KR20020032751A - 지지체로서 니트로셀룰로스 멤브레인을 사용한 마이크로웰 플레이트 단백질 칩 및 이의 제조 방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 표면상에는 분석하고자 하는 단백질에 대해 특이적으로 결합하는 항원이나 항체 등의 1종 이상의 단백질이 고정되어 있고, 뒷면은 소수성 중합체로 코팅된 니트로셀룰로스 멤브레인 지지체가 각 웰 내부 바닥면에 부착된 마이크로 웰 플레이트 단백질 칩 및 이의 제조 방법에 관한 것이다.

본 발명의 단백질 칩은 지지체로서 니트로셀룰로스 멤브레인을 사용하므로, 유리 플레이트 또는 플라스틱이나 금속 플레이트를 사용하는 종래의 단백질 칩에 비해 비교적 용이하고 간편하게 단백질을 표면상에 고정시킬 수 있으며, 동시에 많은 시료를 분석할 수 있고, 각종 자동화된 기기들을 이용하는데 유리하므로, 시험시 뛰어난 효율성과 보다 정확한 분석 결과를 제공한다.

Description

지지체로서 니트로셀룰로스 멤브레인을 사용한 마이크로 웰 플레이트 단백질 칩 및 이의 제조 방법{A micro well plate protein chip using nitrocellulose membrane as a support and a method for the preparation thereof}

본 발명은 지지체로서 니트로셀룰로스 멤브레인을 사용한 마이크로 웰 플레이트 단백질 칩 및 이의 제조 방법에 관한 것이다.

최근, 질병 진단이나 약물 치료 효능 평가 등 병리학, 생명공학 등의 분야에서 시료내 단백질을 분석하기 위한 최첨단의 기술로서 단백질 칩에 대한 연구가 급속도로 이루어지고 있고, 이에 대한 관심 또한 나날이 높아지고 있다. 일반적으로, 단백질 칩은 목적 단백질에 특이적으로 결합하는 항원이나 항체 등의 단백질을 지지체의 표면상에 고정시킨 후, 시료와의 반응, 주로 면역 반응을 이용하여 그 결합 결과를 분석함으로써, 시료내 특정 단백질을 검출하는 것이다.

현재 사용되고 있는 단백질 칩들은 지지체로서 유리 플레이트 또는 플라스틱이나 금속 플레이트 같은 소재의 기판들을 사용하며, 이들 기판들이 갖고 있는 물리적인 특성과 고정시키고자 하는 항원, 항체 등 단백질의 특성을 이용하여 이들 단백질을 지지체의 표면상에 고정시키고 있다. 그 구체적인 방법들로는 다음과 같은 것들이 있다.

그중 첫 번째는 지지체와 단백질 상호간의 소수성을 이용한 방법으로, 소수성(hydrophobic)을 나타내는 플라스틱이나 금속 플레이트의 표면에 단백질의 소수성 부분이 부착되는 특성을 이용하여 단백질을 고정시키는 방법이다. 이 방법은 플라스틱이나 금속의 표면상에 단백질이 고정되는데 상당히 오랜 시간이 소요된다는단점과 함께, 고정된 정도가 매우 불규칙하여 그 정도에 따라 각기 다른 면역 반응 정도를 나타낸다는 문제점을 갖고 있다. 그리고 고정시키고자 하는 단백질이 그 특성에 따라 각기 다른 고정상태를 나타내므로 여러 종류의 단백질을 함께 고정시키는데 어려움이 있다.

두 번째는 EDC[1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)-carbodiimide]를 사용하여 플라스틱 등 지지체 표면의 카르복실기(carboxyl group)를 활성화시킨 후, 합성 단백질의 아미노기(amino group)와 결합 반응시킴으로써, 단백질을 지지체의 표면상에 부착하는 기술[참조; Bioorg Khim. Ivanovskaia MG, Naryshkin NA, Shabarova ZA. 21(6):454-60(1995, 6)]이다. 그러나 이 기술에 의해 플라스틱 표면에 단백질을 공유 결합으로 영구 고정시켜 단백질 칩을 제조하는 경우에 있어서도, 플라스틱 표면의 카르복실기와 단백질의 아미노기간의 반응에 상당한 시간이 소요되는 단점을 가지고 있다.

이와 같이, 단백질 칩을 제조하는데 있어, 유리 플레이트 또는 플라스틱이나 금속 플레이트 같은 종래의 지지체 표면상에 단백질을 고정시키는데에는 상기와 같은 여러 가지 어려움이 있으며, 지지체 소재 자체의 비유연성 관계로, 마이크로 웰 플레이트와 같은 자동화가 가능한 용기나 기구내에 단백질 칩을 설치하기 곤란한 문제점 등을 가지고 있었다.

이에, 본 발명은 유리 플레이트 또는 플라스틱이나 금속 플레이트 같은 지지체를 사용한 종래 단백질 칩의 제조과정과 제품의 안정성면에서의 문제점을 인식하고, 이를 해결하기 위해, 용이하고 간편하게 단백질을 표면상에 고정시킬 수 있어 효율적이고, 반응성이 우수하며, 각종 자동화 기기에 쉽게 활용할 수 있는 단백질 칩을 제공하는 것을 그 목적으로 한다.

도 1a는 96-웰 마이크로 플레이트를 위에서 촬영한 사진이고, 도 1b는 96-웰 마이크로 플레이트의 각 웰을 확대 촬영한 사진.

도 2a는 표면상에 단백질(항원 또는 항체)을 고정시킨 니트로셀룰로스 멤브레인을 개략적으로 도시한 도면이고, 도 2b는 상기 도 2a의 니트로셀룰로스 멤브레인을 도 1a의 웰 내부 바닥면에 부착시킨 마이크로 웰 플레이트 단백질 칩에서 하나의 웰을 개략적으로 도시한 도면.

도 3은 실시예 1에 대한 도면으로, 도 3a는 시료 반응전 5종의 간염 바이러스 HCV 항원(1: 면역반응 대조군, 2: 코어 단백질, 3: NS3 단백질, 4: NS4 단백질, 5: NS5 단백질)이 고정된 상태의 마이크로 웰 플레이트 단백질 칩에서 하나의 웰을 개략적으로 도시한 도면이고, 도 3b는 시료 반응후 결과를 도시한 도면.

도 4는 실시예 2에 대한 도면으로, 도 4a는 시료 반응전 5종의 항체(1: 면역반응 대조군, 2: 결핵균 항체, 3: 클라미디아 항체, 4: 말라리아 항체, 5: 스트렙토코커스 항체)가 고정된 상태의 마이크로 웰 플레이트 단백질 칩에서 하나의 웰을 개략적으로 도시한 도면이고, 도 4b는 시료 반응후 결과를 도시한 도면.

상기한 목적을 달성하기 위해, 본 발명은 니트로셀룰로스 멤브레인 지지체가 마이크로 웰 플레이트내에 부착된 단백질 칩 즉, 마이크로 웰 플레이트 단백질 칩을 제공한다. 더욱 구체적으로 본 발명은 표면상에는 분석하고자 하는 단백질에 대해 특이적으로 결합하는 항원이나 항체 등의 1종 이상의 단백질이 고정되어 있고, 뒷면은 소수성 중합체로 코팅된 니트로셀룰로스 멤브레인 지지체가 각 웰 내부 바닥면에 부착된 마이크로 웰 플레이트 단백질 칩 및 이의 제조 방법에 관한 것이다.

본 발명의 단백질 칩은 지지체로서 니트로셀룰로스 멤브레인을 사용하며, 표면상에는 분석하고자 하는 단백질에 특이적으로 결합하는 항원이나 항체 등의 1종 이상의 단백질이 고정되고, 뒷면은 소수성 중합체, 예를 들면 폴리스티렌, 폴리프로필렌 또는 폴리에틸렌으로 처리되어진 것을 특징으로 한다.

본 발명의 마이크로 웰 플레이트 단백질 칩은 다음과 같은 단계들을 포함하는 방법에 의해 제조된다:

(1) 니트로셀룰로스 멤브레인의 뒷면을 소수성 중합체 용액으로 코팅하는 단계,

(2) 상기 니트로셀룰로스 멤브레인을 마이크로 웰 플레이트의 웰에 들어갈 수 있을 정도의 크기로 절단하는 단계,

(3) 마이크로 웰 플레이트의 각 웰 내부 바닥면에 접착제를 도포한후, 상기 니트로셀룰로스 멤브레인을 부착시키는 단계,

(4) 마이크로 웰 플레이트내에 부착된 니트로셀룰로스 멤브레인의 표면상의 소정의 위치에, 분석하고자 하는 단백질에 대해 특이적으로 결합하는 1종 이상의 항원 또는 항체를 각각 0.05 내지 0.5 ㎕씩 분무하는 단계, 및

(5) 분무된 항원 또는 항체가 니트로셀룰로스 멤브레인 표면에 흡착 고정되도록 35-40℃에서 1시간 동안 반응시켜 항원 또는 항체들이 고정되도록 하는 단계.

본 발명에서 지지체로 사용된 니트로셀룰로스 멤브레인은 표면상에 항원이나 항체 등의 단백질을 분무한 후, 이 단백질들이 표면에 흡착 고정되도록 35-40℃에서 1시간 정도 반응시킴으로써, 종래에 사용하였던 유리 플레이트 또는 플라스틱이나 금속 플레이트에 비해 비교적 용이하고 간편하게 단백질을 고정시킬 수 있으며, 물리적 특성상 유연성이 우수하여 마이크로 웰 플레이트 등 각종 자동화 기기에 쉽게 부착 사용할 수 있는 장점이 있다.

이때, 지지체 표면상에 고정시키는 단백질은 분석하고자 하는 단백질에 대해 특이적으로 결합하는 여러 종류의 단백질, 예를 들면 항원이나 항체와 같은 단백질을 사용하며, 결과 분석을 용이하게 하기 위해 각 항원 또는 항체 등의 단백질에는 통상의 표지물질, 예를 들면 효소 측정법에 의한 효소 및 기질, 형광측정법에 의한 형광 염료, 방사선측정법에 의한 방사성동위원소 등을 사용하여 표지하는 것이 바람직하다. 또는 결과 분석을 위해, 상기한 표지물질을 부착한, 분석 단백질에 특이적인 2차 항체를 사용하는 것도 가능하다.

본 발명에서는 니트로셀룰로스 멤브레인의 뒷면을 소수성 중합체 용액으로 코팅하여 줌으로써, 멤브레인 하부로부터 유입된 수분이나 유분 등이 멤브레인의 성상에 영향을 미치지 않도록 처리한다. 이러한 처리과정은 특히 멤브레인을 마이크로 웰 플레이트 등 각종 기구에 부착하는 과정에서 접착제 성분 등에 의해 멤브레인에 변성이 일어나는 것을 방지하는 역할을 한다.

상기와 같이 니트로셀룰로스 멤브레인의 뒷면에 코팅하는 소수성 중합체의 예로는 폴리스티렌, 폴리프로필렌, 폴리에틸렌 등이 있다.

본 발명에 사용되는 마이크로 웰 플레이트로는 당해 기술분야에서 사용되는 모든 마이크로 웰 플레이트 그리고 유사 시험 기구 등이 모두 가능하며, 96-웰 마이크로 플레이트를 사용하는 것이 여러면에서 유리하다.

본 발명의 마이크로 웰 플레이트 단백질 칩을 사용하여 시료를 분석하는 경우, 시료 반응전 가능한 특이 단백질 결합 반응을 제거하기 위해 BSA(bovine serum albumin) 등으로 각 웰을 사전에 코팅시켜 주는 것이 바람직하다.

본 발명의 마이크로 웰 플레이트 단백질 칩은 개별 단백질 칩을 사용하는 것에 비해, 동시에 많은 시료를 분석할 수 있고, 각종 자동화된 기기들을 이용하는데 유리한 점이 있다.

도 1에는 96-웰 마이크로 플레이트의 상단 촬영 사진(도 1a) 및 각 웰의 확대 사진(도 1b)이 제시되어 있다. 또한, 표면상에 단백질(항원 또는 항체)을 고정시킨 니트로셀룰로스 멤브레인을 개략적으로 나타낸 도면과 이 니트로셀룰로스 멤브레인을 도 1a의 웰 내부 바닥면에 부착시킨 마이크로 웰 플레이트 단백질 칩중하나의 웰을 개략적으로 나타낸 도면이 각각 도 2a 및 도 2b로서 제공되어 있다.

본 발명의 마이크로 웰 플레이트 단백질 칩을 제조하는 과정을 구체적으로 예를 들어 설명하면 다음과 같다.

니트로셀룰로스 멤브레인의 뒷면을 소수성 중합체 용액으로 2-3차례 도포하고 건조시켜 코팅한 후, 마이크로 웰 플레이트의 웰에 들어갈 수 있을 정도의 크기로 절단한다. 마이크로 웰 플레이트의 웰 내부 바닥면에 접착제를 도포한 후, 그 접착면에 상기에서 준비된 니트로셀룰로스 멤브레인을 부착하여 준다. 이러한 시험 준비 과정에서 멤브레인의 표면에 시험 결과에 영향을 미칠 수 있는 다른 이물질이 묻지 않도록 주의하여야 하며, 이와 함께 멤브레인 부착용으로 사용되는 접착제 성분이 멤브레인으로 스며들지 않도록 주의하여야 한다. 마이크로 웰 플레이트의 각 웰 내부에 부착된 니트로셀룰로스 멤브레인의 표면상에 각각 정해진 다른 위치에 각기 다른 종류의 표지물질이 부착된 항원(또는 항체)들을 각각 약 0.5 ㎕씩 분무하고, 37℃에서 1시간 동안 반응시켜 항원(또는 항체)들이 흡착 고정될 수 있도록 하여 니트로셀룰로스 멤브레인을 지지체로 하는 본 발명의 마이크로 웰 플레이트 단백질 칩을 제조한다. 제조된 마이크로 웰 플레이트 단백질 칩의 각 웰에 시료를 주입하고, 면역 반응을 수행한 후, 표지물질을 판독하여 시료내 단백질을 분석한다.

이하에서는 본 발명의 마이크로 웰 플레이트 단백질 칩을 시료 분석 시험에 활용하는 경우를 구체적인 예를 중심으로 실시예로서 상세히 설명한다. 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위해 제공된 것으로, 본 발명을 한정하는 것으로 이해되어서는 안된다.

[실시예 1]본 발명의 방법을 사용한 시료내 HCV 항체 확인 시험

본 발명의 방법에 따라, HCV의 항원 단백질중 코어 단백질(core protein), NS3 단백질(비구조 3 단백질), NS4 단백질(비구조 4 단백질), NS5 단백질(비구조 5 단백질)을 대조군과 함께, 준비된 마이크로 웰 플레이트 단백질 칩의 멤브레인 표면상에 각기 0.5㎕씩 일렬로 분무하고, 37℃에서 약 1시간 동안 항온처리하여 각 항원 단백질을 멤브레인 표면상에 고정시켰다. 환자의 혈청 시료를 각 웰에 주입하고 상온에서 30분 동안 면역 반응을 수행하여 혈청내에 존재하는 HCV 특이 항체가 단백질 칩상의 항원과 결합될 수 있도록 하였다. 혈청 시료를 마이크로 웰로부터 제거하고, 세척액(PBS-T; 10mM phosphate buffer pH7.4, 150mM NaCl, 0.05% Tween20)으로 3회 세척하여 미결합 항체를 제거하였다. 사람의 항체에 대하여 특이적으로 결합할 수 있는 형광 염료가 부착된 2차 항체를 각 웰에 주입하여 특이적 항체-항체 결합 반응이 이루어지도록 반응시켰다. 상기 세척액으로 마이크로 웰을 3회 세척하여 미결합 항체를 제거하였다. 마이크로 웰을 형광 인지 디지털 카메라(cooled ccd camera)로 분석하여 항원-항체 결합 여부를 분석하였다.

그 결과가 도 3에 제시되어 있다. 도 3b에 따라, 시험 혈액중에 HCV에 대한 항체가 존재함을 알 수 있었다.

[실시예 2]본 발명의 방법을 사용한 시료내 병원성 미생물의 존재유무 확인 시험

본 발명의 방법에 따라, 결핵균(M.TB), 클라미디아(Chlamydia), 말라리아(Malaria), 스트렙토코커스(Streptococus)에 대한 특이 항체를 대조군과함께, 준비된 마이크로 웰 플레이트 단백질 칩의 멤브레인 표면상에 각기 0.5㎕씩 일렬로 분무하고, 37℃에서 약 1시간 동안 항온처리하여 각 항체 단백질을 멤브레인 표면상에 고정시켰다. 환자의 시료를 각 웰에 주입하고 상온에서 30분 동안 면역 반응을 수행하여 시료내에 존재하는 병원균이 단백질 칩상의 항체와 결합될 수 있도록 하였다. 혈청 시료를 마이크로 웰로부터 제거하고, 세척액(PBS-T; 10mM phosphate buffer pH7.4, 150mM NaCl, 0.05% Tween20)으로 3회 세척하였다. 각 병원균에 대하여 특이적으로 결합할 수 있는 형광 염료가 부착된 2차 항체를 각 웰에 주입하여 특이적 항원-항체 결합 반응이 이루어지도록 반응시켰다. 상기 세척액으로 마이크로 웰을 3회 세척하여 미결합 항체를 제거하였다. 마이크로 웰을 형광 인지 디지털 카메라(cooled ccd camera)로 분석하여 항원-항체 결합 여부를 분석하였다.

그 결과가 도 4에 제시되어 있다. 도 4b에 따라, 시험 시료중에 결핵균이 존재함을 알 수 있었다.

본 발명의 마이크로 웰 플레이트 단백질 칩은 지지체로서 니트로셀룰로스 멤브레인을 사용하므로, 종래에 사용하였던 유리 플레이트 또는 플라스틱이나 금속 플레이트에 비해 비교적 용이하고 간편하게 단백질을 표면상에 고정시킬 수 있으며, 개별 단백질 칩을 사용하는 것에 비해, 동시에 많은 시료를 분석할 수 있고, 각종 자동화된 기기들을 이용하는데 유리하므로, 시료 분석을 통한 환자의 질병 진단이나 치료시 투여한 약물의 효능 등 임상 결과 파악 및 병리학 연구 등 관련 분야에서 시험시 뛰어난 효율성과 보다 정확한 분석 결과를 제공한다.

Claims (4)

1. 목적하는 단백질에 대해 특이적으로 결합하는 단백질 1종 이상을 표면상에 고정시킨 니트로셀룰로스 멤브레인 지지체를 마이크로 웰 플레이트의 각 웰 내부에 부착시킨 마이크로 웰 플레이트 단백질 칩.
2. 제 1 항에 있어서,

   상기 니트로셀룰로스 멤브레인의 뒷면이 폴리스티렌, 폴리프로필렌 또는 폴리에틸렌 용액으로 코팅되어 있는 것을 특징으로 하는 단백질 칩.
3. 제 2 항에 있어서,

   상기 단백질이 목적하는 단백질에 대해 특이적인 항원 또는 항체인 것을 특징으로 하는 단백질 칩.
4. (1) 니트로셀룰로스 멤브레인의 뒷면을 소수성 중합체 용액으로 코팅하는 단계,

   (2) 상기 니트로셀룰로스 멤브레인을 마이크로 웰 플레이트의 웰에 들어갈 수 있을 정도의 크기로 절단하는 단계,

   (3) 마이크로 웰 플레이트의 각 웰 내부 바닥면에 접착제를 도포한후, 상기 니트로셀룰로스 멤브레인을 부착시키는 단계,

   (4) 마이크로 웰 플레이트내에 부착된 니트로셀룰로스 멤브레인의 표면상의 소정의 위치에, 분석하고자 하는 단백질에 대해 특이적으로 결합하는 1종 이상의 항원 또는 항체를 각각 0.05 내지 0.5 ㎕씩 분무하는 단계 및

   (5) 분무된 항원 또는 항체가 니트로셀룰로스 멤브레인 표면에 흡착 고정되도록 35-40℃에서 1시간 동안 반응시켜 항원 또는 항체들이 고정되도록 하는 단계를 포함하는 마이크로 웰 플레이트 단백질 칩의 제조 방법.