FR2587118A1

FR2587118A1 - Appareil optique pour la realisation d'analyses immunologiques

Info

Publication number: FR2587118A1
Application number: FR8612549A
Authority: FR
Inventors: Tomas B Hirschfeld
Original assignee: Ord Inc
Current assignee: Ord Inc
Priority date: 1985-09-09
Filing date: 1986-09-08
Publication date: 1987-03-13
Anticipated expiration: 2006-09-08
Also published as: GB2180367A; FR2587118B1; JPS6280610A; DE3630351A1; CA1264971A; US4654532A; JP2557353B2; GB8621175D0; DE3630351B4

Abstract

CET APPAREIL COMPORTE UNE SOURCE DE RAYONNEMENT ET UNE FIBRE OPTIQUE 20 APTE A TRANSMETTRE LEDIT RAYONNEMENT ET POSSEDANT UNE FACE D'ENTREE 22 DANS LAQUELLE LEDIT RAYONNEMENT PEUT PENETRER DANS LA FIBRE, CETTE DERNIERE POSSEDANT UNE FORME RETRECIE 12, DONTLE DIAMETRE DIMINUE ENTRE LA FACE D'ENTREE ET UN EMPLACEMENT ELOIGNE DE CETTE FACE SUIVANT LA DIRECTION LONGITUDINALE DE LADITE FIBRE, CETTE FIBRE CONSTITUANT UN GUIDE D'ONDES UTILISE AVEC UN FLUORIMETRE 45 ET ENTOURE EN PARTIE PAR UNE ENCEINTE TUBULAIRE 28. APPLICATION NOTAMMENT AUX APPAREILS D'ANALYSE IMMUNOLOGIQUE.

Description

Appareil optique pour la réalisation d'analyses immunologiques La présente

invention concerne un appareil optique

permettant une commutation entre des ouvertures numériques op-

tiques tout en conservant la puissance de sortie, et plus par-

ticulièrement un appareil optique perfectionné pour la réali-

sation d'analyses chimiques et biochimiques.

Parmi la grande variété de techniques chimiques et biochimiques utilisées pour des analyses ou des examens, une

technique particulièrement utile et sensible utilise un systè-

O10 me optique mettant en oeuvre les principes de la spectrosco-

pie à réflexion totale interne atténuée (ATR). Particulière-

ment utile pour des analyses immunologiques, un tel système optique utilise un guide d'ondes optiques, sur une partie de

la surface extérieure duquel on peut immobiliser, par une liai-

son covalente, un réactif à un anticorps, avec un antigène dans une solution d'essai. Un faisceau de lumière introduit

dans une extrémité du guide d'ondes subit une réflexion tota-

le interne dans le milieu dense du guide d'ondeset produit une

forme d'onde électromagnétique, connue sous le terme de com-

posante d'onde évanescente. Cette dernière s'étend de façon caractéristique uniquement sur une fraction d'une longueur d'onde à travers l'interface existant entre le guide d'ondes

et la solution d'essai. Cependant cette pénétration est suf-

fisante pour permettre une interaction optique substantielle

de la composante d'onde évanescente atecl'anticorps immobi-

lisé, avec lesquels l'antigène présent dans la solution d'es-

sai forme un complexe,et uniquement d'une manière minimale avec toute solution volumineuse dans laquelle l'antigène était

présent. Une telle interaction optique permet alors d'analy-

ser l'antigène. Un certain nombre de tels systèmes utilisant la spectroscopie à réflexion totale interne pour une analyse sont connus et ont été décrits par exemple dans les brevets US n 4 133 639, dans lequel se trouve décrit un système qui mesure la fluorescence provoquée par l'interaction optique;

4 050 895, qui décrit un système basé sur l'absorption de l'on-

de évanescente par la substance à analyser; et 4 321 057 et 4 399 099, qui tous deux décrivent des systèmes qui détectent des variations du rayonnement transmis à travers la fibre;

4 447 546, qui décrit un système d'analyse immunologique ba-

sé sur la fluorescence; et d'autres.

Un certain nombre de facteurs déterminent la sen-

sibilité de tels systèmes, l'un des facteurs les plus impor-

tants étant que la sensiblité augmente rapidement lorsque l'ou-

verture numérique (NA) de la fibre augmente au niveau du point

de contact avec le milieu environnant qui est analysé. La sen-

sibilité est une fonction de la puissance huitième de NA pour de faibles valeurs de cette dernière, et est fonction d'une puissance inférieure, mais encore importante, de NA pour des

valeurs élevées de cette dernière.

L'ouverture numérique (NA) peut être définie par (1) NA = 2sinB o n2 est l'indice de réfraction du milieu (de façon typique de l'air) dans lequel le rayonnement se propage initialement pour tomber sur une extrémité d'entrée de la fibre, et B est

l'angle d'incidence maximale du rayonnement mau niveau de l'ex-

trémité d'entrée de cette fibre. Cette relation (1) définit

l'ouverture numérique au niveau de l'entrée dans la fibre.

L'ouverture numérique peut être également définie par: (2) NA = (n 2-n12) o n0 est l'indice de réfraction du coeur de la fibre et n1 est l'indice de réfraction du milieu entourant la fibre (par

exemple essentiellement l'échantillon ou la solution volumi-

neuse dans laquelle l'antigène est disposé). La relation (2)

peut par conséquent être utilisée pour définir l'ouverture nu-

mérique au niveau du point de contact entre la fibre et le

fluide qui est analysé. Pour une telle fibre, l'ouverture nu-

mérique, pour laquelle le milieu environnant contacte la fi-

bre, est maximum lorsque le matériau du coeur de la fibre pos-

sède un indice de réfraction très élevé et que le milieu en-

vironnant possède un très faible indice de réfraction, c'est-

à-dire que l'on a n0">> n1. Par exemple on peut obtenir des sen-

sibilités satisfaisantes lorsqu'une fibre de verre possédant

un indice de réfraction ordinaire est entourée par une solu-

tion aqueuse qui possède, de façon typique, un indice de ré-

fraction situé au voisinage de 1,33-1,35.

Si l'ouverture numérique au niveau de l'entrée de la fibre est inférieure à l'ouverture numérique présente au niveau du point de contact avec la solution environnante, on

ne tire aucun avantage du fait que l'ouverture NA est supé-

rieure au niveau du point de contact, et le système ne sera pas presque aussi sensible qu'il pourrait l'être, en tenant compte du fait que la sensibilité dépend selon une fonction

correspondant à une puissance huitième de l'ouverture numéri-

que. Si l'ouverture numérique NA au niveau de l'entrée était supérieure à celle présente au niveau du point de contact avec

la fibre, le rayonnement d'entrée sortirait de la fibre au ni-

veau de l'interface etaugmentait d'une manière importante et

indésirable la fluorescence du fond.

Bien qu'il soit important de prévoir un dispositif de fixation pour la fibre de manière qu'au moins l'extrémité de la fibre, dans laquelle le rayonnement est projeté, soit positionnée de façon précise, un contact entre la fibre et le dispositif de fixation tend à réduire l'ouverture numérique

dans la mesure o l'indice de réfraction du matériau du dis-

positif de fixation est en général supérieur à n1. Afin de ré-

duire ce problème, il était usuel de recouvrir la fibre, au

moins à proximité de l'extrémité de cette dernière, dans la-

quelle le rayonnement se propage, avec un revêtement consti-

tué de façon typique par un polymère de haut poids moléculai-

re, disposé de manière à fournir un milieu intercalaire pos-

sédant un faible indice de réfraction entre le dispositif de fixation et la fibre. Un tel revêtement peut également être

opaque et posséder de préférence un faible coefficient de ré-

fraction. La partie de la fibre destinée à contacter la solu-

tion de la substance à analyser ou l'échantillon devant être analysé reste non munie d'un revêtement. De façon idéale tout rayonnement, qui peut traverser la fibre, peut être employé utilement si l'indice de réfraction du revêtement est le même que l'indice de réfraction de l'échantillon. Malheureusement l'indice de réfraction dans la plupart des revêtements pouvant être obtenus est compris entre environ 1,4 à 1,43, et de tels indices limitent l'ouverture numérique maximale à une valeur nettement inférieure à celle que l'on pourrait obtenir si l'on disposait d'un revêtement possédant un indice de réfraction

plus faible.

En outre on peut améliorer l'ouverture numérique

en prévoyant une fibre gainée comportant un coeur en verre pos-

sédant un indice de réfraction supérieur, mais on ne dispose

pas actuellement dans le commerce de verres possédant un in-

dice de réfraction très élevé, en tant que fibres munies d'une gaine plastique pouvant être retirée et possédant un faible

indice de réfraction. On peut également obtenir une améliora-

tion de l'ouverture numérique en s'assurant que le flux de ra-

yonnement est aussi intense que possible dans l'angle solide d'incidence maximal du système, et une fixation précise de

l'extrémité de la gaine de la fibre prend une importance par-

ticulière lorsque l'angle d'obliguité du rayonnement incident

par rapport à l'axe est très important. Cette exigence de fi-

xation est particulièrement difficile à satisfaire en rapport

avec les fibres de télécommunications, actuellement disponi-

bles, qui possèdent un très faible diamètre (par exemple en-

viron 350 microns). Par exemple dans le brevet US n 4 050 895,

on indique l'utilisation d'un certain nombre de lentilles hé-

misphériques et d'une ouverture annulaire pour réaliser l'in-

jection par couplage de rayons, arrivant suivant un grand an-

gle, dans une fibre. Cependant l'obtention, de cette manière, de très grandes ouvertures numériques requiert des lentilles

fortement corrigées avec une profondeur de champ très faible.

De telles lentilles sont difficiles à fabriquer, très onéreu-

reuses, difficiles à maintenir alignées et possèdent un coef-

ficient de transmission réduit en-raison de leur structure qui

de façon typique est formée d'éléments multiples. Il faut ha-

bituellement utiliser des systèmes à immersion pour un éclai-

rement avec une grande ouverture numérique, mais ces systèmes

tendent à être peu maniables et sont également onéreux.

Un but principal de la présente invention est par

conséquent de fournir un système optique perfectionné, qui ré-

duise au minimum la nécessité d'utiliser un système optique à immersion, améliore le coefficient de transmission optique de la fibre, permet l'utilisation de lentilles d'éclairement

possédant une profondeur de champ plus importante, et tout ce-

ci avec l'avantage d'une ouverture numérique améliorée. D'autes buts importants de la présente invention consistent à fournir

une nouvelle fibre optique munie d'une ouverture numérique net-

tement accrue et de fournir une telle fibre optique pour une

transmission avec réflexion totale interne, ladite fibre per-

mettant d'utiliser un matériau de revêtement formant gaine pos-

sédant un indice de réfraction ordinaire, au voisinage de la

partie o la fibre est fixée ou maintenue.

D'autres buts importants de la présente invention sont de fournir un système optique perfectionné pour détecter

des substances à analyser au niveau d'une interface solide-

liquide conformément à des techniques ATR, fournir un tel système optique en utilisant une fibre optique possédant une

ouverture numérique améliorée et par conséquent une sensibi-

lité accrue, fournir un tel système dans lequel l'ouverture

numérique obtenue peut être aussi grande que cela est autori-

sé par les deux indices de réfraction de l'échantillon et de la fibre, fournir un tel système, dans lequel l'effet de la

réponse du système dû à une modification de l'indice de réfrac-

tion de l'échantillon de la substance à analyser est réduite,

fournir un tel système, qui permette d'utiliser des fibres pos-

sédant des diamètres plus importants que ceux que l'on pouvait utiliser raisonnablement jusqu'à présent, et par conséquent permettre une fixation et un alignement plus commodes de la

fibre et fournir un système plus robuste, fournir un tel sys-

tème, dans lequel la surface d'entrée est nettement accrue, ce qui permet de collecter plus fortement la lumière, mais dans lequel le diamètre de la fibre dans la zone d'échantil- lonnage est réduit afin d'obtenir une sensibilité supérieure; fournir un tel système, dans lequel les exigences en matière

de tolérance pour l'alignement transversal et pour l'aligne-

ment axial de la fibre sont réduites, et fournir un procédé permettant d'améliorer l'ouverture numérique dans un système

d'analyse utilisant une fibre optique.

Ces objectifs ainsi que d'autres objectifs sont at-

teints grâce à l'utilisation, dans le cadre de la présente in-

vention, d'une fibre se rétrécissant graduellement depuis une pupille d'entrée possédant un diamètre relativement important

jusqu'à un diamètre nettement plus petit dans une position dis-

tante longitudinalement de la pupille d'entrée. Une telle fi-

bre conique permet une conservation de la puissance de sortie étant donné qu'il existe un accroissement graduel de l'angle

d'incidence du rayonnement lorsque ce dernier parcourt la fi-

bre depuis la pupille d'entrée en direction de la section de

la partie de diamètre réduit, l'ouverture numérique du rayon-

nement dans les parties de section transversale réduite augmen-

tant dans le rapport inverse du diamètre. En d'autres termes

le faisceau de lumière traversant la fibre est comprimé angu-

lairement par la conicité du milieu dans lequel il est confi-

né; le rapport des diamètres de la partie de gros diamètre et de la partie de faible diamètre de la fibre conique est

exactement l'inverse du rapport des ouvertures numériques.

D'autres buts de la présente invention apparaîtront pour une part d'une manière évidente et ressortiront pour une

part dans la suite de la description.

Par conséquent l'invention porte sur l'appareil pos-

sédant la constitution, la combinaison d'éléments et l'agen-

cement des pièces, et sur le procédé incluant les différentes

phases opératoires et la relation et l'ordre d'une ou de plu-

sieurs telles phases opératoires les unes par rapport aux au-

tres, qui sont tous indiqués à titre d'exemple dans la descrip-

tion détaillée qui va suivre.

D'autres caractéristiques et avantages de la pré-

sente invention ressortiront de la description donnée ci-après

prise en référence aux dessins annexés, sur lesquels: - la figure 1 représente une coupe transversale

idéalisée à plus grande échelle d'une fibre conforme aux prin-

cipes de la présente invention;

- la figure 2 représente une coupe transversale lon-

gitudinale à plus grande échelle d'un dispositif d'analyse com-

portant une fibre optique idéalisée basée sur les principes de la présente invention;

- la figure 3 est une vue en élévation de l'extré-

mité d'entrée du dispositif d'analyse de la figure 2;

- la figure 4 représente une coupe transversale idéa-

lisée à plus grande échelle d'une autre forme d'une structure de fibres conforme auxprincipesde la présente invention;

- la figure 5 représente une coupe transversale lon-

gitudinale à plus grande échelle d'un autre dispositif d'ana-

lyse comportant une fibre optique conforme à la présente in-

vention; et

- la figure 6 représente un système schématique uti-

lisant la fibre conforme à la présente invention en tant qu'élé-

ment de transition dans un système de transmission optique ty-

pique à l'état solide.

En se référant à la figure 1, on y voit représentée une forme de réalisation de la présente invention indiquée à titre d'exemple par la fibre 20. Cette dernière est un corps allongé s'étendant depuis une extrémité ou face d'entrée 22

jusqu'à une extrémité opposée ou terminale 24, la fibre 20 pos-

sédant de préférence une section transversale essentiellement circulaire. Au niveau de la face 22, la surface de la fibre

est de façon typique plane, et est perpendiculaire à l'axe lon-

gitudinal de la fibre et est de préférence extrêmement polie de manière à réduire au minimum toute imperfection ou défaut

de surface qui tendrait à diffuser un rayonnement d'excita-

tion incident. Sinon la face 22 de la fibre peut être confor-

mée avec d'autres formes optiques désirées de manière à ser-

vir par exemple de surface optique d'amplification ou d'adap-

tation. La fibre 20 est adaptée pour la propagation, sur sa

longueur et moyennant des réflexions totales internes multi-

ples, d'un rayonnement d'excitation optique pénétrant par la

face d'entrée 22 sous un angle solide d'admission (B) essen-

tiellement symétrique par rapport à l'axe longitudinal de la fibre et défini précédemment, comme cela est bien connu des

spécialistes de la technique des fibres optiques, par la re-

lation (1). La fibre 20 peut être constituée par un matériau

faisant partie d'un très grand nombre de matériaux essentiel-

lement homogènes et transparents du point de vue optique pour le rayonnement d'excitation, par exemple des matériaux vitreux tels que le verre, des matériaux cristallins tels que le quartz, le saphir et analogues; des polymères synthétiques tels que les polyoléfines, les polypropylènes et analogues. Lorsquela fibre doit être utilisée pour des analyses de fluides comme cela va être décrit ci-après, l'indice de réfraction (n1) du

materiau consistant la fibre 20 duiLt t pe Supé -euri & "2 - sa-

voir l'indice de réfraction du fluide qui est analysé. Ce der-

nier indice de réfraction est égal de façon typique à environ

1,3 pour une solution aqueuse.

Dans une forme de réalisation, la fibre 20 est con-

formée de manière à fournir une forme conique longitudinale de préférence graduelle et uniforme depuis la face d'entrée 22 jusqu'à une extrémité de terminaison 24. Cette transition graduelle sert à accroitre graduellement la convergence du

faisceau d'entrée sans dépasser l'angle critique pour la fi-

bre. De façon idéale la conicité de la fibre ne doit pas dé-

passer 5 . De façon typique pour une fibre possédant une lon-

gueur de quelques millimètres, le diamètre doit diminuer de façon uniforme (c'est-à-dire non nécessairement linéairement, mais essentiellement sans aucune discontinuité ou variation angulaire brusque de l'angle de conicité) depuis un diamètre de 1 mm au niveau de la face 22 jusqu'à quelques centaines de microns au niveau de l'extrémité 24. Si le diamètre de la fi- bre au niveau de l'extrémité 24 est finalement inférieur à une certaine valeur limite, pour laquelle l'ouverture numérique maximale est obtenue, le rayonnement sort ou s'échappe de la

fibre à cet endroit.

En se référant à la forme de réalisation représen-

tée sur la figure 2, on y voit représenté un appareil indiqué

à titre d'exemple 24 pour réaliser l'analyse d'un fluide, le-

quel appareil applique les principes de la présente-invention.

L'appareil 26 comporte une fibre optique 20, une enceinte 28 et un dispositif de fixation 30 et est semblable à de nombreux égards au système représenté dans le brevet US n 4 447 546

attribué en date du 8 Mai 1984 à l'un des auteurs de la pré-

sente invention.

La fibre 20 de la figure 2 présente essentiellement

les caractéristiques décrites en référence à la forme de réa-

lisation de la figure 1, hormis que, dans le but de rendre ma-

ximale l'excitation par le rayonnement d'entrée, la partie co-

nique 32 de cette forme de réalisation s'étend entre un élé-

ment d'entrée 34 et un élément de sortie allongé 36. Ces deux

éléments possèdent de préférence des diamètres essentielle-

ment constants. Le diamètre de l'élément d'entrée 34 s'adapte au diamètre supérieur de la partie conique 32 et le diamètre de l'élément de sortie 36 s'adapte au diamètre inférieur de la partie conique 32. Etant donné que la surface de l'élément

de sortie 36 doit être utilisée en tant que zone d'échantil-

lonnage ou de détection pour l'analyse, l'ensemble de l'échan-

tillonnage est alors réalisé au niveau de l'ouverture numéri-

que maximale du système, c'est-à-dire au niveau de l'extrémi-

té de plus petit diamètre de la fibre. Pour un appareil d'ana-

lyse immunologique, la fibre 20 possédera de façon typique une longueur égale à environ 25 mm, étant entendu cependant qu'une telle longueur est indiquée simplement à titre d'exemple et

n'est aucunement limitative.

Le dispositif de fixation 30 est représenté simple-

ment sous la forme d'un court manchon, revêtement ou anneau 38 entourant un court élément de la fibre 20 au voisinage de

la face 22 et s'étendant radialement à partir de cette derniè-

re en étant en contact avec une partie de la surface intérieu-

re de l'enceinte 28 au voisinage d'une extrémité de cette der-

nière. Comme cela est représenté notamment sur la figure 3,

le manchon 38 comporte de préférence une ou plusieurs perfo-

rations 40 s'étendant essentiellement parallèlement à l'axe

de la fibre 20 de manière à permettre une communication flui-

dique entre les volumes voisins de chaque extrémité du man-

chon. La fonction principale du manchon 38 est de positionner

la fibre 20 de telle sorte que le rayonnement d'entrée puis-

se être dirigé de façon précise sur la face 22, et également de maintenir la fibre 20 à distance de la surface intérieure

de l'enceinte 28. Etant donné que le manchon 38 est nécessai-

rement en contact avec une partie de la surface de la fibre , il peut modifier de façon nuisible l'ouverture numérique

de la fibre, de sorte qu'il est fortement souhaitable de limi-

ter le contact entre le manchon et la fibre à une valeur mi-

nimale compatible avec le rôle mécanique du manchon, et de le fabriquer en un matériau, comme par exemple du siloxane, qui possède un faible indice de réfraction qui de préférence est

proche ou adapté à celui du fluide devant être analysé.

Dans une forme de réalisation donnée à titre d'exem-

ple, il est envisagé qu'un élément actif, comme par exemple un élément de sortie allongé 36 de la surface de la fibre soit

défini en tant que zone activée, au niveau de laquelle l'ana-

* lyse doit être exécutée. L'élément 36 peut être délimité par

un revêtement additionnel ajouté au niveau des extrémités op-

posées de la surface de la fibre de sorte que seul l'élément -35limité- de la fibre reste non recouvert. Les dimensions de la

zone activée peuvent naturellement être réglées au moyen d'au-

tres techniques et en fait essentiellement l'ensemble de la

longueur de la fibre au-delà du manchon peut constituer la zo-

ne activée. Cependant, comme cela a été indiqué, il est sou-

haitable de conformer la zone activée sous la forme d'un cy-

lindre possédant un diamètre constant correspondant à l'ou-

verture numérique maximale pouvant être obtenue, ce qui confè-

re au système la sensibilité maximale. Afin d'activer la sur-

face de l'élément 36, on recouvre et on traite de façon typi-

que ce dernier avec un réactif tel que celui décrit de façon

détaillée dans le brevet US n 4 447 546.

L'enceinte 28 est un tube qui est de préférence,

mais non nécessairement optiquement transparent, mais est cons-

titué en un matériau qui est relativement insoluble avec le

fluide analysé et ne réagit pas chimiquement avec ce dernier.

De façon typique l'enceinte 28 est simplement un tube de ver-

re possédant un diamètre intérieur supérieur au diamètre ex-

térieur maximum de la fibre 20 et dimensionné de préférence de manière à délimiter un volume prédéterminé entourant au

moins la surface activée de la partie 36 de la fibre.

La fabrication de la fibre conique peut être réali-

sée d'une manière très simple en partant par exemple d'un coeur de fibre en verre de diamètre constant (par exemple

500 microns) disponible dans le commerce, en chauffant la fi-

bre localement comme par exemple avec un chalumeau ou un dis-

positif de chauffage électrique jusqu'à ce qu'une zone locale de la fibre devienne plastique, puis en tirant la fibre à une vitesse et avec une distribution de température permettant de rétrécir la fibre pour l'amener à un diamètre réduit de par exemple 300 microns. L'angle minimum admissible de conicité

est fonction de considérations pratiques telles que la lon-

gueur admissible de la fibre, mais l'angle maximum de conici-

té ne doit pas dépasser ce qui est nécessaire pour conserver la relation angulaire critique nécessaire pour maintenir la

transmission au moyen d'une réflexion totale interne, et dé-

pend par conséquent de l'indice de réfraction du matériau de la fibre. Par exemple, pour un noyau de fibres constitué par du quartz fondu, l'angle de conicité maximum devrait être de préférence maintenu à une valeur inférieure à environ 5 . On peut ensuite découper la fibre conique là o on le désire. Le choix de la durée, des températures, des vitesses de tirage et de la distribution de température dépend naturellement dans une large mesure des caractéristiques physiques du matériau particulier choisi pour la fibre. On peut utiliser n'importe

quel procédé parmi un nombre d'autres procédés connus pour éti-

rer ou former une fibre conique. De façon surprenante, la pré-

sente invention se prête parfaitement à la formation d'une fi-

bre à double circulation (c'est-à-dire les fibres capables de

transmettre la lumière depuis la face d'entrée jusqu'à l'ex-

trémité distale, puis de la réfléchir en elle-même jusqu'à la

face d'entrée, si on le désire). Une telle surface réfléchis-

sante distale, située au niveau de l'extrémité 42 sur la fi-

gure 2, peut être aisément formée simplement par chauffage de

la fibre en ce point et tirage de la fibre à une vitesse suf-

fisamment élevée pour rompre cette dernière et former une ter-

minaison présentant un angle important et qui sert de miroir

apte à réfléchir la lumière dans la direction opposée. La ter-

minaison 42 peut par conséquent avoir un effet semblable à un

réflecteur en forme de prisme, mais peut être formée d'une ma-

nière beaucoup plus simple sans les problèmes liés à la for-

mation de miroirs classiques comme par exemple par meulage,

métallisation, polissage et analogue. Naturellement la termi-

naison 42 peut être simplement conformée de manière à refou-

ler la lumière, si on le désire, dans la mesure o l'on peut observer la fluorescence au niveau de la face d'entrée 22 sans

aucune gêne de la part de la lumière d'excitation.

Lors du fonctionnement de la forme de réalisation de la figure 2, on applique sur l'élément 36 de la fibre 20

un revêtement 43 constitué par un réactif faisantpartied'un cer-

tain nombre de réactifs d'activation (comme par exemple un

constituant formé d'un complexe anticorps-antigène et qui in-

clut une marque luminescente) et on le soumet essentiellement à la même procédure que celle décrite dans le brevet US

n 4 447 546.

En bref on remplit l'espace intercalaire 44 présent

entre l'enceinte 28 et la fibre 20 avec un échantillon liqui-

de de la substance devant être analysée, en faisant incuber l'échantillon si cela est nécessaire. Comme représenté sur la figure 2, on utilise l'appareil avec un fluorimètre 45 qui fournit une source de rayonnement d'excitation, de préférence

un émetteur de rayonnement à l'état solide ou un laser de tel-

le sorte que la longueur d'onde du rayonnement peut être spé-

cifiée de façon précise. La face d'entrée 22 est éclairée par

le rayonnement d'excitation, qui, de façon typique, est capa- ble d'exciter ou de provoquer une fluorescence dans la volume traversé au

voisinage de la surface de l'élément 36, par une onde évanescente accompagnant la transmission du rayonnement

dans la fibre. Le rayonnement d'excitation est comprimé angu-

lairement depuis l'extrémité d'entrée de la fibre jusque dans

la partie recouverte, par la conicité de la fibre, ce qui ac-

croit considérablement l'ouverture numérique. Etant donné que l'ouverture numérique de l'élément 36 est nettement supérieure à celle de la face 22, le réactif, qui est excité par l'onde

évanescente, est le siège d'une intensité d'excitation nette-

ment plus importante que celle que fournirait une fibre ne pré-

sentant pas une forme conique et comportant une face d'entrée de même diamètre. La fluorescence induite est alors renvoyée

selon un effet de tunnel dans la fibre, par le matériau exci-

té, de manière à être lue par un photomètre 45. Sinon on peut disposer l'élément de détection du photomètre au niveau de

l'extrémité distale de la fibre afin de mesurer la fluorescen-

ce émise par cette extrémité, mais dans un tel cas il faut

prévoir d'établir une distinction, par filtrage, entre le ra-

yonnement d'excitation et le rayonnement de fluorescence.

Pour obtenir une sensibilité maximale dans un sys-

tème d'analyse conforme à la présente invention, il est hau-

tement souhaitable d'obtenir une ouverture numérique qui soit

aussi proche que possible que l'ouverture numérique maximale.

Comme cela a été noté précédemment, une ouverture numérique trop faible entraîne une perte de signal, qui correspond à la puissance huitième; une ouverture numérique trop importante provoque un refoulement d'énergie, la perte d'une partie du

signal et un accroissement de la fluorescence ambiante. La re-

production de fibres présentant une ouverture numérique maxi-

maie impose de reproduire d'une façon précise, d'une fibre à une autre, le même rapport de diamètres de la face d'entrée à celui de la zone sensible de la fibre, ce qui implique des

tolérances de fabrication non réalistes.

On peut contourner ce problème en réalisant la fi-

bre avec un diamètre d'entrée légèrement supérieur à ce qui

est nécessaire, de manière à obtenir un rapport di/df des dia-

mètres légèrement trop important, di étant le diamètre au ni-

veau de l'entrée et df le diamètre au niveau du point final

ou sensible sur la fibre. Avec une telle structure, le rayon-

nement d'entrée commence à sortir de la fibre lorsqu'il at-

teint la zone de la fibre recouverte par l'échantillon, l'in-

dice de réfraction inférieur de l'air environnant en cet en-

droit empêchant une perte d'énergie à travers la surface de

la fibre. Ceciimpose une limite au rapport maximum utilisa-

ble des diamètres. Ce rapport doit être supérieur à ce que l'on peut obtenir avec une interface fibre/échantillon, mais

doit être inférieur à ce qui garantit une réflexion totale in-

terne au niveau de l'interface fibre/air. Cette relation peut être exprimée sous la forme: (3) Vn02-nl2 <NAi(di/df) < n0 o n0 est l'indice de réfraction de la fibre, n1 l'indice de réfraction de l'échantillon et NA. l'ouverture numérique au i niveau de la surface d'entrée de la fibre. Dans ces conditions, la lumière supplémentaire collectée par la surface d'entrée plus large reste dans la fibre jusqu'à ce qu'elle atteigne le

point ou la zone o le milieu environnant possède le même in-

dice de réfraction que l'échantillon. Etant donné qu'un ac-

croissement de d. implique un accroissement de l'énergie d'en-

i

trée, la perte d'énergie laisse subsister un transfert d'éner-

gie net identique à celui obtenu dans un système dans lequel d. est plus faible, mais aucun rayonnement ne sort, mais i

l'énergie extraite ne devrait pas pouvoir créer une interfé-

rence ambiante. A cet effet, comme représenté sur la figure 4 (sur laquelle des chiffres identiques désignent des parties identiques par rapport à la forme de réalisation de la figure 2),au niveau ou au voisinage de la jonction entre les éléments 32 et 36, au niveau de laquelle tout rayonnement sortant de la fibre tend à poser des problèmes du point de vue du fond ambiant, la fibre est entourée par un anneau 46 absorbant le

rayonnement et qui est en contact avec la fibre sur sa péri-

phérie et est constitué en un matériau possédant un indice de

réfraction adapté d'une manière aussi juste que cela est pos-

sible à celui de la solution échantillon. Par exemple, pour des échantillons aqueux, l'anneau 46 peut être formé par un gel rempli par un colorant absorbant ou du noir de carbone,

ou bien peut être simplement un anneau constitué en une matiè-

re plastique absorbant le rayonnement, comme par exemple du

polytétrafluoroéthylène noir.

Non seulement l'accroissement des rapports des dia-

mètres réduit des exigences concernant les tolérances de fa-

brication, mais il sert également à réduire les tolérances re-

quises de positionnement, à la fois du point de vue axial et du point de vue transversal, pour la fibre dans un système d'analyse. L'accroissement de surface de la surface d'entrée

réduit à l'évidence l'exigence sur la tolérance de position-

nement transversal étant donné que, dans un tel cas, un fais-

ceau focalisé doit parcourir une plus grande distance trans-

versalement avant de quitter la face d'entrée. Etant donné que

cet accroissement de surface réduit également l'angle d'inci-

dence B requis pour obtenir la même ouverture numérique, la profondeur de champ admissible du système optique d'entrée est accrue et la tolérance axiale requise pour la face d'entrée de la fibre, qui doit rester inférieure à la profondeur de

champ, est moins sévère.

Le présent système permet de fournir un appareil d'analyse à fibre optique possédant une ouverture numérique

aussi élevée que celle que l'on peut obtenir eu égard aux li-

mites imposées par l'indice de réfraction de l'échantillon et par l'indice de réfraction du coeur de la fibre. Etant donné que l'on peut partir d'un "barreau" presqu'essentiellement en verre,plutôt que de fibres fines comme cela est décrit dans le brevet US n 4 447 546, on n'est pas limité par le type de

verre que l'on peut utiliser, c'est-à-dire des verres pour té-

lécommunications, et par conséquent on peut utiliser des ver-

res possédant un indice de réfraction très élevé, ce qui ac-

croit de façon supplémentaire l'ouverture numérique maximale que l'on peut obtenir au niveau de la partie de la fibre qui

est en contact avec l'échantillon. En réalité l'ouverture nu-

mérique maximale au niveau de l'échantillon peut maintenant être supérieure à l'unité. Pour atteindre cet objectif sans

réaliser un rétrécissement de la fibre, il faudrait que le dis-

positif d'éclairement soit un système à immersion. En d'autres termes, étant donné que l'ouverture numérique d'entrée d'une fibre conique peut être inférieure à l'ouverture numérique qui existe à l'intérieur de la fibre conique au niveau du point

de contact avec l'échantillon, on peut se dispenser d'une im-

mersion, en utilisant une fibre qui possède un diamètre d'en-

trée suffisammant important pour que l'ouverture numérique

d'entrée reste inférieure à l'unité.

En outre l'utilisation de la fibre conique conforme

à la présente invention permet d'utiliser des lentilles d'en-

trée possédant une ouverture numérique réduite. De telles len-

tilles à ouverture numérique réduite sont meilleur marché,

plus faciles à construire, mieux corrigées, tendent à possé-

der un coefficient de transmission supérieur et possèdent éga-

lement de meilleures profondeurs de champ de sorte que leur

focalisation est moins critique.

Etant donné que la fibre conique elle-même (au moins au niveau de l'extrémité o elle est fixée ou maintenue) peut posséder un diamètre supérieur que dans les dispositifs d'ana- lyse de l'art antérieur, on peut utiliser la fibre conique pour réaliser un système qui est plus robuste et possède des

tolérances beaucoup plus libres du point de vue positionne-

ment. En outre, étant donné qu'il n'est pas nécessaire que l'extrémité d'entrée ou l'extrémité large de la fibre conique

possède une ouverture numérique aussi large que ce qui est re-

quis dans l'art antérieur, on peut installer un revêtement ou

une gaine possédant n'importe quel indice de réfraction rai-

sonnable, et le problème du maintien ou de la fixation de la

fibre devient, à cet égard, secondaire.

Dans les systèmes d'analyse utilisant des fibres

optiques, il serait souhaitable que de petites variations in-

contrôlables de l'indice de réfraction de l'échantillon n'aient

jamais un effet minimum sur les lectures. De faibles varia-

tions de l'indice de réfraction de la couche superficielle

sont également difficiles à contrôler étant donné qu'elles dé-

pendent de la manière avec laquelle le réactif, tel que la cou-

che formée d'anticorps, a été appliqué à la surface de la fi-

bre. Etant donné que les fibres coniques conformes à la pré-

sente invention améliorent tellement l'ouverture numérique ef-

ficace et que l'on peut utiliser des fibres possédant un indi-

ce de réfraction élevée dans de tels dispositifs d'analyse,

l'importance du contrôle des indices de réfraction de la pel-

licule superficielle et du fond est fortement réduite et il est possible d'effectuer de meilleures mesures. Par exemple,

dans un dispositif d'analyse utilisant une fibre conique pos-

sédant un indice de réfraction égal à environ 1,76, des mesu-

res effectuées respectivement en utilisant des échantillons

d'eau et de sérum ont fourni une variation de réponses d'en-

viron 10 %, ce qui contraste avec un facteur égal environ à 2 pour un système utilisant une fibre standard non rétrécie, cylindrique. Les avantages de l'utilisation d'une fibre conique dans un dispositif d'analyse par fluorescence sont tout à fait considérables. La limite de l'ouverture numérique (pour des échantillons de liquide) pour des fibres normales est en gros égale à 0,3 si l'on utilise une gaine étendue ou à 0, 4 si l'on n'utilise que de courts segments de gaine et si l'on tolère une certaine perte dans cette gaine. Dans une fibre conique conforme à la présente invention, on peut aisément obtenir des

ouvertures numériques dépassant 1. Afin d'optimiser l'échan-

tillon particulier qui est analysé, il faut sélectionner le

degré de conicité de manière que le rapport des ouvertures nu-

mériques fournissent l'ouverture numérique finale désirée au

niveau de l'échantillon. L'ouverture numérique maximale pou-

vant être obtenue de cette manière est égale à la racine car-

rée de l'indice de réfraction de la fibre élevée au carré moins l'indice de réfraction de l'échantillon élevé au carré. Par exemple l'ouverture numérique maximale est égale à 1,12 pour une fibre possédant un indice de réfraction élevé égal à 1,76 et un échantillon possédant un indice de réfraction égal à

1,351. Cette ouverture numérique élevée implique une sensibi-

lité accrue d'un facteur égal à environ 500 par rapport à ce

qu'on peut obtenir avec des fibres cylindriques standards.

L'amélioration du signal délivré par l'appareil d'analyse en rapport avec l'ouverture numérique est due, de façon optimale, à quatre facteurs: un facteur correspondant à la puissance deux de la capacité du système à collecter la lumière, un facteur correspondant à la puissance deux pour le

rendement d'excitation de l'onde évanescente, un facteur cor-

respondant à une puissance deux pour le rendement de collecte

de la fluorescence produite par l'onde évanescente, et un fac-

teur correspondant à une puissance deux en ce qui concerne l'angle solide de collecte de la fluorescence. Cependant il existe une réduction intrinsèque des intensités d'injection

par couplage lorsque l'indice de réfraction de la fibre aug-

mente au point que pour des ouvertures numériques élevées, on ne peut pas s'attendre à une amélioration correspondant à la

puissance 8. C'est pourquoi dans l'appareil d'analyse compor-

tant des fibres coniques présentant une ouverture numérique élevée, on obtient uniquement, par rapport à l'art antérieur,

une amélioration correspondant à un facteur maximum égal ap-

proximativement à 500, au lieu d'obtenir une amélioration théo-

rique correspondant à 10 000. Cette amélioration est obtenue en partie par le fait que l'épaisseur de la zone évanescente

diminue pour une ouverture numérique élevée et que par consé-

quent on échantillonne un volume plus faible. Il existe un ef-

fet d'épaisseur pour l'échantillon volumineux et, lorsque l'ef-

fet d'épaisseur est absent comme dans le cas d'une petite fi-

bre, il existe un autre effet léger dû au désaccord entre les

indices de réfraction et à une variation des intensités d'in-

jection par couplage du rayonnement à travers l'interface.

Dans la description de la fibre de la présente in-

vention, que l'on a donnée jusqu'alors, les éléments 32 et 36 ont été considérés comme étant homogènes, au moins de façon implicite, mais ceci n'est pas nécessaire etadans certains cas

n'est pas particulièrement souhaitable. Comme cela est repré-

senté en particulier sur la figure 5, la fibre 20 est consti-

tuée de deux sections en aboutement, 47 et 48, qui correspon-

dent respectivement aux éléments 32 et 36, mais la section co-

nique 47 est constituée par un polymère synthétique transpa-

rent comme par exemple du polyméthylméthacrylate et la sec-

tion 48 est formée par un verre optique, auquel cas il faut

prendre soin à conformer le joint entre les sections de maniè-

re à fournir la transmission maximale du rayonnement qui se

propage le long de la fibre.

Comme représenté sur la figure 6, la fibre conforme

à la présente invention est également utile d'une manière sub-

stantielle en tant qu'élément de transmission de manière à

réaliser l'adaptation du diamètre des systèmes optiques d'en-

trée/sortie dans des lignes de transmission. Sur la figure 6, la fibre 20 est accouplée, au niveau d'une face d'entrée 22, à une source optique à l'état solide 50, comme par exemple un laser ou une diode photoémissive, dont on ne peut normalement pas réduire les dimensions, et une extrémité distale 24 de la

fibre est accouplée à l'entrée de la fibre optique 52 présen-

tant la qualité permettant son utilisation pour une transmis-

sion. La sortie de cette fibre est à son tour raccordée à un

capteur photoélectrique 54. Sinon, si une transition supplé-

mentaire est souhaitée, la sortie de la fibre 52 peut être rac-

cordée à l'extrémité la plus petite d'une autre fibre analo-

gue 20, dont l'extrémité la plus grosse est alors accouplée

au capteur 54.

Etant donné que certaines modifications peuvent être apportées à l'appareil et au procédé indiqués ci-dessus sans sortir du cadre de l'invention ici décrite, on estime que tous

les éléments contenus dans la description donnée ci-dessus ou

représentés sur les dessins annexés doivent être interprétés

comme étant de nature illustrative et non dans un sens limi-

tatif.

Claims

REVENDICATIONS

1. Appareil optique caractérisé en ce qu'il compor-

te, en combinaison, - une source de rayonnement (50), et - une fibre optique (20) apte à transmettre ledit rayonnement et possédant une face d'entrée (22), dans laquelle

ledit rayonnement peut être introduit, ladite fibre se rétré-

cissantd'une manière uniforme, avec une variation de son diamè-

tre entre ladite face d'entrée (22) et un emplacement (24) es-

pacé de cette face suivant la direction longitudinale de la-

dite fibre.

2. Appareil optique selon la revendication 1, ca-

ractérisé en ce que ladite fibre (22) se rétrécit avec une for-

me conique à partir de ladite face d'entrée (22) et que l'an-

gle de cette conicité est inférieur à environ 5 .

3. Appareil optique selon la revendication 1, carac-

térisé en ce que ladite source de rayonnement (50) est un émet-

teur de rayonnement à l'état solide.

4. Appareil optique selon la revendication 1, ca-

ractérisé en ce que ladite source de rayonnement est un laser.

5. Appareil optique selon la revendication 1, ca-

ractérisé en ce qu'il comporte des moyens de détection accou-

plés à ladite face d'entrée (22) de manière à détecter un ra-

yonnement se propageant en retour dans ladite fibre.

6. Appareil optique selon la revendication 1, ca-

ractérisé en ce que l'ouverture numérique au niveau de ladite extrémité opposée (24) de ladite fibre est supérieure à 1 dans

le cas o ladite fibre est entourée par de l'air.

7. Appareil optique selon la revendication 1, ca-

ractérisé en ce qu'il comporte un anneau (46) absorbant le ra-

yonnement et disposé en contact avec et autour de ladite fi-

bre (22) dans une zone intermédiaire entre ladite face d'en-

trée (22) et ledit emplacement.

8. Appareil optique servant à réaliser des analyses immunologiques en utilisant un réactif comportant une marque fluorescente apte à émettre un rayonnement de fluorescence lorsqu'elle est excitée par un rayonnement d'excitation, cet appareil comprenant une fibre optique (20) apte à transmettre à la fois ledit rayonnement d'excitation et ledit rayonnement de fluorescence et possédant une face d'entrée (22), dans la-

quelle ledit rayonnement d'excitation peut se propager de ma-

nière à créer, à l'intérieur d'une zone limitée par au moins

une partie de la surface de ladite fibre, une onde évanescen-

te apte à déclencher un rayonnement de fluorescence dans les

marques qui peuvent être disposées dans cette zone, caracté-

_ -_ -risé en ce que ladite fibre (20) possède une forme se rétré-

cissant d'unmimiûeunifcmr avec une variation de son diamètre en-

tre ladite face d'entrée (22) et un emplacement (24) espacé

de cette face suivant la direction longitudinale de la fibre.

9. Appareil optique selon la revendication 8, ca-

ractérisé en ce que ledit réactif est un complexe antigène-

anticorps.

10. Appareil optique selon la revendication 8, ca-

ractérisé en ce qu'il comporte des moyens (28) servant à déli-

miter un volume incluant ladite zone et limités, au moins en

partie, par ledit élément de ladite surface de la fibre (20).

11. Appareil optique selon la revendication 10, ca-

ractérisé en ce que ledit volume possède les dimensions d'un capillaire.

12. Appareil optique selon la revendication 10, ca-

ractérisé en ce que lesdits moyens (28) comprennent une encein-

te allongée entourant au moins ladite partie de ladite surfa-

ce de la fibre, tout en en étant espacée.

13. Appareil selon la revendication 8, caractérisé en ce que ladite fibre possède une forme se rétrécissant de façon douce avec une réduction de son diamètre depuis ladite

face d'entrée (22) en direction de l'extrémité opposée de la-

dite fibre.