JP2763112B2

JP2763112B2 - 水溶性低分子化キトサンおよびその製造法

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Publication number: JP2763112B2
Application number: JP63220377A
Authority: JP
Inventors: 一経田中; 佳代子妻木; 端三輪
Original assignee: KEI AI KASEI KK
Current assignee: KEI AI KASEI KK
Priority date: 1988-09-05
Filing date: 1988-09-05
Publication date: 1998-06-11
Anticipated expiration: 2013-06-11
Also published as: JPH0269502A

Description

【発明の詳細な説明】〔産業上の利用分野〕本発明は、種々の工業的用途に用いられる（極大分子
量4,000−12,000の低分子化キトサンを主に含む）水溶
性低分子化キトサン及びその製造法に関する。

〔従来の技術〕

キトサンは、２−アミノ−２−デオキシ−Ｄ−グルコ
ースがβ−1,4結合した塩基性多糖類で、通常はキチン
を脱アセチル化することにより得られる。このキトサン
は水には溶解しないが希酸水溶液には溶ける。しかしな
がら高分子化合物であるために粘度が高く、また中性乃
至アルカリ性にすると不溶化するためにキトサンの使用
用途はおのずから限定されてくる。従って水溶性の低分
子キトサンを得る技術の確立が強く要望されている。そ
こでキトサンの低分子化が種々検討されてきたが、従来
技術でキトサンを処理して低分子化しても極大分子量4,
000−12,000で酸性乃至アルカリ性の水溶液に溶けるも
のは得られない。

従来、中性の水にも溶解可能な低分子キトサンを得る
方法としては、キトサンに塩素ガスを接触させて低分子
化する方法（特開昭60−186504号）、あるいは亜硝酸塩
処理による方法（特開昭60−184002号）がある。しかし
ながらこれらの方法により生成した水溶性の低分子化キ
トサンはいずれも極大分子量が3,000以下と小さく、ま
たこれらの酸化分解法は、酸化による脱アミノ化のため
に純粋な低分子化キトサンを得ることが困難であるとい
う欠点を有している。

キトサンを低分子化する別法として、過酸化水素水に
よる分解法（特開昭54−148890号）または過硼酸ソーダ
水溶液で処理する方法があるが、これらの方法で得られ
る低分子化キトサンはその分子量が低くても12,000程度
であるため、中性乃至アルカリ性の水にこれを溶解させ
ることは出来ない。

これに対して、酵素法によりキトサン低分子化する方
法がある。キトサンを分解する酵素としては主にキトサ
ナーゼが報告されている。キトサナーゼを生産する微生
物としてミクソバクター（Myxobacter）AL−１〔ヘッジ
＆ウォルフ：ジャーナル・オブ・バクテリオロジー（A.
Hedges ＆ R.S.Wolfe:Journal of Bacteriology）第120
巻，第844〜853頁（1974年）〕，バチルス（Bacillus s
p.）Ｒ−４〔トミナガ他：ビオヒミカ・エ・ビオフィジ
カ・アクタ（Y.Tominaga et al:Biochimica et Biophys
ica Acta〕第410巻，第145〜155頁（1975）〕，バチル
ス（Bacillus sp.）No.99−５〔堀内：特開昭60−18058
5号；日本農芸化学会昭和59年度大会講演要旨集，第550
頁（1984年）〕，バチルス（Bacillus sp.）No.7−Ｍ
〔大宝ら：特開昭61−280277号〕，アルカリゲネス（Al
caligenes）MHK−１株〔矢吹ら：特開昭62−201571
号〕，バチルス・サーキュランス（Bacillus circulan
s）LCC−１株〔矢吹ら：特開昭63−94971号〕，バチル
ス・プミルス（Bacillus pumilus）BN−262〔武部ら：
特開昭63−63382号〕，アルカリゲネス・ファエカリス
（Alcaligenes faecalis）IK−５〔市川ら：日本農芸化
学会昭和63年度大会講演要旨集，第536頁〕といった
殺菌が知られている。また、以上の他にストレプトミセ
ス（Streptomyces sp.）No.6〔プライスら；ジャーナル
・オブ・バクテリオロジー（J.S.Price et al:Journal
of Bacteriology）第124巻，第1574〜1584頁（1975
年）〕，ストレプトミセス・グリセウス（Streptomyces
griseus）HUT 6037〔大宝ら：キチン・キトサン・アン
ド・リレイテッド・エンザイム（Chitin,Chitosan and
Related Enzymes）第147〜160頁（1985年）アカデミッ
ク・プレス（Academic Press）〕，ストレプトミセス
（Streptomyces sp.）WAK−861〔寺田ら：日本農芸化学
会昭和62年度大会講演要旨集第651頁〕およびペニシ
リウム・イスランディクム（Penicillium islandicum）
QM7571〔フェントン他：ジャーナル・オブ・ジェネラル
・ミクロバイオロジー（D.M.Fenton et al:Journal of
General Microbiology）第126巻，第151〜165頁（1981
年）〕がキトサナーゼを生産することが知られている。

これらのうちバチルスNo.99−５のキトサナーゼとペ
ニシリウム・イソランディクムのキトサナーゼについて
はキトサンの脱アセチル化度と酵素分解性との関係につ
いて研究されているが、分子量の比較的大きな生成物に
関する報告は見あたらない。

〔発明が解決しようとする課題〕

本発明らは、キトサンに関する上記の事情に鑑みて、
極大分子量が主として4,000−12,000であり、かつ酸性
〜アルカリ性の水溶液に可溶な水溶性低分子化キトサン
およびその製造技術を確立することが当業界における重
要な技術的課題であるとの認識を有するに至った。

〔課題を解決するための手段〕

そこで、本発明者らは、水溶性低分子化キトサンにつ
いて鋭意検討した結果、原料として種々の脱アセチル化
度を有するキトサンを用いてこれにキトナーゼを作用さ
せ、膜処理により低分子化キトサンを得たところ原料の
キトサンの脱アセチル化度と得られた水溶性低分子化キ
トサンの分子量とに関連があることを見出した。すなわ
ち、脱アセチル化度の比較的低いキトサンを用いると極
大分子量10,000前後の水溶性低分子化キトサンが得られ
るが、原料のキトサン脱アセチル化度が90％を超えると
得られる水溶性低分子化キトサンの分子量が低下する傾
向が認められ、更に脱アセチル化度100％付近のキトサ
ンを用いた場合には、極大分子量約1,000の低分子化キ
トサンは水溶性となるが、極大分子量2,000の低分子化
キトサンは水に不溶であった。また、従来の化学的処理
方法によるキトサンの低分子化では、生成した低分子キ
トサンの脱アミノ化が避けられなかったが、反応特異性
の高い酵素（キトサナーゼ）を用いることにより、脱ア
ミノ化の程度の極めて低い水溶性低分子化キトサンを温
和な条件で得ることが可能となった。この脱アミノ化の
程度を規定するために、フェノール硫酸法を採用した。
すなわち、キトサンを構成するグルコサミンやＮ−アセ
チルグルコサミンといったアミノ糖をフェノール硫酸法
により発色した場合には490nm付近の吸収が認められな
いが、脱アミノ化により生じた糖はフェノール硫酸法に
より490nm付近にピークが認められるようになることを
利用したものである。本発明者らはこれらの知見に基づ
いて本発明を完成するに至った。

本発明は、極大分子量が主として4,000−12,000であ
り、かつ酸性〜アルカリ性の水溶液に可溶な水溶性低分
子化キトサン及びその製造法を提供することを目的とす
るものである。

本発明は、以下の（１）〜（８）の技術的事項によっ
て構成されるものであり、当該（１）〜（８）の各発明
は全て本発明の範囲に含まれる。

（１）脱アセチル化度が60−90％であるところのキト
サンにキトサナーゼを作用させ、反応と同時または反応
後にアルカリを加えて反応液pHを７−10に上げて得られ
る極大分子量が主として4,000−12,000であり、かつ酸
性〜アルカリ性の水溶液に可溶な水溶性低分子化キトサ
ン。

（２）反応液pHを７−10に上げた後、濾過または膜処
理により酵素反応生成物を分離して得られる上記（１）
の水溶性低分子化キトサン。

（３）フェノール硫酸法によるグルコース換算糖量が
10％以下であることを特徴とする上記（１）又は（２）
の水溶性低分子化キトサン。

（４）脱アセチル化度が60−90％であるところのキト
サンにキトサナーゼを作用させ、反応と同時または反応
後にアルカリを加えて反応液pHを７−10に上げて得られ
る極大分子量が主として4,000−12,000であり、かつ酸
性〜アルカリ性の水溶液に可溶な低分子化キトサンを得
ることを特徴とする水溶性低分子化キトサンの製造法。

（５）反応液pHを７−10に上げた後、濾過または膜処
理により酵素反応生成物を分離し、低分子化キトサンを
得ることを特徴とする上記（４）記載の水溶性低分子化
キトサンの製造法。

（６）キトサナーゼがバチルス属菌（Bacillus sp.）
No.K−881（微工研菌寄第10257号）により生産されたも
のであることを特徴とする上記（４）又は（５）の水溶
性低分子化キトサンの製造法。

（７）膜が孔径0.05μｍ乃至５μｍの精密濾過膜また
は分画分子量１万以上の限外濾過膜である上記（５）の
水溶性低分子化キトサンの製造法。

（８）膜が孔径0.05μｍ乃至５μｍのセラミックフィ
ルターである上記（５）の水溶性低分子化キトサンの製
造法。

続いて、本発明の構成につき更に詳しく説明する。

本発明において用いられる原料のキトサンは、従来公
知のキトサンのうち脱アセチル化度60−90％のものが使
用でき、例えば市販されているキチンまたは天然に存在
するキチンを常法により脱アセチル化して得られるキト
サンや、脱アセチル化度90％以上のキトサンをアセチル
化して得られるキトサン等が挙げられる。前者の例とし
ては例えばかに殻を脱灰、脱蛋白してえられるキチンを
濃度30−50％の水酸化ナトリウム水溶液に浸漬し、50−
130℃で目的の脱アセチル化度になるように反応時間を
設定して反応させた後、アルカリを除去し、次いで洗浄
乾燥して得られたフレーク状または更に粉砕された粉末
状の乾燥物質が挙げられる。また、脱アセチル化度60％
未満の原料キトサンを用いて本発明の製造法に従って調
製した場合には、より高分子で水溶性の低分子化キトサ
ンが得られる。酵素処理量を増やすか、または反応時間
を長くすることにより、極大分子量が4,000−12,000の
水溶性の低分子化キトサンを得ることも不可能ではない
が、生産効率は脱アセチル化度60−90％のキトサンに比
べて劣る。また、この場合に得られた低分子化キトサン
は、単位重量あたりのアミノ基含量が少なく、ポリカチ
オン性の効果が劣り、本発明の実施には適当ではない。

本発明において、キトサナーゼを原料キトサンに作用
させるためにキトサン溶液を調製しなければならない
が、キトサンは酸に溶けるので、キトサンに酸水溶液を
加えてキトサン濃度が１−30％、好ましくは５−10％の
溶液とする。この場合、溶液のpHがキトサナーゼの作用
最適pH付近となるように添加する酸の量を加減する。例
えばバチルスNo.K−881由来のキトサナーゼの場合、至
適pHは６であるのでキトサン溶液のpHが５−６になるよ
うに酸の添加量を調整する。

キトサン溶液の調製に使用する酸は、キトサンを溶解
しうるものであれば、有機酸または無機酸のいずれであ
ってもこれを使用することができるが、塩酸、蟻酸、酢
酸、乳酸、グルタミン酸等が好ましい。このキトサン溶
液にキトサナーゼの粉末または溶液を加え、キトサナー
ゼの作用温度においてキトサンを分解する。キトサナー
ゼの作用温度は、例えはバチルス由来のキトサナーゼの
場合、30−60℃であるが、40℃前後にするのが好まし
い。

本発明において酵素反応によって生ずる低分子化キト
サンの分子量分布は反応時間あるいは酵素量等によって
変化するため、目的とする分子量の水溶性キトサンを高
収率に得るためには反応時間（または酵素量）と生成物
の分子量との関係に基づいて、反応条件を厳密に決定す
る必要がある。

なお、本発明に使用するキトサナーゼは、脱アセチル
化度60−90％のキトサンを分解して、極大分子量4,000
−12,000の低分子化キトサンを主として生成することが
できる酵素であれば、いかなるものであってもこれを使
用することができる。例えば、市販のキトサナーゼ（販
売：和光純薬,Bacillus pumilus BN−262由来）は本発
明に使用し得るものであるが、非常に高価であるため、
酵素処理によって製造する水溶性低分子化キトサンも非
常に高価なものとなる。

そこで本発明者らは、広く自然界より安価にキトサナ
ーゼを生産しうる微生物の検索を行った結果、土壌中よ
り分離したバチルス属菌（Bacillus sp.）No.K−881
（微工研菌寄第10257号）がキトサナーゼを効率良く生
産すること等の知見を得た。

本菌（バチルス属菌No.K−881）の菌学的性質は以下
に示す通りである。

（ａ）細胞の形態肉汁または肉汁寒天培地で37℃,24〜72時間培養し、
観察。

細胞の系及び大きさ：短桿菌,0.5〜1.0×1.0〜3.
0μｍ細胞の多形性の有無：未定運動性の有無：無し胞子の有無：有り，球形〜楕円形の内生胞子，胞
子の位置は亜端立または端立グラム染色性：陽性抗酸性：陰性（ｂ）各培地における生育状態肉汁寒天平板培養（37℃,24〜72時間）：不透明
で厚く、乳白色の円形コロニーを形成する。

コロニーの表面には凹凸や光沢が有り色素は産生しな
い。

肉汁寒天斜面培養（37℃,24〜72時間）：生育は
良好で、時間とともに拡がり、の記載に同じ。

肉汁液体培養（37℃,24〜72時間）：培地表面に
乳白色の菌膜を形成するが液は濁らない。

肉汁ゼラチン穿刺培養（25℃,24〜72時間）：穿
刺線に浴って生育し、ゼラチンは液化される。

リトマスミルク（37℃,24〜72時間）:2日目ころ
より液化及び変色が認められ、酸性となる。凝固は認め
られない。時間の経過とともに液化は進み、半透明とな
る。

（ｃ）生理学的性質硝酸塩の還元：陽性（酵母エキス添加コハク酸硝酸塩培地,37℃,24〜
120時間）脱窒反応：陰性（駒形らの方法,37℃,24〜72時間） MRテスト：陰性（37℃,24〜72時間） VPテスト：陽性（37℃,24〜72時間）インドールの生成：陰性（37℃,24〜72時間）硫化水素の生成：陰性（TSI寒天法,37℃,24〜72時間）デンプンの加水分解：陰性（37℃,24〜72時間）クエン酸の利用：（コーザーの培地,37℃,24〜72時間）：未利用（クリステンセンの培地,37℃,24〜72時間）：利
用無機窒素源の利用硝酸塩：未利用アンモニウム塩：アンモニウム塩を唯一の窒素
源として生育できる。

色素の生成（キングＡ寒天斜面培地）：陰性ウレアーゼ：陽性（クリステンセン・ウレア寒天培地,37℃,24〜72
時間）オキシダーゼ：陽性（肉汁寒天培地,37℃,24〜48時間）カタラーゼ：陽性（肉汁寒天培地,37℃,24〜48時間）生育の範囲至適温度:25〜35℃ pH :5〜９７％NaCl存在下での生育：生育する酸素に対する態度：好気性（１％グルコース肉汁高層寒天培地,37℃,24〜72
時間）Ｏ−Ｆテスト：酸化（oxidation）（ヒュー・ライフソン法,28℃,D−グルコース）糖類からの酸およびガスの生成の有無（28℃,24〜72時間）（ｄ）その他の性質エッグヨーク反応（37℃,24〜48時間）：陽性以上の菌学的性質に基づいて、バージェイズ・マニュ
アル・オブ・デターミネィティブ・バクテリオロジー
（Bergey's Manual of Determinative Bacteriology）
の第８版（1974年）を検索したところ、No.K−881株は
バチルス（Bacillus）属に属することがわかった。

バチルス属菌No.K−881により生産されたキトサナー
ゼの酵素化学的性質は以下に示す通りである。

（１）作用キトサンに作用し、β−1,4結合を加水分解する。分
解型式はエンド型と考えられる。

（２）基質特異性本キトサナーゼは、キトサンやコロイダルキトサンに
は作用するが、粉末キチン、コロイダルキチン、グリコ
ールキチン、カルボキシメチルセルロース（CMC）およ
びα−1,4−ポリガラクトサミンには作用しない。本キ
トサナーゼは脱アセチル化度80％前後のキトサンを最も
よく分解し、さらに脱アセチル化度が低下すると、分解
率は急激に低下する。

pH6.0,40℃において10分間反応させた場合のキトサン
の脱アセチル化度と相対活性の関係を第１図に示す。

（３）至適pH及び安定pH pH4〜８の範囲において作用し、至適pHは約6.0であ
る。40℃において10分間反応させた場合の反応液pHと相
対活性の関係を第２図に示す。

また40℃において30分間加熱処理した場合、安定pHの
範囲は第３図に示すとおり５〜８である。

（４）酵素力価の測定法キトサン（脱アセチル化度75〜90％,16メッシュ以
下）0.5gを、0.075N酢酸90mlに溶解し、水酸化ナトリウ
ム溶液pH6.0に調整した後、水で全容を100mlとして基質
のキトサン溶液を調製する。

このキトサン溶液0.5mlに酵素溶液0.5ml（約0.025uni
tのキトサナーゼを含む）を添加し、40℃で10分間酵素
反応を行わせる。その後反応液にアセチルアセトン溶液
1mlを加え、ロンドル・モルガン法により反応液中に生
成した還元糖量を測定する。

上記条件下において１分間に１μmolのグルコサミン
に相当する還元糖を遊離する酵素力価を、１単位（uni
t）とする。

（５）作用適温の範囲 60℃まで作用し最適温度は約55℃である。

pH6.0において10分間反応させた場合の温度と相対活
性の関係を第４図に示す。

（６）熱安定性及び安定化 pH6,15分間の加熱処理では50℃以下で安定であるが90
℃では完全に失活する。

温度と残存活性の関係を第５図に示す。

なお、本キトサナーゼの熱安定性は、イオン強度によ
って影響を受け、透析した場合、pH6,60℃,15分間の加
熱処理により完全に失活する。

本キトサナーゼは0.1M以上の塩化ナトリウムによって
安定化される。

pH6,50℃において15分間加熱処理した場合の残存活性
の塩化ナトリウム濃度による影響を第６図に示す。

この他に、塩化カリウム等のアルカリ金属塩や塩化ア
ンモニウム，塩化マンガン，硫酸アンモニウム，硫酸マ
グネシウムによって安定化が認められる。

（７）阻害及び活性化本キトサナーゼは0.05MのNiSO₄,ZnSO₄,CuSO₄によりほ
ぼ100％が阻害される。

また、0.05MのNaCl,KCl,NH₄Cl,（NH₄）₂SO₄,MgSO₄,Mn
Cl₂による活性化が認められる。ただし、活性化の程度
は基質のキトサンによって異なる。

なお、本キトサナーゼはEDTAによる活性化は認められ
ない。

（８）精製方法本キトサナーゼの精製は、例えば次のように行う。培
養液の水溶性画分を硫安塩析または有機溶媒沈澱により
分画した後、透析を行い、さらに0.005Mの酢酸緩衝液
（pH4.5）で平衡化したSP−トヨパール650Sカラム（東
ソー製）を用いてイオン交換クロマトグラフィーを行
う。次にトヨパールHW−50Sによるゲル濾過クロマトグ
ラフィーにより精製する。

（９）分子量 0.1Mリン酸緩衝液（0.2M硫酸ナトリウム含有）を用
い、TSKゲルG3000SWグラスカラム（東ソー製）による
ゲル濾過クロマト法により測定すると、分子量約31,000
である。

（10）等電点アクリルアミド焦点電気泳動法により等電点を測定す
ると8.4である。

本発明においてキトサナーゼ処理の後、または酵素反
応途中において、アルカリを加えて反応液のpHを７−10
に上げ、キトサン中のアミノ基のアンモニウム塩形成を
破壊し、水不溶性キトサンを析出させる。本発明に使用
するアルカリとしては、水溶液中においてアルカリ性を
示す物質であれば良く、例えばナトリウムやカリウムの
水酸化物を用いることができるが、水酸化ナトリウムの
水溶液を用いることが好ましい。水不溶性キトサンの量
が少ない場合には、使用用途によってはそのままでも利
用可能である。この場合は必要に応じて脱塩操作を行
い、凍結乾燥法または噴霧乾燥法等により乾燥粉末化す
る。一方水不溶性キトサンを除去した水溶性低分子化キ
トサンを調製する場合には、濾過または膜分離操作を行
った後に用途により乾燥粉末化を行う。また必要に応じ
て膜分離工程の前あるいは後で脱塩操作を行う。本発明
においてキトサンの膜処理に使用できる膜としては、孔
径0.05μｍ乃至５μｍの精密濾過膜または分画分子量１
万以上の限外濾過膜がある。ここで言う精密濾過膜とし
ては、たとえばセラミック膜（東芝セラミックス社製
メンブラロックスセラミックフィルター，日本ガイシ社
製セラミックフィルター，日本セメント社製セラミ
ックフィルター，久保田鉄工社製セラミックフィルター
等），ポリオレフィン系膜（旭化成社製マイクローザ
膜等），ポリビニルアルコール系膜（クラレ社製 SFフ
ィルター等），ポリプロピレン系膜（日東電工社製 NT
M膜等），ポリカーボネート系膜（スルザー社製 WO膜
等），ポリスルホン系膜（富士フィルム社製 PSE膜
等），ポリビニリデンフロライド系膜（ミリポア・リミ
テッド製デュラポア膜等）。テフロン系膜（ザルトリ
ウス社製ザルトフロル膜，キュノ社製テフロンフィ
ルター等），セルロース系膜（富士フィルム社製 FM
膜，ミリポア・リミテッド製 MF−ミリポア膜，ザルト
リウス社製ザルトブラン等）等を挙げることができ
る。またここで言う限外濾過膜としては、たとえばポリ
スルホン系膜（ミリポア・リミテッド製 PT膜，日東電
工社製 NUT膜等），セルロース系膜（ミリポア・リミ
テッド製 PT膜等），ポリアクリルニトリル系膜（旭化
成社製 ACV膜等）などを挙げることができる。

〔発明の効果〕

以上説明したように、本発明の製造方法によれば脱ア
セチル化度60−90％のキトサンから比較的分子量の大き
な水溶性低分子化キトサンを温和な条件で収率よく製造
することができ、しかも従来の方法では極大分子量3,00
0以下あるいは12,000をこえるものしか得られず、しか
も脱アミノ化による品質低下といった欠点があったの
を、本発明の製造方法によってこれらの欠点を解消する
ことができた。本来、キトサンはポリカチオン性、皮膜
形成能等の性質を持つ機能性の高い高分子であり、食品
・医薬品・化粧品等の分野で広く利用できるものである
が、生体のpHである中性付近では不溶性であるという難
点を有する。しかるに本発明の製造方法によって得られ
る水溶性低分子化キトサンは、極大分子量が主として4,
000−12,000と高く、キトサン本来のポリカチオン性、
皮膜形成能という特性を有しながら、酸性乃至アルカリ
性の水溶液に可溶であり、更に化学的な修飾を行ってい
ないため原料のキトサンと同様に安全性が高く、食品、
医薬品、化粧品をはじめとして広く利用することができ
る。

以下に参考例、実施例及び比較例を示して本発明を具
体的に説明するが、本発明はこれに限定されるものでは
ない。

参考例（１）（種培養） 500ml容三角フラスコに、デンプン３％，ペプトン５
％，リン酸一カリウム0.1％，硝酸ナトリウム0.1％，硫
酸マグネシウム0.05％を含む液体培地（pH6.0）100mlに
入れ、常法により滅菌した後、バチルス属菌（Bacillus
sp.）No.K−881（微工研菌寄第10257号）を接種し、28
℃において１日間振とう培養し、種培養液とした。

（酵素生産用培養）５三角フラスコ５本に、上記と同一の組成の液体培
地をそれぞれ600mlずつ入れ、常法により滅菌した後、
この培地に上記の種培養液10mlを接種し、28℃において
５日間振とう培養した。

（酵素の調製）上記で得られた培養液を遠心分離（7000rpm）により
菌体を除去した。得られた上澄液のキトサナーゼ活性は
5.2u/mlであった。この上澄液2700mlに固体硫安1515g
（硫安80％飽和に相当）を加え、濾過し、得られた沈澱
物をイオン交換水に溶解し、イオン交換水に対して１日
間透析を行った後、真空凍結乾燥を行い、粗酵素キトサ
ナーゼの粉末77.5gを得た。本品のキトサナーゼ活性は1
05u/gであった。

参考例（２）参考例（１）で得られた粗酵素キトサナーゼ粉末10g
を0.005Mの酢酸緩衝液（pH4.5）150mlに溶解し、遠心分
離で不溶物を除去した後、0.005M酢酸緩衝液（pH4.5）
で平衡化したSP−トヨパール650Sカラム（直径2.2cm×
長さ20cm,東ソー製）によるイオン交換クロマトグラフ
ィー（流速:3ml/分）を行った。０〜0.5Mの塩化ナトリ
ウムの直線濃度勾配により、酵素を溶出させ、酵素活性
フラクションを集め、次にダイアフローメンブレンフィ
ルターPM−10（アミコン社製）で濃縮した。この液を0.
1Mリン酸緩衝液（pH6）で平衡化したトヨパールHW50Sカ
ラム（直径2cm×長さ100cm,東ソー製）を用いるゲル濾
過クロマトグラフィーを行った。活性フラクションを集
め、精製キトサナーゼ溶液15ml（総活性326units）を得
た。比活性は39.4unit/タンパク質mgであった。

参考例（３）脱アセチル化度81％のキトサン〔和光純薬，キトサン
80H;粘度（0.5W/V％,20℃）180cp〕7.5gにイオン交換水
115ml及び1N酢酸水溶液25mlを加えて溶解した（pH5.
9）。このキトサン溶液を14mlずつＬ字試験管に取り、
キトサナーゼ溶液（参考例（１）のキトサナーゼ粉末0.
143gを水1mlに溶かす:15u/ml）1mlを加え40℃の恒温水
槽内で振とうしながら15分間,1時間,5時間,23時間反応
した後、Ｌ字試験管を沸とう水浴中に浸漬し、反応を停
止させた。これらの反応液につき、Asahipak GS−320カ
ラム（旭化成工業製）を用いた高速液体クロマトグラフ
ィー法により分子量を測定した。その結果は第７図に示
すとおりであった。

上記条件下で反応した場合、反応時間は15分前後が適
当であった。

実施例（１） 500ml容のビーカーに脱アセチル化度72％のキトサン
（和光純薬，キトサン70H）12.5gを取り、これにイオン
交換水210ml及び1N酢酸水溶液39mlを加えて充分撹拌
し、均一な溶液とした。このキトサン酢酸溶液のpHは5.
8であった。このキトサン酢酸溶液にキトサナーゼ溶液
（参考例（１）のキトサナーゼ粉末38mgを水1mlに溶か
す:4u/ml）1mlを加え40℃の恒温水槽内で攪拌しながら1
2時間反応した後、反応液を加熱して酵素反応を停止さ
せた。つぎに10％水酸化ナトリウム溶液14mlを加えてpH
を８に調整すると不溶物を生ずる。この反応液を透析膜
を用いた透析により脱塩した後、脱塩液345mlを孔径0.2
μｍ、膜面積0.02m²のセラミックフィルター（日本セメ
ント社製）を用いて濾過し、305mlの透明な濾過液を得
た。この液を凍結真空乾燥法で乾燥し、粉末の水溶性低
分子化キトサン8.2gを得た。（なおセラミックフィルタ
ー濾過残を乾燥したところ3.0gであった。）実施例（２）脱アセチル化度81％のキトサン（和光純薬，キトサン
80H）12.5gを取り、これにイオン交換水207ml及び1N酢
酸水溶液42mlを加えて溶解した（pH5.9）。そして、実
施例（１）と同様な条件で酵素処理、pH調整、脱塩、膜
処理、乾燥を行い、水溶性低分子化キトサン8.8gを得
た。（なおセラミックフィルター濾過残を乾燥したとこ
ろ2.7gであった。）実施例（３）脱アセチル化度87％のキトサン（和光純薬，キトサン
90M）12.5gを取り、これにイオン交換水199ml及び1N酢
酸水溶液50mlを加えて溶解した（pH5.8）。そして実施
例（１）と同様な条件で酵素処理、pH調整、脱塩、膜処
理、乾燥を行い、水溶性低分子化キトサン7.3gを得た。
（なおセラミックフィルター濾過残を乾燥したところ3.
6gであった。）比較例（１）脱アセチル化度59％のキトサン12.5gを取り、これに
イオン交換水223ml及び1N酢酸水溶液26mlを加えて溶解
した（pH5.3）。そして実施例（１）と同様な条件で酵
素処理、pH調整、脱塩、膜処理、乾燥を行い、水溶性の
低分子化キトサン7.7gを得た。（なおセラミックフィル
ター濾過残はほとんどなかった。）比較例（２）脱アセチル化度93％のキトサン（北海道曹達CS−90）
12.5gを取り、これにイオン交換水166ml及び1N酢酸水溶
液83mlを加えて溶解した（pH5.3）。そして実施例
（１）と同様な条件で酵素処理、pH調整、脱塩、膜処
理、乾燥を行い、水溶性の低分子化キトサン3.0gを得
た。（なおセラミックフィルター濾過残を乾燥したとこ
ろ5.4gであった。）比較例（３）脱アセチル化度100％のキトサン（和光純薬，キトサ
ン100L）12.5gを取り、これにイオン交換水185ml及び1N
酢酸水溶液64mlを加えて溶解した（pH5.5）。そして実
施例（１）と同様な条件で酵素処理、pH調整、脱塩、膜
処理、乾燥を行い、水溶性の低分子化キトサン1.2gを得
た。（なおセラミックフィルター濾過残を乾燥したとこ
ろ4.9gであった。）つぎに実施例（１）、（２）、（３）および比較例
（１）、（２）、（３）で得た水溶性低分子化キトサン
及び低分子化キトサンの分子量および加熱時の色調増加
の比較を第１表に示す。

極大分子量はウォーターズ社製高速液体クロマトグラ
フ装置（M600マルチソルベント送液システム、710B型全
自動サンプルプロセッサー、M410型示差屈折計）および
Asahipak GS−320カラム（旭化成工業製）を用い、標準
物質としてプルランを用いるGPS法で測定した（ピーク
頂点の保持時間より求めた分子量を、極大分子量とす
る）。また脱アセチル化度は、メチレンブルーを指示薬
としてキトサンの酢酸水溶液をポリビニル硫酸カリウム
水溶液で滴定するコロイド滴定法により測定した。

第１表の結果より、原料キトサンの脱アセチル化度
と、得られた水溶性の低分子化キトサンの分子量とに関
連性が認められ、特に脱アセチル化度が90％を超えると
水溶性となる低分子化キトサンの分子量が低下する傾向
が認められる。そして低分子化すると、還元基の割合が
増えるために水溶液中においてアミノ・カルボニル反応
（メイラード反応）等により褐変しやすくなる。一方、
本発明により得られた水溶性の低分子化キトサンは褐変
の程度が低く、また分子量も比較的大きい。

実施例（４）脱アセチル化度87％のキトサン（和光純薬，キトサン
90M）12.5gを用いて実施例（３）と同様な条件で酵素処
理、pH調整を行い、精密濾過膜旭化成工業社製マイ
クローザXPW−11（孔径0.1μ，膜面積0.1²）を用いて濾
過し、濾液を電気透析装置マイクロアシライザーG3（旭
化成工業社製）により脱塩した後、凍結真空乾燥法で乾
燥し、粉末の水溶性低分子化キトサン9.7gを得た。

比較例（４）脱アセチル化度87％のキトサン（和光純薬，キトサン
90M）13.9gを亜硝酸ナトリウム0.95gを含む水溶液65ml
に室温で５分間浸漬した後、酢酸7.5gを添加し、室温で
２時間反応させる。反応後、水210mlを加え、40％水酸
化ナトリウム溶液でpHを９に調整し、実施例（４）と同
様にして濾過を行い、透析した後、凍結真空乾燥を行い
6.2gの粉末を得た。

次に実施例（４）および比較例（４）で得た粉末の分
子量及びフェノール硫酸法によるグルコース換算糖量の
比較を第２表に示す。

第２表の結果により、従来技術である亜硝酸塩処理に
より得られた低分子化キトサンでは、極大分子量が3000
付近と低く、また脱アミノ化が生じるために、フェノー
ル硫酸法によるグルコース換算糖量値が高い値を示す。
一方、本発明により得られた水溶性低分子化キトサンで
は、極大分子量が比較的大きく、また、脱アミノ化の程
度も低いことがフェノール硫酸法によるグルコース換算
糖量値より類推される。

【図面の簡単な説明】

第１図は、キトサンの脱アセチル化度と本発明により得
られたキトサナーゼの相対活性の関係を示す図であり、
第２図は至適pH、第３図は安定pH範囲、第４図は作用適
温の範囲、第５図は熱安定、第６図は熱安定性に対する
塩化ナトリウム濃度の影響を示す図である。第７図は、
参考例（３）における酵素反応の時間とキトサンの分子
量分布を示す図である。

Claims

(57)【特許請求の範囲】

【請求項１】脱アセチル化度が60−90％であるところの
キトサンにキトサナーゼを作用させ、反応と同時または
反応後にアルカリを加えて反応液pHを７−10に上げて得
られる極大分子量が主として4,000−12,000であり、か
つ酸性〜アルカリ性の水溶液に可溶な水溶性低分子化キ
トサン。
【請求項２】反応液pHを７−10に上げた後、濾過または
膜処理により酵素反応生成物を分離して得られる請求項
１記載の水溶性低分子化キトサン。
【請求項３】フェノール硫酸法によるグルコース換算糖
量が10％以下であることを特徴とする請求項１又は２記
載の水溶性低分子化キトサン。
【請求項４】脱アセチル化度が60−90％であるところの
キトサンにキトサナーゼを作用させ、反応と同時または
反応後にアルカリを加えて反応液pHを７−10に上げて得
られる極大分子量が主として4,000−12,000であり、か
つ酸性〜アルカリ性の水溶液に可溶な低分子化キトサン
を得ることを特徴とする水溶性低分子化キトサンの製造
法。
【請求項５】反応液pHを７−10に上げた後、濾過または
膜処理により酵素反応生成物を分離し、低分子化キトサ
ンを得ることを特徴とする請求項４記載の水溶性低分子
化キトサンの製造法。
【請求項６】キトサナーゼがバチルス属菌（Bacillus s
p.）No.K−881（微工研菌寄第10257号）により生産され
たものであることを特徴とする請求項４又は５記載の水
溶性低分子化キトサンの製造法。
【請求項７】膜が孔径0.05μｍ乃至５μｍの精密濾過膜
または分画分子量１万以上の限外濾過膜である請求項５
記載の水溶性低分子化キトサンの製造法。
【請求項８】膜が孔径0.05μｍ乃至５μｍのセラミック
フィルターである請求項５記載の水溶性低分子化キトサ
ンの製造法。