DE69907720T2

DE69907720T2 - Phospholipid-derivate von nichtsteroiden entzündungshemmenden medikamenten

Info

Publication number: DE69907720T2
Application number: DE69907720T
Authority: DE
Inventors: Alexander Kozak; Israel Shapiro
Original assignee: DPHARM Ltd; D Pharm Ltd
Current assignee: DPHARM Ltd; D Pharm Ltd
Priority date: 1998-11-19
Filing date: 1999-11-18
Publication date: 2004-02-26
Anticipated expiration: 2019-11-19
Also published as: NZ510938A; DE69907720D1; EP1131326A1; US6730696B1; EP1131326B1; WO2000031083A1; IL127143A0; AU1292800A; US7417035B2; EP1131326A4; US7173018B2; JP2002530410A; CA2346869C; US20040147485A1; AU766045B2; ZA200102718B; CA2346869A1; US20070191310A1; ATE239739T1

Description

FELD DER ERFINDUNG
Die vorliegende Endung betrifft Verbindungen, die nichtsteroidale entzündungshemmende Arzneistoffe (NSAIDs) umfassen, die an eine Phospholipid-Einheit über eine Brückengruppe kovalent gebunden sind, Arzneimittel, die derartige Verbindungen zur Behandlung von Erkrankungen und Störungen, die mit entzündlichen Zuständen verbunden sind, umfassen. Die Erfindung betrifft ferner ein Verfahren zur Synthese der Phospholipid-Derivate von NSAIDs.
HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Eine Entzündung ist ein wichtiger Aspekt des natürlichen Abwehrmechanismus. Eine Entzündung wird ein pathologischer Prozess, der ein ärztliches Eingreifen erfordert, wenn die Entzündungsmediatoren einen unangemessen hohen Schaden des umgebenden Gewebes verursachen. Beispiele für derartige pathologische Prozesse sind rheumatoide Arthritis (RA) und Psoriasis. Kürzlich ist eine entscheidende Entzündungskomponente in anderen Typen von Erkrankungen, zum Beispiel neurologischen Störungen, wie Multipler Sklerose und Alzheimer Krankheit, gefunden worden. Ein gemeinsames Merkmal vieler entzündlicher Erkrankungen ist eine Erhöhung der Phospholipase-A₂ (PLA₂)-Aktivität.
PLA₂ ist der übliche Name für eine mannigfaltige Gruppe von Enzymen, die spezifisch die sn-2-Bindung des Glycerophospholipids hydrolysieren, um die freien Fettsäuren und Lysophospholipide freizusetzen. Von PLA₂ wird angenommen, dass es für die Freisetzungsrate der Arachidonsäure limitierend ist. Von dem anderen Produkt seiner Umsetzung, dem Lysophospholipid, wird angenommen, dass es die Vorstufe des Thrombocyten-Aktivierungs-Faktors (PAF) ist. PAF und die Arachidonsäure-Stoffwechselprodukte, die Eicosanoide, sind pro-inflammatorische Lipid-Zwischenprodukte, die von mobilisierten Zellmembran-Phospholipiden durch die Einwirkung der Phospholipase-Enzyme abgeleitet sind. Infolgedessen wird PLA₂ damit in Verbindung gebracht, eine entscheidende Rolle in der Bildung der kompletten Kaskade, der von den Phospholipiden abgeleiteten Entzündungsmediatoren, zu spielen.
Für eine anhaltende Entzündung sind drei Klassen von Arzneistoffen in der Anwendung verbreitet, Corticosteroide, nichtsteroidale entzündungshemmende Arzneistoffe (NSAIDs) und langsam wirkende krankheitsverändernde Arzneistoffe.
Corticosteroide sind die stärksten und wirksamsten Mittel in der Kontrolle von entzündlichen Zuständen. Unglücklicherweise ist die Verwendung dieser Arzneistoffe über einen längeren Zeitraum mit Nebenwirkungen verbunden. Topische Corticosteroid-Zubereitungen sind in der Anwendung bei entzündlichen dermatologischen Zuständen weit verbreitet und inhalierte Corticosteroide machen 55% des „Asthma-Markts" in Großbritannien aus. Prednisolon ist das am meisten verbreitete, verabreichte Corticosteroid bei RA, das obwohl es den zu Grunde liegenden Krankheitsprozess positiv beeinflusst, nicht zu einer Heilung führt und mit schweren Nebenwirkungen verbunden ist.
NSAIDs erleichtern die Symptome einer Entzündung ohne den Verlauf der Erkrankung zu verändern, haben jedoch nachteilige gastrointestinale und renale Nebenwirkungen. Die Hauptwirkung ist die Hemmung der Arachidonsäurecyclooxygenase (in entzündlichen Zellen des COX₂-Isoenzyms) und infolgedessen das Hemmen der Prostaglandin- und Thromboxan-Bildung.
Krankheitsverändernde anti-rheumatische Arzneistoffe (DMARDs) wie Goldprodukte, Auranofin (SKB), Chloroquin (Sanofi), Sulfasalazin (Pharmacia & Upjohn), Cyclosporin (Sandoz (Novartis)) und Methotrexat (MTX, APH, Pharmacia & Upjohn) sind Mittel zweiter Wahl zur Behandlung von RA. In den meisten Fällen ist deren Wirkungsweise unzureichend definiert und der Begriff „langsam wirkend" wird verwendet, da diese Mittel Wochen oder Monate benötigen, um eine nachweisbare Wirkung aufzuweisen. Die Behandlung mit DMARDs muss über Jahre fortgesetzt werden. Wenn eine vollständige Remission für mindestens sechs Monate erreicht ist, wird die Dosierung allmählich vermindert und kann völlig gestoppt werden. DMARDs scheinen eine mit Röntgenaufnahmen verbundene Schädigung zu vermindern und die Marker der akuten Phase bei RA zu verbessern, jedoch weisen sie alle nachteilige Wirkungen auf.
Diclofenac [o-[(2,6-Dichlorphenyl)amino]phenyl]acetat ist ein nichtsteroidaler entzündungshemmender Arzneistoff der Phenylessigsäure-Klasse. Wenn es oral gegeben wird, erfolgt die Aufnahme des Diclofenacs rasch und vollständig. Es bindet umfassend an Plasma-Albumin. Wesentliche Konzentrationen des Arzneistoffs werden in der synovialen Flüssigkeit erreicht, die der angenommene Wirkort der NSAIDs ist. Diclofenac ist ein wirksamer Inhibitor der Prostaglandin-Synthese und es wurde gezeigt, dass es Interleukin-1 (IL-1β) und den Tumor-Nekrose-Faktor alpha (TNF-?), der in die Osteoarthritis involviert ist, hemmt. Gastrointestinale Komplikationen, wie Geschwürbildung und Unverträglichkeit sind die häufigsten nachteiligen Wirkungen von Diclofenac. Nierenversagen und Überempfindlichkeitsreaktionen können auch auftreten. Viele Patienten mit rheumatischen Störungen weisen einen gewissen Grad eines Nierenfunktionsdefekts auf und sind besonders anfällig gegenüber dem Auslösen einer Niereninsuffizienz durch NSAIDs.
Andere nichtsteroidale entzündungshemmende Arzneistoffe, wie Salicylate, Indomethacin und Ibuprofen hemmen direkt die Cyclooxygenase, ein Schlüsselenzym im Synthese-Pathway der Prostaglandine. Jedoch, da diese Arzneistoffe frühe Reaktionen in dem Arachidonsäure-Stoffwechsel hemmen, können sie die Bildung von mehr als einem Produkt blockieren, was folglich zu schweren Nebenwirkungen führt. Indomethacin zum Beispiel kann auch den Calciumfluss durch die Membranen unterbrechen, die cAMP-abhängige Proteinkinase und die Phosphodiesterase hemmen.
Es wäre deshalb wünschenswert, in der Lage zu sein, den Nutzen von NSAIDs auf Zustände auszudehnen, die nicht auf niedrigere Dosen der Arzneistoffe ansprechen und unerwünschte Nebenwirkungen durch ihre Zielausrichtung auf erkrankte Zellen zu verringern.
Die Verwendung von Prodrugs, um gewünschte Kennzeichen, wie erhöhte Bioverfügbarkeit oder erhöhte Zielort-Spezifität auf bekannte Arzneistoffe zu übertragen, ist ein bekanntes Konzept auf dem Fachgebiet der Arzneimittelentwicklung. Die Verwendung von verschiedenen Lipiden in der Herstellung von bestimmten Typen von Prodrugs ist nach dem Stand der Technik ebenfalls bekannt. Jedoch offenbart der Stand der Technik keine Prodrugs, die NSAIDs umfassen, die während der Aktivierung durch intrazelluläre Lipasen eine bevorzugte Anhäufung und Freisetzung des Arzneistoffs innerhalb der erkrankten Zellen ermöglichen.
Die internationale Patentanmeldung WO 91/16920 offenbart Phospholipid-Prodrugs von Salicylaten und nichtsteroidalen entzündungshemmenden Arzneistoffen, wobei der Arzneistoff direkt ohne einen Abstandshalter entweder an einen oder an beide der Glycerinhydroxyl-Gruppen eines Phospholipids oder an vorhandene Hydroxyl- oder Aminogruppen der Kopfgruppe des Phospholipids gebunden ist. Diese Prodrugs schützen, wenn sie oral eingenommen werden, die Magenschleimhaut und setzen den aktiven Grundbestandteil im Darm über die Einwirkung der Pankreasenzyme frei.
In anderen Beispielen von Phospholipid-Prodrugs ist die Formulierung der Prodrugs in Liposome oder andere Mizellarstrukturen das Merkmal, das ihre bevorzugte Aufnahme, z. B. durch Leberzellen oder durch Makrophagen ermöglicht, wie im Fall der Phospholipid-Konjugate antiviraler Arzneistoffe, offenbart in den internationalen Patentanmeldungen WO 93/00910 und WO 90/00555.
Die internationale Patentanmeldung WO 96/22780 offenbart Zusammensetzungen, die nichtsteroidale entzündungshemmende Arzneistoffe umfassen, die nichtkovalent mit zwitterionischen Phospholipiden verbunden sind. In Gegensatz dazu betrifft die vorliegende Erfindung nichtsteroidale entzündungshemmende Arzneistoffe, die an ein Phospholipid über eine Abstandsgruppe kovalent gebunden sind.
U.S. Patent Nr. 5,149,794 offenbart ein Verfahren zur Abgabe von Arzneistoffen selektiv an intrazelluläre Organellen. Die offenbarten Verbindungen umfassen einen antiviralen oder antineoplastischen Arzneistoff, der an einen Lipid-Träger über eine Abstandsgruppe kovalent gebunden ist, der die Arzneistoff-Freisetzung am Zielort modulieren kann. Im Gegensatz zu der vorliegenden Erfindung ist das offenbarte Prodrug aufgrund des Vorhandenseins des Lipid-Trägers zielortspezifisch und die Arzneistofffreisetzung aus dem Lipid-Konjugat ist keine Voraussetzung für die Zielausrichtung des Arzneistoffs. Zusätzlich offenbart das U.S. Patent weder Phospholipide als Lipid-Träger noch Verbindungen, die nichtsteroidale entzündungshemmende Arzneistoffe umfassen.
U.S. Patent Nr. 5,256,641 offenbart Verfahren für die Abgabe und die spezifische Zielausrichtung Antigen-wirkender Peptide auf Zellen zur spezifischen Bildung einer Immunabwehr gegen derartige Peptide. Im Gegensatz dazu offenbart die vorliegende Erfindung keine Prodrugs, bei denen die Wirkstoffe Peptide sind, obwohl Peptide als Abstandshalter zwischen dem Wirkstoff und dem Phospholipid dienen können.
U.S. Patent Nr. 5,543,389 offenbart kovalent gebundene polare Lipid-Arzneistoff-Konjugate, um den Eintritt von Arzneistoffen in Zellen in pharmakokinetisch nützlichen Mengen zu erleichtern. Die Begründung für die spezifische Aktivierung des Prodrugs in diesem Fall unterscheidet sich stark von der der vorliegenden Erfindung. Die Beispiele der vorliegenden Erfindung mit Phospholipiden waren nicht dazu gedacht – und im Nachhinein ist klar, dass es wegen der ungünstigen Bedingungen aufgrund der sterischen Hinderung und der stereochemischen Probleme uneffektiv wäre – wirksame Phospholipid-Prodrugs zu synthetisieren, wenn der Abstandshalter zwischen dem Lipid und dem Arzneistoff weniger als die spezifische Länge von mindestens 4 Kohlenstoffatomen aufweist.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung stellt in einer Ausführungsform Verbindungen der allgemeinen Formel I
Formel I bereit oder ein pharmazeutisch verträgliches Salz davon, wobei:
R1 eine gesättigte oder ungesättigte, substituierte oder unsubstituierte Kohlenwasserstoffkette mit 2 bis 30 Kohlenstoffatomen ist;
R2 H oder eine Kopfgruppe eines Phospholipids ist;
D der Rest eines nichtsteroidalen, entzündungshemmenden Arzneistoffs ist, welcher eine funktionelle Gruppe, ausgewählt aus einer Carboxyl-, Hydroxyl-, Amin- und Thiolgruppe, aufweist, wobei D durch diese funktionelle Gruppe an eine Brückengruppe -C(O)-Z-X- gebunden ist, wobei Z eine gesättigte oder ungesättigte Kohlenwasserstoffkette mit 2 bis 15 Kohlenstoffatomen ist, und X aus Amino-, Hydroxy-, Thio- und Carbonylgruppen so ausgewählt ist, dass, wenn die funktionelle Gruppe von D eine Carboxylgruppe ist, X aus einer Amino-, Hydroxy- und Thiogruppe ausgewählt ist, und, wenn die funktionelle Gruppe von D eine Amino-, Hydroxy- oder Thiogruppe ist, X eine Carbonylgruppe ist.
In einer bevorzugten Ausführungsform ist der Rest R1 der vorstehenden Verbindung der Formel I eine Kohlenwasserstoffkette mit 10 bis 20 Kohlenstoffatomen, bevorzugt ein Alkylrest von 15 bis 17 Kohlenstoffatomen.
Gemäß einer anderen bevorzugten Ausführungsform ist der nichtsteroidale entzündungshemmende Arzneistoff ausgewählt aus Diclofenac, Indomethacin, Ibuprofen, Naproxen und 6-Methoxy-2-naphthylessigsäure, ist jedoch nicht auf diese beschränkt.
In noch einer anderen bevorzugten Ausführungsform ist die Kopfgruppe R2 des Phospholipids ausgewählt aus Cholin, Ethanolamin, Inositol und Serin.
Bevorzugt gemäß der Erfindung sind Verbindungen der allgemeinen Formel I, wobei der Arzneistoff-Rest D inaktiv ist, solange er an die -C(O)-Z-X-Brückengruppe gebunden ist, und wobei die Freisetzung des Wirkstoffs durch eine enzymatische Spaltung einer Esterbindung an der sn-2-Position des Phospholipids initiiert wird. Vorzugsweise wird die enzymatische Spaltung durch eine Phospholipase ausgeführt, stärker bevorzugt durch die Phospholipase A₂ (PLA₂).
Die am meisten bevorzugten Verbindungen gemäß der Endung sind:
1-Stearoyl-2-{3-[2-(2,6-dichloranilino)phenylacetamido]propanoyl}-sn-glycero-3-phosphocholin,
1-Stearoyl-2-{4-[2-(2,6-dichloranilino)phenylacetamido]butanoyl}-sn-glycero-3-phosphocholin,
1-Stearoyl-2-{5-[2-(2,6-dichloranilino)phenylacetamido]valeroyl}-sn-glycero-3-phosphocholin,
1-Stearoyl-2-{6-[2-(2,6-dichloranilino)phenylacetamido]hexanoyl}-sn-glycero-3-phosphocholin,
1-Stearoyl-2-{8-[2-(2,6-dichloranilino)phenylacetamido]octanoyl}-sn-glycero-3-phosphocholin,
1-Stearoyl-2-{12-[2-(2,6-dichloranilino)phenylacetamido]dodecanoyl}-sn-glycero-3-phosphocholin,
1-Stearoyl-2-{3-[1-(p-chlorbenzoyl)-5-methoxy-2-methylindolylacetamido]propanoyl}-sn-glycero-3-phosphocholin,
1-Stearoyl-2-{4-[1-(p-chlorbenzoyl)-5-methoxy-2-methylindolylacetamido]butanoyl}-sn-glycero-3-phosphocholin,
1-Stearoyl-2-{5-[1-(p-chlorbenzoyl)-5-methoxy-2-methylindolylacetamido]valeroyl}-sn-glycero-3-phosphocholin,
1-Stearoyl-2-{6-[1-(p-chlorbenzoyl)-5-methoxy-2-methylindolylacetamido]hexanoyl}-sn-glycero-3-phosphocholin,
1-Stearoyl-2-{8-(1-(p-chlorbenzoyl)-5-methoxy-2-methylindolylacetamido]octanoyl}-sn-glycero-3-phosphocholin,
1-Stearoyl-2-{3-[α-methyl-4-(2-methylpropyl)benzolacetamido]propanoyl}-sn-glycero-3-phosphocholin,
1-Stearoyl-2-{6-[α-methyl-4-(2-methylpropyl)benzolacetamido]hexanoyl}-sn-glycero-3-phosphocholin,
1-Stearoyl-2-{3-[(S)-6-methoxy-α-methyl-2-naphthalinacetamido]propanoyl}-sn-glycero-3-phosphocholin,
1-Stearoyl-2-{4-[(S)-6-methoxy-α-methyl-2-naphthalinacetamido]butanoyl}-sn-glycero-3-phosphocholin,
1-Stearoyl-2-{6-[(S)-6-methoxy-α-methyl-2-naphthalinacetamido]hexanoyl}-sn-glycero-3-phosphocholin, und
1-Stearoyl-2-{4-[2-(6-methoxynaphtyl)acetamido]butanoyl}-sn-glycero-3-phosphocholin.
Verbindungen der Erfindung sind zur Behandlung von Erkrankungen und Störungen nützlich, die mit entzündlichen Zuständen verbunden sind. Diese Verbindungen können als Prodrugs dienen, die bei anfänglicher enzymatischer Spaltung, der eine weitere enzymatische oder nicht enzymatische Spaltung (oder Spaltungen) folgen kann (können), nichtsteroidale entzündungshemmende Mittel an der erkrankten Stelle freisetzen.
Infolgedessen stellt in einer anderen Ausführungsform die Erfindung Arzneimittel bereit, die einen pharmazeutisch verträglichen Träger und als Wirkstoff eine Verbindung der allgemeinen Formel I
Formel I umfassen oder ein pharmazeutisch verträgliches Salz davon, wobei
R1 eine gesättigte oder ungesättigte, substituierte oder unsubstituierte Kohlenwasserstoffkette mit 2 bis 30 Kohlenstoffatomen ist;
R2 H oder eine Kopfgruppe eines Phospholipids ist;
D der Rest eines nichtsteroidalen, entzündungshemmenden Arzneistoffs ist, welcher eine funktionelle Gruppe, ausgewählt aus einer Carboxyl-, Hydroxyl-, Amin- und Thiolgruppe, aufweist, wobei D durch diese funktionelle Gruppe an eine Brückengruppe -C(O)-Ζ-X- gebunden ist, wobei Z eine gesättigte oder ungesättigte Kohlenwasserstoffkette mit 3 bis 15 Kohlenstoffatomen ist, und X aus Amino-, Hydroxy-Thio- und Carbonylgruppen so ausgewählt ist, dass, wenn die funktionelle Gruppe von D eine Carboxylgruppe ist, X aus einer Amino-, Hydroxy- und Thiogruppe ausgewählt ist, und, wenn die funktionelle Gruppe von D eine Amino-, Hydroxy- oder Thiogruppe ist, X eine Carbonylgruppe ist.
Die Arzneimittel diese Erfindung sind zur Behandlung von Erkrankungen und Störungen nützlich, die mit entzündlichen Zuständen verbunden sind, einschließlich, jedoch nicht beschränkt auf Autoimmunerkrankungen, wie Arthritis, rheumatoide Arthritis, Multiple Sklerose, Lupus visceralis, andere Erkrankungen, wie Asthma, Psoriasis, entzündliche Darmerkrankung, neurologische degenerative Erkrankungen, wie Alzheimer Krankheit, Parkinson Krankheit, Huntington Krankheit, vaskuläre Demenz und andere pathologische Zustände, wie Epilepsie, Migräne, Schlaganfall und Trauma.
Jede geeignete Art der Verabreichung des Arzneimittels kann gemäß der Erfindung verwendet werden, einschließlich, jedoch nicht beschränkt auf eine orale, oculare, nasale, parenterale, topische oder rektale Verabreichung. Die Arzneimittel können in der Form von Lösungen, Suspensionen, Kapseln, Tabletten, Aerosolen, Gelen, Salben oder Suppositorien vorliegen.
In noch einer anderen Ausführungsform stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Synthese der Verbindungen in Übereinstimmung mit der Erfindung bereit. Das Syntheseverfahren umfasst:

(i) Bereitstellen eines Moleküls y-X-Z-COOH, wobei y aus H und OH ausgewählt ist, Z eine gesättigte oder ungesättigte Kohlenwasserstoffkette mit 2 bis 15 Kohlenwasserstoffatomen ist, und X aus Amino-, Hydroxy-, Thio- und Carbonylgruppen ausgewählt ist;
(ii) Ersetzen von y durch eine geeignete Schutzgruppe B;
(iii) Herstellen des Anhydrids des Moleküls B-X-Z-COOH;
(iv) Acylieren eines Lysolecithins mit dem Anhydrid aus Schritt (iii), um ein 1-Acyl-2-acyl(X-B)-sn-glycero-3-phospholipid zu erhalten;
(v) Entfernen der Schutzgruppe B von der funktionellen Gruppe X; und
(vi) Kuppeln eines nichtsteroidalen, entzündungshemmenden Arzneistoffs D mit der funktionellen Gruppe X,

Weitere Aufgaben der vorliegenden Erfindung werden für einen Fachmann bei der Durchsicht der folgenden Offenbarung, einschließlich der detaillierten Beschreibung von spezifischen Ausführungsformen der Erfindung, offensichtlich werden.
KURZE BESCHREIBUNG DER ABBILDUNGEN
Die Erfindung wird anhand der detaillierten nachstehenden Beschreibung zusammen mit den Abbildungen vollständiger verstanden und eingeschätzt werden, wobei:
1 stellt die Änderung des Körpergewichts (%) von Ratten dar, die per os mit Mehrfachgaben entweder des Vehikels (offene Kreise), 10 mg/kg Diclofenac (DCF, gefüllte Kreise), 30 mg/kg 1-Stearoyl-2-{4-[2-(2,6-dichloranilino)phenylacetamido]butanoyl}-sn-glycero-3-phosphocholin (gekennzeichnet als DP-DCF; Z = 3; gefüllte Quadrate) oder 30 mg/kg 1-Stearoyl-2-{6-[2-(2,6-dichloranilino)phenylacetamido]hexanoyl}-sn-glycero-3-phosphocholin (gekennzeichnet als DP-DCF; Z = 5; gefüllte Dreiecke) behandelt wurden.
2 stellt die Gastro-Toxizitäts-Punktwerte für Ratten nach vierzehntägiger Behandlung mit einer täglichen Gabe per os entweder des Vehikels (weißer Balken), 10 mg/kg DCF (gestreifter Balken), 30 mg/kg DP-DCF; Z = 3 (grauer Balken) oder 30 mg/kg DP-DCF; Z = 5 (schwarzer Balken) dar.
3 stellt die Wirkung von DCF (10 mg/kg) und DP-DCF; Z = 5 (30 mg/kg) auf Carrageenan-induziertes Pfoten-Ödem bei Ratten dar. Die Volumina der behandelten Tierpfoten wurden 3, 5 und 7 Stunden (weiße, graue beziehungsweise schwarze Balken) nach der Carrageenan-Injektion gemessen und sind als prozentualer Anstieg des Pfotenvolumens gezeigt. Statistisch signifikante Wirkungen (p < 0,05) sind durch Sternchen (*) gekennzeichnet.
4 stellt die Spiegel der Neuronspezifischen Enolase (NSE) dar, die im Serum von Mongolischen Rennmäusen 24 Stunden nach dem Auslösen einer globalen Ischämie des Vorderhirns gemessen wurden. Die Rennmäuse wurden mit einer einzelnen oralen Verabreichung von 10 mg/kg DCF (gestreifter Balken), 30 mg/kg DP-DCF; Z = 5 (schwarzer Balken) oder dem Vehikel (grauer Balken) zwei Stunden vor dem Auslösen der Ischämie behandelt. Der NSE-Spiegel der scheinbehandelten Tiere ist durch einen weißen Balken gezeigt. Eine statistisch signifikante Wirkung (p < 0,05) ist durch ein Sternchen (*) gekennzeichnet.
5 stellt die Spiegel der Neuronspezifischen Enolase (NSE) dar, die im Serum von Mongolischen Rennmäusen 24 Stunden nach dem Auslösen einer globalen Ischämie des Vorderhirns gemessen wurden. Die Rennmäuse wurden mit einer täglichen oralen Verabreichung von 30 mg/kg DP-DCF; Z = 5 (schwarzer Balken) oder dem Vehikel (grauer Balken) über 5 Tage behandelt, beginnend 4 Tage vor dem Auslösen der Ischämie. Der NSE-Spiegel der scheinbehandelten Tiere ist durch einen weißen Balken gezeigt.
DETAILIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung betrifft eine Gruppe neuer Verbindungen, die nichtsteroidale entzündungshemmende Arzneistoffe (NSAIDs) umfasst, die kovalent über eine Brückengruppe an die sn-2-Position eines Phospholipids gebunden sind.
Die Verbindungen gemäß der Erfindung sind Phospholipid-Derivate, wobei der konjugierte NSAID-Rest pharmakologisch inaktiv ist und die gesteuerte Freisetzung des Wirkstoffs an dem Ort eines erkrankten Gewebes geschieht. Die Verbindungen, die hydrophober Natur sind, können biologische Membranen und Barrieren durchdringen, infolgedessen wird das gebundene Prodrug in die Zellen oder Organe effektiv transportiert. Die Spezifität der Aktivierung des entzündungshemmenden Prodrugs wird durch die Brückengruppe erbracht, die so gestaltet ist, dass sie gegenüber der Spaltung durch eine Phospholipase (z. B. PLA₂) empfindlich ist, die an dem Erkrankungsort spezifisch erhöht ist. Infolgedessen geschieht eine Anhäufung des Wirkstoffs an dem Ort der Erkrankung, wohingegen in gesundem Gewebe lediglich ein Basalwert der Prodrug-Spaltung vorkommen wird.
Es sollte verständlich sein, dass die neuen Verbindungen der Erfindung, in denen die NSAIDs als Prodrugs eingebracht sind, effektiver als ihre entsprechenden freien Arzneistoffe in mindestens zweierlei Hinsicht sind: (i) sie weisen höhere therapeutische Wirksamkeit bei relativ niedrigen Dosen auf, und (ii) sie zeigen geringere Nebenwirkungen und geringere Toxizität.
Demgemäß ist es möglich die Nützlichkeit von NSAIDs auf Zustände auszudehnen, die nicht auf niedrigere Dosen des Arzneistoffs ansprechen und unerwünschte Nebenwirkungen durch die gesteuerte Freisetzung des Wirkstoffs an der erkrankten Stelle zu verringern. Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform ist der freigesetzte Arzneistoff mit dem entsprechenden ursprünglichen Arzneistoff identisch, der für die Synthese einer Verbindung der Erfindung verwendet wird, daher wird erwartet, dass er eine ähnliche Breite der therapeutischen Wirksamkeit aufweist. Ebenfalls nützlich sind Arzneistoff-Derivate, die, obwohl sie von dem Phospholipid-Molekül freigesetzt sind, an die gesamte Brückengruppe oder einen Teil davon gebunden bleiben, wobei sie dennoch in der Lage sind, therapeutische Wirkungen auszuüben, die mit denen des ursprünglichen Arzneistoffs D vergleichbar sind.
Die Verbindungen der Erfindung weisen die allgemeine Formel I
Formel I auf oder sind ein pharmazeutisch verträgliches Salz davon, wobei
R1 eine gesättigte oder ungesättigte, substituierte oder unsubstituierte Kohlenwasserstoffkette mit 2 bis 30 Kohlenstoffatomen ist;
R2 H oder eine Kopfgruppe eines Phospholipids ist;
D der Rest eines nichtsteroidalen, entzündungshemmenden Arzneistoffs ist, welcher eine funktionelle Gruppe, ausgewählt aus einer Carboxyl-, Hydroxyl-, Amin- und Thiolgruppe, aufweist, wobei D durch diese funktionelle Gruppe an eine Brückengruppe -C(O)-Z-X- gebunden ist, wobei Z eine gesättigte oder ungesättigte Kohlenwasserstoffkette mit 2 bis 15 Kohlenstoffatomen ist, und X aus Amino-, Hydroxy-, Thio- und Carbonylgruppen so ausgewählt ist, dass, wenn die funktionelle Gruppe von D eine Carboxylgruppe ist, X aus einer Amino-, Hydroxy- und Thiogruppe ausgewählt ist, und, wenn die funktionelle Gruppe von D eine Amino-, Hydroxy- oder Thiogruppe ist, X eine Carbonylgruppe ist.
Es ist erwünscht, dass die geschaffene kovalente Bindung zwischen der Brückengruppe und dem Arzneistoff-Derivat, d. h. die X-D-Bindung eine stabile Ester-, Amid- oder Thioester-Bindung ist, die unter physiologischen Bedingungen nicht spontan dissoziiert.
In dem Entwurf einer Verbindung gemäß der Erfindung sollte, um sie als ein Prodrug zu verwenden, die spezielle Natur des zu behandelnden entzündlichen Zustands in Betracht gezogen werden. Dies schließt ein Bestimmen der gewünschten pharmakologischen Wirkung, die erreicht werden soll, ein, infolgedessen die Wahl des Arzneistoffs D und die Identifizierung des bestimmen Ortes, an dem die gewünschte pharmakologische Wirkung benötigt wird.
Es sollte angemerkt werden, dass die Anzahl der Kohlenstoffatome in der R1-Kette der Verbindung der allgemeinen Formel I gemäß der gewünschten Lipophilie des Moleküls bestimmt wird. Die Lipophilie des Moleküls ist direkt mit der gewählten Kohlenwasserstoffkettenlänge korreliert. Die R1-Ketten gemäß der Erfindung können 2 bis 30 Kohlenstoffatome enthalten. Moleküle mit R1, die 10 bis 20 Kohlenstoffatome aufweisen, sind am meisten erwünscht, da sie das Molekül mit einer geeigneten Hydrophobie zum Durchqueren biologischer Membranen ausstatten und gleichzeitig ein adäquates Substrat für die Wirkung der Phospholipase bereitstellen.
R1 kann eine gesättigte oder ungesättigte Kohlenwasserstoffkette sein, die eine oder mehrere Doppelbindungen enthält. Ein oder mehrere Kohlenwasserstoffatome der Kette können substituiert sein, zum Beispiel durch Halogenatome oder durch einen kleinen Alkylrest, wie Methylgruppen, mit der Maßgabe, dass die Substituenten noch einen freien Zugang für das gewünschte Spaltungsenzym zulassen.
In bevorzugten Ausführungsformen der Erfindung ist R1 ein Alkylrest einer ungeraden Anzahl von Kohlenstoffatomen. Stärker bevorzugt ist R1 ein Alkylrest von 15 oder 17 Kohlenstoffatomen, die den natürlich vorkommenden Palmitoylrest (C₁₆) beziehungsweise Stearoylrest (C₁₈) an der α-Position des Phospholipids ergeben.
Die Auswahl des entzündungshemmenden Arzneistoff-Rests D, der in die Verbindung der allgemeinen Formel I eingeschlossen werden soll, ist von der Erkrankung oder der Störung, die behandelt werden soll, abhängig. Jeder nichtsteroidale entzündungshemmende Arzneistoff, der eine freie -C(O)OH, -OH, -NH₂, -NH oder -SH-Gruppe besitzt, die für eine Umsetzung mit einer funktionellen Gruppe der Brückengruppe erreichbar ist, kann ausgewählt werden, um eine stabile kovalente Bindung D-X zu bilden. Geeignete NSAIDs schließen Arzneistoffe, die gegenwärtig auf dem Markt bekannt sind, ein, sind jedoch nicht auf diese beschränkt, wie beispielsweise:
1) Arylessigsäurederivate, wie Diclofenac, Etodolac, Ibufenac und Indomethacin, 2) Arylcarbonsäurederivate, wie Ketorolac, 3) Aminoarylcarbonsäurederivate, wie Flufenaminsäure, Meclofenaminsäure, Mefenaminsäure, Niflumsäure, 4) Arylpropionsäurederivate, wie Fenoprofen, Ibuprofen, Ketoprofen und Naproxen, 5) Salicylsäurederivate, wie Fendosal, Mesalamin und Salsalat und 6) Thiazincarbonsäureamide, wie Piroxicam und Tenoxicam.
Ebenfalls geeignet als Rest D sind aktive Metaboliten oder Derivate von NSAIDs, die ihre entzündungshemmende Wirkung beibehalten, vorausgesetzt, dass sie eine verfügbare funktionelle Gruppe aufweisen, wie vorstehend erwähnt, die leicht zur Umsetzung mit der geeigneten Brückengruppe erreichbar ist. Ein spezielles Beispiel für diese Art von Arzneistoff ist die Verbindung 6-Methoxy-2-naphthylessigsäure, die ein in vivo-Metabolit von Nabumeton [4-(6-Methoxy-2-naphthyl)butan-2-on] ist.
Gegenwärtig bevorzugte Ausführungsformen gemäß der Endung sind ausgewählt aus Prodrugs, wobei D ein Diclofenac-, Indomethacin-, Ibuprofen-, Naproxen- und 6-Methoxy-2-naphthylessigsäure-Rest ist, sind jedoch nicht auf diese beschränkt. Jedoch wird jeder dieser gegenwärtig bekannten nichtsteroidalen entzündungshemmenden Arzneistoffe oder sollte, die in Zukunft erhältlich sein werden, in Umfang und Konzept der vorliegenden Erfindung eingeschlossen, vorausgesetzt, dass der Arzneistoff entweder eine Carboxylgruppe, Hydroxylgruppe, ein primäres oder sekundäres Amin oder eine Thiolgruppe enthält, die für die Beteiligung an der kovalenten Bindung mit der Komponente X der Brückengruppe zugänglich sind.
Es ist erwünscht, eine Verbindung der allgemeinen Formel I bereitzustellen, wobei der entzündungshemmende Arzneistoff in der Lage ist, ein Enzym, das eine zentrale Rolle im Hervorrufen von entzündlichen Prozessen spielt, die zu einer Erkrankung oder Störung führen, zu hemmen, während sie keine nachteiligen Wirkungen auf andere grundlegende Prozesse der Zelle aufweist. Derartige erwünschte Arzneistoffe sind zum Beispiel Celecoxib (Searle & Co.) und Meloxicam (Boehringer, Ingelheim), die in der Lage sind, gezielt das Enzym Cyclooxygenase 2 (COX 2), das in entzündeten Zellen induziert wird, zu hemmen, nicht jedoch die Cyclooxygenase 1 (COX 1), die an der normalen Homöostasie beteiligt ist.
Die Wahl der bevorzugten Brückengruppe, -C(O)-Z-X- hängt von verschiedenen Erwägungen ab; sie sollte an einer stabilen kovalenten Bindung mit der D-Einheit teilnehmen, während sie sich selbst am Zielort zur Spaltung eignet. Eine bevorzugte Brückengruppe ist eine derartige, die unter normalen physiologischen Bedingungen, auf die die Verbindung auf ihrem Weg zum Zielort trifft, einer Spaltung widersteht. Die Brückengruppe sollte bei der enzymatischen Spaltung der Esterbindung an der sn-2-Position des Phospholipids der allgemeinen Formel I keine sterische Hinderung ergeben.
Abhängig von dem behandelten entzündlichen Zustand und der speziellen erkrankten Zelle oder der Organe, wird es mitunter erwünscht sein, eine derartige Brückengruppe zu wählen, die die Freisetzung des Wirkstoffs durch Erleichtern oder Verzögern seiner Abspaltung von dem Prodrug-Molekül steuert.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform beträgt die Gesamtzahl der Kohlenstoffatome in der Brückengruppe C(O)-Z-X mindestens 6, jedoch höchstens 15. Es wurde gefunden, dass diese Länge der Kohlenstoffkette einen Abstandshalter bereitstellt, der einen guten Zugang für ein Enzym, bevorzugt eine Phospholipase und insbesondere PLA₂ zur Verdauung der Esterbindung an der sn-2-Position des Phospholipids der allgemeinen Formel I ermöglicht. Kürzere Abstandshalter, insbesondere Brückengruppen, die weniger als vier Kohlenstoffatome umfassen, können problematisch sein, indem sie für die Wirkung der Phospholipase eine ungünstige sterische Umgebung bereiten. Ein Zustand sterischer Störung kann auch durch längere Abstandshalter erzeugt werden, d. h., wenn die Anzahl der Kohlenstoffatome in der Brückenkette größer als 15 ist.
X kann ausgewählt werden aus einer Amino-, Hydroxy-, Thio- und Carbonylgruppe, mit der Maßgabe, dass wenn die funktionelle Gruppe von D eine -C(O)OH-Gruppe ist, X keine Carbonylgruppe ist und wenn die funktionelle Gruppe von D eine -OH, -NH₂, -NH oder -SH Gruppe ist, X eine Carbonylgruppe ist.
Einige Kombinationen von X mit speziellen Arzneistoffen können ungünstig sein, da sie eine sehr labile Bindung ergeben, die spontan gespalten wird, wodurch die Wirksamkeit des Prodrugs stark verringert wird. Eine derartige ungünstige Kombination besteht zum Beispiel, wenn die funktionelle Gruppe von D eine Carboxylgruppe, wie zum Beispiel bei Diclofenac, ist, die eine kovalente Bindung mit X, das eine Carbonylgruppe ist, bildet. Die sich daraus ergebende Bindung -(CO)-O-(CO)- ist eine labile Bindung, die zum Dissoziieren neigt.
Die therapeutische Wirksamkeit einer speziellen Verbindung gemäß der Erfindung sollte durch einen Fachmann beurteilt werden, der die allgemeine Kenntnis der Pharmakologie und die Unterweisungen der vorliegenden Erfindung in Betracht zieht. Die Wahl einer spezifischen Verbindung, die als ein Prodrug gemäß der Erfindung verwendet werden soll, wird auch von der speziellen Erkrankung oder Störung, die behandelt werden soll, abhängen.
Es wird darauf hingewiesen, dass die Freisetzung des Wirkstoffs am Zielort durch eine erste Spaltung der Verbindung an der sn-2-Position des Phospholipids, bevorzugt durch eine Phospholipase, stärker bevorzugt durch die Phospholipase A₂ initiiert wird. PAL₂ ist aus zwei zwingenden Gründen das stärker bevorzugte Spaltungsenzym; (i) ihre erhöhte Aktivität ist ein gemeinsames Kennzeichen in vielen entzündlichen Prozessen und (ii) sie ist während der Entwicklung der entzündlichen Erkrankung abnorm erhöht. Infolgedessen wird der Arzneistoff, der an das Lipid gebunden ist, wegen der erhöhten PAL₂-Aktivität, bevorzugt am Ort der Entzündung freigesetzt. In Übereinstimmung mit der Erfindung ist das Phospholipid-NSAID-Konjugat-Prodrug so entworfen, dass es mehrere deutliche Vorteile gegenüber dem Stammarzneistoff aufweist, einschließlich der verbesserten Wirksamkeit, der Wirkkraft und der pharmakokinetischen Eigenschaften zusammen mit verminderter Toxizität. Es wird erwartet, dass die Prodrug-Verbindungen der Erfindung mit den vorstehend erwähnten Vorteilen wirkungsvolle alternative neue Arzneistoffe für Erkrankungen und Störungen, die mit Entzündungen verbunden sind, sein werden.
Die erste Spaltung an der sn-2-Position des Phospholipids kann ferner die nachfolgende Spaltung erleichtern, die für die Freisetzung des aktiven NSAID von der Brückengruppe notwendig ist. Diese zweite Spaltung kann enzymatisch oder nicht enzymatisch ausgeführt werden. Enzyme, die für die Durchführung der zweiten Spaltung infrage kommen, können eine Amidase, Esterase oder jedes andere geeignete Enzym einschließen, das an der erkrankten Stelle funktionell verfügbar ist.
In einer anderen Ausführungsform kann die Freisetzung eines wirksamen entzündungshemmenden Arzneistoffs aus der D-X-Bindung durch jede Spaltung an der sn-2-Position des Phospholipids initiiert werden, was zur Freisetzung eines wirksamen Arzneistoffs führt. Darüber hinaus kann, unter gewissen Umständen, der freigesetzte wirksame Arzneistoff sich von dem ursprünglichen Molekül des Stammarzneistoffs unterscheiden. Dies schließt Arzneistoff-Derivate ein, bei denen eine chemische Gruppe (chemische Gruppen) von der D-Struktur entfernt worden ist oder zu der D-Struktur hinzugefügt wurde. Diese Fälle sind in dem Konzept der Erfindung ebenfalls eingeschlossen, vorausgesetzt, dass das sich ergebende Arzneistoff-Derivat seine therapeutische Fähigkeit bewahrt. Vorzugsweise wird der Abspaltungsprozess des Moleküls der Endung spezifisch an den erkrankten Zellen initiiert, infolgedessen wird ein hoch spezifischer und hoch effektiver Arzneistoff an dem gewünschten Zielort freigesetzt.
Ungeachtet des exakten Wirkmechanismus ist es offensichtlich, dass die neuen Verbindungen der Erfindung ein erhöhtes therapeutisches Profil aufweisen. Darüber hinaus sind sie effektiver als ihre entsprechenden Stammarzneistoffe in mindestens zweierlei Hinsicht: (i) erhöhte Spezifität und (ii) verringerte Nebenwirkungen. Die Verbindungen der Erfindung können eine Erweiterung der Verwendbarkeit von NSAIDs auf Zustände, die nicht auf niedrigere Dosen des Arzneistoffs ansprechen, ermöglichen, sowie durch die gesteuerte Freisetzung des aktiven Arzneistoffs an der erkrankten Stelle eine Verringerung unerwünschter Nebenwirkungen ermöglichen.
In Übereinstimmung mit einer anderen Ausführungsform der Erfindung werden Arzneimittel bereitgestellt, die als Wirkstoff eine Verbindung der allgemeinen Formel I umfassen, wobei Z der Brückengruppe 3 bis 15 Kohlenstoffatome aufweist, und ein pharmazeutisch verträgliches Verdünnungsmittel oder einen Träger, die auf dem Fachgebiet bekannt sind.
Die Arzneimittel können in flüssiger, Aerosol- oder fester Darreichungsform vorliegen und können in jede geeignete Formulierung formuliert werden, einschließlich, jedoch nicht beschränkt auf, Lösungen, Suspensionen, Mizellen, Emulsionen, Mikroemulsionen, Aerosole, Salben, Gele, Suppositorien, Kapseln, Tabletten und dergleichen, je nach dem, wie es für den angemessenen Weg der Verabreichung benötigt wird.
Verbindungen der Erfindung sind in der Behandlung von Erkrankungen und Störungen, die mit einem entzündlichen Zustand verbunden sind, nützlich. Infolgedessen stellt die vorliegende Erfindung in noch einer anderen Ausführungsform ein Verfahren zur Behandlung einer derartigen entzündlichen Erkrankung oder Störung bereit, die das Verabreichen einer therapeutisch wirksamen Menge einer Verbindung der allgemeinen Formel I oder eines Arzneimittels in Übereinstimmung mit der Erfindung an einen Patienten umfasst, der dessen bedarf. Der Begriff „therapeutisch wirksame Menge", der in der Beschreibung verwendet wird, bezieht sich auf die Menge einer gegebenen Prodrug-Verbindung gemäß der Erfindung, die Aktivitäten entgegenwirkt oder hemmt, die mit entzündlichen Prozessen einhergehen, folglich entweder eine subjektive Erleichterung des Symptoms (der Symptome) oder eine objektiv nachweisbare Verbesserung bereitstellt, wie sie durch einen Kliniker oder einen anderen qualifizierten Beobachter festgestellt werden kann.
Insbesondere stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Behandlung einer Erkrankung oder Störung bereit, die mit einem entzündlichen Zustand verbunden ist, einschließlich, jedoch nicht beschränkt auf, Autoimmunerkrankungen, wie Arthritis, rheumatoide Arthritis, Multiple Sklerose, Lupus visceralis, andere Erkrankungen, wie Asthma, Psoriasis, entzündliche Darmerkrankung, neurologische degenerative Erkrankungen, wie Alzheimer Krankheit, Parkinson Krankheit, Huntington Krankheit, vaskuläre Demenz und andere pathologische Zustände, wie Epilepsie, Migräne, Schlaganfall und Trauma.
Jeder geeignete Weg der Verabreichung ist durch die Erfindung eingeschlossen, einschließlich, jedoch nicht beschränkt auf, orale, intravenöse, intramuskuläre, subkutane, Inhalations-, intranasale, topische, rektale oder andere bekannte Verabreichungswege. In bevorzugten Ausführungsformen werden die Arzneimittel der Erfindung oral oder nasal verabreicht.
Die Dosis-Bereiche für die Verabreichung der Zusammensetzungen der Erfindung sind derart, dass sie groß genug sind, um die gewünschte schützende Wirkung zu erzeugen. Dieser Dosierungsbereich für das Prodrug variiert mit dem verwendeten spezifischen Arzneistoff, dem behandelten entzündlichen Zustand oder der neurologischen Störung, dem Weg der Verabreichung und der Wirkkraft des speziellen Prodrug-Moleküls in der Freisetzung des Arzneistoffs an dem spezifischen Zielort. Die verabreichte Dosierung wird vom Alter, dem Geschlecht, dem Gesundheitszustand, dem Gewicht des Rezipienten, von konkurrierenden Behandlungen, sofern es welche gibt, von der Frequenz der Behandlung und der Art der gewünschten Wirkung abhängig sein. Die Dosierungsanweisung und die Mittel der Verabreichung werden durch den behandelnden Arzt oder einen Fachmann bestimmt.
In noch einer anderen Ausführungsform stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Synthese der Verbindungen der vorstehend definierten Formel I bereit, indem die Schritte des detaillierten Syntheseschemas, das nachstehend beschrieben ist, befolgt werden. Ein spezielleres Syntheseschema ist in Schema I gezeigt und in den Beispielen 1 bis 5 veranschaulicht. Allgemein gesprochen beinhaltet das Syntheseverfahren die folgenden Schritte:
Schritt 1: Schutz der funktionellen Einheit X an der Brückengruppe. Der Zweck dieses Schrittes ist es, chemische Umsetzungen von X während der Kopplung der Brückengruppe an das Lysolecithin-Molekül zu verhindern, sodass eine Verknüpfung der Brückengruppe an das Lipid ausschließlich über die Carboxylgruppe der Verknüpfungsgruppe HO(O)C-Z-X vermittelt wird.
Jede Schutzgruppe, die mit der funktionellen Einheit X reagiert, um ihre reaktive Funktion zu maskieren und die ohne weiteres nach der Kopplung entfernt werden kann, kann eingesetzt werden. Geeignete Reagenzien für die Verwendung als Schutzgruppen sind dem Fachmann wohlbekannt und schließen Folgende ein: Chlorameisensäurebenzylester, Dibenzyldicarbonat (zum Schutz einer NH₂- oder NH-Gruppe), Benzyloxymethylchlorid, Dihydropyran (zum Schutz einer OH-Gruppe), Diphenylcarbinol, Trimethylacetamidocarbinol (zum Schutz einer SH-Gruppe) und Methoxymethylchlorid (zum Schutz einer COOH-Gruppe), sind jedoch nicht auf diese beschränkt.
Passende Schutzgruppen-Reagenzien und Protokolle für deren Verwendung sind in Protecting Groups von Kocienski, P. (Thieme foundation of organic chemistry series, 1994) und in Protective Groups in Organic Synthesis von Greene, T. und Wuts, P. (John Wiley & Sons, Inc. 1991) beschrieben, deren Lehren hier durch Bezugnahme aufgenommen sind.
Schritt 2: Herstellung eines Anhydrids der geschützten Brückengruppe. Die Bildung des Anhydrids wird durch Verwendung eines Reagens, das ein Molekül Wasser von den zwei geschützten Brückengruppen entfernt, durchgeführt. Diese Umsetzung wird bevorzugt unter inerter Atmosphäre durchgeführt. Ein allgemein verwendetes Reagens für diese Umsetzung ist zum Beispiel Dicyclohexylcarbodiimid (DCC).
Schritt 3: Kopplung der geschützten Brückengruppe an das Lysolecithin. Dieser Schritt wird durch Acylierung des passenden Phospholipids an der sn-2-Position durchgeführt, um das 1-Acyl-2-acyl(X-geschützte)-sn-glycero-3-phospholipid zu ergeben.
Das Anhydrid der geschützten Brückengruppe und das entsprechende Lysolecithin werden in einem organischen Lösemittel, zum Beispiel Chloroform oder Methylenchlorid in Gegenwart eines Katalysators, zum Beispiel eines tert-Amins, wie Dimethylaminopyridin (DMAP) gelöst.
Schritt 4: Entfernung der Schutzgruppe von der funktionellen Gruppe X. Protokolle zur Entfernung der Schutzgruppen, die in Schritt 1 zum Schutz der funktionellen Gruppe X verwendet wurden, sind in Protecting Groups von Kocienski, P. (Thieme foundation of organic chemistry series, 1994) und in Protective Groups in Organic Synthesis von Greene, T. und Wuts, P. (John Wiley & Sons, Inc. 1991) beschrieben. In einem speziellen Verfahren wird die Schutzgruppe durch Hydrierung in Gegenwart von Pd/C entfernt.
Schritt 5: Kopplung eines nichtsteroidalen entzündungshemmenden Arzneistoffs an die Lipid-Einheit. Die Kopplung des entsprechenden Arzneistoffs an die funktionelle Gruppe X der Brückengruppe ist die letzte Stufe in dem Protokoll zur Synthese der erfindungsgemäßen Verbindungen. Diese Umsetzung wird in einem organischen Lösemittel in Gegenwart eines Reagens durchgeführt, das eine Kondensationsreaktion ermöglicht, bei der Wassermoleküle entfernt werden. Derartige üblicherweise verwendete Reagenzien sind zum Beispiel die Kombination von Triphenylphosphin und Aldrithiol-2.
Im Gegensatz zu anderen bekannten Verfahren zur Synthese von Lipid-Derivaten der Arzneistoffe ist das vorliegende Protokoll einzigartig, indem es den Arzneistoff-Verknüpfungsschritt als letzten Schritt vorsieht. Es ist wichtig, dass der Arzneistoff im letzten Schritt zugefügt wird, um mögliche Modifikationen und Verschlechterungen an seiner Struktur zu verhindern. Infolgedessen ist das in der vorliegenden Erfindung offenbarte Verfahren vorteilhaft hinsichtlich einer höheren Ausbeute des gewünschten Reaktionsprodukts und einer stark verringerten Menge an Nebenprodukten.
In einer bevorzugten Ausführungsform sind die reagierenden funktionellen Gruppen, die die X-D-Bindung bilden, -C(O)OH- und NH₂- oder NH-Gruppen, die eine Peptidbindung ergeben. Die Carboxyl- oder die Aminogruppen können entweder durch die Gruppe X an der Brückengruppe bereitgestellt werden oder als eine erreichbare funktionelle Gruppe am Arzneistoff-Molekül. Gemäß dieser bevorzugten Ausführungsform wird, wenn die reagierende Gruppe des Arzneistoffs eine Carboxylgruppe ist, diese mit einem Amin an der Brückengruppe umgesetzt und umgekehrt, wenn die reagierende Gruppe des Arzneistoffs ein Amin ist, ist ihr reagierendes Gegenstück an der Brückengruppe eine Carboxylgruppe.
BEISPIELE
Ein spezielles Schema für die Synthese der Verbindungen der Erfindung ist in Schema I umrissen. Dieses Schema ist nachstehend beispielhaft durch die detaillierte Beschreibung der Synthese spezifischer Lipid-Derivate von Diclofenac ([o-(2,6-dichloranilino)phenyl]essigsäure), Indomethacin (1-(p-Chlorbenzoyl)-5-methoxy-2-methyl-3-indolylessigsäure), Ibuprofen (2-(4-Isobutylphenyl)propionsäure), Naproxen (d-2-(6-Methoxy-2-naphthyl)propionsäure) und 6-Methoxy-2-naphthylessigsäure, die mit Phosphatidylcholin konjugiert sind, in den Beispielen 1 bis 5 aufgeführt. Die Synthese ist ein sechsstufiges Verfahren: Die erste Stufe ist der Schutz der funktionellen Gruppe an dem Verknüpfer, in diesem Fall der Aminogruppe von einer Aminosäure. Die zweite Stufe ist die Herstellung eines Anhydrids dieser geschützten Aminosäure. Die dritte Stufe ist die Bildung eines Lipid-Derivats, das die geschützte Aminosäure und ein Lysolecithin umfasst. Die Entfernung der Schutzgruppe, um das Aminosäurelipid-Konjugat zu ergeben, wird in der vierten und fünften Stufe durchgeführt. Die Verknüpfung des entsprechenden Arzneistoffs, in diesen besonderen Beispielen Diclofenac, Indomethacin, Ibuprofen, Naproxen oder 6-Methoxy-2-naphthylessigsäure, an 1-Acyl-2-(n-aminoacyl])-sn-glycero-3-phosphocholin wird in der letzten Stufe realisiert.
Schema I
Ein Schema zur Synthese von Phosphatidylcholin-Derivaten von Diclofenac, Indomethacin, Ibuprofen, Naproxen und 6-Methoxy-2-naphthylessigsäure.
Schritt 1:
C₆H₅CH₂OC(O)Cl + H₂N-(CH₂)n-COOH → C₆H₅CH₂OC(O)-NH-(CH₂)_n-COOH + HCl .
Schritt 2:
2C₆H₅CH₂OC(O)-NH-(CH₂)_n-COOH + C-C₆H₁₁-N=C=N-C₆H₁₁-c → [C₆H₅CH₂OC(O)-NH-(CH₂)_n-C(O)]₂O + (c-C₆H₁₁NH)₂CO
Schritt 3:
Schritt 4:
Schritt 5:

Schritt 6:
wobei HOOC-R_d in dem Synthese-Schema ein nichtsteroidaler entzündungshemmender Arzneistoff ist. Zum Beispiel kann HOOC-Rd ausgewählt sein aus:
BEISPIEL 1: Herstellung der Lipid-Derivate von Diclofenac (DP-DFC)
Stufe 1. Schutz der Aminogruppe der Aminosäure (Herstellung von Z-Aminosäure
Einem Gemisch von 0,1 mol der entsprechenden Aminosäure (Aminopropansäure, Aminobutansäure, Aminovaleriansäure, Aminohexansäure oder Aminooctansäure) in Ethanol (25 ml) in einem Einhalsrundkolben (250 ml), der mit einem Magnetrührer und einem Tropftrichter versehen ist, wird eine Lösung von NaOH (8,8 g, 0,22 mol) in 100 ml Wasser zugegeben, und das Gemisch wird mithilfe eines Magnetrührers bis zur vollständigen Lösung gerührt. Die so erhaltene Lösung wird auf 0°C in einem Eis/Wasserbad gekühlt, und Chlorameisensäurebenzylester (27,4 g, 0,15 mol) wird über 30 Minuten tropfenweise zugegeben. Das Reaktionsgemisch wird für 3 Stunden bei 0°C gerührt. Später werden der Reaktionslösung etwa 100 ml Wasser zugegeben, und das Gemisch wird in einen Scheidetrichter gegossen. Die Lösung wird mit Diethylether (3 × 50 ml) gewaschen. Die Wasserfraktion wird abgetrennt und mit HCl (3 N) auf einen pH-Wert = 1 angesäuert, während sie in einem Eis/Wasserbad gekühlt wird. Wenn sich ein Niederschlag bildet, wird dieser abgefiltert, mit Wasser gewaschen und in 100 ml Chloroform gelöst. Die Chloroform-Lösung wird mit Natriumsulfat für zwei Stunden getrocknet. Dann wird das Natriumsulfat von der Chloroformlösung durch Filtration abgetrennt, und das Lösemittel wird in einem Verdampfer unter Vakuum abgezogen. Der Rückstand wird mit Hexan gewaschen und über Nacht im Vakuum über Phosphorpentoxid (P₂O₅) getrocknet.
Wenn sich kein Niederschlag gebildet hat oder in der Absicht, die Produktausbeute zu maximieren, wird die angesäuerte wässrige Fraktion mit Chloroform (2 × 50 ml) gewaschen. Die Chloroformextrakte werden vereinigt und mit Wasser (50 ml) gewaschen. Die folgenden Arbeitsschritte mit der Lösung sind dieselben wie für die vorstehend beschriebene Chloroformlösung des Niederschlags, nämlich Trocknen mit Natriumsulfat für zwei Stunden, dann Abtrennen des Natriumsulfats von der Chloroformlösung durch Filtration und Abziehen des Lösemittels in einem Verdampfer unter Vakuum. Der Rückstand wird dann mit Hexan gewaschen und über Nacht im Vakuum über Phosphorpentoxid (P₂O₅) getrocknet.
Alle Produkte wurden auf einer DC wie folgt analysiert:
DC-Analyse: Kieselgel 60 auf Aluminiumfolie. Elutionsmittel ist Chloroform-Methanol (4 : 1 Vol./Vol.). Der Indikator ist ein Spray der Zusammensetzung: 4-Methoxybenzaldehyd (10 ml), absolutes Ethanol (200 ml), 98%ige Schwefelsäure (10 ml) und Eisessig (2 ml). Das Chromatogramm wird mit dem Indikator besprüht und dann unter Verwendung von heißer Luft bei 150–180 °C angekohlt. Folgendes sind die Zwischenprodukte, die am Ende von Stufe 1 des Synthese-Verfahrens erhalten wurden:
3-(Benzyloxycarbonylamino)propansäure. C₆H₅-CH₂-O-C(O)-NH-CH₂-CH₂-COOH.
Weißer Feststoff. Ausbeute 60%. DC-Analyse: ein Fleck R_f 0,7.
¹H NMR (CD₃OD), δ (ppm): 2,46–2,52 (t, 2H), 3,29–3,39 (t, 2H), 5,06 (s, 2H), 7,27–7,32 (m, 5H).
4-(Benzyloxycarbonylamino)butansäure. C₆H₅CH₂-O-C(O)-NH-(CH₂)₃-COOH.
Weißer Feststoff. Ausbeute 60%. DC-Analyse: ein Fleck R_f 0,7.
¹H NMR (CD₃OD), δ (ppm): 1,71–1,82 (m, 2H), 2,28–2,34 (t, 2H), 3,10–3,17 (t, 2H), 5,06 (s, 2H), 7,26–7,34 (m, 5H).
5-(Benzyloxycarbonylamino)valeriansäure. C₆H₅CH₂-O-C(O)-NH-(CH₂)₄-COOH.
Weißer Feststoff. Ausbeute 60%. DC-Analyse ein Fleck R_f 0,7.
¹H NMR (CD₃OD), δ (ppm): 1,45–1,50 (m, 2H), 1,56–1,62 (m, 2H), 2,25–2,31 (t, 2H), 3,08 –3,13 (t, 2H), 5,05 (s, 2H), 7,26–7,34 (m, 5H).
6-(Benzyloxycarbonylamiohexansäure. C₆H₅CH₂-O-C(O)-NH-(CH₂)₅-COOH.
Weißer Feststoff. Ausbeute 50%. Smp 54–56°C. DC-Analyse: ein Fleck R_f 0,7.
¹H NMR (CD₃OD), δ (ppm): 1,30–1,63 (mehrere m, 6H), 2,24–2,30 (t, 2H), 3,07–3,13 (t, 2H), 5,05 (s, 2H), 7,29–7,34 (m, 5H).
8-(Benzyloxycarbonylamino)octansäure. C₆H₅CH₂-O-C(O)-NH-(CH₂)₇-COOH.
Weißer Feststoff. Ausbeute 50%. DC-Analyse: ein Fleck R_f 0,7.
¹H NMR (CD₃OD), δ (ppm): 1,32 (breites s, 6H), 1,47–1,50 (m, 2H), 1,53–1,59 (m, 2H), 2,23 –2,29 (t, 2H), 3,06–3,12 (t, 2H), 5,05 (s, 2H), 7,29–7,34 (s, 5H).
12-(Benzyloxycarbonylamio)dodecansäure. C₆H₅CH₂-O-C(O)-NH-(CH₂)₁₁-COOH.
Weißer Feststoff. Ausbeute 50%. DC-Analyse: ein Fleck R_f 0,7.
¹H NMR (CD₃OD), δ (ppm): 1,30 (breites s, 14H), 1,48–1,51 (m, 2H), 1,54–1,59 (m, 2H), 2,25–2,29 (t, 2H), 3,06–3,13 (t, 2H), 5,05 (s, 2H), 7,29–7,34 (s, 5H).
Stufe 2. Synthese des Z-Aminosäureanhydrids.
Die Lösung der in Stufe 1 hergestellten entsprechenden Z-Aminosäure bei Stufe 1 (0,05 mol) in frisch destilliertem Dichlormethan (25 ml) wird unter einer inerten Argonatmosphäre in einen Zweihalsrundkolben (100 ml), der mit einem Magnetrührer und einem Tropftrichter versehen ist, gegeben. Eine Lösung von Dicyclohexylcarbodiimid (0,0325 mol) in 25 ml frisch destilliertem Dichlormethan wird, ebenfalls unter Argon, tropfenweise unter Rühren der Lösung der Z-Aminosäure zugegeben. Nach 20 Minuten Rühren wird der so erhaltene Harnstoff-Niederschlag abgefiltert und die Lösung unter Vakuum abgezogen. Der rohe Rückstand wird mit Hexan (2 × 20 ml) gewaschen und im Vakuum getrocknet.
DC-Analyse: Das gleiche Verfahren wird für die DC-Analyse der Anhydride aller Z-Aminosäuren verwendet. Kieselgel 60 auf Aluminiumfolie. Das Fließmittel ist ein Gemisch von Chloroform mit Aceton (8 : 2, Vol./Vol.). Zur Kennzeichnung wird Ninhydrin-Spray auf dem Chromatogramm verwendet, gefolgt von dem Ankohlen mit heißer Luft (100°C).
Anhydrid der 3-(Z-amino)propansäure
Weißer Feststoff. Die Ausbeute beträgt 70%. DC-Analyse: ein Fleck R_f 0,8.
Chemische Analyse: C₂₂H₂₄N₂O₇. Berechnet: C 61,68%, H 5,60%, N 6,54%. Gefunden: C 61,20%, H 5,52%, N 6,50%.
Anhydrid der 4-(Z-amino)butansäure
Weißer Feststoff. Die Ausbeute beträgt 70%. DC-Analyse ein Fleck R_f 0,8.
Chemische Analyse: C₂₄H₂₈N₂O₇. Berechnet: C 63,16%, H 6,14%, N 6,14%. Gefunden: C 62,77%, H 6,36%, N 5,88%.
Anhydrid der 5-(Z-amino)valeriansäure
Weißer Feststoff. Die Ausbeute beträgt 70%. DC-Analyse: ein Fleck R_f 0,8.
Chemische Analyse: C₂₆H₃₂N₂O₇. Berechnet: C 64,46%, H 6,61%, N 5,78%. Gefunden: C 64,09%, H 6,86%, N 5,49%.
Anhydrid der 6-(Z-amino)hexansäure
Weißer Feststoff. Die Ausbeute beträgt 70%. DC-Analyse: ein Fleck R_f 0,8.
Chemische Analyse: C₂₈H₃ ₆N₂O₇. Berechnet: C 64,46%, H 6,61%, N 5,79%. Gefunden: C 64,39%, H 6,85%, N 5,52%.
Anhydrid der 8-(Z-amino)octansäure
Weißer Feststoff. Die Ausbeute beträgt 75%. DC-Analyse ein Fleck R_f 0,85.
Chemische Analyse: C₃₂H₄₄N₂O₇. Berechnet: C 67,60%, H 7,75%, N 4,93%. Gefunden: C 67,44%, H 7,79%, N 4,72%.
Anhydrid der 12-(Z-amino)dodecansäure
Weißer Feststoff. Die Ausbeute beträgt 70%. DC-Analyse: ein Fleck R_f 0,85.
Chemische Analyse: C₄₀H₆₀N₂O₇. Berechnet: C 72,29%, H 9,04%, N 4,21%. Gefunden: C 72,02%, H 9,42%, N 4,12%.
Stufe 3. Herstellung des 1-Acyl-2-(Z-aminoacyl)-sn-glycero-3-phosphocholins.
Das Anhydrid der entsprechenden Z-Aminosäure, 0,01 mol gelöst in 150 ml frisch destilliertem Chloroform, wird unter einer inerten Argonatmosphäre in einen Einhalsrundkolben (250 ml), der mit einem Magnetrührer versehen ist, gegeben. Zu dieser Lösung werden 0,01 mol (1,22 g) 4-(Dimethylamino)pyridin (DMAP) in 25 ml Chloroform gegeben, gefolgt von der Zugabe einer Suspension von 0,0056 mol Lysolecithin in 50 ml Chloroform. Das Reaktionsgemisch wird energisch für 3 – 5 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Das Lysolecithin löst sich und das Reaktionsgemisch wird nach etwa 2 Stunden Rühren transparent. Die Umsetzung wird mittels DC unter Verwendung von Kieselgel 60 auf Aluminiumfolie kontrolliert, das Elutionsmittel ist Chloroform : Methanol : Wasser, 65 : 35 : 5, der Indikator ist ein Spray der Zusammensetzung: 4-Methoxybenzaldehyd (10 ml), absolutes Ethanol (200 ml), 98%ige Schwefelsäure (10 ml) und Eisessig (2 ml). Das Chromatogramm wird mit dem Indikator besprüht, gefolgt von Ankohlen mit heißer Luft bei 150°C. Es wird angenommen, dass die Umsetzung vollständig und beendet ist, wenn das gesamte Lysolecithin verschwunden ist. Das Reaktionsgemisch wird dann in einen Scheidetrichter überführt und mit einer Lösung von 1%iger HCl (3 × 50 ml) gewaschen, dann mit gesättigter Lösung von Natriumbicarbonat (3 × 50 ml) und schließlich mit Wasser (3 × 50 ml). Das so erhaltene Produkt in der organischen Lösung wird über Natriumsulfat getrocknet und dann filtriert. Das Lösemittel wird bei 30°C im Vakuum abgezogen, und der Rückstand wird mit Hexan gewaschen, und man lässt ihn über Nacht im Vakuum trocknen. Das so erhaltene Molekül 1-Acyl-2-(Z-aminoacyl)-sn-glycero-3-phosphocholin ist das Hauptprodukt der Umsetzung.
Das zweite Produkt der Umsetzung ist die Z-Aminosäure: In der Absicht, die Ausbeute dieses Produkts zu erhöhen, wird es aus dem Reaktionsgemisch zurückextrahiert wie folgt: Die wässrigen Natriumbicarbonatfraktionen werden gesammelt und vereinigt und dann mit 3 N HCl auf pH-Wert von 1 angesäuert. Die Z-Aminosäure wird mit Chloroform (2 × 50 ml) extrahiert. Die Chloroformextrakte werden vereinigt, einmal mit Wasser gewaschen und über Natriumsulfat für 30 Minuten unter Rühren getrocknet. Das Natriumsulfat wird durch Filtration entfernt, und das Chloroform wird abgezogen. Danach wird der Rückstand mit Hexan gewaschen und über P₂O₅ im Vakuum getrocknet.
DC-Analyse: Kieselgel 60 auf Aluminiumfolie. Das Elutionsmittel ist Chloroform/Methanol/Wasser (65 : 35 : 5, Vol./Vol.). Der Indikator ist ein Spray der Zusammensetzung: 4-Methoxybenzaldehyd (10 ml), absolutes Ethanol (200 ml), 98%ige Schwefelsäure (10 ml) und Eisessig (2 ml). Das Chromatogramm wird mit dem Indikator besprüht und dann unter Verwendung von heißer Luft bei 100–150°C angekohlt.
1-Stearoyl-2-[3-(benzyloxycarbonylamino)propanoyl]-sn-glycero-3-phosphocholin.
Weißes Wachs. Ausbeute 70%. DC-Analyse: ein Fleck. R_f 0,55.
¹H NMR (CDCl₃), δ (ppm): 0,83–0,89 (t, 3H), 1,23–1,27 (breites s, 28H), 1,54 (m, 2H), 2,22– 2,29 (t, 2H), 2,53–2,56 (m, 2H), 3,15 (s, 9H), 3,41–3,44 (m, 2H), 3,60–3,63 (m, 2H), 3,85– 3,96 (m, 2H), 4,13–4,25 (m, 4H), 5,05 (s, 2H), 5,20 (m, 1H), 7,27–7,33 (m, 5H).
1-Stearoyl-2-[4-(benzyloxycarbonylamino)butanoyl]-sn-glycero-3-phosphocholin
Weißes Wachs. Ausbeute 70%. DC-Analyse: ein Fleck. R_f 0,55.
¹H NMR (CDCl₃), δ (ppm): 0,84–0,88 (t, 3H), 1,25 (breites s, 28H), 1,52–1,55 (m, 2H), 1,72– 1,80 (m, 2H), 2,23–2,32 (m, 4H), 3,07–3,14 (m, 2H), 3,18 (s, 9H), 3,61–3,65 (m, 2H), 3,86– 3,94 (m, 2H), 4,10–4,25 (m, 4H), 5,06 (s, 2H), 5,22 (m, 1H), 7,26–7,33 (m, 5H).
1-Stearoyl-2-[5-(benzyloxycarbonylamino)valeroyl]-sn-glycero-3-phosphocholin
Weißes Wachs. Ausbeute 70%. DC-Analyse: ein Fleck. R_f 0,55.
¹H NMR (CDCl₃, δ (ppm): 0,84–0,89 (t, 3H), 1,26 (breites s, 28H), 1,54–1,65 (m, 4H), 1,72– 1,77 (m, 2H), 2,23–2,30 (m, 4H), 3,07–3,12 (m, 2H), 3,16 (s, 9H), 3,61–3,65 (m, 2H), 3,86– 3,94 (m, 2H), 4,10–4,25 (m, 4H), 5,06 (s, 2H), 5,20 (m, 1H), 7,26–7,33 (m, 5H).
1-Stearoyl-2-[6-(benzyloxycarbonylamino)hexanoyl]-sn-glycero-3-phosphocholin
Weißes Wachs. Ausbeute 65%. DC-Analyse: ein Fleck. R_f 0,55.
¹H NMR (CDCl₃), δ (ppm): 0,84–0,89, (t, 3H), 1,24 (breites s, 28H), 1,30–1,62 (mehrere m, 8H), 2,22–2,30 (m, 4H), 3,06–3,12 (m, 2H), 3,15 (s, 9H), 3,61–3,65 (m, 2H), 3,88–3,97 (m, 2H), 4,10–4,25 (m, 4H), 5,05 (s, 2H), 5,20 (m, 1H), 7,25–7,32 (m, 5H).
1-Stearoyl-2-[8-(benzyloxycarbonylamino)octanoyl]-sn-glycero-3-phosphocholin
Weißes Wachs. Ausbeute 65%. DC-Analyse: ein Fleck. R_f 0,55.
¹H NMR (CDCl₃), δ (ppm): 0,84–0,89 (t, 3H), 1,25 (breites s, 28H), 1,30–1,33 (m, 6H), 1,46– 1,49 (m, 2H), 1,52–1,58 (m, 4H), 2,22–2,29 (m, 4H), 3,05–3,10 (m, 2H), 3,17 (s, 9H), 3,61– 3,65 (m, 2H), 3,85–3,96 (m, 2H), 4,10–4,23 (m, 4H), 5,06 (s, 2H), 5,20 (m, 1H), 7,22– 7,29 (m, 5H).
1-Stearoyl-2-[12-(benzyloxycarbonylamino)dodecanoyl]-sn-glycero-3-phosphocholin
Weißer Feststoff. Ausbeute 60%. DC-Analyse: ein Fleck. R_f 0,53.
¹H NMR (CDCl₃) δ ppm): 0,84–0,88 (t, 3H), 1,23 (breites s, 28H), 1,30 (breites s, 14H), 1,45 –1,50 (m, 4H), 1,53–1,59 (m, 2H), 2,23–2,50 (m, 4H), 3,06–3,12 (m, 2H), 3,17 (s, 9H), 3,62 –3,67 (m, 2H), 3,84–3,94 (m, 2H), 4,10–4,25 (m, 4H), 5,05 (s, 2H), 5,20 (m, 1H), 7,23– 7,30 (m, 5H).
Schritt 4. Entfernung der Benzyloxycarbonyl-Schutzgruppe
Das so erhaltene 1-Stearoyl-2-[(benzyloxycarbonylamino)acyl]-3-phosphocholin (0,0025 mol) wird in einem Gemisch von 100 ml Methanol und 5 ml Essigsäure gelöst. Die Lösung wird in einen Doppelhalsrundkolben (200 ml), der mit einem Magnetrührer versehen ist, unter Argonatmosphäre gegeben. Pd/C (0,5 g) wird der Lösung zugegeben, und Wasserstoff wird für 4 Stunden durch das Reaktionsgemisch geblasen. Der Fortgang der Umsetzung wird mittels DC-Analyse überwacht unter den folgenden Bedingungen: Kieselgel 60 auf Aluminiumfolie. Das Elutionsmittel ist ein Gemisch aus Chloroform/Methanol/Wasser (65 : 35 : 5, Vol./Vol.), der Indikator ist ein Spray der Zusammensetzung: p-Methoxybenzaldehyd (10 ml), absolutes Ethanol (200 ml), 98%ige Schwefelsäure (10 ml) und Eisessig (2 ml). Das Chromatogramm wird mit dem Indikator besprüht und dann unter Verwendung von heißer Luft bei 100–150°C angekohlt.
Es wird vermutet, dass die Umsetzung komplett und die Hydrierung gestoppt ist, nachdem das gesamte 1-Stearoyl-2-[(benzyloxycarbonylamino)acyl]-sn-glycero-phosphocholin verschwunden ist. Das Reaktionsgemisch wird dann durch Celete filtriert, um Pd/C zu entfernen, und bei 30°C unter Vakuum verdampft. Der rohe Rückstand wird mit Ether (3 × 30 ml) gewaschen und über Nacht im Vakuum getrocknet. Die Bedingungen der DC-Analyse sind die gleichen, wie vorstehend angezeigt.
1-Stearoyl-2-(3-aminopropanoyl)-sn-glycero-3-phosphocholinacetat
Weißes Wachs. Ausbeute 70%. DC-Analyse: ein Fleck. R_f 0,2.
¹H NMR (CD₃OD), δ (ppm): 0,87–0,92 (t, 3H), 1,28 (breites s, 28H), 1,58–1,61 (m, 2H), 1,92 (s, 3H), 2,30–2,38 (t, 2H), 2,71–2,77 (t, 2H), 3,17–3,19 (m, 2H), 3,22 (s, 9H), 3,62– 3,65 (m, 2H), 3,87–4,48 (mehrere m, 6H), 5,24 (m, 1H).
³¹P NMR (CD₃OD), δ (ppm): 0,01 (s).
Chemische Analyse: C₂₉H₅₉N₂O₈P·CH₃COOH. Berechnet: C 56,88%, H, 9,63%, N, 4,28%, P 4,74%. Gefunden: C 57,01%, H 10,11%, N 4,18%, P 4,52%.
1-Stearoyl-2-(4-aminobutanoyl)-sn-glycero-3-phosphocholinacetat
Weißes Wachs. Ausbeute 70%. DC-Analyse: ein Fleck. R_f 0,2
¹H NMR (CD₃OD), δ (ppm): 0,86–0,92 (t, 3H), 1,28 (breites s, 28H), 1,56–1,60 (m, 2H), 1,94 (s, 3H), 1,96–1,99 (m, 2H), 2,29–2,35 (t, 2H), 2,46–2,52 (m, 2H), 2,95–3,02 (t, 2H), 3,22 (s, 9H), 3,62–3,66 (m, 2H), 3,87–4,46 (mehrere m, 6H), 5,21–5,22 (m, 1H).
³¹P NMR (CD₃OD), δ (ppm): 0,01 (s).
Chemische Analyse: C₃₀H₆₁N₂O₈P·CH₃COOH. Berechnet: C 57,48%, H, 9,73%, N, 4,19%, P 4,64%. Gefunden: C 57,12%, H 9,55%, N 4,22%, P 4,38%.
1-Stearoyl-2-(5-aminovaleryl)-sn-glycero-3-phosphocholinacetat
Weißes Wachs. Ausbeute 70%. DC-Analyse: ein Fleck. R_f 0,2.
¹H NMR (CD₃OD), δ (ppm): 0,87–0,92 (t, 3H), 1,27 (breites s, 28H), 1,55–1,61 (m, 2H), 1,92 (s, 3H), 1,96–2,10 (m, 2H), 2,29–2,35 (t, 2H), 2,46–2,52 (m, 2H), 2,95–3,02 (t, 2H), 3,22 (s, 9H), 3,62–3,66 (m, 2H), 3,85–4,46 (mehrere m, 6H), 5,19–5,21 (m, 1H).
³¹P (CD₃OD), δ (ppm): 0,01 (s).
Chemische Analyse: C₃₁H₆₃N₂O₈P·CH₃COOH. Berechnet: C 58,06%, H 9,82%, N 4,05%, P 4,54%. Gefunden: C 57,90%, H 10,01%, N 4,20%, P 4,48%.
1-Stearoyl-2-(6-aminohexanoyl)-sn-glycero-3-phosphocholinacetat
Weißes Wachs. Ausbeute 65%. DC-Analyse: ein Fleck. R_f 0,2.
¹H NMR (CD₃OD), δ (ppm): 0,86–0,92 (t, 3H), 1,28 (breites s, 28H), 1,32–1,50 (m, 2H), 1,56 –1,72 (breites m, 6H), 1,91 (s, 3H), 2,28–2,40 (breites m, 4H), 2,88–2,94 (t, 2H), 3,22 (s, 9H), 3,61–3,66 (m, 2H), 3,95–4,08 (m, 2H), 4,10–4,38 (mehrere m, 4H), 5,24 (m, 1H).
³¹P NMR (CD₃OD), δ (ppm): 0,01 (s).
Chemische Analyse: C₃₂H₆₅N₂O₈P·CH₃COOH. Berechnet: C 58,62%, H 9,91%, N 4,02%, P 4,45%. Gefunden: C 58,19%, H 10,11 %, N 4,12%, P 4,58%.
1-Stearoyl-2-(8-aminoctanoyl)-sn-glycero-3-phosphocholinacetat
Weißes Wachs. Ausbeute 65%. DC-Analyse: ein Fleck. R_f 0,2.
¹H NMR (CD₃OD), δ (ppm): 0,86–0,92 (t, 3H), 1,28 (breites s, 28H), 1,37 (s, 6H), 1,59–1,67 (breites m, 6H), 1,93 (s, 3H), 2,28–2,39 (breites m, 4H), 2,86–2,92 (t, 2H), 3,22 (s, 9H), 3,62– 3,66 (m, 2H), 3,97–4,03 (m, 2H), 4,13–4,39 (mehrere m, 4H), 5,22–5,23 (m, 1H).
³¹P (CD₃OD), δ (ppm): 0,01 (s).
Chemische Analyse: C₃₄H₆₉N₂O₈P·CH₃COOH. Berechnet: C 59,67%, H 10,08%, N 3,87%, P 4,28%. Gefunden: C 59,22%, H 10,21%, N 3,99%, P 4,08%.
1-Stearoyl-2-(12-aminododecanoyl)-sn-glycero-3-phosphocholinacetat
Weißer Feststoff. Ausbeute 60%. DC-Analyse: ein Fleck. R_f 0,2.
¹H NMR (CD₃OD), δ (ppm): 0,85–0,90 (t, 3H), 1,28 (s, 28H), 1,36 (breites s, 14H), 1,56–1,68 (m, 6H), 1,94 (s, 3H), 2,29–2,39 (m, 4H), 2,85–2,90 (m, 2H), 3,20 (s, 9H), 3,60–3,66 (m, 2H), 3,95–4,03 (m, 2H), 4,12–4,37 (mehrere m, 4H), 5,21–5,23 (m, 1H).
³¹P (CD₃OD), ? (ppm): 0,01 (s).
Chemische Analyse: C₄₀H₈₁N₂O₁₀P·CH₃COOH. Berechnet: C 61,54%, H 10,38%, N 3,59%, P 3,97%. Gefunden: C 61,36%, H 10,69%, N 3,41%, P 3,85%.
Stufe 5. Herstellung des freien 1-Acyl-2-[n-(aminoacyl)-sn-glycero-3-phosphocholins.
Die Lösung von Essigsäure und dem entsprechenden 1-Acyl-2-[n-aminoacyl-sn-glycero-3-phosphatidylcholinkomplex (1,36 mmol) in Methylenchlorid (30 ml) wird in einen Einhalsrundkolben (150 ml), der mit einem Magnetrührer versehen ist, gegeben.
Triethylamin (0,3 ml, 3 mmol) wird zu dieser Lösung zugegeben. Das so erhaltene Reaktionsgemisch wird bei Raumtemperatur für 30 Minuten gerührt. Während dieses Verfahrens wird das freie 2-Aminoacyllipid gebildet. Die Reaktionslösung mit dem so erhaltenen freien 2-Aminoacyllipid wird für die folgende Synthese ohne zusätzliche Behandlung verwendet.
Stufe 6. Herstellung von 1-Acyl-(2-n-arylacetamidoacyl)-sn-glycero-3-phosphocholin.
Ein Gemisch des entsprechenden Arzneistoffs, in diesem Fall Diclofenac [o-[(2,6-Dichlorphenyl)amino]phenyl]essigsäure] (1,36 mmol), Triphenylphosphin (0,72 g, 2,75 mmol) und Aldrithiol (0,6 g, 2,75 mmol) wird unter einer inerten Argonatmosphäre in einen Reaktionskolben, der die Lösung des freien 2-Aminoacyllipids in Methylenchlorid (siehe Stufe 5) enthält, gegeben. Die Umsetzung wird sofort gelb und wird unter Rühren für eine Stunde bei Raumtemperatur unter Argonatmosphäre stehen gelassen. Das Lösemittel wird dann durch Verdampfen entfernt, und das Produkt wird extrahiert und durch Flash-Säulenchromatografie gereinigt, wobei die Zusammensetzung der mobilen Phase variiert. Zum Extrahieren und Reinigen von 1 g des festen Reaktionsgemischs wurden 35 g Kieselgel 60 (230–400 Mesh ASTM) in einer Glassäule (40 × 2 cm) mit einem Druck von etwa 1,5 atm verwendet. Die erste Fraktion des Elutionsmittels sind 150 ml eines Gemischs von Chloroform mit Methanol (65 : 35 Vol./Vol.). Die zweite Fraktion des Elutionsmittels sind 250 ml eines Gemischs von Chloroform, Methanol und Wasser (65 : 35 : 5 Vol./Vol.). In der ersten Fraktion werden die Hauptverunreinigungen entfernt, und in der zweiten Fraktion wird die Feinreinigung des Endprodukts, d. h. des Phospholipid-Arzneistoff-Konjugats durchgeführt.
Lipid-Derivate von Diclofenac (DP-DFC)
All die vorstehend erwähnten synthetisierten Produkte sind fahl gelbe Feststoffe, die, wenn sie mittels DC analysiert werden, einen hellroten Fleck zeigen, R_f ist 0,3. Die DC-Analysebedingungen sind wie folgt: Kieselgel 60 auf Aluminiumfolie. Das Elutionsmittel ist Chloroform : Methanol : Wasser (65 : 35 : 5, Vol./Vol.). Der Indikator ist ein Spray der Zusammensetzung: 4-Methoxybenzaldehyd (10 ml), absolutes Ethanol (200 ml), 98%ige Schwefelsäure (10 ml) und Eisessig (2 ml). Das Chromatogramm wird mit dem Indikator besprüht und dann unter bei 100°C angekohlt.
1-Stearoyl-2-{3-[2-(2,6-dichloranilino)phenylacetamido]propanoyl}-sn-glycero-3-phosphocholin.
Ausbeute 75%.
¹H NMR (CD₃OD), δ (ppm): 0,84–0,89 (t, 3H), 1,26 (breites s, 28H), 1,54–1,59 (m, 2H), 2,27 –2,33 (t, 2H), 2,56–2,61 (t, 2H), 3,18 (s, 9H), 3,44–3,49 (t, 2H), 3,58– 3,61 (m, 2H), 3,68 (s, 2H), 4,02–4,05 (m, 2H), 4,19–4,26 (m, 3H), 4,36–4,38 (m, 1H), 5,21–5,25 (m, 1H), 6,36– 6,40 (d, 1H), 6,84–6,90 (t, 1H), 7,02–7,09 (m, 2H), 7,20–7,24 (d, 1H), 7,37 –7,41 (d, 2H).
³¹P (CD₃OD), δ (ppm): –0,84 (s).
Chemische Analyse: C₄₃H₆₈N₃O₉PCl₂·H₂O. Berechnet: C 56,83%, H, 7,93%, N, 4,62%, P 3,41 %: Gefunden: C 57,01 %, H 7,59%, N 4,27%, P 3,39%.
1-Stearoyl-2-{4-[2-(2,6-dichloranilino)phenylacetamido]butanoyl)-sn-glycero-3-phosphocholin.
Ausbeute 75%.
¹H NMR (CD₃OD), δ (ppm): 0,86–0,90 (t, 3H), 1,25 (breites s, 28H), 1,53–1,57 (m, 2H), 1,80 –1,84 (m, 2H), 2,27–2,31 (t, 2H), 2,36–2,41 (t, 2H), 3,17 (s, 9H), 3,19– 3,25 (m, 2H), 3,57– 3,60 (m, 2H), 3,66 (s, 2H), 4,00–4,03 (m, 2H), 4,17–4,25 (m, 3H), 4,37– 4,41 (m, 1H), 5,21– 5,25 (m, 1H), 6,37–6,40 (d, 1H), 6,85–6,89 (t, 1H), 7,01–7,07 (m, 2H), 7,19 –7,22 (d, 1H), 7,37–7,40 (d, 2H).
³¹P (CD₃OD), δ (ppm): –0,88 (s).
MS: C₄₄H₇₀N₃O₉PCl₂. Gefunden: m/e: 886,9 (FAB) (Haupt-Peak).
Chemische Analyse: C₄₄H₇₀N₃O₉PCl₂·H₂O. Berechnet: C 57,27%, H 8,03%, N 4,56%, P 3,36%. Gefunden: C 57,21%, H 8,11%, N 4,61%, P 3,32%.
1-Stearoyl-2-{5-[2-(2,6-dichloranilino)phenylacetamido]valeryl}-sn-glycero-3-phosphocholin.
Ausbeute 75%.
¹H NMR (CD₃OD), δ (ppm): 0,83–0,89 (t, 3H), 1,24 (breites s, 28H), 1,54– 1,64 (breites m, 6H), 2,26–2,34 (m, 4H), 3,18–3,23 (m, 11H), 3,58–3,62 (m, 2H), 3,66 (s, 2H), 4,00–4,03 (m, 2H), 4,16–4,25 (m, 3H), 4,36–4,38 (m, 1H), 5,21–5,25 (m, 1H), 6,36– 6,40 (d, 1H), 6,87 –6,89 (t, 1H), 7,02–7,08 (m, 2H), 7,19–7,22 (d, 1H), 7,37–7,40 (d, 2H).
³¹P NMR (CD₃OD), δ (ppm): –0,92 (s).
Chemische Analyse: C₄₅H₇₂N₃O₉PCl₂. Berechnet: C 60,00%, H, 8,00%, N, 4,66%, P 3,44%, Cl 7,88%. Gefunden: C 59,64%, H 8,28%, N 4,69%, P 3,54%, Cl 7,66%.
1-Stearoyl-2-{6-[2-(2,6-dichloranilino)phenylacetamidol}hexanoyl}-sn-glycero-3-phosphocholin.
Ausbeute 80%.
¹H NMR (CD₃OD), δ (ppm): 0,85–0.90 (t, 3H), 1,26–1,35 (breites s, 30H), 1,50–1,61 (m, 6H), 2,26–2,34 (m, 4H), 3,16–3,22 (m, 11H), 3,59–3,66 (m, 4H), 4,00–4,02 (m, 2H), 4,19– 4,26 (mehrere m, 3H), 4,38–4,40 (m, 1H), 5,21–5,25 (m, 1H), 6,37–6,40 (d, 1H), 6,83–6,90 (t, 1H), 6,99–7,07 (mehrere m, 2H), 7,18–7,22 (d, 1H), 7,37–7,41 (d, 2H).
³¹P NMR (CD₃OD), δ (ppm): –0,92 (s).
Chemische Analyse: C₄₆H₇₄N₃O₉PCl₂·2H₂O. Berechnet: C 58,10%, H, 8,21%, N, 4,42%, P 3,26%. Gefunden: C 58,31%, H 8,36%, N 4,11%, P 3,30%.
1-Stearoyl-2-{8-[2-(2,6-dichloranilino)phenylacetamidol}octanoyl}-sn-glycero-3-phosphocholin.
Ausbeute 80%.
¹H NMR (CD₃OD), δ (ppm): 0,85–0,91 (t, 3H), 1,26–1,30 (breites s, 34H), 1,51–1,60 (m, 6H), 2,26–2,34 (m, 4H), 3,16–3,22 (m, 11H), 3,60–3,65 (m, 4H), 3,96–4,02 (m, 2H), 4,16– 4,27 (mehrere m, 3H), 4,38–4,40 (m, 1H), 5,19–5,24 (m, 1H), 6,36–6,40 (d, 1H), 6,83–6,90 (t, 1H), 6,99–7,09 (mehrere m, 2H), 7,18–7,22 (d, 1H), 7,37–7,41 (d, 2H).
³¹P NMR (CD₃OD), δ (ppm): –0,91 (s).
Chemische Analyse: C₄₈H₇₈N₃O₉PCl₂·2H₂O. Berechnet: C 58,90%, H, 8,38%, N, 4,29%, P 3,16%. Gefunden: C 59,19%, H 8,39%, N 4,19%, P 3,20%.
1-Stearoyl-2-{12-[2-(2,6-dichloranilino)phenylacetamidoldodecanoyl}-sn-glycero-3-phosphocholin
Ausbeute 70%.
¹H NMR (CD₃OD), δ (ppm): 0,87–0,92 (t, 3H), 1,28 (breites s, 42H), 1,49– 1,62 (breites m, 6H), 2,28–2,36 (m, 4H), 3,16–3,22 (m + s, 11H), 3,62–3,66 (m + s, 4H), 3,98 –4,03 (t, 2H), 4,18–4,29 (m, 3H), 4,41–4,42 (d, 1H), 5,20 (breites m, 1H), 6,37–6,41 (d, 1H), 6,87–6,90 (t, 1H), 7,02–7,10 (m, 2H), 7,19–7,22 (d, 1H), 7,39–7,42 (d, 2H).
³¹P NMR (CD₃OD), δ (ppm): –1,71 (s).
Chemische Analyse: C₅₂H₈₆N₃O₉PCl₂·H₂O. Berechnet: C 61,42%, H, 8,66%, N 4,13%, P 3,05%. Gefunden: C 61,33%, H 9,07 %, N 4,18 %, P 2,85%.
BEISPIEL 2: Herstellung der Lipid-Derivate des Indomethacins (DP-Indo)
Das Verfahren zur Herstellung der Lidipd-Derivate des Indomethacin (1-(p-Chlorbenzoyl)-5-methoxy-2-methyl-3-indolylessigsäure) ist das gleiche wie das in Beispiel 1, Schritte 1 bis 6 umrissene, mit der Ausnahme, dass in Schritt 6 der in das Reaktionsgemisch eingeschlossene Arzneistoff Indomethacin anstelle von Diclofenac ist.
Lipid-Derivate des Indomethacins (DP-Indo) Die synthetisierten Verbindungen wurden einer DC-Analyse unter den folgenden Bedingungen unterzogen: Kieselgel 60 auf Aluminiumfolie. Das Elutionsmittel ist Chloroform : Methanol Wasser (65 : 35 : 5, Vol./Vol.). Der Indikator ist ein Spray der Zusammensetzung: 4-Methoxybenzaldehyd (10 ml), absolutes Ethanol (200 ml), 98%ige Schwefelsäure (10 ml) und Eisessig (2 ml). Das Chromatogramm wird mit dem Indikator besprüht und dann bei 100°C angekohlt.
1-Stearoyl-2-{3-[1-(p-chlorbenzoyl)-5-methoxy-2-methyl-3-indolylacetamido]propanoyl}-sn-glycero-3-phosphocholin.
Fahl gelbes Wachs. Ausbeute 80%.
DC-Analyse: ein Fleck. R_f ist 0,35.
¹H NMR (CD₃OD), δ (ppm): 0,85–0,91 (t, 3H), 1,26–1,30 (breites s, 28 H), 1,52–1,55 (m, 2H), 2,25–2,31 (m, 5H), 2,54–2,60 (t, 2H), 3,18 (m, 9H), 3,43–3,46 (t, 2H), 3,57–3,62 (m, 4H), 3,81 (s, 3H), 3,98–4,02 (m, 2H), 4,13–4,25 (mehrere m, 4H), 5,16 (m, 1H), 6,64–6,69 (d, 1H), 6,92–6,95 (d, 1H), 7,00 (s, 1H), 7,54–7,58 (d, 2H), 7,67–7,72 (d, 2H).
³¹P (CD₃OD), δ (ppm): –0,13 (s).
Chemische Analyse: C₄₈H₇₃N₃O₁₁PCl·H₂O. Berechnet: C 59,41%, H 7,94%, N 4,33%, P 3,20%, Cl 3,66%. Gefunden: C 59,79%, H 7,96%, N 3,91%, P 3,28%, Cl 3,60%.
1-Stearoyl-2-{4-[1-(p-chlorbenzoyl)-5-methoxy-2-methyl-3-indolylacetamido]butanoyl}-sn-glycero-3-phosphocholin.
Fahl gelbes Wachs. Ausbeute 80%.
DC-Analyse: ein Fleck. R_f ist 0,35.
¹H-NMR (CD₃OD), δ (ppm): 0,85–0,91 (t, 3H), 1,26 (breites s, 28H), 1,52–1,55 (m, 2H), 1,77 –1,83 (m, 2H), 2,24–2,39 (m, 7H), 3,18 (s, 9H), 3,21–3,29 (m, 2H), 3,57– 3,60 (m, 4H), 3,80 –3,81 (s, 3H), 3,98–4,01 (m, 2H), 4,15–4,36 (mehrere m, 4H), 5,19–5,20 (m, 1H), 6,64– 6,69 (d, 1H), 6,92–6,96 (d, 1H), 7,00 (s, 1H), 7,54–7,57 (d, 2H), 7,67– 7,72 (d, 2H).
³¹P NMR (CD₃OD), δ (ppm): –0,08 (s).
1-Stearoyl-2-{5-[1-(p-Clorbenzoyl)-5-methoxy-2-methyl-3-indolylacetamido]valeryl}-sn-glycero-3-phosphocholin
Fahl gelbes Wachs. Ausbeute 80%.
DC-Analyse: ein Fleck. R_f ist 0,35.
¹H-NMR (CD₃OD), δ (ppm): 0,85–0,91 (t, 3H), 1,26 (s, 28H), 1,53–1,60 (m, 6H), 2,25–2,36 (m, 7H), 3,21 (s, 9H), 3,58–3,62 (m, 4H), 3,87–3,80 (s, 3H), 3,98–4,01 (m, 2H), 4,15–4,24 (mehrere m, 3H), 4,35–4,37 (zwei d, 1H), 5,20–5,21 (m, 1H), 6,64–6,68 (d, 1H), 6,92–6,96 (d, 1H), 7,00 (s, 1H), 7,54–7,57 (d, 2H), 7,67–7,72 (d, 2H).
³¹P (CD₃OD), δ (ppm): –0,07 (s).
1-Stearoyl-2-{6-[1-(p-chlorbenzoyl)-5-methoxy-2-methyl-3-indolylacetamido]hexanoyl}-sn-glycero-3-phosphocholin
Fahl gelbes Wachs. Ausbeute 80%.
DC-Analyse: ein Fleck. R_f ist 0,38.
¹H NMR (CD₃OD), δ (ppm): 0,85–0,91 (t, 3H), 1,26 (breites s, 30H), 1,48– 1,62 (m, 6H), 2,26 –2,32 (m, 7H), 3,15–3,19 (m, 11H), 3,59–3,62 (m, 4H), 3,80 (s, 3H), 3,96– 4,01 (t, 2H), 4,16 –4,25 (m, 3H), 4,36–4,38 (zwei d, 1H), 5,20–5,21 (m, 1H), 6,64–6,69 (d, 1H), 6,91–6,95 (d, 1H), 7,01 (s, 1H), 7,53–7,58 (d, 2H), 7,68–7,71 (d, 2H).
³¹P NMR (CD₃OD), δ (ppm): –0,07 (s).
1-Stearoyl-2-{8-[1-(p-chlorbenzoyl)-5-methoxy-2-methyl-3-indolylacetamido]octanoyl}-sn-glycero-3-phosphocholin
Fahl gelbes Wachs. Ausbeute 80%.
DC-Analyse: ein Fleck. R_f ist 0,38.
¹H-NMR (CD₃OD) δ (ppm): 0,85–0,91 (t, 3H), 1,26 (breites s, 34H), 1,51–1,57 (m, 6H), 2,26 –2,33 (m, 7H), 3,16–3,20 (m, 11H), 3,58–3,63 (m, 4H), 3,80 (s, 3H), 3,96–4,02 (t, 2H), 4,16 4,26 (m, 3H), 4,39–4,41 (zwei d, 1H), 5,21 (m, 1H), 6,64–6,69 (d, 1H), 6,91–6,95 (d, 1H), 7,01 (s, 1H), 7,53–7,58 (d, 2H), 7,68–7,71 (d, 2H).
³¹P NMR (CD₃OD), δ (ppm): –0,08 (s).
BEISPIEL 3: Herstellung von Lipid-Derivaten des Ibuprofens (DP-Ibu)
Das Verfahren zur Herstellung der Lipid-Derivate des Ibuprofens (2-(4-Isobutylphenyl)propionsäure) ist das gleiche wie das in Beispiel 1, Schritte 1 bis 6, umrissene, mit der Ausnahme, dass in Schritt 6 der in das Reaktionsgemisch eingeschlossene Arzneistoff Ibuprofen anstelle von Diclofenac ist.
Lipid-Derivate des Ibuprofens (DP-Ibu)
Die synthetisierten Verbindungen wurden einer DC-Analyse unter den folgenden Bedingungen unterzogen: Kieselgel 60 auf Aluminiumfolie. Das Elutionsmittel ist Chloroform : Methanol Wasser (65 : 35 : 5, Vol./Vol.) Der Indikator ist ein Spray der Zusammensetzung: 4-Methoxybenzaldehyd (10 ml), absolutes Ethanol (200 ml), 98%ige Schwefelsäure (10 ml) und Eisessig (2 ml). Das Chromatogramm wird mit dem Indikator besprüht und dann bei 100°C angekohlt.
1-Stearoyl-2-{3-[α-methyl-4-(2-methylpropyl)benzolacetamido]propanoyl}-sn-glycero-3-phosphocholin
Weißes Wachs. Hygroskopisch. Ausbeute 60%.
DC-Analyse: ein Fleck. R_f ist 0,38.
¹H NMR(CD₃OD), δ (ppm): 0,88–0,93 (m, 9H), 1,29 (s, 28 H), 1,41–1,44 (d, 3H), 1,58–1,63 (m, 2H), 1,80–1,90 (m, 1H), 2,28–2,35 (t, 2H), 2,43–2,46 (d, 2H), 2,51–2,57 (t, 2H), 3,22 (s, 9H), 3,40–3,45 (m, 2H), 3,61–3,66 (m, 3H), 3,98–4,43 (mehrere m, 6H), 5,18 (m, 1H), 7,01–7,07 (d, 2H), 7,22–7,26 (d, 2H).
³¹P NMR (CD₃OD), δ (ppm): –0,20 (s).
Chemische Analyse: C₄₂H₇₅N₂O₉P·4H₂O. Berechnet: C 59,02%, H 9,93%, N 3,28%, P 3,63%. Gefunden: C 59,26%, H 9,64%, N 3,43%, P 3,65%.
1-Stearoyl-2-{6-[α-methyl-4-(2-methylpropyl)benzolacetamido]hexanoyl}-sn-glycero-3-phosphocholin
Weißes Wachs. Hygroskopisch. Ausbeute 50%.
DC-Analyse: ein Fleck. R_f ist 0,38.
¹H-NMR (CD₃OD); δ (ppm): 0,88–0,93 (m, 9H), 1,29 (breites s, 31H), 1,40–1,48 (m + d, 6H), 1,55–1,62 (m, 4H), 1,78–1,90 (m, 1H), 2,27–2,35 (m, 4H), 2,43–2,46 (d, 2H), 3,11–3,16 (m, 2H), 3,22 (s, 9H), 3,56–3,66 (m, 3H), 4,00–4,03 (t, 2H), 4,18–4,28 (mehrere m, 4H), 5,18 (m, 1H), 7,07–7,11 (d, 2H), 7,22–7,25 (d, 2H).
³¹P NMR (CD₃OD), δ (ppm): –0,20 (s).
Chemische Analyse: C₄₅H₈₁N₂O₉P·2,5H₂O. Berechnet: C 62,07%, H 9,89%, N 3,22%, P 3,56%. Gefunden: C 62,00%, H 10,01 %, N 3,32%, P 3,19%.
BEISPIEL 4: Herstellung der Lipid-Derivate des Naproxens (DP-Nau)
Das Verfahren zur Herstellung der Lipid-Derivate des Naproxens (d-2-(6-Methoxy-2-naphthyl)propionsäure ist das gleiche wie das in Beispiel 1, Schritte 1 bis 6, umrissene, mit der Ausnahme, dass in Schritt 6 der in das Reaktionsgemisch eingeschlossene Arzneistoff Naproxen anstelle von Diclofenac ist.
Lipid-Derivate von Naproxen (DP-Nap)
Die synthetisierten Verbindungen wurden einer DC-Analyse unter den folgenden Bedingungen unterzogen: Kieselgel 60 auf Aluminiumfolie. Das Elutionsmittel ist Chloroform : Methanol Wasser (65 : 35 : 5, Vol./Vol.) Der Indikator ist ein Spray der Zusammensetzung: 4-Methoxybenzaldehyd (10 ml), absolutes Ethanol (200 ml), 98%ige Schwefelsäure (10 ml) und Eisessig (2 ml). Das Chromatogramm wird mit dem Indikator besprüht und dann bei 100°C angekohlt.
1-Stearoyl-2-{3-[(S)-6-methoxy-α-methyl-2-naphthalenacetamido]propanoyl}-sn-glycero-3-phosphocholin
Weißes Wachs. Hygroskopisch. Ausbeute 65%.
DC-Analyse: ein Fleck. R_f ist 0,38.
¹H NMR (CD₃OD), δ (ppm): 0,86–0,91 (t, 3H), 1,26 (s, 28 H), 1,50–1,53 (m, 5H), 2,23–2,29 (t, 2H), 2,51–2,57 (t, 2H), 3,16 (s, 9H), 3,41–3,46 (t, 2H), 3,56–3,60 (m, 2H), 3,78–3,80 (m, 1H), 3,88 (s, 3H), 3,97–4,02 (m, 2H), 4,12–4,31 (mehrere m, 4H), 5,17–5,20 (m, 1H), 7,08– 7,13 (d, 1H), 7,19 (s, 1H), 7,41–7,45 (d, 1H), 7,70–7,73 (m, 3H).
³¹P (CD₃OD), δ (ppm): –0,17 (s).
Chemische Analyse: C₄₃H₇₁N₂O₁₀P·4H₂O. Berechnet: C 58,37%, H 8,93%, N 3,17%, P 3,50%. Gefunden: C 58,34%, H 8,98%, N 3,25%, P 3,58%.
1-Stearoyl-2-{4-[(S)-6-methoxy-α-methyl-2-naphthalenacetamido]butanoyl}-sn-glycero-3-phosphocholin
Weißes Wachs. Hygroskopisch. Ausbeute 65%.
DC-Analyse: ein Fleck. R_f ist 0,38.
¹H NMR (CD₃OD), δ (ppm): 0,86–0,91 (t, 3H), 1,26 (s, 30H), 1,50–1,53 (m, 5H), 1,73–1,82 (m, 2H), 2,26–2,33 (m, 4H), 3,17 (s, 11H), 3,56–3,60 (m, 2H), 3,75–3,78 (m, 1H), 3,88 (s, 3H), 3,97–4,02 (m, 2H), 4,12–4,31 (mehrere m, 4H), 5,17–5,20 (m, 1H), 7,08–7,13 (d, 1H), 7,19 (s, 1H), 7,41–7,45 (d, 1H), 7,70–7,73 (m, 3H).
³¹P (CD₃OD), δ (ppm): –0,22 (s).
Chemische Analyse: C₄₄H₇₃N₂O₁₀P·5H₂O. Berechnet: C 58,10%, H 9,12%, N 3,08%, P 3,40%. Gefunden: C 58,69%, H 9,24%, N 3,18%, P 3,40%.
1-Stearoyl-2-{6-[(S)-6-methoxy-α-methyl-2-naphthalenacetamido]hexanoyl}-sn-glycero-3-phosphocholin
Weißes Wachs. Hygroskopisch. Ausbeute 65%.
DC-Analyse: ein Fleck. R_f ist 0,38.
¹H NMR (CD₃OD), δ (ppm): 0,87–0,91 (t, 3H), 1,26 (breites s, 32 H), 1,44–1,57 (mehrere m, 10H), 2,23–2,31 (m, 4H), 3,14–3,20 (s, 9H), 3,60–3,62 (m, 2H), 3,75–3,78 (m, 1H), 3,88 (s, 3H), 4,00–4,02 (m, 2H), 4,17–4,38 (mehrere m, 4H), 5,22 (m, 1H), 7,09–7,12, (d, 1H), 7,19 (s, 1H), 7,43–7,46 (d, 1H), 7,70–7,73 (m, 3H).
³¹P NMR (CD₃OD), δ (ppm): –0,80 (s).
Chemische Analyse: C₄₆H₇₇N₂O₁₀P·2H₂O. Berechnet: C 62,44%, H 9,16%, N 3,17%, P 3,50%. Gefunden: C 62,73%, H 9,41%, N 3,29%, P 3,49%.
BEISPIEL 5: Herstellung der Lipid-Derivate der 6-Methoxy-2-naphthylessigsäure (DP-MNap)
Das Verfahren zur Herstellung der Lipid-Derivate der 6-Methoxy-2-naphthylessigsäure ist das gleiche wie das in Beispiel 1, Schritte 1 bis 6, umrissene, mit der Ausnahme, dass in Schritt 6 der in das Reaktionsgemisch eingeschlossene Arzneistoff 6-Methoxy-2-naphthylessigsäure anstelle von Diclofenac ist.
6-Methoxy-2-naphthylessigsäure wurde gemäß dem Verfahren, das von Khorana und Pishawikar (Indian J. Pharm. (1961) 23: 297–301) beschrieben wurde, hergestellt. Die Ausbeute betrug 60%.
Die Endprodukte, d. h. die Phospholipid-Arzneistoff-Konjugate, die am Ende von Schritt 6 erhalten wurden, wurden einer DC-Analyse unter den folgenden Bedingungen unterzogen: Kieselgel 60 auf Aluminiumfolie. Das Elutionsmittel ist Chloroform : Methanol : Wasser (65 35 : 5 Vol./Vol.). Der Indikator ist ein Spray der Zusammensetzung: 4-Methoxybenzaldehyd (10 ml), absolutes Ethanol (200 ml), 98%ige Schwefelsäure (10 ml) und Eisessig (2 ml). Das Chromatogramm wird mit dem Indikator besprüht und dann bei 100°C angekohlt. Ein Lipid-Derivat der 6-Methoxy-2-naphthylessigsäure (DP-MNap) ist nachstehend dargestellt.
1-Stearoyl-2-{4-[2-(6-methoxynaphthyl)acetamido]butanoyl}-sn-glycero-3-phosphocholin
Weißes Wachs. Ausbeute 60%. DC-Analyse: ein Fleck. R_f ist 0,5.
¹H NMR (CD₃OD), δ (ppm): 0,87–0,92 (t, 3H), 1,27 (breites s, 28 H), 1,53–1,56 (breites m, 2H), 1,78–1,84 (m, 2H), 2,25–2,40 (m, 4H), 3,15 (s, 9H), 3,21–3,27 (m, 2H), 3,54 – 3,58 (m, 2H), 3,62 (s, 2H), 3,90 (s, 3H), 4,00–4,04 (m, 2H), 4,18–4,23 (m, 3H), 4,36–4,41 (d, 1H), 5,20–5,24 (m, 1H), 7,09–7,14 (d, 1H), 7,21–7,22 (m, 1H), 7,36–7,40 (d, 1H), 7,67–7,75 (m, 3H).
³¹P (CD₃OD), ? (ppm): 0,83 (s).
Chemische Analyse: C₄₃H₇₁N₂O₁₀P·2H₂O. Berechnet: C 61,28%, H 8,90%, N 3,32%, P 3,68%. Gefunden: C 61,42%, H 9,08%, N 3,48%, P 3,70%.
BEISPIEL 6: Löslichkeitsmessungen der Lipid-Derivate von Diclofenac, Indomethacin, Ibuprofen, Naproxen und 6-Methoxy-2-naphthylessigsäure
Die Löslichkeit der verschiedenen Lipid-Derivate von Diclofenac, Indomethacin, Ibuprofen, Naproxen und 6-Methoxy-2-naphthylessigsäure wurde bei Raumtemperatur (22 °C) in wässrigen Lösungen (Wasser und Salzlösung) und in organischen Lösungen (Ethanol und Octanol) bestimmt. Zusätzlich wurden die Werte des Verteilungskoeffizienten (P_c) für diese Verbindungen, d. h. ihre Verteilungsverhältnisse zwischen der organischen und der wässrigen Phase (Octanol/Salzlösung) berechnet. Die Ergebnisse, dargestellt als der berechnete LogP_c, sind in Tabelle 1 gezeigt.
Die Verteilung der Verbindungen zwischen der organischen und der wässrigen Phase wurde mittels der Schüttelkolben-Technik bestimmt. Fünf Milliliter Octanol, das etwa 3 mg der zu untersuchenden Verbindung enthält, wurden mit 5 ml Salzlösung gemischt. Das Gemisch wurde über Nacht bei 22 °C geschüttelt, bevor die Octanol- und die Salzlösungsphase abgetrennt wurden. Ein ml von jeder Phase wurde in einem geeigneten Volumen Ethanol gelöst, sodass die optische Absorption der so erhaltenen Lösung im Bereich von 0,1 bis 1,0 liegt.
Der Koeffizient P_c ist nach dem folgenden Verhältnis berechnet:
Wobei A_oct für die optische Absorption bei λ_max der Ethanollösung steht, in der ein ml der Octanolphase gelöst ist, V₁ steht für das Volumen dieser Ethanollösung und I₁ ist die Weite (cm) der Küvette, die für die Messung der optischen Absorption verwendet wurde.
A_sal steht für die optische Absorption bei λ_max der Ethanollösung, in der ein ml der Salzlösungsphase gelöst ist, V₂ steht für das Volumen dieser Ethanollösung und I₂ ist die Weite (cm) der Küvette, die für die Messung der optischen Absorption verwendet wurde.
Die Löslichkeitswerte der Lipid-Derivate von Diclofenac, Indomethacin, Ibuprofen, Naproxen und 6-Methoxy-2-naphthylessigsäure in Wasser und Salzlösung und ihre Verteilung in Octanol/Salzlösung werden hier in der nachstehenden Tabelle 1 gezeigt.
Die getesteten Lipid-Derivate bilden Suspensionen oder Gel-Gemische in Wasser und Salzlösung. Lösungen, die die Lipid-Derivate beinhalten, bilden Suspensionen oder Gel-Gemische, sogar nachdem sie durch 0,45 μm-Filter filtriert wurden.
TABELLE 1: Die Löslichkeit in Wasser und Salzlösung und der Octan/Salzlösungs-Verteilungskoeffizient (log P_c) der Lipid-Derivate bei 22 °C.
Lipid-Derivate weisen die Struktur auf: Lysolecithin-Verknüpfer-Arzneistoff, wobei der Verknüpfer für -C(O)-(CH₂)n-NH- steht, der Arzneistoff Diclofenac (DCF), Indomethacin (Indo), Ibuprofen (Ibu), Naproxen (Nap) oder 6-Methoxy-2-naphthylessigsäure (Mnap) ist.
Die Löslichkeitsmessungen zeigen, dass alle untersuchten Lipid-Derivate sich gut in Ethanol und Octanol lösen, d. h. mehr als 10 mg/ml bei Raumtemperatur. Die so erhaltenen Lösungen sind transparent, und die Verbindungen bleiben in der Lösung für mindestens mehrere Tage bei Raumtemperatur stabil.
Es ist offensichtlich, dass die Lipid-Derivate gemäß der Erfindung die gewünschten hydrophoben Eigenschaften erworben haben, die für die Gehirn-Penetration und -Maskierung vorteilhaft sind.
BEISPIEL 7: in vitro-Spaltung der DP-DFC in Gewebe-Homogenaten
Die Fähigkeit der Verbindungen der Erfindung, gespalten zu werden, um freies Diclofenac zu ergeben, wurde in vitro in Homogenaten des Rattenhirns und der Rattenleber untersucht. Zwei Verbindungen wurden getestet: Die Prodrug 1-Stearoyl-2-{4-[2-(2,6-dichloranilino)phenylacetamido]butanoyl}-sn-glycero-3-phosphocholin (DP-DFC; Z = 3) und die Verbindung 1-Stearoyl-2-{3-[2-(2,6-dichloranilino)phenylacetamido]propanoyl}-sn-glycero-3-phosphocholin (DP-DFC; Z = 2), die eine Brückengruppe mit insgesamt 4, beziehungsweise 3 Kohlenstoffatomen umfassen.
Leber und Hirn wurden aus männlichen Sabra-Ratten, die 250–280 g wogen, unter einer Pentobarbital-Anästhesie chirurgisch entfernt. Proben von etwa 1–1,5 g von jedem Gewebe wurden in PBS pH = 7,4 (Dulbecco) bei einem Verhältnis von 1 : 9 Gew./Vol. von Gewebe zu Puffer homogenisiert.
DP-DFC wurde zu jedem Homogenat bis zu einer Endkonzentration von 40 μg/ml zugefügt. Die Gemische wurden bei 37 °C inkubiert und für 1, 2, 3 und 6 Stunden geschüttelt und dann auf Eis gegeben, um die Umsetzung zu stoppen.
Die Mengen des freien Diclofenac in Proben von 1 ml wurden entweder von den Gehirn- oder den Leber-Homogenaten mittels eines Reverse-Phase-HPLC-Tests bestimmt. Die Menge des Proteins in jeder Probe wurde mittels des Lowry-Verfahrens getestet.
Die Mengen des freien Diclofenac, die zu jedem Zeitpunkt freigesetzt wurden, berechnet pro 1 mg des Proteins, sind in Tabelle 2 gezeigt. Das Ergebnis für jeden Zeitpunkt stellt den Durchschnitt aus 5 Wiederholungen unter Verwendung der Gewebe von fünf individuellen Tieren dar.
TABELLE 2: In vitro Spaltung von DP-DFC

N.D.: kennzeichnet nicht nachweisbare Mengen des freien Diclofenacs.

Wie in Tabelle 2 gezeigt, wurde eine signifikante Spaltung des Diclofenac von seinem Lipid-Konjugat sowohl in den Gehirn- als auch in den Leber-Homogenaten nur für das Prodrug DP-DFC; Z = 3 und nicht für die Verbindung DP-DFC; Z = 2 nachgewiesen. Diese Ergebnisse decken die wichtige Rolle auf, die die Brückengruppe beim Ermöglichen der Freisetzung des Arzneistoffs von seinem Phospholipid-Derivat spielt.
Unter den vorstehend beschriebenen experimentellen Bedingungen waren die Mengen des Diclofenac, die von dem Prodrug in den Gehirn- und Leber-Homogenaten freigesetzt wurden, zu 30% beziehungsweise 15% des Arzneistoffs, der als DP-DFC eingeführt wurde, äquivalent.
Um die Wirkung der Temperatur auf die Reaktion zu bewerten, wurde ein paralleler Satz von Inkubationen bei 4 °C durchgeführt. Es stellte sich heraus, dass das Kühlen auf 4 °C die Spaltung von DP-DFC; Z = 3 zu DFC (Daten nicht gezeigt) vollständig hemmte.
Die zeit- und temperaturabhängige Weise der Freisetzung des Diclofenac in Homogenaten unterstützt die Schlussfolgerung, dass der Arzneistoff enzymatisch von dem Prodrug-Molekül abgespalten wird.
BEISPIEL 8: in vivo sub-chronische Toxizitäts-Studie von DP-DCF
Die DP-DCF-Verbindungen wurden auf ihre sub-chronische Toxizität während eines 14-tägigen Verabreichungszeitraums nach zwei Kriterien bewertet: a) Überwachen der Veränderungen des Körpergewichts und b) Bewertung der Gastro-Toxizitäts-Punktwerte.
Männliche Sprague-Dawley-Ratten mit einem Gewicht von 250–280 g wurden unter Standardbedingungen über einen Akklimatisierungszeitraum von einer Woche mit Nahrung und Wasser nach Belieben versorgt. Den Ratten wurden handelsübliches Diclofenac (DCF; Sigma, USA) oder äquivalente Dosen von 1-Stearoyl-2-{4-[2-(2,6-dichloranilino)phenylacetamido]butanoyl}-sn-glycero-3-phosphocholin (DP-DFC; Z = 3) oder 1-Stearoyl-2-{6-[2-(2,6-dichloranilino)phenylacetamido]hexanoyl}-sn-glycero-3-phosphocholin (DP-DFC; Z = 5) für 14 Tage täglich durch eine Sonde p. o. verabreicht. Die Tiere, die nur mit der Vehikel-Lösung behandelt wurden, dienen als Kontrollgruppe. Die Behandlungsgruppen waren wie folgt:
A. Veränderungen des Körpergewichts
Ein Hauptmerkmal allgemeiner Toxizität ist die Abnahme des Körpergewichts. Männliche Sabra-Ratten wurden wie vorstehend beschrieben behandelt. Die Ratten wurden vor dem Dosieren zu Beginn des Experiments (Tag Null) und am 5., 9. und 13. Tag der Behandlung gewogen. Die prozentualen Veränderungen des Körpergewichts sind in 1 gezeigt.
Wie aus 1 ersichtlich, zeigen die mit DCF behandelten Tiere eine maximale Abnahme des Körpergewichts an Tag 5 des Experiments. Im Gegensatz zu den mit DCF behandelten Tieren nahmen die mit DP-DCF behandelten Gruppen über 14 Tage an Gewicht zu mit einem ähnlichen Profil wie die mit dem Vehikel behandelte Gruppe.
B-Toxizitäts-Punktwerte
Die Toxizitäts-Punktwerte wurden am Ende des 14-tägigen Zeitraums der multiplen p. o. Verabreichung bewertet. Am Tag 14 wurden die Tiere 4 Stunden nach der Verabreichung des Testmaterials durch eine i. p. Injektion von 0,5 ml Pentobarbital-Natrium (200 mg/ml) anästhesiert und eine Laparotomie wurde durchgeführt, um den Rattenmagen mit annähernd 15 mm des damit verbundenen Duodenums zu entfernen. Die Mägen wurden entlang der schmalen Krümmung aufgeschnitten und mit sanftem Reiben unter fließendem Wasser gewaschen. Eine semi-quantitative Bewertung des gastrischen Schadens wurde durch das Zuweisen von Punktwerten im Bereich von 1 bis 5 bestimmt. Die Punktwerte indizieren wie folgt: (0) Keine makroskopisch sichtbaren Läsionen; (1) Hyperämie; (2) ein bis zwei leichte Läsionen; (3) mehr als zwei leichte Läsionen; (4) schwere Läsionen; (5) Perforation.
Wie in 2 gezeigt, waren die DP-DCF-Derivate weniger toxisch als der Stammarzneistoff DCF. Die beiden getesteten Verbindungen, DP-DCF; Z = 3 und DP-DCF; Z = 5, zeigen ein besseres toxikologisches Profil als Diclofenac. Die gastrischen Nebenwirkungen von DCF nahmen während der multiplen Dosierungsverabreichung zu, und es wurden Toxizitätspunktwerte von 4 am 14. Tag erreicht. Die reizende Wirkung der getesteten DP-DCF-Verbindungen war gleich dem der mit dem Vehikel erhalten wurde, nämlich Toxizitätspunktwerte zwischen 0,25 und 1.
Schlussfolgerung: Wie anhand zweier Parameter, die während einer zweiwöchigen Studie kontrolliert wurden, bewertet wurde, erwiesen sich die getesteten DP-DCF-Verbindungen im Wesentlichen als weniger toxisch als die Stammverbindungen. Es wurde eine normale Gewichtszunahme über zwei Wochen bei den mit DP-DCF behandelten Tieren beobachtet im Vergleich zu den Gewichtsverlusten, die bei den mit der Stammverbindung Diclofenac behandelten Tieren beobachtet wurden. Die Verbindungen der Erfindung erwiesen sich außerdem als weniger ulcerogen, wie nach den Gastro-Toxizitätspunktwerten, die nach 14 Tagen der chronischen p. o.-Verabreichung des Arzneistoffs erhalten wurden, beurteilt.
BEISPIEL 9: in vivo Penetration von Diclofenac in das Rattengehirn nach einer i. v.-Iniektion von DP-DFC
Die zeitabhängige Penetration der Lipid-Konjugate des Diclofenacs wird in Rattenserum und im Rattengehirn nach einer i. v.-Verabreichung von DP-DFC gemessen. 10 mg/kg DP-DFC werden männlichen Sabra-Ratten mit einem Gewicht von 250–280 g intravenös injiziert. Die Prodrug (5 mg/ml) wird wie folgt formuliert: 50 mg DP-DFC werden in 300–400 μl Ethanol gelöst, und Lipofundin^® (B. Braun, Melsungen, Germany) wird bis zu einem Endvolumen von 10 ml zugegeben. Die Menge der formulierten Prodrug, die den Tieren injiziert wird, beträgt 2 ml/kg Körpergewicht.
Die Tiere werden entweder 0,5, 1, 2 oder 3 Stunden nach der Injektion getötet. Proben des gesamten Gehirns und Blutproben werden von einzelnen Ratten zu jedem Zeitpunkt erhalten. Das Serum wird mittels Zentrifugieren des Bluts (5 Min. bei etwa 800 × g) abgetrennt. Das Gehirn wird behandelt wie folgt: Das gesamte Gehirn wird in Salzlösung homogenisiert. Die Hälfte des Homogenats wird in organische Lösemittel (Methanol-Chloroform 1 : 2) extrahiert und wird zur Bestimmung des Spiegels des Lipid-Derivats (DP-DFC) verwendet. Die andere Hälfte wird mittels 85%iger H₃PO₄ angesäuert, in Chloroform extrahiert und zur Bestimmung des Spiegels des freien Diclofenacs (DFC) verwendet. Jede der organischen Phasen wird durch Zentrifugieren abgetrennt, über Na₂SO₄ getrocknet und verdampft. Die so erhaltenen Rückstände werden in der entsprechenden mobilen Phase, die in dem HPLC-Verfahren verwendet wird, gelöst, und die Mengen sowohl des DP-DFC als auch des DFC werden mittels Reverse-Phase-HPLC bestimmt.
Schlussfolgerung: Nach der i. v.-Verabreichung des Prodrug penetriert DP-DFC die Blut-Hirn-Schranke (BBB).
BEISPIEL 10: Entzündungshemmende Aktivität des DP-DFC (in vivo-Wirksamkeits-Studie
Die Wirksamkeit der DP-DFC Lipid-Derivate wurde in vivo in dem Modellsystem des Nagetier-Carrageenan-Ödem-Tests getestet. Das Carrageenan-induzierte Rattenpfoten-Ödem wird weit verbreitet als Tiermodell für akute Entzündung verwendet. Das Ziel der Studie ist, das Potenzial prophylaktischer Effekte der DP-DCF-Derivate auf die Vorbeugung entzündlicher Schwellungen zu bewerten und insbesondere die Wirksamkeits-Parameter mit denen der für Diclofenac erhaltenen zu vergleichen. Die experimentelle Vorbereitung war wie folgt: Männlichen Sprague-Dawley-Ratten mit einem Gewicht von 120–180 g (geliefert von Harlan Laboratories Breeding Center, Israel) wurde der Arzneistoff oder das Prodrug intraperitoneal (i. p.) eine Stunde vor dem Auslösen einer Entzündung mit Carrageenan injiziert. Tiere, denen nur das Vehikel injiziert wurde, dienten als Kontrollgruppe.
Das Pfoten-Ödem wurde mittels einer einzigen sub-plantaren Injektion von 0,1 ml 2%igem Carrageenan in physiologischer Salzlösung in die rechte Hinterpfote des Versuchstiers ausgelöst. Kurz vor der Auslösung des Pfoten-Ödems wurde die Pfotenstärke der rechten Hinterpfoten der Versuchstiere unter Verwendung eines Plethysmograph und eines Mikrometers dreifach vermessen, um eine Basislinie bereitzustellen. 3, 5 und 7 Stunden nach der Carrageenan-Injektion wurde die Stärke der rechten Hinterpfote in der gleichen Weise wie vorstehend gemessen.
Die potentielle entzündungshemmende Aktivität im Unterdrücken des Carrageenan-induzierten Pfoten-Ödems wurde anhand der relativen Differenz im Pfotenvolumen zwischen den prä- und post-Carrageenan-Messungen bewertet, ausgedrückt als (%)-Veränderung.
Die Dosismengen betrugen für Diclofenac 10 mg/kg i. p. und 30 mg/kg (Dosis-Äquivalent) für die DP-DCF-Derivate. 10 ml/kg der Trägerlösung wurden für die Vehikel-Kontrolle verwendet.
In 3 sind die mit einem der DP-Derivate, DP-DCF; Z = 5, erhaltenen Ergebnisse dargestellt im Vergleich mit denen, die mit der Stammverbindung Diclofenac erhalten wurden. Wie aus 3 ersichtlich, zeigen sowohl DCF als auch das DP-DCF-Derivat eine statistisch signifikante und stetige entzündungshemmende Aktivität während des gesamten 7-stündigen post-Carrageenan-Messungszeitraums (der Wert für Signifikanz ist p < 0,05 mittels statistischer Analyse unter Verwendung des Student t-Tests). Entzündungshemmende Wirkung wurde bereits bei der 3-Stunden-post-Carrageenan-Messung gefunden.
BEISPIEL 11: neuroprotektive Wirkungen von DP-DCF
Die neuroprotektiven Wirkungen der Verbindungen der Erfindung wurden im dem Modellsystem der globalen Ischämie des Vorderhirns in Mongolischen Rennmäusen untersucht. Männliche Mongolische Rennmäuse von 60–70 g (Charles River Laboratories, USA) wurden in dieser Studie verwendet. Eine globale Ischämie des Vorderhirns wurde durch vorübergehenden Verschluss beider Halsschlagadern für 10 Minuten unter Verwendung von Arterienklemmen ausgelöst. Die Testverbindungen wurden den Tieren, 7– 8 Tiere pro Gruppe, oral durch eines der zwei Schemata verabreicht:

a) eine Einzeldosis-Verabreichung von handelsüblichem Diclofenac (Sigma, USA; 10 mg/kg) oder ein Dosisäquivalent von DP-DCF; Z = 5 (30 mg/kg). Die Verabreichung erfolgte per os (p. o.) zwei Stunden vor dem Auslösen der Ischämie (4);
b) Mehrfachdosierung von DP-DCF; Z = 5 (30 mg/kg) täglich oral für 5 Tage verabreicht, beginnend vier Tage vor dem Auslösen der Ischämie (5).

In beiden Schemata dienten Tiere, die nur mit dem Vehikel behandelt wurden, als Kontrollgruppen. Blutproben wurden aus den Augenhöhlen der Tiere 24 Stunden nach dem Einsetzen der Ischämie genommen, und die Serumspiegel der Neuronspezifischen Enolase (NSE) wurden mittels eines radioimmunologischen Versuchs unter Verwendung eines NSE-Kits (Pharmatope Ltd., Israel) bestimmt. Die gemessenen NSE-Werte, ausgedrückt in ng/ml, sind in den 4 und 5 zusammengefasst.
Es wurde gezeigt, dass die Serum-Werte des NSE im Fall einer ischämischen Verletzung erhöht waren. Infolgedessen können die Serum-Werte des NSE als Marker für den Grad des neuronalen Schadens dienen (Barone et al. (1993) Brain Res. 623: 77–82).
Wie in 4 gezeigt, ist der NSE-Wert im Serum von Tieren, die mit einer Einzeldosis von DP-DCF behandelt wurden, verringert im Vergleich zu dem NSE-Wert im Serum von Tieren, die mit DCF oder dem Vehikel allein behandelt wurden. Der Stamm-Arzneistoff, Diclofenac, dringt schlecht in das Gehirn ein, und es ist nicht zu erwarten, dass es eine Wirkung auf die Veränderungen der NSE-Werte, die mit der Ischämie des Gehirns einhergehen, hat.
Wie in 5, die die Ergebnisse des Experiments der Mehrfachdosierung zusammenfasst, gezeigt, gibt es auch in diesem Fall eine signifikante Verringerung des NSE-Werts, der im Serum der Tiere, die mit der DP-DCF-Verbindung behandelt wurden, gefunden wurde (p < 0,05).
Schlussfolgerung: Das getestete DP-DCF-Derivat zeigt einen neuronalen Schutzeffekt, wie anhand der signifikanten Verringerung der NSE-Aktivität im Serum, gemessen nach der globalen cerebralen Ischämie, angezeigt. Die Wirkung wurde sowohl in den Einzel- als auch in den Mehrfachdosierungsschemata demonstriert.
Obwohl die vorliegende Erfindung im Detail beschrieben wurde, wird es dem Fachmann ersichtlich sein, dass viele Variationen und Modifikationen gemacht werden können. Aus diesem Grund soll die Erfindung nicht als auf die im Detail beschriebenen Ausführungsformen beschränkt aufgefasst werden, vielmehr werden der Umfang und der Gedanke der Erfindung leichter verstanden werden durch Bezugnahme auf die folgenden Ansprüche.

Claims

Verbindung der allgemeinen Formel I
Formel I oder ein pharmazeutisch verträgliches Salz davon, wobei: R1 eine gesättigte oder ungesättigte, substituierte oder unsubstituierte Kohlenwasserstoffkette mit 2 bis 30 Kohlenstoffatomen ist; R2 H oder die Kopfgruppe eines Phospholipids ist; D der Rest eines nichtsteroidalen, entzündungshemmenden Arzneistoffs ist, welches eine funktionelle Gruppe, ausgewählt aus einer Carboxyl-, Hydroxyl-, Amin- und Thiolgruppe, aufweist, wobei D durch diese funktionelle Gruppe an eine Brückengruppe -C(O)-Z-X- gebunden ist, wobei Z eine gesättigte oder ungesättigte Kohlenwasserstoffkette mit 2 bis 15 Kohlenstoffatomen ist, und X aus Amino-, Hydroxy-, Thio- und Carbonylgruppen so ausgewählt ist, dass, wenn die funktionelle Gruppe von D eine Carboxylgruppe ist, X aus einer Amino-, Hydroxy- und Thiogruppe ausgewählt ist, und, wenn die funktionelle Gruppe von D eine Amino-, Hydroxy- oder Thiogruppe ist, X eine Carbonylgruppe ist.
Verbindung gemäß Anspruch 1, wobei der konjugierte Rest des nichtsteroidalen, entzündungshemmenden Arzneistoffs pharmakologisch inaktiv ist.
Verbindung gemäß Anspruch 1, wobei eine Esterbindung an der sn-2-Position des Phospholipids der allgemeinen Formel I durch eine Lipase gespalten werden kann.
Verbindung gemäß Anspruch 3, wobei die Lipase eine Phospholipase ist.
Verbindung gemäß Anspruch 4, wobei die Phospholipase die Phospholipase A₂ (PLA₂) ist.
Verbindung gemäß Anspruch 1, wobei R1 eine Kohlenwasserstoffkette mit 10 bis 20 Kohlenstoffatomen ist.
Verbindung gemäß Anspruch 1, wobei R1 eine Kohlenwasserstoffkette mit 15 oder 17 Kohlenstoffatomen ist.
Verbindung gemäß Anspruch 1, wobei D aus Diclofenac, Indomethacin, Ibuprofen, Naproxen und 6-Methoxy-2-naphthylessigsäure ausgewählt ist.
Verbindung gemäß Anspruch 1, wobei R2 aus Cholin, Ethanolamin, Inositol und Serin ausgewählt ist.
Verbindung gemäß Anspruch 1, ausgewählt aus: 1-Stearoyl-2-{3-[2-(2,6-dichloranilino)phenylacetamido]propanoyl}-sn-glycero-3-phosphocholin, 1-Stearoyl-2- {4-[2-(2,6-dichloranilino)phenylacetamido]butanoyl} -sn-glycero-3-phosphocholin, 1-Stearoyl-2-{5-[2-(2,6-dichloranilino)phenylacetamido]valeroyl}-sn-glycero-3-phosphocholin, 1-Stearoyl-2- {6-[2-(2,6-dichloranilino)phenylacetamido]hexanoyl} -sn-glycero-3-phosphocholin, 1-Stearoyl-2-{8-[2-(2,6-dichloranilino)phenylacetamido]octanoyl}-sn-glycero-3-phosphocholin, 1-Stearoyl-2- {12-[2-(2,6-dichloranilino)phenylacetamido]dodecanoyl}-sn-glycero-3-phosphocholin, 1-Stearoyl-2-{3-[1-(p-chlorbenzoyl)-5-methoxy-2-methylindolylacetamido]propanoyl}-sn-glycero-3-phosphocholin, 1-Stearoyl-2-{4-[1-(p-chlorbenzoyl)-5-methoxy-2-methylindolylacetamido]butanoyl}-sn-glycero-3-phosphocholin, 1-Stearoyl-2-{5-[1-(p-chlorbenzoyl)-5-methoxy-2-methylindolylacetamido]valeroyl}-sn-glycero-3-phosphocholin, 1-Stearoyl-2-{6-[1-(p-chlorbenzoyl)-5-methoxy-2-methylindolylacetamido]hexanoyl}-sn-glycero-3-phosphocholin, 1-Stearoyl-2-{8-[1-(p-chlorbenzoyl)-5-methoxy-2-methylindolylacetamido] octanoyl}-sn-glycero-3-phosphocholin, 1-Stearoyl-2-{3-[α-methyl-4-(2-methylpropyl)benzolacetamido]propanoyl}-sn-glycero-3-phosphocholin, 1-Stearoyl-2-{6-[α-methyl-4-(2-methylpropyl)benzolacetamido]hexanoyl} -sn-glycero-3-phosphocholin, 1-Stearoyl-2-{3-[(S)-6-methoxy-α-methyl-2-naphthalinacetamido]propanoyl}-sn-glycero-3-phosphocholin, 1-Stearoyl-2-{4-[(S)-6-methoxy-α-methyl-2-naphthalinacetamido]butanoyl}-sn-glycero-3-phosphocholin, 1-Stearoyl-2-{6-[(S)-6-methoxy-α-methyl-2-naphthalinacetamido]hexanoyl}-sn-glycero-3-phosphocholin, und 1-Stearoyl-2- {4-[2-(6-methoxynaphtyl)acetamido]butanoyl} -sn-glycero-3-phosphocholin.
Arzneimittel, umfassend einen pharmazeutisch verträglichen Träger und, als Wirkstoff, eine Verbindung der allgemeinen Formel I
Formel I oder ein pharmazeutisch verträgliches Salz davon, wobei: R1 eine gesättigte oder ungesättigte, substituierte oder unsubstituierte Kohlenwasserstoffkette mit 2 bis 30 Kohlenstoffatomen ist; R2 H oder die Kopfgruppe eines Phospholipids ist; D der Rest eines nichtsteroidalen, entzündungshemmenden Arzneistoffs ist, welches eine funktionelle Gruppe, ausgewählt aus einer Carboxyl-, Hydroxyl-, Amin- und Thiolgruppe, aufweist, wobei D durch diese funktionelle Gruppe an eine Brückengruppe -C(O)-Z-X- gebunden ist, wobei Z eine gesättigte oder ungesättigte Kohlenwasserstoffkette mit 2 bis 15 Kohlenstoffatomen ist, und X aus Amino-, Hydroxy-, Thio- und Carbonylgruppen so ausgewählt ist, dass, wenn die funktionelle Gruppe von D eine Carboxylgruppe ist, X aus einer Amino-, Hydroxy- und Thiogruppe ausgewählt ist, und, wenn die funktionelle Gruppe von D eine Amino-, Hydroxy- oder Thiogruppe ist, X eine Carbonylgruppe ist.
Arzneimittel gemäß Anspruch 11, wobei -C(O)-Z-X-D ein inaktives Derivat eines Arzneistoffs ist.
Arzneimittel gemäß Anspruch 11, wobei eine Esterbindung an der sn-2-Position des Phospholipids der allgemeinen Formel I durch eine Lipase gespalten werden kann.
Arzneimittel gemäß Anspruch 13, wobei die Lipase eine Phospholipase ist.
Arzneimittel gemäß Anspruch 14, wobei die Phospholipase die Phospholipase A₂ (PLA₂) ist.
Arzneimittel gemäß Anspruch 11, wobei R1 eine Kohlenwasserstoffkette mit 10 bis 20 Kohlenstoffatomen ist.
Arzneimittel gemäß Anspruch 11, wobei R1 eine Kohlenwasserstoffkette mit 15 oder 17 Kohlenstoffatomen ist.
Arzneimittel gemäß Anspruch 11, wobei D aus Diclofenac, Indomethacin, Ibuprofen, Naproxen und 6-Methoxy-2-naphthylessigsäure ausgewählt ist.
Arzneimittel gemäß Anspruch 11, wobei R2 aus Cholin, Ethanolamin, Inositol und Serin ausgewählt ist.
Arzneimittel gemäß Anspruch 11, wobei die Verbindung der allgemeinen Formel I ausgewählt ist aus: 1-Stearoyl-2-{3-[2-(2,6-dichloranilino)phenylacetamido]propanoyl} -sn-glycero-3-phosphocholin, 1-Stearoyl-2-{4-[2-(2,6-dichloranilino)phenylacetamido]butanoyl}-sn-glycero-3-phosphocholin, 1-Stearoyl-2- {5-[2-(2,6-dichloranilino)phenylacetamido]valeroyl}-sn-glycero-3-phosphocholin, 1-Stearoyl-2-{6-[2-(2,6-dichloranilino)phenylacetamido]hexanoyl}-sn-glycero-3-phosphocholin, 1-Stearoyl-2-{8-[2-(2,6-dichloranilino)phenylacetamido]octanoyl} -sn-glycero-3-phosphocholin, 1-Stearoyl-2-{12-[2-(2,6-dichloranilino)phenylacetamido]dodecanoyl}-sn-glycero-3-phosphocholin, 1-Stearoyl-2-{3-[1-(p-chlorbenzoyl)-5-methoxy-2-methylindolylacetamido]propanoyl}-sn-glycero-3-phosphocholin, 1-Stearoyl-2-{4-[1-(p-chlorbenzoyl)-5-methoxy-2-methylindolylacetamido]butanoyl}-sn-glycero-3-phosphocholin, 1-Stearoyl-2-{5-[1-(p-chlorbenzoyl)-5-methoxy-2-methylindolylacetamido]valeroyl}-sn-glycero-3-phosphocholin, 1-Stearoyl-2-{6-[1-(p-chlorbenzoyl)-5-methoxy-2-methylindolylacetamido]hexanoyl}-sn-glycero-3-phosphocholin, 1-Stearoyl-2-{8-[1-(p-chlorbenzoyl)-5-methoxy-2-methylindolylacetamido]octanoyl}-sn-glycero-3-phosphocholin, 1-Stearoyl-2-{3-[α-methyl-4-(2-methylpropyl)benzolacetamido]propanoyl} -sn-glycero-3-phosphocholin, 1-Stearoyl-2-{6-[α-methyl-4-(2-methylpropyl)benzolacetamido]hexanoyl}-sn-glycero-3-phosphocholin, 1-Stearoyl-2-{3-[(S)-6-methoxy-α-methyl-2-naphthalinacetamido]propanoyl}-sn-glycero-3-phosphocholin, 1-Stearoyl-2-{4-[(S)-6-methoxy-α-methyl-2-naphthalinacetamido]butanoyl}-sn-glycero-3-phosphocholin, 1-Stearoyl-2-{6-[(S)-6-methoxy-α-methyl-2-naphthalinacetamido]hexanoyl}-sn-glycero-3-phosphocholin, und 1-Stearoyl-2-{4-[2-(6-methoxynaphtyl)acetamido]butanoyl}-sn-glycero-3-phosphocholin.
Arzneimittel gemäß einem der Ansprüche 11 bis 20 in der Form von Lösungen, Suspensionen, Kapseln, Tabletten, Aerosolen, Gelen, Salben oder Suppositorien.
Arzneimittel gemäß einem der Ansprüche 11 bis 20 zur oralen, okulären, nasalen, parenteralen, topischen oder rektalen Verabreichung.
Arzneimittel gemäß Anspruch 22 zur oralen Verabreichung.
Arzneimittel gemäß Anspruch 22 zur nasalen Verabreichung.
Arzneimittel gemäß einem der Ansprüche 11 bis 24 zur Behandlung einer Erkrankung oder Störung, welche mit einem entzündlichen Zustand verbunden ist.
Arzneimittel gemäß Anspruch 25, wobei die Erkrankung oder Störung mit einem entzündlichen Zustand verbunden ist, welcher aus Arthritis, rheumatoider Arthritis, Asthma, Psoriasis, Lupus visceralis, entzündlicher Darmerkrankung, und den neurologischen Erkrankungen und Störungen Multipler Sklerose, Alzheimer Krankheit, Parkinson Krankheit, Huntington Krankheit, vaskulärer Demenz, Epilepsie, Migräne, Hirnschlag und Trauma ausgewählt ist.
Verwendung zur Herstellung eines Arzneistoffs einer Verbindung der allgemeinen Formel I
Formel I oder ein pharmazeutisch verträgliches Salz davon, wobei: R1 eine gesättigte oder ungesättigte, substituierte oder unsubstituierte Kohlenwasserstoffkette mit 2 bis 30 Kohlenstoffatomen ist; R2 H oder die Kopfgruppe eines Phospholipids ist; D der Rest eines nichtsteroidalen, entzündungshemmenden Arzneistoffs ist, welches eine funktionelle Gruppe, ausgewählt aus einer Carboxyl-, Hydroxyl-, Amin- und Thiolgruppe, aufweist, wobei D durch diese funktionelle Gruppe an eine Brückengruppe -C(O)-Z-X- gebunden ist, wobei Z eine gesättigte oder ungesättigte Kohlenwasserstoffkette mit 3 bis 15 Kohlenstoffatomen ist, und X aus Amino-, Hydroxy-, Thio- und Carbonylgruppen so ausgewählt ist, dass, wenn die funktionelle Gruppe von D eine Carboxylgruppe ist, X aus einer Amino-, Hydroxy- und Thiogruppe ausgewählt ist, und, wenn die funktionelle Gruppe von D eine Amino-, Hydroxy- oder Thiogruppe ist, X eine Carbonylgruppe ist.
Verfahren zur Herstellung einer Verbindung der allgemeinen Formel I nach Anspruch 1, umfassend: (i) Bereitstellen eines Moleküls y-X-Z-COOH, wobei y aus H und OH ausgewählt ist, Z eine gesättigte oder ungesättigte Kohlenwasserstoffkette mit 2 bis 15 Kohlenwasserstoffatomen ist, und X aus Amino-, Hydroxy-, Thio- und Carbonylgruppen ausgewählt ist; (ii) Ersetzen von y durch eine geeignete Schutzgruppe B; (iii) Herstellen des Anhydrids des Moleküls B-X-Z-COOH; (iv) Acylieren eines Lysolecithins mit dem Anhydrid aus Schritt (iii), um ein 1-Acyl-2-acyl(X-B)-sn-glycero-3-phospholipid zu erhalten; (v) Entfernen der Schutzgruppe B von der funktionellen Gruppe X; und (vi) Kuppeln eines nichtsteroidalen, entzündungshemmenden Arzneistoffs D mit der funktionellen Gruppe X, um dadurch ein Molekül der allgemeinen Formel I zu erzeugen.
Verfahren gemäß Anspruch 28, wobei die geschützte funktionelle Gruppe X eine Gruppe -NH ist.
Verfahren gemäß Anspruch 28, wobei das Phospholipid aus Schritt (iv) Phosphatidylcholin, Phosphatidylethanolamin, Phosphatidylinositol oder Phosphatidylserin ist.
Verfahren gemäß Anspruch 28, wobei der nichtsteroidale entzündungshemmende Arzneistoff D aus Diclofenac, Indomethacin, Ibuprofen, Naproxen und 6-Methoxy-2-naphthylessigsäure ausgewählt ist.