FR2774379A1 - Procede de production, par des cellules vegetales, d'alpha 1-antitrypsine et de ses variantes, et produits contenant l'alpha-antitrypsine ainsi obtenue - Google Patents

Abstract

L'invention concerne un procédé de production d'alpha1 -antitrypsine (alpha1 -AT), ou de variantes de celle-ci caractérisé par : i) l'introduction dans des cellules végétales monocotylédones, d'un acide nucléique comportant une séquence codant pour l'alpha1 -antitrypsine (alpha1-AT) ou pour une variante de celle-ci, les variantes se différenciant de l'alpha1 -AT humaine naturelle par une ou plusieurs substitution (s), délétion (s) ou insertion (s) d'acides aminés, et éventuellement une séquence codant pour un agent sélectif;ii) sélection des cellules ayant intégré de manière stable l'acide nucléique;iii) propagation des cellules transformées en culture, ou régénération de plantes entières chimériques ou transgéniques;iv) récupération et éventuellement purification de L'alpha1 -antitrypsine ou de ses variantes, ainsi produites.

Description

PROCEDE DE PRODUCTION, PAR DES CELLULES VEGETALES,
D'al-ANTITRYPSINE ET DE SES VARIANTES, ET PRODUITS
CONTENANT L'a-ANTITRYPSINE AINSI OBTENUE
L'invention concerne un procédé de production, par des cellules végétales monocotylédones, d'al- antitrypsine et de ses analogues, et les protéines ainsi obtenues. L'invention vise également les cellules et plantes monocotylédones, génétiquement transformées, capables de produire des analogues d'a1antitrypsine, et les construits d'acides nucléiques impliqués dans la transformation. En outre, l'invention vise des produits pharmaceutiques contenant l'al-antitrypsine et ses variantes, ainsi obtenues.

L'alpha-l-antitrypsine, a1-AT, également connue sous les désignations d'alpha-l-inhibiteur de protéase (a1-PI), d'antitrypsine et de metserpine, est une protéine plasmatique présente dans le plasma à une concentration de l'ordre de 1,3 grammes par litre.

Synthétisée par le foie, il s'agit d'une glycoprotéine de 51kDa à 54kDa, constituée d'une seule chaîne polypeptidique de 394 acides aminés (Long et al.,
Biochemistry, 1984, vol. 23, pages 4828-4837).

Elle possède 3 sites de N-glycosylation sur les résidus Asn-46, Asn-83 et Asn-247, les trois chaînes glycosidiques ayant une structure core'1 commune de
Asn-(NAc Glc)2-(Man)3, avec 2 ou 3 antennes de NAc Glc
Gal-Sia. La partie glucidique représente 13% de la masse totale de la glycoprotéine.

En raison d'un polymorphisme survenant à 3 positions dans la protéine, il existe 3 formes d'al-AT:
M1, M2, M3
213 376 101
M1 Val/Ala Glu Arg
M2 Val Asp Arg
M3 Val Asp His
L'a1-AT est un inhibiteur de protéase à sérine.

Sa fonction biologique principale est d'inhiber ltélastase neutrophile et de protéger ainsi le tissu pulmonaire contre les attaques protéolytiques.

Il existe plusieurs variantes "pathologiques" communes de la protéine : par exemple la forme "Z" dans laquelle Glu-342 est substitué par Lys, et la forme "S" dans laquelle Glu-264 est substitué par Val.

Des différences au niveau de la glycosylation, et en particulier dans le nombre de résidus d'acide sialique, peuvent aussi être observées.

Les mutants Z et S, bien que capables de fonctionner comme agents anti-élastase, sont produits en faible quantité conduisant à une déficience, et surtout dans le cas de la variante "Z", au développement d'emphysème pulmonaire sévère.

Cette pathologie est actuellement traitée par thérapie substitutive avec des concentrés plasmatiques. Les besoins annuels actuels par patient sont estimés à 200 grammes et la demande mondiale à plusieurs centaines de kilogrammes par an. L'échelle de production de la protéine à partir de sang humain couvre difficilement ces besoins.

La production d'a1-AT humaine par voie recombinante a donc été envisagée. L'a1-AT recombinante non-glycosylée a notamment été produite chez E. coli sous forme de protéine de fusion. La protéine, exprimée à un taux d'environ 15% des protéines cellulaires totales, présentait une activité antiélastase caractéristique d'a1-AT, mais était selon les auteurs, susceptible de présenter des propriétés immunologiques modifiées en raison de l'extension Nterminale (Courtney et al., PNAS, 1984, vol. 81, pages 669-673).

La production chez la levure d'al-AT à des taux élevés (10-38 des protéines cellulaires totales) a également été décrite par Johansen et al. (Mol.

Biol.Med., 1987, vol. 4, pages 291-305). Le rendement a été augmenté par la délétion des premiers 5, 10 ou 15 acides aminés.

Travis et al. (J. Biol. Chem., 1985, vol. 260 na 7, pages 4384-4389) ont décrit la production d'al-AT non glycosylée chez la levure. Deux variantes de la protéine ont été obtenues à un rendement d'environ 10% des protéines cellulaires solubles totales, chacune ayant une activité a1-AT mais une stabilité réduite par rapport à l'a1-AT native.

L'al-AT glycosylée a été exprimée dans le sang et dans le lait d'animaux transgéniques, notamment des lapins, des souris et des brebis.

Dans le sang des animaux transgéniques, la protéine était présente à une concentration d'environ 1 mg/ml de plasma. Elle conserve son activité antiélastase (Massoud et al., C. R. Acad. Sci. Paris, 1990, tome 311, série III, pages 275-280).

Dans le lait de brebis transgéniques, les niveaux d'al-antitrypsine ont atteint 60 g/l. La protéine ainsi produite est entièrement glycosylée (Wright et al.,
Bio/Technology, Septembre 1991, vol. 9, pages 830834). La nature de la glycosylation n'a pas été publiée.

La production de protéines recombinantes dans le lait des animaux transgéniques se propose de diminuer les coûts de production. Cependant, il reste des problèmes d'éthique et de contaminations virales et subvirales du même type que ceux rencontrés avec les produits purifiés classiques.

Le problème technique que se propose de résoudre la présente invention est de produire de l'al-AT recombinante en grande quantité à des coûts faibles, sans risque de contaminations virales ou sub-virales, par exemple par des prions. La protéine présente une activité a1-AT satisfaisante, et doit être stable et adaptée du point de vue immunologique à la forme d'administration choisie. Les présents inventeurs ont résolu ce problème technique en utilisant, comme hôte pour la transformation génétique, des cellules végétales, et plus particulièrement des cellules végétales monocotylédones.

Diverses équipes se sont déjà intéressées à la production de protéines recombinantes de mammifères dans des cellules végétales ou dans des plantes transgéniques. Par exemple, l'expression spécifique dans les graines de colza, de la leu-enképhaline a été obtenue avec des niveaux d'expression d'environ 0,1% (Vanderkerckhove et al., Biotechnology, 1989, vol. 7, pages 929-932).

En 1990, Simons et al. (Biotechnology, 1990, vol.

8, pages 217-221) ont transféré le gène de la sérum albumine humaine dans des cellules de tabac et de pomme de terre. Quelle que soit l'origine des peptides signaux (humaine ou végétale), des taux de sérum albumine humaine de l'ordre de 0,02% des protéines totales ont été obtenus dans les feuilles, les tiges et les tubercules de pomme de terre.

D'autres protéines recombinantes de mammifères ont aussi été produites dans les plantes : l'antigène de surface de l'hépatite B (Mason et al., P.N.A.S, 1992, vol. 89, pages 11745-11749) ; l'interféron humain (Edelbaum, J. of Interferon Res., 1992, vol.

12, pages 449-453) ; un anticorps de souris anti
Streptococcus mutans, agent de la carie dentaire (Hiatt et Ma, FEBS, 1992, vol. 307, pages 71-75) ; un anticorps anti-Herpès et l'hirudine (Russel, Moloney, respectivement, Intl. Meeting of Production of
Recombinant Proteins in Plants, Leicester, 1994, page 43, pages 36-38).

L'ensemble de ces recherches montre que la production de protéines recombinantes de mammifères dans les cellules végétales est possible et que les mécanismes de synthèse de protéines à partir des séquences d'ADN sont similaires chez les cellules animales et les cellules végétales. De plus, il apparaît que la cellule végétale est capable de réaliser la plupart des étapes de maturation posttraductionnelles des protéines comme l'assemblage des sous-unités, le repliement des chaînes, la maturation protéolytique, la formation des ponts-disulfures et le clivage des peptides signaux de manière semblable aux cellules animales.

Quelques différences existent néanmoins au niveau de la glycosylation. Bien que les étapes de glycosylation conduisant aux glycannes polymannosidiques soient réalisées de manière identique chez les plantes et chez les mammifères, la maturation des glycannes polymannosidiques en glycannes complexes est sensiblement différente. Les
N-glycannes des glycoprotéines végétales diffèrent principalement des glycannes de mammifères par l'absence d'acide sialique, également connu sous le nom d'acide N-acétylneuraminique, et par la présence d'un résidu de ss-1,2 xylose et d'un résidu de fucose lié en a-1,3 au résidu de GlcNAc proximal du "core" (Driouich et al., Regard sur la biochimie, 1993, vol.

3, pages 33-42). Les abréviations signifiant des résidus glucidiques sont celles habituellement utilisées dans l'art (VLIEGENTHART J.F.G and MONTREUIL
J., Chap. II, Glycoproteins, Montreuil J., Schachter
H., Vliegenthart J.F.G., 1995, ELSEVIER SCIENCE B.V., pages 13-28 ; MONTREUIL J., Advances in Carbohydrate
Chemistry and Biochemistry, 1980, Vol. 37, Academic
Press Inc., pages 157-223).

La glycosylation joue un rôle important dans la mise en place de la structure spatiale de la protéine, dans la solubilité de la molécule, dans la protection contre les attaques protéolytiques et dans les mécanismes de reconnaissance immunitaire. Le glycanne contrôle aussi la demi-vie de la protéine et peut luimême, dans certains cas, porter la fonction biologique. Compte tenu du rôle important joué par la glycosylation, l'on essaie normalement, pour la fabrication de protéines thérapeutiques, de reproduire le plus fidèlement possible la glycosylation naturelle de la protéine. Ceci n'est pas possible dans des cellules végétales, en raison de la présence du xylose, absent chez les animaux, et de l'absence d'acide sialique chez les plantes. Bien que présentant de nombreux avantages du point de vue économique, les différences au niveau de la glycosylation de la protéine peuvent donc rendre imprévisible le succès de l'utilisation de cellules végétales pour la production de protéines thérapeutiques.

Malgré ces différences importantes, les présents inventeurs ont réussi à produire dans des plantes monocotylédones transgéniques, à des niveaux d'expression élevés, des protéines ayant une activité d'al-AT. Les protéines ont une stabilité acceptable. De manière surprenante, les inventeurs ont aussi constaté, que dans certaines conditions, la maturation protéolytique de la glycoprotéine est fonction de l'adressage cellulaire, permettant la production d'une série de "variantes" protéiques, de poids moléculaire différent, présentant toutes une activité d'a1-AT.

L'invention concerne donc un procédé de production d'a1-antitrypsine, ou de variantes de celleci caractérisé par i) l'introduction, dans des cellules végétales provenant d'une espèce monocotylédone, d'un acide nucléique comportant une séquence codant pour l'a1- antitrypsine ou pour une variante de celle-ci, les variantes se différenciant de l'a1-AT humaine naturelle par une ou plusieurs substitution(s), délétion(s) ou insertion(s) d'acides aminés, et éventuellement une séquence codant pour un agent sélectif ii) sélection des cellules ayant intégré de manière stable l'acide nucléique iii) propagation des cellules transformées en culture, ou régénération de plantes entières chimériques ou transgéniques iv) récupération et éventuellement purification de l'a1-antitrypsine ou de ses variantes, ainsi produites.

L'invention concerne également une protéine susceptible d'être produite par le sus-dit procédé, et présentant une activité de protéase à sérine, de préférence une activité de l'a1-AT, caractérisée en ce que
- soit elle est exempte de chaines Nglycosidiques
- soit elle est N-glycosylée par au moins un glycanne de type mannosidique ou polymannosidique, et/ou par au moins un glycanne de type complexe comportant éventuellement au sein de sa structure un ou plusieurs résidus de xylose et éventuellement un ou plusieurs résidus de fucose, le glycanne de type complexe étant normalement dépourvu de résidus d'acide sialique.

Dans le contexte de l'invention, les termes ciaprès ont les significations suivantes
- une "variante" de l'a1-AT signifie une protéine qui se différencie de l'a1-AT humaine naturelle (mature ou pré-protéine) par une ou plusieurs substitution(s), délétion(s) ou insertion(s) d'acides aminés. De manière générale, les variantes présentent au moins 90% et de préférence au moins 95% d'homologie ou d'identité avec la séquence en acides aminés décrite par Long et al. (Biochemistry, 1984, vol. 23, pages 4828-4837), illustrée dans la Figure 1, le pourcentage d'homologie entre deux protéines étant défini tel qu'indiqué ci-dessous. Le terme variante est utilisé, dans le contexte de l'invention, de manière synonyme avec le terme analogue . Les variantes présentent aussi une activité d'inhibiteur de protéase à sérine. Il a été constaté que certaines modifications au niveau de la séquence en acides aminés de l'a1-AT peut conférer à la protéine une activité d'inhibiteur de protéase à sérine autre que celle normalement associée à l'a1-AT, par exemple une activité caractéristique de l'antithrombine III (Jallat et al., Protein Engineering, Vol. 1, NO 1, pp 29-35, 1986). Les variantes d'a1-AT de l'invention présentent une glycosylation identique ou différente de l'a1-AT humaine naturelle. Le terme variante englobe également des fragments de l'a1-AT et ses analogues qui présentent une activité d'inhibiteur de protéase à sérine, de préférence une activité d'a1-AT.

- une activité d'inhibiteur de protéase à sérine signifie la capacité d'inhiber partiellement ou totalement toute protéase ayant un résidu sérine au sein de son site actif, par exemple la trypsine, l'élastine, la cathepsine G, la thrombine, la collagénase, la chymotrypsine et la plasmine.

- "une activité de l'a1-AT" signifie une activité anti-élastase, déterminée selon la technique de Travis et Johnson, Meth. in Enzymol., 1981, vol. 80, pages 754-765. Cette technique est détaillée dans les exemples. L'activité peut également être déterminée selon la capacité de la protéine à inhiber la trypsine (voir Travis et Johnson, supra). De manière générale, pour les deux techniques, la protéine recombinante présente une activité d'inhibition d'au moins 30% et de préférence au moins 75%, par exemple 85% de celle de l'a1-AT humaine naturelle à molarité égale. Une troisième technique consiste en la détermination de la capacité de la protéine recombinante à hydrolyser le substrat Methoxy-L-Alanyl-L-Prolyl-L-Valine-Pnitroanilide (Massoud et al., supra). La capacité de la protéine à inhiber l'activité de chacune des protéases à sérine mentionnées ci-dessus peut aussi être utilisée comme indice de l'activité des protéines de l'invention (The Plasma Proteins", Second Edition,
Ed. Pulnam, Academic Press, 1975, p.241-242).

- monocotylédone signifie un végétal phanérogame angiosperme dont la tige et la racine sont (presque toujours) dépourvues de cambiums et donc de formations secondaires; la feuille est presque toujours pourvue de nervures parallèles; la graine renferme un embryon à un seul cotylédon.

- le pourcentage d'homologie entre deux séquences d'acides aminés est calculé comme étant le nombre d'acides aminés identiques plus le nombre d'acides aminés similaires dans l'alignement des deux séquences, divisé par la longueur des séquences entre deux positions données. Si, entre les deux positions données, les deux séquences n'ont pas la même longueur, le pourcentage d'homologie est le nombre d'acides aminés identiques et similaires, divisé par la longueur de la séquence la plus longue. Les acides aminés considérés comme étant "similaires" sont connus dans l'art, voir par exemple R.F. Feng, M.S. Jobson and R.F. Doolittle ; J. Mol. Evol. ; 1985 ; vol. 21 pages 112-115. Ils sont normalement considérés comme étant ceux qui, au sein d'une matrice de permutation, ont un coefficient de substitution positif.

Selon une première variante de l'invention, la protéine recombinante à activité al-AT est nonglycosylée. Ce type de protéine peut être obtenu dans une cellule végétale en utilisant la séquence d'acide nucléique codant pour le polypeptide mature, c'est-àdire sans le peptide signal N-terminal de 24 acides aminés (voir par exemple Figure 1). Aucun autre signal n'est ajouté. Le polypeptide ainsi produit s'accumule dans le cytoplasme de la cellule. Il aura normalement un poids moléculaire inférieur d'environ l0kD à celui de l'al-AT humaine naturelle, c'est-à-dire autour de 45kDa, et une stabilité moindre dans le plasma.

Selon une variante préférée, la protéine de l'invention est glycosylée à l'un au moins des 3 sites naturels de glycosylation : Asn-46, Asn-83 ou Asn-247.

La glycosylation est de type mannosidique, polymannosidique ou de type complexe, ou un mélange des deux. L'expression entièrement glycosylée signifie, dans le contexte de l'invention, que la molécule en question est glycosylée aux 3 sites naturels de glycosylation.

Le ou les glucanne(s) de type mannosidique ont la structure GlcNAc2-Manl. Le ou les glucanne(s) polymannosidique(s) ont la structure GîcNAc2-Man2-9, par exemple GlcNAc2-Mang, GlcNAc2-Mana, GlcNAc2-Man6 ou
GlcNAc2-Man5, ou GlcNAc2-Man3.

Le ou les glucanne(s) de type complexe sont biantennés et ont une structure de base GlcNAc2-Man3 à laquelle sont éventuellement associés des résidus de xylose (Xyl), fucose (Fuc) et éventuellement galactose (Gal) ou N-acétylglucosamine (GlcNAc). Ils sont normalement exempts de résidus d'acide sialique, ce composé n'ayant pas jusqu'alors été mis en évidence dans les cellules végétales.

De préférence, le glycanne complexe est de type "phytohémagglutinine" (PHA) constitué d'une structure "core" GlcNAc2Man3 dont le mannose lié en ss porte un résidu de ss 1,2-xylose et dont le GlcNAc proximal porte un résidu d'a 1,3 fucose (GlcNAc2 (Fuc) Man3 (Xyl)). Ce genre de structure est fréquent pour les glycoprotéines de localisation vacuolaire ou extracellulaire. Le résidu de fucose a 1,3-lié peut éventuellement être absent.

Le glycanne complexe peut aussi être du type "Laccase" (Driouich et al, Regard sur la Biochimie, 1993, n"3, pp33-42) composé d'une structure de base
GlcNAc2 (Fuc) Man3 (Xyl) associée à deux chaînes latérales. Chaque chaîne latérale est constituée d'un résidu de ss 1,2 GlcNAc auquel est lié un résidu d'a 1,6 fucose et un résidu de ss 1,4 galactose.

La glycoprotéine de l'invention peut être glycosylée aux trois sites naturels (Asn-46, Asn-83 et
Asn-247) ou seulement à l'un ou deux d'entre eux.

Parmi les variantes préférées, l'on peut citer des glycoprotéines portant exclusivement des glycannes polymannosidiques. Ces glycoprotéines présentent une très faible immunogénicité chez l'animal parce que ce type de glycosylation existe sous forme identique chez la plante et chez l'animal.

On peut aussi citer les glycoprotéines portant exclusivement des glycannes de type complexe, par exemple deux ou trois glycannes de type PHA GlcNAc2 (Fuc) Man3 (Xyl)
La partie glucidique représente, normalement, entre 2 et 30%, par exemple 5 à 20% de la masse totale de la glycoprotéine de l'invention.

La partie protéique de la glycoprotéine correspond à la partie protéique de toute protéine ou fragment de protéine présentant une activité a1-AT. il s'agit normalement du polypeptide mature d'al-AT humaine, mais peut également être celui d'animaux tels que le lapin ou le singe.

La séquence en acides aminés complète de l'a1-AT humaine, y compris le peptide signal N-terminal (Type M1 ), est décrite par Long et al. (Biochemistry, 1984, vol. 23, pages 4828-4837). En plus du type M1, il existe également les types M2 ou M3 (Val 213 - Asp 376 - Arg 101 ; Val 213 - Asp 376 - His 101, respectivement), ou une variante de M1, M2 ou M3 dans laquelle Val 213 est remplacé par Ala. Les protéines de l'invention peuvent comporter les séquences en acide aminés des types M1, M2 ou M3.

La séquence en acides aminés peut aussi être celle des variantes Z ou S, associées à certains troubles pulmonaires. Ces variantes se distinguent du type M1 décrit par Long et al par Glu-342 o Lys (variante Z) et Glu-264 o Val (variante S).

De manière générale, la protéine de l'invention peut comporter toute séquence en acides aminés se différenciant de la séquence naturelle par une ou plusieurs substitution(s), délétion(s) ou insertion(s) d'acides aminés. Normalement, ces variantes présentent une homologie, ou une identité, d'au moins 90% par exemple 95%, avec la séquence décrite par Long et al.(Biochemistry, 1984, vol. 23, pages 4828-4837
Figure 1).

Parmi les variantes préférées, l'on peut citer des séquences d'a1-AT dont la Met358 du site actif, a été modifié, par exemple remplacé par un acide aminé différent, tel que Arg, Leu, Ala, Ile ou Val. De plus,
Asp2 et Asp6 peuvent être remplacés par Asn.

Les variantes de la protéine de l'invention peuvent aussi comporter des fragments de la séquence décrite par Long et al. (Biochemistry, 1984, vol. 23, pages 4828-4837) et de ses analogues définis ci-dessus à condition que l'activité d'inhibiteur de protéase à sérine, et particulièrement celle de l'a1-AT, soit conservée. Ces fragments sont constitués d'environ 200 à 393 acides aminés consécutifs de la séquence d'a1AT, de préférence entre 250 et 390 acides aminés. Parmi les fragments préférés, on peut citer 1' l'a1AT mature humaine dont l'extrémité N terminale a été tronquée par la délétion d'environ 1 à 10 acides aminés.

L'extrémité C terminale peut aussi être tronquée d'environ 1 à 20 acides aminés. Le site actif de la protéine se trouvant autour des acides aminés Met-358 à Glu-363, il est important de ne pas effectuer de délétion C terminale de longueur trop importante afin de ne pas affecter le site actif.

Outre la séquence en acides aminés responsable de l'activité a1-AT proprement dite, la protéine de l'invention peut comprendre différents signaux peptidiques responsables de l'adressage de la protéine vers les différents compartiments cellulaires où sont effectuées les modifications co- et posttraductionnelles. Ces signaux sont le peptide signal
N-terminal, également connu sous le nom de prépeptide, le signal de type KDEL responsable de la rétention de la protéine dans le réticulum endoplasmique et le signal d'adressage vacuolaire, ou propeptide.

En effet, dans la cellule végétale, l'adressage des protéines est basé sur le même principe que dans les cellules animales. A partir de l'ADN chromosomique, le gène est transcrit en ARN messager, puis traduit en protéine au niveau des ribosomes. Si la protéine naissante possède un peptide signal Nterminal ou prépeptide, elle pénètre dans le réticulum endoplasmique où ont lieu un certain nombre de maturations post-traductionnelles, notamment le clivage du peptide signal, les N-glycosylations conduisant aux glycannes polymannosidiques, et la formation des ponts disulfures. La présence d'un peptide KDEL, HEKDEL ou SEKDEL à l'extrémité C terminale provoque la rétention de la protéine dans le réticulum endoplasmique et, dans certains cas, l'accumulation de protéines dans des vésicules du réticulum endoplasmique. Lors de la rétention d'une protéine dans le réticulum endoplasmique, le signal
KDEL (HDEL ou SEKDEL) n'est pas clivé et il subsiste sur la protéine mature.

En l'absence d'un signal de rétention du type
KDEL, la protéine est transportée vers l'appareil de
Golgi et subit, au cours de ce transport, une première modification de ses chaînes de glycannes (suppression des glucoses terminaux). Dans l'appareil de Golgi, la maturation des glycannes se poursuit par la suppression des résidus et l'addition de résidus xylose et fucose pour former les glycannes complexes.

En l'absence d'un signal d'adressage vacuolaire ou "propeptide", la protéine est alors sécrétée et s accumule dans l'espace intercellulaire. Lorsque la protéine possède à l'extrémité N-terminale ou Cterminale un propeptide, la proprotéine est dirigée vers la vacuole. A l'entrée dans la vacuole, le propeptide est clivé et certaines maturations finales de glycannes sont réalisées.

Parmi ces différents signaux, le prépeptide, responsable de l'adressage de la protéine dans le réticulum endoplasmique, est toujours présent. Il s'agit normalement d'un peptide signal N-terminal hydrophobe ayant entre 10 et 40 acides aminés. il est normalement d'origine animale ou végétale. il peut en effet s'agir du prépeptide naturellement associé à l'a1-AT humaine (PA), ou d'un prépeptide provenant d'une autre protéine humaine, par exemple celui de la sérum albumine humaine. Par exemple, il s'agit d'un prépeptide d'origine végétale, par exemple celui de la sporamine (PS), de la lectine d'orge, de l'extensine végétale (pEXT), de l'a-mating factor, des protéines végétales impliquées dans la défense contre les microorganismes (PRla et PRS, "pathogenesis related proteins").

Normalement, le peptide signal est clivé par un signal peptidase dès l'introduction co-traductionnelle du polypeptide naissant dans la lumière du réticulum endoplasmique (RER) . La protéine mature ne comporte plus cette extension N-terminale.

La protéine de l'invention peut, outre le prépeptide, aussi comporter un signal de rétention endoplasmique, consistant en les peptides KDEL, SEKDEL ou HDEL. Ces signaux se trouvent normalement à l'extrémité C-terminale de la protéine et subsistent sur la protéine mature. La présence de ce signal sur les protéines de l'invention est avantageuse pour plusieurs raisons : d'une part, la rétention de la protéine dans le réticulum endoplasmique a tendance à augmenter les rendements en protéines recombinantes.

D'autre part, la maturation de la glycosylation polymannosique en glycannes complexes n'aura pas lieu ; la protéine conserve donc la glycosylation polymannosique, minimisant le risque de réactions immunologiques indésirables lorsque la protéine sera administrée à l'homme comme médicament. Selon cette variante de l'invention, le glycoprotéine comporte donc la séquence en acides aminés d'a1-AT, un signal du type KDEL, au moins un glycanne de type polymannosique, et est exempt de glycannes de type complexe. Selon l'invention, ce type de protéine peut aussi être obtenu en utilisant des mutants de plantes incapables de fabriquer la N-acétyl glucosaminyl transférase (von Schaewen et al., Plant Physiol. 1993 102: 1109-1118), et donc incapables de produire des glycannes complexes.

La protéine de l'invention peut, outre le prépeptide, comporter aussi un signal d'adressage vacuolaire ou "propeptide". En présence d'un tel signal, la protéine est adressée aux vacuoles des tissus aqueux, par exemple les feuilles, ainsi qu'aux corps protéiques des tissus de réserve, par exemple les graines, tubercules et racines. L'adressage de la protéine vers les corps protéiques de la graine est particulièrement intéressant en raison de la capacité de la graine à accumuler des protéines, jusqu'à 40% des protéines par rapport à la matière sèche, dans des organites cellulaires dérivés des vacuoles, appelés corps protéiques et en raison de la possibilité de stocker plusieurs années les graines contenant les protéines recombinantes à l'état déshydraté.

Comme propeptide, on peut utiliser un signal d'origine animale ou végétale, les signaux végétaux étant préférés, par exemple la pro-sporamine, ou la lectine d'orge. Le propeptide peut être N-terminal ("N-terminal targeting peptide" ou NTTP), ou C terminal (CTTP) ou peut consister en une séquence interne à la protéine. Dans la mesure où le propeptide est normalement clivé dès l'entrée de la protéine dans la vacuole, il n'est pas présent dans la protéine mature. Pour un adressage vacuolaire, on peut utiliser une combinaison peptide signal et propeptide Nterminal de sporamine de patate douce (PPS).

Selon une autre variante de l'invention, la protéine de l'invention peut être sous forme de protéine de fusion, en particulier avec une protéine végétale. La protéine végétale peut être choisie afin d'augmenter le rendement ou de faciliter la sécrétion et la purification. La protéine de fusion peut aussi être choisie afin de permettre le ciblage de l'al-AT ou de faciliter son transport.

L'objectif principal de l'invention étant de produire l'a1-AT recombinante dans des cellules végétales monocotylédones, 1 invention vise également les acides nucléiques codant pour les protéines, et pour les signaux d'adressage, éventuellement en association avec des séquences régulatrices adéquates, permettant l'expression de l'al-AT dans la cellule végétale.

La séquence d'acide nucléique codant pour l'a1-
AT, ou pour ses variantes ou les fragments définis cidessus, peut être de l'ADNc ou de l'ADN génomique avec ses introns. Normalement, il s'agit d'ADNc, une séquence appropriée est illustrée la Figure 1 (Long et al, Biochemistry, 1984, vol. 23, pages 4828-4837).

Toute séque d'autre part, des séquences régulatrices de transcription reconnues par une cellule végétale monocotylédone. Les séquences régulatrices comprennent un ou plusieurs promoteurs d'origine végétale plus particulièrement d'origine monocotylédone, ou virale ou provenant d'Agrobacterium tumefaciens. il peut s'agir d'un promoteur constitutif, par exemple le promoteur actine de riz, ou des promoteurs spécifiques de certains tissus comme le grain, ou spécifiques de certaines phases de développement de la plante monocotylédone.

Comme promoteurs spécifiques de graines, on peut citer le promoteur du gène gamma (g) zéine de maïs (Reina et al, 1990).
il peut être envisagé d'utiliser des "enhancers" pour améliorer l'efficacité d'expression.

Les séquences régulatrices de terminaison sont d'origine végétale ou virale ou provenant d'Agrobacterium tumefaciens, et sont fonctionnelles dans des cellules végétales monocotylédones.

Selon une variante, le gène chimérique de l'invention comprend en outre une séquence codant pour un peptide signal permettant la sécrétion de la protéine, et éventuellement une séquence codant pour un signal de rétention endoplasmique ou pour un signal d'adressage vacuolaire.

Les promoteurs semences spécifiques sont particulièrement avantageux en association avec un signal d'adressage vacuolaire (prépropeptide).

Dans le cas où des introns hétérologues sont utilisés en combinaison avec 1'ADNc d'al-AT, bien entendu, le gène chimérique comprend également ces introns.

L'invention vise également des plasmides ou vecteurs caractérisés en ce qu'ils contiennent au moins l'une des séquences d'acide nucléique, de préférence un gène chimérique, selon l'invention. De préférence, les plasmides et vecteurs permettent la transformation stable de la plante, par exemple les plasmides Ti d'Agrobacterium, des vecteurs viraux tels que les Geminivirus.

Tous les moyens connus pour introduire de l'ADN étranger dans les cellules végétales peuvent être utilisés, par exemple Agrobacterium, électroporation, transformation de protoplastes, bombardement avec canon à particules, ou pénétration d'ADN dans des cellules comme le pollen, la microspore, la graine et l'embryon immature, suspensions cellulaires embryogènes et non embryogènes, inflorescence immature et vecteurs viraux tels que les Geminivirus. La séquence de l'invention est introduite dans un vecteur approprié avec toutes les séquences régulatrices nécessaires tels que promoteurs, terminateurs, etc... ainsi que toute séquence nécessaire pour sélectionner les transformants.

L'intégration de l'acide nucléique dans le génome peut éventuellement avoir lieu par recombinaison homologue. Dans ce cas, l'acide nucléique transformant comporte, sur chaque extrémité, une séquence homologue aux séquences qui jouxtent le site d'insertion souhaité dans le génome.

L'invention concerne également les cellules végétales monocotylédones transformées avec les séquences de l'invention, et capable de produire une ou plusieurs protéine(s) ayant une activité d'inhibiteur de protéase à serine et, en particulier, de l'a1-AT.
il peut s'agir de cultures de cellules végétales in vitro, par exemple en milieu liquide. Différents modes de culture ("batch", "fed batch" ou en continu) pour ce type de cellules sont actuellement à l'étude.

Les cultures en "batch" sont comparables à celles effectuées en erlenmeyer dans la mesure où le milieu n' est pas renouvelé, les cellules ne disposent ainsi que d'une quantité limitée d'éléments nutritifs. La culture en "fed batch" correspond quant à elle à une culture en "batch" avec une alimentation programmée en substrat. Pour une culture en continu, les cellules sont alimentées en permanence avec du milieu nutritif.

Un volume égal du mélange biomasse-milieu est ôté afin de maintenir le volume du réacteur constant. Les quantités de biomasse végétale envisageables avec des cultures en bioréacteurs sont variables selon l'espèce végétale, le mode de culture et le type de bioréacteur.

Les cellules de l'invention peuvent aussi être immobilisées, ce qui permet d'obtenir une production constante et prolongée d'al-AT. La séparation de l'al
AT et la biomasse végétale est aussi facilitée. Comme méthode d'immobilisation, on peut citer l'immobilisation en billes d'alginate, d'agar, à l'intérieur de mousse de polyuréthane, ou bien encore dans des fibres creuses.

Au lieu de produire l'a1-AT de l'invention par culture de cellules végétales, on peut régénérer des plantes chimériques ou transgéniques à partir d'explants transformés, en ayant recours à des techniques connues en soi.

Comme plantes préférées, on peut citer toutes les plantes monocotylédones. On peut citer les céréales telles que le blé, le maïs, le riz, l'orge, le sorgho et l'avoine, mais aussi la canne à sucre, l'asperge et la banane.

L'invention concerne également les graines des plantes transgéniques capables de produire l'al-AT ainsi que leurs descendances.

Selon le procédé de l'invention, les protéines sont récupérées, et éventuellement purifiées, afin de permettre leur utilisation dans un grand nombre d'applications.

Les méthodes de récupération (extraction) et de purification des protéines sont choisies en fonction de la méthode de production, c'est-à-dire cellules en culture ou plantes entières, et éventuellement de l'adressage mis en oeuvre.

L'extraction est normalement faite par broyage des tissus, par exemple feuilles ou grains, dans un tampon approprié, filtrage du broyat, précipitation des protéines dans le surnageant, centrifugation et reprise du culot dans un tampon approprié avec dialyse. Une étape de purification partielle peut aussi être effectuée à ce stade par chromatographie sur colonne d'échangeuse d'ions.

L'invention vise aussi des anticorps monoclonaux ou polyclonaux capables de reconnaître spécifiquement la protéine de l'invention. Ces anticorps peuvent être utilisés dans la purification des protéines de l'invention et dans le suivi des patients.

L'invention vise en outre un produit pharmaceutique comprenant une ou plusieurs protéine(s) de l'invention en association avec un excipient acceptable du point de vue physiologique.

La composition pharmaceutique de l'invention peut être administrée sous forme d'aérosol (particulièrement appropriée, s'il s'agit de l'al-AT non-glycosylée) pour injection nasale, ou par voie intraveineuse, sous-cutanée, topique ou percutanée.
il est également possible d'utiliser un implant sous-cutané des cellules végétales transformées sans purification de l'a1-AT, isolées dans une membrane semi-perméable laissant passer la protéine active. La ou les protéine(s) de l'invention peut ou peuvent être administrée(s) en forme de liposome(s), encapsidée(s) ou conjuguée(s) à une molécule de ciblage.

L'invention vise également l'utilisation de la protéine de l'invention pour la préparation d'un médicament pour le traitement de conditions liées à une déficience en al-antitrypsine. Les maladies qui sont susceptibles d'être traitées comprennent la mucoviscidose, le choc septique, et l'emphysème pulmonaire. La composition pharmaceutique de l'invention peut aussi être utilisée comme antirhumatoïde grâce à son effet anti-collagénase.

Les protéines de l'invention peuvent également être utilisées en cosmétologie. Leur activité anticollagénase empêche la dégradation du tissu conjonctif et en particulier, du collagène et de l'élastine.

Selon cette variante de l'invention, les protéines peuvent être purifiées ou peuvent être utilisées sous forme d'extraits de toute ou partie de la plante ou de la graine ou d'extraits de culture cellulaire.

L'invention vise l'utilisation de la protéine de l'invention dans une application industrielle.

Les protéines de l'invention peuvent aussi être utilisées comme réactifs anti-protéases sous forme de préparations enzymatiques industrielles.

L'invention concerne également un extrait de plante contenant 1 à 90% environ d'une protéine selon l'invention, et notamment l'al-antitrypsine. Cet extrait peut être utilisé comme médicament, notamment en thérapie de conditions liées à une déficience en a1-
AT, notamment l'emphysème pulmonaire, la mucoviscidose, le choc septique ou comme antirhumatoïde. L'invention concerne également une composition pharmaceutique comprenant un tel extrait de plante en association avec un excipient acceptable du point de vue physiologique, de préférence pour l'administration par voie orale ou nasale, par exemple sous forme d'aérosol.

La Figure 1 illustre l'ADNc et la séquence en acide aminés de l'al-AT humaine (type M). L'extrémité NH2 de la protéine mature (Glu) est indiqué comme +1. Les acides aminés -1 à -24 représentent le peptide signal
N-terminal de la protéine immature. Le site réactif (Met) est indiqué par un cercle solide (i). Quatre sites de glycosylation potentiels sont présents dans la protéine, indiqués par des diamants noirs (+), mais seulement trois d'entre eux portent des chaînes glycosidiques (Long et al Supra).

La Figure 2 illustre la carte schématique du plasmide pUC-AAT. L'ADNc de AAT est inséré au site PstI de pUC18. PA (boîte en pointillés) correspond à la séquence du peptide signal AAT. AAT (boîte en noir) correspond à la séquence codant l'al-antitrypsine humaine. Ap (boîte en blanc) correspond au gène conférant la résistance à l'ampicilline.

EXEMPLES
I. CONSTRUCTIONS
L'al-antitrypsine humaine (AAT), une glycoprotéine de 53 kDa, est naturellement synthétisée sous forme d'un précurseur de 418 acides aminés. La protéine mature AAT est constituée de 394 acides aminés et est clivée au site Ala - Glu de son peptide signal de 24 acides aminés. La séquence complète du cDNA ainsi que la séquence peptidique sont décrites par Long et ai. al.(Biochemistry, 1984, vol. 23, pages 4828-4837).

La séquence complète de l'ADNc est renfermée dans le plasmide pUC18 commercialisé par Clontech. Ce plasmide est appelé pUC-AAT (Figure 2).

L'ADNc de AAT, fragment d'ADN digéré par StuI et
SalI et isolé à partir de pUC18, a été cloné aux sites
XbaI traité à la Klenow et SalI du vecteur pBSIISK+ commercialisé par Stratagene Cloning Systems. Le plasmide résultant a été appelé pBIOC30.

A. CONSTRUCTION DES VECTEURS pBIOC31 ET pBIOC32.

MODIFICATION DE L'EXTREMITE 3' DU cDNA CODANT POUR
L'al-ANTITRYPSINE
A.1. CONSTRUCTION DU PLASMIDE pBIOC31 NE
CONTENANT QUE LE PREMIER CODON STOP DE L'1-
ANTITRYPSINE
Pour favoriser l'expression dans les plantes, seul le premier codon stop (TAA) de la protéine alantitrypsine humaine (AAT) a été préservé. Le vecteur pBIOC30 a donc été modifié à l'extrémité 3' du cDNA codant pour AAT.

Le fragment EcoRV-SalI de pBIOC30 a été remplacé par le fragment EcoRV-SalI issu de l'amplification PCR réalisée sur pBIOC30 à l'aide des 2 oligodésoxynucléotides, 5' CCACGATATCATCACCAAGTTCC 3' (contenant le site unique EcoRV) et 5' cggtcgacgaattcCAGTTATTTTTGGGTGGGATTC 3' (contenant les sites SalI et EcoRi, et le premier codon stop de l'AAT) . L'amplification PCR du fragment EcoRV-SalI a été réalisée dans 100 ul de milieu réactionnel comprenant 10 ul de tampon Taq DNA polymérase x10 (500 mM KCl, 100 mM Tris-HCl, pH9,0 et 1% Triton x100), 6 p1 de 25 mM MgCl2, 3 ul de 10 mM dNTP (dATP, dCTP, dGTP et dTTP), 100 pM de chacun des 2 oligodésoxynucléotides décrits ci-dessus, 5 ng d'ADN matrice (vecteur pBIOC30), 2,5 U de Taq DNA polymérase (Promega) et 2 gouttes d'huile de vaseline. L'ADN a été dénaturé à 940C pendant 5 min., soumis à 30 cycles constitués chacun de 1 min. de dénaturation à 94"C, 1 min. d'hybridation à 70"C et de 1 min. d'élongation à 72"C, puis l'élongation à 72"C a été poursuivie pendant 5 min. Cette réaction PCR a été réalisée dans la machine "DNA Thermal Cycler" de PERKIN ELMER CETUS.

L'huile a été éliminée par extraction au chloroforme.

Puis, les fragments d'ADN du milieu réactionnel ont été précipités en présence de 1/10 de volume de 3M acétate de sodium pH4,8 et de 2,5 volumes d'éthanol absolu à -80 C pendant 30 min., centrifugés à 12000g pendant 30 min., lavés à l'éthanol 70%, séchés et digérés par les 2 enzymes de restriction EcoRV et
SalI. Les fragments d'ADN digérés issus de PCR ont été purifiés par électrophorèse sur gel d'agarose 2%, électroélués (Sambrook et al., 1989), précipités en présence de 1/10 de volume de 3M acétate de sodium pH4,8 et de 2,5 volumes d'éthanol absolu à -80 C pendant 30 min., centrifugés à 12000g pendant 30 min., lavés à ltéthanol 70%, séchés, puis ligués à l'ADN plasmidique pBIOC30 digéré par EcoRV et SalI, purifié par électrophorèse sur gel d'agarose 0,8%, électroélué, soumis à la précipitation alcoolique, séché et déphosphorylé par l'enzyme phosphatase alcaline d'intestin de veau (Boehringer Mannheim) selon les recommandations du fabricant. La ligation a été réalisée avec 100 ng du vecteur déphosphorylé décrit ci-dessus et 50 ng de fragments d'ADN digérés issus de l'amplification PCR décrits ci-dessus dans un milieu réactionnel de 10 pl en présence de 1 p1 de tampon T4 DNA ligase x 10 (Amersham) et de 2,5 U d'enzyme T4 DNA ligase (Amersham) à 14"C pendant 16 heures. Les bacteries, Escherichia coli DH5a rendues préalablement compétentes, ont été transformées (Hanahan, 1983). L'ADN plasmidique des clones obtenus, sélectionnés sur 50 ,ug/ml ampicilline, a été extrait selon la méthode de la lyse alcaline (Birnboim et
Doly, 1979) et analysé par digestion enzymatique par des enzymes de restriction. L'ADN plasmidique de certains des clones retenus a été vérifié par séquençage à l'aide du kit de séquençage T7 commercialisé par Pharmacia selon la méthode des didésoxynucléotides (Sanger et al., 1977). Le plasmide résultant a été appelé pBIOC31.

A.2. CONSTRUCTION DU PLASMIDE pBIOC32 CONTENANT
LE PREMIER CODON STOP DE L'g-ANTITRYPSINE PRECEDE DU
SIGNAL KDEL
La séquence codant le signal KDEL (Lys-Asp-Glu
Leu) placée à l'extrémité C-terminale de la séquence codant la protéine mature al-antitrypsine humaine en amont du codon stop combinée à la présence de la séquence codant le peptide signal N-terminal de la sporamine A des racines tubérisées de patate douce permet un adressage dans le réticulum endoplasmique.

Pour insérer la séquence codant le signal KDEL avant le premier codon stop (TAA) de la protéine mature al-antitrypsine humaine (AAT) qui seul sera préservé, le vecteur pBIOC30 a été modifié à l'extrémité 3' de l'ADNc codant pour AAT. La présence d'un codon Lys juste avant le codon stop de AAT, s'est soldée par l'introduction de la séquence codant le signal DEL uniquement.

Le fragment EcoRV-SalI de pBIOC30 a été remplacé par le fragment EcoRV-SalI issu de l'amplification PCR réalisée sur pBIOC30 à l'aide des 2 oligodésoxynucléotides commandés chez Genset, 5'
CCACGATATCATCACCAAGTTCC 3' (contenant le site unique
EcoRV) et 5' cggtcgacgaattcCAGTTAtagctcatcTTTTTGGGTGGG 3' (contenant les sites SalI et EcoRi, et la séquence
KDEL et le premier codon stop de AAT mature), en suivant le protocole d'amplification PCR décrit cidessus dans le paragraphe a.1. Après double digestion enzymatique par EcoRV et SalI, les fragments d'ADN issus de l'amplification PCR ont été purifiés par électrophorèse sur gel d'agarose 2%, électroélués (Sambrook et al., 1989), précipités en présence de 1/10 de volume de 3M acétate de sodium pH4,8 et de 2,5 volumes d'éthanol absolu à -80 C pendant 30 min., centrifugés à 12000g pendant 30 min., lavés à l'éthanol 70%, séchés, puis ligués à l'ADN plasmidique de pBIOC30 doublement digéré par EcoRV et SalI, purifié par électrophorèse sur gel d'agarose 0,8t, électroélué (Sambrook et al., 1989), soumis à la précipitation alcoolique, séché et déphosphorylé par l'enzyme phosphatase alcaline d'intestin de veau (Boehringer Mannheim) selon les recommandations du fabricant. La ligation a été réalisée avec 100 ng du vecteur déphosphorylé décrit ci-dessus et 50 ng de fragments d'ADN digérés issus de l'amplification PCR décrits ci-dessus dans un milieu réactionnel de 10 ul en présence de 1 ul de tampon T4 DNA ligase x 10 (Amersham) et de 2,5 U d'enzyme T4 DNA ligase (Amersham) à 140C pendant 16 heures. Les bactéries,
Escherichia coli DH5a rendues préalablement compétentes, ont été transformées (Hanahan, 1983).

L'ADN plasmidique des clones obtenus, sélectionnés sur 50 ug/ml ampicilline, a été extrait selon la méthode de la lyse alcaline (Birnboim et Doly, 1979) et analysé par digestion enzymatique par des enzymes de restriction. L'ADN plasmidique de certains des clones retenus a été vérifié par séquençage à l'aide du kit de séquençage T7 M commercialisé par Pharmacia selon la méthode des didésoxynucléotides (Sanger et al., 1977).

Le plasmide résultant a été appelé pBIOC32.

B. CONSTRUCTION DES VECTEURS pBIOC33, pBIOC34, pBIOC35
ET pBIOC74. MODIFICATION DE L'EXTREMITE 5' DU cDNA
CODANT POUR L'al-ANTITRYPSINE
Dans l'une des constructions, la séquence contenant l'al-antitrypsine humaine mature précédée d'une partie de celle de son peptide signal naturel PA (11 derniers codons des 24 nécessaires) est contenue dans pBIOC31. Le clone modifié résultant a été appelé pBIOC74.

Par ailleurs, la séquence codant pour le peptide signal naturel PA de l'al-antitrypsine humaine (24 premiers codons) a été remplacé par celle codant pour un signal d'adressage d'origine végétale en respectant les phases ouvertes de lecture des séquences codant pour le signal d'adressage apporté et la protéine mature al-antitrypsine humaine. Ce signal d'adressage est soit un peptide signal (PS) qui permettrait une sécrétion de la protéine dans le milieu extracellulaire de l'espace intercellulaire, soit un prépropeptide c'est-à-dire un peptide signal suivi des séquences N-terminales d'adressage vacuolaire (PPS) qui adresserait la protéine dans la vacuole. Les séquences PS et PPS constituées respectivement de 23 et 37 acides aminés, sont celles d'une protéine de réserve des racines tubérisées de patate douce : la sporamine A (Murakami et al., 1986 ; Matsuoka et
Nakamura, 1991). Le plasmide pBIOC31 modifié contenant la séquence codant pour l'al-antitrypsine humaine (AAT) fusionnée soit à PS (PS-AAT), soit à PPS (PPS
AAT) a été appelé pBIOC33 et pBIOC34 respectivement.

Le plasmide pBIOC32 modifié contenant la séquence codant pour l'al-antitrypsine humaine (AAT) fusionnée à PS (PS-AAT-KDEL) a été appelé pBIOC35.

B.1. CONSTRUCTION DU PLASMIDE pBIOC74 CONTENANT
PA-AAT.

Le plasmide pBIOC31 a été digéré doublement par
SacI et BamHI pour supprimer les 11 derniers codons de la séquence codant pour le peptide signal naturel PA et le premier codon de l'al-antitrypsine humaine mature. Cette séquence a été remplacée par la séquence entière codant pour le peptide signal naturel PA de 24 acides aminés (ATG CCG TCT TCT GTC TCG TGG GGC ATC CTC
CTG CTG GCA GGC CTG TGC TGC CTG GTC CCT GTC TCC CTG
GCT) fusionnée au premier codon de la protéine AAT mature (Glu). La séquence "PS - 3 premiers codons de la protéine AAT mature" a été amplifiée par PCR à partir du plasmide pUC18-AAT à l'aide des 2 oligodésoxynucléotides, 5' gggagctcgaattcaacaATG CCG
TCT TCT GTC TCG TG 3' (contenant les sites EcoRI et
SacI et le signal traductionnel de Kozack) et 5' G GGG
ATC CTC AGC CAG GG3' (contenant le site BamHI de la séquence codant pour la protéine AAT mature), en suivant le protocole d'amplification PCR décrit cidessus dans le paragraphe a.l. Après double digestion enzymatique par SacI et BamHI, les fragments d'ADN issus de l'amplification PCR ont été purifiés par électrophorèse sur gel d'agarose 2%, électroélués (Sambrook et al., 1989), précipités en présence de 1/10 de volume de 3M acétate de sodium pH4,8 et de 2,5 volumes d'éthanol absolu à -80 C pendant 30 min., centrifugés à 12000g pendant 30 min., lavés à l'éthanol 70%, séchés, puis ligués à l'ADN plasmidique de pBIOC31 doublement digéré par SacI et BamHI, purifié par électrophorèse sur gel d'agarose 0,8%, électroélué (Sambrook et al., 1989), soumis à la précipitation alcoolique, séché et déphosphorylé par l'enzyme phosphatase alcaline d'intestin de veau (Boehringer Mannheim) selon les recommandations du fabricant. La ligation a été réalisée avec 100 ng du vecteur déphosphorylé décrit ci-dessus et 50 ng de fragments d'ADN digérés issus de l'amplification PCR décrits ci-dessus dans un milieu réactionnel de 10 ul en présence de 1 ul de tampon T4 DNA ligase x 10 (Amersham) et de 2,5 U d'enzyme T4 DNA ligase (Amersham) à 14"C pendant 16 heures. Les bactéries,
Escherichia coli DH5a rendues préalablement compétentes, ont été transformées (Hanahan, 1983).

L'ADN plasmidique des clones obtenus, sélectionnés sur 50 ug/ml ampicilline, a été extrait selon la méthode de la lyse alcaline (Birnboim et Doly, 1979) et analysé par digestion enzymatique par des enzymes de restriction. L'ADN plasmidique de certains des clones retenus a été vérifié par séquençage à l'aide du kit TM de séquençage T7 commercialisé par Pharmacia selon la méthode des didésoxynucléotides (Sanger et al., 1977). Les séquences du PA et de AAT mature ont été clonées en maintenant leurs phases de lecture ouverte.

La séquence de clivage entre les séquences PA et AAT mature est Ala-Glu. Le plasmide résultant a été appelé pBIOC74.

B.2. CONSTRUCTION DU PLASMIDE pBIOC33 CONTENANT
PS-AAT.

Le plasmide pBIOC31 a été digéré doublement par
SacI et BamHI pour supprimer la séquence codant pour le peptide signal naturel de l'al-antitrypsine humaine. Cette séquence a été remplacée par celle codant pour le peptide signal PS de 23 acides aminés (ATG AAA GCC TTC ACA CTC GCT CTC TTC TTA GCT CTT TCC
CTC TAT CTC CTG CCC AAT CCA GCC CAT TCC) fusionnée aux 3 premiers codons de la protéine AAT mature (Glu-Asp
Pro). La séquence "PS - 3 premiers codons de la protéine AAT mature" a été amplifiée par PCR à partir du plasmide pMAT103 (Matuoka et Nakamura, 1991) à l'aide des 2 oligodésoxynucléotides, 5' gcgagctcgaattcaacaATG AAA GCC TTC ACA CTC GC 3' (contenant les sites EcoRI et SacI et le signal traductionnel de Kozack) et 5' CT GGG ATC CTC GGA ATG
GGC TGG ATT GGG CAG G 3' (contenant le site BamHI de la séquence codant pour la protéine AAT mature), en suivant le protocole d'amplification PCR décrit cidessus dans le paragraphe a.1. Après double digestion enzymatique par SacI et BamHI, les fragments d'ADN issus de l'amplification PCR ont été purifiés par électrophorèse sur gel d'agarose 2%, électroélués (Sambrook et al., 1989), précipités en présence de 1/10 de volume de 3M acétate de sodium pH4,8 et de 2,5 volumes d'éthanol absolu à -80 C pendant 30 min., centrifugés à 12000g pendant 30 min., lavés à l'éthanol 70%, séchés, puis ligués à l'ADN plasmidique de pBIOC31 doublement digéré par SacI et BamHI, purifié par électrophorèse sur gel d'agarose 0,8%, électroélué (Sambrook et al., 1989), soumis à la précipitation alcoolique, séché et déphosphorylé par l'enzyme phosphatase alcaline d'intestin de veau (Boehringer Mannheim) selon les recommandations du fabricant. La ligation a été réalisée avec 100 ng du vecteur déphosphorylé décrit ci-dessus et 50 ng de fragments d'ADN digérés issus de l'amplification PCR décrits ci-dessus dans un milieu réactionnel de 10 ,ul en présence de 1 ul de tampon T4 DNA ligase x 10 (Amersham) et de 2,5 U d'enzyme T4 DNA ligase (Amersham) à 14"C pendant 16 heures. Les bactéries,
Escherichia coli DH5a rendues préalablement compétentes, ont été transformées (Hanahan, 1983).

L'ADN plasmidique des clones obtenus, sélectionnés sur 50 pg/ml ampicilline, a été extrait selon la méthode de la lyse alcaline (Birnboim et Doly, 1979) et analysé par digestion enzymatique par des enzymes de restriction. L'ADN plasmidique de certains des clones retenus a été vérifié par séquençage à l'aide du kit de séquençage T7 commercialisé par Pharmacia selon la méthode des didésoxynucléotides (Sanger et al., 1977).

Les séquences du PS et de AAT mature ont été clonées en maintenant leurs phases de lecture ouverte. La séquence de clivage entre les séquences PS et AAT mature est Ser-Glu. Le plasmide résultant a été appelé pBIOC33.

B.3. CONSTRUCTION DU PLASMIDE pBIOC34 CONTENANT
PPS-AAT.

Le plasmide pBIOC31 a été digéré doublement par
SacI et BamHI pour supprimer la séquence codant pour le peptide signal naturel de l'al-antitrypsine humaine. Cette séquence a été remplacée par celle codant pour le prépropeptide PPS N-terminal de 37 acides aminés (ATG AAA GCC TTC ACA CTC GCT CTC TTC TTA
GCT CTT TCC CTC TAT CTC CTG CCC AAT CCA GCC CAT TCC
AGG TTC AAT CCC ATC CGC CTC CCC ACC ACA CAC GAA CCC
GCC) fusionnée aux 3 premiers codons de la protéine
AAT mature (Glu-Asp-Pro) . La séquence "PPS - 3 premiers codons de la protéine AAT mature" a été amplifiée par PCR à partir du plasmide pMAT103 (Matuoka et Nakamura, 1991) à l'aide des 2 oligodésoxynucléotides, 5' gcgagctcgaattcaacaATG AAA
GCC TTC ACA CTC GC 3' (contenant les sites EcoRI et
SacI et le signal traductionnel de Kozack) et 5' CT
GGG ATC CTC GGC GGG TTC GTG TGT GGT TG 3' (contenant le site BamHI de la séquence de la protéine AAT mature), en suivant le protocole d'amplification PCR décrit ci-dessus dans le paragraphe a.1. Après double digestion enzymatique par SacI et BamHI, les fragments d'ADN issus de l'amplification PCR ont été purifiés par électrophorèse sur gel d'agarose 2%, électroélués (Sambrook et al., 1989), précipités en présence de 1/10 de volume de 3M acétate de sodium pH4,8 et de 2,5 volumes d'éthanol absolu à -80 C pendant 30 min., centrifugés à 12000g pendant 30 min., lavés à l'éthanol 70%, séchés, puis ligués à l'ADN plasmidique de pBIOC31 doublement digéré par SacI et
BamHI, purifié par électrophorèse sur gel d'agarose 0,8%, électroélué (Sambrook et al., 1989), soumis à la précipitation alcoolique, séché et déphosphorylé par l'enzyme phosphatase alcaline d'intestin de veau (Boehringer Mannheim) selon les recommandations du fabricant. La ligation a été réalisée avec 100 ng du vecteur déphosphorylé décrit ci-dessus et 50 ng de fragments d'ADN digérés issus de l'amplification PCR décrits ci-dessus dans un milieu réactionnel de 10 pl en présence de 1 ul de tampon T4 DNA ligase x 10 (Amersham) et de 2,5 U d'enzyme T4 DNA ligase (Amersham) à 14"C pendant 16 heures. Les bactéries,
Escherichia coli DH5a rendues préalablement compétentes, ont été transformées (Hanahan, 1983).

L'ADN plasmidique des clones obtenus, sélectionnés sur 50 pg/ml ampicilline, a été extrait selon la méthode de la lyse alcaline (Birnboim et Doly, 1979) et analysé par digestion enzymatique par des enzymes de restriction. L'ADN plasmidique de certains des clones retenus a été vérifié par séquençage à l'aide du kit de séquençage T7 TM commercialisé par Pharmacia selon la méthode des didésoxynucléotides (Sanger et al., 1977).

Les séquences du PPS et de AAT mature ont été clonées en maintenant leurs phases de lecture ouverte. La séquence de clivage entre les séquences PPS et AAT mature est Ala-Glu. Le plasmide résultant a été appelé pBIOC34.

B.4. CONSTRUCTION DU PLASMIDE pBIOC35 CONTENANT
PS-AAT-KDEL.

Le plasmide pBIOC32 a été digéré doublement par
SacI et BamHI pour supprimer la séquence codant pour le peptide signal naturel de l'a1-antitrypsine humaine. Cette séquence a été remplacée par celle codant pour le peptide signal PS de 23 acides aminés (ATG AAA GCC TTC ACA CTC GCT CTC TTC TTA GCT CTT TCC
CTC TAT CTC CTG CCC AAT CCA GCC CAT TCC) fusionnée aux 3 premiers codons de la protéine AAT mature (Glu-Asp
Pro). La séquence "PS - 3 premiers codons de la protéine AAT mature" a été amplifiée par PCR à partir du plasmide pMAT103 (Matuoka et Nakamura, 1991) à l'aide des 2 oligodésoxynucléotides, 5' gcgagctcgaattcaacaATG AAA GCC TTC ACA CTC GC 3' (contenant les sites EcoRI et SacI et le signal traductionnel de Kozack) et 5' CT GGG ATC CTC GGA ATG
GGC TGG ATT GGG CAG G 3' (contenant le site BamHI de la séquence de la protéine AAT mature), en suivant le protocole d'amplification PCR décrit ci-dessus dans le paragraphe a.1. Après double digestion enzymatique par
SacI et BamHI, les fragments d'ADN issus de l'amplification PCR ont été purifiés par électrophorèse sur gel d'agarose 2%, électroélués (Sambrook et al., 1989), précipités en présence de 1/10 de volume de 3M acétate de sodium pH4,8 et de 2,5 volumes d'éthanol absolu à -80 C pendant 30 min., centrifugés à 12000g pendant 30 min., lavés à l'éthanol 70%, séchés, puis ligués à l'ADN plasmidique de pBIOC32 doublement digéré par SacI et BamHI, purifié par électrophorèse sur gel d'agarose 0,8%, électroélué (Sambrook et al., 1989), soumis à la précipitation alcoolique, séché et déphosphorylé par l'enzyme phosphatase alcaline d'intestin de veau (Boehringer Mannheim) selon les recommandations du fabricant. La ligation a été réalisée avec 100 ng du vecteur déphosphorylé décrit ci-dessus et 50 ng de fragments d'ADN digérés issus de l'amplification PCR décrits ci-dessus dans un milieu réactionnel de 10 ul en présence de 1 pl de tampon T4 DNA ligase x 10 (Amersham) et de 2,5 U d'enzyme T4 DNA ligase (Amersham) à 14"C pendant 16 heures. Les bactéries,
Escherichia coli DHSa rendues préalablement compétentes, ont été transformées (Hanahan, 1983)
L'ADN plasmidique des clones obtenus, sélectionnés sur 50 ug/ml ampicilline, a été extrait selon la méthode de la lyse alcaline (Birnboim et Doly, 1979) et analysé par digestion enzymatique par des enzymes de restriction. L'ADN plasmidique de certains des clones retenus a été vérifié par séquençage à l'aide du kit de séquençage T7 commercialisé par Pharmacia selon la méthode des didésoxynucléotides (Sanger et al., 1977).

Les séquences du PS et de AAT mature ont été clonées en maintenant leurs phases de lecture ouverte. La séquence de clivage entre les séquences PS et AAT mature est Ser-Glu. Le plasmide résultant a été appelé pBIOC35.

C. CONSTRUCTION DES PLASMIDES UTILISABLES EN
TRANSFORMATION GENETIQUE DU MAIS PAR BIOLISTIQUE
C.1. EXPRESSION CONSTITUTIVE : Construction de pPAR-IAR-PA-AAT, pPAR-IAR-PS-AAT, pPAR-IAR-PS-AAT-KDEL et pPAR-IAR-PPS-AAT.

L'expression constitutive dans le maïs a nécessité, entre autre, les séquences régulatrices suivantes - promoteur actine de riz suivi de l'intron actine de riz (pAR-IAR) contenu dans le plasmide pActl-F4 décrit par McElroy et al. (1991) ; - la séquence terminatrice de transcription, terminateur polyA NOS, qui correspond à la région en 3' non codante du gène de la nopaline synthase du plasmide Ti d' Agrobacterium turne fa ci ens souche à nopaline (Depicker et al., 1982).

Le plasmide pBSII-PAR-IAR-tNOS, dans lequel ont été insérées les séquences codant "PA-AAT", "PS-AAT", "PS-AAT-KDEL" et "PPS-AAT", est décrit par exemple dans la demande de brevet W09633277 qui est incorporée par référence.

Les séquences, codant "PA-AAT", "PS-AAT", "PS
AAT-KDEL" et "PPS-AAT", ont été isolées par digestion enzymatique EcoRI respectivement à partir de pBIOC74, pBIOC33, pBIOC35 et pBIOC34. Les fragments digérés ont été purifiés par électrophorèse sur gel d'agarose à 0,8%, puis soumis à l'électroélution, à la précipitation alcoolique, séchés, repris dans H20. Ils ont été traités par action de l'enzyme Klenow (New
England Biolabs) selon les recommandations du fabricant. Ils ont été insérés dans le plasmide pBSII
PAR-IAR-tNOS digéré doublement par SalI et NcoI, purifié, traité à l'enzyme Mung Bean Nucléase (New
England Biolabs) et déphosphorylé par l'enzyme phosphatase alcaline de veau (Boehringer Mannheim) selon les recommandations des fabricants. La ligation a été réalisée avec 20 ng du vecteur déphosphorylé et 200 ng de fragments d'ADN contenant la séquence codant "PA-AAT", "PS-AAT", "PS-AAT-KDEL" ou "PPS-AAT", décrits ci-dessus, dans un milieu réactionnel de 20 pl en présence de 2 p1 de tampon T4 DNA ligase x 10 (Amersham), de 2 p1 de 50% polyethylène glycol 8000 et de 5 U d'enzyme T4 DNA ligase (Amersham) à 14"C pendant 16 heures. Les bactéries, Escherichia coli
DH5a rendues préalablement compétentes, ont été transformées (Hanahan, 1983). L'ADN plasmidique des clones obtenus, sélectionnés sur 50 pg/ml ampicilline, a été extrait selon la méthode de la lyse alcaline (Birnboim et Doly, 1979) et analysé par digestion enzymatique par des enzymes de restriction. Les plasmides résultants ont été appelés pPAR-IAR-PA-AAT, pPAR- IAR-PS -AAT, pPAR- lAR- PS -AAT -KDEL e t pPAR- IAR-PPS -
AAT.

C.2. EXPRESSION DANS L'ALBUMEN DES SEMENCES DE
MAIS
C.2.1 CONSTRUCTION DE pPgzéine-PA-AAT, pPgzéine-PS-AAT, pPgzéine-PS-AAT-KDEL et pPgzéine-PPS
AAT.

L'expression dans l'albumen des semences de maïs a nécessité, entre autre, les séquences régulatrices suivantes - le promoteur du gène gamma (g) zéine de maïs (Pgzéine) contenu dans le plasmide p63 est décrit dans
Reina et al., 1990. Le plasmide p63 résulte du clonage de Pgzéine, en remplacement du promoteur 35S (P35S), aux sites HindIII et XbaI du plasmide pUC18 renfermant, entre ses sites HindIII et EcoRI, la cassette d'expression "P35S-gus-TNOS" de pBI221 commercialisé par Clontech. Il permet une expression dans l'albumen des semences de maïs.

- la séquence terminatrice de transcription, terminateur polyA NOS, qui correspond à la région en 3' non codante du gène de la nopaline synthase du plasmide Ti d' Agrobacterium tumefaciens souche à nopaline (Depicker et al., 1982).

Les plasmides pPgzéine-PA-AAT, pPgzéine-PS-AAT, pPgzéine-PS-AAT-KDEL et pPgzéine-PPS-AAT où les séquences codant "PA-AAT", "PS-AAT", "PS-AAT-KDEL" ou "PPS-AAT" ont été placées sous contrôle du Pgzéine, ont été obtenus par clonage aux sites, SacI et BamHI, traités par l'enzyme T4 DNA polymérase (New England
Biolabs), puis déphosphorylés par l'enzyme phosphatase alcaline de veau (Boehringer Mannheim) du plasmide p63, des fragments EcoRI traité à la Klenow (New
England Biolabs) isolé à partir de pBIOC74, pBIOC33, pBIOC35 et pBIOC34. La ligation a été réalisée comme décrite dans l'exemple C1. Les bactéries, Escherichia coli DH5a rendues préalablement compétentes, ont été transformées (Hanahan, 1983). L'ADN plasmidique des clones obtenus, sélectionnés sur 50 pg/ml ampicilline, a été extrait selon la méthode de la lyse alcaline et analysé par digestion enzymatique par des enzymes de restriction. Les clones résultants ont été appelés pPgzéine-PA-AAT, pPgzéine-PS-AAT, pPgzéine-PS-AAT-KDEL et pPgzéine-PPS-AAT.

D. CONSTRUCTION DES PLASMIDES UTILISABLES EN
TRANSFORMATION GENETIQUE DU MAIS PAR Agrobacterium tume fa ci ens
Les plasmides pSB-PA-AAT, pSB-PS-AAT, pSB-PS-AAT-KDEL, pSB-PPS-AAT, qui portent une réplication de pBR322 et un gène de résistance à la spectinomycine, ont été obtenus par insertion d'un plasmide binaire possédant des régions ori et cos, construit selon les méthodes décrites dans les brevets WO 9400977 et WO 9506722 entre les bordures droite et gauche du T-DNA des cassettes d'expression "promoteur actine de riz-intron actine de riz-gène bar-terminateur NOS" et respectivement PA-AAT sous contrôle de PAR-IAR ou
Pgzéine, PS-AAT sous contrôle de PAR-IAR ou Pgzéine,
PS-AAT-KDEL sous contrôle de PAR PAR ou Pgzéine et
PPS-AAT sous contrôle de PAR-IAR ou Pgzéine.

Les plasmides obtenus ont été introduits dans
Agrobacterium tumefaciens souche LBA4404 (pSB1) décrite par Ishida et al. (Nature Biotechnology, 1996, 14 : 745-750) . Les bactéries résultantes contiennent les cointégrats de pSB1 et respectivement de pSB-PA
AAT, pSB-PS-AAT, pSB-PS-AAT-KDEL, pSB-PPS-AAT.

Il. OBTENTION DE PLANTES DE MAIS TRANSGENIQUES.

A. Obtention et utilisation de cal de maïs comme cible pour la transformation génétique.

La transformation génétique du maïs, quelle que soit la méthode employée (électroporation; Agrobacterium, microfibres, canon à particules), requiert généralement l'utilisation de cellules indifférenciées en divisions rapides ayant conservé une aptitude à la régénération de plantes entières. Ce type de cellules compose le cal friable embryogène (dit de type II) de mais.

Ces cals sont obtenus à partir d'embryons immatures de génotype Hl II ou (A188 x B73) selon la méthode et sur les milieux décrits par Armstrong (1994). Les cals ainsi obtenus sont multipliés et maintenus par repiquages successifs tous les quinze jours sur le milieu d'initiation.

Des plantules sont ensuite régénérées à partir de ces cals en modifiant l'équilibre hormonal et osmotique des cellules selon la méthode décrite par Vain et al.

(1989). Ces plantes sont ensuite acclimatées en serre où elles peuvent être croisées ou autofécondées.

B. Utilisation du canon à particules pour la transformation génétique du maïs.

Le paragraphe précédent décrit l'obtention et la régénération des lignées cellulaires nécessaires à la transformation ; on décrit ici une méthode de transformation génétique conduisant à l'intégration stable des gènes modifiés dans le génome de la plante.

Cette méthode repose sur l'utilisation d'un canon à particules ; les cellules cibles sont des fragments de cals décrits dans le paragraphe 1. Ces fragments d'une surface de 10 à 20 mm2 ont été disposés, 4 h avant bombardement, à raison de 16 fragments par boite au centre d'un boite de petri contenant un milieu de culture identique au milieu d'initiation, additionné de 0,2 M de mannitol + 0,2 M de sorbitol. Les plasmides portant les gènes à introduire sont purifiés sur colonne Qiagen,, en suivant les instructions du fabricant. Ils sont ensuite précipités sur des particules de tungsten (M10) en suivant le protocole décrit par Klein (1987). Les particules ainsi enrobées sont projetées vers les cellules cibles à l'aide du canon et selon le protocole décrit par J. Finer (1992).

Les boites de cals ainsi bombardées sont ensuite scellées à l'aide de ScellofraisB, puis cultivées à l'obscurité à 27"C. Le premier repiquage a lieu 24 h après, puis tous les quinze jours pendant 3 mois sur milieu identique au milieu d'initiation additionné d'un agent sélectif. Les agents sélectifs utilisables consistent généralement en composés actifs de certains herbicides (basta, Round upO,) ou certains antibiotiques (Hygromycine, Kanamycine...).

On obtient après 3 mois ou parfois plus tôt, des cals dont la croissance n'est pas inhibée par l'agent de sélection, habituellement et majoritairement composés de cellules résultant de la division d'une cellule ayant intégré dans son patrimoine génétique une ou plusieurs copies du gène de sélection. La fréquence d'obtention de tels cals est d'environ 0,8 cal par boite bombardée.

Ces cals sont identifiés, individualisés, amplifiés puis cultivés de façon à régénérer des plantules. Afin d'éviter toute interférence avec des cellules non transformées toutes ces opérations sont menées sur des milieux de culture contenant l'agent sélectif.

Les plantes ainsi régénérées sont acclimatées puis cultivées en serre où elles peuvent être croisées ou autofécondées.

C. Utilisation d'Agrobacterium tumefaciens pour la transformation génétique du maïs.

La technique utilisée est décrite par Ishida et al. (Nature Biotechnology, 1996, 14 : 745-750).

III. : ANALYSE DE L'EXPRESSION DE L'al-ANTITRYPSINE
HUMAINE DANS LES GRAINES DE MAIS
Le protocole d'extraction de l' < x1-antitrypsine pour la réalisation des tests ELISA et des Western blot, à partir de graines de maïs est le suivant : 100 mg de graines sont broyées dans l'azote liquide puis dans 1 ml de tampon Tris-HCl 100mM pH 8 additionné d'EDTA lmM, de dithiotréitol lmM et de NaC1 250 mM. Le broyat est conservé à 40C pour macération pendant 2 heures, puis centrifugé à 4"C pendant 10 min à 10000g.

Sur le surnageant de centrifugation, un dosage des protéines solubles est réalisé par la méthode de
Bradford (1976).

Immunodétection par Western blot
Les protéines extraites selon le protocole cidessus sont dénaturées par chauffage à 95"C pendant 5 min en présence de tampon Tris-HCl 50 mM pu6,8, SDS 4%, ss-mercaptoéthanol 1%, saccharose 20% et bleu de bromophénol 0,01%. Les protéines sont ensuite séparées par électrophorèse sur gel de polyacrylamide en conditions dénaturantes selon la technique de Laemmli (1970) à raison de 30 g de protéines solubles par échantillon. Après migration, les protéines sont transférées sur une membrane de nitrocellulose. Un anticorps polyclonal anti-a1-antitrypsine obtenu chez le lapin (Dako) est utilisé comme sonde et la révélation est effectuée au moyen d'un anticorps antiimmunoglobulines de lapin marqué à la phosphatase alcaline (Sigma).

Purification partielle de 11a1-antitrypsine à partir de graines de maïs
L'extrait protéique est passé sur colonne d'héparine BIORAD, colonne échangeuse d'anions Mono Q, et une colonne gel filtration Superdex 75.

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Claims (37)

REVENDICATIONS

1 - Procédé de production d'a1-antitrypsine (al

AT), ou de variantes de celle-ci caractérisé par i) l'introduction dans des cellules végétales monocotylédones, d'un acide nucléique comportant une séquence codant pour l'al-antitrypsine (al-AT) ou pour une variante de celle-ci, les variantes se différenciant de l'a1-AT humaine naturelle par une ou plusieurs substitution(s), délétion(s) ou insertion(s) d'acides aminés, et éventuellement une séquence codant pour un agent sélectif ii) sélection des cellules ayant intégré de manière stable l'acide nucléique ; iii) propagation des cellules transformées en culture, ou régénération de plantes entières chimériques ou transgéniques ; iv) récupération et éventuellement purification de l'a1-antitrypsine ou de ses variantes, ainsi produites.

2 - Procédé selon la revendication 1 caractérisé en ce que l'al-antitrypsine ou ses variantes présentent une activité d'inhibition de protéases à sérine, de préférence une activité de l'al-AT humaine.

3 - Procédé selon la revendication 2 caractérisé en ce que l'acide nucléique introduit dans les cellules végétales code pour la protéine illustrée dans la figure 1, ou pour une protéine présentant au moins 90% d'homologie avec celle-ci, ou encore un fragment de l'une de ces protéines ayant une longueur comprise entre 200 et 393 acides aminés.

4 - Procédé selon la revendication 3 caractérisé en ce que l'acide nucléique comporte en outre une séquence codant pour un peptide signal ou "prépeptide", et éventuellement une séquence codant pour un signal de rétention endoplasmique ou pour un signal d'adressage vacuolaire.

5 - Procédé selon l'une quelconque des revendications 3 ou 4 caractérisé en ce que l'acide nucléique comporte en outre des séquences régulatrices de transcription reconnues par une cellule végétale monocotylédone.

6 - Protéine présentant une activité d'inhibiteur de protéase à sérine, de préférence une activité de l'al-antitrypsine humaine, caractérisée en ce qu'elle est susceptible d'être produite par le procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 5.

7 - Protéine selon la revendication 6 caractérisée en ce qu'elle est N-glycosylée par au moins un glycanne de type mannosidique ou polymannosidique, et/ou par au moins un glycanne de type complexe comportant éventuellement au sein de sa structure un ou plusieurs résidus de xylose et éventuellement un ou plusieurs résidus de fucose.

8 - Protéine selon la revendication 7 comportant la séquence en acides aminés illustrée dans la figure 1, ou une séquence présentant au moins 90% d'homologie avec cette séquence, ou encore un fragment de l'une de ces séquences ayant une longueur comprise entre 200 et 393 acides aminés.

9 - Protéine selon la revendication 8 caractérisée en ce que le glycanne est lié Nglycosidiquement à Asn-46, Asn-83 ou Asn-247.

10 - Protéine selon l'une quelconque des revendications précédentes caractérisée en ce qu'elle porte à la fois un ou plusieurs glycannes de type polymannosique et un ou plusieurs glycannes de type complexe.

11 - Protéine selon l'une quelconque des revendications précédentes caractérisée en ce que le glycanne polymannosique présente la structure GlcNAc2 Man59, par exemple GlcNAc2-Mang.

12 - Protéine selon l'une quelconque des revendications précédentes caractérisée en ce que le glycanne complexe présente la structure GlcNAc2 (Fuc)

Man3 (Xyl).

13 - Protéine selon l'une des revendications 6 à 12 caractérisée en ce que la séquence en acides aminés comporte en outre un peptide signal N-terminal, permettant une sécrétion de la protéine et éventuellement un signal responsable de la rétention de la protéine dans le réticulum endoplasmique, ou un signal reconnu par une cellule végétale comme étant un signal d'adressage vacuolaire.

14 - Protéine selon la revendication 13 caractérisée en ce que le peptide signal est le prépeptide de la sporamine, de la lectine d'orge, de l'extensine végétale, de l'a-mating factor, des protéines de pathogénèse.

15 - Protéine selon la revendication 13 caractérisée en ce que le peptide signal est celui de 1 'a1-antitrypsine native.

16 - Protéine selon la revendication 13 caractérisée en ce que le signal responsable de la rétention de la protéine dans le réticulum endoplasmique est choisi parmi les peptides KDEL,

SEKDEL et HDEL.

17 - Protéine selon la revendication 13 caractérisée en ce que le signal d'adressage vacuolaire est d'origine végétale, tel que celui de la sporamine, ou celui de la lectine d'orge.

18 - Protéine selon la revendication 6 caractérisée en ce qu'elle est exempte de chaînes Nglycosidiques.

19 - Acide nucléique comportant : i) une séquence codant pour l'al-AT ou pour une variante de celle-ci, et ii) une séquence d'adressage choisie parmi une séquence codant pour un peptide signal "pré" d'origine végétale et éventuellement une séquence codant pour un signal de rétention ou pour un signal d'adressage vacuolaire, et iii) des séquences régulatrices de transcription reconnues par une cellule végétale monocotylédone.

20 - Acide nucléique selon la revendication 19 caractérisé en ce que les séquences régulatrices comprennent un ou plusieurs promoteur(s) d'origine végétale ou virale.

21 - Acide nucléique selon l'une quelconque des revendications 19 et 20 caractérisé en ce que la séquence codant pour 1'a1-AT est un ADNc codant pour l'a1-AT mature.

22 - Vecteur comprenant un acide nucléique selon l'une quelconque des revendications 19 à 21.

23 - Cellules végétales monocotylédones transformées de manière stable par un acide nucléique selon l'une quelconque des revendications 19 à 21, et capable de produire une ou plusieurs protéine(s) ayant une activité d'inhibiteur de protéase à sérine, de préférence une activité d'a1-antitrypsine.

24 - Cellules végétales monocotylédones selon la revendication 23 caractérisées en ce qu'il s'agit d'une culture de cellules végétales, par exemple en milieu liquide ou immobilisées, ou une culture de racines.

25 - Cellules végétales selon la revendication 24 caractérisées en ce qu'il s'agit de cellules faisant partie d'une plante monocotylédone transformée.

26 - Plante monocotylédone chimérique ou transgénique capable de produire une protéine ayant une activité d'inhibiteur de protéase à sérine, de préférence une activité d'al-antitrypsine, caractérisée en ce qu'elle comporte des cellules selon la revendication 23.

27 - Graines de plante transgénique selon la revendication 26.

28 - Anticorps monoclonaux ou polyclonaux capable de reconnaître spécifiquement la protéine selon les revendications 6.à 18.

29 - Produit pharmaceutique comprenant une ou plusieurs protéine(s) selon l'une quelconque des revendications 6 à 18 en association avec un excipient acceptable du point de vue physiologique.

30 - Protéine ayant une activité d'al-AT selon les revendications 6 à 18 pour l'utilisation comme médicament.

31 - Protéine selon la revendication 30 pour une utilisation en thérapie de conditions liées à une déficience en a1-AT, notamment l'emphysème pulmonaire, la mucoviscidose, le choc septique, ou comme antirhumatoïde.

32 - Utilisation d'une protéine selon l'une quelconque des revendications 6 à 18 pour la préparation d'un médicament pour le traitement de conditions liées à une déficience en al-AT.

33 - Utilisation d'une protéine selon l'une quelconque des revendications 6 à 18 dans la préparation de produits cosmétiques, ou de réactifs chimiques.

34 - Extrait de plante contenant 1 à 90% environ d'une protéine selon l'une quelconque des revendications 6 à 18, et notamment l'al-antitrypsine.

35 - Extrait de plante selon la revendication 34 pour l'utilisation comme médicament.

36- Extrait de plante selon la revendication 35 pour une utilisation en thérapie de conditions liées à une déficience en al-AT, notamment l'emphysème pulmonaire, la mucoviscidose, le choc septique ou comme anti-rhumatoïde.

37- Composition pharmaceutique comprenant un extrait de plante selon la revendication 34 en association avec un excipient acceptable du point de vue physiologique, de préférence pour l'administration par voie orale ou nasale, par exemple sous forme d'aérosol.