FR2712888A1 - Utilisation de alpha-D-alkylglucopyranosides et esters de ceux-ci pour la préparation de prodrogues capables de traverser la barrière hématoencéphalique, prodrogues obtenues et précurseurs de celles-ci. - Google Patents

Abstract

L'invention concerne notamment l'utilisation, comme transporteurs de médicaments vers le système nerveux central (SNC), de alpha-D-alkylglucopyranosides et esters de ceux-ci ayant la formule générale (I): (CF DESSIN DANS BOPI) dans laquelle R1 est un radical alkyle, linéaire ou ramifié, en C2 à C1 8 ; R2 est un groupe -CO-R où R est un radical hydrocarboné, linéaire ou ramifié, saturé ou éthyléniquement insaturé, en C5 à C1 7 , ou un groupe -CO-(CH2 )n -COOH où n = 4 à 14; R3 et R4 sont chacun, indépendamment, H ou le reste -CO-R' d'un acide gras HOOC-R' où R' est un radical hydrocarboné, linéaire ou ramifié, saturé ou éthyléniquement insaturé en C5 à C1 7 , avec la condition qu'un seul des groupes R3 et R4 soit un reste -CO-R'.

Description

L'invention concerne l'utilisation de D-alkyl-

glucopyranosides et esters de ceux-ci pour la préparation de

prodrogues capables de traverser la barrière hémato-

encéphalique, les prodrogues obtenues et des précurseurs de celles-ci. Le système nerveux central (SNC) est protégé des variations de concentrations des différents nutriments présents dans le compartiment sanguin. Cette protection lui est conférée par une barrière qui le sépare du sang: la barrière hémato-encéphalique (BHE). Très sélective, elle lui assure toutefois un approvisionnement constant dans les différentes substances dont il a besoin pour son fonctionnement. Cependant, cette barrière peut devenir un obstacle majeur quand un dysfonctionnement apparaît au sein du SNC, comme peuvent le provoquer certains virus, certaines bactéries, les tumeurs cancéreuses, les manifestations épileptiques et autres maladies neurodégénératives (maladie d'Alzheimer, de Parkinson, chorée de Huntington). En effet, le transport de médicaments au sein du SNC, au travers de la BHE, à un niveau de concentration o ils seraient efficaces, est difficile, voire même impossible. Ce transfert constitue souvent l'étape limitante dans le traitement des affections centrales. Le cas des maladies neurodégénératives, et, en particulier, les démences séniles de type Alzheimer, représentent un nouveau défi pour l'industrie pharmaceutique car ce type de démence progresse avec l'accroissement du vieillissement de la population. Les dernières estimations pour les Etats-Unis donnent les chiffres de 4 millions de patients aujourd'hui, et en prévoient 23 millions dans le

monde en l'an 2000 dont 5 à 8 millions pour les seuls Etats-

Unis. L'enjeu économique est énorme: plus de 2 milliards de dollars par an seront nécessaires pour le traitement de ces

maladies.

Il existe donc un besoin pour un moyen qui permettrait d'améliorer le passage à travers la BHE de substances actives, qui ne passent normalement pas ou très peu à travers la BHE, afin qu'elles puissent agir plus

efficacement sur le SNC.

La présente invention vise à fournir un tel moyen.

Plus particulièrement, la présente invention concerne l'utilisation, comme transporteurs de médicaments vers le système nerveux central (SNC), de a-D-alkylglucopyranosides et esters de ceux-ci ayant la formule générale (I):

CH2OR2

(I) OR

HO OR1

OR3 dans laquelle R1 est un radical alkyle, linéaire ou ramifié, en C2 à Cl., de préférence n-butyle; R2 est un groupe -CO-R o R est un radical hydrocarboné, linéaire ou ramifié, saturé ou éthyléniquement insaturé, en C5 à C17, ou un groupe -CO-(CH2),-COOH o n = 4 à 14; R3 et R4 sont chacun, indépendamment, H ou le reste -CO-R' d'un acide gras HOOC-R' o R' est un radical hydrocarboné, linéaire ou ramifié, saturé ou éthyléniquement insaturé en Cs à C17, avec la condition qu'un seul des groupes R3 et R4 soit un reste

-CO-R'.

L'invention est basée sur la découverte qu'on peut améliorer le passage de médicaments ou de neurotransmetteurs à travers la BHE par fixation de ceux-ci sur des composés transporteurs liposolubles appropriés. Les produits résultants appelés "prodrogues" (couple transporteur/composé actif) sont capables de traverser la BHE du fait qu'ils sont

plus liposolubles que le composé actif individuel.

Pour obtenir une liposolubilité adéquate, il convient, bien entendu, de choisir un transporteur adapté au composé

actif à transporter.

Les composés de formule (I) définis ci-dessus se prêtent bien à la fixation de composés actifs contenant un groupe carboxylique libre qui ne diffusent pas, ou très peu, à travers la BHE. En effet, les groupes - OH disponibles sur les composés de formule (I) sont estérifiables par de tels composés avec production d'esters dont certains sont capables de franchir la BHE en proportion accrue par rapport

au composé actif de départ. Dans le cas o R2 est un groupe -

CO-(CH2)n-COOH, ils se prêtent également à la fixation de composés actifs contenant un groupe amino ou hydroxyle primaire libre. En effet, le groupe amino ou hydroxyle peut

réagir avec le groupe carboxyle libre du groupe -CO-(CH2),-

COOH avec production d'amides ou d'esters.

Les composés résultants qui sont capables de franchir

la BHE sont ceux qui présentent un caractère liposoluble.

Des exemples non limitatifs de composés hydrosolubles contenant un groupe carboxyle libre, ayant un intérêt pharmacologique en tant que médicaments ou en tant que neurotransmetteurs mais dont l'utilisation pour traiter des désordres ou maladies du SNC n'a pas donné jusqu'à ce jour les résultats escomptés en raison de leur trop faible transfert à travers la BHE, sont les acides aminés par exemple l'acide gamma- aminobutyrique (GABA) et ses dérivés, la glycine, la DOPA et autres, des peptides courts (de 2 à 4 acides aminés, par exemple) et certains composés à action anti-inflammatoire qui comprennent un groupe carboxyle comme

le Diclofenac .

Selon le composé de formule (I) particulier utilisé, on peut faire réagir 2 ou 3 molécules de composé carboxylique par molécule de composé de formule (I), selon que ce dernier

comprend 2 ou 3 groupes -OH libres.

Des exemples non limitatifs de composés actifs hydrosolubles contenant un groupe amino ou hydroxyle réactif libre sont la dopamine, la sérotonine, etc.... On peut faire réagir une molécule de composé aminé ou hydroxylé par molécule de composé de formule (I) comprenant un groupe R2 à

groupe carboxyle libre.

Les composés de formule (I) utiles aux fins de l'invention sont ceux qui ont un caractère lipophile. La lipophilie d'un composé donné peut être déterminée à partir de son coefficient de partage P dans un mélange eautoluène (1: 1, en volume): p = Ctol/C.eau o Cto1 est la concentration du composé dans la phase "toluène", et C.eau est la concentration du composé dans la phase aqueuse et est exprimée ci-après par la valeur Log P:

Log P = LogC -Log Cto - Log Cu.

La concentration du composé dans chacune des phases peut être mesurée par dosage colorimétrique à l'anthrone

(A.ax=625 nm).

Compte tenu de la sensibilité des méthodes de mesure, les valeurs de Log P mesurées peuvent varier de -3 pour des composés fortement hydrosolubles, tels que le glucose, à +3 pour les molécules fortement liposolubles, comme le benzène

ou l'octanol.

Dans le cas d'un composé de formule (I), il faut qu'il présente une valeur de Log P d'au moins 0,50, de préférence d'au moins 1,4, de façon que sa lipophilie puisse contrebalancer l'hydrophilie attachée au composé actif avec

lequel il sera mis à réagir.

L'invention concerne également les composés, appelés ci-après prodrogues, obtenus comme résultat de la réaction des groupes -OH libres ou du groupe -COOH libre des composés

de formule (I) par un composé réactif avec ledit groupe -

COOH ou lesdits groupes -OH.

Plus particulièrement, l'invention concerne les prodrogues répondant à la formule générale (II): CH20B

/O-E

A (II)

1R1

A-0OR

OD o R1 est un radical alkyle, linéaire ou ramifié, en C2 à C18, de préférence n-butyle; A est H, -CO-R" o R" est un radical hydrocarboné, linéaire ou ramifié, saturé ou éthyléniquement insaturé en C1 à C17, ou le reste -CO-X d'un composé actif HOOC-X comportant un groupe carboxyle réactif; B est un reste -CO-R' d'un acide gras HOOC-R' o R' est un radical hydrocarboné, linéaire ou ramifié, saturé ou

éthyléniquement insaturé en C5 à C17, ou bien un groupe -CO-

(CH2)n-COO-W o n = 4 à 14 et W est le reste d'un composé actif comportant un groupe amino primaire ou hydroxyle primaire; D et E sont chacun, indépendamment, H ou un reste -CO-X ou -CO-R'; avec les conditions que (i) lorsque B est -CO-R', au moins deux des groupes A, D et E sont -CO-X, et (ii) lorsque B est -CO-(CH2),-COO-W, A, D et E sont H, -CO-R'

ou -CO-R".

L'invention concerne aussi des précurseurs de prodrogues de la formule II, qui répondent à la formule générale III: o

CH20C-R'

-C-Z\

( III)

X -C-O

"e 0 C - Z

0 "

0

o R1 est tel que défini ci-dessus, le groupement -CO-X' est le reste d'un acide aminé ou d'un peptide dont le ou les groupes amino sont protégés, -CO-Z est un groupement -CO-X' ou un groupement -CO-R' tel que défini ci-dessus, au moins

un des groupes -CO-Z étant -CO-X'.

De préférence le groupe amino de l'acide aminé est

protégé par un groupe t-butyloxy-carbamate (en abrégé t-

Boc). Les composés de formule (I) peuvent être préparés par estérification enzymatique de l'a-D-alkylglucopyranoside approprié par un acide gras en C6-C18 ou par un diacide dicarboxylique en C6-C16 dans un solvant non polaire, tel que l'hexane, au reflux et en présence d'une lipase. Des exemples non limitatifs de lipases utilisables sont la lipase de Mucor miehei adsorbée sur une résine anionique, telle que le produit Lipozyme ou la lipase de Candida antartica, telle que le produit Novozym , toutes deux vendues par la Société NOVO INDUSTRI (Danemark). Cette estérification produit principalement le monoester en

position 6 avec un peu de diester en position 2, 6. Le 6-

monoester peut être ensuite estérifié dans des conditions

similaires pour donner le 2,6-diester. Les a-D-

alkylglucopyranosides de départ sont des composés disponibles dans le commerce ou pouvant être obtenus par

résolution enzymatique d'un mélange commercial de a- et B-

D-alkylglucopyranosides à l'aide d'une B-glucosidase.

Des acides gras utilisables sont, par exemple, l'acide laurique, l'acide palmitique, l'acide stéarique, l'acide

linoléique, l'acide oléique, etc...

Des diacides dicarboxyliques utilisables ont la formule HOOC-(CH2),-COOH o n = 4 à 14. L'acide adipique et l'acide

hexadécanedioïque sont des diacides préférés.

Certains des composés de formule (II), peuvent être préparés par couplage (estérification) d'un composé à groupe carboxylique libre avec les groupes -OH libres d'un composé de formule (I). Si le composé à groupe carboxylique libre comporte un autre groupe fonctionnel susceptible de réaction pendant la synthèse, comme c'est le cas par exemple des acides aminés qui comportent un groupe -NH2 réactif, il convient de protéger cet autre groupe fonctionnel avant d'effectuer la réaction. Dans le cas d'un groupe -NH2 d'un acide aminé, on peut, par exemple, le protéger, au moyen du 2-(tert-butyloxycarbonyl-oxyimino)-2- phényl-acétonitrile en abrégé BOC-ON), comme décrit par exemple par Itoh, M.;

Hagiwara, D et Kamiya, J. (1975), Tetrahedron Letters, 4393-

4394. Des acides aminés protégés sont, cependant,

disponibles dans le commerce.

Le couplage du composé carboxylé éventuellement protégé avec le composé de formule (I) peut être effectué, par exemple, comme décrit par Hassner, A. et Alexanian, V.

(1978) Tetrahedron Letters, 4475-4478, au moyen de N,N-

dicyclohexylcarbodiimide en présence de N,N-

diméthylaminopyridine dans CH2Cl2.

Selon le composé de formule (I) utilisé (diester ou monoester), on peut coupler 2 ou 3 molécules de composé

carboxylé par molécule de composé de formule (I).

Après le couplage, on réalise, s'il y a lieu, la déprotection des groupes protégés, par exemple par hydrolyse à l'aide d'acide trifluoroacétique à 50% en volume dans CH2Cl2 à 0 C pendant 30 mn, comme l'enseignent Lundt, B.F.; Johansen, N.L.; Volund, A. et Markussen, J. (1978), International Journal of peptide and protein Research 12, 258- 268. Dans ce cas les composés de formule (II) sont

obtenus sous forme salifiée (trifluoroacétate).

Dans le cas o on prépare des composés de formule II par réaction d'un composé de formule (I) o R2 est un groupe -CO-(CH2),-COOH avec un composé à groupe amino ou hydroxyle

réactif, une opération de protection n'est pas nécessaire.

L'aptitude des composés de formule (II) et de leurs sels à franchir la BHE a été démontrée au moyen d'essais in

vitro et in vivo chez la souris.

Les exemples non limitatifs suivants sont donnés dans

le but d'illustrer l'invention.

Exemple 1: Préparation du a-D-butylglucopyranoside (composé 1) 277 ml d'une solution aqueuse contenant 50 g d'un mélange des anomères a et B du D-butylglucopyranoside (disponible auprès de la Société CERESTAR HOLDING) comprenant 60% de l'anomère a et 10 mM de tampon acétate de sodium (pH 5) ont été mis à incuber avec 27 g de poudre d'amande [contenant de l'enzyme B-D-glucosidase (EC: 3.2.1.2.1)] pendant 18h à 50 C. Au bout de ce temps l'anomère B avait complètement disparu comme montré par chromatographie liquide à haute performance (CLHP). Le mélange résultant a été filtré, puis concentré jusqu'à siccité. De l'a-D- butylglucopyranoside (composé 1) (25 g, rendement 83%) a été extrait du résidu par du CH2Cl2 chaud et utilisé sans autre purification pour la suite de la synthèse. Le composé 1 présente une valeur de Log P égale à 0,56. Exemple 2: Préparation de dérivés acylés du composé 1 (a) 1, 7 g (8,5 mmole) d'acide laurique et 1 g (4,23 mmol) du composé 1 préparé dans l'exemple 1 ont été ajoutés à de l'hexane bouillant dans un appareil Dean-Stark. On a ajouté 0,15 g de Lipozyme (commercialisé par la Société NOVO INDUSTRI) et la suspension résultante a été agitée à 70 C pendant 3 jours, temps après lequel la formation de diester a été détectée. On a filtré le mélange réactionnel

et évaporé le solvant sous pression réduite. Une flash-

chromatographie sur colonne de silice (94: 6 CH2Cl2-MeOH) du résidu obtenu (2,60 g) a donné le dérivé 6-0-lauroylé (composé 2) (1,4 g, rendement 80%). Le composé (Z) avait un a20 point de fusion de 25 C; un pouvoir rotatoire [a]n: + 29 (c 1,3, CHC13), un Log P égal à 0,87, et l'analyse IR a

montré des raies à 3490 (OH), 2980 (CH) et 1730 (C = O) cm-'1.

Analyse calculée pour C22H4207: C, 63,10, H, 10,04. Trouvé:

C, 62,72; H, 10,04.

(b) En utilisant le mode opératoire de la partie (a) ci-dessus si ce n'est qu'on a remplacé l'acide laurique par l'acide adéquat, on a préparé les dérivés 6-0-palmitoylé (composé 3), 6-0-stéaroylé (composé 4) et 6-0-oléoylé (composé 5). Le composé 4 a un Log P de 0, 93. Le tableau 1 ci-après résume certaines données concernant les composés 3,

4 et 5 obtenus.

TABLEAU 1

:.. ANALYSE

Composé N Pf, C Rendement % [a]20* Formule brute Calculée Trouvée

3 30 78 +43 C28H5007 C, 64,56 64,38

H, 10,62 10,65

4 37 78 +36 C30H5407 C, 66,89 66,60

H, 10,82 11,08

huile 80,5 +32 C30H5207 C, 65,98 65, 85

H, 10,48 10,39

o

* C 1,3, CHC13

o, o, o, (c) A un mélange fondu de 1 g (4,23 mmoles) de composé 1 et de 2,41 g d'acide stéarique (8,46 mmoles) à 75 C, on a ajouté 0,15 g de Lipozyme . Après 72h de réaction, une analyse par spectroscopie RMN C13 a montré que le produit obtenu était un mélange de composé 4, du dérivé 2,6-0- distéaroylé (composé 6) et du dérivé 3-0-stéaroylé (composé 7).

(d) Préparation du 2,6-di-O-stéaroyl-a-D-

butylglucopyranoside (composé 5) La synthèse du composé fi à partir du composé 4 et de 1 équivalent d'acide stéarique a été réalisée selon le mode

opératoire général de la partie (a) de l'exemple 2 ci-

dessus. Le produit brut résultant a été soumis à une flash-

chromatographie sur colonne de silice (98: 2 CH2Cl2-MeOH) et on a obtenu le composé 6 avec un rendement global de 96%. Ce composé 6 avait les propriétés suivantes: Pf 42 C; Log P KB r 3480 (OH), 2970 1,76; [a]20: + 34 (c 1,3, CHC13); r 3480 (OH), 2970 (CH) et 1730 (C = 0) cm- '. Analyse calculée pour C46H8808: C,

71,82; H, 11,53. Trouvé: C, 71,74; H, 11,52.

Il est à noter qu'en l'absence d'enzyme, il ne se forme

pas d'esters.

(e) Préparation du 2-0-lauroyl-6-0-stéaroyl-a-D-

butylglucopyranoside (composé 8) On a fait réagir du composé 4 (lg, 1,99 mmole) et de l'acide laurique (0,4 g, 1,99 mmole), comme décrit en (a) ci-dessus pour la préparation du composé 6. On a obtenu, après purification par flash-chromatographie comme décrit en (d), 1,30 g de composé 8 (rendement global 96%). Le composé avait les propriétés suivantes: Pf 39 C; [a]0: + 58 D (c 1, 16, CHC13). Analyse élémentaire calculée pour C34H6408:

C, 67,96; H, 10,73. Trouvé C, 67,92; H, 11,10.

(f) Préparation du 2,6-di-O-lauroyl-a-D-

butylglucopyranoside (composé 9) On a préparé le composé 9 en suivant le mode opératoire utilisé en (d) ci-dessus si ce n'est qu'on a remplacé

l'acide stéarique par de l'acide laurique.

Le point de fusion de ce composé est inférieur à la température ambiante et n'a pas été mesuré. Spectrométrie de masse: M' + 17: 618; M+ 601. Le composé 9 a un Log P égal

à 1,41.

Les composés 2 à 6, à et 9 sont des composés répondant à la formule générale (I).

Exemple -a:

On a préparé des composés (prodrogues) de la formule II

à partir des composés Z, 4, 6, et 9 et de l'acide 4-amino-

butyrique ou acide 4-amino-butanoïque (en abrégé GABA) après protection du groupe amino réactif de ce dernier. Des formes protégées du GABA sont disponibles dans le commerce, en particulier sous l'appellation t-bocGABA. Le GABA est un acide aminé que l'on a choisi comme médicamentmodèle car, outre le fait que le GABA ne peut pas franchir la BHE dans des conditions normales, il est connu que son métabolisme est altéré lors de maladies telles que les maladies d'Alzheimer, de Parkinson, d'Huntington et l'épilepsie. Les composés de formule II obtenus (prodrogues de GABA) ont été évalués, en ce qui concerne leur aptitude à franchir la BHE sur un modèle in vitro de BHE. On a également évalué leurs propriétés biologiques in vivo sur la souris par un test de

sélection de médicaments anticonvulsivants.

A) Préparation du 6-O-lauroyl 2.3.4-tri-O(N-tBoc 4-

aminobutanoyl)a-D-butylglucopyranoside (composé 12) 1,31 g (5,5 mmoles) de composé 2, 3,75 g (18,14 mmoles) de N,N'- dicyclohexylcarbodiimide (DCC), 0,22 g (1,8 mmole) de N,N-diméthyl-amino- 4-pyridine (DMAP) et 3,7 g (18,15 mmoles) de tBoc-GABA de formule (CH3)3COCONH(CH2)3COOH (vendu, par exemple, par la Société ALDRICH CHEMICALS) sont dissous, sous agitation magnétique, dans 30 ml de dichlorométhane, à température ambiante, sous atmosphère d'azote. Un précipité apparait quelques minutes après l'addition des réactifs (correspondant à la N,N'-dicyclohexylurée (DCU)), et le milieu réactionnel est agité pendant 2 heures supplémentaires. Le précipité est alors éliminé par filtration, et le filtrat lavé successivement avec des solutions aqueuses d'HCl 0,1 N, de NaHCO3 à 5% et de NaCl saturé. La phase organique, séchée sur sulfate de sodium est évaporée à sec. L'huile jaune résiduelle est purifiée par flash chromatographie sur gel de silice pour conduire à 2,95 g (3 mmoles) de produit final, avec un rendement global de 70% après purification. Le composé 12 a les propriétés suivantes: - Pouvoir rotatoire [a]20+58 (C 0,4,CH3OH) - Point de fusion: 89 C - Analyse infra-rouge (NaCl): v-N-H amide: 3454 cm-' v-CH, CH2,CH3: 2979,2960 cm-' v-(CH3)3C (déformation CH): 1393/1363 (rapport 1/2) cm-' v-C=0 ester: 1745 cm-' v-C=0 carbamate: 1654 cm-' v-(CH3)3C (squelette tBoc): 1250 cm-' Analyse élémentaire pour C53H95N306: Calc.: C 60,43 H 9,03 N 4,31 Trouvée: C: 60,35 H: 8,53 N: 4,20

B) Préparation du 6-0-lauroyl 2,3,4-tri-O-(4-ammonium-

butanoyl) a-D-butylglucooyranoside-tris-trifluoroacétate (composé 22) 0,2 g (2,06 x 10-4 mole) de composé 12 est dissous sous agitation, à 0 C, dans 1,5 ml de CH2Cl2, et sous atmosphère d'azote, 1,5 ml d'acide trifluoroacétique sont alors additionnés et 30 min après, le milieu réactionnel est amené à sec par distillation sous pression réduite. L'huile résiduelle est purifiée par chromatographie sur couche mince (CCM) préparative sur silice greffée RP-18. La bande correspondant au produit, est grattée, lavée par du méthanol et concentrée. Cette phase méthanolique, diluée 30 fois dans de l'eau, est lyophilisée pour conduire à 0,205 g de produit

final avec un rendement quantitatif.

Le composé 22 a les propriétés suivantes - Pouvoir rotatoire: [a]20 + 52 (C 0,434,CH30H)

- Point de fusion: hygroscopique.

- Analyse infra-rouge (KBr): v-NH3+: 3250 cm-' v-CH,CH2: 2924 cm-' v-C=O ester: 1739 cm' v-COO-: 1677 cm' v-CF: 1197,1135 cm-' Analyse élémentaire pour C40H66FgN3016: Calc.: C: 47,29 H: 6,50 N: 4,13 Trouvée: C: 46,93 H: 6,83 N: 4,09 En suivant les modes opératoires généraux décrits dans les parties A) et B) ci-dessus, si ce n'est qu'on est parti d'un composé de formule I différent, on a préparé une série de précurseurs de prodrogues et une série des prodrogues correspondantes comme récapitulé dans le tableau II suivant:

TABLEAU II

Composé de Précurseur formule I de Prodrogue de départ prodrogue

2 12 22

4 14 24

6 16 26

9 19 29

Les précurseurs de prodrogues répondaient à la formule générale III o R1, Z, X' et Y avaient les significations suivantes: Composé R1 Z X' y No 12 C4H9 tBOcNH(CH2)3 tBocNH(CH2)3 C11H23 14 C4H9 tBOcNH(CH2)3 tBocNH(CH2)3 C17H35 16 C4H9 C17H35 tBocNH ( CH2) 3 C17H35 19 C4H9 CllH23 tBocNH(CH2)3 C1lH23 Les prodrogues répondaient à la formule II o R1, Z, X et Y avaient les significations suivantes: Composé RI D A et E B No 22 C4H9 CF3COO-+H3N CF3COO-'H3N -CO-C1lH23

(CH2)3-CO- (CH2)3-CO-

24 C4H CF3COO-+H3N CF3COO-+H3N -CO-C17H35

(CH2)3-CO- (CH2)3-CO-

26 C4H9 C17H35-CO- CF3COO-+H3N -CO-C17H35

(CH2)3-CO-

29 C4H9 CllH23-CO- CF3COO-)H3N -CO-CllH23

_ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ (CH 2)3-C O -

Les précurseurs de prodrogues avaient les propriétés suivantes: Point de Pouvoir Analyse élémentaire Composé fusion rotatoire Spectre de C [a]20 C H N masse

(C, CHC13) M++17 M+

Cs55H99N3016 14 +89 +58 Calc.62,42 9,42 4,00 1075 1058 (0,67) Exp.62,59 9,56 3, 97

C64H118N2014

16 +40 +47 Calc.67,45 10,43 2, 46 1156 1130 (0,70) Exp.67,33 10,51 2,50

C52H94N2014

19 +35 +46 Calc.64,30 10,43 2, 46 988 971 ________________ (0,52) Exp. 64,53 9,89 3,00 - Analyse infra-rouge (KBr): voir les données du composé 12 La prodrogue 24 avait les propriétés suivantes: - Pouvoir rotatoire [a]20+38 C (c 0,47, CH30H) Analyse élémentaire pour C46H78FgN3016, H20: Calc.: C: 49,42 H: 7,16 N: 3,76 Trouvée: C: 49,33 H: 7,48 N: 3,70. La prodrogue 2f avait les propriétés suivantes: - Pouvoir rotatoire [a]20+32 (c 3,33, CH30H) Analyse élémentaire pour C58H104F6N2014,2H20 Calc.: C: 58,09 H: 9,01 N: 2,33

Trouvée: C: 58,11 H: 8,66 N: 2,17.

Le prodrogue 29 avait les propriétés suivantes: - pouvoir rotatoire [a]20+55 (c 0,67, CH30H) Analyse élémentaire pour C46H80F6N2014,H20 Calc.: C: 54,33 H: 8,07 N: 2,76 Trouvée: C: 54,27 H: 8,03 N: 2,89 Toutes les prodrogues ont été obtenues sous forme d'une poudre ou d'une huile blanche avec un rendement global de

synthèse de l'ordre de 60%.

L'aptitude des prodrogues de l'invention à franchir la BHE plus aisément que le GABA lui-même a été démontrée d'abord par un test in vitro, puis par un test in vivo chez

la souris.

Tests in vitro: Dans ces tests, on a utilisé un modèle in vitro de BHE

développé à l'Institut Pasteur de Lille et décrit par Marie-

Pierre Dehouck et coll. dans Journal of Neurochemistry, 58, 1790-1797 (1992) auquel on pourra se reporter pour plus de détails. En bref, le test consiste à placer une solution de Ringer-HEPES (NaCl, 150 mM; KCl, 5,2 mM; CaCl2, 2,2 mM;

MgCl26H20, 0,2 mM; NaHC03, 6 mM; HEPES [N-(2-hydroxyéthyl)-

pipérazine-N'-(acide 2-éthanesulfonique)], 5 mM; glucose 2,8 mM) dans le compartiment inférieur d'une boîte à 6 puits (2ml par puits). Un filtre imprégné de collagène et recouvert d'une monocouche de cellules endothéliales de capillaires cérébraux de boeuf produites comme décrit par Dehouck et coll., supra, est transféré dans le premier puits. 2 ml de la solution de Ringer-HEPES contenant la molécule à tester sont déposés dans le compartiment supérieur du filtre, à la concentration de 150 pM. Au temps , 20, 40, 60, 90 et 120 min après addition de la molécule, les filtres sont transférés dans un autre puits afin de réduire au maximum le retour de la molécule du compartiment

inférieur vers le compartiment supérieur.

Les expériences sont réalisées sur trois séries de puits, avec des filtres couverts de cellules endothéliales

de capillaires cérébraux ou de collagène seul comme témoin.

La quantité de substance est déterminée dans les différents compartiments inférieurs en comptant la radioactivité ou en

dosant la molécule froide par CLHP.

Lors de chaque expérience, 3 filtres, pris au hasard dans la série, sont utilisés afin de déterminer la perméabilité au saccharose et à l'inuline (ces substances ne diffusent pas dans des conditions physiologiques), dans le but de vérifier l'intégrité de la monocouche de cellules endothéliales. Afin de déterminer le coefficient de perméabilité endothéliale (Pe) des prodrogues, la clairance, exprimée en pl, de chaque substance est déterminée suivant la formule développée suivante: Clairance (pl) = Q/S o Q est la quantité de substance dans le compartiment inférieur o S est la concentration de substance dans le

compartiment supérieur.

Pendant 60 min, la clairance augmente linéairement avec le temps. Sur le graphe clairance = f(t), la mesure de la pente correspond à la valeur du "PSt" o PS correspond au produit de la perméabilité par la surface de la monocouche de cellules endothéliales, exprimé en pl/min. Pour les filtres témoins, "PSf" est calculé de la même façon. La perméabilité de la monocouche de cellules endothéliales seule (PSe) est donnée par la relation suivante: l/PSe = 1/PSt - 1/PSf Le coefficient de perméabilité endothéliale "Pe" est calculé en divisant PSe par la surface de la monocouche de cellules endothéliales (4,2 cm2). Le coefficient "Pe"

s'exprime en cm/min.

Le GABA a servi dans cette étude. Il est connu pour ne

pas diffuser de façon significative au travers de la BHE.

L'évaluation du transfert du GABA sur ce modèle in vitro de

BHE a constitué la première étape.

La méthode de dosage du GABA fait appel à un comptage radioactif, ce qui implique l'utilisation de GABA marqué au 14C. Dans le Tableau ci- dessous, les valeurs de perméabilité

du GABA obtenues dans une série d'essais sont présentées.

Comptage de la radioactivité (14C) PSf(pl/min) 12,83(r = 0,99) PSt(pl/min) 2,05(r = 0,99) Pe(10-3 cm/min) 0,58 *Les valeurs entre parenthèses correspondent aux coefficients de régression linéaire des droites dont les

coefficients PSt et PSf sont les pentes.

La valeur du Pe du GABA obtenu confirme que le GABA ne

passe que très faiblement au travers de ce modèle de BHE.

Pour pouvoir comparer les différentes valeurs de Pe obtenues au cours de toutes les expériences, on a divisé la valeur de Pe d'une prodrogue par celle du GABA obtenue dans la même série d'expériences. Ceci a abouti à l'expression d'un coefficient "C", défini comme suit: C = Pe prodrogue/Pe GABA Etude du transfert des prodrogues 22, 24. 26 et 29 sur le

modèle in vitro de BHE.

Afin de pouvoir mesurer par comptage radioactif le Pe de chacune des prodrogues précitées, on a préparé des prodrogues 22, 24, 26 et 29marquées au 14C en effectuant leur synthèse comme décrit plus haut si ce n'est qu'on est parti de GABA radioactif marqué au 14C. Le Pe a été déterminé par comptage radioactif comme le GABA.5 Le Tableau ci- dessous présente l'ensemble des valeurs des différents coefficients de perméabilité ainsi que les

valeurs du coefficient C pour les prodrogues de la famille des esters liposolubles par un comptage radioactif.

Prodrogue PSt PSf C*

22-[U-14C] 8,33 13,68 3,01

24-[U-14C] 6,83 14,68 1,81

26-[U-14C] 4,51 13,44 2,80

1 29-[U-14C] 4,88 13,22 3,17

*C = Pe/Pe..

Ces résultats montrent que les 4 prodrogues testées diffusent mieux que le GABA au travers de ce modèle in vitro de BHE, en particulier les prodrogues 22, 26 et 29. Il est intéressant de noter que le composé 22 possède un

coefficient C identique à celui du glucose, molécule elle-

même connue pour être bien transférée au travers de ce modèle et à travers la BHE par un mécanisme de transport actif. Tests in vivo L'activité inhibitrice du GABA et des prodrogues de l'invention sur le SNC a été évaluée par un test de sélection de médicaments anticonvulsivants. Ce test consiste à rechercher, pour une substance donnée, la protection qu'elle confère à des souris vis-à-vis d'une crise

épileptiforme induite par la picrotoxine.

La crise induite est caractérisée par l'apparition chronologique des phénomènes suivants: * tremblements, * catatonus: raidissement de la queue, * crise clonique: secousses musculaires associées à des mouvements myocloniques, * crise tonique: flexion/extension des pattes postérieures,

* décès.

La protection de la crise épileptiforme, conférée par

une prodrogue, sera évaluée par le pourcentage de survie.

Picrotoxine L'agent convulsif (la picrotoxine) a été injecté par voie i. p. chez la souris, à raison de 7,5 mg/kg,

correspondant à la DL50 (Merck index, XIème Edition, 1989).

Dans les conditions expérimentales utilisées au cours de cette étude, 17% et non 50% des souris ont survécu à l'injection de picrotoxine. Une dose plus importante de picrotoxine n'aurait pas permis de constater une éventuelle protection par les prodrogues, alors qu'à une dose plus faible (5mg/kg) 80% des animaux ont survécu. De ce fait, l'utilisation de cette dose de convulsivant n'aurait pas permis d'observer une différence entre le GABA et les prodrogues. Dans ces conditions, le décès apparaît 24,2 1,9 min (n = 42) après l'injection de picrotoxine (temps de référence). Les prodrogues et le GABA sont injectés par voie

i.p. 15 min avant l'injection de picrotoxine.

GABA Les résultats obtenus après injection de doses

croissantes de GABA, sont consignés dans le Tableau ci-

après: co co co N Cq S000'0> d: e auuaXow eT e saeD9 sap auwwos:.S seznuTw ue ewTadxa seoep np uoT:Taeddep u uaow sdwal: aywT xnewTue,p eaqwoN: u (6'0) |%0 t 1' 6'6T 8E61 00 'SS (t''T) | %0 L' 1 TT 61 696 00T L 8z 6 (9'0) |%0 O'T Z'LT t8t OS S ' zS (o'T) %LT 6'T z'tz 0 0 6'8Z Z |TAUans ap WaS UTW l/IOwd 5:/6m 6 aBe6uaoanod Y.wT. esoa SPTOd u Le GABA ne confère aucune protection vis-à-vis du décès pour des doses comprises entre 50 et 200 mg/kg. Le pourcentage de survie est de 0% et, bien qu'inférieur au résultat obtenu en l'absence de GABA, il n'est pas significativement différent. Prodrogues 26 et 29: Ces prodrogues incluent au sein de leur structure 2 molécules de GABA. Dans le but d'avoir un élément de comparaison entre les différentes prodrogues, la dose administrée a été ramenée à une dose en pmol/kg de GABA injecté. Les valeurs des pourcentages de survie et des TMAD obtenus pour les prodrogues de la famille des esters liposolubles, en fonction de la dose injectée, sont

présentées dans le Tableau ci-après.

Prodrogue n Poids g Dose TMAD Pourcentage mg/kg pmol/kg min SEM de survie

- 42 28,9 0 0 24,2 1,9 17%

(l'o)

29 9 24,8 50 100 25,2 4,6 22%

(0,3)

2129 9 30,4 100 200 27,7 3,0 11%

(1,8)

2 9 10 25,2 200 400 27,9 4,6 33%

(0,5)

4 24,2 400 800 30,9 5,3 25%

(0,8)

26 E 4 23,7 50 86 16,9 2,3 0%

(0,5)

26 9 32,4 100 172 34,0 3,6 33%

(1,4)

23,6 200 344 30,5 6,7 25%

(0,5) n: Nombre d'animaux

TMAD: Temps moyen d'apparition du décès exprimé en minutes.

SEM: Somme des écarts à la moyenne On voit d'après les résultats cidessus que les prodrogues 26 et 29 permettent de doubler le pourcentage de survie par rapport à la picrotoxine (33%) aux doses de 200 et 100 mg/kg respectivement. Le fait de doubler ces doses ne permet pas toutefois de constater une amélioration: un

plateau d'activité semble donc atteint.

Il est intéressant de noter qu'à aucune dose il n'a été rapporté de toxicité aiguë provoquant le décès avant

l'injection de picrotoxine.

Ces résultats montrent que les prodrogues de l'invention sont des agents thérapeutiques potentiellement utiles pour traiter les dysfonctionnements et maladies du SNC, telles que la maladie d'Alzheimer, la maladie de Parkinson, la chorée de Huntington, l'épilepsie, etc...,

ainsi que les phénomènes d'anxiété et de stress.

Les prodrogues de l'invention peuvent être administrées par voie intrapéritonéale sous forme de suspension aqueuses, par exemple à des doses de 10 à 100 pmole/kg de poids du corps. Pour la prodrogue 29 cela correspond à environ 5 à 50

mg/kg de poids du corps.

* Il va de soi que les modes de réalisation décrits ne sont que des exemples et que l'on pourrait les modifier, notamment par substitution d'équivalents techniques, sans

sortir pour cela du cadre de l'invention.

Claims (8)

REVENDICATIONS

1. L'utilisation, comme transporteurs de médicaments

vers le système nerveux central (SNC), de a-D-

alkylglucopyranosides et esters de ceux-ci ayant la formule générale (I):

CH2OR2

(I)

OR4O

HO OR1

OR3 dans laquelle R1 est un radical alkyle, linéaire ou ramifié, en C2 à C18; R2 est un groupe -CO-R o R est un radical hydrocarboné, linéaire ou ramifié, saturé ou éthyléniquement insaturé, en Cs à C17, ou un groupe -CO-(CH2)n-COOH o n = 4

à 14; R3 et R4 sont chacun, indépendamment, H ou le reste -

CO-R' d'un acide gras HOOC-R' o R' est un radical hydrocarboné, linéaire ou ramifié, saturé ou éthyléniquement insaturé en Cs à C17, avec la condition qu'un seuldes groupes

R3 et R4 soit un reste -CO-R'.

2. Utilisation selon la revendication 1, caractérisée

en ce que R1 est un radical butyle.

3. Prodrogues répondant à la formule générale (II): CH20B / -E (Il) Ri AO O-D o R1 est un radical alkyle, linéaire ou ramifié, en C2 à C18; A est H, -CO-R" o R" est un radical hydrocarboné, linéaire ou ramifié, saturé ou éthyléniquement insaturé en Ci à C17, ou le reste -CO-X d'un composé actif HOOC-X comportant un groupe carboxyle réactif; B est un reste -CO-R' d'un acide gras HOOC-R' o R' est un radical hydrocarboné, linéaire ou ramifié, saturé ou éthyléniquement insaturé en C5 à C17, ou bien un groupe -CO-(CH2)n-COO-W o n = 4 à 14 et W est le reste d'un composé actif comportant un groupe amino primaire ou hydroxyle primaire; D et E sont chacun, indépendamment, H ou un reste -CO-X ou -CO-R'; avec les conditions que (i) lorsque B est -CO-R', au moins deux des groupes A, D et E sont -CO-X, et (ii) lorsque B est -CO-(CH2)n-COO-W, A, D et

E sont H, -CO-R' ou -CO-R".

4. Prodrogues selon la revendication 3, caractérisées

en ce que R1 est un radical butyle.

5. Précurseurs de prodrogues de la formule II, qui répondent à la formule générale III a tI

CH20C-R'

/O-C-Z\

(III)

OR1

X'-C-O

" 0 C - Z

O..

0

o R1 est tel que défini ci-dessus, le groupement -CO-X' est le reste d'un acide aminé ou d'un peptide dont le ou les groupes amino sont protégés, -CO-Z est un groupement -CO-X' ou un groupement -CO-R' tel que défini ci-dessus, au moins

un des groupes -CO-Z étant -CO-X'.

6. Précurseurs selon la revendication 5, caractérisés en ce que le groupe amino de l'acide aminé est protégé par

un groupe t-butyloxy-carbamate.

7. Précurseurs selon la revendication 5 ou 6,

caractérisés en ce que R1 est un radical butyle.

8. Procédé de préparation d'un composé de la formule

(I) défini à la revendication 1, caractérisé en ce qu'il comprend (a) l'estérification enzymatique d'un a-D-alkyl-

glucopyranoside approprié par un acide gras en C6 à C18 dans un solvant non polaire en présence d'une lipase pour obtenir5 principalement un monoester, puis (b) facultativement, l'estérification du monoester en diester dans des conditions

similaires à celles de l'étape (a).