FI92603C - Mikrobinen menetelmä syklosporiinien valmistamiseksi - Google Patents

Description

92603

Mikrobinen menetelma syklosporiinien valmistamiseksi 5 Tåmån keksinnon kohteena on mikrobinen menetelma syklospo- riiniseoksen tai sen komponenttien, syklosporiinin A, syklo-sporiinin B ja syklosporiinin C valmistamiseksi aerobisen fermentaation avulla.

10 Syklosporiinit ovat syklisiå, neutraaleja, apolaarisia 11- jåsenisiå oligopeptidejå, joissa muutamat aminohappo-osat ovat erilaisia. Syklosporiinin A ja syklosporiinin B ovat ensin eriståneet A. Riiegger et al. [Helv. Chim. Acta 59, 1075 15 (1976)], kun taas syklosporiinit B, D, E ja G on eristetty R.

Traberin et al.:n toimesta [Helv. Chim. Acta 60, 1568 (1977)] sienen (NRRL 8044) viljelmåstå, joka identifioitiin tålloin Trichoderma polvsporum (Ling ex Pers.) Rifaiksi. Myohemmin mainitun kannan taksonomia on tarkistettu ja sitå on kutsuttu 20 tåmån jålkeen kirjallisuudessa nimellå Tolvpocladium inflatum

Garns.

Tållå hetkellå tunnetaan 25 erilaista syklosporiiniantibioot-tia, jotka on nimitetty kirjainten A - Z mukaisesti [Helv.

25 Chim. Acta 70, 13 (1987)]. Nåistå komponenteista syklosporii- ni A on arvokkain aine, jolla on selektiivinen immunosuppres-siivinen vaikutus.

Syklosporiini A on tullut ensin tunnetuksi mietona antifungi-30 sidisenå antibioottina, sen merkittåvå immunosuppressiivinen vaikutus on havaittu vasta myohemmin [J. F. Borel et al.: Immunology 32, 1017 (1977)].

Useissa in vitro- ja in vivo-tutkimuksissa on vahvistettu, 35 ettå syklosporiinit A, C ja G ovat erittåin spesifisiå immu- nosuppressiivisia aineita.

Syklosporiini A inhiboi sekå humoraalisen ettå solujen vå-littåmån immuunivasteen. Tutkittaessa sen toimintatapaa se 92603 2 inhiboi sekå T-soluproliferaation (uudiskasvun) ettå inter-leukiini- 2-synteesin.

Syklosporiinin A terapeuttista kåyttoå ihmisen elinsiirroissa 5 on esitetty vuonna 1978. Sitå on kåytetty ensini munuais- (R.

J. Calne et al.: Lancet 1978/2. 1323) ja luuydinsiirroissa (R. L. Powles et al.: Lancet 1978/2. 1327).

Elin- (munuais-, haima-, maksa-, sydån-, keuhko-) ja luuydin-10 siirroissa elinten tai luuytimen hylkimistå voidaan eståå kåyttåmållå syklosporiinia A.

Edelleen syklosporiinia A on kåytetty onnistuneesti joidenkin autoimmuunisairauksien [uveiitin (silmån keksikalvon tuleh-15 duksen), reumaattisen artriitin, psoriaasin ja halvausmaisen lihasheikkouden] hoitamiseen.

Patenttikirjallisuudessa seuraavia mikro-organismeja on kåytetty syklosporiiniseoksen valmistamiseksi: Cvlindrocarpon 20 lucidum Booth. NRRL 5760 (CH-patenttijulkaisu 589.716), Tolv- pocladium inflatum Garns, NRRL 8044 (aikaisemman takso-nomian mukaisesti: Trichoderma polvsporum (Link ex Pers) Rifai patentti julkaisu·603.790) Bissett'in mukaisesti (1983): Tol.

Inflatum W. Garns. 1971 on merkitykseltåån sama kuin Tol.

25 Niveum (Rostrup) sissett comb. mov.) ja Fusarium solani.

MCI-1549, MCI-1550 (JP-hakemusjulkaisu 82 63093). Yllå esite-tyillå mikro-organismeilla suoritetuissa kåymisprosesseissa on saatu syklosporiinien alhaisia tuotantotasoja pitkien kåymisjaksojen jålkeen ja eristetyt saannot ovat olleet myos 30 alhaisia.

Tutkimuksiemme pååmåårånå on ollut sellaisten mikro-organis-mikantojen loytåminen, jotka voisivat tuottaa syklospo-riiniantibioottiseosta tai sen komponentteja korkeissa kon-35 sentraatioissa ja edullisimmissa olosuhteissa kuin edellå mainitut kannat. Analysoitaessa suuri måårå maasta eristetty-jå rihmasienikantoja on loydetty Tolvpocladium-suvun mikro- 3 92603 organismikanta, joka pystyy syntetisoimaan biologisesti syklosporiiniantibioottiseosta. Tåtå mikro-organismia, jota olemme nimittåneet nimellå CY/93, ei voitu identifioida taksonomiatutkimuksissa mihinkåån syklosporiiniseosta tuotta-5 viin sienilajeihin. Tolvpocladium varium species nova CY/93 on Tolvpocladium-suvun uusi taksoni, joka voidaan different!-oida laji-tasolla.

Yllå oleviin loytoihin perustuen keksinnon kohteena on mik-10 robimenetelmå, joka tuottaa liemen, joka sisåltåå suuria kon- sentraatioita syklosporiinia, kåyttåmållå uutta mikro-orga-nismia, Tolvpocladium varium species nova CY/93, joka on talletettu kokoelmaan National Collection of Agricultural and Industrial Microorganisms (valtakunnallinen maanviljelys- ja 15 teollisuusmikro-organismien kokoelma), Budapest, Unkari, numerolla NCAIM(P)F 001005. Kåymisliemi sisåltåå paitsi syklosporiinia A, joka on pååtuote, myos pieniå mååriå syklosporiinia B ja syklosporiinia C.

20 Uuden sienisuvun taksonomisia ominaisuuksia verrattiin Tolv- pocladium-laiin pååtuntomerkkeihin seuraavasti:

Gams on esittånyt ensimmåisen kerran Tolvpocladium-suvun 1971 maaperån Moliniales-lahkon uutena sukuna. Sen luonteenomaisia 25 ominaisuuksia ovat hidas kasvu, tyynymåiset valkoiset pesåk- keet, terminaaliset ja lateraaliset pikkukuromat, jotka kehittyvåt osittain lyhyeen sivuhaaraan ja joissa on voimak-kaasti paisunut kanta ja rihmainen, tavallisesti kaareva kaula, joka pååtyy yksisoluiseen konidioon (kuromaan). Tåsså 30 suvussa Gams on erottanut nyt seuraavat kolme uutta lajia: T\_ . geodes. T. cvlindrosporum ja Ί\_ inflatum. T. geodes :11a on selva Actinomvcetes-twppinen maahaju, kun taas uusi T. varium sp. nov. CY/93 on tåysin ilman sitå. Edelleen Ί\_ geo-des-laiin kantosolut ovat huomattavasti kapeampia kuin Ί\_ 35 varium sp. nov. CY/93-lajin kantasolut. Ί\_ cvlindrosporum-la- jin konidiot ovat luonteenomaisesti pitkiå ja pitkånomaisia, . kun taas Ί\_ varium sp. nov. CY/93-laiin konidiot ovat pallo- 92603 4 maisia ja ainoastaan hieman pitkånomaisia. Ί\. inflatum-laiin konidiot ovat munanmuotoisia ja pitempiå kuin varium sp. nov. CY/93-lajin viljelmåsså havaitut konidiot. T\_ inflatum--lajin pikkukuromia muodostuu luonteenomaisesti kiehkuroina 5 joko suoraan sienirihmoihin tai 2 - 3 μπΐ:η pituisiin kan- tosoluihin. Ί\_ varium sp. nov. CY/93-lajissa ei ole mitåån tållaista kiehkuraista rakennetta, vaan tåmå on havaittavissa ainoastaan ajoittain satunnaisesti. Etupååsså valkoisen pumpulimaisen ilmarihmaston johdosta kaikkien tunnettujen 10 Tolvpocladium-laiien koloniat (pesåkkeet) ovat valkoisia, kun taas kolonioiden takapuolet ovat kellertåvån harmaita, vårit-tomiå tai keltaisia. Mitåån tyyppillisiå liukenevia pigment-tejå eimuodostu. Ί\_ varium sp. nov. CY/93 voidaan erottaa myos tåsså suhteessa: alustalla, joka sisåltåå glukoosia ja 15 peptonia samoin kuin mallasuute-hiivauutetta, muodostuu ajal- lisesti vaihtelevasti tumma, syvån harmaa ja vastaavasti musta pigmentti.

Uuden lajin taksonominen arviointi verrattuna muihin tunnet-20 tuihin Tolvpocladium-laieihin suoritettiin seuraavien julkai- sujen mukaisesti: W. Garns: Persoonia, 6, 185 - 191 (1971); G.

L. Barron: Can. J. Bot. 5R, 439 - 442 (1980) ja Bisett, J.:

Can. J. Bot. 61, 1311 - 1329 (1983).

25 Tolvpocladium varium sp. nov. CY/93-lajin tunnusomaiset ra- kenteet esitetåån lyhyesti seuraavasti: 10-påivåisillå kolonioilla on 10 - 25 mm:n låpimitta, niiden pinta on peittynyt valkoisella, pumpulimaisella, runsaasti 30 itioitå muodostavalla ilmarihmastolla. Kolonioiden takapuoli on kellertåvån harmaa tai likaisen harmaa. Joillakin komp-• leksisilla alustoilla muodostuu tummanharmaa, liukeneva pig mentti. Ilmarihmaston rihmoissa havaitaan sekå terminaalista ettå lateraalista itioiden muodostumista. Pikkukuromia si-35 jaitsee joko yksittåin tai siellå tåållå satunnaisesti kieh kuroina, suoraan rihman påållå tai lyhyiden (2-3 μπι) kan-tosolujen påållå. Pikkukuromat ovat muodostuneet paisuneesta 5 92603 kannasta (2 - 4 x 2 - 3 μπι) ja pitkistå rihmaisesta kaulasta (2 -4x0,5 -0,6 μπι) . Påiden konidiot ovat pieniå (2 - 3 x 1,3 - 2,2 μιπ) , tavallisesti pallomaisia ja sileitå. Erityinen lisånimi "varium" koskee pikkukuromien vaihtelevuutta. Tolv-5 pocladium varium-laiilla on elinaikanaan mååråttyå samankal- taisuutta Haroosporium-suvun kanssa, johon tulemme viittaa-maan toisaalla.

Kanta CY/93 ei voi kåyttåå raffinoosia, mutta se kasvaa hyvin 10 seuraavien hiililåhteiden påållå: mannitoli, inositoli, sak- karoosi, fruktoosi, ramnoosi, galaktoosi, dekstroosi, ara-binoosi ja ksyloosi pintaviljelmåsså. Sen viljelmåt kehitty-våt heikosti ravinto- ja mallasuuteagarin påållå ja hyvin soijajauho-agarin, Czapek-agarin ja peruna-dekstroosiagarin 15 påållå. Kaurajauhoagar ja dekstroosihiivauuteagar eivåt sovellu varastointiin.

Tolvpocladium varium poikkeaa jyrkåsti Tolvpocladium triaono-sporum-laiista. joka muodostaa konidioita, jotka ovat tri-20 gonisia tasokuvassa ja joissa on hieman koverot reunat. To lvpocladium varium poikkeaa myos Tolvpocladium balanoides-lajista. Viimeksi mainittu muodostaa pullomaisia lateraalisia pikkukuroumia. Lisåksi Tolvpocladium varium n. sp.-laiin holotyyppikanta (CY/93) poikkeaa Tolvpocladium inflatumin * 25 (CBS 714.70) autenttisesta kannasta siinå suhteessa, ettå viimeksi mainittu kanta kehittåå runsaan valkoisen ilmarih-maston viljeltåesså maltoosi-agarravintoalustalla, kun taas Tolvpocladium varium sp. nov. CY/93 ei muodosta tållaista ilmarihmastoa. Tolvpocladium inflatum-laiin tållainen kanta 30 tuottaa punertavanruskean endopigmentin sen substraattirih- mastossa rauta-peptoniagarviljelyalustalla, kun taas Tolvpocladium varium sp. nov. CY/93-lajin alustarihmasto pysyy vaaleankeltaisena. Kanta Tolvpocladium varium sp. nov. CY/93 ei kåytå arabinoosia, kun taas Tolvpocladium inflatum kåyttåå 35 sitå. Kåytettåesså natriumnitriittiå viimeksi mainittu kanta kehittåå runsaan rihmaston, kun taas Tolvpocladium varium sp.

« ‘ nov. CY/93 tuskin kasvaa ollenkaan.

92603 6

Lajin Tolvpocladium varium sd. nov. CY/93 vertailu muiden Tolvpocladium-laiien autenttisten kantojen, lajin Trichoderma polvsporum ATCC 16.641 ja Cvlindrocarpon lueidum NRRL 5760 kanssa on esitetty taulukossa I.

« 7 92603

Taulukko 1 ------- e ei eie g

o au zj u a S

t on -u o o *<H ro — -a\ -ado Ό cio τα o όιν e e -h “ ro >- ro ιογ' ro in ro r-~- ra oj u α <r rH U 1—1 o —i o * i—i ^r-tuuvo u g u o u r« · oucnu ^h O Ό q-λ g ~ o ε OT3U α Ό —· o tn ,-m o tn o a-H ^ o. a acr- o.cr'G.or^ o. tu si tn >.·^ >«—i i >ό o >»u 55 , .-HU HHW HHU1H om ^ ΰ jr* o ra o o >o o turn o tu uoi— Τ'p 2: _l·— > i— u o e— uuh mu.*- oi >— Q- < f·γ5 ^

Selluloosan hajottaminen - _ _ - +++ +++

Ilmarihmasto: vihreå tai sinertavan vihrea “ - - +++ +++

Punaisen liukenevan pig- rnentin tuottaminen King- - - +++ , agarin paalla--------

Ruskean pigmentin tuottaminen rauta-peptoniagarin - - paalla__"______

Tummanruskean pigmentin tuottaminen synteettisen " - _ _ +++ glyseroliagarin paalla

Sakkaroosin kåytto +++ +++ +++ +++ +++ - +++.

Inuliinin kaytto - - - +++

Kasvu 5 Crssa +++ +++ +++ +++ +++ — —

Kasvu 37°C:ssa + +++

Keståvyys lampokasittelyn suhteen 50uC:ssa 60 min. +++ _ +++ +++ ajan

Happotuotanto glukoosista +++· +++ + + +++ +++ +++

Natriumsalisylaatin kåytto - - +++ +++

Natriummalonaatin kaytto ++ ++ ++ ++ ++ , ·' Natriumtartraatin kåytto + ++ ++-_++ ++

Liukenevan lilan pigmentin .... . .... - - - +++ +++ tuottaminen tyrosiim- ja leusiiniagarin påållå 92603 8

Yllå oleviin loytoihin perustuen keksinnon kohteena on mene-telmå syklosporiiniantibioottiseoksen ja/tai sen komponent-tien, syklosporiinin A, syklosporiinin B ja syklosporiinin C valmistamiseksi kåyttåmållå aerobisesti rihmaista sienikan-5 taa, joka syntetisoi biologisesti yllå mainittua antibioottia (antibiootteja) ravintoalustalla, joka sisåltåå kåyttokelpoi-sia hiili- ja typpilåhteitå sekå mineraalisuoloja, ja eristå-mållå muodostuneet tuotteet, jonka menetelmån mukaan kasvate-taan Tolvpocladium varium so. nov. CY/93 -kantaa, joka on 10 talletettu kokoelmaan National Collection of Agricultural and

Industrial Microorganisms, Budapest, Unkari, numerolla NCAIM (P) F 001005, tai tåmån mutanttia tai varianttia, joka kyke-nee tuottamaan syklosporiiniseosta tai tåmån komponentteja, syklosporiinia A, syklosporiinia B tai syklosporiinia C, 15 ravintoalustalla, joka sisåltåå hiililåhteitå, orgaanisia ja epåorgaanisia typpilåhteitå samoin kuin mineraalisuoloja, aerobisissa olosuhteissa 25 - 30 °C:ssa ja haluttaessa eris-tetåån ja puhdistetaan tuotettu syklosporiiniantibioottiseos tai sen komponentit.

20 Tåmån keksinnon eråån edullisen suoritusmuodon mukaisesti syklosporiiniantibioottiseos tuotetaan uudesta Tolvpocladium varium sp. nov. CY/93-kannasta. Valittu kanta on erittåin edullinen sen nopean kasvun ansiosta. Kannan eråånå edul-. 25 lisena ominaisuutena on se, ettå se voi kåyttåå hyvåksi sakkaroosia, glukoosia, sorboosia, maltoosia, fruktoosia, tårkkelystå, glyserolia samoin kuin erilaisia rasvoja ja 51-jyjå hiililåhteinå, ja useita orgaanisia ja epåorgaanisia typpilåhteitå, kuten maissin liotusnestettå, peptonia, hii-30 vauutetta, lihauutetta, natriumnitraattia, ammoniumnitraat- tia, ammoniumsulfaattia samoin kuin erilaisia aminohappoja.

i

Yllå mainittujen hiili- ja typpilåhteiden lisåksi syklospo-riiniantibioottiseoksen valmistamiseksi kåytetyt ravinto-alustat voivat sisåltåå myos mineraalisuoloja (kaliumklori-35 dia, magnesiumsulfaattia tai kaliumdivetyfosfaattia), hiven- aineita (kuparia, mangaania, rautasuoloja), edelleen vita-; miineja ja vaahdonestoaineita.

9 92603 Tåmån keksinnon eråån edullisen menetelmån mukaisesti neste-måinen kasvualusta siirrostetaan konidioiden ja rihmaston suspensiolla, joka on valmistettu Tolypocladium varium sp. nov. CY/93-kannan vinoagarviljelysså. 3 påivåå keståvån vil-5 jelyn jålkeen saatua esiviljelmåå kåytetåån antibiootin val- mistukseen kåytetyn alustan inokuloimiseksi, jota inkuboidaan tåmån jålkeen 25 - 30 °C:ssa, etenkin 25 °C:ssa 5-7 påivån ajan. Kåyttåmisen aikana pH pidetåån arvossa 6,0 - 2,5, etenkin 5,2. Kåyttåminen suoritetaan aerobisissa olosuhteissa 10 voimakkaasti sekoittaen (750 - 1000 rpm) ja ilmastamalla 300 1/tunti.

Kåyttåmisen aikana liemen syklosporiinipitoisuutta valvotaan mikrobianalyysin ja suurpainenestekromatografian avulla. He-15 ti, kun maksimaalinen måårå antibiootteja on muodostunut, nåmå otetaan talteen viljelynesteestå tunnetuilla uuttoja/tai adsorptiomenetelmillå.

Liemien syklosporiinikonsentraatio mitataan syklosporiinien 20 antifungisidisen aktiivisuuden perusteella levydiffuusiotes- tisså. Testiorganismeina voidaan kåyttåå edullisesti sieniå Aspergillus niger, Aspergillus iaponicus ja Curvularia lunata [M. DreyfusS et al.: European J. Appl. Microbiol. 3, 125 -133 (1976)]. Liemen syklosporiinikonsentraation HPLC-analyysi .25 suoritettiin lieminåytteistå, jotka oli laimennettu kymmen- kertaisiksi metanolilla [F. Kreuzig, J. Chromat. 290, 181 (1984)]. Kokeittemme mukaisesti pååtuotteena syklosporiinia A ja sivutuotteina syklosporiinia B ja C sisåltåvåå syklospo-riinianti-bioottiseosta tuotetaan suurella saannolla (950 30 μg/ml) uudesta Tolupocladium varium sp. nov. CY/93-kannasta.

10 92605 liemisuodoksen syklosporiinit voidaan uuttaa veteen sekoittu-mattomilla orgaanisilla liuottimilla, kuten etyyliasetaatil-la, n-butyyliasetaatilla, dikloorimetaanilla, 1,2-dikloo-rietaanilla tai kloroformilla, etenkin n-butyyliasetaatilla.

5 Uuttamalla saatu raakatuote sisåltåå epåpuhtautena punaisia ja violetteja pigmenttejå, joita sieni tuottaa ja jotka voidaan poistaa adsorboimalla aktiivihiilellå tai piihappo-geelillå. Mahdolliset lipidiepåpuhtaudet (s.o. vaahdonestoai-ne) voidaan erottaa jakamalla petrolieetterin ja 10 % vettå 10 sisåltåvån metanolin jårjestelmåsså, jolloin epåpuhtaudet siirtyvåt petrolieetterifaasiin.

Vesipitoinen metanolifaasi konsentroidaan alennetussa pai-neessa, sitten vesipitoinen jåånnos uutetaan dikloorimetaa-15 nilla, joka haihdutetaan puhdistetun syklosporiinin tuotta- miseksi. Syklosporiini A voidaan erottaa våhåisemmistå syk-losporiinikomponenteista pylvåskromatografian ja uudelleen-kiteyttåmisen avulla.

20 Eristettyjen tuotteiden rakenne selvitettiin UV-, IR-, 1H-NMR-, 13C-NMR- ja massaspektroskopialla ja aminohappoana-lyysillå.

Seuraavat esimerkit ovat havainnollistavia eivåtkå rajoita 25 mitenkåån keksinnon piiriå.

• ·

Esimerkki 1

Konidio- tai rihmastosuspensio valmistetaan kåyttåmållå 5 ml 30 0,9 %:sta natriumkloridiliuosta Tolvpocladium varium nov. sp.

• CY/93-kannan mallasuute-hiivauute-vinoagarviljelystå. 1 ml tåtå suspensiota kåytetåån steriilin IC-inokulaattialustan (100 ml) inokuloimiseksi 500 ml:n Erlenmeyer-pullossa.

35 IC-alustan koostumus: glukoosia 40 g kaseiini-peptonia 5 g 11 92603 natriumnitraattia 3 g kaliumdivetyfosfaattia 2 g kaliumkloridia 0,5 g magnesiumsulfaattia x 7 H20 0,5 g 5 rauta(II)sulfaattia x 7 H20 0,01 g 1000 ml:ssa vesijohtovettå.

Ravintoalustan pH såådetåån arvoon 5,2 ennen sterilointia ja seosta steriloidaan 121 °C:ssa 25 minuutin ajan. Viljelmåå 10 inkuboidaan 25 °C:ssa pyorivåsså sekoittimessa (340 rpm), sitten 5 ml:n annoksia tåtå inokulaattialustaa kåytetåån 15 500 ml:n Erlenmeyer-pullon inokuloimiseksi, jotka sisåltåvåt kukin 100 ml steriiliå FCl-alustaa.

15 FC^-alustan koosturnus: glukoosia 80 g tryptonia 40 g ureaa 2 g 20 ammoniumsulfaattia 12 g natriumnitraattia 3 g kaliumdivetyfosfaattia 2 g kaliumkloridia 0,5 g magnesiumsulfaattia x 7 H20 0,5 g 25 rauta(II)sulfaattia x 7 H20 0,01 g 1000 ml:ssa vesijohtovettå.

Ravintoalustan pH asetetaan arvoon 5,2 ennen sterilointia ja seosta steriloidaan 121 °C:ssa 25 minuutin ajan.

30 . Pulloja inkuboidaan pyorivåsså sekoittimessa (340 rpm) 25 °C:ssa. Kåymisen aikana liemen antibioottikonsentraatiota valvotaan levydiffuusiotestillå. Testiorganismina kåytetåån Aspergillus niaer-sientå. Liemen syklosporiiniantibioot-35 tiseoksen konsentraatio analysoidaan kåyttåmållå standardina syklosporiinia A.

• » 92603 12 Kåyttåmistå jatketaan 168 tunnin ajan, jolloin liemi sisåltåå 400 Mg/ml syklosporiiniantibioottiseosta. Syklosporiiniseos eristetåån seuraavan menetelmån mukaisesti.

5 Solut, jotka sisåltyvåt 1 1:aan lientå, suodatetaan ja anti- biootit peståån 2 kertaa 200 ml :11a metanolia. Metanolin ve-si-liuos konsentroidaan alennetussa paineessa, sitten anti-bioottiseos uutetaan vesikonsentraatista 2 x 50 ml :11a n-bu-tyyliasetaattia. Liemisuodoksen syklosporiinipitoisuus uute-10 taan 200 ml :11a n-butyyliasetaattia. n-butyyliasetaattiuut- teet yhdistetåån, kuivatetaan vedettomån natriumsulfaatin påållå ja haihdutetaan sitten alennetussa paineessa 40 °C:ssa. 3,7 g saatua raakatuotetta liuotetaan 10 ml:aan metanolia ja siirretåån Sephadex LH-20-geelipylvåån ylåosaan 15 (pylvåan pituus 40 cm, låpimitta 2,5 cm), joka on valmisteltu metanolilla. Sitten lipidiepåpuhtaudet erotetaan eluoimalla metanolilla. Syklosporiiniseoksen sisåltåvåt fraktiot haihdutetaan alennetussa paineessa 40 °C:ssa. Saadun syklosporiiniseoksen (1,05 g) komponenttien erotus suoritetaan kromatogra-20 foimalla piihappogeelipylvåållå, joka on valmistettu 20 g:sta

Kieselgel 40:tå (Reanal, Budapest), eluoimalla kloroformime-tanoli-liuotinseoksilla, jotka sisåltåvåt asteittain kasvavia mååriå metanolia. Eluointi aloitetaan 100 ml :11a kloroformia, sitten jatketaan kloroformimetanoli-seoksilla, joissa jokai-25 sen 100 ml:n annoksen metanolipitoisuutta on lisåtty 0,5 %:lla. Fraktioiden syklosporiinipitoisuutta valvotaan ohut-kerroskromatografialla (levy: Kieselgel 60 F254 / DC Alufoil (Merck), kehitysliuotin: etyyliasetaatti-isopropanoli 95:5, osoitus: jodihoyryt). Syklosporiinit A, B ja C eluoidaan 30 pylvååstå metanoli-kloroformiseoksilla, jotka sisåltåvåt * 2,0%,2,5%ja vastaavasti 3,0 % metanolia. Puhtaat kom ponent it sisåltåvåt fraktiot haihdutetaan alennetussa paineessa, jolloin saadaan 225 mg syklosporiinia A [sp. 137 -140 °C, [ Oi ] D = -189° (metanoli)], 25 mg syklosporiinia B (sp.

35 149 - 151 °C) ja 52 mg syklosporiinia C (sp. 150 - 152 °C).

13 92603

Esimerkki 2 5 1 IC-inokulaattialustaa, jota on steriloitu 121 °C:ssa 45 minuutin ajan 10 l:n laboratoriofermentorissa, inokuloidaan 5 200 ml :11a inokulaattiravisteluviljelmåå, joka on valmistettu esimerkisså 1 esitetyllå tavalla, sitten inkuboidaan 25 °C:ssa, sekoitetaan (750 rpm) ja ilmastetaan 300 l:lla/h ilmaa.

10 Kåyttåmistå jatketaan 72 tunnin ajan, sitten 500 ml tåtå in- okulaattialustaa kåytetåån FC2-alustan (5 1) inokuloimiseksi, jota on steriloitu 121 °C:ssa 45 minuutin ajan 10 l:n laboratoriof ermentorissa .

15 FC2-alustan koostumus: glukoosia 80 g tryptonia 40 g ureaa 2 g 20 ammoniumsulfaattia 12 g natriumnitraattia 3 g kaliumdivetyfosfaattia 2 g kaliumkloridia 0,5 g magnesiumsulfaattia x 7 H20 0,5 g ;25 kupari (II) sulfaattia x 5 H20 0,01 g magnaani(II)sulfaattia x 7 H20 0,01 g rauta(II)sulfaattia x 7 H20 0,01 g 1000 ml:ssa vesijohtovettå.

30 Alustan pH asetaan arvoon 5,2 ennen sterilointia. Inokuloitua : viljelmåå inkuboidaan 25 °C:ssa, sekoitetaan (750 rpm) ja ilmastetaan 300 l:lla/h.

Kåyttåmistå jatketaan yllå esitetyisså olosuhteissa 144 tun-35 nin ajan, kunnes saadaan huippusyklosporiinitiitterit, sitten liemi korjataan.

92603 14

Syklosporiini A eristetåån 4,8 l:sta kåymislientå, joka si-såltåå 500 ^g/ml syklosporiiniseosta, seuraavalla menetel-mållå.

5 Mikro-organismin solut sentrifugoidaan ja syklosporiiniseos peståån soluista 2x1 1:11a metanolia. Metanolin vesi-liuos konsentroidaan alennetussa paineessa, sitten antibioottiseos uutetaan vesikonsentraatista 2 x 250 ml :11a n-butyyliasetaat-tia.

10

Syklosporiiniseos uutetaan kåymisliemen suodoksesta 2 x 500 ml :11a n-butyyliasetaattia. Kaikki n-butyyliasetaatti-uutteet yhdistetåån, kuivatetaan vedettomån natriumsulfaatin påållå ja sitten liuos haihdutetaan alennetussa paineessa 40 °C:ssa.

15 Saadun raakatuotteen (19,2 g) alustava puhdistus suoritetaan kromatografoimalla pylvåållå, joka on valmistettu 100 g:sta Kieselgel 60:tå (hiukkaskoko 0,063 - 0,2 mm), kåyttåmållå kehitysliuottimena kloroformin, metanolin ja asetonin seosta (92:4:4). Syklosporiiniseoksen sisåltåvåt fraktiot (ohutker- 20 roskromatografia-analyysi: levy: Kieselgel 60 F254 , DC Alufoil (Merck), kehitysliuotin: heksaani-asetoni 2:1, osoitus: kloo-ri/tolidiini-reagenssi) haihdutetaan kuiviin. Haihdutusjåån-n5s (5,28 g) kromatografoidaan pylvåållå, jolloin saadaan syklosporiini A. Pylvås valmistetaan 115 g:sta Kieselgel ^25 60:tå (hiukkaskoko 0,063 - 0,2 mm) ja se eluoidaan heksaanin ja asetonin seoksilla, joissa on asteittain kasvavia mååriå asetonia. Syklosporiini A eluoidaan pylvååstå seoksella, joka sisåltåå 23 % asetonia. Haihduttamalla syklosporiinin A sisåltåvåt fraktiot saadaan 1,46 g syklosporiinia A.

30 ' Esimerkki 3

Konidio- tai rihmastosuspensio valmistetaan kåyttåmållå 5 ml 0,9 %:sta natriumkloridiliuosta Tolvpocladium varium nov. sp.

35 CY/93-kannan mallasuute-hiivauute-vinoagarviljelystå ja kåytetåån esimerkisså 1 esitetyn IC-inokulaattialustan (800 ml) inokuloimiseksi ja steriloidaan 3 l-.n Erlenmeyer-pullos- 15 92603 sa. Pulloa inkuboidaan pyorivåsså sekoittimessa (340 rpm) 25 °C:ssa 2,5 påivån ajan, sitten sillå inokuloidaan 5 1 FC3-alustaa, jota on steriloitu 10 l:n laboratoriofermentorissa 121 °C:ssa 45 minuutin ajan.

5 FC3-alustan koostumus: sorboosia 80 g tryptonia 40 g 10 ureaa 2 g ammoniumsulfaattia 12 g natriumnitraattia 3 g kaliumdivetyfosfaattia 2 g kaliumkloridia 0,5 g 15 magnesiumsulfaattia x 7 H20 0,5 g magnaani(II)sulfaattia x 7 H20 0,01 g rauta(II)sulfaattia x 7 H20 0,01 g 1000 ml:ssa vesijohtovettå.

20 Alustan pH asetetaan arvoon 5,2 ennen sterilointia. Inoku- loitua viljelmåå inkuboidaan 25 °C:ssa, sekoitetaan (1000 rpm) ja ilmastetaan 300 l:lla/h.

Kåyttåmistå jatketaan 168 tunnin ajan, jolloin kåymisliemi 25 sisåltåå 600 μg/ml syklosporiiniantibioottiseosta mikrobiana- lyysin perusteella.

Eriståmållå esimerkisså 2 esitetyllå tavalla saadaan 310 mg syklosporiinia A 1 l:sta lientå.

30 ; Esimerkki 4

Konidio- tai rihmastosuspensio valmistetaan kåyttåmållå 5 ml 0,9 %:sta natriumkloridiliuosta Tolvpocladium varium nov. sp.

35 CY/93-kannan (NCAIM(P)F 001005) 5-7 påivåå vanhasta mallas- uute-hiivauute-vinoagarviljelmSsta ja kåytetåån esimerkisså ; 1 esitetyn IC-inokulaattialustan (500 ml) inokuloimiseksi ja » « 92603 16 steriloidaan 3 l:n Erlenmeyer-pullossa. Pulloa inkuboidaan pyorivåsså sekoittimessa (340 rpm) 25 °C:ssa 3 påivån ajan, sitten sillå inokuloidaan 5 1 FC4-alustaa, jota on steriloitu 10 l:n laboratoriofermentorissa 121 °C:ssa 45 minuutin ajan.

5 FC4-alustan koostumus: maltoosia 80 g tryptonia 40 g 10 ureaa 2 g ammoniumsulfaattia 12 g natriumnitraattia 3 g kaliumdivetyfosfaattia 2 g kaliumkloridia 0,5 g 15 magnesiumsulfaattia x 7 H20 0,5 g magnaani(II)sulfaattia x 7 H20 0,01 g kupari (II)sulfaattia x 5 H20 0,01 g rauta(II)sulfaattia x 7 H20 0,01 g 1000 ml:ssa vesijohtovettå.

20

Alustan pH asetetaan arvoon 5,2 ennen sterilointia.

Inokuloinnin jålkeen kåymislientå inkuboidaan 25 °C:ssa, se-koitetaan (1000 rpm) ja ilmastetaan 300 l:lla/h.

25 « Kåyttåmistå jatketaan 144 tunnin ajan, jolloin kåymisliemi sisåltåå 620 μg/ml syklosporiiniantibioottiseosta mikrobiana-lyysin perusteella.

30 Eriståminen suoritetaan esimerkisså 1 esitetyllå tavalla.

Nåin saadaan 305 mg syklosporiinia A 1 l:sta lientå.

Esimerkki 5 35 Konidio- tai rihmastosuspensio valmistetaan kåyttåmållå 5 ml 0,9 %:sta natriumkloridiliuosta Tolvpocladium varium nov. sp. •t CY/93-kannan (NCAIM(P)F 001005) 5-7 påivåå vanhasta mallas- 17 92603 uute-hiivauute-vinoagarviljelmastå ja kåytetåån esimerkisså 1 esitetyn IC-inokulaattialustan (500 ml) inokuloimiseksi ja steriloidaan 3 l:n Erlenmeyer-pullossa. Pulloa inkuboidaan pyorivåsså sekoittimessa (340 rpm) 25 °C:ssa 2 påivån ajan, 5 sitten sillå inokuloidaan 5 l FC^-alustaa, jota on steriloitu 10 l:n laboratoriofermentorissa 121 °C:ssa 45 minuutin ajan.

Inokuloinnin jålkeen kåymislientå sekoitetaan (750 rpm) 25 °C:ssa ja ilmastetaan 300 l:lla/h. Viljellåån 96 tunnin ajan, 10 sitten lisåtåån maltoosin (100 g) steriloitua vesiliuosta ja kåyttåmistå jatketaan 144 tunnin ajan, jolloin liemi sisåltåå 950 μg/ml syklosporiiniantibioottiseosta mikrobianalyysin mukaisesti. Kaikkiaan keråtåån 4,8 1 lientå. Eriståminen suoritetaan esimerkisså 2 esitetyllå tavalla, jolloin saadaan 15 2,75 syklosporiinia A.

Claims (3)

92603 18 Patenttivaatiaukeet:

1. Mikrobinen menetelmå syklosporiiniseoksen tai sen kom-ponenttien, syklosporiinin A, syklosporiinin B ja syklospo- 5 riinin C valmistamiseksi kåyttåmållå aerobisesti rihmasieni- kantaa, joka pystyy syntetisoimaan biologisesti yllå mainit-tua antibioottia (antibiootteja) ravintoalustassa, joka sisåltåå sopivia hiili- ja typpilåhteitå samoin kuin mineraa-lisuoloja, ja eriståmållå muodostuneet tuotteet, 10 tunnettu siitå, ettå kasvatetaan Tolvpocladium varium so. nov. CY/93 -kantaa, joka on talletettu kokoelmaan National Collection of Agricultural and Industrial Microorganisms, Budapest, Unkari, numerolla NCAIM (P) F 001005 ja joka kykenee tuottamaan syklosporiiniseosta tai tåmån kom-15 ponentteja, syklosporiinia A, syklosporiinia B tai syklospo- riinia C, ravintoalustalla, joka sisåltåå hiililåhteitå, or-gaanisia ja epåorgaanisia typpilåhteitå samoin kuin mineraa-lisuoloja, aerobisissa olosuhteissa 25 - 30 °C:ssa ja halut-taessa eristetåån ja puhdistetaan tuotettu syklospo-20 riiniantibioottiseos tai sen komponentit.

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmå, tunnettu siitå, ettå kåyttåminen suoritetaan viljelyalustalla, joka sisåltåå typpilåhteenå peptonia, ammoniumsulfaattia ja/tai 25 tryptonia ja hiililåhteenå glukoosia, maltoosia ja/tai sor- boosia.

3. Tolvpocladium varium sp. nov. CY/93 -kanta, joka on talletettu kokoelmaan National Collection of Agricultural and In- 30 dustrial Microorganisms, Budapest, Unkari, numerolla NCAIM (P) F 001005 ja joka kykenee tuottamaan syklosporiiniseosta tai tåmån komponentteja, syklosporiinia A, syklosporiinia B tai syklosporiinia C. 19 92603