JP2690944B2 - 組織プラスミノーゲンアクチベーター活性を有するタンパク質の高濃度溶液 - Google Patents

組織プラスミノーゲンアクチベーター活性を有するタンパク質の高濃度溶液

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Description

【発明の詳細な説明】 本発明はプラスミノーゲンアクチベーター活性を有す
るタンパク質の高濃度溶液の製法、その方法により調製
された溶液、およびかかる溶液のヒトおよび動物医薬中
における使用に関する。
身体は血液の損失および血栓症から自身を防御するた
めに平衡状態にある２つのシステムすなわち凝固系およ
び繊維素溶解系を有する。この両者間の相互作用によ
り、はじめに止血のための不溶性フイブリン重合体が形
成され、これが創傷が治癒する間に繊維素溶解による溶
解過程により分解される。
トロンビンおよびプラスミンはこの両システムにおけ
る重要酵素である。生理学的条件下においては、凝固系
と繊維素溶解系との間の動的な平衡はトロンビンの血栓
形成活性とプラスミンの血栓溶解活性の制御の下にあ
る。この平衡にはそれぞれの阻害剤が寄与している。こ
の２種のシステムの一方が優勢になると致命的な結果、
すなわち出血および血栓症のみならず血管損傷を生じう
る。
血栓溶解作用を有するプラスミンは比較的非特異的
な、トリプシン様のセリンプロテアーゼである。このも
のは不活性な前駆物質であるプラスミノーゲンの形で合
成される。プラスミノーゲンは血液中に不活性前駆物質
として循環しておりそしてある種の刺激に応答してはじ
めて活性化される。プラスミノーゲンのプラスミンへの
変換はプラスミノーゲンアクチベーターにより触媒され
る。
プラスミノーゲンは４種の異なるプラスミノーゲンア
クチベーター系により活性化される、すなわち （１） 第XII因子依存系、 （２） 連鎖球菌から単離されたプラスミノーゲンアク
チベーターであるストレプトキナーゼ、 （３） 組織プラスミノーゲンアクチベーター（以下ｔ
−PAと略記する）、および （４） 尿のプラスミノーゲンアクチベーター（ｕ−PA
またはウロキナーゼ）。
第XII因子依存性の系を介した活性化は生理学的に低
次な重要性しか有していない。細菌性プラスミノーゲン
アクチベーターであるストレプトキナーゼは治療上大へ
ん重要ではあるが、尿プラスミノーゲンアクチベーター
であるウロキナーゼと同様に、それが投与または遊離さ
れた後に血管系全体に作用する、すなわち目的部位以外
にもプラスミノーゲン活性化を及ぼすという欠点を有す
る。終りに、組織プラスミノーゲンアクチベーターは多
くの組織および組織液体中に存在するタンパク質であ
り、このものはフイブリンに結合してはじめてその完全
な繊維素溶解活性を展開する。従つてｔ−PAによるこの
プラスミノーゲン活性化は目的とする部位でのみ特異的
に進行する反応であり、この反応は他の血漿タンパク質
を同時に非特異的にタンパク分解するという危険を伴わ
ないものである。
どの原因によるかに関わりなく、繊維素溶解系の副次
的な機能により、血栓形成による血管閉鎖を招来しう
る。かかる血栓の結果生ずるものは例えば心筋梗塞、肺
塞栓または卒中である。繊維素溶解系の副次的な機能に
より惹起される多くの疾患の予防および治療において
は、プラスミノーゲンアクチベーターの投与が重要な役
割を演じている。理想的には投与されるプラスミノーゲ
ンアクチベーターは副作用のない、フイブリン特異的な
溶解治療ができるものであるべきである。この要件に合
致するものはｔ−PAのみである、何故なら前記したよう
に、ｔ−PAによる活性化はフイブリンへの結合に依存し
ているからである。ｔ−PAは動物細胞から治療に充分な
量に産生されうる。しかしながらｔ−PAはウロキナーゼ
と正しく同様に、人体中では３〜８分しか半減期を有し
ない。それゆえ例えば血管内注入物の形態で一定して継
続的にｔ−PAの供給を行う必要がある。同時に心不全ま
たは腎不全を有する患者に付加的な負担を負わさないた
めには投与される液体の容量はできるだけ低く抑えられ
ねばならない。それゆえｔ−PAを含有し生理学的に受容
されうる非経口溶液の製剤はできるだけ高濃度であるこ
とが要求される。
EP−Ａ−156,169号記載の条件下に、リジンまたはオ
ルニチンを添加することにより3,000〜50,000U/mlのｔ
−PA濃度を達成することができる。このものでは必要と
される治療量では供給される流体量が極端に多量とな
る。このヨーロッパ特許出願EP156,169号に記載される
ようにリジンまたはオルニチンを添加しても治療上妥当
に使用できるｔ−PA含有溶液が得られない。
西ドイツ特許公開第3,617,753号公報にはpHを２〜５
に低下させることによりｔ−PA濃度が5,000,000U/mlま
で達するｔ−PA溶液が記載されている。それにより治療
上妥当なｔ−PA濃度の溶液を得ることができるが、しか
し同時に甚しく非生理学的pH値を有する溶液の注入に堪
えねばならない。かかる溶液の投与により注入部位の付
近での皮膚刺激および血管損傷が不可避的に生ずること
になる。
それゆえ本発明の目的はｔ−PA活性を有するタンパク
質の非経口投与可能な、生理学的に受容されうる高濃度
溶液を調製できる方法を開発することであつた。
この目的は本発明に従つてＤ−および／またはＬ−ア
ミノ酸、それらの塩、誘導体および同族体からなる群か
ら選択される少なくとも２種の物質を溶液に加えること
により、達成される。
驚くべきことに、Ｄ−および／またはＬ−アミノ酸、
それらの塩、誘導体および同族体からなる群から選択さ
れる少なくとも２種の物質の添加はｔ−PA活性を有する
タンパク質に安定性促進作用を及ぼすことが判明した。
同時に、数種のこれらの物質の組み合せによりタンパク
質の溶解度が高まることが観察されうる。この２種の効
果の広がりは全く予想外である。安定性の高まりのみな
らず溶解度の増大は明らかに個個の作用の相剰作用に由
来している。
本発明による物質例えばリジン、オルニチン、アルギ
ニン、ジアミノピメリン酸、アグマチン、クレアチン、
グアニジノ酢酸、アセチルオルニチン、シトルリン、ア
ルギニノこはく酸、トラネキサム酸およびε−アミノカ
プロン酸は注入用の溶液の製剤化に顕著に適する。それ
らのすべてに共通した特徴はアミノ基および／またはグ
アニジノ基の形態の塩基性の基が存在することである。
プラスミノーゲンアクチベーター活性を有するタンパ
ク質の高濃度溶液の製造にはアルギニンおよびリジンの
好ましくは0.001〜１モル／、特に好ましくは0.01〜
0.5モル／の組合せが特に適当であることが判明し
た。従つて、例えば＋４℃で５日間インキュベーション
後の細胞培養上澄み液中のｔ−PA活性は出発値の31％ま
で低下したが、一方平行実験した試料に0.1モル／の
アルギニンおよび0.1モル／のリジンを添加すると同
じ時間インキュベーションした後でも５％の活性低下し
か生じないことが示された。
本発明による物質の安定性促進および溶解度増大作用
は１本鎖または２本鎖形の組織プラスミノーゲンアクチ
ベーターのみならずその天然に存在するか、合成または
遺伝子操作により調製された誘導体においても、あるい
はｔ−PAとその天然に存在するか、合成または遺伝子操
作により調製された誘導体、および／またはプロウロキ
ナーゼまたはウロキナーゼとの組み合せにおいても観察
された。
ｔ−PAまたは同じ活性を有するタンパク質の単離は慣
用の方法により行われうる。場合によりｔ−PA活性を有
するタンパク質をはじめにカオトロピツク剤例えばKSCN
の緩衝された溶液で透析することにより溶液となし、こ
の状態で所望のｔ−PA濃度となるまで濃縮し、そして次
に少なくとも２種類の本発明による物質好ましくはアル
ギニンおよびリジンを含有する緩衝された溶液で透析し
てもよい。その場合例えばプラスミノーゲンアクチベー
ター活性を有するタンパク質を含有する溶液を約0.05モ
ル／のトリス−HCl（pH7）中の約1.6モル／のKSCN
で始めに透析しそして次に0.05モル／のトリス−HCl
（pH7）中のそれぞれ0.1モル／濃度のアルギニンとリ
ジンを含有する溶液で透析することになろう。
しかしながら、安全性促進効果は細胞培養上澄み液に
本発明による物質を直接添加することによつても同様に
達成されうる。本発明により処理された細胞培養上澄み
液からは、ｔ−PA活性を有しかつその非活性が対照血清
の３倍高いタンパク質が単離される。
本発明による物質の安全性ならびに溶解度促進効果は
広範囲にわたりpHに関わりなく存在する。タンパク質を
含有する相当する溶液のpHは５〜10にあることができ、
そして好ましくは６〜８である。
通常非経口投与用溶液は過することにより滅菌され
る。というのは生物学的に活性な分子の多くは低温殺菌
による破壊されようからである。しかしながら滅菌過
された生成物では天然痘ワクチンのSV−40汚染あるいは
第VIII因子製剤によるエイズウイルスの感染により証明
されるように、ウイルスの存在が決して完全に排除でき
るわけではない。本発明方法の重要な利点はｔ−PA活性
を有するタンパク質が本発明による物質の添加により充
分に安定化されて、従つてその活性が低温殺菌後でも実
質的に残存したままであることである。例えば緩衝され
たｔ−PA含有溶液は１回の低温殺菌後で出発時活性の0.
5％しか保持していないが、それぞれ１モル／のアル
ギニンおよびリジンの添加により当初活性の約85％を保
持することができた。
本発明による物質の安定化作用は低温殺菌の種類とは
実質的に関係がない。従つて、低温殺菌はpH5〜10およ
び40〜90℃で１〜60時間インキュベーションすることに
より行うことができる。
しかしながら好都合には低温殺菌は事実上生理学的p
H、すなわちpH6〜８、および50〜70℃で６〜16時間イン
キュベーションすることにより行われる。
最も好ましい態様は、pH約７での低温殺菌であり、ｔ
−PA活性を有するタンパク質を60℃で10時間インキュベ
ーションすることである。
タンパク質を含有する溶液は場合により他の添加剤、
例えば単糖類または二糖類、糖アルコール、および場合
により他の付加的な成分例えばアルブミン、ゼラチン、
ヘマクセル（Heamaccel）、塩化ナトリウム、塩化カル
シウム、ヘパリン、EDTA、グルシンまたは界面活性剤を
添加することもできる。これらの付加的な成分は例えば
安定化、系の緩衝、プロテアーゼの抑制、表面張力の減
小、および浸透圧の調節のために生理学的に受容されう
る量で添加される。
低温殺菌においてスクロースまたはソルビトールを添
加することによりもう一つの安定化促進効果が得られ
る。すなわち、それぞれ0.5モル／のアルギニンおよ
びリジンを含有する、グリシンにより緩衝されたｔ−PA
溶液中において低温殺菌後も残存する活性分子の割合は
約81％から96％まで高められうる。その場合0.2〜2kg/
のスクロースまたはソルビトールの添加が好ましい。
本発明により処理されたｔ−PAまたは同じ作用を有す
るタンパク質の活性は凍結乾燥に続き使用直前に滅菌水
に溶解させた後でもなお保持されていた。
本発明方法により、ｔ−PA活性を有しかつ５×106U/m
lより高い濃度を有するタンパク質溶液が調製されう
る。この濃度ゆえに、比較的長期間にわたる連続的注入
においても問題なく投与を行うことができる。極端な排
泄困難を有する患者ではｔ−PA濃度は溶解度または安定
性に問題を生じることなく30×106U/mlまで高めること
ができる。
選択されたｔ−PA濃度の如何に関わりなく、本発明に
より調製された溶液の活性は低温殺菌後でも実質的に保
持されていることが判明した。ｔ−PA活性を有する本発
明による水性タンパク質溶液は低温殺菌により滅菌され
かつ治療上価値ある比活性を有するはじめてのプラスミ
ノーゲンアクチベーター製剤である。
本発明による溶液はヒトおよび動物の医薬への使用に
等しく適する。生理学的に受容されうる物質のみしか添
加されていないので、本発明による溶液の投与において
は炎症も皮膚刺激もまたは血管損傷も生じない。
本発明による溶液の好ましい使用分野は血栓症および
塞栓症の治療および予防である、すなわち本発明による
製剤は繊維素溶解剤として使用されうる。
以下の実施例により本発明を説明する。
実施例 １ ｔ−PA産生性CHO−細胞（チヤイニーズハイスター卵
巣）をウシ血清５％を含有するダルベツコ改良イーグル
倍地20中で培養した。細胞培養上澄み液を24時間毎に
採取しそして新鮮な倍地ととり代えた。
滅菌条件下に採取された細胞培養上澄み液を0.1モル
／のアルギニンおよび0.1モル／のリジンの存在下
または非存在下に＋４℃で５日間貯蔵した。
ｔ−PA活性をRanby氏の方法（Progress in Fibrinoly
sis５、233−235、1981）に従い毎日測定した。
この結果は、処理されなかつた細胞培養上澄み液中の
活性ｔ−PAの含量がほとんど70％まで失われている、す
なわち続いて単離されたタンパク質の比活性が採取時点
のわずかに約30％にしか達しないことを明らかに示して
いる。しかしながら本発明により処理された細胞培養上
澄み液は５％しか活性損失がないのでアルギニンおよび
リジンの添加により活性の実質的な損失を伴うことなく
細胞培養上澄み液の暫定的な貯蔵を行うことができる。
実施例 ２ ｔ−PAを含有する溶液をpH7.0の0.05モル／のトリ
ス−HCl中の1.6モル／のKSCNで透析し、次にpH7.0の
0.05モル／のトリス−HCl中の0.1モル／のアルギニ
ンおよび0.1モル／のリジンで透析しそしてｔ−PA濃
度0.1、0.2、0.5、1.0、10、20、40、60および80mg/ml
となるまで濃縮した。ｔ−PAを溶液中に60mg/mlの濃度
まで保持できることが観察された。他の添加剤なしのツ
イーン（Tween ）80を用いた場合の溶解度限界はｔ−P
A 0.5mg/mlであつた。
実施例 ３ ｔ−PAを含有する溶液をpH7.0の0.05モル／のトリ
ス中の1.6モル／のKSCNで透析し、次にpH7.0の0.05モ
ル／のグリシンならびに漸増濃度のアルギニンおよび
リジンを含有する緩衝液で透析した。記載のあるところ
には0.5または1g/mlのスクロースをｔ−PA含有溶液に加
えた。この溶液をpH7に調整した。この溶液を60℃で10
時間加熱した。ｔ−PA活性を低温殺菌の前と後に測定し
た。
この表により、スクロースの添加もアルギニンとリジ
ンの添加もプラスミノーゲンアクチベーターに対して安
定化効果を有することが示される。スクロースもアルギ
ニンとリジンも添加されなかつた試料では低温殺菌によ
り活性がほとんど完全に破壊されるが、1g/mlのスクロ
ースのみを添加した後では当初活性の68％が保持されて
いる。この数字はアルギニンおよびリジンの添加により
大きく改良されて、1g/mlのスクロースおよびそれぞれ
0.5モル／のアルギニンとリジンの組き合せを添加す
ると当初活性の96％が保持されており、このことは低温
殺菌による活性損失が無視しうる程度に小さくなること
を意味している。

Claims (16)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】組織プラスミノーゲンアクチベーター（ｔ
    −PA）の溶液に、リジン、オルニチン、アルギニン、ジ
    アミノピメリン酸、アグマチン、クレアチン、グアニジ
    ノ酢酸、アセチルオルニチン、シトルリン、アルギニノ
    こはく酸、トラネキサム酸もしくはε−アミノカプロン
    酸またはそれらの塩もしくは誘導体からなる、アミノお
    よび／またはグアニジノ基の形態で塩基性基を含有する
    Ｄおよび／またはＬ−アミノ酸から選択される少なくと
    も２種類の物質を加えることを特徴とする、５×106U/m
    l以上の組織プラスミノーゲンアクチベーター活性濃度
    を有するタンパク質の溶液の製法。
  2. 【請求項２】アルギニンおよびリジンを好ましくはそれ
    ぞれ0.001〜１モル／、特に好ましくは0.01〜0.5モル
    ／加えることからなる請求項１記載の方法。
  3. 【請求項３】タンパク質である組織プラスミノーゲンア
    クチベーターが１本鎖または２本鎖形であるか、または
    その天然に存在するか、合成または遺伝子操作により調
    製された誘導体であり、そして単独で、あるいは組織プ
    ラスミノーゲンアクチベーターおよびその天然に存在す
    るか、合成または遺伝子操作により調製された誘導体お
    よび／またはプロウロキナーゼまたはウロキナーゼと組
    み合わせて溶液中に含有されることからなる請求項１ま
    たは２に記載の方法。
  4. 【請求項４】プラスミノーゲンアクチベーター活性を有
    するタンパク質を含有する溶液を、先ず緩衝されたKSCN
    溶液、次いでアルギニンおよびリジンを含有する緩衝さ
    れた溶液、好ましくは先ず0.05モル／のトリス−HC
    l、pH7中の1.6モル／KSCN緩衝液、次いで0.1モル／
    のアルギニンおよび0.1モル／のリジンを含有するpH7
    の緩衝された溶液で透析することからなる請求項１〜３
    のいずれかに記載の方法。
  5. 【請求項５】溶液が細胞培養上澄み液であることからな
    る請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
  6. 【請求項６】溶液をpH5〜10、好ましくはpH6〜８に調製
    することからなる請求項１〜５のいずれかに記載の方
    法。
  7. 【請求項７】タンパク質を含有する溶液を低温殺菌する
    ことからなる請求項１〜６のいずれかに記載の方法。
  8. 【請求項８】低温殺菌がpH5〜10および40〜90℃で１〜6
    0時間インキューベーションすることにより行われるこ
    とからなる請求項７記載の方法。
  9. 【請求項９】低温殺菌がpH6〜８および50〜70℃で６〜1
    5時間インキュベーションすることにより行われること
    からなる請求項８記載の方法。
  10. 【請求項１０】低温殺菌がpH6.5〜7.5および60℃で10時
    間インキュベーションすることにより行われることから
    なる請求項９記載の方法。
  11. 【請求項１１】溶液に慣用の医薬上受容されうる安定化
    および／または緩衝物質の付加的に加えることからなる
    請求項１〜10のいずれかに記載の方法。
  12. 【請求項１２】好ましくは0.2〜2kg/のスクロースお
    よび／またはソルビトールが加えることからなる請求項
    11記載の方法。
  13. 【請求項１３】タンパク質を含有する溶液を凍結乾燥す
    ることからなる請求項１〜12のいずれかに記載の方法。
  14. 【請求項１４】請求項１〜13のいずれかに記載の方法に
    より調製された、組織プラスミノーゲンアクチベーター
    活性を有するタンパク質を含有する溶液。
  15. 【請求項１５】活性が低温殺菌後も実質的に保持されて
    いることからなる請求項14記載の溶液。
  16. 【請求項１６】繊維素溶解剤として使用するための請求
    項14または15に記載の溶液。
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