FI95752B - Määrityskitti ja -menetelmä kokonaisten solujen immunologiseen määritykseen - Google Patents

Description

- 95752 Määrityskitti ja -menetelmä kokonaisten solujen immunologiseen määritykseen

Keksintö koskee testikittiä ja tällä kitillä suori-5 tettavaa immunologista määritysmenetelmää solupopulaa tioille tai niiden alaryhmille ominaisten pinta-antigeenien määrittämiseksi. Immunologista määritysmenetelmää ja vastaavaa kittiä voidaan käyttää myös itse solujen määrittämiseen niiden pinta-antigeenimäärityksen avulla. Nämä . 10 määritykset ovat käyttökelpoisia diagnostiikassa.

Antigeenien tai solun pintamarkkereiden tuntemus on edistynyt valtavasti lymfosyyttihybridisaation kehittämisen ja KÖHLERIN ja MILSTEININ (Nature, 1975, 256, 495- 497) monoklonaalisten vasta-aineiden löytämisen jälkeen.

15 Monoklonaalisten vasta-aineiden avulla voidaan nimenomaan osoittaa ja analysoida erilaisten solujen pintamarkkereita tai membraaniantigeeneja. Nämä markkerit (tai antigeenit) voivat olla erilaisia: proteiineja, glykoproteiineja tai glykolipidejä. Tutkitut karakterisoinnit soveltuvat siis 20 pääasiallisesti kudos- tai elinmarkkereiden, normaalien solujen erilaistumis- tai aktivoitumistilan markkereiden ja normaalien tai syöpäsolujen identifiointiin tai tyypitykseen. Eräs erityisen merkittävä alue on hematopoeettis-ten solulinjojen (erytrosyytit, megakaryosyytit, granuloit 25 syytit, monosyytit, lymfosyytit) tutkimus.

Niinpä esimerkiksi monoklonaalisten vasta-aineiden avulla voidaan määrittää T- ja B-lymfosyyttien keskinäiset pintaominaisuudet. Vastaavat markkerit identifioivat yksin tai yhdessä lymfosyyttien funktionaalisia erilaistumis-30 tai erikoistumistiloja. Kansainvälisellä sopimuksella hu-maanileukosyyttien pintamarkkerit on luokiteltu ryhmiin tai erilaistumisluokkiin (CD), jotka IUIS-OMS:n alakomitea on määrittänyt 1984, ja ne on esitetty Maailman Terveysjärjestön julkaisussa 1984, 62 (5), 813-815.

35 Näiden markkereiden identifiointi monoklonaalisten vasta-aineiden avulla on mahdollistanut markkereiden ra- - 95752 2 kenteen ja biologisten toimintojen selvittämisen. Esimerkiksi CD4- ja CD8-markkereiden molekyylit osallistuvat leukosyyttien adheesioon, ja T-lymfosyyttien pinnalla niillä on auttava ja indusoiva tehtävä (CD4-markkeri) tai 5 sytotoksinen ja suppressoiva tehtävä (CD8-markkeri).

Näiden tietojen ja markkereita tunnistavien mono-klonaalisten vasta-aineiden avulla voidaan näitä markkereita käyttää diagnostiikassa ja erilaisten patologisten tilojen, etenkin malignien hemopatioiden (leukemia, lym-10 fooma, jne.) ja immuunisysteemin toimintahäiriöiden (autoimmuunisairaudet, synnynnäiset tai hankitut immuunihäi-riöt, kuten AIDS, jne.) seuraamisessa. (BRETON-GORIUS ja VAINCHENKER, Le Biologiste, 1987, XXI, no 167 63-70, SHAW, Immunology Today, 1987, 8 (1), 1-3).

15 Monoklonaaliset vasta-aineet ovat nykyään korvaa mattomia työkaluja kliinisen biologian soluanalyyseissä.

On olemassa solulaskumenetelmiä, joissa käytetään solujen pinta-antigeenien merkitsemistä, mutta nämä menetelmät ovat usein pitkiä, työläitä, vaikeasti toteutetta-20 via, ja tulokset ovat joskus sattumanvaraisia.

Solun pinta-antigeenien normaalia tai muuttunutta ekspressiota määrittävät yleisesti tunnetut ja käytetyt menetelmät voidaan jakaa kahteen ryhmään. Ensimmäisessä ryhmässä antigeenit määritetään monimutkaisilla ja spesia-.. 25 lisoiduilla laboratoriolaitteilla, jotka perustuvat vir- taussytometriaan (katso PONCELET et ai., J. Immunol.

Methods, 1985, 85, 65-74) tai kvantitatiivisiin mikro- skooppitekniikkoihin (POULTER et ai., J. Immunol. Methods, 1987, 98, 227-234). Nämä solujen antigeenien määritysmene-30 telmät perustuvat signaalin mittaamiseen, joka on lähtöisin antisellulaarisista vasta-aineista, jotka on liitetty suorasti tai epäsuorasti reagenssiin, joka on leimattu fluoresoivalla aineella (tai fluorokromeilla), kuten fluo-reseiini- tai rodamiini-isotiosyanaatilla, tai entsyymeil-35 lä, kuten peroksidaasilla tai alkalisella fosfataasilla. Näiden fluoresoivien tai entsymaattisten reagenssien käyt- 3 - 95752 tö yhdessä tarpeellisten pesuvaiheiden kanssa Johtaa ainoastaan solumembraanien, eikä ympäristön aiheuttamaan fluoresenssiin tai värireaktioon. Näiden menetelmien laajaa käyttöä laboratorioissa rajoittaa spesialisoidut ja 5 kalliit laitteistot (fluoresoiva mikroskooppi, joka voi olla liitetty kuva-analysaattoriin, kryostaatti, virtaus-sytometri). Lisäksi näillä menetelmillä suoritettujen solujen immunomerkitsemisten analysointiin ja tulkitsemiseen tarvitaan sytologian spesialistin asiantuntemusta.

10 Toinen antigeenien määritysmenetelmien ryhmä perus tuu kokonaissolupopulaation markkereiden kvantitatiiviseen arviointiin. Näillä menetelmillä voidaan antigeenit määrittää joko suoralla tai epäsuoralla leimauksella, joka siis usein suoritetaan kahdessa, kolmessa tai neljässä 15 vaiheessa. Kaikissa tapauksissa viimeisessä merkitsemis-vaiheessa käytetty reagenssi sisältää leiman, joka on joko isotooppi, esim. jodi 125, immunoradiologisissa mittauksissa (BROWN et ai., J. Immunol. Methods, 1979, 31, 201. STOCKER ja HEUSSER, J. Immunol. Methods, 1979, 26, 87-95) 20 tai entsyymi immunoentsymologisissa mittauksissa, useimmiten peroksidaasi, alkalinen fosfataasi tai beeta-galakto-sidaasi, (VAN LEUVEN et ai., J. Immunol. Methods, 1978, 23, 109-116, MORRIS Transplantation, 1983, 36(6), 719, BAUMGARTEN, J. Immunol. Methods, 1986, 94, 91-98).

.. 25 Tämän viimeisen ryhmän menetelmät ovat melko hanka- lia, työläitä ja epävarmoja, sillä ne vaativat useita so-lumateriaalin pesuja ja sentrifugointeja; joskus entsy-maattisen reaktion tuloksena syntynyt värillinen liuos on siirrettävä lopullista spektrofotometrista mittausta var-30 ten; lopuksi useimmiten käytetty solujen kemiallinen kiin-• nittäminen johtaa joidenkin, erityisesti tavallisille ke miallisille kiinnitysaineille, kuten glutaraldehydille tai metanolille, herkkien antigeenien irreversiibeliin hajoamiseen (DROVER et ai., J. Immunol. Methods, 1986, 90, 275-35 281).

- 95752 4

Kirjallisuudesta on tunnettua, että antigeeni, jolla on useita antigeenisiä determinantteja, ts. useita epi-tooppeja, voidaan määrittää kiinnittämällä tämä antigeeni yhdestä sen epitoopista kiinteälle pinnalle immobilisoi-5 tuun vasta-aineseen ja sitomalla sen toiseen epitooppiin toinen vasta-aine, johon on kytketty mittausta varten ent-symaattinen tai radioisotooppinen markkeri.

Eräs tämänkaltainen, usein sandwich-tekniikaksi sanottu menetelmä on nimenomaan esitetty patenteissa tai . 10 patenttihakemuksissa FR 2 487 983, FR 2 500 166, EP 119 736. Missään näissä dokumenteissa ei esitetä tämän tekniikan käyttöä kokonaisille soluille, vaikka sana "solu" esiintyykin niiden antigeenien luettelossa, joiden määritykseen menetelmä soveltuu.

15 Edellä mainituissa patenteissa esitettyjen esimerk kien erilaiset antigeenit ovat kaikki yksinomaan proteii-nimolekyylejä, jotka ovat liukoisia veteen ja fysiologisiin nesteisiin, kuten hormonit, entsyymit tai kiertävät kasvainmarkkerit. Päinvastoin on selvää, että solu ei ole 20 molekyyli ja eroaa siitä vähintäänkin huomattavasti suuremman kokonsa puolesta ja siksi, etteivät solut liukene fysiologisiin nesteisiin. Siispä tähän päivään saakka sandwich-tekniikkaa ei ole koskaan käytetty kokonaisiin soluihin.

,. 25 Lisäksi solujen immunosieppaus kiinteälle alustalle on esitetty WO-patenttihakemuksessa 86/02091, jolloin tarkoitus oli poistaa ei-toivotut solut transplantaatioihin tarkoitetuista luuydinnäytteistä. Tässä patenttihakemuksessa solut kiinnitettiin kelluviin mikrokantajiin, ja 30 tämän vuoksi käytetty vasta-aine piti sitoa kiinteälle alustalle monimutkaisella makromolekyylirakenteella, jota sanottiin verkosto-releeksi, vasta-aineen ja vastaavan soluantigeenin välisen oikean orientaation takaamiseksi.

Tässä hakemuksessa ei ole mainintaa menetelmän käyttöstä 35 antigeenin kvantitatiiviseen määrittämiseen.

- 95752 5 WO-patenttihakemuksessa 84/03151 on esitetty myös solujen immunosieppaus analyyttiseen tarkoitukseen. Tässä tarkoituksena oli identifioida tutkittavien solujen kudos-ryhmiä (tavallisesti menetelmää kutsutaan HLA-tyypityksek-5 si). Solut kalastetaan vasta-aineiden avulla, jotka on sidottu ja sijoiteltu erityiseen muotoon hyvin erikoiselle alustalle (mikroskooppilevyt). Tulokset saadaan levyn yksinkertaisella visuaalisella tarkastelulla, ja päädytään tulokseen "kaikki tai ei mitään". Siispä aikaisemmin esi-10 tettyjen solujen kiinnitysmenetelmien avulla ei voida analyyttisesti kvantitoida joidenkin solujen membraanien antigeenejä. Lisäksi kaikkien näiden menetelmien ongelmana voi olla spesifisyys, sillä niissä solujen tunnistus on vain yhden ainoan vasta-aineen varassa.

15 Tämän keksinnön kohteena olevalla määritysmenetel mällä on huomattavia etuja verrattuna aikaisemmin tunnettuihin ja käytettyihin menetelmiin, sillä tämän menetelmän avulla voidaan yhdellä ainoalla analyysikerralla mitata kvantitatiivisesti yhden solupopulaation kaikki antigee-20 nit. Tässä määrityksessä soluja ei käsitellä kemiallisesti tai fysikaalisesti, ja ne ovat fysiologisesti koskemattomassa tilassa. Lisäksi keksinnön mukaisella menetelmällä on hyvin suuri spesifisyys, mikä on ominaista tämänkaltaiselle immunologiselle kaksinkertaiselle tunnistussystee-.. 25 mille, jossa on kaksi erilaista, spesifistä vasta-ainetta saman solun kahta eri antigeeniä kohtaan. Tämä menetelmä on yksinkertainen, nopea ja toistettava. Se soveltuu hyvin suurien näytemäärien analysointiin, minkä takia menetelmää voidaan käyttää diagnostisiin tarkoituksiin kliinisen bio-30 logian laboratorioissa.

' Niinpä tämän keksinnön kohteena on kitti vähintään yhden, solupopulaatiolle tai niiden alaryhmille tyypillisen pinta-antigeenin immunologiseen määrittämiseen, jonka komponentteja ovat: 35 a) kiinteä kantaja, jolle on kiinnitetty kovalent- tisella sidoksella tai fysikaalisella adsorptiolla yksi - 95752 6 tai useampia monoklonaalisia vasta-aineita, jotka ovat mitattavan solupopulaation jotain muuta kun mainittua tyypillistä pinta-antigeenia vastaan, ja joiden tarkoituksena on immobilisoida kantajalle ne alaryhmän solut, joilla on 5 määritettävä antigeeni; b) vähintään yksi liuos, joka sisältää mitattavan solupopulaation tai sen alaryhmän ominaiselle antigeenille monoklonaalisen vasta-aineen, joka on leimattu radioaktiivisella tai entsymaattisella leimalla; 10 c) vasta-aineen ollessa leimattu entsyymillä, ent- syymikehite, ts. yksi tai useampia liuoksia, joka sisältää entsyymin substraattia, ja haluttaessa yhden tai useamman tarvittavan reagenssin entsyymiaktiivisuuden toteamiseen.

Tässä selityksessä ja seuraavissa vaatimuksissa 15 käytetty termi solu tarkoittaa humaani- ja eläinsoluja, alkueläimiä ja mikro-organismeja (bakteerit tai sienet). Verisolujen joukosta tämä keksintö koskee tumallisia partikkeleita, kuten leukosyyttejä, ja tumattomia partikkeleita, kuten punasoluja tai verihiutaleita.

20 Tämän keksinnön mukainen määritysmenetelmä soveltuu kokonaisille soluille, ts. ei lyysoituneille.

Soluja ei käsitellä mitenkään kemiallisesti tai fysikaalisesti, ja ne ovat määrityksessä täysin fysiologisesti koskemattomassa tilassaan. Näin voidaan taata, että ; 25 määrityksen kohteena olevat membraanimarkkerit säilyvät parhaiten ehjinä.

Kiinteänä alustana voidaan käyttää kaikkia solusus-pensioiden käsittelyyn sopivia välineitä, ja edullisesti putkia, tietynlaisia magneettisia alustoja tai kovia tai 30 pehmeitä, kuopallisia mikrotiitterilevyjä, jotka voivat ’ olla polyetyleenistä, polystyreenistä, polyvinyyliklori- dista tai nitroselluloosasta. Solujen immobilisointiin tarkoitetut monoklonaaliset vasta-aineet voidaan kiinnittää kiinteille alustoille joko kemiallisella kovalentti-35 sella sidoksella tai fysikaalisella adsorptiolla hyvin tunnettujen klassisten menetelmien mukaisesti, joita on - 95752 7 esitetty julkaisussa STOCKER ja EUSSER, J. IMMUNOL.

METHODS, 1979, voi 26, s. 87-95. Kantaja voidaan edullisesti kyllästää etukäteen proteiinilla.

Keksinnön mukaisesti kiinteälle alustalle kiinnite-5 tyn tai kiinnitettyjen monoklonaalisten vasta-aineiden avulla voidaan sitoa sellainen solupopulaatio, joka sisältää sen tai ne solupopulaatiot, joilla on mitattava antigeeni. Jos tämä populaatio koostuu humaanisoluista, ovat sitomiseen edullisimmat monoklonaaliset vasta-aineet anti-10 HLA luokan I vasta-aineita, jotka ovat spesifisiä leukosyyteissä ja useissa muissa elimistön solulinjoissa esiintyvien HLA-A,-B ja -C antigeenien yhteiselle osalle. Vasta-aineista erityisen edullinen on nimeltään I-luokan S vasta-aine, jota markkinoi BYOSIS.

15 Joissakin tapauksissa, kun tutkittavat solut ovat humaanisoluja, ja kaikissa niissä tapauksissa, kun solut eivät ole humaanisoluja, voidaan keksinnön mukaiseen im-munosieppaukseen käyttää myös tutkittaville soluille sopivia monoklonaalisia vasta-aineita.

20 Sanonnalla "radioisotooppi-leimalla leimattu monok- lonaalinen vasta-aine" tarkoitetaan monoklonaalista vasta-ainetta, johon on liitetty, joko sen luonnolliseen rakenteeseen kuuluvaan osaan, esim. oleellisiin tyrosiinijäännöksiin, tai siihen kiinnitettyyn sopivaan radikaaliin, .. 25 radioaktiivinen isotooppi, jonka radioaktiivisuuden avulla voidaan määrittää kiinnittyneen vasta-aineen määrä.

Sanonnalla "entsymaattisella leimalla leimattu mo-noklonaalinen vasta-aine" tarkoitetaan monoklonaalista vasta-ainetta, johon on liitetty entsyymi, joka yhdessä 30 sopivien reagenssien kanssa mahdollistaa tämän monoklonaa-lisen vasta-aineen kvantitatiivisen mittauksen.

Substraatti ja reagenssit valitaan niin, että entsyymin ja näiden yhdisteiden aikaansaaman reaktion tai reaktioketjun lopputuote olisi: 35 - joko värillinen tai fluoresoiva yhdiste, joka leviää soluja ympäröivään nesteeseen, ja joka on lopulli- 8 95752 sen spektrofotometrisen tai vastaavasti fluorometrisen mittauksen kohteena, - tai värillinen, liukenematon yhdiste, joka laskeutuu solujen ja niiden kiinnitysseinämien päälle, ja 5 joka voidaan mitata heijastusfotometrillä tai arvioida mahdollisesti silmällä vertaamalla sitä referenssivärei-hin.

Määrityskitti voi sisältää lisäksi pesupuskuria, jolla kiinteä kantaja pestään immobilisoinnin jälkeen, 10 sekä jälkeen, kun solut on merkitty valitulla leimalla leimatulla vasta-aineella tai -aineilla.

Määrityskitti voi lisäksi sisältää myös tarpeellisia näytteitä määrityksen kalibrointiin sekä laaduntarkkailuun.

15 Tämän keksinnön kohteena on myös menetelmä solupo pulaation tai sen alaryhmän pinta-antigeenien immunologiseen määrittämiseen, tunnettu siitä, että menetelmässä: - solupopulaatio immobilisoidaan spesifisesti tai immunosiepataan kiinteälle alustalle yhdessä vaiheessa 20 käyttämällä yhtä tai useampaa monoklonaalista vasta-ainetta, jotka on etukäteen kiinnitetty kovalenttisella sidoksella tai fysikaalisella adsorptiolla tälle alustalle, ja joka tunnistaa solujen pinnassa olevan, määritettävästä antigeenistä eroavan antigeenin, ja samanaikaisesti immo- 25 bilisoidun solupopulaation tai jonkin sen alaryhmän määritettävä pinta-antigeeni merkitään suorasti tälle määritettävälle antigeenille spesifisellä monoklonaalisella vasta-aineella, joka on leimattu radioisotoopilla tai entsyymillä; 30 - testiä inkuboidaan ajanjakso, jonka aikana immu- nosieppaus ja merkitseminen tapahtuvat samanaikaisesti; - kiinteä kantaja pestään ei-toivottujen sitoutumattomien solujen ja ylimääräisen radioisotoopilla tai entsyymillä leimatun vasta-aineen poistamiseksi; 35 - mitataan määritettävän antigeenin määrä merkitys sä solupopulaatiossa tai sen alaryhmässä joko laskemalla 9 95752 sitoutunut radioaktiivisuus tai vaihtoehtoisesti sen jälkeen, kun liuosta on käsitelty entsyymin substraatilla ja mahdollisesti yhdellä tai useammalla sopivalla lisärea-genssilla, mittaamalla fotometrisesti transmissio tai hei-5 jastus tai mittaamalla fluoresenssiemissio.

Keksinnön mukaista määrityskittiä sekä menetelmää käytetään edullisesti humaaniveren partikkelien, kuten erityisesti leukosyyttien, ja etenkin lymfosyyttien, T-lymfosyyttien, T4- ja T8-lymfosyyttien ja B-lymfosyyttien, 10 sekä granulosyyttien, monosyyttien ja verihiutaleiden pinta-antigeenien määritykseen.

Toinen edullinen käyttökohde on on patogeenisten mikro-organismien, kuten esim. Candida albicans'in pinta-antigeenien määritys.

15 Lisäksi keksinnön mukainen määrityskitti ja immuno loginen menetelmä soveltuvat hyvin kasvainsolujen, etenkin virtsateiden syöpäsolujen ja malignien hemopaattisten solujen pinta-antigeenien määrittämiseen.

Keksinnön mukaisella määrityskitillä ja menetelmäl-20 lä voidaan mitata signaaleja (radioaktiivisuutta tai valon absorptiota tai emissiota), jotka riippuvat sekä tutkittavan solupopulaation solumäärästä että mitattavan antigeenin tiheydestä solujen pinnalla. Näiden signaalien mittauksella voidaan kvantitatiivisesti määrittää solupopu-25 laation tai sen alaryhmän sisältämän rakenteellisen tai toiminnallisen antigeenin molekyylien kokonaismäärä.

Esimerkiksi hematologiassa erityisen tärkeiden leu-kosyyttimarkkereiden kohdalla tiedetään, että suurimmassa osassa terveistä tapauksista antigeenien tiheyden keskiar-30 vo ei saman solupopulaation sisällä vaihtele merkittävässä määrin näytteestä toiseen. Tarkastellun antigeenin omaa-vien solujen sytologinen laskeminen korreloi hyvin keksinnön mukaisesti mitattuun signaaliin, joka on verrannollinen tutkittavan näytteen sisältämien antigeenimolekyylien 35 kokonaismäärään. Sitävastoin joissakin patologisissa tiloissa antigeenien tiheys solun pinnalla voi vaihdella - 95752 10 saman solupopulaation sisällä ilman, että positiivisten solujen lukumäärä tai osuus vaihtelee huomattavasti. Nämä patologiset tilat havaitaan tavanomaista solulaskumenetel-mää tehokkaammin käyttämällä keksinnön mukaista immunolo-5 gista menetelmää ja kittiä.

Valitsemalla kiinteäksi kantajaksi mikrotiitterile-vy saadaan keksinnölle vielä eräs käyttösovellutus. Keksinnön mukaista kittiä ja immunologista menetelmää voidaan edullisesti käyttää tutkitun solupopulaation eri alaryh-10 mille ominaisten erilaisten pinta-antigeenien määrittämiseen yhdellä ainoalla levyllä. Tähän tarkoitukseen voidaan käyttää toisaalta käyttövalmiita mikrotiitterilevyjä, joille on kiinnitetty etukäteen yksi tai useampia monoklo-naalisia vasta-aineita, jotka kykenevät sitomaan itseensä 15 kaikki tutkittavan populaation solut, toisaalta monoklo-naalisia vasta-aineita, joihin on liitetty sopiva markke-ri ja joista jokainen on spesifinen yhdelle tutkittavien alaryhmien sisältämistä antigeeneistä. Näin yhdellä ainoalla käsittelyllä ja samalla kantajalla voidaan mitata 20 kvantitatiivisesti valittujen alaryhmien karakterisointiin tarvittavat antigeenit.

Tämänkaltainen käyttösovellutus tälle keksinnölle on kliinisbiologisesti kiinnostavien solujen antigeenisten rakenteiden karakterisointi. Eräs sovellutus on tutkitta-.. 25 van henkilön kudosryhmän määritys, jota kutsutaan taval- lisesti HLA-tyypitykseksi.

Toinen sovellutus on kasvainsolujen tyypitys, etenkin maligneissa hemopatioissa, kuten leukemioissa ja lym-foomissa. Tässä säännöllisesti tehdyssä diagnoosissa ka-30 rakterisoidaan näiden potilaan kasvainsolujen tyyppi ja alkuperä sopivasti valitun solun pinta-antigeenisarjan läsnä- tai poissaolon perusteella.

Käyttämällä keksinnön mukaista määrityskittiä, joka sisältää mikrotiitterilevyn, jolle on etukäteen kiinnitet-35 ty yksi tai useampia tutkitun solupopulaation solujen sitomiseen kykeneviä monoklonaalisia vasta-aineita, sekä 11 95752 liuoksia, jotka sisältävät erilaisia entsyymillä tai radioaktiivisella leimalla leimattuja monoklonaalisia vasta-aineita, joista jokainen on spesifinen yhdelle kasvainso-lujen antigeenille, voidaan potilaan kasvainsolupopulaa-5 tion ominaiset antigeenit identifioida ja määrittää kvantitatiivisesti, sekä luokitella ne johonkin syövän suurista ryhmistä, ja etenkin joksikin kliinisesti karakterisoiduksi maligniksi hemopatiaksi. Keksinnön mukaisen menetelmän avulla voidaan siis suorittaa nopeasti ja yhdellä ai-10 noalla kantajalla kasvainsolujen antigeenisten rakenteiden kvalitatiivinen ja kvantitatiivinen analyysi.

Toiseksi keksinnön mukaiseksi käyttösovellutukseksi voidaan mainita humaaniperäiset T-lymfosyytit, joilla on nimenomaan olemassa kaksi alaryhmää: lymfosyytit, joille 15 on ominaista CD4-markkeri, ja joita kutsutaan T4-positii-visiksi lymfosyyteiksi tai yksinkertaisesti T4-lymfosyy-teiksi, sekä lymfosyytit, joille on ominaista CD8-markke-ri, joita kutsutaan T8-positiivisiksi lymfosyyteiksi (tai T8-lymfosyyteiksi).

20 Suhteen T4/T8 numeerinen mittaus on hyvin mielen kiintoista diagnostiikan ja kliinisen biologian kannalta.

Itse asiassa on tunnettua, että suhde T4/T8 muuttuu erilaisten immuunisysteemin häiriötilojen vaikutuksesta, kuten dysimmunitaarisissa sairauksissa, kroonisissa infek-·· 25 tioissa, virusinfektioissa, ja etenkin HIV-viruksen ai- heuttamissa infektioissa (AIDS-virus).

Keksinnön mukaista määrityskittiä ja immunologista menetelmää voidaan käyttää T-lymfosyyttipopulaatiolle yleisesti ominaisten ja/tai T4- ja T8-lymfosyytti-alaryh-30 mille ominaisten antigeenien määritykseen. Tässä tapauk-.* sessa tutkittavan näytteen T-lymfosyytit immobilisoidaan spesifisesti kiinteälle alustalle, ja samanaikaisesti T4-lymfosyyttien pinta-antigeenit merkitään suoraan anti-CD4-monoklonaalisella vasta-aineella, johon on liitetty radio-35 isotooppinen tai entsymaattinen leima; samalla tavalla T8-lymfosyyttien pinta-antigeenit merkitään anti-CD8-mono- 95752 12 klonaalisella vasta-aineella, johon on liitetty sopiva leima.

T-lymfosyyttien kokonaismäärän mittaamiseen käytetään edullisesti anti-CD7-monoklonaalista vasta-ainetta 5 (nimeltään myös anti-T2), johon on liitetty sopiva leima.

Näytteen sisältämien T-lymfosyyttien spesifiseen immobilisointiin käytetään edullisesti yhtä tai useampaa monoklonaalista vasta-ainetta sellaisenaan tai seoksena, näytteen koko T-solujen tunnistamiseksi, yleisien anti-10 leukosyytti vasta-aineiden (tai anti-CD45) tapauksessa, tai kun vasta-aineet yhdessä tunnistavat T-populaation (kutsutaan "yleis T"), kuten anti-CD2- (tai anti-Tll-), anti-CD5- (tai anti-Tl-), anti-CD7- (tai anti-T2-) vasta-aineet tai muut yleis-T-vasta-aineet, joita ei vielä ole 15 luokiteltu erilaistumisluokkiin 0MS:n kriteerien mukaisesti .

Keksinnön mukaista immunologista menetelmää voidaan edullisesti käyttää T-lymfosyytti- sekä T4- ja T8-lymfo-syyttipopulaatiolle ominaisten antigeenien määritykseen 20 useassa osassa samaa kiinteää kantajaa. Radioaktiivisuuteen, valon transmissioon tai heijastumiseen tai fluoresenssiin perustuvan mittauksen avulla voidaan helposti ja suoraan määrittää suhteen CD4/CD8 numeerinen arvo.

Samalla tavalla voidaan samalla kiinteällä kanta-25 jalla määrittää T- ja B-lymfosyytti alaryhmät, jotka yh-dessä muodostavat lymfosyyttilinjan.

T-solujen jotakin pinta-antigeenia tai kaikkia pinta-antigeenejä vastaan olevien monoklonaalisten vasta-aineiden seos voidaan esimerkiksi kiinnittää adsorboimalla 30 kuoppien seinämiin. Nämä monoklonaaliset vasta-aineet im-mobilisoivat edelleen kaikki tutkittavan näytteen sisältä-mät T-solut. Näin valmistetut levyt voidaan lyofilisoida ja säilöä edullisesti 4 °C:een. Tämä vaihe voidaan toteuttaa teollisessa mittakaavassa, ja valmiita levyjä voidaan 35 siis käyttää joko T-lymfosyyttien kokonaismäärityksessä li 13 95752 tai T-lymfosyyttien alaryhmien määrityksessä käytettäviin määrityskitteihin.

Määritettäviä soluja sisältävät, verestä tai muista sopivista, normaaleista tai patogeenisistä biologisista 5 nesteistä peräisin olevat näytteet voidaan käyttää sellaisenaan tai preparoinnin, kuten tunnettujen menetelmien mukaisen tiheysgradienttisentrifugoinnin, jälkeen ja erityisesti hyvin tiheässä liuoksessa, kuten Pharmacian kaupallinen FICOLL-PAQUE. Veren lymfosyyttien määrittämiseksi 10 tutkittava verinäyte voidaan käsitellä myös lyysipuskuril-la, joka hajottaa punasolut.

Sopivat näytteet solususpensiosta saatetaan kiinteän kantajan kanssa kosketuksiin esimerkiksi etukäteen valmistetun mikrotiitterilevyn kuopissa, samanaikaisesti 15 määrityskitin sisältämän, tarkoitetulle solupopulaatiolle spesifistä monoklonaalista vasta-ainetta sisältävän liuoksen kanssa, jossa monoklonaalinen vasta-aine on leimattu sopivalla leimalla, esim. radio-isotoopilla tai entsyymillä. Niinpä radio-isotooppinen leima voidaan valmistaa 20 esim. leimaamalla monoklonaalinen vasta-aine jodi-125:llä tai jodi-131:llä, esimerkiksi kloramiini T:n läsnäollessa tunnetun menetelmän mukaisesti (F.C. GREENWOOD, W.M.HUNTER ja Coll, Biochem. J., 1963, 89, 114); tai entsymaattinen leima voidaan valmistaa konjugoimalla monoklonaalinen vas-25 ta-aine entsyymiin, kuten alkaliseen fosfataasiin, perok-sidaasiin, beeta-galaktosidaasiin tai asetyylikoliinieste-raasiin, tunnettujen menetelmien mukaisesti (katso esim.

M. O'SULLIVAN Methods in Enzymology 1981, 73, 147) tai jonkin niistä muunnetun menetelmän mukaisesti. Joissakin 30 tapauksissa, jotta vältyttäisiin radioaktiivisten yhdisteiden käsittelyyn liittyviltä haitoilta sekä näiden rea- » genssien rajoitettuun säilyvyysaikaan liittyviltä epäkohdilta, käytetään edullisesti mielummin entsyymejä kuin radio-isotooppileimoj a.

35 Inkubointiaika, ts. solujen immobilisointiin ja samanaikaiseen merkitsemiseen tarvittava aika on edulli- ,. 95752 14 sesti korkeintaan yksi tunti. Tänä aikana kiinteä kantaja voidaan mahdollisesti sentrifugoida solujen immobilisortumisen edistämiseksi. Kiinteä kantaja, esim. mikrotiitteri-levy pestään tämän jälkeen sekä kiinnittymättömien solujen 5 sekä ylimääräisen entsyymillä tai radio-isotoopilla leimatun monoklonaalisen vasta-aineen poistamiseksi.

Käytettäessä radio-isotooppista leimaa, kuten esim. jodi-125:ttä, soluihin kiinnittynyt radioaktiivisuus mitataan gammalaskurilla sopivalla tavalla ja esimerkiksi 10 liuottamalla solut ensin emäksiseen liuokseen (esim.

NaOH:iin) ja keräämällä radioaktiivinen liuos absorboivan puskurin avulla.

Kun monoklonaalinen vasta-aine leimataan entsymaattisesti, muodostetaan värillinen tai fluoresoiva yhdiste 15 lisäämällä kiinteälle kantajalle, jolle on kiinnitetty mitattavaa antigeeniä sisältävä solupopulaatio, entsyymin substraattia sisältävää liuosta sekä lisäksi yhtä tai useampaa reagenssia, joiden avulla saadaan lopulta reaktiotuotteeksi joko liukoinen tai liukenematon värillinen 20 yhdiste tai liukoinen fluoresoiva yhdiste, kuten edellä on esitetty. Näin käsitellyistä näytteistä mitataan tämän jälkeen valosignaali jokaiseen tapaukseen sopivalla laitteistolla: transmissio- tai heijastusfotometrilla tai vastaavasti fluorometrilla. Jos kiinteä kantaja on mikrotiit-25 terilevy, voidaan valosignaalit lukea järjestyksessä saman levyn kaikista kuopista käyttämällä tavallisesti biologisissa laboratorioissa käytettyjä automaattisia levyluki-joita, kuten esim. Titertek- tai Fluoroscan-levylukijoita, vastaavasti spektrofotometriseen tai fluorometriseen mit-30 taukseen.

Kun entsymaattisena leimana käytetään alkalista « fosfataasia, kytketään tämä entsyymi monoklonaaliseen vasta-aineeseen Boehringer Mannheim Biochemican esittämän menetelmän mukaisesti. Tämän entsyymin edullisia sub-35 straatteja ovat para-nitrofenyylifosfaatti spektrofotomet- rista mittausta varten tai 4-metyyliumbelliferyylifosfaat- li 15 95752 ti fluorometrista mittausta varten tai 5-bromi-4-kloori- 3-indolyylifosfaatti liukenemattoman värillisen yhdisteen saamiseksi. Entsymaattisena leimana voidaan käyttää myös beeta-galaktosidaasia, jonka edulliset substraatit ovat 5 orto-nitrofenyyli-beeta-D-galaktopyranosidi tai 4-metyy- liumbelliferyyli-beeta-D-galaktopyranosidi.

Monoklonaaliset vasta-aineet voidaan edullisesti kytkeä peroksidaasiin. Tässä tapauksessa kytkemismenetelmä on muunnelma M.B. WILSONin ja P.K. NAKANEn julkaisussa 10 Immunofluorescence and Related Staining Techniques, W.

Knapp, K. Kolubar, G. Wicks, toim. Elsevier/North Holland. Amsterdam, 1978, s. 215-224, esittämästä menetelmästä. Entsyymikonjugaatin valmistuksessa käytetyt modifikaatiot verrattuna alkuperäiseen menetelmään ovat seuraavat: 15 - peroksidaasi/vasta-aineen molaarinen suhde on 3, kun menetelmässä se oli 2, - peroksidaasin aiheuttama hiilihydraattiosien vähemmän tehokas hapettuminen vähentämällä natriumperjodaa-tin ehdotettua pitoisuutta 33 prosentilla.

20 Monoklonaalisiin vasta-aineisiin kytketyn peroksi daasin aktiivisuuden määritykseen käytetyt reagenssit sisältävät hapetettua vettä, entsyymin substraattia ja sopivaa kromogeenia, esimerkiksi orto-fenyleenidiamiinia tai 2,2'-atsino-bis-(3-etyylibentsoatsoliini-6-sulfoni)happoa 25 tai ABTS:a värillisen ja ympäristöön liukoisen reaktio-tuotteen saamiseksi, tai 3,3'-diaminobentsidiiniä tai 3-amino-9-etyylikarbatsolia tai 4-kloori-alfa-naftolia liukenemattoman reaktiotuotteen saaamiseksi, tai para-hydrok-sifenyylipropionihappoa fluoresoivan ja ympäristöön liu-30 koisen reaktiotuotteen saamiseksi.

Keksinnön mukainen kitti T-, T4- ja T8-lymfosyy- * teille ominaisten antigeenien määrittämiseksi sisältää edullisesti: a) mikrotiitterilevyn, jonka kuoppiin on kiinnitet-35 ty yksi tai useampia anti-T-lymfosyytti-monoklonaalisia vasta-aineita.

lfi 95752 lb bl) liuosta, joka sisältää vähintään yhden anti-T-lymfosyytti-monoklonaalisen vasta-aineen, joka on leimattu peroksidaasilla.

b2) liuosta, joka sisältää vähintään yhden anti-5 CD4-antigeeni-monoklonaalisen vasta-aineen, joka on lei mattu peroksidaasilla.

b3) liuosta, joka sisältää vähintään yhden anti-CD8-antigeeni-monoklonaalisen vasta-aineen, joka on leimattu peroksidaasilla.

10 cl) liuosta, joka sisältää hapetettua vettä ja ent syymin substraattia, sopivassa puskurissa.

c2) liuosta, joka sisältää entsyymiaktiivisuuden ekspressoitumisen toteamiseen käytettyä kromogeenia.

Toinen edullinen keksinnön toteuttamistapa on käyt-15 tää asetyylikoliiniesteraasiin kytkettyjä monoklonaalisia vasta-aineita.

Asetyylikoliiniesteraasi kytketään vasta-aineeseen edullisesti FR-patenttihakemuksessa no. 2 550 799 esitetyn menetelmän muunnelman mukaisesti tai menetelmällä, jossa 20 valmistetaan tunnetulla tavalla vasta-ainefragmentteja, entsyymi modifioidaan sopivan heterobifunktionaalisen yhdisteen avulla ja lopulta kytketään näin saadut tuotteet.

Tässä tapauksessa voidaan käyttää myös muita tunnettuja menetelmiä immunoentsymaattisten konjugaattien valmistuk-25 seen.

Asetyylikoliiniesteraasikonjugaatilla havaittu so-luantigeeniin spesifisesti sitoutunut entsyymiaktiivisuus määritetään edullisesti yleisesti tunnetulla menetelmällä, jossa entsyymin substraattina käytetään asetyylitiokolii-30 nia ja kromogeenina Ellmannin reagenssia tai 5,5'-ditio- 2-nitrobentsoehappoa, tutkittavaan tapaukseen soveltuval- la, esimerkiksi Pradellesin et ai.'n julkaisussa Anal.

Chem. 57 (1985) 1170-1173 esittämällä menetelmällä.

Mainittuja kromogeeneja voidaan käyttää sellaise-35 naan tai vesiliukoisina suoloina.

17 95752

Keksinnön mukaisten antigeenimääritysten tulokset voidaan ilmoittaa kaikilla suoritetulle määritykselle soveltuvilla tavoilla. Yksityiskohtaisemmin tulokset voidaan ilmoittaa joko tutkittavan näytteen määrätyn tilavuuden 5 sisältämän tiettyjen antigeenimolekyylien (esim. CD4-anti-geenin) kokonaismääränä, tai tutkittavan näytteen sisältämän erään antigeenin molekyylien määrän ja saman näytteen jonkin toisen antigeenin molekyylien määrän suhteena (esim. CD4- antigeenien ja CD8-antigeenien suhteena tai 10 suhteena CD4/CD8 tutkittavassa verinäytteessä).

Määritettäessä tietyn antigeenin molekyylimäärää tutkittavasta näytteestä käytetään edullisesti standardi-kuvaajaa, joka on muodostettu määritettävää antigeeniä sisältävistä soluista tai sopivista solupreparaateista, ja 15 joka on etukäteen kalibroitu tunnetulla referenssimenetelmällä. Nämä standardit ovat edullisesti joko määritettävän näytteen solujen kanssa alkuperältään samanlaisia soluja tai tutkittavaa antigeeniä sisältävien solulinjo-jen soluja tai näiden solujen preparaatteja, esim. memb-20 raaneja.

Nämä standardit käsitellään samalla tavalla kuin tutkittavat näytteet. Niiden antamien signaalien avulla laaditaan standardikuvaaja, johon tutkittavien näytteiden antamia signaaleja verrataan. Muut laskutoimitukset ovat 25 tavanomaisia.

Tutkittavan näytteen sisältämien kahden antigeenin molekyylimäärän suhteen määrittämiseen voidaan käyttää edellä esitettyä standardimenetelmää ja laskea lopuksi haluttu suhde. Useissa tapauksissa on yksinkertaisempaa 30 laskea suoraan jokaisen antigeenin antama spesifinen sig-, naali, korjata se haluttaessa tunnetuilla kertoimilla, kuten tutkittavien näytteiden dimensioiden suhteella, ja saadaan suoraan haluttu suhde.

Keksinnön mukainen immunologinen määritysmenetelmä 35 on yksinkertainen, nopea ja toistettava. Edullisesti mää- 18 95752 ritykseen kuuluva kokonaisaika on enintään yksi tunti.

Sitä voidaan helposti käyttää suurien näytemäärien analysoimiseen. Sen etujen ymmärtämiseksi verrattuna muihin esitettyihin menetelmiin, se soveltuu useiden vaiheiden 5 analysoimiseen.

Solujen immobilisointi kiinteälle kantajalle on tavallisesti määritysmenetelmän kaikkein hankalin tai vaikeimmin toteutettava vaihe. Tavallisesti käytetty keino on solujen kemiallinen kiinnitys glutaraldehydin tai meta-10 nolin avulla käsittelemättömiin tai poly-L-lysiinillä käsiteltyihin kuoppiin (VAN LEUVEN F. et ai., J. Immunol. Methods, 1978, 23, 109). Kuitenkin nämä kemialliset kiinnitykset voivat vähentää tai jopa estää halutun spesifisen määrityksen tai päinvastoin lisätä vääriä positiivisia 15 tuloksia, mikä on erittäin vakava haittapuoli (DROVER ja MARSHALL J. Immunol. Methods, 1986, 90, 275-281).

Lisäksi kemiallinen kiinnitys vaatii useampia vaiheita: solujen sentrifugoinnin, kiinnitysseoksen valmistuksen, kiinnityksen sekä kiinnitettyjen solujen pesun.

20 Solujeh kuivaamista 37 °C:ssa sekä mahdollista kuop piin kiinnitystä metanolin avulla on myös ehdotettu (BAUM-GARTEN, J. Immunol. Methods, 1986, 94, 91-98). Itse asiassa solujen kuivaaminen 37 °C:ssa voi aiheuttaa muutoksia joissakin herkissä antigeeneissä sekä lisäksi tehdä peri-25 sellulaarisen plasmamembraanin läpäiseväksi, mikä helpot-taa intrasytoplasmisten antigeenien immunomerkkausta pinta-antigeenien merkkauksen lisäksi, mikä johtaa näin häiritsevään taustakohinaan tai vääriin positiivisiin tuloksiin, joten halutaan vain pinta-antigeeneihin rajoittuvaa 30 määritystä.

, Lisäksi menetelmän toistettavuus on epävarmaa; itse c asiassa solujen dekantointi levyn kuoppiin ja solujen kuivaus voivat vaihdella kokeesta toiseen. Lopuksi tämä määritys on pitkä, sillä yksin solujen kuivaus vaatii vähin-35 tään kaksi tuntia.

19 95752

Lymfosyyttipopulaatioita on myös onnistuttu immobi-lisoimaan kuoppiin adsorboitujen polyklonaalisten vasta-aineiden avulla (STOCKER ja HEUSSER J. Immunol. Methods, 1979, 26, 87-95). Sen lisäksi, että immobilisoidaan vie-5 raita soluja ainoan analysoitavan populaation lisäksi, polyklonaaliset vasta-aineet ovat hankalia siksi, että ne voivat reagoida niiden antigeenien kanssa, jotka on tarkoitus mitata merkityllä vasta-aineella, mikä pienentää lisäksi lopullista mitattavaa signaalia.

10 Adsorboitaessa tai kiinnitettäessä hyvin spesifisiä ja affiineja monoklonaalisia vasta-aineita kiinteälle alustalle ja etenkin kuoppiin, voidaan siepata vain halutut solut, muiden kiinnittymättömien solupopulaatioiden poistuessa määritettävän antigeenin merkitsemisvaiheen 15 jälkeen suoritettujen pesujen aikana.

Lisäksi antigeenien ominaisuudet eivät muutu tämän vaiheen aikana minkään kemiallisen tai fysikaalisen tekijän vaikutuksesta, sillä solujen kiinnittämiseen ei käytetä kemiallisia tai fysikaalisia menetelmiä.

20 Siten tämän keksinnön mukaisesti on todettu, että solujen immobilisointi monoklonaalisten vasta-aineiden avulla tekee määritettävä antigeeniä sisältävien solujen immobilisointivaiheen yksinkertaisemmaksi sekä tuloksista luotettavampia.

. 25 Näiden solupopulaatioiden immunologinen määritys toteutetaan tavallisesti merkitsemällä solut tavallisesti kahdessa tai kolmessa peräkkäisessä vaiheessa tapahtuvalla epäsuoralla menetelmällä, jossa spesifisen signaalin sisältämä leima kiinnitetään soluihin viimeisen merkitsemis-30 vaiheen aikana. Käytettäessä kaksivaiheista menetelmää ** solujen merkitsemiseen, pääasiallisesti käytetyt reagens- • · sit sisältävät anti-immunoglobuliini vasta-aineita (anti-Ig), jotka on leimattu beeta-galaktosidaasilla (COBBOLD et ai. J. Immunol. Methods, 1971, 44, 125-133) tai alkali- 35 sella fosfataasilla (HESSIAN J. Immunol. Methods, 1986, 20 95752 91, 29-34) tai jodi-125:llä (SAVION J. Inununol. Methods, 1987, 97, 49-56). Peroksidaasi-anti-peroksidaasi-reagens-sin merkitseminen on kolmivaiheinen menetelmä (VAN LEUVEN 1978).

5 Myös eräässä toisessa kolmivaiheisessa menetelmässä käytetään analysoitavalle antigeenimarkkerille spesifistä monoklonaalista vasta-ainetta, minkä jälkeen biotiini-lei-mattuja anti-hiiri-Ig-vasta-aineita ja lopuksi streptavi-diini-peroksidaasikonjugaattia (BAUMGARTEN, 1986) tai 10 streptavidiini-alkalinen fosfataasi-konjugaattia (IGIET- SEME et ai. J. Immunol. Methods, 1987, 97, 123-131).

Keksinnön mukaisessa menetelmässä kokonaiset solut immunosiepataan ilman mitään soluihin kohdistuvaa fysikaalista tai kemiallista käsittelyä yhdessä vaiheessa sa-15 manaikaisesti, kun osa tai kaikki solut merkitään yhdellä tai useammalla monoklonaalisella vasta-aineella, johon on liitetty suoraan radio-isotooppi tai entsymaattinen leima, minkä avulla voidaan soluista itsestään ensimmäistä kertaa määrittää kvantitatiivisesti valittu membraani-antigeeni.

20 Keksinnön mukaisesti immunologisesti immobi li soitu jen solujen suora merkitseminen: - yksinkertaistaa määritysmenetelmää vähentämällä toisiaan seuraavia merkkausvaiheiden välivaiheita epäsuorassa merkkauksessa: solujen sentrifugointeja, merkkaus-; 25 reagenssien poistamisia, suspendoimisia; - pienentää reagenssien kulutusta; - parantaa luotettavuutta vähentämällä manipulointi vaiheiden määrää; - säästää aikaa; 30 - mahdollistaa materiaalien vähäisellä käytöllä ja tavanomaisen laitteiston avulla suurien näytemäärien samanaikaisen käsittelyn.

Solupopulaation immobilisointiin ja samanaikaiseen määritettävien solujen alaryhmien antigeenien suoraan mer-35 kitsemiseen tarvittava inkubointiaika on lyhyt. Se on kor- • 95752 21 kelntaan yksi tunti määritettäessä T-lymfosyyttejä ja T4-ja T8-lymfosyyttien alaryhmiä.

Kiinteän kantajan pesun jälkeen edellä esitetty määritys suoritetaan mittaamalla tarkka ja yksinkertainen 5 signaali tavanomaisella laitteistolla: radioaktiivisuus, valon absorptio tai emissio.

Keksinnön mukaisella menetelmäkokonaisuudella on siis useita etuja: se on nopea, luotettava, taloudellinen ja yksinkertainen.

10 Keksinnön mukaisella menetelmällä voidaan määrittää pinta-antigeenit solupopulaatioista, joiden solupitoisuu-det voivat vaihdella suuresti.

Menetelmän herkkyys solumäärää kohden riippuu määritettävän solupopulaation antigeenitiheydestä. Haluttaes-15 sa voidaan jokaiselle antigeenille määrittää se antigeenin minimipitoisuus mooleina, joka keksinnön mukaisella menetelmällä pystytään määrittämään.

Siispä jos kiinteä kantaja on esimerkiksi mikro-tiitterilevy, ja määritettävät solut ovat humaanilymfo-20 syyttejä, on todettu, että määritys on merkitsevä, kun analysoitavien solujen määrä on muutaman sadan ja noin 200 000 solun välillä 200 mikrolitran tilavuudessa yhdessä kuopassa; lisärajoituksensa asettavat kuitenkin mitattavan antigeenin tiheys tutkittavien solujen pinnalla sekä vali-. 25 tun detektiontimenetelmän herkkyys, joten siis rajoitukset riippuvat pääasiassa kuitenkin kiinteän kantajan mitoista ja muodosta. Samoin on asia, kun kiinteä kantaja on putkimainen.

On todistettu, että rekisteröityjen signaalien 30 avulla (radioaktiivinen tai fotometrinen mittaus) voidaan ·· muodostaa säännöllisiä ja hyväksyttäviä standardikuvaajia « · tutkitun solumäärän funktiona tavanomaisissa käsittelyolosuhteissa .

Lisäksi menetelmän herkkyyttä voidaan tarvittaessa 35 parantaa kiinnittämällä samaan pinta-antigeeniin samanai- 22 95752 kaisesti useita erilaisia monoklonaalisia vasta-aineita, jotka ovat spesifisiä saman antigeenin useille eri epitoo-peille. Tämä on todistettu määrittämällä Ichikawa-solulin-jan (humaani-T-linja) CD4-antigeenit, jossa käytettiin 5 samanaikaisesti jodi-125:llä leimattuja 0KT4- ja ST4-vas-ta-aineita. Mitattava signaali vahvistui noin 50-prosent-tisesti verrattuna signaaliin, joka saatiin kun jokaista anti-CD4 vasta-ainetta käytettiin yksinään.

Seuraavissa esimerkeissä käytetään ilman, että toi-10 sin mainitaan seuraavia termejä tai niiden lyhenteitä: BSA : naudan seerumin albumiini PBS : fosfaattipuskuroitu fysiologi nen suolaliuos pH 7,4 POD : peroksidaasi

15 IgG : immunoglobuliini G

IgM : immunoglobuliini M

anti-T-IgG tai anti-T : anti-T-lymfosyyttivasta-aine anti-CD4-IgG tai anti-CD4: anti-CD4-antigeenivasta-aine anti-CD8-IgG tai anti-CD8: anti-CD8-antigeenivasta-aine 20 cpm : sykäystä minuutissa dpm : hajoamista minuutissa

Esimerkki 1 CD4- ja CD8-antigeenien molekulaaristen pitoisuuksien immunoentsymaattinen määritys humaaniverestä perok-; 25 sidaasiin konjugoidun vasta-aineen avulla.

A) Määrityskitin valmistus a) Levyn valmistus Käytetään NUNCin (Referenssi 64394) 96 kuopan muovista mikrotiitterilevyä. Kuoppiin pipetoidaan 200 pl:aa 30 liuosta, joka sisältää puhdistettua anti-CD2-monoklonaa-lista vasta-ainetta (nimitetään ST 11), jota käytetään kaikkien T-lymfosyyttien immobilisoimiseen, ts. niiden immunosieppaukseen. Tätä BI0SYS, Compiegne, France, referenssi ST 11, markkinoimaa vasta-ainetta käytetään pitoi-35 suutena 10 pg/ml PBSissä pH 7,4.

23 95752

Monoklonaalinen vasta-aine adsorboidaan 4 °C:n lämpötilassa 12 tunnin aikana. Ylimääräinen vasta-aine poistetaan kääntelemällä levyä.

Valmistetaan liuos, joka sisältää 0,1 prosenttia 5 gelatiinia ja 0,5 prosenttia BSA:ta PBS:ssä. 250 μΐ tätä puskuria pipetoidaan kuoppiin, ja pidetään siellä 1 tunnin ajan 37 °C:ssa, mikä kyllästää kuoppien pinnan proteiinilla; levy pestään 3 kertaa PBS:llä. Näin valmistetut levyt kylmäkuivataan ja säilötään 4 °C:ssa sinetöidyissä 10 muovipusseissa.

b) Peroksidaasikonjugoidun vasta-aineliuoksen valmistus Käytetään Boehringer Mannheim Biochemican (referenssi 814 393) valmistamaa peroksidaasia (POD).

15 Vasta-aineen ja peroksidaasin väliseen kytkentään käytetään menetelmää, joka on esitetty julkaisussa M.B.

WILSON ja P.K. NAKANE, Immunofluorescence and Related Techniques (W. KNAPP, K. KOLUBAR, G. WICK toim., 1978,

Elsevier/North Holland, Amsterdam - s 215-224), sillä 20 poikkeuksella, että peroksidaasihapetuksessa käytetään 1,5 mg POD:ia 0,36 ml:ssa tislattua vettä, sekä lisätään 50 mikrolitraa 0,2 M natriumperjodaattiliuosta. Näin saatu tuote kytketään 2 mg:aan anti-CD4-IgG:tä, joka on 500 mik-rolitrassa karbonaattipuskuria. Natriumborohydridikäsitte-25 lyn sekä PBS:ää vastaan dialysoimisen jälkeen IgG-POD-kon-jugaatti steriilisuodatetaan 0,22 pm:n membraanin läpi lasiputkeen steriileissä olosuhteissa IgG-pitoisuudessa 0,5 mg/ml 4 °C:ssa. Reagenssi pysyy stabiilina vähintään vuoden ajan.

30 Anti-CD8-P0D-konjugaatti valmistetaan samalla ta valla. Samalla tavalla voidaan valmistaa myös IgM-POD-kon-jugaatteja.

c) Totamisreagenssin valmistus

Toteamisreagenssi saadaan seuraavalla tavalla: 35 Valmistetaan 0,1 M sitraattipuskuri liuottamalla sitruunahapon monohydraattia veteen pitoisuudeksi 2,1 % 24 95752 ja säätämällä pH arvoon 5 lisäämällä 7N NaOH:ia. Tämän jälkeen lisätään 30 mg ortofenyleeniamiinin dikloorihyd-raattia 20 ml:aan valmistettua sitraattipuskuria, minkä jälkeen viime hetkellä lisätään 40 mikrolitraa hapetettua 5 vettä (entsyymin substraatti) 30-prosenttisena 20 ml:aa kohden ortofenyleeniamiinia sisältävää sitraattipuskuria.

B) Immunologinen menetelmä a) Solujen erotus

Otetaan 2 ml tutkittavaa verinäytettä. Sekoitetaan 10 se 2 ml:aan PBS-puskuria, ja saostetaan se 3 ml:11a FI-COLL-PAQUEta (Pharmacian markkinoima). Näytettä sentrifu-goidaan nopeudella 400 x g 30 min ajan vallitsevassa lämpötilassa, jolloin muodostunut suspensiorengas sisältää mononukleaariset solut. Tämä suspensio, tilavuudeltaan 15 1 ml, otetaan talteen ja suspensiosta liuos jaetaan 6 x 100 μΐ kuuteen kuoppaan aikaisemmin valmistetulle levylle.

b) Solujen inkubointi

Edellä valmistettu POD-vasta-ainekonjugaatti laimennetaan 1:100 PBS:llä, joka sisältää 1 prosenttia pro-20 teiinia, kuten BSA:ta tai maitojauhetta, ja 100 mikrolitraa tätä liuosta pipetoidaan kuoppiin, ts.: - 2 kuoppaa täytetään 100 μΐ:11a/kuoppa POD-anti-CD4 konjugaattia.

- 2 kuoppaa täytetään 100 μΐ:lla/kuoppa POD-anti- 25 CD8 konjugaattia.

- 2 kuoppaa täytetään 100 μΐ:lla/kuoppa 1-prosent-tista proteiiniliuosta (reaktioblankko)

Solujen kantajaan kiinnitymisen edistämiseksi levyä sentrifugoidaan 3 minuuttia nopeudella 150 x g sen jäl-30 keen, kun levy on seissyt vallitsevassa lämpötilassa tunnin ajan.

c) Kiinnitetyn entsyymin toteaminen ja mittaus

Kuopat tyhjennetään kääntämällä levy. Kuopat pestään 4 kertaa 200 μ:11a PBS:ää. Jokaiseen kuoppaan pipe- 35 toidaan 200 μΐ vastavalmistettua toteamisreagenssia. Levyä inkuboidaan 20 min vallitsevassa lämpötilassa valolta suo-

It 25 95752 jattuna. Optinen tiheys mitataan spektrofotometrillä 492 nm:n aallonpituudella (Titertek Multiskan, tyyppi 310 C - Flow Laboratories).

d) Tulosten standardoiminen ja ilmaiseminen.

5 Näiden kokeiden standardoimiseksi käytetään etukä teen CD4- ja CD8-antigeeneille PONCELETin et ai. (J. Immunol. Methods 1985, 85, 65-74) sytofluorometrisellä menetelmällä kalibroituja humaani totaalilymfosyyttejä. Tämän referenssivalmisteen näytteiden avulla määritettiin 2 10 standardikuvaajaa CD4- ja CD8-antigeeneille, joiden avulla laskettiin jokaisen näytteen vastaava antigeenipitoisuus.

Seuraavassa taulukossa 1 on esitetty 20 verenluovuttajan verinäytteistä määritetyt optiset tiheydet, CD4-sekä CD8-antigeenien molekyylimäärät, sekä näiden anti-15 geenien määrien suhde (CD4/CD8).

\ • > « · 26 95752 TAULUKKO 1 CD4 -antigeeni CD6-antigeeni - CD4/CD8 luovuttajan Antigeeni- Antigeeni- molaa- numero molekyylien molekyylien lukumäärä lukumäärä rinen

Optinen (miljoonina Optinen (miljoonina tiheys pl:ssa verta) tiheys jxL:ssa verta) suhde : 1 : 0,64 : 23 : 1,29 : 92 : 0,25 : : 2 : 0,71 : 27 : 0,75 : 37 : 0,73 : : 3 : 0,82 : 32 : 1,10 : 81 : 0,39 : : 4 : 0,49 : 17 : 0,55 : 23 : 0,74 : : 5 : 0,74 : .29 0,89 : 52 : 0,56 : : 6 : 0,88 : 38 : 0,92 : 55 : 0,69 : : 7 : 0,74 : 29 : 0,72 : 36 : 0,80 : : 8 : 0,75 : 29 : 0,69 : 33 : 0,88 : : 9 : 0,48 : 16 : 0,80 : 41 : 0,39 : : 10 : 1,00 : 50 : 1,08 : 80 s 0,62 : : 11 : 0,61 : 22 : 0,69 : 33 : 0,67 : 12 : 0,73. : 28 : 0,85 : 46 : 0,61 : : 13 : 0,51 : 18 : 0,66 : 30 : 0,60 : : 14 : 0,65 : 24 : 1,06 : 76 : 0,31 : : 15 : 0,92 : 42 : 0,87 : 48 : 0,87 : : 16 : 0,77 : 31 : 0,98 : 63 : 0,49 : : 17 : 0,68 : 25 : 1,01 : 67 : 0,37 : ” : 18 : 0,85 : 36 : 0,96 : 61 : 0,59 : : 19 : 0,91 : 41 : 0,90 : 52 : 0,79 : : 20 : 1,00 : 50 : 1,02 : 69 : 0,72 : 27 95752

Esimerkki 2 CD4- ja CD8-antigeenien molekulaaristen pitoisuuksien immunoentsymaattinen määritys humaaniverestä alkali-seen fosfataasiin konjugoidun vasta-aineen avulla.

5 Määritys suoritetaan esimerkin 1 mukaisesti. Mono- klonaalisen vasta-aineen ja alkalisen fosfataasin konju-gaatti valmistetaan Boehringer Mannheim - Biochemican (Ref. 567 744) ohjeen mukaisesti. Määritettäviä soluja ja konjugaattia inkuboidaan 1 tunti, minkä jälkeen kiinnitelo tyn entsyymin aktiivisuus todetaan lisäämällä liuosta, jossa on 1 mg/ml paranitrofenyylifosfaattia puskurissa, jossa on 1,2 % dietanolamiinia tislatussa vedessä ja jonka pH on säädetty arvoon 9,8 laimealla suolahapolla. Kahden tunnin jälkeen 37 °C:ssa optinen tiheys mitataan spektrofo-15 tometrillä 405 nm:n aallonpituudella.

Tulokset lasketaan ja ilmoitetaan samalla tavalla kuin esimerkissä 1.

Esimerkki 3 CD4- ja CD8-antigeenien molekulaaristen pitoisuuk-20 sien immunoentsymaattinen määritys humaaniverestä jodi-125:een konjugoidun vasta-aineen avulla.

Jodi-125:llä leimattu vasta-aine valmistetaan kuten on esitetty julkaisussa F.C. Greenwood, V.M. Hunter et ai., Biochem. J., 1963, 89, 114.

• 25 50 pg anti-CD4- tai anti-CD8-monoklonaalista vasta- ainetta 50 pl:ssa fosfaattipuskuroitua fysiologista suolaliuosta pH 7,2 sekoitetaan 37 MBq:n kanssa natriumsuolan muodossa olevaa jodi-125:llä, ja seokseen lisätään vielä 30 μΐ T-kloramiiniliuosta, jossa on 0,33 mg T-kloramiinia 30 millilitrassa PBS-puskuria. 1 minuutin sekoituksen jälkeen monoklonaalisen vasta-aineen leimautumisreaktio pysäyte- < · » tään lisäämällä 100 μΐ natriummetabisulfiittiliuosta 2,5 mg/ml annoksena. Näin valmistettu liuos ajetaan PD-10 pylvään läpi (Pharmacia - Sephadex G25M), ja eluoimalla 35 saadaan fraktio, joka sisältää radioleimatun vasta-aineen. Määrityksessä pipetoidaan neljään kuoppaan 100 μΐ esimer- 28 95752 kin 1 mukaisesti valmistettua solususpensiota, joka sisältää humaaniveren mononukleaalisia soluja. Tämän jälkeen pipetoidaan 100 μΐ radioaktiivisen vasta-aineen laimennosta 5 % BSA:ta sisältävässä PBS-puskurissa, niin, että jo-5 kaiseen kuoppaan tulee 150 000 cpm; kahteen kuoppaan pi petoidaan kumpaankin 100 μΐ anti-CD4-I-125-konjugaattia, ja kahteen kuoppaan kumpaankin 100 μΐ anti-CD8-I-125-kon-jugaattia. Solujen kiinnittymistä edistetään sentrifugoi-malla levyä 3 min ajan nopeudella 150 x g, sen jälkeen kun 10 levyä on inkuboitu tunnin ajan vallitsevassa lämpötilassa.

Kuopat tyhjennetään kääntämällä levy. Kuopat pestään 4 kertaa 200 pl:lla PBS:ää/kuoppa. Tämän jälkeen jokaiseen kuoppaan pipetoidaan 75 μΐ IM NaOH:ia. 10 min jälkeen jokaisen kuopan sisältö kerätään absorboivaan puskuriin, ja 15 radioaktiivisuus mitataan gammalaskurilla (LKB:n multi- kuoppalaskuri).

Tulokset lasketaan ja ilmoitetaan esimerkin 1 mukaisesti, mutta optiset tiheydet korvataan laskurin tuloksilla dpm-yksikköinä.

20 Esimerkki 4

Menetelmän pätevyyden todistus.

20 humaaniverinäytteestä määritettiin humaani T-solujen CD4- ja CD8-antigeenit esimerkissä 1 esitetyllä peroksidaasi-immunologisella menetelmällä. Samoista veri- • 25 näytteistä määritettiin lisäksi T4-positiivisten ja T8- • < positiivisten solujen lukumäärien suhde sytologisesti laskemalla käyttämällä tavanomaista tekniikkaa (W.W. ERBER et coll. Lancet, 1984, (8385), 1042-1045.

Immunoentsymaattisesti määritetyn CD4/CD8-suhteen 30 ja sytologisesti laskemalla saadun T4/T8-suhteen korrelaa-tiokerroin on r=0,72.

« ·

Lisäksi seitsemästä muusta humaaniverinäytteestä verrattiin tämän keksinnön mukaisella immunoradiometrisel-lä menetelmällä ja jodi-125-leimalla saatua CD4/CD8-suh-35 detta sytologisesti laskemalla saatuun T4/T8-solujen suhteeseen. Korrelaatiokerroin on r=0,87.

95752 29

Kahdessa tapauksessa saadut korrelaatiokertoimet osoittavat, että huolimatta näillä kahdella menetelmällä saatujen tulosten välisestä tyydyttävästä yhdenmukaisuudesta, ei näiden kahden suhteen antama informaatio ole 5 samanarvoinen, mikä onkin ilmeistä, sillä tämän keksinnön mukainen antigeenien määritysmenetelmä ottaa huomioon ei ainoastaan positiivisten solujen määrän, jonka sytologinen menetelmä määrittää, vaan vielä lisäksi kyseisen antigee-nitiheyden jokaisen näytteen sisältämien positiivisten 10 solujen pinnalla. Tämän keksinnön mukaisella menetelmällä saatava informaatio on siis huomattavasti täydellisempi kuin tavanomaisen referenssimenetelmän antama informaatio (W.W. ERBER et ai. Lancet, 1984, (8385), 1042-1045).

Esimerkki 5 15 T-lymfosyyttien CD4- ja CD8-antigeenien molekulaa- risten pitoisuuksien immunoentsymaattinen määritys humaani verestä peroksidaasiin konjugoidun vasta-aineen avulla.

Tämän esimerkin tarkoituksena on osoittaa että määritykseen kuluvaa aikaa voidaan lyhentää verrattuna esi-20 merkissä 1 esitettyihin olosuhteisiin, modifioimalla toisaalta solujen erotusprosessia ja toisaalta inkubointiai-koja, jotka ovat välttämättömiä immunosieppaus- sekä solujen merkitsemisvaiheissa.

A) Totaaliveren solujen erotusprosessin vaikutus.

. 25 a) Lyhyeen sentrifugointiin perustuva menetelmä: 0,5 ml määritettävää verinäytettä sekoitetaan 1.5 ml:aan PBS-puskuria. 5 ml:n hemolyysiputkeen lisätään 1.5 ml Pharmacian Ficoll-Paqueta, ja Ficoll-kerroksen pinnalle lisätään PBS:ään laimennettu verinäyte. 5 minuutin 30 sentrifugoinnin jälkeen nopeudella 900 x g vallitsevassa ·· lämpötilassa muodostunut 0,5 ml:n suspensiorengas, joka sisältää mononukleaaliset solut, otetaan talteen. Tähän näytteeseen lisätään 1,5 ml PBS-puskuria.

b) Erytrosyyttien lyysiin perustuva menetelmä: 35 Toinen nopea menetelmä verisolujen erottamiseksi on punasoluja lyysaavan puskurin käyttäminen. Käytetyn lyysi-puskurin koostumus on seuraava: 30 95752 ammoniumkloridia: 8,29 g kaliumvetykarbonaattia: 1 g etyleeni-diamiinitetraetikkahapon kaksi natriumia sisältävää suolaa: 0,0307 g litrassa tislattua vettä, pH säädetty 5 arvoon 7,3.

Sekoitetaan 5 ml lyysipuskuria ja 0,250 ml verta.

10 min sekoituksen jälkeen seosta sentrifugoidaan 10 min ajan nopeudella 600 x g. Muodostunut solusakka otetaan 1 ml:aan PBS-puskuria.

10 Määrittämällä CD4- ja CD8-antigeenit esimerkin 1 mukaisella menetelmällä, sekä vertaamalla esimerkissä 1 esitettyä referenssimenetelmää veren mononukleaalisten solujen eristykseen, on todistettu, että molemmilla näillä kahdella menetelmällä kokoveren mononukleaalisten solujen 15 eristämiseksi on mahdollista kerätä tutkittujen verinäyt teiden koko lymfosyyttimäärä.

B) Inkubointiajan vaikutus solujen immunosieppauk-seen ja merkkaukseen.

Jotta saatiin selvitykseksi, onko erimerkissä 1 20 käytettyä 1 tunnin viivettä mahdollista vähentää määrityksen nopeuttamiseksi, verrattiin tuloksia, jotka oli saatu 20 000 mononukleaalista solua/kuoppa sisältävistä identtisistä näytteistä, kun solujen sieppaus- ja merkkausvai-heiden viivettä vaihdeltiin 10 min ja 1 tunnin välillä.

. 25 Olosuhteiden ollessa muuten samat kuin esimerkissä 1, saa dut tulokset on esitetty taulukossa 2.

li 3i 95752 TAULUKKO 2 Optinen tiheys

Inkubointi ---------------------------------------- 5 aika CD4-antigeeni : CD8-antigeeni (minuutteina) ----------------------------------------

Koe : Blankko* : Koe : Blankko* 10 0,322 : 0,037 : 0,329 : 0,023 10 20 0,438 : 0,049 : 0,401 : 0,025 30 0,620 : 0,055 : 0,498 : 0,027 * Nämä optisen tiheyden arvot vastaavat reagenssiblankkoa ilman soluja. Vertailuarvot, jotka on saatu solujen kans-15 sa, mutta ilman joko konjugaattia tai substraattia eivät ole esitettyjä arvoja suurempia.

Nämä tulokset osoittavat, että: - Epäspesifinen signaali (reagenssiblankko) on heikko, sitä matalampi, mitä lyhyempi on konjugaatin in- 20 kubointiaika.

- Spesifinen signaali saavuttaa 10 min aikana analyyttisesti käyttökelpoisen, tarkan sekä toistettavan arvon. Tämä osoittaa, että määritysaikaa on mahdollista lyhentää merkittävästi esimerkin 1 olosuhteisiin verrattuna , 25 ilman, että tulosten tarkkuus suuresti vähenee. Käytännös sä jos ajatellaan kokonaisajansäästöä, joka voidaan saavuttaa verinäytteen valmistelun sekä immunosieppauksen kohdalla, keksinnön mukainen testikitti ja menetelmä mahdollistavat CD4- ja CD8-antigeenien määrityksen kokoveri-30 näytteestä, 10 tai 20 näytettä 96 kuopan levyä kohden, lyhyemmässä kuin 1 tunnissa (näytteen saapumisesta laboratorioon). Tämä määritysaika on lyhyempi kuin millään nykypäivänä tunnetuilla menetelmillä voidaan saavuttaa.

32 95752

Esimerkki 5

Humaani-T-lymfosyyttien CD5-antigeenien molaaristen pitoisuuksien immunoentsymaattinen määritys humaani verestä asetyylikoliiniesteraasiin konjugoidun vasta-aineen avul-5 la.

A) Määrityskitin valmistus a) Kiinteä kantaja.

Käytetään esimerkin 1 mukaisesti valmistettua mik-rotiitterilevyä.

10 b) Monoklonaalisen vasta-aineen asetyylikoliini- esteraasi-konjugaatti.

Käytetään Electrophorus electricus-asetyylikoliini-esteraasia, joka valmistetaan FR-patenttihakemuksessa no.

2 550 799 esitetyn menetelmän mukaisesti.

15 Tämä entsyymi kytketään anti-CD5 vasta-aineeseen, jota nimitetään termillä ST 1, ja jota markkinoi BIOSYS. Kytkeminen suoritetaan julkaisussa YOSHITAKE et ai., Eur.

J. Biochem. 101 (1979), 395-399 esitetyn menetelmän mukaisesti .

20 c) Toteamisreagenssi.

Tämä reagenssi sisältää samalla sekä entsyymin substraatin (asetyylitiokoliini) että Ellmannin reagenssin, ja sen koostumus on seuraava:

- Asetyylitiokoliinia 7,5 x 10'4 M

25 - 5,5' -ditio-2-nitro bentsoehappoa (DTNB) 5 x 10‘4M

% ·, IM natriumfosfaatti-puskurissa, pH 7,4 Tämä liuos laimennetaan suhteessa 1/100 tislattuun veteen ennen käyttöä.

B) Immunologinen menetelmä.

30 a) Mononukleaariset solut erotetaan käyttämällä * esimerkissä 1 esitettyä menetelmää.

b) Solujen inkubointi immunosieppauksen ja merkitsemisen kohdalla kestää 20 minuuttia, kuten esimerkissä 5.

c) Kytketyn entsyymin toteaminen ja mittaus.

35 Jokaiseen kuoppaan lisätään 100 μΐ toteamisreagens- sia. Absorbanssi mitataan 45 min inkuboinnin jälkeen aallonpituudella 412 nm.

li 33 95752

Taulukossa 3 on esitetty mitatut optiset tiheydet näytteille, jotka sisältävät tunnetun määrän T-soluja. Näissä koeolosuhteissa reagenssien blankko on erityisen heikko, ja vastaa optisen tiheyden arvoa 0,002 - 0,003.

5 TAULUKKO 3 T-lymfosyyttien määrä kuoppaa kohden, ja CD5-antigeenimolekyylien määrä miljoonina 10 kuoppaa kohden 540 1 080 2 160 4 320 8 640 17 280 (32) (65) (130) (260) (520) (1040) 15 Optinen tiheys 0,030 0,060 0,138 0,260 0,470 0,850

Tulokset osoittavat näin suoritetun menetelmän erityisen herkkyyden. Itse asiassa 0,030:n optinen tiheys, joka saatiin 540 T-lymfosyyttiä (eli 32 miljoonaa CD5-antigeeni-20 molekyyliä) sisältävästä kuopasta, ja joka on mitattavissa tarkkaan ja on 10-kertaa suurempi kuin taustakohina, vastaa noin 5·10'17 moolia CD5-antigeenia määrityskuoppaa kohden. Tämä herkkyys on samaa luokkaa kuin parhaissa tunnetuissa immunologisissa mittausmenetelmissä, joissa käyte-25 tään herkimpiä radioaktiivisia leimoja.

Esimerkki 7

Aktivoitujen humaani-T-lymfosyyttien eri pinta-antigeenien määritys.

T-lymfosyyttien aktivointi on fysiologinen proses-30 si, joka käynnistyy aikaisin aina, kun immuunisysteemi . kuormittuu, kuten esim. infektoivissa patologisissa ti loissa, elinsiirroissa ja eräissä dysimmunitaarisissa sairauksissa. Tämä luonnollinen prosessi käynnistetään myös usein in vitro laboratorio-olosuhteissa useissa testeissä, 35 kuten sekoitetuissa lymfosyyttireaktioissa tai lymfoblas-

• · I

34 95752 toidisissa transformaatioissa. Viimeisessä tapauksessa polyklonaalinen aktivaatio aiheutetaan käyttämällä esim. fytohemagglutiinia (PHA), concanavaliini-A:ta tai muita lektiinejä. T-lymfosyyttien aktivoituminen saa aikaan 5 useiden membraanimarkkereiden ekspression huomattavaa lisääntymistä, etenkin CD25-antigeenin (interleukiini-2:n reseptori) tai CD2-antigeenin kohdalla. Nämä antigeenit ovat erinomaisia markkereita aktivoitumistilan ilmaisemiseen ja niiden määritys on hyvin mielenkiintoista sekä 10 kliinisen biologian että edellä esitettyjen laboratoriomääritysten kannalta, sillä jokaisessa tapauksessa voidaan välttää radioaktiivisten reagenssien käyttö.

Antigeenit määritetään käyttämällä esimerkissä 1 esitettyä menetelmää taulukossa 4 esitettyjen spesifikaa-15 tioiden mukaan.

TAULUKKO 4

Aktivoitujen T-lymfosyyttien pinta-antigeenien määritys 20 Määritettävä Immunosieppauksessa Peroksidaasilla antigeeni käytetty vasta-aine, merkitty vasta-aine, markkinoija markkinoija

CD 2 ST 1, BIOSYS ST 11, BIOSYS

25 CD 25 ST 11, BIOSYS IOT 14, IMMUNOTECH

Seuraavassa taulukossa 5 on esitetty 251103:lle mononuk-leaaliselle solulle mitatut optiset tiheydet 450 nm:n aallonpituudella, ja niitä on verrattu ilman PHA-stimulaati-30 ota sekä 3 vrk:n stimuloinnin jälkeen samoilla soluilla . saatuihin arvoihin.

• · • · 35 95752 TAULUKKO 5

Optiset tiheydet 5 --------------------------------------------------------

Ei-aktivoidut Aktivoidut Reagenssi-Antigeeni solut solut, 3 vrk blankko CD 25 0,064 0,529 0,044 10 CD 2 0,129 0,768 0,027

Tulokset osoittavat, että 2 tutkitun antigeenin antama spesifinen signaali kasvaa huomattavasti aktivoinnin vaikutuksesta.

15 Esimerkki 8 B-lymfosyyttien pinnalla olevien CD22- ja HLA-Dr (tai luokan II HLA) antigeenien määritys.

Tässä esimerkissä esitetään solujen pinta-antigeenien määritys RAJI-solulinjan soluille, joka on PULVER-20 TAFT'in J. Clln. Patol., 1965, 18, 261-274 esittämä humaa-niperäinen B-lymfoidinen solulinja.

Solujen immunosieppausta varten adsorboidaan määri-tyskuoppiin esimerkin 1 mukaisesti joko luokan II S-vasta-ainetta (BIOSYS) CD 22-antigeenien määrittämiseksi tai . 25 SB4-vasta-ainetta (BIOSYS) luokan II HLA- (tai HLA-Dr)- antigeenien määrittämiseksi.

a) CD22-antigeenin määritys: SB22- (BIOSYS) vasta-aine leimataan jodi-125:llä esimerkissä 3 esitetyn menetelmän mukaisesti. CD22-anti-30 geenit määritetään esimerkissä 3 CD4- ja CD8-antigeeneille • esitetyllä tavalla, lisäämällä kuoppiin järjestyksessä:

RAJI-linjan 5·104 solua ja sen jälkeen 105 cpm leimattua SB

22-vasta-ainetta. Tunnin jälkeen 4 °C:ssa kuopat tyhjennetään kääntämällä levy, minkä jälkeen jokainen kuoppa 35 pestään 4 kertaa 200 pl:lla PBS-puskuria. Soluihin kiin- 1 · ♦ 36 95752 nittynyt radioaktiivisuus kerätään ja mitataan esimerkin 3 mukaisesti. Näin saadaan 760 dpm:n lukema kuopalle, joka sisältää 5 x 104 RAJI-solua sekä reagenssiblankolle (ilman soluja) 50 dpm:n lukema.

5 b) HLA-Dr-antigeenin määritys:

Kuoppiin lisätään peräkkäin 105 solua sekä perok-sidaasilla esimerkin 1 mukaisesti leimattua luokan II S vasta-aine-konjugaattia. Määritys suoritetaan esimerkissä 1 esitetyllä tavalla. Optisen tiheyden arvoksi saadaan 10 1,840 sekä reagenssiblankolle ilman soluja arvo 0,105.

Esimerkki 9

Keksinnön mukaisen menetelmän käyttö T- ja B-lym-fosyyttien antigeenien määritykseen humaaniverestä.

A) Levyjen valmistus: 15 Käytetään esimerkin 1 mukaisesti valmistettuja mik- rotiitterilevyjä, sillä poikkeuksella, että levyn kaikkiin kuoppiin adsorboidaan samalla kerralla sekä vähintään suurimman osan T-lymfosyyteistä (BlOSYS’n luokan I S), että B-lymfosyyttien (BIOSYS'n luokan II S) kiinnittämiseen 20 kykeneviä monoklonaalisia vasta-aineita, joita kumpaakin käytetään pitoisuutena 5 pg/ml.

B) Immunologinen määritys:

Mononukleaaliset solut erotetaan kokoverestä Fi-coll'in avulla esimerkin 1 tai 5 mukaisissa olosuhteissa, 25 minkä jälkeen jokaiseen kuoppaan lisätään 80 000 mononuk- • · leaalista solua 75 pl:ssa PBS-puskuria. T-lymfosyytit määritetään osasta kuoppia BiOSYS’in ST 11-vasta-aineella (anti-CD 2); B-lymfosyytit määritetään lopuista kuopista BI0SYS'in SB 3 vasta-aineella (anti-CD 37), joka tunnistaa 30 kaikki perifeeriset B-lymfosyytit. Nämä vasta-aineet on : etukäteen kytketty peroksidaasiin esimerkissä 1 esitetyn menetelmän mukaisesti. Varsinainen määritys suoritetaan esimerkin 1 mukaisesti.

C) Tulokset 35 Tutkittavan näytteen sisältämät T- ja B-lymfosyyt tien absoluuttiset määrät määritetään standardikuvaajien

II

37 95752 avulla, jotka on muodostettu käsittelemällä identtisesti mononukleaalisia soluja, joista T- ja B-lymfosyyttien määrät on mitattu referenssimenetelmällä.

Vaihtoehtoisesti tutkittavan näytteen tulokset voi-5 daan sopivien standardien avulla ilmaista myös CD2- ja CD37-antigeenien molaarisina konsentraatioina.

Esimerkki 10

Humaaniperäisten verihiutaleiden GpIIb-IIIa- ja CD9-antigeenien määritys.

10 Määritys suoritetaan esimerkin 3 mukaisesti käyt tämällä jodi-125:llä leimattua monoklonaalista vasta-ainetta .

Verihiutaleet erotetaan humaani verestä sentrifugoi-malla PLASMION-perfuusionesteen (laboratorio R. Bellon) 15 läsnäollessa. 5 ml verta ja 5 ml PBS-puskuria sekä 10 ml PLASMIONia sekoitetaan keskenään koeputkessa. Tämän jälkeen koeputkea sentrifugoidaan 10 min ajan nopeudella 1500 rpm. Supernatanttiin keräytyneet verihiutaleet otetaan talteen imemällä pipetillä. Ne pestään kerran PBS:llä 20 sekoittamalla 1 tilavuus hiutalesuspensiota 10-kertaiseen tilavuuteen PBS:ää, minkä jälkeen liuosta sentrifugoidaan 10 min ajan nopeudella 1000 xg. Lopuksi hiutalesakka kerätään ja suspendoidaan uudelleen PBS:ään (2 ml). Hiutaleet lasketaan, ja niiden konsentraatio säädetään arvoon 25 2,5 miljoonaa/ml PBS-puskuria.

GpIIb-IIIa-antigeenin määrityksessä verihiutaleet immunosiepataan lOB2-monoklonaalisen vasta-aineen (Immuno-tech) avulla, ja GpIIb-IIIa antigeeni merkitään P2-mono-klonaalisella vasta-aineella (Immunotech).

30 CD9-antigeenin määrityksessä immunosieppauksessa « käytetään P2-monoklonaalista vasta-ainetta, ja merkitsemi sessä I0B2-monoklonaalista vasta-ainetta. 200 000 verihiutaletta sisältävän näytteen dpm-arvo mitataan.

Tulokset on esitetty taulukossa 6.

38 95752 TAULUKKO 6

Mitattu Vertailu, Määritettävä näyte ilman soluja 5 antigeeni (dpm) (dpm) CD 9 1 927 113

GpIIb-IIIa 2 891 238 10 Esimerkki 11

Humaaniperäisten granulosyyttien sisältämien CD15-antigeenien määritys.

CD15-antigeeni on hyvä spesifinen markkeri humaani-peräisille granulosyyteille (sanotaan vielä polynukleaali-15 set). Tämän antigeenin ansiosta voidaan nämä solut määrittää verestä, samoin kuin myös kaikki muut leukosyyttien alaryhmät. Tämä antigeeni on käyttökelpoinen myös virtsan granulosyyttien määrityksessä, esim. virtsateiden infektioissa, kuten kystiiteksessä tai pyeloneftiiteksessä.

20 Tässä esimerkissä määritys suoritetaan kokoveren granulosyyteille, jotka on eristetty myöhemmin esitettävällä tavalla.

Granulosyytit, samoin kuin eräät mononukleaaliset solut, erotetaan punasoluista esimerkissä 10 verihiuta-25 leille esitetyn tavan mukaisesti, sillä poikkeuksella, että soluja sisältävän koeputken annetaan seistä vallitsevassa lämpötilassa 45 minuuttia, ja leukosyytti-suspensio kerätään 500 μ1:η erissä nesteen pinnalta.

Granulosyytit immobilisoidaan kuoppiin monoklonaa-30 lisen vasta-aineen avulla, joka on spesifinen kaikkien leukosyyttien solumembraanissa olevalle CD45-antigeenille: » « käytetään titrauslevyn kuoppiin esimerkin 1 mukaisesti adsorboitua anti-LCA-vasta-ainetta (BIOSYS).

Määrityksessä käytetään anti-CD15-SMY-15a monoklo-35 naalista vasta-ainetta (BIOSYS), joka on leimattu perok-sidaasilla esimerkin 1 mukaisesti.

« · li 39 95752 Näin kuoppiin lisätyllä 12 500 solun kokonaismäärällä saadaan granulosyyttien CD15-antigeenille spesifiseksi signaaliksi 0,616, sen jälkeen kun arvo on korjattu reagenssiblankon antamalla karkealla optisen tiheyden ar-5 voila 0,100, joka on saatu solujen kanssa ja ilman ent syymikon jugaattia, ja joka johtuu granulosyyttien endogee-nisista peroksidaaseista.

Esimerkki 12

Leukemian fenotyypin arviointi immunoentsymaatti-10 sella menetelmällä.

Leukemia-potilaan kasvainsolujen fenotyypitys on eräs systemaattisesti suoritettu diagnostinen tutkimus potilaan leukemiasolujen tyypin ja alkuperän (T, B, granu-losyytit, myeloblastit, jne.) karakterisoimiseksi. Tämä 15 tutkimus suoritetaan klassisesti immunofluoresenssi-mene- telmällä käyttämällä monoklonaalisten vasta-aineiden valikoimaa, sekä tutkimalla mikroskoopilla ja laskemalla positiivisten solujen määrä. Solujen merkkautumisen tutkimiseen käytetään myös virtaussytometriaa.

20 Monoklonaalisten vasta-aineiden käyttö keksinnön mukaisessa menetelmässä mahdollistaa kliinisesti merkit tävien akuuttien tai kroonisten leukemioiden suurien ryhmien identifioinnin antamalla kvantitatiivista informaatiota erilaisten tutkittavien antigeenien suhteellisista 25 tiheyksistä.

• · - Tässä esimerkissä valmistettiin kuusi peroksidaa-siin konjugoitua monoklonaalista vasta-ainetta, jotka olivat spesifisiä leukemiasolujen pinnassa oleville antigeeneille: 30 - ST 1 ja ST 11 (BIOSYS): anti-CD5 ja anti-CD2 - SB 3 (BIOSYS): anti-CD37 - S-CALLA (SANOFI): anti-CALLA (tai anti-CD10) - Luokan II S (BIOSYS): anti-HLA-Dr (tai anti-HLA, luokka II) 35 - SMY 15 (BIOSYS): anti-CD15 • · 40 95752

Mikrotiitterilevy valmistettiin adsorboimalla etukäteen levylle anti-CD45 (S-LCA, BIOSYS) ja anti-HLA luokan I (S-luokka I, BIOSYS) monoklonaalisten vasta-aineiden seos.

5 Käyttämällä kuutta edellä valittua monoklonaalista vasta-ainetta evaluoitiin kroonisen B-lymfoidisen leukemian (LLC-B) fenotyyppi, joka lisäksi karakterisoitiin tavanomaisella menetelmällä.

Alla olevassa taulukossa 7 on esitetty yhdessä kuo-10 passa olevalle 80 000 mononukleaalisen solun kokonaismäärälle, tai vertailukuopille ilman soluja, aallonpituudella 492 nm mitatut optiset tiheydet. Vertailukuopille, jotka sisälsivät soluja, mutta eivät peroksidaasilla leimattua vasta-ainetta, saatiin optiseksi tiheydeksi 0,110.

15 TAULUKKO 7

Optinen tiheys

Monoklonaalinen vasta- --------------------------------- 20 aine ja vastaava Näyte solujen Vertailu ilman antigeeni kanssa soluja ST 11 (CD2) 0,270 0,030 ST 1 (CD5) 1,350 0,014 25 SB 3 (CD37) 0,850 0,005 • ·

Luokan II S (HLA-Dr) 1,640 0,010 SMY 15 (CD15) 0,235 0,007 CALLA (CD10) 0,160 0,002 30 Tutkitut leukemiasolut sisältävät siis runsaasti CD5-, : CD37- ja H LA luokan II antigeenejä, mutta ne eivät sisällä ’ tai sisältävät hyvin vähän CD15-, CALLA- ja CD2-antigeene- jä, mikä on tyypillistä LLC-B:lie.

M

41 95752

Esimerkki 13

Virtsateiden syöpiin liittyvien antigeenien määritys.

Tämän keksinnön mukaista määrityskittiä ja menetel-5 miä on käytetty erityisesti kasvainsolujen detektoinnissa, erityisesti virtsateiden tuumorien kohdalla, ja ne soveltuvat hyvin riskiryhmien joukkotutkimuksiin, esimerkiksi kemian teollisuuden työntekijöiden tai muiden altistuneiden ryhmien tutkimiseen.

10 Tämä esimerkki osoittaa keksinnön soveltamisen hu- maaniperäisestä urinaarisesta papilloomasta johtuvaan virtsarakon syöpään liittyvien RT4-linjan solujen antigeenin määritykseen (C.C. Rigby ja L.M. Franks, Brit. J. Cancer, 1970, 24, 746-754).

15 Solujen immunosieppaukseen tarkoitetut levyt valmistetaan esimerkin 1 mukaisesti, adsorboimalla kuoppiin S-luokan I (BIOSYS) monoklonaalista vasta-ainetta, joka tunnistaa luokan I HLA-antigeenin, ja joka kykenee sitomaan kaikkia epiteelisoluja.

20 Merkkauskonjugaatit valmistetaan esimerkin 1 (ent- symaattinen merkkaus) tai esimerkin 3 (radioisotooppinen merkkaus) mukaisella menetelmällä, 12F 6-monoklonaalisesta vasta-aineesta (Sanofi), joka tunnistaa vitsarakon syöpään liittyvän antigeenin.

25 Määrityksessä neljään kuoppaan jaetaan 75 μΐ solu- suspensiota (ts. 5011O3 solua/kuoppa). Kahteen kuoppaan lisätään peroksidaasiin kytkettyä 12 F 6-monoklonaalista vasta-ainekonjugaattia (SANOFI), ja kahteen muuhun kuoppaan jodi-l25:een kytkettyä 12 F 6-vasta-ainetta (100 000 30 cpm/kuoppa). Taulukossa 8 on esitetty immunoentsymaatti-sella tai radioimmunologisella menetelmällä saadut tulokset.

·« 42 95752 TAULUKKO 8

Merkitty Optinen tiheys (492 nm) tai cpm Positiivisen monoklo- ------------------------------- ja epäspesi- 5 naalinen Näyte Vertailu fisen sig- vasta-aine naalin suhde 12 F 6 0,782 0,078 10,0 peroksidaasi 10 12 F 6 1 612 350 4,6 jodi 125

Esimerkki 14 15 Candida albicans-hiivan membraani-antigeenin immu- noentsymaattinen määritys.

Candida albicans (serotyyppi 17) solut ovat Pasteur Instituutin kokoelmista Pariisista. Hiivasoluja kasvatettiin 18 tuntia tavanomaisesti kiinteällä synteettisellä 20 alustalla. Solut laskettiin ja valmistettiin solususpen-sio, joka sisälsi 105 solua/ml PBS-puskuria.

Käytetyt anti-Candida albicans-monoklonaaliset vasta-aineet valmistettiin lymfosyyttihybridisaatiolla T. Chardesin tutkielman mukaisesti, Faculty de Pharmacie, . 25 University de Montpellier I, 1988.

* ·

Immunosieppauksessa käytettiin CA4-vasta-ainetta, kun taas määritykseen käytettiin peroksidaasilla leimattua CA12-vasta-ainetta esimerkin 1 olosuhteissa.

Lisättyjä soluja sekä vertailunäytettä sisältäville 30 kuopille 492 nm aallonpituudella mitatut optisen tiheyden ; arvot olivat vastaavasti 1,025 ja 0,080.

Esimerkki 15

Magneettisilla kuulilla suoritettu immunoentsymaat-tinen määritys: humaaniperäisten T-lymfosyyttien CD5-an-35 tigeenien määritys asetyylikoliiniesteraasilla leimatulla 1

II

i * 43 95752 vasta-aine konjugaatilla erityisellä magneettisista kuulista muodostuvalla alustalla.

Solujen sieppaukseen käytetty alusta muodostui magneettisista kuulista, merkkiä DYNABEADS. BIOSYS'in markki-5 noimien kuulien, ref. DYN-11101, pinnalla oleva anti-CD2-vasta-aine kykeni kiinnittämään kaikki tutkittavan näytteen T-lymfosyytit. Kuulia käsiteltiin ennen käyttöä vielä anti-CD2-vasta-aineliuoksella testin toimivuuden parantamiseksi .

10 Tätä varten 10 pl:aan kuulasuspensiota sekoitettiin 1 ml vasta-aineliuosta, jonka pitoisuus oli 25 pg/ml PBS-puskuria, ja liuosta sekoitettiin kevyesti 1 tunnin ajan.

Tämän jälkeen kuulat pestiin 4 kertaa PBS-puskurilla, ja ne säilöttiin 4 ml:aan PBS:ää.

15 Määrityksessä 5 ml:n putkeen lisättiin järjestyk sessä: 200 μΐ kuulasuspensiota, 80 μΐ Ficoll-Paquen (PHARMACIA) avulla kokoverestä erotettuja mononukleaalisia soluja, ja vielä 280 μΐ esimerkissä 6 käytetyn kaltaista STl-vasta-ainekonjugaattia, joka oli leimattu asetyyli-20 koliiniesteraasilla.

Seosta sekoitettiin kevyesti 1 tunnin ajan, minkä jälkeen kuulat erotettiin magneetilla ja kuuliin kiinnittyneet solut pestiin PBS-puskurilla (5 pesua).

Soluihin kiinnittynyt asetyylikoliiniesteraasi il-25 maistiin samalla tavalla kuin esimerkissä 6. Saatu sig- « « naali optisen tiheyden arvoksi oli 0,168 merkittyjen solujen läsnäollessa; ilman soluja saatu blankko oli 0,062.

i * 4

>· I

Claims (37)

95752

1. Määrityskitti solupopulaatiolle tai sen alaryhmälle ominaisen pinta-antigeenin immunologiseen määrityk- 5 seen, tunnettu siitä, että sen komponentteja ovat: a) kiinteä kantaja, jolle on kiinnitetty kovalent-tisella sidoksella tai fysikaalisella adsorptiolla yksi tai useampia monoklonaalisia vasta-aineita, jotka ovat mitattavan solupopulaation jotain muuta kun mainittua tyy- 10 pillistä pinta-antigeenia vastaan; b) yksi tai useampia liuoksia, joista jokainen si sältää mitattavan solupopulaation tai sen alaryhmän ominaiselle antigeenille monoklonaalisen vasta-aineen, joka on leimattu radioaktiivisella tai entsymaattisella leimal- 15 la; c) jos vasta-aine on leimattu entsyymillä, yksi tai useampia liuoksia, jotka sisältävät tarvittavat reagenssit entsyymin aktiivisuuden toteamiseen; d) mahdollisesti lisäkomponentti, joka koostuu pe- 20 supuskurista ja/tai näytteistä, joiden avulla voidaan ver rata ja kontrolloida mittauksen laatua.

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen kitti, tunnettu siitä, että komponentti (a) on kiinteä kantaja, joka on mikrotiitterilevy, jonka kuoppiin on kiinnitetty 25 vasta-aine tai aineet, joiden tarkoitus on immobilisoida sopupopulaatioiden tai alaryhmien joukosta ne solut, jotka sisältävät määritettävän antigeenin.

3. Patenttivaatimuksen 1 mukainen kitti, tunnettu siitä, että komponentti (a) on erityinen mag- 30 neettinen kantaja.

.. 4. Jonkin patenttivaatimuksista 1-3 mukainen kit ti,tunnettu siitä, että komponentti (a) on kiinteä kantaja, jolle on kiinnitetty yksi tai useampia HLA-luokan I vastaisia monoklonaalisia vasta-aineita.

5. Jonkin patenttivaatimuksista 1-3 mukainen kit ti, tunnettu siitä, että komponentin (b) monoklo- li 95752 naaliset vasta-aineet ovat leimattuja radioisotooppileimalla, Joka on Jodi-125 tai Jodi-131.

6. Jonkin patenttivaatimuksista 1-3 mukainen kitti, tunnettu siitä, että komponentin (b) monoklo- 5 naaliset vasta-aineet ovat leimattuja entsyymileimalla.

7. Patenttivaatimuksen 6 mukainen kitti, tunnettu siitä, että komponentin (b) monoklonaaliset vasta-aineet ovat leimattuja peroksidaasilla ja komponentti (c) sisältää ehdottomasti hapetettua vettä ja kromogee- 10 nin, joka on orto-fenyleenidiamiini, 2,2'-atsino-bis-(3-etyylibentsotiatsoliini-6-sulfoni)happo, 3,3'-diamino-bentsidiini, 3-amino-9-etyylikarbatsoli tai niiden vesiliukoinen suola.

8. Patenttivaatimuksen 6 mukainen kitti, t u n - 15. e t t u siitä, että komponentin (b) monoklonaalinen vasta-aine on leimattu alkalisella fosfataasilla ja komponentti (c) sisältää para-nitrofenyylifosfaattia, 4-metyy-liumbelliferyyliä tai 5-bromi-4-kloori-3-indolyylifosfaat-tia.

9. Patenttivaatimuksen 6 mukainen kitti, tun nettu siitä, että komponentin (b) monoklonaalinen vasta-aine on leimattu beeta-galaktosidaasilla ja komponentti (c) sisältää orto-nitrofenyyli-beeta-D-galaktopyra-nosidia tai 4-metyyliumbelliferyyli-beeta-D-galaktopyrano- 25 sidia.

10. Patenttivaatimuksen 6 mukainen kitti, tunnettu siitä, että komponentin (b) monoklonaalinen vasta-aine on leimattu asetyylikoliiniesteraasilla ja komponentti (c) sisältää ehdottomasti asetyylitiokoliinia ja 30 5,5'-ditio-2-nitrobentsoehappoa tai yhtä niiden veteen .. liukenevista suoloista.

11. Patenttivaatimuksen 1 mukainen kitti, tunnettu siitä, että se soveltuu minkä tahansa yhden tai useamman pinta-antigeenin määrittämiseen ihmisen veripar- 35 tikkeleista, kuten leukosyyteistä, lymfosyyteistä, T-lym- 95752 fosyyteistä, B-lymfosyyteistä, granulosyyteistä ja verihiutaleista.

12. Patenttivaatimuksen 11 mukainen kitti, tunnettu siitä, että se soveltuu CD4- tai CD8-antigee- 5 nien määrittämiseksi näitä antigeenejä sisältävistä humaa-ni-T-lymfosyyteistä, joita kutsutaan T4- tai T8-lymfosyy-teiksi.

13. Patenttivaatimuksen 1 mukainen kitti, tunnettu siitä, että se soveltuu minkä tahansa yhden tai 10 useamman pinta-antigeenin määrittämiseen patogeenisestä mikro-organismista.

14. Patenttivaatimuksen 13 mukainen kitti, tunnettu siitä, että patogeeninen mikro-organismi on Candida albicans.

15. Patenttivaatimuksen 1 mukainen kitti, tun nettu siitä, että se soveltuu minkä tahansa yhden tai useamman membraaniantigeenin määrittämiseen kasvainsoluis-ta.

16. Patenttivaatimuksen 15 mukainen kitti, t u n - 20. e t t u ^iitä, että kasvainsolut ovat virtsatiesyöpä- soluja tai maligneja hemopaattisia soluja.

17. Patenttivaatimuksen 1 tai 2 mukainen kitti, tunnettu siitä, että komponentti (a) on mikrotiit-terilevy, jonka kuoppiin on kiinnitetty yksi tai useita 25 solupopulaation pinta-antigeeneille spesifisiä monoklonaa- lisia vasta-aineita ja komponentti (b) koostuu useista liuoksista, joista jokainen sisältää monoklonaalisen vasta-aineen, joka on spesifinen solujen alaryhmän pinta-antigeenille, joka on kiinnitetyn solupopulaation tärkein 30 pinta-antigeeni.

.. 18. Patenttivaatimuksen 17 mukainen kitti, tun nettu siitä, että se soveltuu T-, T4-, T8- ja B-lym-fosyyttien alaryhmien spesifisten antigeenien määrittämiseen.

19. Patenttivaatimuksen 17 mukainen kitti, tun nettu siitä, että se soveltuu eri antigeenien karak- II 95752 terisoimiseen ja määrittämiseen, jotka muodostavat malig-nien hemopaattisten kasvainsolujen pinta-antigeenisen epi-toopin.

20. Menetelmä solupopulaatiolle tai sen alaryhmälle 5 ominaisen pinta-antigeenin immunologiseen mittaukseen, tunnettu siitä, että menetelmässä: a) solupopulaatio tai sen sisältämä alaryhmä, joka sisältää määritettävän antigeenin, immobilisoidaan kiin-teälle kantajalle käyttämällä yhtä tai useampaa monoklo- 10 naalista vasta-ainetta, joka on etukäteen kiinnitetty ko. kantajalle kovalenttisella sidoksella tai fysikaalisella adsorptiolla, ja joka tunnistaa solupopulaation antigeenin, joka ei ole sama kun määritettävä antigeeni, ja samalla määritettävä solupopulaatio tai alaryhmä leimataan 15 ainakin yhdellä määritettävälle antigeenille spesifisellä monoklonaalisella vasta-aineella, joka on leimattu radio-isotooppi- tai entsyymileimalla, b) inkubointiaikaa seurataan; c) kantaja pestään sitoutumattomien solujen ja yli-20 määräisen vasta-aineen poistamiseksi; d) kun vasta-aine on leimattu entsyymillä, lisätään tarvittava tai tarvittavat reagenssit (substraatti tai kromogeeni) entsyymiaktiivisuuden toteamiseksi, e) tulokset luetaan joko määrittämällä radioaktii-25 visuus tai mittaamalla valosignaalilla (värinmuodostus tai fluoresenssi) ja mahdollisesti vertaamalla standardikuvaa-jaan.

21. Patenttivaatimuksen 20 mukainen määritysmenetelmä, tunnettu siitä, että kiinteä kantaja on 30 määritelty patenttivaatimuksissa 1 tai 2.

.. 22. Patenttivaatimuksen 20 tai 21 mukainen määri- “ tysmenetelmä, tunnettu siitä, että määrittämiseen käytettävä monoklonaalinen vasta-aine sisältää entsyymi-leiman.

23. Patenttivaatimuksen 22 mukainen määritysmene telmä, tunnettu siitä, että entsymaattinen leima 95752 on peroksidaasi ja entsyymiaktiivisuus mitataan hapetetulla vedellä ja kromogeenilla, joka on orto-fenyleenidi-amiini, 2,2'-atsino-bis-(3-etyylibentsotiatsoliini-6-sul-foni)happo, 3,3'-diaminobentsidiini, 3-amino-9-etyyli-5 karbatsoli tai niiden vesiliukoinen suola.

24. Patenttivaatimuksen 22 mukainen määritysmenetelmä, tunnettu siitä, että entsymaattinen leima on alkalinen fosfataasi ja entsyymiaktiivisuus mitataan para-nitrofenyylifosfaatilla, 4-metyyliumbelliferyylillä 10 tai 5-bromi-4-kloori-3-indolyylifosfaatilla.

25. Patenttivaatimuksen 22 mukainen määritysmenetelmä, tunnettu siitä, että entsymaattinen leima on beeta-galaktosidaasi ja entsyymiaktiivisuus mitataan orto-nitrofenyyli-beeta-D-galaktopyranosidilla tai 4-me- 15 tyyliumbelliferyyli-beeta-D-galaktopyranosidilla.

26. Patenttivaatimuksen 22 mukainen määritysmenetelmä, tunnettu siitä, että entsymaattinen leima on asetyylikoliiniesteraasi, entsyymiaktiivisuus mitataan asetyylitiokoliinilla ja kromogeenina käytetään 5,5'-di- 20 tio-2-nitrobentsoehappoa tai yhtä sen veteenliukenevista suoloista.

27. Patenttivaatimusten 20 tai 21 mukainen määritysmenetelmä, tunnettu siitä, että määrittämiseen käytettävä monoklonaalinen vasta-aine on leimattu radio- 25 isotoopilla, kuten jodi-125:llä tai jodi-131:llä.

28. Patenttivaatimuksen 20 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että kiinteälle kantajalle sidottu tai sidotut monoklonaaliset vasta-aineet ovat HLA-luokan I vasta-aineita.

29. Patenttivaatimuksen 20 mukainen menetelmä, .. tunnettu siitä, että se soveltuu yhden tai useam man pinta-antigeenin määrittämiseen ihmisen veripartik-keleista.

30 B-lymfosyyttien alaryhmien spesifisten antigeenien määrit-tämiseen.

30. Patenttivaatimuksen 20 mukainen menetelmä, 35 tunnettu siitä, että ihmisen veripartikkelit ovat leukosyyttejä, lymfosyyttejä, T-lymfosyyttejä, CD4-mark- II 95752 kerin sisältäviä T-lymfosyyttejä, joita sanotaan T4-lym-fosyyteiksi, CD8-markkerin sisältäviä T-lymfosyyttejä, joita sanotaan T8-lymfosyyteiksi, B-lymfosyyttejä, granu-losyyttejä tai verihiutaleita.

31. Patenttivaatimuksen 20 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että se soveltuu minkä tahansa yhden tai useamman pinta-antigeenin määrittämiseen patogeeni sesta mikro-organi smi sta.

32. Patenttivaatimuksen 31 mukainen menetelmä, 10 tunnettu siitä, että patogeeninen mikro-organismi on Candida albicans.

33. Patenttivaatimuksen 20 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että se soveltuu minkä tahansa yhden tai useamman membraaniantigeenin määrittämiseen kas- 15 vainsoluista.

34. Patenttivaatimuksen 33 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että kasvainsolut ovat virtsatie-syöpäsoluja tai maligneja hemopaattisia soluja.

35. Patenttivaatimuksen 20 tai 21 mukainen menetel- 20 mä,tunnettu siitä, että solupopulaatio immobili- soidaan mikrotiitterilevylle yhden tai useamman tämän populaation pinta-antigeenille spesifisellä monoklonaalisella vasta-aineella ja samalla kiinnitetyn populaation alaryhmä merkitään suorasti useammalla liuoksella, joista 25 jokainen sisältää yhden määritettävän alaryhmän yhdelle pinta-antigeenille spesifisen monoklonaalisen vasta-aineen.

36. Patenttivaatimuksen 35 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että se soveltuu T-, T4-, T8- ja

37. Patenttivaatimuksen 35 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että sen avulla voidaan karakterisoida ja määrittää eri antigeenejä, jotka muodostavat ma- 35 lignien hemopaattisten kasvainsolujen pinta-antigeenisen epitoopin. 95752