FI95998B

FI95998B - t-PA-liuotus

Info

Publication number: FI95998B
Application number: FI913907A
Authority: FI
Inventors: Ulrich Dr Kohnert; Rudolph Dr Rainer
Original assignee: Boehringer Mannheim Gmbh
Priority date: 1989-12-20
Filing date: 1991-08-19
Publication date: 1996-01-15
Also published as: EP0458929A1; CA2046598C; AU625831B2; ATE102046T1; NO912775L; DE59004814D1; FI913907A0; AU6914991A; HUT60133A; DE3942145A1; NO912775D0; WO1991008764A1; JPH0657660B2; FI95998C; CA2046598A1; KR920700683A; JPH04503680A; HU208630B; HU912740D0; EP0458929B1

Description

95998 t-PA-liuotus - t-PA-solubilisering

Ihmisen plasminogeenin kudosaktivaattori t-PA on terapeut-5 tisesti erittäin merkittävä verihyytymien liuottamisessa kun kyseessä ovat esim. sydänveritulpat. t-PA vaikuttaa hyytymiskaskadiin aktivoimalla plasminogeeniä plasmiiniksi. Plasmiini puolestaan liuottaa fibriiniä, joka on hyytyneen veren pääasiallisin, tukirungon muodostava valkuaisaine.

10

Luonnon t-PA muodostuu useasta funktionaalisesta alueesta: F, G, ΚΙ, K2 ja P. Alue P sisältää proteolyyttisesti aktiivisen keskuksen, joka vaikuttaa plasminogeenin jakautumiseen plasmiiniksi. t-PA:n tai erilaisten t-PA-muteii-15 nien, joista on deletoitunut jokin alueista F, G, K1 ja K2, valmistaminen geeniteknologian keinoin eukaryottisissa tai prokaryoottisissa soluissa on tunnettua. Toisin kuin luonnon t-PA:n ollessa kysessä, prokaryoottisoluissa valmistetut t-PA-johdannaiset ovat valmistuttuaan ei-glykosyloidus-20 sa muodossa.

Proteiinit, joilla on t-PA-aktiivisuutta, liukenevat huonosti puskuriaineisiin, joita tavallisesti käytetään proteiinien liuottamiseen, esim 50 mmol/1 Na-sitraattia, 50 • 25 mmol/1 fosfaattia tai fysiologista NaCl-liuosta. Terapeut tisena aineena käytettävän t-PA-aktiivisen proteiinin entsyymiaktiivisuuden tulisi kuitenkin olla vähintään 0,25 MU/ml, esim. 0,25 - 10 MU/ml.

30 EP-A-0217379 tuo esiin menetelmän, jonka avulla t-PA:n liu- kenevuutta lisätään käyttämällä neutraaleja tai lievästi aikalisiä arginiinikoostumuksia. Menetelmän eräänä haittapuolena on kuitenkin voimakkaasti konsentroidun t-PA-liuos-ten huono stabiilisuus neutraaleissa tai lievästi alkali-35 sissa olosuhteissa.

2 95998 US-patentti 4777043 tuo esiin farmaseuttisen koostumuksen, joka sisältää ihmisen t-PA:ta ja farmaseuttisesti hyväksyttävää arginiumioneja sisältävää puskuriainetta, kloridi-ionien pitoisuus enimmillään 0,3 mol/1. EP-A-0156169, EP-5 A-0303351 ja EP-A-0297294 puolestaan käsittelevät mahdolli suutta edistää t-PA-aktiivisten proteiinien liukenevuutta puskuriaineissa käyttämällä aminohappoja, niiden suoloja, johdannaisia tai homologeja. t-PA:ta voidaan stabiloida myös käyttämällä gelatiinilisäystä (EP-A-0123304), albu-10 miinilisäystä (EP-A-0112940) tai lisäämällä jonkin sakka-ridin polyrikkihappoestereitä tai sulfatoituja sokereita (EP-A-0198321). PCT/US88/04402 tuo esiin menetelmän t-PA:n liukenevuuden lisäämiseen käyttämällä vesipitoista väliainetta ja emäksistä aminohappoa, erityisesti arginiinia, 15 pitoisuuden ollessa 0,02 - 0,2 mol/1 sekä jotain sit- ruunahapporyhmää, pitoisuutena 0,02 - 0,08 mol/1, pH-arvo 5-8.

Nämä erilaiset yhdistelmät eivät kuitenkaan sovi kaikille 20 valkuaisaineille, joilla ilmenee t-PA-aktiivisuutta. Erityisen selvää oli, että glykosyloimaton t-PA, glykolysoi-mattoman t-PA:n muteiinit ja glykosyloitu t-PA liukenevat kaikki hyvin eri tavoin.

; 25 Keksinnön tarkoituksena oli saada aikaan farmaseuttinen valmiste, joka sisältää glykosyloitua ja glykosyloimatonta t-PA:ta tai t-PA-muteiineja, joiden aktiivisuus on yli 0,25 MU/ml, ja jossa t-PA pysyy stabiilina entistä pitemmän aikaa.

30 Tähän päästiin valmistamalla lääkekoostumus, joka sisältää t-PA-aktiivista proteiinia, pitoisuus vähintään 0,4 MU/ml pH-arvossa 4,5 - 9, ja ainetta, joka valitaan ryhmästä sitruunahappo, askorbiibihappo, 2-oksoglutaarihappo, fumaari-35 happo, Tris ja EDTA, joiden pitoisuus on vähintään 0,2 mol/1.

<1 : IMI mil II ill 3 95998

Edullisesti tämän aineen pitoisuus saisi olla 0,2-1 mol/1, vielä edullisemmin 0,3-1 mol/1.

Yhdisteelle sopiva pH-arvo on 4,5 - 9, erityisen edullinen 5 on 6 - 7,5 .

Keksinnössä t-PA-aktiivisilla proteiineilla tarkoitetaan prokaryoottisistä tai eukaryoottisista organismeista saatavaa modifioimatonta t-PA:ta samoin kuin kaikkia t-PA-mute-10 iineja. Esimerkkejä t-PA-muteiineista kuvaa esimerkiksi Harris (Protein Engineering 1, 1987, 449-458).

Edullisesti keksinnön mukainen koostumus saisi sisältää natiivia glykosyloitua t-PA:ta esim. CHO-soluista. Jos 15 keksinnön mukainen valmiste sisältää natiivia glykosyloitua t-PA:ta, sen entsymaattisen aktiivisuuden tulee edullisesti olla vähintään 1,4 MU/ml.

Yksikkö U on määritelty t-PA-aktiivisuuden yksikkö (WHO, 20 National Institute for Biological Standards and Control).

Edelleen edullista on, että käytetään glykosyloimatonta prokaryoottista t-PA:ta (pro-t-PA), joka voidaan saada aikaan patentin DE-3537708 mukaisesti. Pro-t-PA:11a tarkoi-j 25 tetaan t-PA:ta, joka alkaa aminohaposta -3 (Gly) aminohappoon +1 (Ser), ja päättyy kohtaan 527 (Pro) (Harris, Protein Engineering 1, 1987, 449-458). Jos keksinnön mukainen valmiste sisältää pro-t-PA:ta, sen entsymaattisen aktiivisuuden tulee olla vähintään 0,25 MU/ml.

30

Edelleen edullinen on glykosyloimaton t-PA-muteiini, jossa on alueet Kl, K2 ja P, ja jota merkitään pro-KlK2P (valmistus kuten DE—39233391.1). pro-KlK2P alkaa aminohapoista 85-92 ja päättyy kohtaan 527 (Pro). Jos keksinnön mukainen 35 valmiste sisältää pro-KlK2P:tä, sen entsymaattisen aktiivisuuden tulee olla vähintään 0,4 MU/ml.

95998 4

Edullinen on myös glykosyloimaton t-PA-muteiini, jossa on alueet K2 ja P, ja jota merkitään pro-K2P (valmistus kuten EP-A-0382174). pro-K2P alkaa aminohapoista 174-179 päättyy kohtaan 527 (Pro). Sekä K2P että pro-KlK2P voivat sisältää 5 osittain tai kokonaan aminohapot -3 (Gly) aminohappoon +5 (Ile) (Harris, supra). Jos keksinnön mukainen valmiste sisältää pro-K2P:tä, sen entsymaattisen aktiivisuuden tulee olla vähintään 1,4 MU/ml. Kuitenkin kaikki muutkin proka-ryoottiset tai eukaryoottiset t-PA-muteiinit ovat sopivia.

10

Seuraavassa muutamia keksinnön mukaisten valmisteiden erityisen edullisia koostumuksia.

Eräs niistä sisältää 300 mmol/1 sitruunahappoa/NaOH, pH 6.

15 Eräs toinen sisältää 300 mmol/1 askorbiibihappoa, pH 6.

Eräs sisältää 300 mmol/1 2-oksoglutaarihappoa, pH 6. Eräs sisältää 300 mmol/1 EDTA, pH 6. Eräs sisältää 300 mmol/1 fumaarihappoa/NaOH, pH 6. Eräs sisältää 1 mol/1 Tris/HCl, pH 7,2.

20

Vielä eräs keksinnön kohteista on lääkeaine, joka perustuu t-PA-aktiiviseen proteiiniin vaikuttavana aineena liuoksessa tai lyofilisaattina vaikuttavien aineiden kanssa, mahdollisesti lisänä muita sopivia farmaseuttisesti hyväksyt-: 25 täviä lisä-, apu-, kantaja- ja täyteaineita.

Keksinnön mukaisia farmaseuttisia valmisteita voidaan käyttää esimerkiksi injektio- tai infuusioliuoksissa. Tämä voidaan toteuttaa valmistamalla ruiskutusvalmis liuos, joka 30 sisältää keksinnön mukaisen koostumuksen. On kuitenkin mahdollista käyttää keksinnön mukaista koostumusta lyofi-lisaattien muodossa. Ne puolestaan voidaan rekonstruoida tunnettuja injektointiin sopivia väliaineita tai liuoksia käyttäen. Injektointiväliaineista edullisin on vesi, joka 35 sisältää muitakin tavallisia lisäaineita kuten stabilisoin-tiaineita, liuotinväliaineita, puskurlaineita ja isotonisia 5 95998 lisäaineita (esim. fysiologinen NaCl-konsentraatti). Tällaisia lisäaineita ovat esimerkiksi manniitti, tartraatti-tai sitraattipuskuri, etanoli, kompleksinmuodostajat kuten etyleenidiamiinitetraetikkahappo ja niiden ei-toksiset suo-5 lat, esim. suurimolekulääriset polymeerit kuten nestemäinen polyetyleenioksidi viskositeetin säätelyssä. Injektoinnis-sa käytettävien nestemäisten kantoaineiden tulee olla steriilejä, ja edullisesti ne saisivat olla ampulleihin suljettuja.

10 Tämän keksinnön kohteena on vielä glykosyloitujen t-PA-ak-tiivisten proteiinien käyttö keksinnön mukaisten farmaseuttisten valmisteiden valmistukseen.

15 Seuraavat esimerkit selventävät keksinnön konkreettista toteutusta.

Esimerkki 1

Erilaisten aineiden vaikutus glykosyloimattomien t-PA-mute-20 iinien (aluekoostumus K2P) liukoisuuteen

Esimerkissä kuvataan pro-K2P:n (valmistus kuten EP-A-0382174) liukenevuutta erilaisiin puskuriaineisiin. Kuten taulukosta 1 voidaan nähdä, pro-K2P liukenee kokeiltuihin : 25 puskuriliuoksiin aktiviteetilla, joka on selvästi suurempi kuin 1,4 MU/ml.

170 ml puhdistettua pro-K2P:ta (liuotettuna, 0,5 mol/1 ar-giniini/fosforihappo, pH 7,2) ultrasuodatettiin , konsent-30 roinnissa käytettiin Amicon YM-10-kalvoa. 1 ml konsent- raattia dialysoitiin vasten jokaista taulukossa 1 mainittua puskurlainetta. Koe-erien sentrifugoinnin jälkeen mitattiin kirkkaan pinnalle jäävän osan entsymaattinen aktiivisuus.

35 6 95998

Entsymaattinen aktiivisuus on ilmoitettu tilavuusaktivi-teettina MU/ml ja kokonaisaktiviteettina MU.

t-PA-aktiivisuus voidaan mitata tavalliseen tapaan hajotta-5 maila käyttäen kromogeenistä substraattia (H. Lill, ZGIMAL 42, (1987), 478-486). Yksikkö U on määritelty t-PA:n aktiviteetti (WHO, National Institute for Biological Standards and control).

10 TAULUKKO 1

Puskuriaine Aktiviteetti

MU/ml MU

15 _ 0,3 mol/1 sitruunahappo/NaOH, pH 6 2,23 2,05 0,3 mol/1 askorbiinihappo/NaOH, pH 6 1,68 1,95 1 mol/1 Tris/HCl, pH 7,2 8,76 5,8 0,3 mol/1 EDTA/NaOH, pH 6 1,95 1,95 20 0,3 mol/1 2-oksoglutaarihappo, pH 6 2,64 3,17 0,3 mol/1 fumaarihappo/NaOH, pH 6 1,85 4,08

Esimerkki 2 j 25 pro-KlK2P:n liukenevuus

Puhdistettua pro-KlK2P:ta (liuotettuna, 0,5 mol/1 arginii-ni/H3P04, pH 7,2) ultrasuodatettiin, konsentroinnissa käytettiin Amicon YM-10-kalvoa. 1 ml konsentraattia (aktivi-30 teetti 3,5 MU/ml) dialysoitiin vasten jokaista taulukossa 2 t mainittua puskuriainetta. Koe-erien sentrifugoinnin jälkeen mitattiin kirkkaan pinnalle jäävän osan entsymaattinen aktiivisuus.

35 Entsymaattinen aktiivisuus on ilmoitettu tilavuusaktivi-teettina MU/ml ja kokonaisaktiviteettina MU.

7 95998 t-PA-aktiivisuus voidaan mitata tavalliseen tapaan hajottamalla käyttäen kromogeenistä substraattia (H. Lill, ZGIMAL 42, (1987), 478-486). Yksikkö U on määritelty t-PA:n aktiviteetti (WHO, National Institute for Biological Standards 5 and control).

TAULUKKO 2 10 Puskuriaine Aktiviteetti

MU/ml MU

1 mol/1 Tris/HCl, pH 7,2 1,65 1,07 15

Esimerkki 3 pro-tPA:n liukenevuus

Puhdistettua pro-tPA:ta (liuotettuna, 0,5 mol/1 arginii-20 ni/H3P04) ultrasuodatettiin, konsentroinnissa käytettiin

Amicon YM-10-kalvoa. 1 ml konsentraattia (aktiviteetti 2,4 MU/ml) dialysoitiin vasten jokaista taulukossa 3 mainittua puskurlainetta. Koe-erien sentrifugoinnin jälkeen mitattiin kirkkaan pinnalle jäävän osan entsymaattinen aktiivi-25 suus.

30 t-PA-aktiivisuus voidaan mitata tavalliseen tapaan hajotta-- : maila käyttäen kromogeenistä substraattia (H. Lill, ZGIMAL

42, (1987), 478-486). Yksikkö U on määritelty t-PA:n aktiviteetti (WHO, National Institute for Biological Standards and control).

35 95998 8 TAULUKKO 3 5 Puskurianne Aktiviteetti

MU/ml MU

0,3 mol/1 sitruunahappo/NaOH, pH 6 0,29 0,16 1 mol/1 Tris/HCl, pH 7,2 2,15 1,07 10

Esimerkki 4 CHO-tPA:n liukenevuus 15

Puhdistettua CHO-tPA:ta (liuotettuna, 0,5 mol/1 arginii-ni/H3P0«) ultrasuodatettiin, konsentroinnissa käytettiin Amicon YM-10-kalvoa. 1 ml konsentraattia (aktiviteetti 6,6 MU/ml) dialysoitiin vasten jokaista taulukossa 3 mainittua 20 puskurlainetta. Koe-erien sentrifugoinnin jälkeen mitattiin kirkkaan pinnalle jäävän osan entsymaattinen aktiivisuus.

Entsymaattinen aktiivisuus on ilmoitettu tilavuusaktivi-25 teettina MU/ml ja kokonaisaktiviteettina MU.

t-PA-aktiivisuus voidaan mitata tavalliseen tapaan hajottamalla käyttäen kromogeenistä substraattia (H. Lill, ZGIMAL 42, (1987), 478-486). Yksikkö U on määritelty t-PA:n akti-30 viteetti (WHO, National Institute for Biological Standards and control).

il : m i mu 1.1 x αι 35 9 95998 TAULUKKO 4

Puskuriaine Aktiviteetti

5 MU/ml MU

1 mol/1 Tris/HCl, pH 7,2 6,16 6,49 0,3 mol/1 sitruunahappo/NaOH, pH 6 4,44 4,44

Claims

95998

1. Menetelmä farmaseuttisen valmisteen, joka sisältää proteiinia, jolla on t-PA-aktiivisuutta, entsyymiaktiivisuus vähintään 0,25 MU/ml ja pH-arvo 4,5-9, valmistamisek- 5 si, tunnettu siitä, että t-PA-aktiivinen proteiini liuotetaan vähintään yhteen seuraavista aineista: sitruunahappo, askorbiinihappo, 2-oksoglutaarihappo, fumaarihappo, Tris ja EDTA, pitoisuus vähintään 0,2 mol/1, ja liuos saatetaan farmaseuttiseen antomuotoon.

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että mainittujen aineiden pitoisuus on 0,2-1 mol/1.

3. Förfarande enligt patentkrav 1, käxmetecknat av att koncentrationen av nämnda ämnen är 0,3-1-mol/l. 15

3. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu 15 siitä, että mainittujen aineiden pitoisuus on 0,3 -1 mol/1.

4. Förfarande enligt nägot av patentkraven 1-3, käxmetecknat av att domänsammansättningen av det t-PA-aktiva proteinet är K2P, det är oglykosylerat och dess enzymatiska aktivitet är minst 1,4 MU/ml. 20

4. Jonkin patenttivaatimuksen 1-3 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että t-PA-aktiivisen proteiinin domeeni-koostumus on K2P, se on glykosyloimaton ja sen entsymaatti- 20 nen aktiivisuus on vähintään 1,4 MU/ml.

5. Förfarande enligt nägot av patentkraven 1-3, känne-tecknat av att domänsammansättningen av det t-PA-aktiva proteinet är K1K2P, det är oglykosylerat och dess enzymatiska aktivitet är minst 0,4 MU/ml. 25

5. Jonkin patenttivaatimuksen 1-3 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että t-PA-aktiivisen proteiinin domeeni-koostumus on K1K2P, se on glykosyloimaton ja sen entsymaat- , 25 tinen aktiivisuus on vähintään 0,4 MU/ml.

6. Förfarande enligt nägot av patentkraven 1-3, känne-tecknat av att det t-PA-aktiva proteinet är en oglykosyle-rad pro-t-PA och dess enzymatiska aktivitet är minst 0,25 MU/ml. 30

·· 7. Förfarande enligt nägot av patentkraven 1-3, käxme tecknat av att det t-PA-aktiva proteinet är en glykosylerad pro-t-PA och dess enzymatiska aktivitet är minst 1,4 MU/ml. 35 8. Förfarande enligt nägot av de föregäende patentkraven, käxmetecknat av att det används 300 mmol/1 av citronsyra/ NaOH, pH 6. 95998

6. Jonkin patenttivaatimuksen 1-3 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että t-PA-aktiivinen proteiini on glykosyloimaton pro-t-PA ja sen entsymaattinen aktiivisuus on vä- 30 hintään 0,25 MU/ml. » • ’* 7. Jonkin patenttivaatimuksen 1-3 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että t-PA-aktiivinen proteiini on glykosy-loitu t-PA ja sen entsymaattinen aktiivisuus on vähintään 35 1,4 MU/ml. 95998

8. Jonkin edellisen patenttivaatimuksen mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että käytetään 300 mmol/1 sitruunahap-poa/NaOH, pH 6.

9. Förfarande enligt nägot av de föregäende patentkraven, kännetecknat av att det används 300 mmol/1 av ascorbinsy-ra/NaOH, pH 6. 5 10. Förfarande enligt nägot av de föregäende patentkraven, kännetecknat av att det används 300 mmol/1 av 2-oxoglutar-syra/NaOH, pH 6.

9. Jonkin edellisen patenttivaatimuksen mukainen menetel mä, tunnettu siitä, että käytetään 300 mmol/1 askorbiini-happoa/NaOH, pH 6.

10. Jonkin edellisen patenttivaatimuksen mukainen menetel-10 mä, tunnettu siitä, että käytetään 300 mmol/1 2-oksoglutaa- rihappoa/NaOH, pH 6.

11. Förfarande enligt nägot av de föregäende patentkra-10 ven, kännetecknat av att det används 300 ramol/1 av EDTA/ NaOH, pH 6.

11. Jonkin edellisen patenttivaatimuksen mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että käytetään 300 mmol/1 EDTA/NaOH, 15 pH 6.

12. Förfarande enligt nägot av de föregäende patentkraven, kännetecknat av att det används 300 mmol/1 av fumarsy- 15 ra/NaOH, pH 6.

12. Jonkin edellisen patenttivaatimuksen mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että käytetään 300 mmol/1 fumaarihap- : ' poa/NaOH, pH 6. 20"

13. Förfarande enligt nägot av de föregäende patentkraven, kännetecknat av att det används 1 mol/1 av TRIS/HC1, pH 7,2. 20

13. Jonkin edellisen patenttivaatimuksen mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että käytetään 1 mol/1 Tris/HCl, pH 7,2. 25- 14. Jonkin patenttivaatimuksen 1-13 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että koostumukseen lisätään lisäksi tavanomaisia lisä-, apu- ja/tai kantaja-aineita.

15. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu 30 siitä, että farmaseuttinen antomuoto on injektioliuos tai lyofilisaatti. 95998 l. Förfarande för framställning av ett farmaceutiskt pre-parat innehällande ett protein med t-PA-aktivitet, enzymak-tivitet minst 0,25 MU/ml och pH-värde 4,5-9, käxmetecknat 5 av att det t-PA-aktiva proteinet löses i ätminstone ett av följande ämnen: citronsyra, ascorbinsyra, 2-oxoglutarsyra, fumarsyra, Tris och EDTA, halten minst 0,2 mol/1, och lös-ningen bringas i en farmaceutisk doseringsform. 10 2. Förfarande enligt patentkrav 1, käxmetecknat av att koncentrationen av nämnda ämnen är 0,2-1-mol/l.

14. Förfarande enligt nägot av patentkraven 1-13, kännetecknat av att tili sammansättningen tillsätts även konven-tionella tillsats-, hjälp- och/eller bärarämnen. 25

15. Förfarande enligt patentkrav 1, kännetecknat av att den farmaceutiska doseringsformen är en injektionlösning eller lyofilisat. • ·