SE448386B - Nya cyklosporinderivat, forfarande for framstellning av dem samt farmaceutisk komposition innehallande dem - Google Patents

Description

is ” - Research) and Development Division), Peoria, Ill., 'USA under kulturnumret i 20 i44slsà6 i 2f eller °“=\ec/" a i H/ 'Cu _ °\CH/,,.,¿\C7H3 (nedan betecknat som isocyklo- * i sporin G) .I förfaranden förfframställning därav och farmaceutiska beredningar, som innehål- ler föreningarna med formeln I. _ Enligt uppfinningen framställer man cyklosporin G, dihydrocyklosporin G- och isocyklosporin G genom att man I a) får cyklosporin G genom att man odlar stammen NRRL 8044' i närvaro V av ett näringsmedium och isolerar çyklosporin G, eller genom att man " b) fâr dihydrocyklosporin 5G genomatt man hydrerar cyklosporin G, eller genom att man . fc), får isocyklosporin G genom att man behandlar cyklosporin G med en syra. i Odlingen enligt förfarande a) kan utföras enligt ii och för sig kända metoder för odling av analoga stammar, t.ex. såsom beskrivs i exempelrl.

En kultur av stammen NRRL 8044 avsvarnparten Tolypocladíum inflatum i Gams har deponerats vid United States *Department of Agriculture (Northern NRRL 8044 och står till allmänhetens förfogande-En annan kultur därav har deponerats vid Fermentation Research Institute, lnage, Chiba City, Japan, under r kulturnumreta FRL FERKM-'P- nr. 2796. Denna stam har tidigare tillordnats svamparten Trichoderma polysporum (Link ex. Pers.) och finns beskriven Lex. i den engelska patentskriften l,49l,509. f ' ' .Cyklosporin G kanaäven isoleras på i och för sig känt sätt, Lex. såsom I emo-v., .mV-w . . . _. >.-l-»..

»QS :N 'Fx \.| “in 10 "15 20 25 30 448 336 3 beskrivs i exempel l. Härvid kancyklosporin G separeras från samtidigt närvarande naturprodukter, t.ex. det mindre polära cyklosporin D, det något* polärare cykloj- sporin A (även känt som S 748l/l7-l), detpolärare cyklosporin B (även känt som S ^ 748l/É-2) och det ännu polärare cyklosporin C. _ Förfarandet b) -Ienligt uppfinningen kan utföras enligt i och för sigkända metoder, t.ex. genomkatalytisR hydrerinig. i ' i ' Som lösningsmedel kommer företrädesvis etylacetat eller* lägre alifatiska - alkoholer, som 't.ex. metanol, etanol och isopropanol, i fråga. Hydreringen sker lämpligtvis i det neutrala omrâdet vid temperaturer mellan 20 och 30°C ochivid atmosfärstryck' eller något förhöjt tryck. Som katalysator kommer platina, företrädesvistpalladium, t.ex._palladium på kol, i fråga. i Syrabehandlingen 'enligt förfarande c) kan utföras enligt i och för' sig käindazmetoder", exempelvismed starka organiskasyror, t.ex. med trífluorättík- syra, företrädesvis metansulfonsymra eller p-toluensulfonsyra. iMängden av den. starka syra som används för isomeriseringen ligger" företrädesvis mellan I och 4 mol per mol cyklosporin G.

*Som lösningsmedel kommer lägre alkoholer, t.ex. metanol, halogenerade _ - kolväten, t.ex. kloroform eller eter, t.ex. dioxan, i fråga.

Reaktionstemperaturen,*kan variera mellan 20 och 65°C, företrädesvis från usfiil5=5°c. i k k i _ i i Cyklosporin. G,_dihydrocyklosporin G och isocyklosporin G utmärks av intressanta kemoterapeïutiska och Kfarmakologiska egenskaper och kan därför användas *som läkemedel. m I l synnerhet utmärks cyklosporin G, dihydrocyklosporin G och isocyklo-m sporineG av en immunosuppressiv och inflammationshämmande verkan.

.Cyklosporin G- utmärks av en utmärkt verkan vid Freund-adjuvans-artrit. iVid etablerad artrit överträffar föreningen till sin verkningsstyrka den i svenska patentskriften 423 720 beskrivna föreningen .S 4781/ F-l, cyklosporin A liksom den ii den svenska patentansökan nr 7805055-6 beskrivna cyklosporin D' (EDjo =- _l4 mg/kg p.o.). 'Dessutom utmärks cyklosporin G av en kraftig immunosuppressiv ._verkan,_ som vid lymfocytstimulationstestet- enligt Jánossy och Greaves (Clin. _ exp. lmmunol. 2,, 483 (1971) och lg, 525 (1972)) överträffar verkan av cyklosporin _ *Dihydrocyklosporin G utmärks av en god antiartritišk verkan. Av särskilt intresse är' emellertid' den' relativt svaga, immunosuppressiva 'verkan av denna förening. I' I I ' i io 15' 20 25k 30* 443385 i f* lsocyklosporin G är till sin antiartritiska och immunosuppressiva verkan' -- _' jâimfrörbart med cyklosporin G. __ i I ' _ F ör de I Helv. Chem. Acta vid sidan av cyklosporin D beskrivna cyklo- _ sporinerna B, "C och E hänvisas inte. till 'någon immunosuppressiv eller antiartritisk verkan. I I i ' ' I eSom läkemedelakan cyklosporin G, dihydrocyklosporin G och isocyklosporin __ G tillföras separat elleri lämplig läkemedelsform. medtarmakologiskt indifferenta hiälpsubstanser. i i r i' Uppfinningen belysesunärmare med hjälp av följande speciella utíörings; exempel, där alla temperaturer är angivna i celsiusgrader.

Exempel _ -V Cyklosporin/Gy i i? 500 liter¿_avf en närlösning, som per .liter innehåller 00 g glukos, 2¶,0"g natriumkaseinat, 2l,5g .ammoniumíosíaß 5g MgSOuJHzO, Zg KHzPOwaêg NablOa, 0,5 g KCI, 0,01 g -FeßOß och avmineraliserat vatten, ympas med 50 liter av - "en íörkultur av stammen NRRL 80144 och inkuberas v13 dagar vid 27° ilen, stâlíermentor under omrörning (170 varv/min) och luftning (l liter luft/mini/liter inäfiösning) (se Dos 2352:59). i Kulturbuljongenrrörs, ut med samma mängd n-butylacetat, och efter separation av den organiska fasen koncentreras denna i vakuum och råextraktet avíettas genom 3-stegsfördelning mellan metanol-vatten (9:1) och petroleumeter., Metanolíasen separeras, koncentreras 'i vakuum och råprodukten utíälls genom _ tillsats av vattenfDet efter filtrering utvunna materialet kromatograferas på 5-7- faldiga mängden [email protected],med metanol som elueringsmedel. Spetsíraktio- ' nerna kromatograferas sedan på _'!K'ieselgel 60", kornstorlek 0,063 - 0,2 mm (Merck) med hexan-aceton (2:l), :varvid de* först eluerade fraktionerna övervägande innehåller cyklosporin A och cyklosporin D, och de senare eluerade andelarna "övervägande cyklosporin' C. För ytterligare rening kristalliseras de cyklosporin A- Woch D-haltiga fraktionernarg ur 2- *till 2,5-ialdiga mängden aceton vid -150 och » separeras sedan- ytterligare genom kromatografi på "Kieselgel 60", kornstorlek i 07,063 - »0,2 mm (Merck) tvyâ~ gånger, varvid de med hexan-aceton (Zzllförst eluerade fraktionerna innehåller cyklosporin D i. kraftigt anrikad form. Dessa löses i dubbla mängden aceton och får kristallisera vid -l5°. Det därvid erhållna råkristallisatet består av mycket kraftigt anrikatf cyklosporin D, och moderluten innehåller förutom cyklosporin' D ytterligare 'komponenten däribland cyklosporin G. För utvinning av cyklosporin G kromatograferassden till torrhet indunstade moderluten på "Kieselgel 60",_kornstorlek 0,063 - 0,2 mm (Merck) med gvattenmättat etylacetat, varvid *de 4G; (u 10. 105 V20 25 30 rä; “KT s Bruttoformel: C j44s 385 5__ .först 'elueradegfraktionerna innehåller cyklosporin D; och de senare' eluerade fraktionerna cyklosporin G i.b_landning_ vid sidan av ytterligare komponenter. För ytterligare anrikning kromatograferas blandningen först på "Kieselgel 60", korn- - storlek 0,063 - 0,2 mm (Merck), med kloroform-metanol (98:'2) och därefter för * uppseparation* medahexan-aceton _(2:l)_. Därvid innehåller (de _senare eluerade fraktioner-na cyklosporin G i mycket kraftigt anrikad form. För renuitvinning kristalliseras cyklosporin. G-andelarna två gånger ur eter-petroleumeter (lzl) vid' rumstemperatur, vilket-ger tunnskiktskromatografiskt enhetligt, rent (renhetsgrad - 7>95%) cyklosporin G-som färglösa polyedrar med smp. 193 - 1900 (efter torkning - av kristallerna i hlögvakuum vid 800- under 2 timmar). [a] âo -=: _2056 (c =“l,00i kloroform) ' a -1-91° (c = 1,04 1 metanol) ' .Lill-spektrum i metanol: Ändabsorbtion- lR-spektrum i metylenklorid: se fig.l _ _ - lH-NMR-spektrum i CDCIB, 90 MHz, tetrametylsilan som inre standard: se fig.2.' 63-"1135111012 i Exempel- 2: Dihydrocyklosporin G .700 ring. palladium-kol (1096 palladium) förhydreras i 20 ml etanol under 30 ' minuter. Till denna suspension avïpalladíumkatalysatorn sätts en lösning av 14,55 g cyklosporin G i 60 ml etanol, varefter "man vid 210 och ett tryck av 742 mm kvicksilverpelare hydrerar, tills väteupptagningen upphört. Därefter frånfiltrerar manrskata-lysatorn och indunstar .filtratet i vakuum- vid 20 till 400 till torrhet.

I Återstoden» består av tunnskiktskromatografiskt enhetligt dihydrocyklosporin G i form av ett vitt amorft pulver med 'smp. 150 - 1530 (efter torkning i högvakuum 'under li timmar", vid 80%.

Bruttoformel: CGBHI UNI 1012 _ »IOLJÉO =a _z32° (c = 9,61: G1 kiomform) (UV-spektrum i metanol: Ändabsorbtion I ' lR-spektrum i metylenklorid: se fig. 3 I lH-NMR-spektrum iICDCl3, 90 MHz, tetrametylsilan som inre standard: se fig. Ål.

Exempel 3:_ Isocyklosporin G ' Till en lösning av 6,08 g çyklosporin G i 40 ml absolut dioxan sätter man i i “ ” a _ .. . o en lösning av' l,20 gmetansulfonsyra i 20 ml dioxan och håller blandningen vid 50 ' under uteslutning av fuktighet. -Reaktionsförloppet följsi tunnskiktskromatograrn i 443385? 10 v15 f Bruttoformel: C 311? =1}-19e° rg: oflzi kmfoform) i i 6 _ ßfPolyrgrzíam SILflG"-íolier, kloroíiorm-mefiánoi-isättika (90:6:4)r, jodånga för visuali- ' i_ seringenj. Efter 16 timmar kyler man till. rumstemperatur. Genom tillsats av 1,l3 g vaftenfritt' natriumacetef neutralriseras syran, och efter omrörning i 45 minuter avsgigs det utsk-ilda saltet och filtratet indunstas i vakuum vid 450. Återstoden på >8,l g kírsomatogràferas på 7500 g kiselgel, Merckßfkornstorlek 0,063 -0,2 mm, varvid man för eluering”använder”kloroform-metanol (98:2). De fraktioner som praktiskt taget består av *rent isocyklosporin G slås samman, indunstasuí vakuum vid 50° och återstoden krístallíseras ur eter vid +70, 'varvid man får isocyklosporin G med smp. 1431- 1462 í “ e_ i ea"11sNu°12_ -1280- (c ='0,'7É i metanol) _ UV-spektrum i metanol: Ändahsorption IR-spektrum i metylenklorid: se fig. 5; _ lH-NMRfspektrum 'i CDC13,*9O MHZ, tetrametylsilan som' inre' standard: se íig. 6. 4: (Jo (lm

Claims (2)

'Av “m av 7 í RATENIKRAV

1. i Nya cyklosporín-derivat med formeln! “' ' W -cu í _cu;\c¶H/cr4: ÉH: I çH¿,\ _/cH; '| 2 CH; Cu, <|:Hf tlïhlz CH: cua-N-clzfi-Pco-rh CH Å C0-N-C'*-C-'N-CH2 ' L |_ I n. ll I H 0 _ co CN: ï cc I CH-CH-z-CH L en; - - » N-ci-a, 1 c _ u, N i H 9 o H ,o - L | L II 1 |- \ Oc-cH---Nf-co-cH-N-cof-cH-N-c-ÉH-N-CO-ïH CH3 _ H CHj CHgy CH; /Ci ïH2 - - CH; CH: CH GQ çu/3 \(:H; CH; CH: fdäruA befecknar' Cliaš /H c å! u' \cg2 7 _ . ¶| (cyklosporm G) Ho ch' , I: CH/""\.CH | -fllï-N CH_. 0 'L eller °'."?\¶ EH: CH: _ , \_ïH; (dlhydrocyklosporin G) HO '/CH fpu W \cn; CH: _ I | f eller -cf-N CH- 443 ass 4431386 8 en, H \ X C , , / . ' H _ 1 >. . ;\ï"2 (ßocyklosporm G) O ' ca '- f Sea "I"\cn -c HN-ècu- || | L - CHa

2. , Förfarande_ för frakmstâfining av cyklos§oríh G med formeln I, - CH3\ /CH3_ -V ' , '_ , V ' ICH3 c" ¶ í í en CHJ\ /CHQ i I 2 GHz, "CHå ïfl _ _ _ CH; CH; CHj-N-CH-Co-N ca . A co-¥~-c.~«_-c-~-cu¿ z L l- , I L ll _ Å ' H o ¶ co ¶ ¶ ¶ ¶ ¶ CH; i V' _ i i CO cH-cuz-cn u. - 1 ” j ~ ' 7 I °“3' ,.> 1 ' ' ' - N-ca, CHQf-N ' _ ' » H o ' H _ ' O _ I. ' .L- I. I L -V oc-CH-N-co-cu-N-co-ïn-N-fc-cu-N-co-cn ' . | CH H ca cH en cH cm' a _: i I 2 J / \ I 2 en CH” C83 en / ' '~ /'\ CH; \CH: ' CH; CH: I där A betecknaf °"=\ /" \ C "å "/ \ï"2 1 Ho ~c+k \ X flmcH (Û)\c“} °.~= I -_ ...-... th. 10 448 ss6 9 dihydrocyklosporin Gmed formeln I, där A betecknar i ll Li o _och isdcyklosporin G med formeln I, där Å betecknar CH, i u \ / c, å i 7"/ ,\Tfl2 CH i / ' aæcn ""\cu;, v-C HNf-»Cybh- ,|| _| L °_ ica; ik ä n n_ e f: .e c k n a t .air att man odlar stammen NRRL 8044 av svamparten Tolypocladium inflatum rGamsd i närvaro av ett näringsmedium, isclerar det erhållna cyklosporin G ur kulturhqljongen och, för framställning av dihydrocyklo- sporiniG hydrerar (eller, för framställning av isocyklosporin G", behandlar med en syra. 3; Läkemedelsferms för immunosuppressiv och inflammationshämmande be- handling, _ k ä n n e t e c k n a d av) att den som aktiv substans innehåller cyklosporin G med formeln I, É44s?ss6 LO cu¶ >7 ' °\ /°"”_ - en |' C543 V CH; ' ïHQ CH: , 'CH *CHJ-N-CH-Co-N < fcH Å L L , cb u CH; cn-ca,-en Lif CH3 ' CHS-*N _' - . H L CHJ Ü i Cfl; ' ' CH: 'V CH; CH I \ CH; CH; I där' A betecknar' .o __ 0 f . L , || L, OC-VCl-(íN-CVQ- C|.|_..,N._CQV__CH_:>.N__C_-CH ._.~_CO.....CH CH; CH; CO-Né-CH-c-'N-cr-n, CO N-cu, L / CH; CH; I C CH3' 7.4 :D f. 2 fÜf % íe f eeíe 448 386 ' ~1 1. eller isocykulošporin G rhed formeln I, där A betecknar tillsemmans-med ferzrfiakqlpgiskt,indifjerepta hjälpSubstanser.