JP5144950B2 - ナチュラルキラー活性の評価方法 - Google Patents
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(1)エフェクター細胞の調製
文書により同意を得た健常人ボランティア8名から、安静時静脈血35mLをヘパリン入り採血管にて無菌的に採取し、5mLずつ6本に分注した。そのまま室温にて静置し、0時間後(採血直後)、2時間後、5時間後、8時間後、11時間後、および24時間後に比重遠心分離に供し、末梢血単核細胞(PBMC)を回収した。PBMCの回収は以下の手順によった。
119gのHEPES、54.4gのNaCl、3.73gのKCl、4.07gのMgCl2・6H2Oを800mLの精製水に溶解後、1N NaOHでpH7.4に調整し、精製水にて全量1,000mLとした。この溶液をフィルター滅菌し、バッファーA(50mM HEPES、93mM NaCl、5mM KCl、2mM MgCl2、pH7.4)を調製した。また、119gのHEPES、54.4gのNaCl、3.73gのKCl、4.07gのMgCl2・6H2O、2.94gのCaCl2・2H2O、18.0gのグルコースを800mLの精製水に溶解後、1N NaOHでpH7.4に調整し、精製水にて全量1,000mLとした。この溶液をフィルター滅菌し、バッファーB(50mM HEPES、93mM NaCl、5mM KCl、2mM MgCl2、2mM CaCl2、10mMグルコース、pH7.4)を調製した。
ターゲット細胞浮遊液を96ウェルプレートに100μLずつ分注した。その上に、上記(1)で調製したエフェクター細胞浮遊液を「エフェクター細胞:ターゲット細胞」が「40:1」または「20:1」の比率となるように分注した。そのままプレートを5%CO2、37℃の条件下で4時間静置した。4時間経過後、プレートのまま室温、350Gで5分間遠心した。遠心後の上清20μLを測定用プレートに移し、増強試薬100μLを分注して、放出されたEu3+の量(1/10量)をラベルカウンターにて測定した(測定値A)。別途、エフェクター細胞浮遊液の代わりに100μLの1%トリトンX−100溶液を添加したウェル(Total、測定値B)と、100μLの10%FCS含有RPMI1640を添加したウェル(Back、測定値C)も設定し、同時測定した。Totalはターゲット細胞を全て人工的に破壊した場合のEu3+放出値、Backはターゲット細胞からの自然Eu3+放出値を測定するためのものである。
{(A−C)/(B−C)}×100 (I)
第1表ならびに図1に結果を示す。第1表と図1において、a〜hはそれぞれ同一被検者由来の検体を示している。第1表において、各数値はNK活性の測定値(%)、かっこ内の数値は0時間を100とした場合の相対値である。図1は、NK活性と経過時間との関係を表すグラフである。すなわち、いずれの検体の場合も、採血後からPBMCの分離までに要した時間が長いほどNK活性の値が減少していた。また、その減少度合いは検体によってばらつきが大きかった。例えば、24時間経過後に50%以下まで減少した検体(検体f,g)がある一方で、75%程度に留まった検体(検体e)もあり、外挿によって採血直後(0時間経過後)のNK活性を推定することは困難であった。
以上より、細胞障害性試験によるNK活性は、採血後からPBMCの分離までに要した時間が長いほど減少し、採血直後に測定しないと生体の正しい免疫能を反映しないことが示された。
文書により同意を得た健常人ボランティア30名を被検者とし、上記1と同様の手順で採血直後(0時間経過後)のNK活性を測定した。この細胞障害性試験によるNK活性測定値は採血直後のPBMCを用いて測定したものであるから、被検者の免疫能を正確に反映していると考えられた。
以上より、採血直後において、細胞障害性試験によるNK活性とCD4+/CD8+とは高い相関性を示し、細胞障害性試験に代わってCD4+/CD8+を測定することで、NK活性の評価を行えることが示された。同様に、採血直後において、細胞障害性試験によるNK活性とCD4+・CD25+とは高い相関性を示し、細胞障害性試験に代わってCD4+・CD25+を測定することで、NK活性の評価を行えることが示された。
文書により同意を得た健常人ボランティア2名を被検者とし、温熱ストレスをかける直前、並びに、かけた直後、3時間後、6時間後、12時間後、24時間後に採血し、直ちに上記1と同様の手順でPBMCを採取した。温熱ストレスとして、遠赤外線全身加温装置を用い、60分間全身加温を負荷した。この負荷により、被検者2名の直腸温度は39℃まで上昇した。
以上より、同一個体においてCD4+/CD8+あるいはCD4+・CD25+の変動を調べることにより、免疫能の変動を正確に把握できることが示された。
Claims (4)
- 生体から単離された末梢血単核細胞の集団におけるCD4+細胞の数とCD8+細胞の数との比を指標として、前記生体のナチュラルキラー活性を評価することを特徴とするナチュラルキラー活性の評価方法。
- 生体から単離された末梢血単核細胞の集団におけるCD4+・CD25+細胞の数の比率を指標として、前記生体のナチュラルキラー活性を評価することを特徴とするナチュラルキラー活性の評価方法。
- CD4+細胞の数とCD8+細胞の数との比あるいはCD4+・CD25+細胞の数の比率を、予め設定された基準値と比較することにより、前記生体のナチュラルキラー活性を評価することを特徴とする請求項1又は2に記載のナチュラルキラー活性の評価方法。
- 前記基準値は、生体から単離された直後の末梢血単核細胞における細胞障害性試験によるナチュラルキラー活性の値との相関を示す回帰式から求めたものであることを特徴とする請求項3に記載のナチュラルキラー活性の評価方法。
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