EP1051503A1 - Procede de production, par des cellules vegetales, d' alpha 1-antitrypsine et de ses variantes, et produits contenant l' alpha1-antitrypsine ainsi ob - Google Patents

Procede de production, par des cellules vegetales, d' alpha 1-antitrypsine et de ses variantes, et produits contenant l' alpha1-antitrypsine ainsi ob

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Publication number
EP1051503A1
EP1051503A1 EP99901670A EP99901670A EP1051503A1 EP 1051503 A1 EP1051503 A1 EP 1051503A1 EP 99901670 A EP99901670 A EP 99901670A EP 99901670 A EP99901670 A EP 99901670A EP 1051503 A1 EP1051503 A1 EP 1051503A1
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
protein
antitrypsin
plant
nucleic acid
sequence
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Withdrawn
Application number
EP99901670A
Other languages
German (de)
English (en)
Inventor
Véronique Gruber
Béatrice OLAGNIER
Philippe Bournat
Manfred Theisen
Bertrand Merot
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Meristem Therapeutics SA
Original Assignee
Meristem Therapeutics SA
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Meristem Therapeutics SA filed Critical Meristem Therapeutics SA
Publication of EP1051503A1 publication Critical patent/EP1051503A1/fr
Withdrawn legal-status Critical Current

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Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
    • C12N15/8242—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits
    • C12N15/8257—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits for the production of primary gene products, e.g. pharmaceutical products, interferon
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/81—Protease inhibitors
    • C07K14/8107—Endopeptidase (E.C. 3.4.21-99) inhibitors
    • C07K14/811—Serine protease (E.C. 3.4.21) inhibitors
    • C07K14/8121—Serpins
    • C07K14/8125—Alpha-1-antitrypsin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
    • C07K2319/02—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a signal sequence

Definitions

  • the invention relates to a process for the production, by monocotyledonous plant cells, of Quantitrypsin and its analogs, and the proteins thus obtained.
  • the invention also relates to the genetically transformed monocot cells and plants capable of producing analogs of axantitrypsin, and the nucleic acid constructs involved in the transformation.
  • the invention relates to pharmaceutical products containing 1 ⁇ -antitrypsin and its variants, thus obtained.
  • Alpha-1-antitrypsin, and] . -AT also known by the designations of alpha-1-protease inhibitor (cii-PI), antitrypsin and metserpine, is a plasma protein present in plasma at a concentration of the order of 1.3 grams per liter. Synthesized by the liver, it is a glycoprotein from 51kDa to 54kDa, consisting of a single polypeptide chain of 394 amino acids (Long et al., Biochemistry, 1984, vol. 23, pages 4828-4837).
  • Gal-Sia The carbohydrate part represents 13% of the total mass of the glycoprotein. Due to a polymorphism occurring at 3 positions in the protein, there are 3 forms of o ⁇ -AT:
  • ⁇ x -AT is a serine protease inhibitor. Its main biological function is to inhibit neutrophil elastase and thus protect the lung tissue against proteolytic attacks.
  • the Z and S mutants although capable of functioning as anti-elastase agents, are produced in small quantities leading to deficiency, and especially in the case of the "Z" variant, with the development of severe pulmonary emphysema.
  • O ⁇ -AT glycosylee has been expressed in the blood and milk of transgenic animals, including rabbits, mice and sheep.
  • the protein In the blood of transgenic animals, the protein was present at a concentration of approximately 1 mg / ml of plasma. It retains its anti-elastase activity (Massoud et al., C. R. Acad. Sci. Paris, 1990, volume 311, series III, pages 275-280).
  • the technical problem which the present invention proposes to solve is to produce recombinant 0. 3. -AT in large quantities at low costs, without the risk of viral or sub-viral contamination, for example by prions.
  • the protein exhibits satisfactory o-AT activity, and must be stable and immunologically suitable for the form of administration chosen.
  • the present inventors have solved this technical problem by using, as host for the genetic transformation, plant cells, and more particularly monocotyledonous plant cells.
  • N-glycans of vegetable glycoproteins differ mainly from mammalian glycans by the absence of sialic acid, also known as N-acetylneuraminic acid, and by the presence of a residue of ⁇ -1, 2 xylose and of a fucose residue linked in ⁇ -1,3 to the GlcNAc residue proximal to the "core" (Driouich et al., Regard sur la biochemie, 1993, vol.
  • Glycosylation plays an important role in the establishment of the spatial structure of the protein, in the solubility of the molecule, in protection against proteolytic attacks and in the mechanisms of immune recognition.
  • the glycan also controls the half-life of the protein and can itself, in certain cases, carry the biological function.
  • glycosylation we normally try, for the production of therapeutic proteins, to reproduce as faithfully as possible the natural glycosylation of the protein. This is not possible in plant cells, due to the presence of xylose, absent in animals, and the absence of sialic acid in plants. Although having many economic advantages, differences in the glycosylation of the protein can therefore make the success of using plant cells for the production of therapeutic proteins unpredictable.
  • the present inventors have succeeded in producing in transgenic monocotyledonous plants, at high levels of expression, proteins having o-AT activity. Proteins have acceptable stability. Surprisingly, the inventors have also found that, under certain conditions, the proteolytic maturation of the glycoprotein is a function of cell addressing, allowing the production of a series of protein "variants", of different molecular weight, all exhibiting ⁇ -AT activity.
  • the invention therefore relates to a process for the production of ocx-antitrypsin, or variants thereof, characterized by: i) the introduction, into plant cells originating from a monocotyledonous species, of a nucleic acid comprising a sequence encoding the anti- antitrypsin or a variant thereof, the variants differentiating from the natural human c ⁇ c-AT by one or more substitution (s), deletion (s) or insertion (s) of amino acids , and optionally a sequence coding for a selective agent; ii) selection of cells which have stably integrated the nucleic acid; iii) propagation of cells transformed into culture, or regeneration of chimeric or transgenic whole plants; iv) recovery and optionally purification of o ⁇ -antitrypsin or its variants, thus produced.
  • the invention also relates to a protein capable of being produced by the above-mentioned process, and having a serine protease activity, preferably an o-AT activity, characterized in that: either it is free of N-glycosidic chains;
  • variants of ⁇ ⁇ -AT means a protein which differs from natural human c ⁇ -AT (mature or pre-protein) by one or more substitution (s), deletion (s) or insertion ( s) amino acids.
  • the variants have at least 90% and preferably at least 95% of homology or identity with the amino acid sequence described by Long et al. (Biochemistry, 1984, vol. 23, pages 4828-4837), illustrated in FIG. 1, the percentage of homology between two proteins being defined as indicated below.
  • the term "variant” is used, in the context of the invention, synonymous with the term "analog”.
  • the variants also exhibit serine protease inhibitor activity. It has been found that certain modifications in the amino acid sequence of o ⁇ -AT can confer on the protein a serine protease inhibitor activity other than that normally associated with o ⁇ -AT, by example an activity characteristic of antithrombin III
  • variants of o ⁇ -AT of the invention exhibit an identical or different glycosylation of the natural human ⁇ x -AT.
  • variant also encompasses fragments of o ⁇ -AT and its analogs which exhibit serine protease inhibitor activity, preferably ⁇ ⁇ -AT activity.
  • Serine protease inhibitor activity means the ability to partially or totally inhibit any protease having a serine residue within its active site, for example trypsin, elastin, cathepsin G, thrombin, collagenase, chymotrypsin and plasmin.
  • an activity of 0. 3. -AT means an anti-elastase activity, determined according to the technique of Travis and Johnson, Meth. in Enzymol. , 1981, vol. 80, pages 754-765. This technique is detailed in the examples. Activity can also be determined based on the protein's ability to inhibit trypsin (see Travis and Johnson, supra).
  • the recombinant protein has an inhibition activity of at least 30% and preferably at least 75%, for example 85% of that of natural human ai-AT with equal molarity.
  • a third technique consists in determining the capacity of the recombinant protein to hydrolyze the substrate Methoxy-L-Alanyl-L-Prolyl-L-Valine-P-nitroanilide (Massoud et al., Supra).
  • the ability of the protein to inhibit the activity of each of the serine proteases mentioned above can also be used as an index of the activity of the proteins of the invention (The Plasma Proteins ", Second Edition, Ed. Pulnam, Académie Press, 1975, p.241-242).
  • “Monocotyledonous” means a phanerogamous angiosperm plant whose stem and root are (almost always) devoid of cambiums and therefore of secondary formations; the leaf is almost always provided with parallel veins; the seed contains an embryo with a single cotyledon.
  • the percentage of homology between two amino acid sequences is calculated as the number of identical amino acids plus the number of similar amino acids in the alignment of the two sequences, divided by the length of the sequences between two given positions . If, between the two given positions, the two sequences do not have the same length, the percentage of homology is the number of identical and similar amino acids, divided by the length of the longest sequence.
  • Acids amines considered to be "similar" are known in the art, see for example RF Feng, MS Jobson and RF Doolittle; J. Mol. Evol. ; 1985; flight. 21; pages 112-115. They are normally considered to be those who, within a permutation matrix, have a positive substitution coefficient.
  • the recombinant protein with ⁇ x -AT activity is non-glycosylated.
  • This type of protein can be obtained in a plant cell using the nucleic acid sequence coding for the mature polypeptide, that is to say without the N-terminal signal peptide of 24 amino acids (see for example Figure 1) . No other signal is added.
  • the polypeptide thus produced accumulates in the cytoplasm of the cell. It will normally have a molecular weight about 10kD lower than that of natural human ⁇ x -AT, that is to say around
  • the protein of the invention is glycosylated at at least one of the 3 natural glycosylation sites: Asn-46, Asn-83 or Asn-247.
  • Glycosylation is of mannosidic, polymannosidic or complex type, or a mixture of both.
  • the expression "entirely glycosylated” means, in the context of the invention, that the molecule in question is glycosylated at the 3 natural glycosylation sites.
  • the mannosidic glycan (s) have the GlcNAc2-Manl structure.
  • the polymannosidic glycan (s) have the structure GlcNAc 2 -Man 2 - 9 , for example GlcNAc 2 -Man 9 , GlcNAc 2 -Man 8 , GlcNAc 2 -Man 6 or GlcNAc 2 -Man 5 , or GlcNAc 2 -Man 3 .
  • the complex type glycan (s) are biantennary and have a basic structure GlcNAc 2 -Man 3 with which are possibly associated residues of xylose (Xyl), fucose (Fuc) and possibly galactose (Gay) or N-acetylglucosamine (GlcNAc). They are normally free of sialic acid residues, this compound having not hitherto been detected in plant cells.
  • the complex glycan is of the type
  • PHA phytohemagglutinin
  • GlcNAc 2 Man 3 in which the mannose linked in ⁇ carries a residue of ⁇ 1,2-xylose and in which the proximal GlcNAc carries a residue of ⁇ 1,3 fucose ( GlcNAc 2 (Fuc) Man 3 (Xyl)).
  • GlcNAc 2 (Fuc) Man 3 (Xyl) This kind of structure is frequent for glycoproteins of vacuolar or extracellular localization.
  • the 1,3-linked ⁇ -fucose residue may possibly be absent.
  • the complex glycan can also be of the "Laccase” type (Driouich et al, Regard sur la Biochimie, 1993, n ° 3, pp33-42) composed of a basic structure GlcNAc 2 (Fuc) Man 3 (Xyl) associated with two side chains.
  • Each side chain consists of a residue of ⁇ 1.2 GlcNAc to which is linked a residue of ⁇ 1.6 fucose and a residue of ⁇ 1.4 galactose.
  • the glycoprotein of the invention can be glycosylated at the three natural sites (Asn-46, Asn-83 and Asn-247) or only at one or two of them.
  • glycoproteins carrying exclusively glycans of the complex type for example two or three glycans of the PHA type: GlcNAc 2 (Fuc) Man 3 (Xyl).
  • the carbohydrate part normally represents between 2 and 30%, for example 5 to 20% of the total mass of the glycoprotein of the invention.
  • the protein part of the glycoprotein corresponds to the protein part of any protein or protein fragment exhibiting ⁇ i-AT activity. It is normally the mature polypeptide of human ⁇ i-AT, but can also be that of animals such as the rabbit or the monkey.
  • the complete amino acid sequence of human ⁇ ⁇ AT including the N-terminal signal peptide (Type "MI"), is described by Long et al. (Biochemistry, 1984, vol. 23, pages 4828-4837).
  • Ml type there are also the M2 or M3 types (Val 213 - Asp 376 - Arg 101; Val 213 - Asp 376 - His 101, respectively), or a variant of Ml, M2 or M3 in which Val 213 is replaced by Ala.
  • the proteins of the invention can comprise the amino acid sequences of the Ml, M2 or M3 types.
  • the amino acid sequence can also be that of the Z or S variants, associated with certain pulmonary disorders. These variants are distinguished from the type M1 described by Long et al by Glu-342 - »Lys (variant Z) and Glu-264 -» Val (variant S).
  • the protein of the invention can comprise any amino acid sequence differentiating from the natural sequence by one or more substitution (s), deletion (s) or insertion (s) of amino acids. Normally, these variants have homology, or identity, of at least 90%, for example 95%, with the sequence described by Long et al. (Biochemistry, 1984, vol. 23, pages 4828-4837 Figure 1).
  • Asp 2 and Asp 6 can be replaced by Asn.
  • Variants of the protein of the invention may also include fragments of the sequence described by Long et al. (Biochemistry, 1984, vol. 23, pages 4828-4837) and its analogs defined above, provided that the activity of serine protease inhibitor, and in particular that of ⁇ -AT, is preserved. These fragments consist of approximately 200 to 393 consecutive amino acids of the ⁇ i.AT sequence, preferably between 250 and 390 amino acids.
  • the C-terminus can also be truncated by about 1 to 20 amino acids. Since the active site of the protein is located around amino acids Met-358 to Glu-363, it is important not to carry out too long a C terminal deletion in order not to affect the active site.
  • the protein of the invention can include various peptide signals responsible for addressing the protein to the various cellular compartments where the co- and post-translational. These signals are the N-terminal signal peptide, also known as prepeptide, the KDEL type signal responsible for the retention of the protein in the endoplasmic reticulum and the vacuolar addressing signal, or propeptide.
  • the addressing of proteins is based on the same principle as in animal cells. From chromosomal DNA, the gene is transcribed into messenger RNA, then translated into protein at the ribosome level. If the nascent protein has an N-terminal signal peptide or prepeptide, it enters the reticulum endoplasmic where a number of post-translational maturations take place, in particular the cleavage of the signal peptide, the N-glycosylations leading to polymannosidic glycans, and the formation of disulfide bridges.
  • KDEL HEKDEL
  • SEKDEL SEKDEL
  • the protein In the absence of a KDEL-type retention signal, the protein is transported to the Golgi apparatus and undergoes, during this transport, a first modification of its glycan chains (suppression of terminal glucoses).
  • the maturation of the glycans continues by the removal of the residues and the addition of xylose and fucose residues to form the complex glycans.
  • the protein In the absence of a vacuolar or "propeptide" addressing signal, the protein is then secreted and accumulates in the intercellular space.
  • the proprotein When the protein has a propeptide at the N-terminal or C-terminal end, the proprotein is directed to the vacuole. At the entrance to the vacuole, the propeptide is cleaved and certain final maturation of glycans are carried out.
  • the prepeptide responsible for addressing the protein in the endoplasmic reticulum, is always present. It is normally a hydrophobic N-terminal signal peptide having between 10 and 40 amino acids. It is normally of animal or vegetable origin. It may indeed be the prepeptide naturally associated with human ⁇ i-AT (PA), or a prepeptide from another human protein,. for example that of human serum albumin. For example, it is a prepeptide of plant origin, for example that of sporamine (PS), barley lectin, plant extensin (pEXT), ⁇ -mating factor, plant proteins involved in defense against microorganisms (PRla and PRS, "pathogenesis related proteins").
  • PA ⁇ i-AT
  • pEXT plant extensin
  • PRla and PRS ⁇ -mating factor
  • the signal peptide is cleaved by a signal peptidase upon the co-translational introduction of the nascent polypeptide into the lumen of the endoplasmic reticulum (RER).
  • RER endoplasmic reticulum
  • the protein of the invention may, in addition to the prepeptide, also include an endoplasmic retention signal, consisting of the peptides KDEL, SEKDEL or HDEL. These signals are normally found at the C-terminus of the protein and remain on the mature protein. The presence of this signal on the proteins of the invention is advantageous for several reasons: on the one hand, the retention of the protein in the endoplasmic reticulum tends to increase the yields of recombinant proteins. On the other hand, the maturation of polymannosic glycosylation into complex glycans will not take place; the protein therefore retains polymannosic glycosylation, minimizing the risk of undesirable immunological reactions when the protein is administered to humans as a medicine.
  • an endoplasmic retention signal consisting of the peptides KDEL, SEKDEL or HDEL.
  • the glycoprotein therefore comprises the amino acid sequence of ⁇ ⁇ AT, a signal of the KDEL type, at least one glycan of the polymannosic type, and is free of glycans of the complex type.
  • this type of protein can also be obtained using plant mutants unable to manufacture N-acetyl glucosaminyl transferase (von Schaewen et al., Plant Physiol. 1993 102: 1109-1118), and therefore unable to produce complex glycans.
  • the protein of the invention may, in addition to the prepeptide, also include a vacuolar addressing signal or "propeptide".
  • a vacuolar addressing signal or "propeptide”.
  • the protein is addressed to the vacuoles of the aqueous tissues, for example the leaves, as well as to the protein bodies of the reserve tissues, for example the seeds, tubers and roots.
  • the targeting of the protein to the protein bodies of the seed is particularly interesting because of the capacity of the seed to accumulate proteins, up to 40% of the proteins relative to the dry matter, in cellular organelles derived from vacuoles. , called protein bodies and because of the possibility of storing for several years the seeds containing the recombinant proteins in the dehydrated state.
  • propeptide a signal of animal or vegetable origin can be used, plant signals being preferred, for example pro-sporamine, or barley lectin.
  • the propeptide can be N-terminal ("N-terminal targeting peptide" or NTTP), or C terminal (CTTP) or can consist of a sequence internal to the protein. Since the propeptide is normally cleaved upon entry of the protein into the vacuole, it is not present in the mature protein.
  • NTTP N-terminal targeting peptide
  • C terminal C terminal
  • PPS sweet potato sporamine
  • the protein of the invention can be in the form of a fusion protein, in particular with a vegetable protein.
  • the vegetable protein can be chosen in order to increase the yield or to facilitate secretion and purification.
  • the fusion protein can also be chosen in order to allow targeting of the ⁇ i-AT or to facilitate its transport.
  • the main objective of the invention being to produce the recombinant ⁇ x- T in monocotyledonous plant cells
  • the invention also relates to the nucleic acids coding for the proteins, and for the addressing signals, possibly in association with sequences adequate regulators, allowing the expression of ⁇ i-AT in the plant cell.
  • AT can be cDNA or genomic DNA with its introns. Normally, this is cDNA, an appropriate sequence is illustrated in Figure 1 (Long et al, Biochemistry, 1984, vol. 23, pages 4828-4837). Any degenerate sequence can be used.
  • introns preferably originating from a plant gene, can be introduced artificially in order to increase the efficiency of expression of the heterologous sequence.
  • the intron (s) used in this way preferably originate from a monocotyledon such as corn. It is preferably, but not necessarily, the first intron of the gene.
  • the invention also relates to chimeric genes comprising on the one hand a sequence coding for a protein having an ⁇ i-antitrypsin activity and on the other hand, transcription regulatory sequences recognized by a monocotyledonous plant cell.
  • the regulatory sequences include one or more promoters of plant origin, more particularly of monocotyledonous, or viral or from Agrobacterium tumefaciens origin. It can be a constitutive promoter, for example the rice actin promoter, or promoters specific for certain tissues such as grain, or specific for certain phases of development of the monocotyledonous plant.
  • the termination regulatory sequences are of plant or viral origin or from Acrrobacterium tumefaciens, and are functional in monocotyledonous plant cells.
  • the chimeric gene of the invention further comprises a sequence coding for a signal peptide allowing the secretion of the protein, and optionally a sequence coding for an endoplasmic retention signal or for a vacuolar addressing signal.
  • Specific seed promoters are particularly advantageous in combination with a vacuolar addressing signal (prepropeptide).
  • the chimeric gene also includes these introns.
  • the invention also relates to plasmids or vectors characterized in that they contain at least one of the nucleic acid sequences, of preferably a chimeric gene, according to the invention.
  • the plasmids and vectors allow the stable transformation of the plant, for example the Ti plasmids of Agrobacterium, viral vectors such as the Geminiviruses.
  • All known means for introducing foreign DNA into plant cells can be used, for example Agrobacterium, electroporation, transformation of protoplasts, bombardment with a particle gun, or penetration of DNA into cells such as pollen, microspore, seed and immature embryo, embryogenic and non-embryogenic cell suspensions, immature inflorescence and viral vectors such as Geminiviruses.
  • the sequence of the invention is introduced into an appropriate vector with all the necessary regulatory sequences such as promoters, terminators, etc. as well as any sequence necessary for selecting the transformants.
  • the transforming nucleic acid comprises, on each end, a sequence homologous to the sequences which adjoin the desired site of insertion into the genome.
  • the invention also relates to monocotyledonous plant cells transformed with the sequences of the invention, and capable of producing one or more protein (s) having a serine protease inhibitor activity and, in particular,
  • the "fed batch” culture corresponds to a "batch” culture with a programmed substrate feed.
  • the cells are continuously supplied with nutritive medium.
  • An equal volume of the biomass-medium mixture is removed in order to keep the volume of the reactor constant.
  • the quantities of plant biomass that can be envisaged with cultures in bioreactors vary according to the plant species, the culture method and the type of bioreactor.
  • the cells of the invention can also be immobilized, which makes it possible to obtain a constant and prolonged production of ⁇ l-AT.
  • the separation of ⁇ l-AT and plant biomass is also facilitated.
  • immobilization method mention may be made of immobilization in alginate or agar beads, inside polyurethane foam, or even in hollow fibers.
  • chimeric or transgenic plants can be regenerated from transformed explants, using techniques known per se.
  • Cereals such as wheat, corn, rice, barley, sorghum and oats, but also sugar cane, asparagus and bananas can be mentioned.
  • the invention also relates to the seeds of transgenic plants capable of producing ⁇ ⁇ AT and their progeny.
  • the proteins are recovered, and possibly purified, in order to allow their use in a large number of applications.
  • the methods of recovery (extraction) and purification of proteins are chosen according to the production method, that is to say cells in culture or whole plants, and optionally the addressing used.
  • the extraction is normally carried out by grinding the tissues, for example leaves or grains, in an appropriate buffer, filtering the ground material, precipitation of the proteins in the supernatant, centrifugation and resumption of the pellet in an appropriate buffer with dialysis.
  • a partial purification step can also be carried out at this stage by chromatography on an ion exchange column.
  • the invention also relates to monoclonal or polyclonal antibodies capable of specifically recognizing the protein of the invention. These antibodies can be used in the purification of the proteins of the invention and in the monitoring of patients.
  • the invention further relates to a pharmaceutical product comprising one or more protein (s) of the invention in association with an excipient which is physiologically acceptable.
  • composition of the invention can be administered in the form of an aerosol (particularly suitable, if it is non-glycosylated ⁇ ! -AT) for nasal injection, or intravenously, subcutaneously, topically. or percutaneous.
  • the protein (s) of the invention can or can be administered in the form of a liposome (s), encapsidated (s) or conjugated (s) to a targeting molecule.
  • the invention also relates to the use of the protein of the invention for the preparation of a medicament for the treatment of conditions linked to a deficiency in ⁇ j -antitrypsin. Diseases that are susceptible to treatment include cystic fibrosis, septic shock, and pulmonary emphysema.
  • the pharmaceutical composition of the invention can also be used as an anti-rheumatoid thanks to its anti-collagenase effect.
  • the proteins of the invention can also be used in cosmetology. Their anti-collagenase activity prevents the breakdown of connective tissue and in particular of collagen and elastin. According to this variant of the invention, the proteins can be purified or can be used in the form of extracts of all or part of the plant or of the seed or extracts of cell culture.
  • the invention relates to the use of the protein of the invention in an industrial application.
  • the proteins of the invention can also be used as anti-protease reagents in the form of industrial enzymatic preparations.
  • the invention also relates to a plant extract containing approximately 1 to 90% of a protein according to the invention, and in particular 1 ⁇ -antitrypsin.
  • This extract can be used as a medicine, in particular in therapy of conditions linked to a deficiency in ⁇ x -
  • the invention also relates to a pharmaceutical composition
  • a pharmaceutical composition comprising such a plant extract in combination with an excipient which is physiologically acceptable, preferably for administration by the oral or nasal route, for example in the form of an aerosol.
  • a process for the production of yorkitrypsin ( ⁇ 1 -AT), or variants thereof characterized by: i) the introduction in monocotyledonous plant cells, of a nucleic acid comprising a sequence coding for the ⁇ x -antitrypsin ( ⁇ x -AT) or for a variant thereof, the variants differentiating from the natural human ai-AT by one or more substitution (s), deletion (s) or insertion (s) of amino acids, and optionally a sequence coding for a selective agent; ii) selection of cells which have stably integrated the nucleic acid; iii) propagation of cells transformed into culture, or regeneration of chimeric or transgenic whole plants; iv) recovery and possibly purification of the ⁇ x -antitrypsin or its variants, thus produced.
  • nucleic acid additionally comprises a sequence coding for a signal peptide or "prepeptide", and optionally a sequence coding for an endoplasmic retention signal or for a vacuolar addressing signal.
  • nucleic acid additionally comprises transcription regulatory sequences recognized by a monocotyledonous plant cell.
  • °) A protein exhibiting a serine protease inhibitor activity, preferably an activity of human ⁇ -antitrypsin, characterized in that it is capable of being produced by the method according to any of the methods described in 1 °) to 5 °) above.
  • a protein according to the protein set out in 6 °) above characterized in that it is N-glycosylated by at least one glycan of mannosidic or polymannosidic type, and / or by at least one glycan of complex type optionally comprising within its structure one or more xylose residues and possibly one or more fucose residues.
  • a protein according to the protein stated in 7 °) above comprising the amino acid sequence illustrated in FIG.
  • °) A protein according to the protein stated in 13 °) above characterized in that the signal peptide is the prepeptide of sporamine, barley lectin, vegetable extensin, ⁇ -mating factor, pathogenesis proteins.
  • the signal peptide is that of native ⁇ - L -antitrypsin.
  • a nucleic acid comprising: i) a sequence coding for ⁇ l-AT or for a variant thereof, and ii) an addressing sequence chosen from a sequence coding for an original "pre" signal peptide plant and optionally a sequence coding for a retention signal or for a vacuolar addressing signal, and iii) transcription regulatory sequences recognized by a monocotyledonous plant cell.
  • nucleic acid according to the nucleic acid set out in 19 °) above characterized in that the regulatory sequences comprise one or more promoter (s) of plant or viral origin.
  • a chimeric or transgenic monocotyledon plant capable of producing a protein having a serine protease inhibitor activity, preferably an osantitrypsin activity, characterized in that it comprises cells according to the cells listed in 23 °) ci -above .
  • Monoclonal or polyclonal antibodies capable of specifically recognizing the protein according to one of the proteins listed in 6 °) to 18 °) above.
  • a pharmaceutical product comprising one or more protein (s) according to any one of the proteins listed in 6 °) to 18 °) above in combination with an excipient acceptable from the physiological point of view.
  • 32 °) A use of a protein according to any one of the proteins listed in 6 °) to 18 °) above for the preparation of a medicament for the treatment of conditions linked to a deficiency in ⁇ x -AT.
  • 33 °) A use of a protein according to any one of the proteins listed in 6 °) to 18 °) above in the preparation of cosmetic products, or chemical reagents.
  • 34 °) A plant extract containing 1 to 90% approximately of a protein according to any one of the proteins listed in 6 °) to 18 °) above, and in particular 1 ' ⁇ x -antitrypsin.
  • 35 °) A plant extract according to the extract stated in 34 °) above for use as a medicine.
  • FIG. 36 A plant extract according to the extract stated in 35 °) above for use in therapy of conditions related to a deficiency in ⁇ x -AT, in particular pulmonary emphysema, cystic fibrosis, septic shock or as anti-rheumatoid.
  • 37 °) A pharmaceutical composition comprising a plant extract according to the extract stated in 34 °) above in combination with an excipient which is acceptable from the physiological point of view, preferably for administration by the oral or nasal route, for example under aerosol form.
  • Figure 1 illustrates the cDNA and amino acid sequence of human ⁇ l-AT (type M). The NH 2 end of the mature protein (Glu) is indicated as + JL.
  • Amino acids -1 to -24 represent the N-terminal signal peptide of the immature protein.
  • the reactive site (Met) is indicated by a solid circle (•).
  • Four potential glycosylation sites are present in the protein, indicated by black diamonds (), but only three of them carry glycosidic chains (Long et al Supra).
  • FIG. 2 illustrates the schematic map of the plasmid pUC-AAT.
  • the AAT cDNA is inserted at the PstI site of pUC18.
  • PA (dotted box) corresponds to the sequence of the AAT signal peptide.
  • AAT black box corresponds to the sequence coding for human ⁇ 1-antitrypsin.
  • Ap (white box) corresponds to the gene conferring resistance to ampicillin.
  • AAT Human ⁇ l-antitrypsin
  • AAT Human ⁇ l-antitrypsin
  • the mature protein AAT consists of 394 amino acids and is cleaved at the Ala - Glu site of its 24 amino acid signal peptide.
  • the complete sequence of cDNA as well as the peptide sequence are described by Long et al. (Biochemistry, 1984, vol. 23, pages
  • the cDNA of AAT DNA fragment digested with StuI and SalI and isolated from pUC18, was cloned at the Xbal sites treated with Klenow and Sali from the vector pBSIISK + marketed by Stratagene Cloning Systems. The resulting plasmid was called pBIOC30.
  • AAT human ⁇ 1-antitrypsin protein
  • the EcoRV-SalI fragment of pBIOC30 was replaced by the EcoRV-SalI fragment resulting from the PCR amplification carried out on pBIOC30 using the 2 oligodesoxynucleotides, 5 'CCACGATATCATCACCAAGTTCC 3' (containing the unique site EcoRV) and 5 'cggtcgacgaattcCAGTTATTTGGGGT '(containing the Sali and EcoRI sites, and the first stop codon of the AAT).
  • the PCR amplification of the EcoRV-SalI fragment was carried out in 100 ⁇ l of reaction medium comprising 10 ⁇ l of Taq DNA polymerase x10 buffer (500 mM KC1, 100 mM Tris-HCl, pH9, 0 and 1% Triton x100), 6 ⁇ l 25 mM MgCl2, 3 ⁇ l of 10 mM dNTP (dATP, dCTP, dGTP and dTTP), 100 ⁇ M of each of the 2 oligodesoxynucleotides described above, 5 ng of template DNA (vector pBIOC30), 2.5 U of Taq DNA polymerase (Promega) and 2 drops of petrolatum oil.
  • reaction medium comprising 10 ⁇ l of Taq DNA polymerase x10 buffer (500 mM KC1, 100 mM Tris-HCl, pH9, 0 and 1% Triton x100), 6 ⁇ l 25 mM MgCl2, 3 ⁇ l
  • the DNA was denatured at 94 ° C for 5 min. , subjected to 30 cycles each consisting of 1 min. denaturation at 94 ° C, 1 min. hybridization at 70 ° C and 1 min. elongation at 72 ° C, then the elongation at 72 ° C was continued for 5 min.
  • This PCR reaction was carried out in the "DNA Thermal Cycler" machine from PERKIN ELMER CETUS. The oil was removed by extraction with chloroform. Then, the DNA fragments of the reaction medium were precipitated in the presence of 1/10 of volume of 3M sodium acetate pH4.8 and 2.5 volumes of absolute ethanol at -80 ° C for 30 min.
  • the ligation was carried out with 100 ng of the dephosphorylated vector described above and 50 ng of digested DNA fragments resulting from the PCR amplification described above in a reaction medium of 10 ⁇ l in the presence of 1 ⁇ l of T4 DNA buffer.
  • ligase x 10 (Amersham) and 2.5 U of T4 DNA ligase enzyme (Amersham) at 14 ° C for 16 hours.
  • the resulting plasmid was called pBI0C31.
  • sequence coding for the KDEL signal placed at the C-terminal end of the sequence coding for the mature protein ⁇ 1-human antitrypsin upstream of the stop codon combined with the presence of the sequence coding for the signal peptide N-terminal of sporamine A of tuberous roots of sweet potato allows addressing in the endoplasmic reticulum.
  • the vector pBIOC30 was modified at the 3 ′ end of the coding cDNA for AAT.
  • the presence of a Lys codon just before the AAT stop codon resulted in the introduction of the sequence encoding the LED signal only.
  • the EcoRV-Sali fragment of pBIOC30 was replaced by the EcoRV-SalI fragment resulting from the PCR amplification carried out on pBIOC30 using the 2 oligodesoxynucleotides ordered from Genset, 5 ′ CCACGATATCATCACCAAGTTCC 3!
  • the ligation was carried out with 100 ng of the dephosphorylated vector described above and 50 ng of digested DNA fragments resulting from the PCR amplification described above in a reaction medium of 10 ⁇ l in the presence of 1 ⁇ l of T4 DNA buffer.
  • ligase x 10 (Amersham) and 2.5 U of T4 DNA ligase enzyme (Amersham) at 14 ° C for 16 hours.
  • the sequence containing the mature human ⁇ 1-antitrypsin preceded part of that of its natural signal peptide PA (last 11 codons of the 24 required) is contained in pBI0C31.
  • the resulting modified clone was named pBIOC74.
  • sequence coding for the natural signal peptide PA of human ⁇ 1-antitrypsin (first 24 codons) has been replaced by that coding for an addressing signal of plant origin while respecting the open reading phases of the coding sequences.
  • This addressing signal is either a signal peptide (PS) which would allow a secretion of the protein in the extracellular medium of the intercellular space, or a prepropeptide that is to say a signal peptide followed by the N-terminal sequences d vacuolar addressing (PPS) which would address the protein in the vacuole.
  • PS signal peptide
  • PPS vacuolar addressing
  • the PS and PPS sequences consisting respectively of 23 and 37 amino acids, are those of a reserve protein of the tuberous roots of sweet potato: sporamine A (Murakami et al., 1986; Matsuoka and Nakamura, 1991).
  • the modified plasmid pBI0C31 containing the sequence coding for human ⁇ 1-antitrypsin (AAT) fused either to PS (PS-AAT) or to PPS (PPS-AAT) was called pBIOC33 and pBIOC34 respectively.
  • the modified plasmid pBIOC32 containing the sequence coding for human ⁇ 1-antitrypsin (AAT) fused to PS (PS-AAT-KDEL) was called pBIOC35.
  • the plasmid pBI0C31 was digested doubly with Sac1 and BamHI to remove the last 11 codons of the sequence coding for the natural signal peptide PA and the first codon of human ⁇ 1-antitrypsin mature.
  • This sequence has been replaced by the entire sequence coding for the natural signal peptide PA of 24 amino acids (ATG CCG TCT TCT GTC TCG TGG GGC ATC CTC CTG CTG GCA GGC CTG TGC TGC CTG GTC CCT GTC TCC CTG GCT) fused to the first codon mature AAT protein (Glu).
  • the sequence "PS - first 3 codons of the mature AAT protein" was amplified by PCR from the plasmid pUC18-AAT using the 2 oligodesoxynucleotides, 5 'gggagctcgaattcaacaATG CCG TCT TCT GTC TCG TG 3' (containing the EcoRI sites and Sacl and the Kozack translational signal) and 5 'G GGG ATC CTC AGC CAG GG3' (containing the BamHI site of the sequence coding for the mature AAT protein), following the PCR amplification protocol described above in the paragraph al After double enzymatic digestion with Sac1 and BamHI, the DNA fragments resulting from the PCR amplification were purified by electrophoresis on 2% agarose gel, electroeluted
  • the plasmid pBIOC31 was digested twice with Sac1 and BamHI to remove the sequence coding for the natural signal peptide of human ⁇ 1-antitrypsin. This sequence has been replaced by that coding for the signal peptide PS of 23 amino acids
  • the DNA fragments resulting from the PCR amplification were purified by electrophoresis on 2% agarose gel, electroeluted ( Sambrook et al., 1989), precipitated in the presence of 1/10 volume of 3M sodium acetate pH4.8 and 2.5 volumes of absolute ethanol at -80 ° C for 30 min., Centrifuged at 12000 g for 30 min., washed with 70% ethanol, dried, then ligated to the plasmid DNA of pBIOC31 doubly digested with Sacl and BamHI, purified by electrophoresis on 0.8% agarose gel, electroeluted (Sambrook et al., 1989 ), subjected to alcoholic precipitation, dried and dephosphorylated by the enzyme alkaline phosphatase of calf intestine (Boehringer Mannheim) according to the manufacturer's recommendations.
  • the ligation was carried out with 100 ng of the dephosphorylated vector described above and 50 ng of digested DNA fragments resulting from the PCR amplification described above in a reaction medium of 10 ⁇ l in the presence of 1 ⁇ l of T4 DNA buffer.
  • ligase x 10 (Amersham) and 2.5 U of T4 DNA ligase enzyme (Amersham) at 14 ° C for 16 hours.
  • the PS and mature AAT sequences were cloned while keeping their reading phases open.
  • the cleavage sequence between the PS and AAT sequences mature is Ser-Glu.
  • the resulting plasmid was called pBIOC33.
  • the plasmid pBIOC31 was digested twice with Sac1 and BamHI to remove the sequence coding for the natural signal peptide of human ⁇ 1-antitrypsin. This sequence has been replaced by that coding for the N-terminal PPS prepropeptide of 37 amino acids (ATG AAA GCC TTC ACA CTC GCT CTC TTC TTA GCT CTT TCC CTC TAT CTC CTG CCC AAT CCA GCC CAT TCC AGG TTC AAT CCC ATC CGC CTC CCC ACC ACA CAC GAA CCC GCC) fused to the first 3 codons of the mature AAT protein (Glu-Asp-Pro).
  • the sequence "PPS - first 3 codons of the mature AAT protein” was amplified by PCR from the plasmid pMAT103 (Matuoka and Nakamura, 1991) using the 2 oligodesoxynucleotides, 5 'gcgagctcgaattcaacaATG AAA GCC TTC ACA CTC GC 3' (containing the EcoRI and Sac1 sites and the Kozack translational signal) and 5 'CT GGG ATC CTC GGC GGG TTC GTG TGT GGT TG 3' (containing the BamHI site of the sequence of the mature AAT protein), following the protocol d PCR amplification described above in paragraph al After double enzymatic digestion with Sac1 and BamHI, the DNA fragments resulting from the PCR amplification were purified by electrophoresis on 2% agarose gel, electroeluted (Sambrook et al.
  • the ligation was carried out with 100 ng of the dephosphorylated vector described above and 50 ng of digested DNA fragments resulting from the PCR amplification described above in a reaction medium of 10 ⁇ l in the presence of 1 ⁇ l of T4 DNA buffer.
  • ligase x 10 (Amersham) and 2.5 U of T4 DNA ligase enzyme (Amersham) at 14 ° C for 16 hours.
  • the PPS and mature AAT sequences were cloned while keeping their reading phases open.
  • the cleavage sequence between the PPS and mature AAT sequences is Ala-Glu.
  • the resulting plasmid was called pBIOC34.
  • the plasmid pBIOC32 was digested twice with Sac1 and BamHI to remove the sequence coding for the natural signal peptide of human ⁇ 1-antitrypsin. This sequence has been replaced by that coding for the signal peptide PS of 23 amino acids (ATG AAA GCC TTC ACA CTC GCT CTC TTC TTA GCT CTT TCC CTC TAT CTC CTG CCC AAT CCA GCC CAT TCC) fused to the first 3 codons of the mature AAT protein (Glu-Asp-Pro).
  • the sequence "PS - first 3 codons of the mature AAT protein" was amplified by PCR from the plasmid pMAT103 (Matuoka and Nakamura, 1991) using the 2 oligodesoxynucleotides, 5 'gcgagctcgaattcaacaATG AAA GCC TTC ACA CTC GC 3' (containing the EcoRI and Sac1 sites and the Kozack translational signal) and 5 'CT GGG ATC CTC GGA ATG GGC TGG ATT GGG CAG G 3' (containing the BamHI site of the mature AAT protein sequence), following the protocol PCR amplification described above in paragraph al After double enzymatic digestion with Sac1 and BamHI, the DNA fragments resulting from the PCR amplification were purified by electrophoresis on 2% agarose gel, electroeluted (Sambrook et al ., 1989), precipitated in the presence of 1/10 volume of 3M sodium acetate pH4.8 and 2.5 volumes
  • the ligation was carried out with 100 ng of the dephosphorylated vector described above and 50 ng of digested DNA fragments resulting from the PCR amplification described above in a reaction medium of 10 ⁇ l in the presence of 1 ⁇ l of T4 DNA buffer.
  • ligase x 10 (Amersham) and 2.5 U of T4 DNA ligase enzyme (Amersham) at 14 ° C for 16 hours.
  • the PS and mature AAT sequences were cloned while keeping their reading phases open.
  • the cleavage sequence between the PS and mature AAT sequences is Ser-Glu.
  • the resulting plasmid was called pBIOC35.
  • CONSTITUTIVE EXPRESSION Construction of PPAR-IAR-PA-AAT, pPAR-IAR-PS-AAT, pPAR-IAR-PS-AAT-KDEL and pPAR-IAR-PPS-AAT.
  • sequences, coding "PA-AAT”, "PS-AAT”, “PS-AAT-KDEL” and "PPS-AAT”, were isolated by EcoRI enzymatic digestion respectively from pBIOC74, pBIOC33, pBIOC35 and pBIOC34.
  • the digested fragments were purified by electrophoresis on 0.8% agarose gel, then subjected to electroelution, to alcoholic precipitation, dried, taken up in H2O. They were treated by the action of the enzyme Klenow (New England Biolabs) according to the manufacturer's recommendations.
  • the ligation was carried out with 20 ng of the dephosphorylated vector and 200 ng of DNA fragments containing the sequence coding "PA-AAT", "PS-AAT”, “PS-AAT-KDEL” or "PPS-AAT", described above, in a reaction medium of 20 ⁇ l in the presence of 2 ⁇ l of T4 DNA ligase x 10 buffer (Amersham), 2 ⁇ l of 50% polyethylene glycol 8000 and 5 U of T4 DNA ligase enzyme (Amersham) at 14 ° C for 16 hours.
  • DH5a made previously competent have been transformed (Hanahan, 1983).
  • the resulting plasmids were called pPAR-IAR-PA-AAT, pPAR-IAR-PS-AAT, pPAR-IAR-PS-AAT-KDEL and pPAR-IAR-PPS-AAT.
  • the plasmid p63 results from the cloning of Pgzein, in replacement of the promoter 35S (P35S), at the HindiII and Xbal sites of the plasmid pUC18 containing, between its HindiII and EcoRI sites, the expression cassette "P35S-gus-TNOS" of pBI221 marketed by Clontech. It allows an expression in the albumen of corn seeds.
  • polyA NOS terminator which corresponds to the 3 'non-coding region of the nopaline synthase gene of the Ti plasmid of Agrrojbacte ium tumefaciens strain nopaline (Depicker et al., 1982).
  • pPgzein-PA-AAT The plasmids pPgzein-PA-AAT, pPgzein-PS-AAT, pPgzein-PS-AAT-KDEL and.
  • pPgzein-PPS-AAT where the sequences coding "PA-AAT”, "PS-AAT”, “PS-AAT-KDEL” or "PPS-AAT” were placed under the control of Pgzein, were obtained by cloning at the sites, Sacl and BamHI, treated with the enzyme T4 DNA polymerase (New England Biolabs), then dephosphorylated by the enzyme calf alkaline phosphatase (Boehringer Mannheim) of the plasmid p63, EcoRI fragments treated with Klenow (New England Biolabs) isolated from pBIOC74, pBIOC33, pBIOC35 and pBIOC34.
  • the ligation was carried out as described in Example Cl.
  • the bacteria, Escherichia coli DH5a made previously competent, were transformed (Hanahan, 1983).
  • the plasmid DNA of the clones obtained, selected on 50 ⁇ g / ml ampicillin, was extracted according to the method of alkaline lysis and analyzed by enzymatic digestion with restriction enzymes.
  • the resulting clones were called pPgzein-PA-AAT, pPgzein-PS-AAT, pPgzein-PS-AAT-KDEL and pPgzeine-PPS-AAT.
  • the plasmids pSB-PA-AAT, pSB-PS-AAT, pSB-PS-AAT-KDEL, pSB-PPS-AAT, which carry a replication of pBR322 and a spectinomycin resistance gene, were obtained by insertion of a binary plasmid having ori and cos regions, constructed according to the methods described in patents WO 9400977 and WO 9506722 between the right and left borders of the T-DNA of the expression cassettes "rice actin promoter-intron rice actin gene" bar-terminator NOS "and respectively PA-AAT under control of PAR-IAR or Pgzein, PS-AAT under control of PAR-IAR or Pgzein, PS-AAT-KDEL under control of PAR-IAR or Pgzein and PPS-AAT under control of PAR-IAR or Pgzein.
  • the plasmids obtained were introduced into Agrobacterium tumefaciens strain LBA
  • the resulting bacteria contain the cointegrates of pSB1 and respectively of pSB-PA-AAT, pSB-PS-AAT, pSB-PS-AAT-KDEL, pSB-PPS-AAT. II. OBTAINING TRANSGENIC CORN PLANTS.
  • calluses are obtained from immature embryos of genotype Hl II or (A188 x B73) according to the method and on the media described by Armstrong (1994). The calluses thus obtained are multiplied and maintained by successive subcultures every fortnight on the initiation medium.
  • Seedlings are then regenerated from these calluses by modifying the hormonal and osmotic balance of the cells according to the method described by Vain et al. (1989). These plants are then acclimatized in the greenhouse where they can be crossed or self-fertilized.
  • the previous paragraph describes obtaining and regenerating the cell lines necessary for transformation; a method of genetic transformation leading to the stable integration of the modified genes into the plant genome is described here.
  • This method is based on the use of a particle gun; the target cells are fragments of calluses described in paragraph 1. These fragments with an area of 10 to 20 mm 2 were placed, 4 h before bombardment, at the rate of 16 fragments per dish in the center of a petri dish containing a culture medium identical to the initiation medium, supplemented with 0.2 M of mannitol + 0.2 M of sorbitol.
  • the plasmids carrying the genes to be introduced are purified on a Qiagen column, following the manufacturer's instructions. They are then precipitated on tungsten particles (M10) following the protocol described by Klein (1987). The particles thus coated are projected towards the target cells using the cannon and according to the protocol described by J. Finer (1992).
  • Suitable selective agents generally consist of active compounds of certain herbicides (Basta ®, Roundup ®,) or certain antibiotics (Hygromycin, Kanamycin ).
  • Calls are obtained after 3 months or sometimes earlier, calluses whose growth is not inhibited by the selection agent, usually and mainly composed of cells resulting from the division of a cell having integrated into its genetic heritage one or more copies of the selection gene.
  • the frequency of obtaining such calluses is approximately 0.8 cal per bombarded box.
  • calluses are identified, individualized, amplified and then cultivated so as to regenerate seedlings. In order to avoid any interference with untransformed cells, all these operations are carried out on culture media containing the selective agent. The plants thus regenerated are acclimatized and then cultivated in a greenhouse where they can be crossed or self-fertilized.
  • the extraction protocol of the ⁇ l-antitrypsin for carrying out the ELISA tests and Western blots, from corn seeds is as follows: 100 mg of seeds are ground in liquid nitrogen and then in 1 ml of Tris buffer -HCl lOOmM pH 8 supplemented with EDTA ImM, dithiotreitol ImM and NaCl 250 mM. The ground material is stored at 4 ° C for maceration for 2 hours, then centrifuged at 4 ° C for 10 min at 10000g.
  • the proteins extracted according to the above protocol are denatured by heating at 95 ° C. for 5 min in the presence of 50 mM Tris-HCl buffer, pH 6.8, 4% SDS, 1% ⁇ -mercaptoethanol, 20% sucrose and bromophenol blue. 0.01%.
  • the proteins are then separated by electrophoresis on polyacrylamide gel under denaturing conditions according to the technique of Laemmli (1970) at the rate of 30 ⁇ g of proteins soluble by sample. After migration, the proteins are transferred to a nitrocellulose membrane.
  • a polyclonal anti- ⁇ i-antitrypsin antibody obtained in rabbits (Dako) is used as probe and the revelation is carried out by means of an anti-rabbit immunoglobulin antibody labeled with alkaline phosphatase (Sigma).
  • the protein extract is passed through a BIORAD heparin column, anion exchange column Mono Q, and a gel filtration column Superdex 75.

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Abstract

L'invention concerne un procédé de production d'α1-antitrypsine (α1-AT), ou de variantes de celle-ci caractérisé par: i) l'introduction dans des cellules végétales monocotylédones, d'un acide nucléique comportant une séquence codant pour l'α1-antitrypsine (α1-AT) ou pour une variante de celle-ci, les variantes se différenciant de l'α1-AT humaine naturelle par une ou plusieurs substitution(s), délétion(s) ou insertion(s) d'acides aminés, et éventuellement une séquence codant pour un agent sélectif; ii) sélection des cellules ayant intégré de manière stable l'acide nucléique; iii) propagation des cellules transformées en culture, ou régénération de plantes entières chimériques ou transgéniques; iv) récupération et éventuellement purification de l'α1 -antitrypsine ou de ses variantes, ainsi produites.

Description

PROCEDE DE PRODUCTION, PAR DES CELLULES VEGETALES,
D'Œi-ANTITRYPSINE ET DE SES VARIANTES, ET PRODUITS
CONTENANT L ' ^-ANTITRYPSINE AINSI OBTENUE
L'invention concerne un procédé de production, par des cellules végétales monocotylédones, d ' Quantitrypsine et de ses analogues, et les protéines ainsi obtenues. L'invention vise également les cellules et plantes monocotylédones, génétiquement transformées, capables de produire des analogues d' axantitrypsine, et les construits d'acides nucléiques impliqués dans la transformation. En outre, l'invention vise des produits pharmaceutiques contenant 1 ' α^-antitrypsine et ses variantes, ainsi obtenues .
L' alpha- 1-antitrypsine, et].-AT, également connue sous les désignations d ' alpha- 1-inhibiteur de protéase (cii-PI) , d' antitrypsine et de metserpine, est une protéine plasmatique présente dans le plasma à une concentration de l'ordre de 1,3 grammes par litre. Synthétisée par le foie, il s'agit d'une glycoprotéine de 51kDa à 54kDa, constituée d'une seule chaîne polypeptidique de 394 acides aminés (Long et al., Biochemistry, 1984, vol. 23, pages 4828-4837). Elle possède 3 sites de N-glycosylation sur les résidus Asn-46, Asn-83 et Asn-247, les trois chaînes glycosidiques ayant une structure "core" commune de Asn- (NAc Glc) 2- (Man) 3, avec 2 ou 3 antennes de NAc Glc-
Gal-Sia. La partie glucidique représente 13% de la masse totale de la glycoprotéine. En raison d'un polymorphisme survenant à 3 positions dans la protéine, il existe 3 formes d'o^-AT:
Ml, M2, M3 :
213 376 101
Ml Val/Ala Glu Arg
M2 Val Asp Arg
M3 Val Asp His
L'αx-AT est un inhibiteur de protéase à serine. Sa fonction biologique principale est d'inhiber l'élastase neutrophile et de protéger ainsi le tissu pulmonaire contre les attaques protéolytiques .
Il existe plusieurs variantes "pathologiques" communes de la protéine : par exemple la forme "Z" dans laquelle Glu-342 est substitué par Lys, et la forme "S" dans laquelle Glu-264 est substitué par Val. Des différences au niveau de la glycosylation, et en particulier dans le nombre de résidus d'acide sialique, peuvent aussi être observées.
Les mutants Z et S, bien que capables de fonctionner comme agents anti-élastase, sont produits en faible quantité conduisant à une déficience, et surtout dans le cas de la variante "Z", au développement d'emphysème pulmonaire sévère.
Cette pathologie est actuellement traitée par thérapie substitutive avec des concentrés plasmatiques . Les besoins annuels actuels par patient sont estimés à 200 grammes et la demande mondiale à plusieurs centaines de kilogrammes par an. L'échelle de production de la protéine à partir de sang humain couvre difficilement ces besoins.
La production d'o^-AT humaine par voie recombinante a donc été envisagée. L'o^-AT recombinante non-glycosylée a notamment été produite chez E. coli sous forme de protéine de fusion. La protéine, exprimée à un taux d'environ 15% des protéines cellulaires totales, présentait une activité anti- élastase caractéristique d'αx-AT, mais était selon les auteurs, susceptible de présenter des propriétés immunologiques modifiées en raison de l'extension N- terminale (Courtney et al., PNAS, 1984, vol. 81, pages 669-673) .
La production chez la levure d'c^-AT à des taux élevés (10-3% des protéines cellulaires totales) a également été décrite par Johansen et al . (Mol .
Biol.Med., 1987, vol. 4, pages 291-305). Le rendement a été augmenté par la délétion des premiers 5, 10 ou
15 acides aminés.
Travis et al. (J. Biol . Chem. , 1985, vol. 260 n° 7, pages 4384-4389) ont décrit la production d'αx-AT non glycosylee chez la levure. Deux variantes de la protéine ont été obtenues à un rendement d'environ 10% des protéines cellulaires solubles totales, chacune ayant une activité αx-AT mais une stabilité réduite par rapport à l'ctχ-AT native.
L'o^-AT glycosylee a été exprimée dans le sang et dans le lait d'animaux transgéniques, notamment des lapins, des souris et des brebis.
Dans le sang des animaux transgéniques, la protéine était présente à une concentration d'environ 1 mg/ml de plasma. Elle conserve son activité anti- élastase (Massoud et al.., C. R. Acad. Sci . Paris, 1990, tome 311, série III, pages 275-280) .
Dans le lait de brebis transgéniques, les niveaux d'cti-antitrypsine ont atteint 60 g/1. La protéine ainsi produite est entièrement glycosylee (Wright et al., Bio/Technology, Septembre 1991, vol. 9, pages 830- 834) . La nature de la glycosylation n'a pas été publiée .
La production de protéines recombinantes dans le lait des animaux transgéniques se propose de diminuer les coûts de production. Cependant, il reste des problèmes d'éthique et de contaminations virales et subvirales du même type que ceux rencontrés avec les produits purifiés classiques.
Le problème technique que se propose de résoudre la présente invention est de produire de l' 0.3.-AT recombinante en grande quantité à des coûts faibles, sans risque de contaminations virales ou sub-virales, par exemple par des prions . La protéine présente une activité o^-AT satisfaisante, et doit être stable et adaptée du point de vue immunologique à la forme d'administration choisie. Les présents inventeurs ont résolu ce problème technique en utilisant, comme hôte pour la transformation génétique, des cellules végétales, et plus particulièrement des cellules végétales monocotylédones.
Diverses équipes se sont déjà intéressées à la production de protéines recombinantes de mammifères dans des cellules végétales ou dans des plantes transgéniques. Par exemple, l'expression spécifique dans les graines de colza, de la leu-enképhaline a été obtenue avec des niveaux d'expression d'environ 0,1% (Vanderkerckhove et al., Biotechnology, 1989, vol. 7, pages 929-932) .
En 1990, Simons et al. (Biotechnology, 1990, vol. 8, pages 217-221) ont transféré le gène de la sérum albumine humaine dans des cellules de tabac et de pomme de terre. Quelle que soit l'origine des peptides signaux (humaine ou végétale) , des taux de sérum albumine humaine de l'ordre de 0,02% des protéines totales ont été obtenus dans les feuilles, les tiges et les tubercules de pomme de terre .
D'autres protéines recombinantes de mammifères ont aussi été produites dans les plantes : l'antigène de surface de l'hépatite B (Mason et al., P.N.A.S, 1992, vol. 89, pages 11745-11749) ; 1 ' interféron humain (Edelbaum, J. of Interferon Res . , 1992, vol. 12, pages 449-453) ; un anticorps de souris anti- Streptococcus mutans, agent de la carie dentaire (Hiatt et Ma, FEBS, 1992, vol. 307, pages 71-75) ; un anticorps anti-Herpès et l'hirudine (Russel, Moloney, respectivement, Intl. Meeting of Production of Recombinant Proteins in Plants, Leicester, 1994, page 43, pages 36-38) .
L'ensemble de ces recherches montre que la production de protéines recombinantes de mammifères dans les cellules végétales est possible et que les mécanismes de synthèse de protéines à partir des séquences d'ADN sont similaires chez les cellules animales et les cellules végétales. De plus, il apparaît que la cellule végétale est capable de réaliser la plupart des étapes de maturation post- traductionnelles des protéines comme l'assemblage des sous-unités, le repliement des chaînes, la maturation proteolytique, la formation des ponts-disulfures et le clivage des peptides signaux de manière semblable aux cellules animales.
Quelques différences existent néanmoins au niveau de la glycosylation. Bien que les étapes de glycosylation conduisant aux glycannes polymannosidiques soient réalisées de manière identique chez les plantes et chez les mammifères, la maturation des glycannes polymannosidiques en glycannes complexes est sensiblement différente. Les N-glycannes des glycoprotéines végétales diffèrent principalement des glycannes de mammifères par l'absence d'acide sialique, également connu sous le nom d'acide N-acétylneuraminique, et par la présence d'un résidu de β-1 , 2 xylose et d'un résidu de fucose lié en α-1,3 au résidu de GlcNAc proximal du "core" (Driouich et al., Regard sur la biochimie, 1993, vol. 3, pages 33-42). Les abréviations signifiant des résidus glucidiques sont celles habituellement utilisées dans l'art (VLIEGENTHART J.F.G and MONTREUIL J. , Chap. II, Glycoproteins, Montreuil J. , Schachter H., Vliegenthart J.F.G., 1995, ELSEVIER SCIENCE B.V., pages 13-28 ; MONTREUIL J. , Advances in Carbohydrate Chemistry and Biochemistry, 1980, Vol. 37, Académie Press Inc., pages 157-223).
La glycosylation joue un rôle important dans la mise en place de la structure spatiale de la protéine, dans la solubilité de la molécule, dans la protection contre les attaques protéolytiques et dans les mécanismes de reconnaissance immunitaire. Le glycanne contrôle aussi la demi-vie de la protéine et peut lui- même, dans certains cas, porter la fonction biologique. Compte tenu du rôle important joué par la glycosylation, l'on essaie normalement, pour la fabrication de protéines thérapeutiques, de reproduire le plus fidèlement possible la glycosylation naturelle de la protéine. Ceci n'est pas possible dans des cellules végétales, en raison de la présence du xylose, absent chez les animaux, et de l'absence d'acide sialique chez les plantes. Bien que présentant de nombreux avantages du point de vue économique, les différences au niveau de la glycosylation de la protéine peuvent donc rendre imprévisible le succès de l'utilisation de cellules végétales pour la production de protéines thérapeutiques.
Malgré ces différences importantes, les présents inventeurs ont réussi à produire dans des plantes monocotylédones transgéniques, à des niveaux d'expression élevés, des protéines ayant une activité d'o^-AT. Les protéines ont une stabilité acceptable. De manière surprenante, les inventeurs ont aussi constaté, que dans certaines conditions, la maturation proteolytique de la glycoprotéine est fonction de l'adressage cellulaire, permettant la production d'une série de "variantes" protéiques, de poids moléculaire différent, présentant toutes une activité d'c^-AT.
L'invention concerne donc un procédé de production d ' ocx-antitrypsine, ou de variantes de celle- ci caractérisé par : i) l'introduction, dans des cellules végétales provenant d'une espèce monocotylédone, d'un acide nucléique comportant une séquence codant pour l'cti- antitrypsine ou pour une variante de celle-ci, les variantes se différenciant de l'cxχ-AT humaine naturelle par une ou plusieurs substitution (s) , délétion(s) ou insertion (s) d'acides aminés, et éventuellement une séquence codant pour un agent sélectif ; ii) sélection des cellules ayant intégré de manière stable l'acide nucléique ; iii) propagation des cellules transformées en culture, ou régénération de plantes entières chimériques ou transgéniques ; iv) récupération et éventuellement purification de l 'o^-antitrypsine ou de ses variantes, ainsi produites.
L'invention concerne également une protéine susceptible d'être produite par le sus-dit procédé, et présentant une activité de protéase à serine, de préférence une activité de l'o^-AT, caractérisée en ce que : soit elle est exempte de chaînes N- glycosidiques ;
- soit elle est N-glycosylée par au moins un glycanne de type mannosidique ou polymannosidique, et/ou par au moins un glycanne de type complexe comportant éventuellement au sein de sa structure un ou plusieurs résidus de xylose et éventuellement un ou plusieurs résidus de fucose, le glycanne de type complexe étant normalement dépourvu de résidus d'acide sialique. Dans le contexte de l'invention, les termes ci- après ont les significations suivantes :
- une "variante" de l'α^-AT signifie une protéine qui se différencie de l'c^-AT humaine naturelle (mature ou pré-protéine) par une ou plusieurs substitution (s) , délétion(s) ou insertion (s) d'acides aminés. De manière générale, les variantes présentent au moins 90% et de préférence au moins 95% d'homologie ou d'identité avec la séquence en acides aminés décrite par Long et al. (Biochemistry, 1984, vol. 23, pages 4828-4837) , illustrée dans la Figure 1, le pourcentage d'homologie entre deux protéines étant défini tel qu'indiqué ci-dessous. Le terme « variante » est utilisé, dans le contexte de l'invention, de manière synonyme avec le terme « analogue » . Les variantes présentent aussi une activité d'inhibiteur de protease à serine. Il a été constaté que certaines modifications au niveau de la séquence en acides aminés de l'o^-AT peut conférer à la protéine une activité d'inhibiteur de protease à serine autre que celle normalement associée à l'o^-AT, par exemple une activité caractéristique de 1 ' antithrombine III
(Jallat et al., Protein Engineering, Vol. 1, N° 1, pp 29-35, 1986). Les variantes d'o^-AT de l'invention présentent une glycosylation identique ou différente de l'αx-AT humaine naturelle. Le terme « variante » englobe également des fragments de l'o^-AT et ses analogues qui présentent une activité d'inhibiteur de protease à serine, de préférence une activité d'α^-AT.
« une activité d'inhibiteur de protease à serine » signifie la capacité d'inhiber partiellement ou totalement toute protease ayant un résidu serine au sein de son site actif, par exemple la trypsine, l'élastine, la cathepsine G, la thrombine, la collagénase, la chymotrypsine et la plasmine. - "une activité de l' 0.3.-AT" signifie une activité anti-élastase, déterminée selon la technique de Travis et Johnson, Meth. in Enzymol . , 1981, vol. 80, pages 754-765. Cette technique est détaillée dans les exemples. L'activité peut également être déterminée selon la capacité de la protéine à inhiber la trypsine (voir Travis et Johnson, supra) . De manière générale, pour les deux techniques, la protéine recombinante présente une activité d'inhibition d'au moins 30% et de préférence au moins 75%, par exemple 85% de celle de l'ai-AT humaine naturelle à molarité égale. Une troisième technique consiste en la détermination de la capacité de la protéine recombinante à hydrolyser le substrat Methoxy-L-Alanyl-L-Prolyl-L-Valine-P- nitroanilide (Massoud et al., supra). La capacité de la protéine à inhiber l'activité de chacune des protéases à serine mentionnées ci-dessus peut aussi être utilisée comme indice de l'activité des protéines de l'invention (The Plasma Proteins", Second Edition, Ed. Pulnam, Académie Press, 1975, p.241-242) .
« monocotylédone » signifie un végétal phanérogame angiosperme dont la tige et la racine sont (presque toujours) dépourvues de cambiums et donc de formations secondaires; la feuille est presque toujours pourvue de nervures parallèles; la graine renferme un embryon à un seul cotylédon.
- le pourcentage d'homologie entre deux séquences d'acides aminés est calculé comme étant le nombre d'acides aminés identiques plus le nombre d'acides aminés similaires dans l'alignement des deux séquences, divisé par la longueur des séquences entre deux positions données. Si, entre les deux positions données, les deux séquences n'ont pas la même longueur, le pourcentage d'homologie est le nombre d'acides aminés identiques et similaires, divisé par la longueur de la séquence la plus longue. Les acides aminés considérés comme étant "similaires" sont connus dans l'art, voir par exemple R.F. Feng, M. S. Jobson and R.F. Doolittle ; J. Mol. Evol . ; 1985 ; vol. 21 ; pages 112-115. Ils sont normalement considérés comme étant ceux qui, au sein d'une matrice de permutation, ont un coefficient de substitution positif.
Selon une première variante de l'invention, la protéine recombinante à activité αx-AT est non- glycosylée . Ce type de protéine peut être obtenu dans une cellule végétale en utilisant la séquence d'acide nucléique codant pour le polypeptide mature, c'est-à- dire sans le peptide signal N-terminal de 24 acides aminés (voir par exemple Figure 1) . Aucun autre signal n'est ajouté. Le polypeptide ainsi produit s'accumule dans le cytoplasme de la cellule. Il aura normalement un poids moléculaire inférieur d'environ lOkD à celui de l'αx-AT humaine naturelle, c'est-à-dire autour de
45kDa, et une stabilité moindre dans le plasma.
Selon une variante préférée, la protéine de l'invention est glycosylee à l'un au moins des 3 sites naturels de glycosylation : Asn-46, Asn-83 ou Asn-247. La glycosylation est de type mannosidique, polymannosidique ou de type complexe, ou un mélange des deux. L'expression « entièrement glycosylee » signifie, dans le contexte de l'invention, que la molécule en question est glycosylee aux 3 sites naturels de glycosylation..
Le ou les glycanne (s) de type mannosidique ont la structure GlcNAc2-Manl . Le ou les glycanne (s) polymannosidique (s) ont la structure GlcNAc2-Man2-9, par exemple GlcNAc2-Man9, GlcNAc2-Man8, GlcNAc2-Man6 ou GlcNAc2-Man5, ou GlcNAc2-Man3.
Le ou les glycanne (s) de type complexe sont biantennés et ont une structure de base GlcNAc2-Man3 à laquelle sont éventuellement associés des résidus de xylose (Xyl) , fucose (Fuc) et éventuellement galactose (Gai) ou N-acétylglucosamine (GlcNAc) . Ils sont normalement exempts de résidus d'acide sialique, ce composé n'ayant pas jusqu'alors été mis en évidence dans les cellules végétales.
De préférence, le glycanne complexe est de type
"phytohémagglutinine" (PHA) constitué d'une structure "core" GlcNAc2Man3 dont le mannose lié en β porte un résidu de β 1,2-xylose et dont le GlcNAc proximal porte un résidu d'α 1,3 fucose (GlcNAc2 (Fuc) Man3 (Xyl)) . Ce genre de structure est fréquent pour les glycoproteines de localisation vacuolaire ou extracellulaire. Le résidu de fucose α 1,3-lié peut éventuellement être absent.
Le glycanne complexe peut aussi être du type "Laccase" (Driouich et al, Regard sur la Biochimie, 1993, n°3, pp33-42) composé d'une structure de base GlcNAc2 (Fuc) Man3 (Xyl) associée à deux chaînes latérales. Chaque chaîne latérale est constituée d'un résidu de β 1,2 GlcNAc auquel est lié un résidu d'α 1,6 fucose et un résidu de β 1,4 galactose.
La glycoprotéine de 1 ' invention peut être glycosylee aux trois sites naturels (Asn-46, Asn-83 et Asn-247) ou seulement à l'un ou deux d'entre eux. Parmi les variantes préférées, l'on peut citer des glycoproteines portant exclusivement des glycannes polymannosidiques. Ces glycoproteines présentent une très faible immunogénici é chez l'animal parce que ce type de glycosylation existe sous forme identique chez la plante et chez l'animal.
On peut aussi citer les glycoproteines portant exclusivement des glycannes de type complexe, par exemple deux ou trois glycannes de type PHA : GlcNAc2 (Fuc)Man3 (Xyl) .
La partie glucidique représente, normalement, entre 2 et 30%, par exemple 5 à 20% de la masse totale de la glycoprotéine de l'invention. La partie protéique de la glycoprotéine correspond à la partie protéique de toute protéine ou fragment de protéine présentant une activité αi-AT. Il s'agit normalement du polypeptide mature d'αi-AT humaine, mais peut également être celui d'animaux tels que le lapin ou le singe.
La séquence en acides aminés complète de l'α^AT humaine, y compris le peptide signal N-terminal (Type « Ml ») , est décrite par Long et al. (Biochemistry, 1984, vol. 23, pages 4828-4837). En plus du type Ml, il existe également les types M2 ou M3 (Val 213 - Asp 376 - Arg 101 ; Val 213 - Asp 376 - His 101, respectivement), ou une variante de Ml, M2 ou M3 dans laquelle Val 213 est remplacé par Ala. Les protéines de l'invention peuvent comporter les séquences en acide aminés des types Ml, M2 ou M3.
La séquence en acides aminés peut aussi être celle des variantes Z ou S, associées à certains troubles pulmonaires. Ces variantes se distinguent du type Ml décrit par Long et al par Glu-342 —» Lys (variante Z) et Glu-264 -» Val (variante S) .
De manière générale, la protéine de l'invention peut comporter toute séquence en acides aminés se différenciant de la séquence naturelle par une ou plusieurs substitution (s) , délétion(s) ou insertion(s) d'acides aminés. Normalement, ces variantes présentent une homologie, ou une identité, d'au moins 90% par exemple 95%, avec la séquence décrite par Long et al . (Biochemistry, 1984, vol. 23, pages 4828-4837 Figure 1) .
Parmi les variantes préférées, l'on peut citer des séquences d'α,-AT dont la Met358 du site actif, a été modifié, par exemple remplacé par un acide aminé différent, tel que Arg, Leu, Ala, Ile ou Val. De plus, Asp2 et Asp6 peuvent être remplacés par Asn. Les variantes de la protéine de l'invention peuvent aussi comporter des fragments de la séquence décrite par Long et al. (Biochemistry, 1984, vol. 23, pages 4828-4837) et de ses analogues définis ci-dessus à condition que l'activité d'inhibiteur de protease à serine, et particulièrement celle de l'αχ-AT, soit conservée. Ces fragments sont constitués d'environ 200 à 393 acides aminés consécutifs de la séquence d'αi.AT, de préférence entre 250 et 390 acides aminés. Parmi les fragments préférés, on peut citer l'αx-AT mature humaine dont l'extrémité N terminale a été tronquée par la délétion d'environ 1 à 10 acides aminés.
L'extrémité C terminale peut aussi être tronquée d'environ 1 à 20 acides aminés. Le site actif de la protéine se trouvant autour des acides aminés Met-358 à Glu-363, il est important de ne pas effectuer de délétion C terminale de longueur trop importante afin de ne pas affecter le site actif.
Outre la séquence en acides aminés responsable de l'activité αx-AT proprement dite, la protéine de l'invention peut comprendre différents signaux peptidiques responsables de l'adressage de la protéine vers les différents compartiments cellulaires où sont effectuées les modifications co- et post- traductionnelles . Ces signaux sont le peptide signal N-terminal, également connu sous le nom de prepeptide, le signal de type KDEL responsable de la rétention de la protéine dans le reticulum endoplasmique et le signal d'adressage vacuolaire, ou propeptide.
En effet, dans la cellule végétale, l'adressage des protéines est basé sur le même principe que dans les cellules animales. A partir de l 'ADN chromosomique, le gène est transcrit en ARN messager, puis traduit en protéine au niveau des ribosomes . Si la protéine naissante possède un peptide signal N- terminal ou prepeptide, elle pénètre dans le reticulum endoplasmique où ont lieu un certain nombre de maturations post-traductionnelles, notamment le clivage du peptide signal, les N-glycosylations conduisant aux glycannes polymannosidiques, et la formation des ponts disulfures. La présence d'un peptide KDEL, HEKDEL ou SEKDEL à l'extrémité C terminale provoque la rétention de la protéine dans le reticulum endoplasmique et, dans certains cas, l'accumulation de protéines dans des vésicules du reticulum endoplasmique. Lors de la rétention d'une protéine dans le reticulum endoplasmique, le signal KDEL (HDEL ou SEKDEL) n'est pas clivé et il subsiste sur la protéine mature.
En l'absence d'un signal de rétention du type KDEL, la protéine est transportée vers l'appareil de Golgi et subit, au cours de ce transport, une première modification de ses chaînes de glycannes (suppression des glucoses terminaux). Dans l'appareil de Golgi, la maturation des glycannes se poursuit par la suppression des résidus et l'addition de résidus xylose et fucose pour former les glycannes complexes . En l'absence d'un signal d'adressage vacuolaire ou "propeptide" , la protéine est alors sécrétée et s'accumule dans l'espace intercellulaire. Lorsque la protéine possède à l'extrémité N-terminale ou C- terminale un propeptide, la proprotéine est dirigée vers la vacuole. A l'entrée dans la vacuole, le propeptide est clivé et certaines maturations finales de glycannes sont réalisées.
Parmi ces différents signaux, le prepeptide, responsable de l'adressage de la protéine dans le reticulum endoplasmique, est toujours présent. Il s'agit normalement d'un peptide signal N-terminal hydrophobe ayant entre 10 et 40 acides aminés. Il est normalement d'origine animale ou végétale. Il peut en effet s'agir du prepeptide naturellement associé à l'αi-AT humaine (PA) , ou d'un prepeptide provenant d'une autre protéine humaine, . par exemple celui de la sérum albumine humaine. Par exemple, il s'agit d'un prepeptide d'origine végétale, par exemple celui de la sporamine (PS), de la lectine d'orge, de l'extensine végétale (pEXT) , de l'α-mating factor, des protéines végétales impliquées dans la défense contre les microorganismes (PRla et PRS, "pathogenesis related proteins" ) .
Normalement, le peptide signal est clivé par un signal peptidase dès l'introduction co-traductionnelle du polypeptide naissant dans la lumière du reticulum endoplasmique (RER) . La protéine mature ne comporte plus cette extension N-terminale.
La protéine de l'inven ion peut, outre le prepeptide, aussi comporter un signal de rétention endoplasmique, consistant en les peptides KDEL, SEKDEL ou HDEL. Ces signaux se trouvent normalement à l'extrémité C-terminale de la protéine et subsistent sur la protéine mature. La présence de ce signal sur les protéines de l'invention est avantageuse pour plusieurs raisons : d'une part, la rétention de la protéine dans le reticulum endoplasmique a tendance à augmenter les rendements en protéines recombinantes . D'autre part, la maturation de la glycosylation polymannosique en glycannes complexes n'aura pas lieu ; la protéine conserve donc la glycosylation polymannosique, minimisant le risque de réactions immunologiques indésirables lorsque la protéine sera administrée à l'homme comme médicament. Selon cette variante de l'invention, le glycoprotéine comporte donc la séquence en acides aminés d'α^AT, un signal du type KDEL, au moins un glycanne de type polymannosique, et est exempt de glycannes de type complexe. Selon l'invention, ce type de protéine peut aussi être obtenu en utilisant des mutants de plantes incapables de fabriquer la N-acétyl glucosaminyl transférase (von Schaewen et al., Plant Physiol . 1993 102: 1109-1118), et donc incapables de produire des glycannes complexes.
La protéine de l'invention peut, outre le prepeptide, comporter aussi un signal d'adressage vacuolaire ou "propeptide". En présence d'un tel signal, la protéine est adressée aux vacuoles des tissus aqueux, par exemple les feuilles, ainsi qu'aux corps protéiques des tissus de réserve, par exemple les graines, tubercules et racines. L'adressage de la protéine vers les corps protéiques de la graine est particulièrement intéressant en raison de la capacité de la graine à accumuler des protéines, jusqu'à 40% des protéines par rapport à la matière sèche, dans des organites cellulaires dérivés des vacuoles, appelés corps protéiques et en raison de la possibilité de stocker plusieurs années les graines contenant les protéines recombinantes à l'état déshydraté.
Comme propeptide, on peut utiliser un signal d'origine animale ou végétale, les signaux végétaux étant préférés, par exemple la pro-sporamine, ou la lectine d'orge. Le propeptide peut être N-terminal ("N-terminal targeting peptide" ou NTTP) , ou C terminal (CTTP) ou peut consister en une séquence interne à la protéine. Dans la mesure où le propeptide est normalement clivé dès.l'entrée de la protéine dans la vacuole, il n'est pas présent dans la protéine mature. Pour un adressage vacuolaire, on peut utiliser une combinaison peptide signal et propeptide N- terminal de sporamine de patate douce (PPS) .
Selon une autre variante de l'invention, la protéine de l'invention peut être sous forme de protéine de fusion, en particulier avec une protéine végétale. La protéine végétale peut être choisie afin d'augmenter le rendement ou de faciliter la sécrétion et la purification. La protéine de fusion peut aussi être choisie afin de permettre le ciblage de l'αi-AT ou de faciliter son transport.
L'objectif principal de l'invention étant de produire l'αx- T recombinante dans des cellules végétales monocotylédones, l'invention vise également les acides nucléiques codant pour les protéines, et pour les signaux d'adressage, éventuellement en association avec des séquences régulatrices adéquates, permettant l'expression de l'αi-AT dans la cellule végétale .
La séquence d'acide nucléique codant pour l'αi-
AT, ou pour ses variantes ou les fragments définis ci- dessus, peut être de l'ADNc ou de l'ADN génomique avec ses introns. Normalement, il s'agit d'ADNc, une séquence appropriée est illustrée la Figure 1 (Long et al, Biochemistry, 1984, vol. 23, pages 4828-4837). Toute séquence dégénérée peut être utilisée. Lorsqu'il s'agit d'ADNc, des introns, provenant de préférence d'un .gène végétal, peuvent être introduits artificiellement afin d'augmenter l'efficacité de l'expression de la séquence hétérologue. En effet, il a été démontré, particulièrement chez les monocotylédones que l'insertion d'un intron dans la partie 5' non traduite d'un gène, c'est-à-dire entre le site d'initiation de transcription et le site d'initiation de traduction, conduit à une amélioration de la stabilité du messager, et par conséquence, à une meilleure expression. Le ou les introns utilisé (s) de cette manière proviennent de préférence d'une monocotylédone telle que le maïs. Il s'agit de préférence, mais pas obligatoirement, du premier intron du gène.
L'invention vise également des gènes chimériques comprenant d'une part une séquence codant pour une protéine ayant une activité d'αi-antitrypsine et d'autre part, des séquences régulatrices de transcription reconnues par une cellule végétale monocotylédone . Les séquences régulatrices comprennent un ou plusieurs promoteurs d'origine végétale plus particulièrement d'origine monocotylédone, ou virale ou provenant d 'Agrobacterium tumefaciens. Il peut s'agir d'un promoteur constitutif, par exemple le promoteur actine de riz, ou des promoteurs spécifiques de certains tissus comme le grain, ou spécifiques de certaines phases de développement de la plante monocotylédone .
Comme promoteurs spécifiques de graines, on peut citer le promoteur du gène gamma (g) zéine de maïs (Reina et al, 1990) .
Il peut être envisagé d'utiliser des "enhancers" pour améliorer l'efficacité d'expression.
Les séquences régulatrices de terminaison sont d'origine végétale ou virale ou provenant d'Acrrobacterium tumefaciens, et sont fonctionnelles dans des cellules végétales monocotylédones.
Selon une variante, le gène chimérique de l'invention comprend en outre une séquence codant pour un peptide signal permettant la sécrétion de la protéine, et éventuellement une séquence codant pour un signal de rétention endoplasmique ou pour un signal d'adressage vacuolaire.
Les promoteurs semences spécifiques sont particulièrement avantageux en association avec un signal d'adressage vacuolaire (prépropeptide) .
Dans le cas où des introns hétérologues sont utilisés en combinaison avec l'ADNc d'αi-AT, bien entendu, le gène chimérique comprend également ces introns .
L'invention vise également des plasmides ou vecteurs caractérisés en ce qu'ils contiennent au moins l'une des séquences d'acide nucléique, de préférence un gène chimérique, selon l'invention. De préférence, les plasmides et vecteurs permettent la transformation stable de la plante, par exemple les plasmides Ti d 'Agrobacterium, des vecteurs viraux tels que les Geminivirus .
Tous les moyens connus pour introduire de l 'ADN étranger dans les cellules végétales peuvent être utilisés, par exemple Agrobacterium, électroporation, transformation de protoplastes, bombardement avec canon à particules, ou pénétration d'ADN dans des cellules comme le pollen, la microspore, la graine et l'embryon immature, suspensions cellulaires embryogènes et non embryogènes, inflorescence immature et vecteurs viraux tels que les Geminivirus. La séquence de l'invention est introduite dans un vecteur approprié avec toutes les séquences régulatrices nécessaires tels que promoteurs, terminateurs, etc.. ainsi que toute séquence nécessaire pour sélectionner les transformants.
L'intégration de l'acide nucléique dans le génome peut éventuellement avoir lieu par recombinaison homologue. Dans ce cas, l'acide nucléique transformant comporte, sur chaque extrémité, une séquence homologue aux séquences qui jouxtent le site d'insertion souhaité dans le génome.
L'invention concerne également les cellules végétales monocotylédones transformées avec les séquences de l'invention, et capable de produire une ou plusieurs protéine (s) ayant une activité d'inhibiteur de protease à serine et, en particulier,
Il peut s'agir de cultures de cellules végétales in vitro, par exemple en milieu liquide. Différents modes de culture ("batch", "fed batch" ou en continu) pour ce type de cellules sont actuellement à l'étude. Les cultures en "batch" sont comparables à celles effectuées en erlenmeyer dans la mesure où le milieu n'est pas renouvelé, les cellules ne disposent ainsi que d'une quantité limitée d'éléments nutritifs. La culture en "fed batch" correspond quant à elle à une culture en "batch" avec une alimentation programmée en substrat. Pour une culture en continu, les cellules sont alimentées en permanence avec du milieu nutritif. Un volume égal du mélange biomasse-milieu est ôté afin de maintenir le volume du réacteur constant . Les quantités de biomasse végétale envisageables avec des cultures en bioréacteurs sont variables selon l'espèce végétale, le mode de culture et le type de bioréacteur.
Les cellules de l'invention peuvent aussi être immobilisées, ce qui permet d'obtenir une production constante et prolongée d'αl-AT. La séparation de l'αl- AT et la biomasse végétale est aussi facilitée. Comme méthode d'immobilisation, on peut citer l'immobilisation en billes d'alginate, d'agar, à l'intérieur de mousse de polyuréthane , ou bien encore dans des fibres creuses.
Au lieu de produire l'a!-AT de l'invention par culture de cellules végétales, on peut régénérer des plantes chimériques ou transgéniques à partir d'expiants transformés, en ayant recours à des techniques connues en soi .
Comme plantes préférées, on peut citer toutes les plantes monocotylédones. On peut citer les céréales telles que le blé, le maïs, le riz, l'orge, le sorgho et l'avoine, mais aussi la canne à sucre, l'asperge et la banane.
L'invention concerne également les graines des plantes transgéniques capables de produire l'α^AT ainsi que leurs descendances.
Selon le procédé de l'invention, les protéines sont récupérées, et éventuellement purifiées, afin de permettre leur utilisation dans un grand nombre d ' applications .
Les méthodes de récupération (extraction) et de purification des protéines sont choisies en fonction de la méthode de production, c'est-à-dire cellules en culture ou plantes entières, et éventuellement de l'adressage mis en oeuvre.
L'extraction est normalement faite par broyage des tissus, par exemple feuilles ou grains, dans un tampon approprié, filtrage du broyât, précipitation des protéines dans le surnageant, centrifugation et reprise du culot dans un tampon approprié avec dialyse. Une étape de purification partielle peut aussi être effectuée à ce stade par chromatographie sur colonne d'échangeuse d'ions.
L'invention vise aussi des anticorps monoclonaux ou polyclonaux capables de reconnaître spécifiquement la protéine de l'invention. Ces anticorps peuvent être utilisés dans la purification des protéines de l'invention et dans le suivi des patients.
L'invention vise en outre un produit pharmaceutique comprenant une ou plusieurs protéine (s) de 1 ' invention en association avec un excipient acceptable du point de vue physiologique.
La composition pharmaceutique de l'invention peut être administrée sous forme d'aérosol (particulièrement appropriée, s'il s'agit de l'α!-AT non-glycosylée) pour injection nasale, ou par voie intraveineuse, sous-cutanée, topique ou percutanée.
Il est également possible d'utiliser un implant sous-cutané des cellules végétales transformées sans purification de l'αx-A , isolées dans une membrane semi-perméable laissant passer la protéine active. La ou les protéine (s) de l'invention peut ou peuvent être administrée (s) en forme de liposome (s), encapsidée (s) ou conjuguée (s) à une molécule de ciblage. L'invention vise également l'utilisation de la protéine de l'invention pour la préparation d'un médicament pour le traitement de conditions liées à une déficience en αj-antitrypsine . Les maladies qui sont susceptibles d'être traitées comprennent la mucoviscidose, le choc septique, et l'emphysème pulmonaire. La composition pharmaceutique de l'invention peut aussi être utilisée comme anti- rhumatoïde grâce à son effet anti-collagénase .
Les protéines de l'invention peuvent également être utilisées en cosmétologie. Leur activité anti- collagénase empêche la dégradation du tissu conjonctif et en particulier, du collagène et de l'élastine. Selon cette variante de l'invention, les protéines peuvent être purifiées ou peuvent être utilisées sous forme d'extraits de toute ou partie de la plante ou de la graine ou d'extraits de culture cellulaire.
L'invention vise l'utilisation de la protéine de l'invention dans une application industrielle.
Les protéines de 1 ' invention peuvent aussi être utilisées comme réactifs anti-protéases sous forme de préparations enzymatiques industrielles.
L'invention concerne également un extrait de plante contenant 1 à 90% environ d'une protéine selon l'invention, et notamment 1 'αl-antitrypsine . Cet extrait peut être utilisé comme médicament, notamment en thérapie de conditions liées à une déficience en αx-
AT, notamment l'emphysème pulmonaire, la mucoviscidose, le choc septique ou comme anti- rhumatoïde. L'invention concerne également une composition pharmaceutique comprenant un tel extrait de plante en association avec un excipient acceptable du point de vue physiologique, de préférence pour l'administration par voie orale ou nasale, par exemple sous forme d'aérosol. Des modes de réalisation préférés de l'invention sont présentés dans les revendications, en particulier : 1°) Un procédé de production d'avantitrypsine (α1-AT) , ou de variantes de celle-ci caractérisé par : i) l'introduction dans des cellules végétales monocotylédones, d'un acide nucléique comportant une séquence codant pour 1 ' αx-antitrypsine (αx-AT) ou pour une variante de celle-ci, les variantes se différenciant de l'ai-AT humaine naturelle par une ou plusieurs substitution (s) , délétion(s) ou insertion (s) d'acides aminés, et éventuellement une séquence codant pour un agent sélectif ; ii) sélection des cellules ayant intégré de manière stable l'acide nucléique ; iii) propagation des cellules transformées en culture, ou régénération de plantes entières chimériques ou transgéniques ; iv) récupération et éventuellement purification de 1 'αx-antitrypsine ou de ses variantes, ainsi produites .
2°) Un procédé selon le procédé énoncé au 1°) ci- dessus caractérisé en ce que 1 ' aλ-antitrypsine ou ses variantes présentent une activité d'inhibition de protéases à serine, de préférence une activité de l'a!-AT humaine.
3°) Un procédé selon le procédé énoncé au 2°) ci- dessus caractérisé en ce que l'acide nucléique introduit dans les cellules végétales code pour la protéine illustrée dans la figure 1, ou pour une protéine présentant au moins 90% d'homologie avec celle-ci, ou encore un fragment de l'une de ces protéines ayant une longueur comprise entre 200 et 393 acides aminés.
4°) Un procédé selon le procédé énoncé au 3°) ci- dessus caractérisé en ce que l'acide nucléique comporte en outre une séquence codant pour un peptide signal ou "prepeptide", et éventuellement une séquence codant pour un signal de rétention endoplasmique ou pour un signal d'adressage vacuolaire . °) Un procédé selon l'un quelconque des procédés énoncés au 3°) ou 4°) ci-dessus caractérisé en ce que 1 ' acide nucléique comporte en outre des séquences régulatrices de transcription reconnues par une cellule végétale monocotylédone. °) Une protéine présentant une activité d'inhibiteur de protease à serine, de préférence une activité de 1 ' α^antitrypsine humaine, caractérisée en ce qu'elle est susceptible d'être produite par le procédé selon l'un quelconque des procédés énoncés aux 1°) à 5°) ci-dessus. °) Une protéine selon la protéine énoncée au 6°) ci- dessus caractérisée en ce qu'elle est N-glycosylée par au moins un glycanne de type mannosidique ou polymannosidique, et/ou par au moins un glycanne de type complexe comportant éventuellement au sein de sa structure un ou plusieurs résidus de xylose et éventuellement un ou plusieurs résidus de fucose . °) Une protéine selon la protéine énoncée au 7°) ci- dessus comportant la séquence en acides aminés illustrée dans la figure 1, ou une séquence présentant au moins .90% d'homologie avec cette séquence, ou encore un fragment de l'une de ces séquences ayant une longueur comprise entre 200 et 393 acides aminés. °) Une protéine selon la protéine énoncée au 8°) ci- dessus caractérisée en ce que le glycanne est lié N-glycosidiquement à Asn-46, Asn-83 ou Asn-247. 0°) Une protéine selon l'une quelconque des protéines énoncées précédemment caractérisée en ce qu'elle porte à la fois un ou plusieurs glycannes de type polymannosique et un ou plusieurs glycannes de type complexe . °) Une protéine selon l'une quelconque des protéines énoncées précédemment caractérisée en ce que le glycanne polymannosique présente la structure GlcNAc2-Man5-9, par exemple GlcNAc2-Man9. °) Une protéine selon l'une quelconque des protéines énoncées précédemment caractérisée en ce que le glycanne complexe présente la structure GlcNAc2 (Fuc) Man3 (Xyl) . °) Une protéine selon l'une des protéines énoncées aux 6°) à 12°) ci-dessus caractérisée en ce que la séquence en acides aminés comporte en outre un peptide signal N-terminal, permettant une sécrétion de la protéine et éventuellement un signal responsable de la rétention de la protéine dans le reticulum endoplasmique, ou un signal reconnu par une cellule végétale comme étant un signal d'adressage vacuolaire. °) Une protéine selon la protéine énoncée au 13°) ci-dessus caractérisée en ce que le peptide signal est le prepeptide de la sporamine, de la lectine d'orge, de l'extensine végétale, de l'α-mating factor, des protéines de pathogénèse. °) Une protéine selon la protéine énoncée au 13°) ci-dessus caractérisée en ce que le peptide signal est celui de l 'α-L-antitrypsine native. °) Une protéine selon la protéine énoncée au 13°) ci-dessus caractérisée en ce que le signal responsable de la rétention de la protéine dans le reticulum endoplasmique est choisi parmi les peptides KDEL, SEKDEL et HDEL. °) Une protéine selon la protéine énoncée au 13°) ci-dessus caractérisée en ce que le signal d'adressage vacuolaire est d'origine végétale, tel que celui de la sporamine, ou celui de la lectine d ' orge . °) Une protéine selon la protéine énoncée au 6°) ci- dessus caractérisée en ce qu'elle est exempte de chaînes N-glycosidiques . °) Un acide nucléique comportant : i) une séquence codant pour l'αl-AT ou pour une variante de celle-ci, et ii) une séquence d'adressage choisie parmi une séquence codant pour un peptide signal "pré" d'origine végétale et éventuellement une séquence codant pour un signal de rétention ou pour un signal d'adressage vacuolaire, et iii) des séquences régulatrices de transcription reconnues par une cellule végétale monocotylédone. °) Un acide nucléique selon l'acide nucléique énoncé au 19°) ci-dessus caractérisé en ce que les séquences régulatrices comprennent un ou plusieurs promoteur (s) d'origine végétale ou virale. °) Un acide nucléique selon l'un quelconque des acides nucléiques énoncés aux 19°) et 20°) ci- dessus caractérisé en ce que la séquence codant pour l'α,-AT est un ADNc codant pour l'α^AT mature . °) Un vecteur comprenant un acide nucléique selon l'un quelconque des acides nucléiques énoncés aux 19°) à 21°) . °) Des cellules .végétales monocotylédones transformées de manière stable par un acide nucléique selon l'un quelconque des acides nucléiques énoncés aux 19°) à 21°) ci-dessus, et capable de produire une ou plusieurs protéine (s) ayant une activité d'inhibiteur de protease à serine, de préférence une activité d'α^ antitrypsine . °) Des cellules végétales monocotylédones selon les cellules énoncées au 23°) ci-dessus caractérisées en ce qu'il s'agit d'une culture de cellules végétales, par exemple en milieu liquide ou immobilisées, ou une culture de racines. °) Des cellules végétales selon les cellules énoncées au 24°) ci-dessus caractérisées en ce qu'il s'agit de cellules faisant partie d'une plante monocotylédone transformée. °) Une plante monocotylédone chimérique ou transgénique capable de produire une protéine ayant une activité d'inhibiteur de protease à serine, de préférence une activité d'osantitrypsine, caractérisée en ce qu'elle comporte des cellules selon les cellules énoncées au 23°) ci-dessus . °) Des graines de plante transgénique selon la plante énoncée au 26°) ci-dessus. °) Des anticorps monoclonaux ou polyclonaux capables de reconnaître spécifiquement la protéine selon l'une des protéines énoncées aux 6°) à 18°) ci- dessus . °) un produit pharmaceutique comprenant une ou plusieurs protéine (s) selon l'une quelconque des protéines énoncées aux 6°) à 18°) ci-dessus en association avec un excipient acceptable du point de vue physiologique. °) Une protéine ayant une activité d'αx-AT selon l'une quelconque des .protéines énoncées aux 6°) à 18°) ci-dessus pour l'utilisation comme médicament . °) Une protéine selon la protéine énoncée au 30°) ci-dessus pour une utilisation en thérapie de conditions liées à une déficience en αx-AT, notamment l'emphysème pulmonaire, la mucoviscidose, le choc septique, ou comme anti- rhumâtoïde . 32°) Une utilisation d'une protéine selon l'une quelconque des protéines énoncées aux 6°) à 18°) ci-dessus pour la préparation d'un médicament pour le traitement de conditions liées à une déficience en αx-AT. 33°) Une utilisation d'une protéine selon l'une quelconque des protéines énoncées aux 6°) à 18°) ci-dessus dans la préparation de produits cosmétiques, ou de réactifs chimiques. 34°) Un extrait de plante contenant 1 à 90% environ d'une protéine selon l'une quelconque des protéines énoncées aux 6°) à 18°) ci-dessus, et notamment 1 ' αx-antitrypsine . 35°) Un extrait de plante selon l'extrait énoncé au 34°) ci-dessus pour l'utilisation comme médicament . 36°) Un extrait de plante selon l'extrait énoncé au 35°) ci-dessus pour une utilisation en thérapie de conditions liées à une déficience en αx-AT, notamment l'emphysème pulmonaire, la mucoviscidose, le choc septique ou comme anti- rhumâtoïde . 37°) Une composition pharmaceutique comprenant un extrait de plante selon l'extrait énoncé au 34°) ci-dessus en association avec un excipient acceptable du point de vue physiologique, de préférence pour l'administration par voie orale ou nasale, par exemple sous forme d'aérosol. La Figure 1 illustre l'ADNc et la séquence en acide aminés de l'αl-AT humaine (type M). L'extrémité NH2 de la protéine mature (Glu) est indiqué comme +JL. Les acides aminés -1 à -24 représentent le peptide signal N-terminal de la protéine immature. Le site réactif (Met) est indiqué par un cercle solide (•) . Quatre sites de glycosylation potentiels sont présents dans la protéine, indiqués par des diamants noirs ( ) , mais seulement trois d'entre eux portent des chaînes glycosidiques (Long et al Supra) .
La Figure 2 illustre la carte schématique du plasmide pUC-AAT. L'ADNc de AAT est inséré au site PstI de pUC18. PA (boîte en pointillés) correspond à la séquence du peptide signal AAT. AAT (boîte en noir) correspond à la séquence codant 1 'αl-antitrypsine humaine. Ap (boîte en blanc) correspond au gène conférant la résistance à 1 ' ampicilline.
EXEMPLES I. CONSTRUCTIONS
L 'αl-antitrypsine humaine (AAT), une glycoprotéine de 53 kDa, est naturellement synthétisée sous forme d'un précurseur de 418 acides aminés. La protéine mature AAT est constituée de 394 acides aminés et est clivée au site Ala - Glu de son peptide signal de 24 acides aminés. La séquence complète du cDNA ainsi que la séquence peptidique sont décrites par Long et al . (Biochemistry, 1984, vol. 23, pages
4828-4837) .
La séquence complète de l'ADNc est renfermée dans le plasmide pUC18 commercialisé par Clontech. Ce plasmide est appelé pUC-AAT (Figure 2) .
L'ADNc de AAT, fragment d'ADN digéré par StuI et Sali et isolé à partir de pUC18, a été clone aux sites Xbal traité à la Klenow et Sali du vecteur pBSIISK+ commercialisé par Stratagene Cloning Systems. Le plasmide résultant a été appelé pBIOC30. A. CONSTRUCTION DES VECTEURS pBIOC31 ET pBIOC32. MODIFICATION DE L'EXTREMITE 3' DU cDNA CODANT POUR L ' αl-ANTITRYPSINE
A.l. CONSTRUCTION DU PLASMIDE PBIOC31 NE CONTENANT QUE LE PREMIER CODON STOP DE L'αl- ANTITRYPSINE
Pour favoriser l'expression dans les plantes, seul le premier codon stop (TAA) de la protéine αl- antitrypsine humaine (AAT) a été préservé. Le vecteur pBIOC30 a donc été modifié à l'extrémité 3' du cDNA codant pour AAT.
Le fragment EcoRV-SalI de pBIOC30 a été remplacé par le fragment EcoRV-SalI issu de l'amplification PCR réalisée sur pBIOC30 à l'aide des 2 oligodesoxynucléotides, 5' CCACGATATCATCACCAAGTTCC 3' (contenant le site unique EcoRV) et 5' cggtcgacgaattcCAGTTATTTTTGGGTGGGATTC 3' (contenant les sites Sali et EcoRI , et le premier codon stop de l'AAT). L'amplification PCR du fragment EcoRV-SalI a été réalisée dans 100 μl de milieu réactionnel comprenant 10 μl de tampon Taq DNA polymérase xlO (500 mM KC1, 100 mM Tris-HCl, pH9 , 0 et 1% Triton xlOO) , 6 μl de 25 mM MgCl2, 3 μl de 10 mM dNTP (dATP, dCTP, dGTP et dTTP) , 100 pM de chacun des 2 oligodesoxynucléotides décrits ci-dessus, 5 ng d'ADN matrice (vecteur pBIOC30) , 2,5 U de Taq DNA polymérase (Promega) et 2 gouttes d'huile de vaseline. L'ADN a été dénaturé à 94 °C pendant 5 min. , soumis à 30 cycles constitués chacun de 1 min. de dénaturâtion à 94 °C, 1 min. d'hybridation à 70 °C et de 1 min. d'élongation à 72 °C, puis l'élongation à 72 °C a été poursuivie pendant 5 min. Cette réaction PCR a été réalisée dans la machine "DNA Thermal Cycler" de PERKIN ELMER CETUS . L'huile a été éliminée par extraction au chloroforme. Puis, les fragments d'ADN du milieu réactionnel ont été précipités en présence de 1/10 de volume de 3M acétate de sodium pH4 , 8 et de 2,5 volumes d'éthanol absolu à -80°C pendant 30 min. , centrifugés à 12000g pendant 30 min., lavés à 1 ' éthanol 70%, séchés et digérés par les 2 enzymes de restriction EcoRV et Sali. Les fragments d'ADN digérés issus de PCR ont été purifiés par électrophorèse sur gel d'agarose 2%, électroélués (Sambrook et al., 1989), précipités en présence de 1/10 de volume de 3M acétate de sodium pH4,8 et de 2,5 volumes d'éthanol absolu à -80°C pendant 30 min., centrifugés à 12000g pendant 30 min., lavés à 1 ' éthanol 70%, séchés, puis ligués à l'ADN plasmidique pBIOC30 digéré par EcoRV et Sali, purifié par électrophorèse sur gel d'agarose 0,8%, électroélué, soumis à la précipitation alcoolique, séché et déphosphorylé par l'enzyme phosphatase alcaline d'intestin de veau (Boehringer Mannheim) selon les recommandations du fabricant. La ligation a été réalisée avec 100 ng du vecteur déphosphorylé décrit ci-dessus et 50 ng de fragments d'ADN digérés issus de l'amplification PCR décrits ci-dessus dans un milieu réactionnel de 10 μl en présence de 1 μl de tampon T4 DNA ligase x 10 (Amersham) et de 2,5 U d'enzyme T4 DNA ligase (Amersham) à 14°C pendant 16 heures. Les bactéries, Escherichia coli DH5α rendues préalablement compétentes, ont été transformées (Hanahan, 1983) . L'ADN plasmidique des clones obtenus, sélectionnés sur 50 μg/ml ampicilline, a été extrait selon la méthode de la lyse alcaline (Birnboim et Doly, 1979) et analysé par digestion enzymatique par des enzymes de restriction. L'ADN plasmidique de certains des clones retenus a été vérifié par sequençage a 1 ' aide du kit de sequençage T7 commercialisé par Pharmacia selon la méthode des didésoxynucléotides (Sanger et al., 1977). Le plasmide résultant a été appelé pBI0C31.
A.2. CONSTRUCTION DU PLASMIDE PBIOC32 CONTENANT LE PREMIER CODON STOP DE L ' α-ANTITRYPSINE PRECEDE DU SIGNAL KDEL
La séquence codant le signal KDEL (Lys-Asp-Glu- Leu) placée à l'extrémité C-terminale de la séquence codant la protéine mature αl-antitrypsine humaine en amont du codon stop combinée à la présence de la séquence codant le peptide signal N-terminal de la sporamine A des racines tubérisées de patate douce permet un adressage dans le reticulum endoplasmique.
Pour insérer la séquence codant le signal KDEL avant le premier -codon stop (TAA) de la protéine mature αl-antitrypsine humaine (AAT) qui seul sera préservé, le vecteur pBIOC30 a été modifié à l'extrémité 3' de l'ADNc codant pour AAT. La présence d'un codon Lys juste avant le codon stop de AAT, s'est soldée par l'introduction de la séquence codant le signal DEL uniquement .
Le fragment EcoRV-Sali de pBIOC30 a été remplacé par le fragment EcoRV-SalI issu de l'amplification PCR réalisée sur pBIOC30 à l'aide des 2 oligodesoxynucléotides commandés chez Genset, 5' CCACGATATCATCACCAAGTTCC 3! (contenant le site unique EcoRV) et 5 ' cggtcgacgaattcCAGTTAtagctcatcTTTTTGGGTGGG 3' (contenant les sites Sali et EcoRI, et la séquence KDEL et le premier codon stop de AAT mature) , en suivant le protocole d'amplification PCR décrit ci- dessus dans le paragraphe a.l. Après double digestion enzymatique par EcoRV et Sali, les fragments d'ADN issus de l'amplification PCR ont été purifiés par électrophorèse sur gel d'agarose 2%, électroélués (Sambrook et al., 1989), précipités en présence de 1/10 de volume de 3M acétate de sodium pH4 , 8 et de 2,5 volumes d'éthanol absolu à -80°C pendant 30 min., centrifugés à 12000g pendant 30 min., lavés à 1 ' éthanol 70%, séchés, puis ligués à l'ADN plasmidique de pBIOC30 doublement digéré par EcoRV et Sali, purifié par électrophorèse sur gel d'agarose 0,8%, électroélué (Sambrook et al., 1989), soumis à la précipitation alcoolique, séché et déphosphorylé par l'enzyme phosphatase alcaline d'intestin de veau (Boehringer Mannheim) selon les recommandations du fabricant. La ligation a été réalisée avec 100 ng du vecteur déphosphorylé décrit ci-dessus et 50 ng de fragments d'ADN digérés issus de l'amplification PCR décrits ci-dessus dans un milieu réactionnel de 10 μl en présence de 1 μl de tampon T4 DNA ligase x 10 (Amersham) et de 2,5 U d'enzyme T4 DNA ligase (Amersham) à 14 °C pendant 16 heures. Les bactéries, Escherichia coli DH5α rendues préalablement compétentes, ont été transformées (Hanahan, 1983) . L'ADN plasmidique des clones obtenus, sélectionnés sur 50 μg/ml ampicilline, a été extrait selon la méthode de la lyse alcaline (Birnboim et Doly, 1979) et analysé par digestion enzymatique par des enzymes de restriction. L'ADN plasmidique de certains des clones retenus a été vérifié par sequençage à l'aide du kit de sequençage T7 TM commercialisé par Pharmacia selon la méthode des didésoxynucléotides (Sanger et al., 1977). Le plasmide résultant a été appelé pBIOC32.
B. CONSTRUCTION DES VECTEURS pBIOC33, pBIOC34, pBIOC35 ET pBIOC74. MODIFICATION DE L'EXTREMITE 5' DU cDNA CODANT POUR L ' αl-ANTITRYPSINE
Dans l'une des constructions, la séquence contenant 1 'αl-antitrypsine humaine mature précédée d'une partie de celle de son peptide signal naturel PA (11 derniers codons des 24 nécessaires) est contenue dans pBI0C31. Le clone modifié résultant a été appelé pBIOC74.
Par ailleurs, la séquence codant pour le peptide signal naturel PA de 1 'αl-antitrypsine humaine (24 premiers codons) a été remplacé par celle codant pour un signal d'adressage d'origine végétale en respectant les phases ouvertes de lecture des séquences codant pour le signal d'adressage apporté et la protéine mature αl-antitrypsine humaine. Ce signal d'adressage est soit un peptide signal (PS) qui permettrait une sécrétion de la protéine dans le milieu extracellulaire de l'espace intercellulaire, soit un prépropeptide c'est-à-dire un peptide signal suivi des séquences N-terminales d'adressage vacuolaire (PPS) qui adresserait la protéine dans la vacuole. Les séquences PS et PPS constituées respectivement de 23 et 37 acides aminés, sont celles d'une protéine de réserve des racines tubérisées de patate douce : la sporamine A (Murakami et al., 1986 ; Matsuoka et Nakamura, 1991) . Le plasmide pBI0C31 modifié contenant la séquence codant pour 1 'αl-antitrypsine humaine (AAT) fusionnée soit à PS (PS-AAT) , soit à PPS (PPS- AAT) a été appelé pBIOC33 et pBIOC34 respectivement. Le plasmide pBIOC32 modifié contenant la séquence codant pour 1 'αl-antitrypsine humaine (AAT) fusionnée à PS (PS-AAT-KDEL) a été appelé pBIOC35.
B.l. CONSTRUCTION DU PLASMIDE PBIOC74 CONTENANT PA-AAT.
Le plasmide pBI0C31 a été digéré doublement par Sacl et BamHI pour supprimer les 11 derniers codons de la séquence codant pour le peptide signal naturel PA et le premier codon de 1 'αl-antitrypsine humaine mature. Cette séquence a été remplacée par la séquence entière codant pour le peptide signal naturel PA de 24 acides aminés (ATG CCG TCT TCT GTC TCG TGG GGC ATC CTC CTG CTG GCA GGC CTG TGC TGC CTG GTC CCT GTC TCC CTG GCT) fusionnée au premier codon de la protéine AAT mature (Glu) . La séquence "PS - 3 premiers codons de la protéine AAT mature" a été amplifiée par PCR à partir du plasmide pUC18-AAT à l'aide des 2 oligodesoxynucléotides, 5' gggagctcgaattcaacaATG CCG TCT TCT GTC TCG TG 3' (contenant les sites EcoRI et Sacl et le signal traductionnel de Kozack) et 5 ' G GGG ATC CTC AGC CAG GG3 ' (contenant le site BamHI de la séquence codant pour la protéine AAT mature) , en suivant le protocole d'amplification PCR décrit ci- dessus dans le paragraphe a.l. Après double digestion enzymatique par Sacl et BamHI, les fragments d'ADN issus de l'amplification PCR ont été purifiés par électrophorèse sur gel d'agarose 2%, électroélués
(Sambrook et al., 1989), précipités en présence de 1/10 de volume de 3M acétate de sodium pH4 , 8 et de 2,5 volumes d'éthanol absolu à -80°C pendant 30 min., centrifugés à 12000g pendant 30 min., lavés à 1 ' éthanol 70%, séchés, puis ligués à l'ADN plasmidique de pBIOC31 doublement digéré par Sacl et BamHI, purifié par électrophorèse sur gel d'agarose 0,8%, électroélué (Sambrook et al., 1989), soumis à la précipitation alcoolique, . séché et déphosphorylé par l'enzyme phosphatase alcaline d'intestin de veau
(Boehringer Mannheim) selon les recommandations du fabricant. La ligation a été réalisée avec 100 ng du vecteur déphosphorylé décrit ci-dessus et 50 ng de fragments d'ADN digérés issus de l'amplification PCR décrits ci-dessus dans un milieu réactionnel de 10 μl en présence de 1 μl de tampon T4 DNA ligase x 10
(Amersham) et de 2,5 U d'enzyme T4 DNA ligase
(Amersham) à 14°C pendant 16 heures. Les bactéries, Escherichia coli DH5α rendues préalablement compétentes, ont été transformées (Hanahan, 1983) . L'ADN plasmidique des clones obtenus, sélectionnés sur 50 μg/ml ampicilline, a été extrait selon la méthode de la lyse alcaline (Birnboim et Doly, 1979) et analysé par digestion enzymatique par des enzymes de restriction. L'ADN plasmidique de certains des clones retenus a été vérifié par sequençage à l'aide du kit de sequençage T7 TM commercialise par Pharmacia selon la méthode des didésoxynucléotides (Sanger et al., 1977) . Les séquences du PA et de AAT mature ont été clonées en maintenant leurs phases de lecture ouverte. La séquence de clivage entre les séquences PA et AAT mature est Ala-Glu. Le plasmide résultant a été appelé pBIOC74.
B.2. CONSTRUCTION DU PLASMIDE PBIOC33 CONTENANT PS-AAT.
Le plasmide pBIOC31 a été digéré doublement par Sacl et BamHI pour supprimer la séquence codant pour le peptide signal naturel de 1 'αl-antitrypsine humaine. Cette séquence a été remplacée par celle codant pour le peptide signal PS de 23 acides aminés
(ATG AAA GCC TTC ACA CTC GCT CTC TTC TTA GCT CTT TCC CTC TAT CTC CTG CCC AAT CCA GCC CAT TCC) fusionnée aux 3 premiers codons de la protéine AAT mature (Glu-Asp- Pro) . La séquence "PS - 3 premiers codons de la protéine AAT mature" a été amplifiée par PCR à partir du plasmide pMAT103 (Matuoka et Nakamura, 1991) à l'aide des 2 oligodesoxynucléotides, 5' gcgagctcgaattcaacaATG AAA GCC TTC ACA CTC GC 3 '
(contenant les sites EcoRI et Sacl et le signal traductionnel de Kozack) et 5 ' CT GGG ATC CTC GGA ATG GGC TGG ATT GGG CAG G 3 ' (contenant le site BamHI de la séquence codant pour la protéine AAT mature) , en suivant le protocole d'amplification PCR décrit ci- dessus dans le paragraphe a.l. Après double digestion enzymatique par Sacl et BamHI, les fragments d'ADN issus de l'amplification PCR ont été purifiés par électrophorèse sur gel d'agarose 2%, électroélués (Sambrook et al., 1989), précipités en présence de 1/10 de volume de 3M acétate de sodium pH4 , 8 et de 2,5 volumes d'éthanol absolu à -80°C pendant 30 min., centrifugés à 12000g pendant 30 min., lavés à 1 ' éthanol 70%, séchés, puis ligués à l'ADN plasmidique de pBIOC31 doublement digéré par Sacl et BamHI, purifié par électrophorèse sur gel d'agarose 0,8%, électroélué (Sambrook et al., 1989), soumis à la précipitation alcoolique, séché et déphosphorylé par l'enzyme phosphatase alcaline d'intestin de veau (Boehringer Mannheim) selon les recommandations du fabricant. La ligation a été réalisée avec 100 ng du vecteur déphosphorylé décrit ci-dessus et 50 ng de fragments d'ADN digérés issus de l'amplification PCR décrits ci-dessus dans un milieu réactionnel de 10 μl en présence de 1 μl de tampon T4 DNA ligase x 10 (Amersham) et de 2,5 U d'enzyme T4 DNA ligase (Amersham) à 14 °C pendant 16 heures. Les bactéries, Escherichia coli DH5α rendues préalablement compétentes, ont été transformées (Hanahan, 1983) . L'ADN plasmidique des clones obtenus, sélectionnés sur 50 μg/ml ampicilline, a .été extrait selon la méthode de la lyse alcaline (Birnboim et Doly, 1979) et analysé par digestion enzymatique par des enzymes de restriction. L'ADN plasmidique de certains des clones retenus a été vérifié par sequençage à l'aide du kit de sequençage T7 TM commercialisé par Pharmacia selon la méthode des didésoxynucléotides (Sanger et al., 1977). Les séquences du PS et de AAT mature ont été clonées en maintenant leurs phases de lecture ouverte. La séquence de clivage entre les séquences PS et AAT mature est Ser-Glu. Le plasmide résultant a été appelé pBIOC33.
B.3. CONSTRUCTION DU PLASMIDE PBIOC34 CONTENANT PPS-AAT.
Le plasmide pBIOC31 a été digéré doublement par Sacl et BamHI pour supprimer la séquence codant pour le peptide signal naturel de 1 'αl-antitrypsine humaine. Cette séquence a été remplacée par celle codant pour le prépropeptide PPS N-terminal de 37 acides aminés (ATG AAA GCC TTC ACA CTC GCT CTC TTC TTA GCT CTT TCC CTC TAT CTC CTG CCC AAT CCA GCC CAT TCC AGG TTC AAT CCC ATC CGC CTC CCC ACC ACA CAC GAA CCC GCC) fusionnée aux 3 premiers codons de la protéine AAT mature (Glu-Asp-Pro) . La séquence "PPS - 3 premiers codons de la protéine AAT mature" a été amplifiée par PCR à partir du plasmide pMAT103 (Matuoka et Nakamura, 1991) à l'aide des 2 oligodesoxynucléotides, 5' gcgagctcgaattcaacaATG AAA GCC TTC ACA CTC GC 3' (contenant les sites EcoRI et Sacl et le signal traductionnel de Kozack) et 5 ' CT GGG ATC CTC GGC GGG TTC GTG TGT GGT TG 3' (contenant le site BamHI de la séquence de la protéine AAT mature), en suivant le protocole d'amplification PCR décrit ci-dessus dans le paragraphe a.l. Après double digestion enzymatique par Sacl et BamHI, les fragments d'ADN issus de l'amplification PCR ont été purifiés par électrophorèse sur gel d'agarose 2%, électroélués (Sambrook et al., 1989), précipités en présence de 1/10 de volume de 3M acétate de sodium pH4,8 et de 2,5 volumes d'éthanol absolu à -80°C pendant 30 min., centrifugés à 12000g pendant 30 min., lavés à l' éthanol 70%, séchés, puis ligués à l'ADN plasmidique de pBIOC31 doublement digéré par Sacl et BamHI, purifié par électrophorèse sur gel d'agarose 0,8%, électroélué (Sambrook et al., 1989), soumis à la précipitation alcoolique, séché et déphosphorylé par l'enzyme phosphatase alcaline d'intestin de veau (Boehringer Mannheim) selon les recommandations du fabricant. La ligation a été réalisée avec 100 ng du vecteur déphosphorylé décrit ci-dessus et 50 ng de fragments d'ADN digérés issus de l'amplification PCR décrits ci-dessus dans un milieu réactionnel de 10 μl en présence de 1 μl de tampon T4 DNA ligase x 10 (Amersham) et de 2,5 U d'enzyme T4 DNA ligase (Amersham) à 14°C pendant 16 heures. Les bactéries, Escherichia coli DH5α rendues préalablement compétentes, ont été transformées (Hanahan, 1983) . L'ADN plasmidique des clones obtenus, sélectionnés sur 50 μg/ml ampicilline, a été extrait selon la méthode de la lyse alcaline (Birnboim et Doly, 1979) et analysé par digestion enzymatique par des enzymes de restriction. L'ADN plasmidique de certains des clones retenus a été vérifié par sequençage à l'aide du kit de sequençage T7 TM commercialise par Pharmacia selon la méthode des didésoxynucléotides (Sanger et al., 1977). Les séquences du PPS et de AAT mature ont été clonées en maintenant leurs phases de lecture ouverte. La séquence de clivage entre les séquences PPS et AAT mature est Ala-Glu. Le plasmide résultant a été appelé pBIOC34.
B.4. CONSTRUCTION DU PLASMIDE PBIOC35 CONTENANT PS-AAT-KDEL.
Le plasmide pBIOC32 a été digéré doublement par Sacl et BamHI pour supprimer la séquence codant pour le peptide signal naturel de 1 'αl-antitrypsine humaine. Cette séquence a été remplacée par celle codant pour le peptide signal PS de 23 acides aminés (ATG AAA GCC TTC ACA CTC GCT CTC TTC TTA GCT CTT TCC CTC TAT CTC CTG CCC AAT CCA GCC CAT TCC) fusionnée aux 3 premiers codons de la protéine AAT mature (Glu-Asp- Pro) . La séquence "PS - 3 premiers codons de la protéine AAT mature" a été amplifiée par PCR à partir du plasmide pMAT103 (Matuoka et Nakamura, 1991) à l'aide des 2 oligodesoxynucléotides, 5' gcgagctcgaattcaacaATG AAA GCC TTC ACA CTC GC 3 ' (contenant les sites EcoRI et Sacl et le signal traductionnel de Kozack) et 5 ' CT GGG ATC CTC GGA ATG GGC TGG ATT GGG CAG G 3' (contenant le site BamHI de la séquence de la protéine AAT mature) , en suivant le protocole d'amplification PCR décrit ci-dessus dans le paragraphe a.l. Après double digestion enzymatique par Sacl et BamHI, les fragments d'ADN issus de l'amplification PCR ont été purifiés par électrophorèse sur gel d'agarose 2%, électroélués (Sambrook et al., 1989), précipités en présence de 1/10 de volume de 3M acétate de sodium pH4 , 8 et de 2,5 volumes d'éthanol absolu à -80°C pendant 30 min., centrifugés à 12000g pendant 30 min., lavés à 1 ' éthanol 70%, séchés, puis ligués à l'ADN plasmidique de pBIOC32 doublement digéré par Sacl et BamHI, purifié par électrophorèse sur gel d'agarose 0,8%, électroélué (Sambrook et al., 1989), soumis à la précipitation alcoolique, séché et déphosphorylé par l'enzyme phosphatase alcaline d'intestin de veau (Boehringer Mannheim) selon les recommandations du fabricant. La ligation a été réalisée avec 100 ng du vecteur déphosphorylé décrit ci-dessus et 50 ng de fragments d'ADN digérés issus de l'amplification PCR décrits ci-dessus dans un milieu réactionnel de 10 μl en présence de 1 μl de tampon T4 DNA ligase x 10 (Amersham) et de 2,5 U d'enzyme T4 DNA ligase (Amersham) à 14 °C pendant 16 heures. Les bactéries, Escherichia coli DH5α rendues préalablement compétentes, ont été transformées (Hanahan, 1983) . L'ADN plasmidique des clones obtenus, sélectionnés sur 50 μg/ml ampicilline, a été extrait selon la méthode de la lyse alcaline (Birnboim et Doly, 1979) et analysé par digestion enzymatique par des enzymes de restriction. L'ADN plasmidique de certains des clones retenus a été vérifié par sequençage à l'aide du kit de sequençage T7 TM commercialisé par Pharmacia selon la méthode des didésoxynucléotides (Sanger et al., 1977). Les séquences du PS et de AAT mature ont été clonées en maintenant leurs phases de lecture ouverte. La séquence de clivage entre les séquences PS et AAT mature est Ser-Glu. Le plasmide résultant a été appelé pBIOC35.
C. CONSTRUCTION DES PLASMIDES UTILISABLES EN TRANSFORMATION GENETIQUE DU MAIS PAR BIOLISTIQUE
Cl. EXPRESSION CONSTITUTIVE : Construction de PPAR-IAR-PA-AAT, pPAR-IAR-PS-AAT, pPAR-IAR-PS-AAT-KDEL et pPAR-IAR-PPS-AAT.
L'expression constitutive dans le maïs a nécessité, entre autre, les séquences régulatrices suivantes :
- promoteur actine de riz suivi de 1 ' intron actine de riz (pAR-IAR) contenu dans le plasmide pActl-F4 décrit par McElroy et al . (1991) ; la séquence terminatrice de transcription, terminateur polyA NOS, qui correspond à la région en 3 ' non codante du gène de la nopaline synthase du plasmide Ti d ' Agrobacterium tumefaciens souche à nopaline (Depicker et al . , 1982).
Le plasmide pBSII-PAR-IAR-tNOS, dans lequel ont été insérées les séquences codant "PA-AAT", "PS-AAT", "PS-AAT-KDEL" et "PPS-AAT", est décrit par exemple dans la demande de brevet 09633277 qui est incorporée par référence.
Les séquences, codant "PA-AAT", "PS-AAT", "PS- AAT-KDEL" et "PPS-AAT", ont été isolées par digestion enzymatique EcoRI respectivement à partir de pBIOC74, pBIOC33, pBIOC35 et pBIOC34. Les fragments digérés ont été purifiés par électrophorèse sur gel d'agarose à 0,8%, puis soumis à 1 ' électroélution, à la précipitation alcoolique, séchés, repris dans H2O. Ils ont été traités par action de l'enzyme Klenow (New England Biolabs) selon les recommandations du fabricant. Ils ont été insérés dans le plasmide pBSII- PAR-IAR-tNOS digéré doublement par Sali et Ncol, purifié, traité à l'enzyme Mung Bean Nucléase (New England Biolabs) et déphosphorylé par l'enzyme phosphatase alcaline de veau (Boehringer Mannheim) selon les recommandations des fabricants. La ligation a été réalisée avec 20 ng du vecteur déphosphorylé et 200 ng de fragments d'ADN contenant la séquence codant "PA-AAT", "PS-AAT", "PS-AAT-KDEL" ou "PPS-AAT", décrits ci-dessus, dans un milieu réactionnel de 20 μl en présence de 2 μl de tampon T4 DNA ligase x 10 (Amersham) , de 2 μl de 50% polyethylène glycol 8000 et de 5 U d'enzyme T4 DNA ligase (Amersham) à 14°C pendant 16 heures. Les bactéries, Escherichia coli
DH5a rendues préalablement compétentes, ont été transformées (Hanahan, 1983) . L'ADN plasmidique des clones obtenus, sélectionnés sur 50 μg/ml ampicilline, a été extrait selon la méthode de la lyse alcaline (Birnboim et Doly, 1979) et analysé par digestion enzymatique par des enzymes de restriction. Les plasmides résultants ont été appelés pPAR-IAR-PA-AAT, pPAR-IAR-PS-AAT, pPAR-IAR-PS-AAT-KDEL et pPAR-IAR-PPS- AAT. C.2. EXPRESSION DANS L'ALBUMEN DES SEMENCES DE MAIS
C.2.1 CONSTRUCTION DE pPgzéine-PA-AAT . pPgzéine-PS-AAT, pPgzéine-PS-AAT-KDEL et pPgzéine-PPS- AAT.
L'expression dans l'albumen des semences de maïs a nécessité, entre autre, les séquences régulatrices suivantes : le promoteur du gène gamma (g) zéine de maïs
(Pgzéine) contenu dans le plasmide p63 est décrit dans
Reina et al . , 1990. Le plasmide p63 résulte du clonage de Pgzéine, en remplacement du promoteur 35S (P35S) , aux sites HindiII et Xbal du plasmide pUC18 renfermant, entre ses sites HindiII et EcoRI, la cassette d'expression "P35S-gus-TNOS" de pBI221 commercialisé par Clontech. Il permet une expression dans l'albumen des semences de maïs. la séquence terminatrice de transcription, terminateur polyA NOS, qui correspond à la région en 3 ' non codante du gène de la nopaline synthase du plasmide Ti d' Agrrojbacte ium tumefaciens souche à nopaline (Depicker et al . , 1982).
Les plasmides pPgzéine-PA-AAT, pPgzéine-PS-AAT, pPgzéine-PS-AAT-KDEL et . pPgzéine-PPS-AAT où les séquences codant "PA-AAT", "PS-AAT", "PS-AAT-KDEL" ou "PPS-AAT" ont été placées sous contrôle du Pgzéine, ont été obtenus par clonage aux sites, Sacl et BamHI, traités par 1 ' enzyme T4 DNA polymérase (New England Biolabs), puis déphosphorylés par l'enzyme phosphatase alcaline de veau (Boehringer Mannheim) du plasmide p63 , des fragments EcoRI traité à la Klenow (New England Biolabs) isolé à partir de pBIOC74 , pBIOC33, pBIOC35 et pBIOC34. La ligation a été réalisée comme décrite dans l'exemple Cl. Les bactéries, Escherichia coli DH5a rendues préalablement compétentes, ont été transformées (Hanahan, 1983) . L'ADN plasmidique des clones obtenus, sélectionnés sur 50 μg/ml ampicilline, a été extrait selon la méthode de la lyse alcaline et analysé par digestion enzymatique par des enzymes de restriction. Les clones résultants ont été appelés pPgzeine-PA-AAT, pPgzéine-PS-AAT, pPgzéine-PS-AAT-KDEL et pPgzeine-PPS-AAT.
D. CONSTRUCTION DES PLASMIDES UTILISABLES EN TRANSFORMATION GENETIQUE DU MAIS PAR Agrobacterium tumefaciens .
Les plasmides pSB-PA-AAT, pSB-PS-AAT, pSB-PS-AAT-KDEL, pSB-PPS-AAT, qui portent une réplication de pBR322 et un gène de résistance à la spectinomycine, ont été obtenus par insertion d'un plasmide binaire possédant des régions ori et cos, construit selon les méthodes décrites dans les brevets WO 9400977 et WO 9506722 entre les bordures droite et gauche du T-DNA des cassettes d'expression "promoteur actine de riz-intron actine de riz-gène bar-terminateur NOS" et respectivement PA-AAT sous contrôle de PAR-IAR ou Pgzéine, PS-AAT sous contrôle de PAR-IAR ou Pgzéine, PS-AAT-KDEL sous contrôle de PAR-IAR ou Pgzéine et PPS-AAT sous contrôle de PAR-IAR ou Pgzéine. Les plasmides obtenus ont été introduits dans Agrobacterium tumefaciens souche LBA4404 (pSBl) décrite par Ishida et al . (Nature Biotechnology, 1996,
14 : 745-750) . Les bactéries résultantes contiennent les cointégrats de pSBl et respectivement de pSB-PA- AAT, pSB-PS-AAT, pSB-PS-AAT-KDEL, pSB-PPS-AAT. II. OBTENTION DE PLANTES DE MAÏS TRANSGENIQUES.
A. Obtention et utilisation de cal de maïs comme cible pour la transformation génétique.
La transformation génétique du maïs, quelle que soit la méthode employée (électroporation; AgroJbac eriu.77, microfibres, canon à particules), requiert généralement l'utilisation de cellules indifférenciées en divisions rapides ayant conservé une aptitude à la régénération de plantes entières. Ce type de cellules compose le cal friable embryogène (dit de type II) de maïs .
Ces cals sont obtenus à partir d'embryons immatures de génotype Hl II ou (A188 x B73) selon la méthode et sur les milieux décrits par Armstrong (1994) . Les cals ainsi obtenus sont multipliés et maintenus par repiquages successifs tous les quinze jours sur le milieu d'initiation.
Des plantules sont ensuite régénérées à partir de ces cals en modifiant l'équilibre hormonal et osmotique des cellules selon la méthode décrite par Vain et al . (1989) . Ces plantes sont ensuite acclimatées en serre où elles peuvent être croisées ou autofécondées .
B. Utilisation du canon à particules pour la transformation génétique du maïs.
Le paragraphe précédent décrit l'obtention et la régénération des lignées cellulaires nécessaires à la transformation ; on décrit ici une méthode de transformation génétique conduisant à l'intégration stable des gènes modifiés dans le génome de la plante. Cette méthode repose sur l'utilisation d'un canon à particules ; les cellules cibles sont des fragments de cals décrits dans le paragraphe 1. Ces fragments d'une surface de 10 à 20 mm2 ont été disposés, 4 h avant bombardement, à raison de 16 fragments par boite au centre d'un boite de pétri contenant un milieu de culture identique au milieu d'initiation, additionné de 0,2 M de mannitol + 0,2 M de sorbitol . Les plasmides portant les gènes à introduire sont purifiés sur colonne Qiagen, en suivant les instructions du fabricant. Ils sont ensuite précipités sur des particules de tungsten (M10) en suivant le protocole décrit par Klein (1987) . Les particules ainsi enrobées sont projetées vers les cellules cibles à l'aide du canon et selon le protocole décrit par J. Finer (1992) .
Les boites de cals ainsi bombardées sont ensuite scellées à l'aide de Scellofrais®, puis cultivées à l'obscurité à 27°C Le premier repiquage a lieu 24 h après, puis tous les quinze jours pendant 3 mois sur milieu identique au milieu d'initiation additionné d'un agent sélectif. Les agents sélectifs utilisables consistent généralement en composés actifs de certains herbicides (Basta®, Round up®,) ou certains antibiotiques (Hygromycine, Kanamycine ... ) .
On obtient après 3 mois ou parfois plus tôt, des cals dont la croissance n'est pas inhibée par l'agent de sélection, habituellement et majoritairement composés de cellules résultant de la division d'une cellule ayant intégré dans son patrimoine génétique une ou plusieurs copies, du gène de sélection. La fréquence d'obtention de tels cals est d'environ 0,8 cal par boite bombardée .
Ces cals sont identifiés, individualisés, amplifiés puis cultivés de façon à régénérer des plantules. Afin d'éviter toute interférence avec des cellules non transformées toutes ces opérations sont menées sur des milieux de culture contenant l'agent sélectif. Les plantes ainsi régénérées sont acclimatées puis cultivées en serre où elles peuvent être croisées ou autofécondées .
C. Utilisation d*Agrobacterium tumefaciens pour la transformation génétique du maïs.
La technique utilisée est décrite par Ishida et al . (Nature Biotechnology, 1996, 14 : 745-750).
III. : ANALYSE DE L'EXPRESSION DE L ' αl-ANTITRYPSINE HUMAINE DANS LES GRAINES DE MAIS :
Le protocole d'extraction de 1 'αl-antitrypsine pour la réalisation des tests ELISA et des Western blot, à partir de graines de maïs est le suivant : 100 mg de graines sont broyées dans l'azote liquide puis dans 1 ml de tampon Tris-HCl lOOmM pH 8 additionné d'EDTA ImM, de dithiotréitol ImM et de NaCl 250 mM. Le broyât est conservé à 4°C pour macération pendant 2 heures, puis centrifugé à 4°C pendant 10 min à 10000g.
Sur le surnageant de centrifugation, un dosage des protéines solubles est réalisé par la méthode de Bradford (1976) .
Immunodétection par Western blot
Les protéines extraites selon le protocole ci- dessus sont dénaturées par chauffage à 95°C pendant 5 min en présence de tampon Tris-HCl 50 mM pH6,8, SDS 4%, β-mercaptoéthanol 1%, saccharose 20% et bleu de bromophénol 0,01%. Les protéines sont ensuite séparées par électrophorèse sur gel de polyacrylamide en conditions dénaturantes selon la technique de Laemmli (1970) à raison de 30 μg de protéines solubles par échantillon. Après migration, les protéines sont transférées sur une membrane de nitrocellulose. Un anticorps polyclonal anti-αi-antitrypsine obtenu chez le lapin (Dako) est utilisé comme sonde et la révélation est effectuée au moyen d'un anticorps anti- immunoglobulines de lapin marqué à la phosphatase alcaline (Sigma) .
Purification partielle de 1 ' αl-antitrypsine à partir de graines de maïs :
L'extrait protéique est passé sur colonne d'héparine BIORAD, colonne échangeuse d'anions Mono Q, et une colonne gel filtration Superdex 75.
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Claims

REVENDICATIONS
1 - Procédé de production d 'αi-antitrypsine (αx-
AT) , ou de variantes de celle-ci caractérisé par : i) l'introduction dans des cellules végétales monocotylédones, d'un acide nucléique comportant une séquence codant pour 1 ' αx-antitrypsine (αl-AT) ou pour une variante de celle-ci, les variantes se différenciant de l'a!-AT humaine naturelle par une ou plusieurs substitution (s) , délétion (s) ou insertion(s) d'acides aminés, et éventuellement une séquence codant pour un agent sélectif ; ii) sélection des cellules ayant intégré de manière stable l'acide nucléique ; iii) propagation des cellules transformées en culture, ou régénération de plantes entières chimériques ou transgéniques ; iv) récupération et éventuellement purification de l 'α^antitrypsine ou de ses variantes, ainsi produites.
2 - Procédé selon la revendication 1 caractérisé en ce que 1 ' αi-antitrypsine ou ses variantes présentent une activité d'inhibition de protéases à serine, de préférence une activité de l'αi- T humaine.
3 - Procédé selon la revendication 2 caractérisé en ce que l'acide nucléique introduit dans les cellules végétales code .pour la protéine illustrée dans la figure 1, ou pour une protéine présentant au moins 90% d'homologie avec celle-ci, ou encore un fragment de l'une de ces protéines ayant une longueur comprise entre 200 et 393 acides aminés.
4 - Procédé selon la revendication 3 caractérisé en ce que 1 ' acide nucléique comporte en outre une séquence codant pour un peptide signal ou "prepeptide", et éventuellement une séquence codant pour un signal de rétention endoplasmique ou pour un signal d'adressage vacuolaire.
5 - Procédé selon l'une quelconque des revendications 3 ou 4 caractérisé en ce que l'acide nucléique comporte en outre des séquences régulatrices de transcription reconnues par une cellule végétale monocotylédone .
6 - Protéine présentant une activité d'inhibiteur de protease à serine, de préférence une activité de 1 'α^antitrypsine humaine, caractérisée en ce qu'elle est susceptible d'être produite par le procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 5.
7 - Protéine selon la revendication 6 caractérisée en ce qu'elle est N-glycosylée par au moins un glycanne de type mannosidique ou polymannosidique, et/ou par au moins un glycanne de type complexe comportant éventuellement au sein de sa structure un ou plusieurs résidus de xylose et éventuellement un ou plusieurs résidus de fucose.
8 - Protéine selon la revendication 7 comportant la séquence en acides aminés illustrée dans la figure 1, ou une séquence présentant au moins 90% d'homologie avec cette séquence, ou encore un fragment de l'une de ces séquences ayant une longueur comprise entre 200 et 393 acides aminés.
9 - Protéine selon la revendication 8 caractérisée en ce que . le glycanne est lié N- glycosidiquement à Asn-46, Asn-83 ou Asn-247.
10 - Protéine selon l'une quelconque des revendications précédentes caractérisée en ce qu'elle porte à la fois un ou plusieurs glycannes de type polymannosique et un ou plusieurs glycannes de type complexe .
11 - Protéine selon l'une quelconque des revendications précédentes caractérisée en ce que le glycanne polymannosique présente la structure GlcNAc2- Man5_9, par exemple GlcNAc2-Man9.
12 - Protéine selon l'une quelconque des revendications précédentes caractérisée en ce que le glycanne complexe présente la structure GlcNAc2 (Fuc) Man3 (Xyl) .
13 - Protéine selon l'une des revendications 6 à 12 caractérisée en ce que la séquence en acides aminés comporte en outre un peptide signal N-terminal, permettant une sécrétion de la protéine et éventuellement un signal responsable de la rétention de la protéine dans le reticulum endoplasmique, ou un signal reconnu par une cellule végétale comme étant un signal d'adressage vacuolaire.
14 - Protéine selon la revendication 13 caractérisée en ce que le peptide signal est le prepeptide de la sporamine, de la lectine d'orge, de l'extensine végétale, de l'α-mating factor, des protéines de pathogénèse.
15 - Protéine selon la revendication 13 caractérisée en ce que le peptide signal est celui de 1 ' α^antitrypsine native.
16 - Protéine selon la revendication 13 caractérisée en ce que le signal responsable de la rétention de la protéine dans le reticulum endoplasmique est choisi parmi les peptides KDEL, SEKDEL et HDEL.
17 - Protéine selon la revendication 13 caractérisée en ce que le signal d'adressage vacuolaire est d'origine végétale, tel que celui de la sporamine, ou celui de la lectine d'orge.
18 - Protéine selon la revendication 6 caractérisée en ce qu'elle est exempte de chaînes N- glycosidiques .
19 - Acide nucléique comportant : i) une séquence codant pour l'αχ-AT ou pour une variante de celle-ci, et ii) une séquence d'adressage choisie parmi une séquence codant pour un peptide signal "pré" d'origine végétale et éventuellement une séquence codant pour un signal de rétention ou pour un signal d'adressage vacuolaire, et iii) des séquences régulatrices de transcription reconnues par une cellule végétale monocotylédone .
20 - Acide nucléique selon la revendication 19 caractérisé en ce que les séquences régulatrices comprennent un ou plusieurs promoteur (s) d'origine végétale ou virale.
21 - Acide nucléique selon l'une quelconque des revendications 19 et 20 caractérisé en ce que la séquence codant pour l'a,-AT est un ADNc codant pour 1 'αx-AT mature .
22 - Vecteur comprenant un acide nucléique selon l'une quelconque des revendications 19 à 21.
23 - Cellules végétales monocotylédones transformées de manière stable par un acide nucléique selon l'une quelconque des revendications 19 à 21, et capable de produire une ou plusieurs protéine (s) ayant une activité d'inhibiteur de protease à serine, de préférence une activité d'αi-antitrypsine.
24 - Cellules végétales monocotylédones selon la revendication 23 caractérisées en ce qu'il s'agit d'une culture de cellules végétales, par exemple en milieu liquide ou immobilisées, ou une culture de racines .
25 - Cellules végétales selon la revendication 24 caractérisées en ce qu'il s'agit de cellules faisant partie d'une plante monocotylédone transformée.
26 - Plante monocotylédone chimérique ou transgénique capable de produire une protéine ayant une activité d'inhibiteur de protease à serine, de préférence une activité d' α!-antitrypsine, caractérisée en ce qu'elle comporte des cellules selon la revendication 23.
27 - Graines de plante transgénique selon la revendication 26.
28 - Anticorps monoclonaux ou polyclonaux capable de reconnaître spécifiquement la protéine selon les revendications 6 à 18.
29 - Produit pharmaceutique comprenant une ou plusieurs protéine (s) selon l'une quelconque des revendications 6 à 18 en association avec un excipient acceptable du point de vue physiologique.
30 - Protéine ayant une activité d'αχ-AT selon les revendications 6 à 18 pour l'utilisation comme médicament .
31 - Protéine selon la revendication 30 pour une utilisation en thérapie de conditions liées à une déficience en αx-AT, notamment l'emphysème pulmonaire, la mucoviscidose, le choc septique, ou comme anti- rhumâtoïde .
32 - Utilisation d'une protéine selon l'une quelconque des revendications 6 à 18 pour la préparation d'un médicament pour le traitement de conditions liées à une déficience en αi-AT.
33 - Utilisation d'une protéine selon l'une quelconque des revendications 6 à 18 dans la préparation de produits cosmétiques, ou de réactifs chimiques .
34 - Extrait de plante contenant 1 à 90% environ d'une protéine selon l'une quelconque des revendications 6 à 18, et notamment 1 'αl-antitrypsine.
35 - Extrait de plante selon la revendication 34 pour l'utilisation comme médicament.
36- Extrait de plante selon la revendication 35 pour une utilisation en thérapie de conditions liées à une déficience en α^AT, notamment l'emphysème pulmonaire, la mucoviscidose, le choc septique ou comme anti-rhumatoïde.
37- Composition pharmaceutique comprenant un extrait de plante selon la revendication 34 en association avec un excipient acceptable du point de vue physiologique, de préférence pour l'administration par voie orale ou nasale, par exemple sous forme d' aérosol .
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