agent de dispersion tel que présenté ci-dessus, éventuellement avec une étape de fragmentation mécanique du gel de ladite composition aqueuse de chitosane. La composition obtenue peut dans tous les cas être une suspension ou une solution, administrable par exemple par injection, préférentiellement gélifiante. Dans un mode de réalisation particulier, la composition aqueuse de la présente invention, susceptible d'être obtenue par les étapes décrites ci-dessus.
Le contrôle du pH des solutions est très important pour éviter d'une part la nécrose acide des tissus après injection comme expliqué ci-dessus, et également pour protéger les compositions de l'hydrolyse et la dégradation du chitosane si l'on met en œuvre une stérilisation (par exemple par autoclave à 121°C pendant 15 minutes). Le pH est réajusté si nécessaire avec un composé tel que le bicarbonate de sodium ou un tampon PBS, typiquement dans des quantités réduites. La valeur du pH est avantageusement contrôlée grâce à un pH-mètre.
Dans la cadre de la présente invention, l'ajustement du pH peut de préférence être réalisé de manière très progressive par dialyse.
La dialyse est un procédé de séparation par membrane des molécules ou des ions en solution. Ainsi, dans le cadre de la présente demande, la solution aqueuse de chitosane selon l'invention peut être dialysée contre une solution tampon présentant un pH égal au pH final souhaité pour la solution de chitosane (pH cible), c'est à-dire au moins supérieur à 6,2, avantageusement compris entre 6,2 et 7,2, de préférence entre 6,25 et 7,1. Lorsque la solution tampon présente un pH supérieur au pH de gélification de la solution (par exemple 7,5), la dialyse devrait alors être surveillée pour éviter la gélification de la solution.
La solution tampon peut, par exemple, être une solution saline de tampon phosphate (PBS, TBS, PBS-acide lactique), la tris (tris(hydroxymethyl)methylamine), 4-2-hydroxyethyl-l- piperazineethanesulfonic acid (HEPES), 2-{ [tris(hydroxymethyl)methyl]amino}- ethanesulfonic acid (TES), 3-(N-morpholino)propanesulfonic acid (MOPS), piperazine-N,N'- bis(2-ethanesulfonic acid)), MES (2-(N-morpholino)ethanesulfonic acid (PIPES), du chlorure de sodium (NaCl).
Selon un mode préféré de réalisation, la solution tampon est une solution de tampon phosphate PBS (« Phosphate Buffer Saline » - solution saline de tampon phosphate) composée d'un sel « acide » NaH2P04, d'un sel «basique » le Na2HP04 et de NaCl.
Selon un mode particulier de réalisation, le tampon est physiologiquement acceptable, c'est-à- dire qu'il ne présente aucun risque d'intolérance ou de toxicité lors de l'injection dans les tissus de la solution injectable selon l'invention. A ce titre, le tampon est de préférence différent du glycérophosphate, et en particulier du β-glycérophosphate qui, bien que peu irritant pour la peau, pose des problèmes de calcification lorsqu'il est injecté dans les tissus. Selon un mode de réalisation particulier de l'invention, la dialyse peut être réalisée de manière statique dans un seul bain contre une solution tampon telle que décrite précédemment. Lorsque la dialyse est réalisée de manière statique dans un seul bain contre une solution tampon, il est préférable que ladite solution tampon présente un pH égal au pH final souhaité pour la solution de chitosane (pH cible), par exemple entre 6,5 et 6,9.
Selon un mode plus préféré de réalisation, la dialyse peut être réalisée de manière statique dans plusieurs bains successifs contre des solutions tampon présentant des pH différents de plus en plus proches du pH final souhaité pour la solution de chitosane (pH cible).
Selon un mode particulièrement préféré de réalisation, la dialyse est réalisée de manière dynamique, c'est-à-dire en faisant circuler en continu au moins une solution permettant l'augmentation progressive du pH au travers d'une ou plusieurs poches de dialyse constituées d'une membrane de dialyse renfermant la solution aqueuse de chitosane. Ce type de dialyse est par exemple décrit dans la demande de brevet WO 2016/170284 du Demandeur.
Dans un mode de réalisation particulier selon l'invention, le chitosane est dissous dans l'eau à l'aide d'un acide fort du type acide chlorhydrique. Dans ce cas, le pH est réajusté avec un composé de type bicarbonate de sodium ou d'ammonium ou PBS par exemple, et/ou une base de type NaOH ou KOH par exemple (toujours en contrôlant le pH de manière à ce qu'il reste inférieur à 8,5, préférentiellement inférieur à 6,9).
Dans un mode de réalisation particulier selon l'invention, lors de l'étape de dissolution, l'acide est ajouté en une quantité nécessaire à la dissolution du chitosane. On peut utiliser ainsi un excès d'acide pour certains chitosanes, par exemple les chitosanes difficiles à solubiliser avec la quantité strictement nécessaire d'acide, puis on reprécipite le chitosane, à l'aide d'ammoniaque par exemple. Après une série de lavages destinés à éliminer l'excédent d'ammoniaque et les sels, on peut alors lyophiliser le chitosane pour récupérer la matière sèche. Celle-ci sera alors plus facile à solubiliser.
Dans un autre mode de réalisation particulier selon l'invention, lors de l'étape de dissolution, l'acide est ajouté en une quantité au moins nécessaire à la dissolution du chitosane, telle que la quantité stœchiométrique strictement nécessaire à la protonation des sites NH2.
De manière particulièrement avantageuse, le pH de la composition aqueuse selon la présente invention est inférieur à 8,5, et est typiquement compris entre 4 et 7,6. Dans le cadre de l'invention, le chitosane est solubilisé en solution aqueuse, telle que l'eau, dans un environnement acide dans les gammes de pH mentionnées précédemment, avantageusement par protonation des groupes amine du chitosane. Ces gammes de pH ont été en particulier choisies afin de maximiser la stabilité de la composition aqueuse selon l'invention.
L'objet de la présente invention concerne en outre une composition aqueuse, telle que décrite ci-dessus, caractérisée en ce que ladite composition est liquide, sous forme de gel ou obtenue après dispersion de ladite composition aqueuse de chitosane dans un véhicule dermatologiquement et/ou cosmétiquement acceptable.
Par « véhicule dermatologiquement et/ou cosmétiquement acceptable », il est compris dans le cadre de la présente invention tout excipient dermatologiquement et/ou cosmétiquement acceptable, ou toute matrice ou dispositif dermatologiquement et/ou cosmétiquement acceptable, permettant l'administration de la composition aqueuse selon la présente invention.
Lorsqu'une composition aqueuse telle que décrite présentement est comprise dans une composition avec éventuellement un composé ou un excipent pharmaceutiquement, dermatologiquement, et/ou cosmétiquement acceptable, son utilisation comme composition dermatologique ou encore comme dispositif médical, avantageusement comme implant biorésorbable ou partiellement biorésorbable peut être administré aux dosages suivants. La quantité de chitosane peut être comprise entre 0,1 et 5 % en poids, avantageusement entre 1 et 2% en poids, plus avantageusement entre 1,1 et 1,9 % en poids, encore plus avantageusement entre 1,2 et 1,8% en poids, et de manière encore plus avantageuse entre 1,3 et 1,7% en poids ou encore entre 1,4 et 1,6% en poids, par exemple à 1,5% ± 0,05% en poids de chitosane par rapport à la quantité totale de composition aqueuse administrée. En outre, la quantité de composition ou composition aqueuse administrée en une seule dose est comprise entre 0,01 et 20 grammes par injection, avantageusement comprise entre 0,05 et 10 grammes par injection, plus avantageusement comprise entre 0,1 et 5 grammes par injection, encore plus avantageusement entre 0,4 et 1 gramme par injection, par exemple 0,7 grammes ± 0,1 gramme par injection. Le nombre d'injections peut varier de 1 à 20 fois dans les cas les plus extrêmes. De manière plus routinière, ce nombre d'injection est inférieur à 5 fois pour combler efficacement des cavités d'un volume inférieur à 50 mL (donc à température physiologique). Dans le cas de chirurgie réparatrices plus importantes tels qu'évoqués précédemment (e.g. mammoplastie, lipodystophie aiguë, lipoatrophie aiguë, etc.) les quantités de composition selon la présente invention pouvant être injecté et/ou implantés peuvent s'additionner à des masses égales ou inférieures à 500 grammes, plus communément égales ou inférieures à 350 grammes, encore plus communément égales ou inférieures à 200 grammes, ou encore égales ou inférieures à 100 grammes. De manière typique, la densité de la composition aqueuse administrée est comprise entre 0,9 et 1,2 à 25 °C (donc avant administration). L'utilisation cosmétique selon la présente invention est définie de fait comme n'étant pas invasive dans l'administration de la composition selon la présente invention. Ceci exclu tout acte chirurgical. Néanmoins, l'utilisation cosmétique selon la présente invention peut être effectuée avec des seringues et aiguilles de petit calibre, dans un acte comparable à l'application d'un tatouage. Ainsi de manière arbitraire, les quantités injectées de composition selon la présente invention supérieures à 5 grammes par injection sont exclues dans le cadre d'une utilisation cosmétique. Dans ce cadre, le nombre d'injections est limité arbitrairement à 5 fois au plus pour une quantité totale injectée de 10 grammes.
En outre, la quantité de composition aqueuse administrée en une seule dose peut être comprise entre 0,001 et 1 gramme par cm2 de surface de peau, avantageusement comprise entre 0,01 et 0,5 gramme par cm2 de surface de peau. De manière typique, la densité de la composition aqueuse administrée est comprise entre 0,9 et 1,2 à 25°C.
En outre l'utilisation selon la présente invention peut être faite de manière in vitro ou in vivo.
L'utilisation in vitro est applicable à toutes les applications visées par la présente invention, et en particulier à des buts de détermination de concentrations/quantité d'actifs à administrer.
DESCRIPTIF DES FIGURES
Figure 1A et 1B : Effet sur la prolifération des 3T3L1. La figure 1 montre que pour toutes les concentrations, les cellules 3T3L1 sont capables de proliférer et d'atteindre la confluence en 5 jours bien que deux jours après ensemencement, la morphologie des cellules suggère un milieu agressif, voire toxique pour la condition à 2 %. La figure 1B précise où sur les images expérimentales obtenues pouvait être vu le signal correspondant à l'Adipored (vert expérimentalement, vs. Rouge pour Hoecht).
Figures 2A, 2B et 2C : ces figures montrent l'influence de la concentration en chitosane sur le stockage d'acide oléique par les cellules 3T3L1 lors de la différenciation adipocytaire. Le marquage AdipoRed (Fig. 2A) montre une accumulation d'acides gras lorsque les cellules sont en présence de chitosane à 0.5 %, 0.75 % et 1 % par rapport aux conditions ne contenant pas de chitosane. La figure 2B précise où sur les images expérimentales obtenues pouvait être vu le signal correspondant à l'Adipored (vert expérimentalement). La quantification de cette accumulation (Fig. 2C) démontre qu'elle est maximale lorsque les cellules sont cultivées en présence de chitosane à 0.5%.
Figure 3 : Cette figure montre une distribution des gouttelettes lipidiques (n> 10000) des 3T3L1 exposés une composition de chitosane et à une formulation comprenant du chitosane combinées à du collagène et de la fibronectine. La Figure 3 montre que (Col 2+FNl)+Chitosan2%) sont les meilleures formulations pour augmenter le nombre et la taille moyenne (volume) des gouttelettes lipidiques.
EXEMPLES
Exemple 1 : Préparation des solutions
Deux stratégies de préparation d'une gamme de concentration de solutions gélifiantes de chitosane sont utilisées.
Par dilution finale
4 g de chitosane sont agités dans 95 g de solution saline contenant 150 mM en NaCl (équivalent à 300 mOsmol.L 1). Une fois le chitosane complètement dispersé, 1 g de d'acide acétique est ajouté. L'agitation est maintenue jusqu'à dissolution complète du chitosane. Une solution limpide de chitosane concentrée à 4 % est alors obtenue avec un pH pouvant être compris entre 3 et 4.5 en fonction de l'origine du chitosane.
Une solution de chitosane à 4 % (w/w) est obtenue dans une solution saline (NaCl à 300 mOsmol.L"1) contenant 1 % (w/w) d'acide acétique.
Le pH de la solution de acide de chitosane est rehaussé jusqu'à ce qu'il soit compris entre 6 et 6.5. Cette étape est réalisée par dialyse contre un tampon PBS présentant un pH compris entre 6.5 et 7. Lors de cette étape, le gonflement de la solution de chitosane est contrôlé pour atteindre une concentration finale de 3 % (w/w) (taux de gonflement de 33 %). Les solutions de chitosane sont généralement stérilisées (121 °C pendant 15 min dans un autoclave) pour être stockées avant utilisation. Cette solution est dialysée pour obtenir un pH proche de 6 et une concentration de 3% (w/w).
Avant utilisation, la solution de chitosane à 3 % peut être diluée dans une solution saline à 150 mM en NaCl + 1 % en acide acétique pour accéder à des concentrations inférieures.
Les solutions obtenues peuvent gélifier en présence du milieu physiologique ou d'un milieu de culture.
Par dilution initiale
4 g de chitosane sont agités dans 95 g de solution saline contenant 150 mM de NaCl (équivalent à 300 mOsmol.L"1). Une fois le chitosane complètement dispersé, 1 g de d'acide acétique est ajouté. L'agitation est maintenue jusqu'à dissolution complète du chitosane. Une solution limpide de chitosane concentrée à 4 % est alors obtenue avec un pH pouvant être compris entre 3 et 4.5 en fonction de l'origine du chitosane.
Une solution de chitosane à 4 % (w/w) est obtenue dans une solution saline (NaCl à 300 mOsmol.L"1) contenant 1 % (w/w) d'acide acétique.
Cette solution mère (4 %) est ensuite diluée dans une solution saline (NaCl à 300 mOsmol.L" l) contenant 1 % (w/w) d'acide acétique en différente concentration allant de 4 % à 0.1 %. Chaque solution est alors dialysée contre un tampon PBS présentant un pH compris entre 6.5 et 7. Le taux de gonflement est mesuré afin de contrôler les concentrations finales de chaque solution. La dialyse est stoppée quand le pH des solutions est compris entre 6.0 et 7.4. Chaque solution est stérilisée par autoclave (121 °C pendant 15 min). Les solutions sont utilisées en l'état sans autre forme de dilution ce qui préserve leur pH.
Les solutions obtenues peuvent gélifier en présence du milieu physiologique ou d'un milieu de culture
Exemple 2 : Effet de différentes dilutions de chitosane sur la prolifération, la différenciation et la capture d'acide gras par la lignée adipocytaire murine 3T3L1
Matériels et Méthodes
Différentes solutions de chitosane (2%, 1%, 0.75 % et 0.5 %) sont préparées par dilution des solutions obtenues dans l'exemple 1. Par exemple, une préparation de chitosane à 2 % (w/w) obtenue dans l'exemple 1 (DA : 2 , Mw : 450000 g.mol 1, BIOXIS Pharmaceuticals S.A. S.) est diluée dans une solution saline (NaCl à 300 mOsmol.L"1) contenant 1 % (w/w) d'acide acétique dans un puits (en plaques 24 puits) puis distribuée sur la moitié des autres puits, séchée, rincée au PBS puis avec le milieu de culture avant ensemencement cellulaire (lignée adipocytaire murine 3T3L1 ATCC CL- 173™). Lorsque les cellules sont à confluence, la différenciation est induite par ajout d'un milieu de différenciation. Les cellules sont alors traitées avec une faible dose d'acide oléique (OA, 2.5 μΜ) pendant 6 heures. Les cellules sont remises en milieu de culture sans OA jusqu'au lendemain afin d'éviter un bruit de fond éventuel de ΟΑ. La prolifération est analysée par microscopie à contraste de phase (x20) : les images sont prises à différents temps (2 jours et 5 jours post ensemencement), à une position identique pour chaque puits. La différenciation et le stockage d'acide oléique sont analysés en microscopie à fluorescence : les cellules sont fixées puis marquées avec AdipoRed (vert de manière expérimentale ou tel qu'identifié dans les figures) mettant en évidence la présence d'acides gras sous forme de triglycérides (TG) stockés dans plusieurs gouttelettes au cours de la différenciation, fusionnant en une seule gouttelette lorsque les adipocytes sont matures) et avec Hoechst 3352 (rouge de manière expérimentale) pour le marquage des noyaux. Le marquage est observé en microscopie à fluorescence et la quantification effectuée par imagerie. L'imagerie et la quantification de fluorescence sont effectuées sur une station d'imagerie en temps réel. Les contrôles sont fixés avant induction de différenciation (confluence, D0).
Résultats
Deux jours après ensemencement, pour toutes les concentrations, les cellules 3T3L1 sont capables de proliférer et d'atteindre la confluence en 5 jours (Figure 1A et 1B). Ainsi, aux concentrations testées, les adipocytes augmentent en nombre et en volume. La morphologie des cellules suggère toutefois un milieu agressif, voire toxique pour la condition à 2 %.
La Figure 2 montre l'influence de la concentration en chitosane sur le stockage d'acide oléique par les cellules 3T3L1 lors de la différenciation adipocytaire. Ainsi, les mêmes cellules que celles testées à la figure 1 sont mise en œuvre en présence d'acide oléique (acide gras que les cellules adipocytaires ont la capacité de capter). Le marquage AdipoRed (Fig. 2A et 2B) montre une accumulation d'acides gras lorsque les cellules sont en présence de chitosane à 0.5 , 0.75 % et 1 % par rapport aux conditions ne contenant pas de chitosane. Ainsi, en présence de chitosane, les cellules 3T3L1 captent davantage d'acide oléique que le témoin. La quantification de cette accumulation démontre qu'elle est maximale lorsque les cellules sont cultivées en présence de chitosane à 0.5% (figure 2C).
Conclusion
Les cellules 3T3L1 sont capables de proliférer en présence de chitosane. Après deux jours en culture, la présence de chitosane semble toutefois avoir un effet toxique sur la lignée 3T3L1 pour des concentrations supérieures ou égales à 2 %. Le chitosane favorise la capture d'acides gras de manière dose-dépendante. Parmi les solutions testées, il semble que ce soit les solutions à 0.5 % qui présentent la meilleure efficacité. Cette capture permettrait une augmentation du volume des adipocytes et donc, par extrapolation, du tissus graisseux in vivo.
Exemple 3 : Effet de différentes dilutions de chitosane sur la capture d'acide gras en présence de fibronectine et de collagène par la lignée adipocytaire murine 3T3L1
Matériels et Méthodes
Différentes solutions de chitosane (2 %, 1 % 0.75 % et 0.5 %) sont préparées par dilution des solutions obtenues dans l'exemple 1.
Par exemple, une préparation de chitosane à 2 % (w/w) obtenue dans l'exemple 1 Pour cela, une préparation de chitosane à 2 % (w/w) (DA : 2 %, Mw : 450000 g.mol"1, BIOXIS Pharmaceuticals S.A. S.) Les solutions ont été utilisées en l'état sans subir de pré dilution en solution saline acide. De plus, une solution à base de Collagène I 2mg/ml + Fibronectine I lmg/mL + Chitosane à 2% (Noté Col FN Chi2) est aussi évaluée. Les compositions sont distribuées en plaque 96 puits après ensemencement cellulaire (lignée adipocytaire murine 3T3L1, ref ATCC CL-173™). Lorsque les cellules sont à confluence, la différenciation est induite par ajout d'un milieu de différenciation. Les cellules sont alors traitées avec une faible dose d'acide oléique (OA, 2.5 μΜ) pendant 6 heures. Les cellules sont remises en milieu de culture sans acide oléïque jusqu'au lendemain avant observation sur Cytation 3. La distribution en taille des gouttelettes lipidiques (volume des adipocytes) est observée.
Résultats
La Figure 3 montre que la solution Collagène I 2mg/ml + Fibronectine I lmg/mL + Chitosane à 2% (Noté Col FN Chi2) présente moins d' adipocytes de taille inférieure à 15μιη et plus d' adipocytes de taille comprise entre 15 et 55μιη que la solution de chitosane à 2%. L'ajout de composés de la matrice extracellulaire comme le collagène ou la fibronectine permet donc de favoriser l'augmentation du nombre et de la taille moyenne (donc du volume) des gouttelettes lipidiques.
Conclusion Le chitosane seul permet d'accroître la taille des gouttelettes lipidiques. Cet effet est encore majoré en présence de fibronectine et de collagène.

Claims

REVENDICATIONS
1. Composition aqueuse de chitosane comprenant entre 0,1 et 5 % en poids de chitosane, par rapport au poids total de la composition, pour son utilisation dans l'augmentation du volume et/ou du nombre d'adipocytes.
2. Composition aqueuse selon la revendication 1, pour son utilisation dans le traitement ou la lutte contre le vieillissement de la peau, pour le comblement des défauts cutanés tels que les rides ou pour la réparation ou la reconstruction des tissus cutanés ou sous-cutanés.
3. Composition aqueuse selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisée en ce qu'elle comprend entre 0,2 et 3 % en poids, de préférence entre 0,5 et 2 % en poids, plus préférentiellement entre 0,5 et 1,9 % en poids de chitosane, par rapport au poids total de la composition.
4. Composition aqueuse selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisée en ce qu'elle présente un pH inférieur à 8,5, avantageusement compris entre 4 et 7,6, plus avantageusement entre 5,5 et 7,5, de préférence entre 6,2 et 6,8.
5. Composition aqueuse selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisée en ce que le chitosane présente un degré d'acétylation inférieur à 30%, avantageusement inférieur à 15%, et de préférence inférieur à 10%.
6. Composition aqueuse selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisée en ce qu'elle comprend au moins un composé de la matrice extracellulaire, et/ou au moins un substituant de la matrice extracellulaire.
7. Composition aqueuse selon la revendication 6, caractérisée en ce que le composé de la matrice extracellulaire est choisi parmi les protéines et leurs dérivés glycosylés, en particulier choisis parmi le collagène, l'élastine, la fibronectine, la laminine ou leurs mélanges.
8. Composition aqueuse selon la revendication 6 ou 7, caractérisée en ce qu'elle contient entre 0,01 et 5% en poids, par rapport au poids total de la composition d'au moins un composé de la matrice extracellulaire et/ou d'au moins un substituant de la matrice extracellulaire, avantageusement entre 0,1 et 4% en poids, plus avantageusement entre 0,2 et 3% en poids, encore plus avantageusement entre 0,3 et 2% en poids, voire entre 0,5 et 1% en poids.
9. Composition aqueuse selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisée en ce qu'elle est liquide ou sous forme de gel.
10. Composition aqueuse selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisée en ce qu'elle comprend au moins un composé actif tel qu'un composé analgésique, anesthésique local, tel que la lidocaïne, mépivacaïne, bupivacaïne ou ropivacaïne, un composé angiogénique, ou encore un composé actif du type facteur de croissance ou oligosaccharide bioactif.
11. Composition aqueuse selon l'une quelconque des revendications précédentes, formulée pour être administrée par injection intradermique, par injection sous-cutanée ou intrapéritonéal.
12. Composition aqueuse selon l'une quelconque des revendications précédentes, pour son utilisation comme composition dermatologique ou encore comme dispositif médical.
13. Composition aqueuse selon l'une quelconque des revendications précédentes, pour son utilisation comme implant biorésorbable ou partiellement biorésorbable.
14. Utilisation d'au moins un composé de la matrice extracellulaire, et/ou au moins un substituant de la matrice extracellulaire pour diminuer la toxicité à l'égard des adipocytes d'une composition aqueuse de chitosane comprenant entre 0,1 et 5 % en poids de chitosane par rapport au poids total de la composition.
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