FI91083C - Menetelmä geenien ilmentämiseksi hiivassa, ja DNA-sekvenssejä sekä plasmideja, jotka käsittävät kyseisiä DNA-sekvenssejä käytettäviksi menetelmän toteuttamiseksi - Google Patents

Description

i 91083

Menetelmå geenien ilmentåmiseksi hiivassa, ja DNA-sekvenssejå sekå plasmideja, jotka kåsittåvåt kyseisiå DNA-sekvenssejå kåytettåviksi menetelmån toteuttamiseksi

Keksinto koskee uutta menetelmåå geenien ilmentåmiseksi hiivassa, ja DNA-sekvenssejå kuin myos plasmideja, jotka sisål-tåvåt mainittuja DNA-sekvenssejå kåytettåviksi menetelmån toteuttamiseksi .

Kuvauksessa kåytetåån muun muassa seuraavia ilmaisuja:

Promoottorialue: DNA-sekvenssi, joka sisåltåå promoottorin ja kohdesekvenssejå RNA-polymeraasia vårten sekå mahdollisia ak-tivointialueita, jotka sisåltåvåt kohdesekvenssejå trans-kriptionaalisia sååtelyaineita vårten.

Sååtelyaine: Aineita, jotka toteuttavat tai vålittåvåt sååte-lytoimintaa. Nåin olien sååtelyaineet sisåltåvåt myos aineita, jotka vaikuttavat sååtelytoimintaa toteuttavien tai vålittåvi-en aineiden konsentraatioon.

Esisekvenssi (signaalisekvenssi): Yleenså tarkoitetaan DNA-sekvenssiå, joka kopioidaan mRNAihan, mutta jota sekvenssiå ei edelleen siirretå (lueta) proteiiniin. Esisekvenssi kåsittåå nåin olien DNA-sekvenssin kopioinnin aloituksesta ATG-luennan aloituskodoniin. Esillå olevan keksinnon suhteen tållå tarkoitetaan lyhyttå DNA-sekvenssiå, jossa tyypillisesti on 40-70 emåsparia, ja joka kåsittåå kohdesekvenssejå posttranskriptio-naaliselle sååtelylle, jota toteuttaa tai vålittåå solunsisåi-nen hemi.

Lisåksi kåytetåån seuraavia ilmaisuja, jotka yleenså ovat tun-nettuja henkilSille, jotka tuntevat molekyylibiologian alaa.

2 CAP-liitospaikka: Paikka, jossa 7-metyyli-GTP lisåtåån vastaa-vaan mRNA:han.

DNA-sekvenssi: Lineaarinen nukleotidien joukko, joita yhdis-tåvåt toisiinsa fosfodiesterisidokset vierekkåisten pentoosien 3' - ja 5' -hiiliatomien vålillå.

Ilmeneminen: Prosessi, jonka rakennegeeni låpikåy polypeptidin tuottamiseksi. Se on transkription (kopioinnin) ja translation (luennan) kuin my6s mahdollisten posttranskriptionaalis-ten modifikaatioiden yhdistelmå.

Edeltåvåt alueet: DNA-sekvenssejå, jotka edeltåvåt koodaavia alueita. Edeltåvåt 5'-alueet sisåltåvåt promoottorin. Edeltåvåt 3' -alueet voivat sisåltåå transkriptionaalisia lopetta-missignaaleja jne.

Geeni: DNA-sekvenssi, joka koostuu kolmesta tai neljåstå osas-ta, (1) geenituotetta koodaava sekvenssi, (2) promoottorialu-een sekvenssit, jotka sååtelevåt sitå ilmeneeko geeni vai ei, (3) ne sekvenssit 3'-pååsså, jotka sååtelevåt transkriptionaa-lista lopettamista ja valinnaista polyadenylaatiota sekå mah-dillisesti (4) vålisså olevat sekvenssit.

Vålisekvenssit: DNA-sekvenssit geenin sisållå, jotka eivåt koodaa mitåån peptidikappaletta. Vålisekvenssit kopioidaan esi-mRNA:han ja ne eliminoituvat prekursori-RNA:n modifikaa-tion kautta mRNArhan.

Kloonaus: Prosessi, jossa saadaan organismien tai DNA-sekvens-sien populaatio, joka on låhtåisin yhdestå sellaisesta or-ganismista tai sekvenssistå suvuttoman lisååntymisen kautta, tai erityisemmin:

Prosessi, jossa eristetåån tietty organismi tai osa siitå, ja tåmån alafraktion lisååminen (kasvattaminen) homogeenisena populaationa.

II

3 91083

Koodaava sekvenssi: DNA-sekvenssi, joka mååraå polypeptidin aminohapposekvenssin.

Låhetti-RNA (mRNA): RNA-molekyyli, joka muodostetaan geenin kopioinnin tai prekursori-RNA:n mahdollisen modifikaation kaut-ta. mRNA-molekyyli vålittåa geneettisen viestin måårååmållå polypeptidin aminohapposekvenssin mRNA-molekyylin tullessa osittain siirretyksi (luetuksi) mainittuun peptidiin.

Nukleotidi: DNA:n tai RNA:n monomeerinen yksikko, joka kasit- taa sokeriosan (pentoosi), fosfaatin, ja typellisen hetero-syklisen emaksen. Emas on kytkeytyneena sokeriosaan glykosidi-sella sidoksella (pentoosin l’-hiili), ja tama emaksen ja soke-rin yhdistelmå on nukleosidi. Emas tekee nukleotidista tunnus-omaisen. Nelja DNA-emasta ovat adeniini (A)f guaniini (G), sytosiini (C), ja tymiini (T). Nelja RNA-emasta ovat A, G, C ja urasiili (U).

plasmidi: Ei-kromosomaalinen, kaksijuosteinen DNA-sekvenssi, joka kasittaa kasittelemattoman replikonin, sellaisen, etta plasmidi replikoituu isantasolussa. Kun plasmidi saatetaan yksisoluisen organismin sisaan, muuttuvat tai transformoituvat sen organismin ominaisuudet plasmidin DNA:sta johtuen. Esimer-kiksi plasmidi, jossa on tetrasykliinin resistenssin geeni (Tc ), transformoi solun, joka aikaisemmin oli herkkå tetra-sykliinille, sellaiseksi, joka on siile resistentti. Plasmidin transformoimaa solua kutsutaan transformantiksi.

Polypeptidi: Aminohappojen lineaarinen joukko, jotka ovat kytkeytyneet toisiinsa peptidisidosten valityksella vierekkais-ten aminohappojen a-amino- ja karboksiryhmien valilla.

Rekombinaatio: Uuden DNA-molekyy1 in syntyminen eri alkuperaa olevien DNA-sekvenssien yhdistymisen kautta.

Replikointi: DNA-molekyylien kopiointiprosessi.

4

Replikoni: Itse-replikoiva geneettinen elementti, jossa on låhtdkohta DNA-replikoinnin kåyntiinpanolle, ja geenit, jotka spesifioivat toimintoja, jotka ovat vålttåmåttomiå repli-koinnin ohjaamiseksi.

Restriktiokappale: DNA-sekvenssi, joka muodostuu kaksijuostei-sesta katkaisemisesta entsyyxnillå, joka tunnistaa spesifisen kohde-DNA:n sekvenssin.

RNA-polymeraasi: Entsyymi, joka toteuttaa DNA:n kopioinnin RNArksi.

Transformaatio: Prosessi, jossa solu ottaa vastaan plasmidin.

Translaatio (luenta): Prosessi polypeptidin tuottamiseksi mRNA:sta tai prosessi, jossa mRNA-molekyylisså låsnå oleva geneettinen informaatio mååråå spesifisten aminohappojen jår-jestyksen polypeptidin synteesin aikana.

Transkriptio (kopiointi): Menetelmå vastaavan RNA-sekvenssin syntetisoimiseksi DNA-sekvenssistå.

Vektori: Plasmidi, faagi-DNA tai muut DNA-sekvenssit, jotka pystyvåt replikointiin isåntåsolussa, ja joilla on yksi tai pieni måårå endonukleaasin tunnistuspaikkoja, joissa DNA-sek-venssit voidaan katkaista mååritettåvisså olevalla tavalla ilman siihen liittyvåå DNA:n biologisen toiminnan oleellista menetystå, esim. replikaation, kuoriproteiinin tuottamisen tai promoottorin tai sidospaikkojen menetystå, ja jotka sisåltåvåt markkerin, joka on sopiva kåytettåvåksi transformoitujen solu-jen identifioinnissa, esimerkiksi tetrasykliiniresistenssin tai ampisilliiniresistenssin muodossa. Vektoria nimitetåån usein kloonausvålineeksi.

Biologisesti aktiivisen tuotteen tuottaminen yhdistelmå-DNA-tekniikan avulla on monimutkainen asia, johon kuuluu monia

II

5 91083 prosessivaiheita kopioinnin kåyntiinpanemisesta biologisesti aktiivisen molekyylin lopulliseen toteuttamiseen.

Monia nåistå prosessivaiheista ei esiinny prokarioottisilla organismeilla, mikå on syy siihen, miksi eukarioottisia tuo-tanto-organismeja tåytyy kåyttåå monissa tapauksissa. Hiiva on eukarioottinen organismi, jonka synteesiaparaatti kåsittåå monia prosesseja ja sååtelymekanismeja, jotka ovat ominaisia korkeammille organismeille. Hiivasoluilla on lisåksi lyhyt generaatioaika ja hiivan kåytolle on olemassa tuhatvuotinen kokemuspohja viljeltåvånå organismina.

Tåysin ratkaisevia tekijditå halutun geenituotteen biologisen synteesin kannalta ovat transkriptionaalisen kåyntiinpanon mahdollisuus ja parantaminen sekå transkriptionaalinen ja posttranskriptionaalinen sååtely geenin ilmentåmisesså.

Nåitå toimintoja toteuttavat pååasiassa edeltåvåt 5'-alueet. Suuri joukko prokarioottisten ja eukarioottisten geenien 5'-alueista on sekventoitu, ja muun muassa siihen perustuen on hankittu laaja tietåmys geenin ilmenemisen sååtelystå ja ala-alueista ja sekvensseistå, jotka ovat tårkeitå geenin ilmenemisen sååtelylle. Sååtelymekanismissa on suuria eroja prokari-oottisissa ja eukarioottisissa organismeissa, mutta nåiden kahden ryhmån sisållå esiintyy monia yhteisiå piirteitå.

Geenin ilmenemisen sååtely voi tapahtua transkriptionaalisella tasolla, ja silloin se tulee edullisesti nåkyviin transkrip-tion kåyntiinpanofrekvenssin sååtelyn kautta. Viimeksi mainit-tu on hyvin tunnettua, ja sitå kuvailee muun muassa Benjamin Lewin, Gene Expression, John Wiley & Sons, vol. I, 1974, vol.

II, toinen painos 1980, vol. Ill, 1977. Vaihtoehtoisesti såå-telyå voi tapahtua posttranskriptionaalisella tasolla, esimer-, . kiksi translaation kåyntiinpanon frekvenssin sååtelysså trans-laationopeudessa ja translaation lopettamisen sååtelysså.

6

Leghemoglobiinit ovat monomeerisiå hemoproteiineja, joita yk-sinomaan syntetisoituu juurinystyroisså, joita kehittyy Rhizo-biabakteerien ja hernekasvien symbioottisen yhteyden kautta. Looginen kandidaatti sååtelyaineeksi, joka aktivoi leghemoglo-biinigeenejå, on Rhizobiassa tuotettu hemi, joka muodostaa leghemoglobiinien prosteettisen ryhmån. Useiden hemoproteiini-en synteesiå Saccharomyces cerevisiae-hiivassa sååtelee myos solunsisåisen hemin taso, joka hemi muodostaa my6s nåiden pro-teiinien prosteettisen ryhmån. Nåin olien isosytokromi c-gee-nin transkriptio on hemistå riippuvainen, kun taas katalaasi T,:n tapauksessa hemisååtelyå tapahtuu sekå transkriptionaali-sella ettå posttranskriptionaalisella tasolla.

Esillå olevan keksinnon mukaisesti tuodaan esille soijapavun neljån leghemoglobiinigeenin, Lba, Lbcl, Lbc2 ja Lbc3 edeltå-vien 5'-alueiden sekvenssit. Sekvenssit esitetåån oheisessa sekvenssikaaviossa, kaavio 1, jossa sekvenssit on asetettu ri-viin siihen tapaan, ettå homologia nåkyy selvåsti.

Sekvenssikaaviossa osoittaa, ettå mikåån emås ei ole låsnå kyseesså olevassa paikassa. Geenien nimet ja emåksen asema laskettuna vastavirtaan ATG-låhtokodonista ovat esitettyinå sekvenssikaavion oikealla puolella. Lisåksi tårkeåt sekvenssit on alleviivattu.

Kuten kåy ilmi sekvenssikaaviosta, on olemassa selvå homologi-an aste neljån edeltåvån 5'-alueen vålillå, ja asemassa 23-24 emåsparia vastavirtaan CAP-liitospaikasta ne kaikki sisåltåvåt TATATAAA sekvenssin, joka vastaa "TATA" kehystå, joka eukari-oottisissa soluissa sijaitsee tavallisesti vastaavan måårån emåspareja vastavirtaan CAP-liitospaikasta kohdalla. Edelleen CCAAG-sekvenssi on låsnå kohdalla 64-72 emåsparia vastavirtaan CAP-liitospaikasta mainitun sekvenssin vastatessa "CCAAT" kehystå, joka tavallisesti sijaitsee 70-90 emåsparia vastavirtaan CAP-liitospaikasta. CAP-liitospaikasta translaation låh-t5kodoniin, ATG:hen, on låsnå esisekvenssejå, joissa on 52-59 emåsparia, ja niillå on selvå homologia-aste noin 75-80 %.

I) 7 91083

Esillå olevan keksinnSn mukaisesti on edelleen osoitettu Lbc3:n ollessa esimerkkinå, ettå soijapavun leghemoglobiini-geenien edeltåvåt 5'-alueet ovat toiminnallisesti aktiivisia hiivassa. Viimeksi mainittu on osoitettu yhdiståmållå E. Colin kloramfenikoliasetyylitransferaasi (CAT)-geeni soijapavun Lbc3-geenin edeltåviin 5'ja 3'-alueisiin sellaisella tavalla, ettå CAT-geenin ilmenemistå ohjaa Lb-promoottori. Yhteensulau-tettu sekvenssi sijoitettiin hiivan plasmidivektoriin, YEP 24, joka sisålsi hiivan URA-3-geenin valintamarkkerina. Hiivakanta S. cerevisiae TMI, joka on URA-3 ja kykenemåton syntetisoimaan hemiå mutaation johdosta δ-aminolevuliinihapposyntetaasi gee-nisså, δ-ALA, transformoitiin mydhemmin muodostuneella konst-ruktiolla. Transformoiduissa hiivasoluissa ilmeni CAT-aktiivi-suutta kaikissa testatuissa kasvuolosuhteissa. Sen tåhden voi-daan tehdå johtopååtds, ettå soijapavun leghemoglobiinigeenien edeltåvåt 5'-alueet ovat toimivia hiivassa.

Esillå olevan keksinndn mukaisesti on lisåksi osoitettu, ettå edeltåvåt 5'-alueet toimivat kohteena sååtelylle, jota intra-sellulaarinen hemi toteuttaa tai vålittåå. CAT-aktiivisuus on nåin olien 20-40 kertaa korkeampi hiivassa S. cerevisiae TMI, joka on kasvanut δ-ALArn låsnå ollessa, kuin CAT-aktiivisuus hiivassa, joka on kasvanut ilman tåtå hemiprekursoria kasvu-alustassa. Samanlaisia korkeita CAT-aktiivisuuksia oli låsnå hiivassa S. cerevisiae TMI, joka oli kasvanut hemin, protopor-fyriini IX, tai hemianalogin, deuteroporfyriini IX, låsnå ollessa. Hemin vaikutus CAT-aktiivisuuteen on spesifistå, koska URA-3-geenituotteen måårå pysyy vakiona kaikissa testatuissa olosuhteissa. Edelleen transkriptionaalinen taso ei ilmeisesti muutu hemin låsnåolon johdosta, koska CAT-mRNA-taso pysyy vakiona riippumatta muutoksista solunsisåisen hemin konsentraa-tiossa. Sen vuoksi voidaan pååtellå, ettå hemin toteuttamaa tai vålittåmåå sååtelymekanismia esiintyy posttranskriptionaa-lisella tasolla.

Keksinn6n oleelliset tunnusmerkit on esitetty oheisissa patentt ivaatimuksissa.

8 CAT-aktiivisuuden havaittu lisååntyminen riippuu proteiinisyn-teesistå. CAT-entsyymin puoliintumisaika on lisåksi riippumaton hemin låsnåolosta, eikå hemi stimuloi CAT-aktiivisuutta in vitro. Sen vuoksi hemi mitå todennåk6isemmin sååtelee geenin ilme-nemistå translaationaalisella tasolla. Lbc3:n edeltåvån 5'-alu-een yhtymistå neomysiinifosfotransferaasi (neo) geenin koodaa-vaan alueeseen ohjaa hemi tåysin samalla tavalla kuin CAT-gee-niå, joka yhtyi Lbc3-geenin edeltåvåån 5'-alueeseen. Hemin vai-kutusta ei nåin olien vålitå hemi, joka vuorovaikuttaa koodaa-van sekvenssin kanssa, vaan pikemminkin hemi, joka vuorovaikuttaa edeltåvien 5'- ja 3'-Lbc3-sekvenssien kanssa, jotka ovat låsnå CATmRNA:ssa. Geenin ilmenemistå, joka geeni sisåltåå vain edeltåvån 5'-alueen ja neo-geenin, ohjaa hemi samalla tavalla Solunsisåisen hemin vaikutus geenin ilmenemiseen voidaan nåin olien saada vålillisesti aikaan vuorovaikutuksella esisekvens-sin kanssa.

Lyhyet esisekvenssit eivåt sisållå translaation låhtokodoneja. Solunsisåisen hemin toteuttama tai vålittåmå sååtelymekanismi ei sen vuoksi liity låheisesti sååtelymekanismeihin, jotka kos-kevat vååriå låhtokodoneja, vrt. julkaisua Hunt, T., Nature, vol. 316, 580-581 (1985). Sååtelymekanismia, jota kuvaillaan esillå olevan keksinndn yhteydesså, toteuttaa tai vålittåå hemi, joka vuorovaikuttaa esisekvenssin kanssa, ja se on sen vuoksi uusi sååtelymekanismi.

Plasmidien låsnåolo solussa, joka on låsnå luonnollisessa ym-påristosså, antaa solun kåytt5Sn ominaisuuden, joka on solulle edullinen vain tietyisså olosuhteissa. Plasmidin koodaamia omi-naisuuksia voi esimerkiksi olla resistenssi antibiootille, jota on låsnå ympåroivåsså ympåristosså. Plasmidin låsnåolo ja plasmidin koodaamien geenituotteiden synteesi kuormittavat kuiten-kin solun energia-aineenvaihduntaa ja proteiinisynteesiapa-raattia, ja solu, joka sisåltåå plasmidin, syrjåytyy pois ja håviåå ympåriståsså, jossa ei tarvita plasmidin koodaamia omi-naisuuksia.

Edellå mainittu epåstabiilisuus lisååntyy lisåksi kåyttåmållå plasmideja vektoreina halutun geenituotteen synteesiå vårten,

II

91083 9 jota kyseinen solu ei tavallisesti tuota. Viimeksi mainittu merkitsee sita, etta solut, jotka syntetisoivat sellaisia tuot-teita, on saatettava selektiopaineeseen, sen varmistamiseksi, etta haluttua geenituotetta voidaan silti syntetisoida. Aikai-sempi menetelmå tietyn geenituotteen suuren ilmenemisen saa-vuttamiseksi on se, etta ilmenetnistå såatelee voimakas promoot-tori, joka aiheuttaa suuren mRNA-konsentraation luetuksi tulemi-sen kyseiseksi geenituotteeksi.

Geenituotteen suuri konsentraatio voidaan kuitenkin saavuttaa myos kyseisen mRNA:n tehokkaammalla translaatiolla. Viimeksi mainittu merkitsee sita, etta geenituotteen synteesia ohjataan seka transkriptionaalisella etta translaationaalisella tasolla, mika merkitsee sita, etta soluun kohdistuva geneettinen kuor-mitus, joka solu syntetisoi tiettya geenituotetta, voidaan jakaa kahden aktiviteetin osalle yhden sijasta kuten tavallisesti.

Mainittuja kahta aktiviteettia voidaan sen vuoksi manipuloida sellaisella tavalla, etta sama tulos geenituotteen konsentraation suhteen voidaan saavuttaa, vaikka promoottori ei ole niin voimakas kuin tavallisesti kaytetyt promoottorit. Sellainen kahden aktiviteetin jakautuminen merkitsee sita, etta solu ei ole niin geneettisesti kuormitettu kuin silloin, kun geenituotteen synteesia ohjaa vain yksi voimakas promoottori. Taman seurauksena voidaan kyseiseen soluun kohdistuvaa selektiopainetta vahentaa.

On lisaksi tarkeaa saada energia-aineenvaihdunnan ja proteiini-synteesiaparaatin kaytto solun kannalta jarkevimmåksi siinå vaiheessa, jossa halutun geenituotteen synteesia tapahtuu. Sellainen rationaalinen energia-aineenvaihdunnan ja proteiini-synteesiaparaatin kayttaminen saatetaan edullisesti paremmaksi optimoimalla geenituotteen synteesin myohempia vaiheita mieluum-min kuin optimoimalla varhaisia vaiheita.

Tarkea geenin ilmenemissysteemin piirre on sen vuoksi se, etta halutun tuotteen ilmenemista voidaan lisata, alkujaan alhaisesta 10 ilmenemisestå ylituotantoon, manipuloimalla solun ulkoista elinympåristoa, kuten esilla olevassa keksinnossa tuodaan julki. Edelleen, posttranskriptionaalisten synteesivaiheiden indusoi-va optimointi - mika on tuotu julki esilla olevassa keksinnossa - on edullisempaa kuin transkription indusoitu optimointi.

Aikaisemmissa menetelmisså geenien ilmentamiseksi hiivassa kåytetåån joukkoa promoottoreja ja ekspressiovektoreita, vrt. esimerkiksi EP 120 551 A2, jossa tuodaan julki GAPDH- tai PyK-hiivapromoottorien kaytto kuin myos ekspressiovektorien kaytta-minen, jotka sisaltavat naita promoottoreita.

GB-patentti 2 137 208 A julkaisee edelleen promoottorin GAL1 kåyttåmisen useissa ekspressiovektoreissa.

Kaytettaessa naita aikaisemmin tunnettuja promoottoreja, voidaan ilmenemistå lisata vain lisååmallå transkriptio-kayntiinpanon frekvenssia. Naiden promoottorien kayttaminen aiheuttaa niin muodoin suuren geneettisen kuorman solulle, energia-aineen-vaihdunnan ja synteesiaparaatin irrationaalisen kayton kuin myos syntyvan epastabiilisuuden, tehden valttamattdmåksi suuren selektiopaineen kohdistumisen isantaorganismiin kaytettaessa naita promoottoreita.

Esilla olevan keksinnon tarkoituksena on sen vuoksi tuoda esille menetelma promoottorien kayttamiseksi, jotka ovat aktiivisia hiivassa, kuin myos esisekvensseja, jotka saattavat niita seu-raavan geenin ilmenemisen uudella tavalla saatelyn alaiseksi posttranskriptionaalisella tasolla. Keksinnon tarkoituksena on lisaksi antaa kayttoon promoottori- ja esisekvenssin yhdistelmia, missa yhtevdessa nama yhdistelmat on saatu kasvin leghemoglobii-nigeenien edeltSvista 5’-alueista, ja ovat osoittautuneet toimin-nallisiksi hiivassa, kuin myos keksinnon tarkoituksena on antaa kayttoon plasmideja, jotka sisaltavat edella olevan promoottori-ja esisekvenssien yhdistelman.

Il 11 91083

Esillå olevan keksinnån mukaista menetelmåå geenien ilmentåmi-seksi hiivassa viemållå hiivasoluun yhdistelmå-DNA-sekvenssi, joka sisåltåå sekå ilmennettåvån geenin ettå edeltåvån 5'-alu-een, joka kåsittåå promoottorisekvenssin, ja kasvattamalla transformoituja hiivasoluja kasvualustassa, kuvataan kåyttåmål-lå yhdistelmå-DNA-sekvenssinå sekvenssiå, jonka edeltåvå 5'-alue kåsittåå ensimmåisen DNA-sekvenssin, joka sisåltåå promoottorisekvenssin yhdistyneenå toiseen DNA-sekvenssiin, joka sisåltåå esisekvenssin, jota sååtelevåt posttranskriptionaali-sella tasolla hemi, hemianalogit ja hemiprekursorit. Tållå ta-valla on mahdollista liittåmållå geeni mydtåvirtaan yhdistel-måstå ja sopivassa vektorissa, joka kykenee replikoitumaan hiivassa, saada aikaan biologisesti aktiivisen tuotteen synteesi. Tåmå menetelmå tekee mahdolliseksi lisåtå halutun geenin il-menemistå uudella sååtelymekanismilla, joka toimii posttran-skriptionaalisella tasolla. Erityisenå seurauksena saadaan isåntåsolun geneettisesti pelkistynyt kanta, ja isåntåsolun proteiinisynteesiaparaatin ja energia-aineenvaihdunnan optimaa-linen kåyttå ja niin muodoin ekspressiovektorin lisååntynyt stabiilisuus isåntåsolussa.

Menetelmån erityinen suoritusmuoto keksinnån mukaisesti kåyttåå ensimmåisenå DNA-sekvenssinå eristettyå tai syntetisoitua pro-moottorisekvenssiå liitettåvåksi toiseen eristettyyn tai synte-tisoituun esisekvenssiin. Tållå tavalla on mahdollista yhdiståå mikå tahansa hiivan, kasvien tai elåinten esisekvenssi, joka luonnollisissa olosuhteissa on alttiina posttranskriptionaali-seen sååtelyyn patenttivaatimuksen 1 mukaisesti, minkå tahansa sopivan hiivan promoottorin, kasvipromoottorin tai muun pro-moottorin kanssa, joka on toiminnallinen hiivassa.

Keksinnån mukaisen menetelmån erityisen suoritusmuodon mukaisesti lisååntyy hemin solunsisåinen konsentraatio lisååmållå kasvualustaan sellaisia hiilenlåhteitå, erityisesti ei-fermen-toituvia hiilenlåhteitå, jotka saavat aikaan kohonneita hemin solunsisåisiå konsentraatioita. Tållå tavalla saadaan aikaan halutun geenin ilmenemisen induktio lisååmållå hiilenlåhde kasvualustaan. Esimerkkejå sellaisista hiilenlåhteistå ovat 12 glyseroli ja sukkinaatti, jotka ovat erityisen edullisia, koska ne ovat huokeita ja helposti saatavissa olevia hiilenlåhteitå. Lisåksi etanolia voidaan kåyttåå. Tietyisså olosuhteissa voi hiiva itse tuottaa tåmån etanolin kasvaessaan. Kasvun pååttymi-sen jålkeen etanoli kåytetåån, minkå seurauksena translaatio lisååntyy.

Erityisen suoritusmuodon mukaisesti voidaan saavuttaa sama vai-kutus hemin solunsisåisen konsentraation lisååntymisen avulla lisååmållå kasvualustaan yhtå tai useampaa ainetta, jotka on valikoitu ryhmåstå, johon kuuluvat hemi, hemianalogit ja hexni-prekursorit. Esimerkkinå hemianalogista on deuteroporfyriini IX, ja esimerkkinå hemiprekursorista on δ-aminolevuliinihappo.

Keksinnån mukaisen menetelmån erityinen suoritusmuoto kåyttåå DNA-sekvenssiå, joka sisåltåå promoottorisekvenssin ja esisek-venssin, joka mainittu DNA-sekvenssi on identtinen kasvin leg-hemoglobiinigeenien, hiivageenien tai muiden geenien edeltåvien 5'-alueiden kanssa, on niistå peråisin tai sisåltåå niitå, jotka geenit ovat alttiina ekspressiosååtelylle luonnollisissa olosuhteissa, mainitun ekspressiosååtelyn ollessa solunsisåisen hemin toteuttamaa tai vålittåmåå. Tållå tavalla pååståån yksin-kertaisesti kåsiksi esisekvenssin ja promoottorisekvenssin yh-distelmåån, mainitun yhdistelmån olien osoitettu esillå olevan keksinnon mukaisesti toiminnalliseksi hiivassa. Esimerkkejå sellaisista DNA-sekvensseistå ovat soijapavun leghemoglobiini-geenien neljå edeltåvåå 5'-aluettaf nimittåin Lba sekvenssillå

GAGATACATT ATAATAATCT CTCTAGTGTC TATTTATTAT TTTATCTGGT GATATATACC TTCTCGTATA CTGTTATTTT TTCAATCTTG TAGATTTACT TCTTTTATTT TTATAAAAAA GACTTTATTT TTTTAAAAAA AATAAAGTGA ATTTTGAAAA CATGCTCTTT GACAATTTTC TGTTTCCTTT TTCATCATTG GGTTAAATCT CATAGTGCCT CTATTCAATA ATTTGGGCTC AATTTAATTA GTAGAGTCTA CATAAAATTT ACCTTAATAG TAGAGAATAG AGAGTCTTGG AAAGTTGGTT TTTCTCGAGG AAGAAAGGAA ATGTTAAAAA CTGTGATATT TTTTTTTTGG ATTAATAGTT ATGTTTATAT GAAAACTGAA AATAAATAAA CTAACCATAT TAAATTTAGA ACAACACTTC AATTATTTTT TTAATTTGAT TAATTAAAAA ATTATTTGAT TAAATTTTTT AAAAGATCGT TGTTTCTTCT TCATCATGCT GATTGACACC CTCCACAAG£ CAAGAGAAAC ACATAAGCTT TGGTTTTCTC ACTCTCCAAG CCCTCTATAT AAACAAATAT TGGAGTGAAG TTGTTGCATA ACTTGCATCG AACAATTAAT AGAAATAACA GAAAATTAAA AAAGAAATAT G

II

91083 13

Lbcl sekvenssillå: TTCTCTTAAT ACAATGGAGT TTTTGTTGAA CATACATACA TTTAAAAAAA AATCTCTAGT GTCTATTTAC CCGGTGAGAA GCCTTCTCGT GTTTTACACA CTTTAATATT ATTATATCCT CAACCCCACA AAAAAGAATA CTGTTATATC TTTCCAAACC TGTAGATTTA TTTATTTATT TATTTATTTT TACAAAGGAG ACTTCAGAAA AGTAATTACA TAAAGATAGT GAACATCATT TTATTTATTA TAATAAACTT TAAAATCAAA CTTTTTTATA TTTTTTGTTA CCCTTTTCAT TATTGGGTGA AATCTCATAG TGAAGCCATT AAATAATTTG GGCTCAAGTT TTATTAGTAA AGTCTGCATG AAATTTAACT TAACAATAGA GAGAGTTTTC GAAAGGGAGC GAATGTTAAA AAGTGTGATA TTATATTTTA TTTCGATTAA TAATTATGTT TACATGAAAA CATACAAAAA AATACTTTTA AATTCAGAAT AATACTTAAA ATATTTATTT GCTTAATTGA TTAACTGAAA ATTATTTGAT TAGGATTTTG AAAAGATCAT TGGCTCTTCG TCATGCCGAT TGACACCCTC CACAAGCCAA GAGAAACTTA AGTTGTAAAC TTTCTCACTC CAAGCCTTCT ATATAAACAT GTATTGGATG TGAAGTTATT GCATAACTTG CATTGAACAA TAGAAAATAA CAAAAAAAAG TAAAAAAGTA GAAAAGAAAT ATG,

Lbc2 sekvenssilla:

TCGAGTTTTT ACTGAACATA CATTTATTAA AAAAAACTCT CTAGTGTCCA TTTATTCGGC GAGAAGCCTT CTCGTGCTTT ACACACTTTA ATATTATTAT ATCCCCACCC CCACCAAAAA AAAAAAAACT GTTATATCTT TCCAGTACAT TTATTTCTTA TTTTTACAAA GGAAACTTCA CGAAAGTAAT TACAAAAAAG ATAGTGAACA TCATTTTTTT AGTTAAGATG AATTTTAAAA TCACACTTTT TTATATTTTT TTGTTACCCT TTTCATTATT GGGTGAAATC TCATAGTGAA

ACTATTAAAT AGTTTGGGCT CAAGTTTTAT TAGTAAAGTC TGCATGAAAT TTAACTTAAT AATAGAGAGA GTTTTGGAAA GGTAACGAAT GTTAGAAAGT GTGATATTAT TATAGTTTTA TTTAGATTAA TAATTATGTT TACATGAAAA TTGACAATTT ATTTTTAAAA TTCAGAGTAA TACTTAAATT ACTTATTTAC TTTAAGATTT TGAAAAGATC ATTTGGCTCT TCATCATGCC GATTGACACC CTCCACAAGC CAAGAGAAAC TTAAGTTGTA ATTTTTCTAA CTCCAAGCCT TCTATATAAA CACGTATTGG ATGTGAAGTT GTTGCATAAC TTCCATTGAA CAATAGAAAT AACAACAAAG AAAATAAGTG AAAAAAGAAA TATG,

Lbc3 sekvenssillå: 14 TATCAAGATT AAAAAATACA CTCATATATA TGCCATAAGA ACCAACAAAA GTACTATTTA AGAAAAGAAA AAAAAAACCT GCTACATAAT TTCCAATCTT GTAGATTTAT TTCTTTTATT TTTATAAAGG AGAGTTAAAA AAATTACAAA ATAAAAATAG TGAACATCGT CTAAGCATTT TTATATAAGA TGAATTTTAA AAATATAATT TTTTTGTCTA AATCGTATGT ATCTTGTCTT AGAGCCATTT TTGTTTAAAT TGGATAAGAT CACACTATAA AGTTCTTCCT CCGAGTTTGA TATAAAAAAA ATTGTTTCCC TTTTGATTAT TGGATAAAAT CTCGTAGTGA CATTATATTA AAAAAATTAG GGCTCAATTT TTATTAGTAT AGTTTGCATA AATTTTAACT TAAAAATAGA GAAAATCTGG AAAAGGGACT GTTAAAAAGT GTGATATTAG AAATTTGTCG GATATATTAA TATTTTATTT TATATGGAAA CTAAAAAAAT ATATATTAAA ATTTTAAATT CAGAATAATA CTTAAATTAT TTATTTACTG AAAATGAGTT GATTTAAGTT TTTGAAAAGA TGATTGTCTC TTCACCATAC CAATTGATCA CCCTCCTCCA ACAAGCCAAG AGAGACATAA GTTTTATTAG TTATTCTGAT CACTCTTCAA GCCTTCTATA TAAATAAGTA TTGGATGTGA AGTTGTTGCA TAACTTGCAT TGAACAATTA ATAGAAATAA CAGAAAAGTA GAAAAGAAAT ATG·

Keksinndn mukaisen menetelmHn lisasuoritusmuodossa kåy-tetSan DNA-sekvenssiS, joka on identtinen YEP Lb CAT-geenin edeltavien 5'-alueiden kanssa, on niistS peråi-sin tai sisåltSa niitS, jolla geenilla on sekvenssi:

TATGAAGATT AAAAAATACA CTCATATATA TGCCATAAGA ACCAACAAAA GTACTATTTA AGAAAAGAAA AAAAAAACCT GCTACATAAT TTCCAATCTT GTAGATTTAT TTCTTTTATT TTTATAAAGG AGAGTTAAAA AAATTACAAA ATAAAAATAG TGAACATCGT CTAAGCATTT TTATATAAGA TGAATTTTAA AAATATAATT TTTTTGTCTA AATCGTATGT ATCTTGTCTT AGAGCCATTT

TTGTTTAAAT TGGATAAGAT CACACTATAA AGTTCTTCCT CCGAGTTTGA TATAAAAAAA ATTGTTTCCC TTTTGATTAT TGGATAAAAT CTCGTAGTGA CATTATATTA AAAAAATTAG GGCTCAATTT TTATTAGTAT AGTTTGCATA AATTTTAACT TAAAAATAGA GAAAATCTGG AAAAGGGACT GTTAAAAAGT GTGATATTAG AAATTTGTCG GATATATTAA TATTTTATTT TATATGGAAA CTAAAAAAAT ATATATTAAA ATTTTAAATT CAGAATAATA CTTAAATTAT TTATTTACTG AAAATGAGTT GATTTAAGTT TTTGAAAAGA TGATTGTCTC TTCACCATAC CAATTGATCA CCCTCCTCCA ACAAGCCAAG AGAGACATAA GTTTTATTAG TTATTCTGAT CACTCTTCAA GCCTTCTATA TAAATAAGTA TTGGATGTGA AGTTGTTGCA TAACTTGCAT TGAACAATTA ATAGAAATAA CAGAAAAGTA GAATTCTAAA ATG

II

15 91083

Keksinndn mukaisen menetelmån lisåsuoritusmuodossa tuodaan vie-lå esille menetelmå valmistaa polypeptidiå viemållå hiivasolun sisåån rekombinanttiplasmidi, joka menetelmå on tunnettu siitå, ettå kåytetåån rekombinanttiplasmidina plasmidia, joka sisåltåå promoottorisekvenssin ja esisekvenssin DNA-sekvenssisså, jossa on kasvin leghemoglobiinigeenin edeltåvå 5'-alue.

Keksinnon mukaisen menetelmån toisessa suoritusmuodossa tuodaan esille menetelmå, jossa kåytetåån rekombinanttiplasmidina plasmidia, joka sisåltåå promoottorisekvenssin ja esisekvenssin DNA-sekvenssisså, jossa on kasvin leghemoglobiinigeenin edeltåvå 5'-alue sekå edeltåvå 3'-alue.

Esillå oleva keksint6 kåsittelee lisåksi DNA-sekvenssiå, jota on tarkoitus kåyttåå toisena DNA-sekvenssinå toteutettaessa keksinnon mukaista menetelmåå, mainitun sekvenssin ollessa tunnettu siitå, ettå se on lyhyt DNA-sekvenssi, joka kopioidaan låhetti-RNA-juosteeksi, joka on kohteena sååtelylle, jota so-lunsisåinen hemi toteuttaa tai vålittåå. Esimerkkejå sellaisis-ta DNA-sekvensseistå ovat DNA-sekvenssit, jotka ovat identtisiå kasvin leghemoglobiinigeenien, hiivan geenien tai muiden geeni-en esisekvenssin kanssa, on siitå peråisin tai sisåltåvåt sen, joissa geeneisså mainittu esisekvenssi luonnollisissa olosuh-teissa on kohteena sååtelylle, jota solunsisåinen hemi toteuttaa tai vålittåå. Esimerkkejå niistå ovat keksinnån mukaisesti DNA-sekvenssit, jotka ovat identtisiå soijapavun leghemoglobiinigeenien esisekvenssin kanssa, ovat siitå peråisin tai jotka sisåltåvåt sen, nimittåin Lba sekvenssillå: AACTTGCATC GAACAATTAA TAGAAATAAC AGAAAATTAA AAAAGAAATA TG;

Lbcl sekvenssillå: AACTTGCATT GAACAATAGA AAATAACAAA AAAAAGTAAA AAAGTAGAAA AGAAATATG;

Lbc2 sekvenssillå: AACTTGCATT GAACAATAGA AATAACAACA AAGAAAATAA GTGAAAAAAG AAATATG; 16 ja Lbc3 sekvenssillå: AACTTG CATT GAACAATTAA TAGAAATAAC AGAAAAGTAG AAAAGAAATA .

TG.

Toinen esimerkki sellaisesta DNA-sekvenssistå on sekvenssi, joka on identtinen YEP Lb CAT-geenin esisekvenssin kanssa, on siitå peråisin tai sisåltåå sen, jolla geenillå on sekvenssi AACTTGCATT GAACAATTAA TAGAAATAAC AGAAAAGTAG AATTCTAAAA TG.

Esillå oleva keksintå kåsittelee edelleen DNA-sekvenssejå, jot-ka sisåltåvåt ensimmåisen DNA-sekvenssin ja toisen DNA-sekvens -sin yhdistelmån, ja joita on tarkoitus kåyttåå toteutettaessa menetelmåå keksinnån mukaisesti.

Nåmå DNA-sekvenssit ovat tunnettuja siitå, ettå ne sisåltåvåt promoottorisekvenssin ja esisekvenssin, ja ovat identtisiå kas-vin leghemogloniinigeenien edeltåvien 5'-alueiden kanssa, ovat niistå peråisin tai sisåltåvåt niitå.

Esimerkkejå sellaisista DNA-sekvensseistå ovat keksinnån mukaisesti DNA-sekvenssit, jotka sisåltåvåt promoottorisekvenssin ja esisekvenssin, ja jotka ovat identtisiå soijapavun leghemoglo-biinigeenien edeltåvien 5'-alueiden kanssa, ovat niistå peråisin tai sisåltåvåt niitå, nimittåin Lba sekvenssillå: GAGATACATT ATAATAATCT CTCTAGTGTC TATTTATTAT TTTATCTGGT GATATATACC TTCTCGTATA CTGTTATTTT TTCAATCTTG TAGATTTACT TCTTTTATTT TTATAAAAAA GACTTTATTT TTTTAAAAAA AATAAAGTGA ATTTTGAAAA CATGCTCTTT GACAATTTTC TGTTTCCTTT TTCATCATTG GGTTAAATCT CATAGTGCCT CTATTCAATA ATTTGGGCTC AATTTAATTA GTAGAGTCTA CATAAAATTT ACCTTAATAG TAGAGAATAG AGAGTCTTGG AAAGTTGGTT TTTCTCGAGG AAGAAAGGAA ATGTTAAAAA CTGTGATATT TTTTTTTTGG ATTAATAGTT ATGTTTATAT GAAAACTGAA AATAAATAAA CTAACCATAT TAAATTTAGA ACAACACTTC AATTATTTTT TTAATTTGAT TAATTAAAAA ATTATTTGAT TAAATTTTTT AAAAGATCGT TGTTTCTTCT TCATCATGCT GATTGACACC CTCCACAAGC CAAGAGAAAC ACATAAGCTT TGGTTTTCTC ACTCTCCAAG CCCTCTATAT AAACAAATAT TGGAGTGAAG TTGTTGCATA ACTTGCATCG AACAATTAAT AGAAATAACA GAAAATTAAA AAAGAAATAT G, li

Lbcl sekvenssillå: 17 91083 TTCTCTTAAT ACAATGGAGT TTTTGTTGAA CATACATACA TTTAAAAAAA AATCTCTAGT GTCTATTTAC CCGGTGAGAA GCCTTCTCGT GTTTTACACA CTTTAATATT ATTATATCCT CAACCCCACA AAAAAGAATA CTGTTATATC TTTCCAAACC TGTAGATTTA TTTATTTATT TATTTATTTT TACAAAGGAG ACTTCAGAAA AGTAATTACA TAAAGATAGT GAACATCATT TTATTTATTA TAATAAACTT TAAAATCAAA CTTTTTTATA TTTTTTGTTA CCCTTTTCAT TATTGGGTGA AATCTCATAG TGAAGCCATT AAATAATTTG GGCTCAAGTT TTATTAGTAA AGTCTGCATG AAATTTAACT TAACAATAGA GAGAGTTTTC GAAAGGGAGC GAATGTTAAA AAGTGTGATA TTATATTTTA TTTCGATTAA TAATTATGTT TACATGAAAA CATACAAAAA AATACTTTTA AATTCAGAAT AATACTTAAA ATATTTATTT GCTTAATTGA TTAACTGAAA ATTATTTGAT TAGGATTTTG AAAAGATCAT TGGCTCTTCG TCATGCCGAT TGACACCCTC CACAAGCCAA GAGAAACTTA AGTTGTAAAC TTTCTCACTC CAAGCCTTCT ATATAAACAT GTATTGGATG TGAAGTTATT GCATAACTTG CATTGAACAA TAGAAAATAA CAAAAAAAAG TAAAAAAGTA GAAAAGAAAT ATG,

Lbc2 sekvenssillå: TCGAGTTTTT ACTGAACATA CATTTATTAA AAAAAACTCT CTAGTGTCCA TTTATTCGGC GAGAAGCCTT CTCGTGCTTT ACACACTTTA ATATTATTAT ATCCCCACCC CCACCAAAAA AAAAAAAACT gttatatctt TCCAGTACAT TTATTTCTTA TTTTTACAAA GGAAACTTCA CGAAAGTAAT TACAAAAAAG ATAGTGAACA TCATTTTTTT AGTTAAGATG AATTTTAAAA TCACACTTTT TTATATTTTT TTGTTACCCT TTTCATTATT GGGTGAAATC TCATAGTGAA ACTATTAAAT AGTTTGGGCT CAAGTTTTAT TAGTAAAGTC TGCATGAAAT TTAACTTAAT AATAGAGAGA GTTTTGGAAA GGTAACGAAT GTTAGAAAGT GTGATATTAT TATAGTTTTA TTTAGATTAA TAATTATGTT TACATGAAAA TTGACAATTT ATTTTTAAAA TTCAGAGTAA TACTTAAATT ACTTATTTAC TTTAAGATTT TGAAAAGATC ATTTGGCTCT TCATCATGCC GATTGACACC CTCCACAAGC CAAGAGAAAC TTAAGTTGTA ATTTTTCTAA CTCCAAGCCT TCTATATAAA CACGTATTGG ATGTGAAGTT GTTGCATAAC TTGCATTGAA CAATAGAAAT AACAACAAAG AAAATAAGTG AAAAAAGAAA TATG,

Lbc3 sekvenssilla: 18 TATGAAGATT AAAAAATACA CTCATATATA TGCCATAAGA ACCAACAAAA GTACTATTTA AGAAAAGAAA AAAAAAACCT GCTACATAAT TTCCAATCTT GTAGATTTAT TTCTTTTATT TTTATAAAGG AGAGTTAAAA AAATTACAAA ATAAAAATAG TGAACATCGT CTAAGCATTT TTATATAAGA TGAATTTTAA AAATATAATT TTTTTGTCTA AATCGTATGT ATCTTGTCTT AGAGCCATTT TTGTTTAAAT TGGATAAGAT CACACTATAA AGTTCTTCCT CCGAGTTTGA TATAAAAAAA ATTGTTTCCC TTTTGATTAT TGGATAAAAT CTCGTAGTGA CATTATATTA AAAAAATTAG GGCTCAATTT TTATTAGTAT AGTTTGCATA AATTTTAACT TAAAAATAGA GAAAATCTGG AAAAGGGACT GTTAAAAAGT GTGATATTAG AAATTTGTCG GATATATTAA TATTTTATTT TATATGGAAA CTAAAAAAAT ATATATTAAA ATTTTAAATT CAGAATAATA CTTAAATTAT TTATTTACTG AAAATGAGTT GATTTAAGTT TTTGAAAAGA TGATTGTCTC TTCACCATAC CAATTGATCA CCCTCCTCCA ACAAGCCAAG AGAGACATAA GTTTTATTAG TTATTCTGAT CACTCTTCAA GCCTTCTATA TAAATAAGTA TTGGATGTGA AGTTGTTGCA TAACTTGCAT TGAACAATTA ATAGAAATAA CAGAAAAGTA GAAAAGAAAT ATG.

Toinen esimerkki sellaisesta DNA-sekvenssistå on sekvenssi/ joka on identtinen YEP Lb CAT-geenin esisek-venssin kanssa, on siita perSisin tai sisåltåå sen, jolla geenilla on sekvenssi:

TATGAAGATT AAAAAATACA CTCATATATA TGCCATAAGA ACCAACAAAA GTACTATTTA AGAAAAGAAA AAAAAAACCT GCTACATAAT TTCCAATCTT GTAGATTTAT TTCTTTTATT TTTATAAAGG AGAGTTAAAA AAATTACAAA ATAAAAATAG TGAACATCGT CTAAGCATTT TTATATAAGA TGAATTTTAA AAATATAATT TTTTTGTCTA AATCGTATGT ATCTTGTCTT AGAGCCATTT TTGTTTAAAT TGGATAAGAT CACACTATAA AGTTCTTCCT CCGAGTTTGA TATAAAAAAA ATTGTTTCCC TTTTGATTAT TGGATAAAAT CTCGTAGTGA CATTATATTA AAAAAATTAG GGCTCAATTT TTATTAGTAT AGTTTGCATA AATTTTAACT TAAAAATAGA GAAAATCTGG AAAAGGGACT GTTAAAAAGT GTGATATTAG AAATTTGTCG GATATATTAA TATTTTATTT TATATGGAAA CTAAAAAAAT ATATATTAAA ATTTTAAATT CAGAATAATA CTTAAATTAT TTATTTACTG AAAATGAGTT GATTTAAGTT TTTGAAAAGA TGATTGTCTC TTCACCATAC CAATTGATCA CCCTCCTCCA ACAAGCCAAG AGAGACATAA GTTTTATTAG TTATTCTGAT CACTCTTCAA GCCTTCTATA TAAATAAGTA TTGGATGTGA AGTTGTTGCA TAACTTGCAT TGAACAATTA ATAGAAATAA CAGAAAAGTA GAATTCTAAA ATG

II

91083 19

Keksinto koskee lisåksi mitå tahansa plasmidia, jota on tarkoi-tus kåyttåå keksinnon mukaisen menetelmån suorituksessa, ja jolle on ominalsta se, ettå se sisåltåå ensimmåisen DNA-sek-venssin kuten aikaisemmin mååriteltiin, tai toisen DNA-sekvens-sin ja toisen DNA-sekvenssin yhdistelmån, myos kuten aikaisem-min mååriteltiin. Sopivia keksinndn mukaisia plasmideja ovat YEP Lb CAT ja YEP 5 Lb Km. Keksinnon mukaiset plasmidit mahdol-listavat halutun geenituotteen suuren ilmenemisen liittåmållå koodaavia sekvenssejå nåitå geenituotteita vårten.

Esimerkki 1

Soijapavun leghemoglobiinigeenien edeltåvien 5'-alueiden sek- venssimååritys_

Soijapapu (glysiini maks. var. evans)-geenikokoelmasta annetaan kåyttdon neljå soijapavun leghemoglobiinigeeniå Lba, Lbcl, Lbc2 ja Lbc3, kuten kuvailivat Jensen, E. 0. et al., Nature Vol.

291, no 3817, 677-679 (1981). Neljån soijapavun leghemoglo-biinigeenin edeltåvåt 5'-alueet eristetåån, kuten kuvaili Jensen, E. 0., Ph D-våit6skirja, Institut for Molekylaer Biologi, Århus Universitet (1985), ja neljån edeltåvån 5'-alueen sek-venssit mååritetåån kåyttåmållå dideoksiketjuterminaa-tiomenetelmåå kuten kuvaili Sanger, F., J.Mol. Bio. 143, 161 (1980) ja ilmaistaan sekvenssikaaviossa.

Esimerkki 2 YEP Lb CAT:n konstruointi

Konstruoiminen on suoritettu prosessijaksojen jårjestyksesså kuten jåljempånå on kuvailtu:

Lbc3-geenin alakloonaus

Lbc3-geeni eristettiin soijapapu-DNA-kokoelman 12 kb:n EcoRI-restriktiokappaleena, jota ovat kuvailleet Wiborg et al., Nucl. Acids. Res. 10, 3487. Osa kappaleesta on esitettynå kaavion 2 ylåosassa. Tåmå kappale liuotettiin entsyymien avulla ilmaisten mydhempi liittåminen pBR322:een kuten on esitetty kaaviossa. Muodostuneet plasmidit Lbc3HH ja Lbc3HX liuotettiin mydhemmin PvuIIilla ja liitettiin uudelleen, josta oli tuloksena kaksi plasmidia nimettynå pLpHH ja pLpHX.

20

Lbc3-geenin edeltåvien 51-sekvenssien alakloonaus Tåtå tarkoitusta vårten kåytettiin plasmidia pLpHH, kuten esi-tetåån kaaviossa 3. Plasmidi avattiin PvuII:n avulla, ja sitå kåsiteltiin eksonukleaasilla Bal31. Reaktio pysåytettiin eri aikoina, ja lyhennetyt plasmidit liitettiin pBR322:n sekvens-seihin. Nåitå sekvenssejå on kåsitelty etukåteen kuten on esi- tetty kaaviossa 3, siten, ettå niiden toisessa pååsså oli DNA- , . TTC --- sekvenssi

Liittåmisen jålkeen tapahtui liuottamisen EcoRI:llå, ja sek-venssit, jotka sisålsivåt edeltåviå 5'-sekvenssejå, liitettiin EcoRI:llå liuotettuun pBR322:een. Nåmå plasmidit transformoi-tiin E. coliin K803, ja plasmidit transformanteissa testattiin sekvenssianalyysin avulla. Yksi plasmidi, p213 5'Lb, eristetty-nå yhdestå transformantista, sisålsi edeltåvån 5'-sekvenssin, joka pååttyi 7 emåsparia ennen Lb ATG-låhtokodonia sillå taval-la, ettå sekvenssi on seuraava: 2 kb -5' edeltåvå --- AAAGTAGAATTCTAAAATG Lbc3- sekvenssi.

Lbc3-geenin edeltåvån 3'-alueen alakloonaus Tåtå tarkoitusta vårten kåytettiin plasmidia pLpHX, joka liuo-tettiin XhoII:lla. Pååt tåytettiin osittain, ja ylimåårå DNA:-sta poistettiin, kuten esitetåån kaaviossa 4. Osoitettu sekvenssi liitettiin plasmidiin pBR322, jota oli esikåsitelty, kuten kaaviossa on esitetty. Konstruktio transformoitiin E. coliin K803. Yksi transformanteista sisålsi plasmidin, jota nimitettiin Xho2a-3'Lb:ksi. Koska XhoII tunnistussekvenssi on sijoittunut vålittomåsti Lp-pysåytyskodonin jålkeen, vrt. kaa-vio 2, plasmidi sisålsi noin 900 emåsparia edeltåvåstå 3'-alu-eesta, ja sekvenssi alkoi GAATTCTACAA---.

Lb-promoottorikasetin konstruointi

EcoRI/SphI-sekvenssi Xho2a-3'Lb:stå sekoitettiin BamHl/EcoRI-sekvenssin kanssa p 213-5'Lb:stå. Nåmå kaksi sekvenssiå liitettiin BamHI/SphI-katkaisupisteiden kautta pBR322-johdannaiseen, 91083 21 josta EcoRI-tunnistussekvenssi oli poistettu, vrt. kaavio 4. Ligatoidut plasmidit transformoitiin E.coliin K803. Yksi plas-midi yhdesså transformantissa sisålsi oikeita sekvenssejå, ja sitå nimitettiin plasmidiksi pEJLb 5'-3'-l.

Kimeerisen Lh/CAT-geenin konstruointi pBR322:n CAT-geeni eristettiin useana pienempånå restriktiosek-venssinå kuten esitetåån kaaviossa 5. Koodaava 5'-alue eristettiin Alul-sekvenssinå, joka myohemmin liitettiin plasmidiin pBR322, ja kåsiteltiin kuten kaaviossa on ilmaistu. Tåmå transformoitiin E. coliin K803, ja valikoitu transformantti sisålsi plasmidin, jota nimitettiin AluIIiksi. Koodaava 3'-alue eristettiin Taql-sekvenssinå. Tåtå sekvenssiå kåsiteltiin eksonuk-leaasilla Bal31, minkå jålkeen lisåttiin EcoRI-linkkereitå. Sitten seurasi liuotus EcoRI:llå ja liittåminen EcoRI:llå liuo-tettuun plasmidiin pBR322. Jålkimmåinen transformoitiin E. coliin K803, ja transformantit analysoitiin. Yksi plasmidi,

Taql2, sisålsi CAT-geenin koodaavan 3'-alueen plus23 emåsparin edeltåviå 3-sekvenssejå pååttyen siten myohemmin seuraavaan sekvenssiin - CCCCGAATTC. Myohemmin seuraavat sekvenssit liitettiin yhdesså EcoRI:llå liuotettuun plasmidiin pEJLb5'-3'-1: EcoRI/PvuII-sekvenssi AluII:sta, PvuII/Ddel-sekvenssi pBR322:sta ja Ddel/EcoRI-sekvenssi Taq 12:sta. Jålkimmåinen transformoitiin E coliin K803. Valikoitu transformantti sisålsi oikean plasmidin, jota nimitettiin pEJLb5'-3'-CATrksi.

Kimeerisen T.h/CAT-geenin kloonaus hiivan plasmidissa Tåmå kimeerinen geeni eristettiin plasmidin pEJLbS1-3'-CAT 15 sekvenssistå BamHI/Sphl ja liitettiin hiivan plasmidiin YEP24, joka oli katkaistu samoilla entsyymeillå. Transformoinnin E coliin K803 jålkeen tutkittiin valikoitua transformanttia. Se sisålsi plasmidin YEP LbCAT, joka esitetåån kaaviossa 6. Tåmå plasmidi transformoitiin edelleen hiivakantoihin Saccharomyces cerevisiae DBY747 ja ΊΜ1.

22

Esimerkki 3 YEP 5Lb Km:n konstruointi

Neomysiinifosfotransferaasi (NPTII)-geeni eristettiin pKM2:sta (Beck, et al., Gene 19, 327). Tåmån geenin koodaava 5'-alue eristettiin Sau3A-sekvenssinå, kuten on esitetty kaaviossa 7, ja liitettiin my5hemmin pBR322:een, mistå oli tuloksena plasmi-di, nimettynå SAU 13. Koodaava ja edeltåvå 3'-alue geenistå NPTII eristettiin PvuII-sekvenssinå. Jålkimmåinen liitettiin yhdesså plasmidin EcoRI/PvuII-sekvenssin kanssa EcoRI/PvuII:lla liuotettuun plasmidiin pEJLb 5'-3'-l. Transformaation yhteydes-så E. coliin K803, valikoitiin transformantti, jossa oli oikea plasmidi, pEJLb 5'Km 1. Tåmå plasmidi liuotettiin mydhemmin BamHI:n avulla ja osittain PvuIIrn avulla sellaisella tavalla, ettå koko edeltåvå 5'-Lb-sekvenssi + koodaava NPTII-sekvenssi olivat låsnå BamHI/PvuII-sekvenssisså. Tåmå sekvenssi liitettiin BamHl/PvuII:11a liuotettuun YEP24:åån, mistå oli tuloksena plasmidi YEP 5Lb Km, esitettynå kaaviossa 8. Tåmå plasmidi transformoitiin hiivakantaan Saccharomyces cerevisiae Tml.

Esimerkki 4

Hiilenlåhteen vaikutus CAT:n ilmenemiseen

Saccharomyces cerevisiaeta DBY747, joka sisålsi plasmidin YEP Lb CAT, kasvatetaan minimialustassa + 2 % hiilenlåhdettå. Solut keråtåån talteen solutiheydesså 5 x 106 solua per ml. CAT-ak-tiivisuus mitataan kuten kuvailevat Walker, Edlund, Boulet & Rutter, Nature, 306. 557 (1983).

Taulukossa 1 CAT-aktiivisuus on ilmaistu hiilenlåhteen funktiona. Korkein aktiivisuus, joka saatiin kasvattamalla sukkinaa-tilla ja glyserolilla, on keinotekoisesti asetettu 100 %:ksi.

Taulukko 1

Hiilenlåhde Aktiivisuus

Sukkinaatti 100

Glyseroli 100

Glukoosi 28

Sakkaroosi 18 11 91083 23

Esimerkki 5

Hemiprekursoreiden ja hemianalogien vaikutus geenin ilmenemisen indusoitumiseen_

Saccharomyces cerevisiaeta TMI, joka sisåltåå plasmidin YEP Lb CAT, kasvatetaan minimaalialustassa + 2 % glukoosia + 0,1 % TweenR:iå + 20 /ug/ml ergosterolia + 50 /ug/ml metioniinia, mu-kana myds yksi seuraavista hemianalogeista tai hemiprekurso-reista. Deuteroporfyriini IX (dp):åå ja protoporfyriiniå (pp), vastaavasti lisåtåån loppukonsentraatioksi 5 /ug/ml. Hemiiniå lisåtåån loppukonsentraatioon 5 /ug/ml. δ-aminolevuliinihappoa, δ-ALA, lisåtåån loppukonsentraatioon 50 /ug/ml.

Taulukossa 2 on CAT-aktiivisuus osoitettu hemiprekursorin ja hemianalogin aktiivisuutena, vastaavasti. Korkein saatu aktii-visuus lisååmållå δ-ALAraa tai dp:tå on asetettu keinotekoises-ti 100 %:ksi.

Taulukko 2

Induktori CAT-aktiivisuus

Glukoosi + δ-ALA 100

Glukoosi + dp 100

Glukoosi + pp 50

Glukoosi + hemiini 25

Glukoosi 5

Esimerkki 6

Linkkerien liittåminen esisekvenssiin

Kaksi synteettistå DNA-linkkeriå on liitetty; yksi vålittomåsti låhtdkodonin ylåpuolelle, joka sisåltåå entsyymin Bglll tunnis-tussekvenssin, ja yksi vastavirtaan CAP-liitospaikasta, joka sisåltåå tunnistussekvenssin Kpnl:lle, vrt. kaavio 9, jossa uutta konstruktiota pEJ5'-3'-CAT101 verrataan alkuperåiseen konstruktioon.

Kahden konstruktion ilmenemisen vertailu osoittaa (testi kuten esimerkisså 5): 24 qlukoosi qlukoosi + hemi induktin CAT15 0,11 6,01 55x CAT101 0,22 1,72 8x

Numerot ilmoittavat nmoolia reagoinutta kloramfenikolia/mg pro-teiinia/min.

Tåmå osoittaa sen, ettå kaksi spesifistå muutosta 5'-alueessa aiheuttaa hemi-induktion putoamisen tasolta 55x tasolle 8x.

Esimerkki 7

Lbc3:n 5'-alueen korvaaminen vastaavalla alueella S. cere- visiaen ILVl-qeenistå_

Koko Lbc3 5'-alue poistetaan CAT 101:stå katkaisemalla BamHI:-llå ja Bglll:lla. Tilalle liitetåån 765 emåsparin DNA-sekvenssi ILVl-geenistå, joka sisåltåå promoottori- ja esisekvenssin.

Tåtå konstruktiota nimitetåån PEJ CAT-BD.

Toisessa konstruktiossa poistetaan Lbc3-promoottori esisekvenssin jåådesså jåljelle. Tåmå tehdåån katkaisemalla CAT101 Bam-HI:llå ja Kpnlrllå. Tåmå sekvenssi korvataan 670 emåsparin sek-venssillå ILVlistå, promoottori ilman esisekvenssiå. Tåtå plas-midia nimitetåån PEJ CAT-KN.

Konstruktioita kuvataan kaavamaisesti: -promoottori esisekvenssi koodaava sekvenssi -IH i IIH'· . - - -

CAT-BD ILVI CAT

i — —. . — CAT-KN ILVI Lbc3 _CAT_ -n 111111' -

Sekvenssien vertailua kuvataan kaaviossa 10.

91083 25

Ilmenemistesti glukoosi glukoosi + hemi induktio CAT-BD 1089 1162 CAT-KN 789 1580 2x

Samat yksikot kuin aikaisemmissa testeissa.

Ainoa ero kahden konstruktion valilla on esisekvenssin alku-pera. Tulos osoittaa, etta Lbc3-esisekvenssi on valttamaton induktiolle. Iriduktiotaso ei kuitenkaan ole niin korkea kuin CATlOl:sså, joka on låhtomateriaali; tama voi johtua tosisei-kasta, etta konstruktio alkaa 13 nukleotidia lahempana ATG:ta, ja siita puuttuu nain olien 13 mRNA-nukleotidia, jotka voivat olla tarkeita induktion kannalta.

Kaikki nama kokeet osoittavat selvasti, etta hemi-induktio liittyy Lbc3-esisekvenssiin.

On selvaa, ettei esilla olevan keksinnon patenttisuoja rajoitu tassa ilmaistuihin esimerkkeihin.

Nain olien ei keksinnon mukaisesti kayteta yksinomaan edeltaviS 5'-alueita soijapavun leghemoglobiinigeeneista. On hyvin tun-nettua, etta kaikkien hernekasvien leghemoglobiinigeeneilla on sama aktiivisuus, vrt. Appleby (1974) teoksessa The Biology of Nitrogen Fixation, Quispel. A. Ed. North-Holland Publishing Company, Amsterdam Oxford, sivut 499-554, ja edelleen on osoi-tettu salkopavun PvLbl-geenin osalta, etta selva homologia-aste on olemassa soijapavun Lbc3:n kanssa. Nain olien keksinto kasittaa leghemoglobiinigeenien 5'-alueiden kayttamisen kaikis-ta kasveista.

Keksinnon mukaisesti on myos mahdollista kayttaa sellaisia sek-venssejS kasveista, elaimista tai hiivasta, jotka luonnolli-sissa olosuhteissa toteuttavat tai valittavat uutta saatelyakti-viteettia, jota on kuvailtu esilla olevan keksinnon mukaisesti.

26

Viimeksi mainittu soveltuu erityisesti sellaisiin sekvenssei-hin, joita voidaan eriståå geenikokoelmien DNA-sekvensseistå hydridisaatiolla soijapavun leghemoglobiinigeenien edeltåvien 5'-alueiden merkittyjen sekvenssien kanssa.

On hyvin tunnettua, ettå on mahdollista muuttaa nukleotidisek-venssejå edeltåvien 5'-alueiden ei-vålttåmåttomisså ala-alueis-sa, ilman, ettå viimeksi mainittu aiheuttaa muuttuneen promoot-toriaktiivisuuden ja såådeltåvyyden. On myos hyvin tunnettua, ettå muuttamalla edeltåvien 5'-alueiden tårkeiden ala-alueiden sekvenssejå, on mahdollista muuttaa sidosaffiniteetteja nukle-otidisekvenssien ja tekijdiden tai sååtelyaineiden vålillå, jotka ovat vålttåmått6miå transkriptionaaliselle kåyntiinpanol-le ja translationaaliselle kåyntiinpanolle, ja ettå on niin muodoin mahdollista parantaa promoottoriaktiivisuutta ja/tai såådeltåvyyttå. Esillå olevan keksinnån piiriin kuuluu myos tietysti edeltåvien 5'-alueiden sellaisten muutettujen sekvenssien kåyttåminen. Erityisesti voidaan mainita esisekvenssien kåyttåminen, joita on laajennettu yli luonnollisen pituuden, edellyttåen ettå sellaisten sekvenssien kåyttåminen tekee halu-tun geenituotteen ilmenemisestå esillå olevan keksinndn mukai-sen uuden sååtelyn kohteen.

II

Claims (20)

1. 27 91083
2. 1. Menetelmå geenien ilmentåmiseksi hiivassa saattamalla hiivasoluun yhdistelmå-DNA-sekvenssi, joka sisåltåå sekå il-mennettåvån geenin ettå edeltåvån 5'-alueen, joka kåsittåå promoottoriselcvenssin, ja viljelemållå transformoituja hii-vasoluja omassa kasvualustassa, tunnettu siitå, ettå kåyte-tåån edeltåvåå 5'-aluetta kasvileghemoglobiinista, joka kåsittåå ensimmåisen DNA-sekvenssin, joka sisåltåå promootto-risekvenssin ja toisen DNA-sekvenssin, joka sisåltåå signaa-lisekvenssin, jota sååtelevåt posttranskriptionaalisella tasolla hemi, hemianalogit tai hemiprekursorit, ja ettå he-min solunsisåinen konsentraatio kasvaa, ja siitå, ettå kas-vualustaan lisåtåån sellaisia hiililåhteitå, jotka saavat aikaan kasvaneen hemin solunsisåisen konsentraation.
3. 2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmå, tunnettu siitå, ettå ensimmåisenå DNA-sekvenssinå kåytetåån bakteerista eristettyå DNA-sekvenssiå tai kasvin DNAista in vitro synte-tisoitua DNA:ta, joka sisåltåå promoottoriselcvenssin yhdis-tettåvåksi toiseen DNA-sekvenssiin.
4. 3. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmå, tunnettu siitå, ettå toisena DNA-sekvenssinå kåytetåån bakteerista eristettyå DNA-sekvenssiå tai kasvin DNArsta in vitro synte-tisoitua, joka sisåltåå signaalisekvenssin yhdistettåvåksi ensimmåiseen DNA-sekvenssiin.
5. 4. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmå, tunnettu siitå, ettå hiilenlåhde valitaan ryhmåstå glyseroli, sukkinaat-ti tai etanoli.
6. 5. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmå, tunnettu siitå, ettå kohotetaan hemin solunsisåistå konsentraatiota li-sååmållå kasvualustaan yksi tai useampia aineita, jotka on valittu ryhmåstå, johon kuuluvat hemi, hemianalogit ja hemiprekursorit . 28
7. 6. Patenttivaatimuksen 5 mukainen menetelmå, tunnettu sii-tå, ettå kåytetåån hemianalogina yhdistettå deuteroporfyrii-ni IX ja/tai hemiprekursorina yhdistettå δ-aminolevuliini-happo.
8. 7. Patenttivaatimuksen l mukainen menetelmå, tunnettu sii-tå, ettå kåytetåån DNA-sekvenssiå, joka on identtinen soija-pavun leghemoglobiinigeenien edeltåvien 5'-alueiden kanssa.
9. 8. Patenttivaatimuksen 7 mukainen menetelmå, tunnettu sii-tå, ettå edeltåvå 5'-alue on identtinen Lba-geenin edeltåvien 5'-alueiden kanssa, jolla geenillå on sekvenssi: GAGATACATT ATAATAATCT CTCTAGTGTC TATTTATTAT TTTATCTGGT GATATATACC TTCTCGTATA CTGTTATTTT TTCAATCTTG TAGATTTACT TCTTTTATTT TTATAAAAAA GACTTTATTT TTTTAAAAAA AATAAAGTGA ATTTTGAAAA CATGCTCTTT GACAATTTTC TGTTTCCTTT TTCATCATTG GGTTAAATCT CATAGTGCCT CTATTCAATA ATTTGGGCTC AATTTAATTA GTAGAGTCTA CATAAAATTT ACCTTAATAG TAGAGAATAG AGAGTCTTGG AAAGTTGGTT TTTCTCGAGG AAGAAAGGAA ATGTTAAAAA CTGTGATATT TTTTTTTTGG ATTAATAGTT ATGTTTATAT GAAAACTGAA AATAAATAAA CTAACCATAT TAAATTTAGA ACAACACTTC AATTATTTTT TTAATTTGAT TAATTAAAAA ATTATTTGAT TAAATTTTTT AAAAGATCGT TGTTTCTTCT TCATCATGCT GATTGACACC CTCCACAAGC CAAGAGAAAC ACATAAGCTT TGGTTTTCTC ACTCTCCAAG CCCTCTATAT AAACAAATAT TGGAGTGAAG TTGTTGCATA ACTTGCATCG AACAATTAAT AGAAATAACA GAAAATTAAA AAAGAAATAT G.
10. 9. Patenttivaatimuksen 7 mukainen menetelmå, tunnettu sii-tå, ettå edeltåvå 5'-alue on identtinen Lbcl-geenin edeltåvien 5'-alueiden kanssa, jolla geenillå on sekvenssi: TTCTCTTAAT ACAATGGAGT TTTTGTTGAA CATACATACA TTTAAAAAAA AATCTCTAGT GTCTATTTAC CCGGTGAGAA GCCTTCTCGT GTTTTACACA CTTTAATATT ATTATATCCT CAACCCCACA AAAAAGAATA CTGTTATATC TTTCCAAACC TGTAGATTTA TTTATTTATT TATTTATTTT TACAAAGGAG ACTTCAGAAA AGTAATTACA TAAAGATAGT GAACATCATT TTATTTATTA TAATAAACTT TAAAATCAAA CTTTTTTATA TTTTTTGTTA CCCTTTTCAT TATTGGGTGA AATCTCATAG TGAAGCCATT AAATAATTTG GGCTCAAGTT TTATTAGTAA AGTCTGCATG AAATTTAACT TAACAATAGA GAGAGTTTTC GAAAGGGAGC GAATGTTAAA AAGTGTGATA TTATATTTTA TTTCGATTAA TAATTATGTT TACATGAAAA CATACAAAAA AATACTTTTA AATTCAGAAT AATACTTAAA ATATTTATTT GCTTAATTGA TTAACTGAAA ATTATTTGAT TAGGATTTTG AAAAGATCAT TGGCTCTTCG TCATGCCGAT TGACACCCTC CACÅAGCCAA GAGAAACTTA AGTTGTAAAC TTTCTCACTC CAAGCCTTCT ATATAAACAT GTATTGGATG tgaagttatt gcataacttg cattgaacaa TAGAAAATAA CAAAAAAAAG TAAAAAAGTA GAAAAGAAAT ATG. 91083 29
11. 10. Patenttivaatimuksen 7 mukainen menetelmå, tunnettu sii-tå, ettå edeltåvå 5'-alue on identtinen Lbc2-geenin edeltå-vien 5'-alueiden kanssa, jolla geenillå on sekvenssi: TCGAGTTTTT ACTGAACATA CATTTATTAA AAAAAACTCT CTAGTGTCCA TTTATTCGGC GAGAAGCCTT CTCGTGCTTT ACACACTTTA ATATTATTAT ATCCCCACCC CCACCAAAAA AAAAAAAACT GTTATATCTT TCCAGTACAT TTATTTCTTA TTTTTACAAA GGAAACTTCA CGAAAGTAAT TACAAAAAAG ATAGTGAACA TCATTTTTTT AGTTAAGATG AATTTTAAAA TCACACTTTT TTATATTTTT TTGTTACCCT TTTCATTATT GGGTGAAATC TCATAGTGAA ACTATTAAAT AGTTTGGGCT CAAGTTTTAT TAGTAAAGTC TGCATGAAAT TTAACTTAAT AATAGAGAGA GTTTTGGAAA GGTAACGAAT GTTAGAAAGT GTGATATTAT TATAGTTTTA TTTAGATTAA TAATTATGTT TACATGAAAA TTGACAATTT ATTTTTAAAA TTCAGAGTAA TACTTAAATT ACTTATTTAC TTTAAGATTT TGAAAAGATC ATTTGGCTCT TCATCATGCC GATTGACACC CTCCACAAGC CAAGAGAAAC TTAAGTTGTA ATTTTTCTAA CTCCAAGCCT TCTATATAAA CACGTATTGG ATGTGAAGTT GTTGCATAAC TTGCATTGAA CAATAGAAAT AACAACAAAG AAAATAAGTG AAAAAAGAAA TATG.
12. 11. Patenttivaatimuksen 7 mukainen menetelmå, tunnettu sii-tå, ettå edeltåvå 5'-alue on identtinen Lbc3-geenin edeltå-vien 5'-alueiden kanssa, jolla geenillå on sekvenssi: TATGAAGATT AAAAAATACA CTCATATATA TGCCATAAGA ACCAACAAAA GTACTATTTA AGAAAAGAAA AAAAAAACCT GCTACATAAT TTCCAATCTT GTAGATTTAT TTCTTTTATT TTTATAAAGG AGAGTTAAAA AAATTACAAA ATAAAAATAG TGAACATCGT CTAAGCATTT TTATATAAGA TGAATTTTAA AAATATAATT TTTTTGTCTA AATCGTATGT ATCTTGTCTT AGAGCCATTT TTGTTTAAAT TGGATAAGAT CACACTATAA AGTTCTTC CT C C GAGTTTG A TATAAAAAAA ATTGTTTCCC TTTTGATTAT TGGATAAAAT CTCGTAGTGA CATTATATTA AAAAAATTAG GGCTCAATTT TTATTAGTAT AGTTTGCATA AATTTTAACT TAAAAATAGA GAAAATCTGG AAAAGGGACT GTTAAAAAGT GTGATATTAG AAATTTGTCG GATATATTAA TATTTTATTT TATATGGAAA CTAAAAAAAT ATATATTAAA ATTTTAAATT CAGAATAATA CTTAAATTAT TTATTTACTG AAAATGAGTT GATTTAAGTT TTTGAAAAGA TGATTGTCTC TTCACCATAC CAATTGATCA CCCTCCTCCA ACAAGCCAAG AGAGACATAA GTTTTATTAG TTATTCTGAT CACTCTTCAA GCCTTCTATA TAAATAAGTA TTGGATGTGA AGTTGTTGCA TAACTTGCAT TGAACAATTA ATAGAAATAA CAGAAAAGTA GAAAAGAAAT ATG. 1 DNA-sekvenssi, jota voidaan kåyttåå yhdistelmå-DNA-segment isså patenttivaatimusten l-ll mukaisten menetelmien suo-rittamisessa, tunnettu siitå, ettå se kåsittåå ensimmåisen DNA-sekvenssin, joka sisåltåå promoottorisekvenssin, ja toisen DNA-sekvenssin, joka sisåltåå signaalisekvenssin, jota sååtelevåt posttranskriptionaalisella tasolla hemi, hemi- 30 analogit tai hemiprekursorit, ja joka on identtinen kasvi-leghemoglobiinin edeltåvån 5'-alueen kanssa.
13. 13. DNA-sekvenssi, jota kåytetåån patenttivaatimuksen 12 mukaisen menetelmån suorittamisessa, tunnettu siitå, ettå se on identtinen soijapavun leghemoglobiinigeenien signaalisek-venssin kanssa.
14. 14. Patenttivaatimuksen 13 mukainen DNA-sekvenssi, tunnettu siitå, ettå se on identtinen Lba-geenin edeltåvien 5'-aluei-den kanssa, jolla geenillå on sekvenssi: GAGATACATT ATAATAATCT CTCTAGTGTC TATTTATTAT TTTATCTGGT GATATATACC TTCTCGTATA CTGTTATTTT TTCAATCTTG TAGATTTACT TCTTTTATTT TTATAAAAAA GACTTTATTT TTTTAAAAAA AATAAAGTGA ATTTTGAAAA CATGCTCTTT GACAATTTTC TGTTTCCTTT TTCATCATTG GGTTAAATCT CATAGTGCCT CTATTCAATA ATTTGGGCTC AATTTAATTA GTAGAGTCTA CATAAAATTT ACCTTAATAG TAGAGAATAG AGAGTCTTGG AAAGTTGGTT TTTCTCGAGG AAGAAAGGAA ATGTTAAAAA CTGTGATATT TTTTTTTTGG ATTAATAGTT ATGTTTATAT GAAAACTGAA AATAAATAAA CTAACCATAT TAAATTTAGA ACAACACTTC AATTATTTTT TTAATTTGAT TAATTAAAAA ATTATTTGAT TAAATTTTTT AAAAGATCGT TGTTTCTTCT TCATCATGCT GATTGACACC CTCCACAAGC CAAGAGAAAC ACATAAGCTT TGGTTTTCTC ACTCTCCAAG CCCTCTATAT AAACAAATAT TGGAGTGAAG TTGTTGCATA ACTTGCATCG AACAATTAAT AGAAATAACA GAAAATTAAA AAAGAAATAT G.
15. 15. Patenttivaatimuksen 13 mukainen DNA-sekvenssi, tunnettu siitå, ettå se on identtinen Lbcl-geenin edeltåvien 5'-alu-eiden kanssa, jolla geenillå on sekvenssi: TTCTCTTAAT ACAATGGAGT TTTTGTTGAA CATACATACA TTTAAAAAAA AATCTCTAGT GTCTATTTAC CCGGTGAGAA GCCTTCTCGT GTTTTACACA CTTTAATATT ATTATATCCT CAACCCCACA AAAAAGAATA CTGTTATATC TTTCCAAACC TGTAGATTTA TTTATTTATT TATTTATTTT TACAAAGGAG ACTTCAGAAA AGTAATTACA TAAAGATAGT GAACATCATT TTATTTATTA TAATAAACTT TAAAATCAAA CTTTTTTATA TTTTTTGTTA CCCTTTTCAT TATTGGGTGA AATCTCATAG TGAAGCCATT AAATAATTTG GGCTCAAGTT TTATTAGTAA AGTCTGCATG AAATTTAACT TAACAATAGA GAGAGTTTTC GAAAGGGAGC GAATGTTAAA AAGTGTGATA TTATATTTTA TTTCGATTAA TAATTATGTT TACATGAAAA CATACAAAAA AATACTTTTA AATTCAGAAT AATACTTAAA ΑΤΛΤΤΤΑΤΤΤ GCTTAATTGA TTAACTGAAA ATTATTTGAT TAGGATTTTG AAAAGATCAT TGGCTCTTCG TCATGCCGAT TGACACCCTC CACAAGCCAA GAGAAACTTA AGTTGTAAAC TTTCTCACTC CAAGCCTTCT ATATAAACAT GTATTGGATG TGAAGTTATT GCATAACTTG CATTGAACAA TAGAAAATAA CAAAAAAAAG TAAAAAAGTA GAAaAGAAAT ATG. 31 91083
16. 16. Patenttivaatimuksen 13 mukainen DNA-sekvenssi, tunnettu siitå, ettå se on identtinen Lbc2-geenin edeltåvien 5'-alu-eiden kanssa, jolla geenillå on sekvenssi: TCGAGTTTTT ACTGAACATA CATTTATTAA AAAAAACTCT CTAGTGTCCA TTTATTCGGC GAGAAGCCTT CTCGTGCTTT ACACACTTTA ATATTATTAT ATCCCCACCC CCACCAAAAA AAAAAAAACT GTTATATCTT TCCAGTACAT TTATTTCTTA TTTTTACAAA GGAAACTTCA CGAAAGTAAT TACAAAAAAG ATAGTGAACA TCATTTTTTT AGTTAAGATG AATTTTAAAA TCACACTTTT TTATATTTTT TTGTTACCCT TTTCATTATT GGGTGAAATC TCATAGTGAA ACTATTAAAT AGTTTGGGCT CAAGTTTTAT TAGTAAAGTC TGCATGAAAT TTAACTTAAT AATAGAGAGA GTTTTGGAAA GGTAACGAAT GTTAGAAAGT GTGATATTAT TATAGTTTTA TTTAGATTAA TAATTATGTT TACATGAAAA TTGACAATTT ΑΤΤΤΤΤΑΑΛΑ TTCAGAGTAA TACTTAAATT ACTTATTTAC TTTAAGATTT TGAAAAGATC ATTTGGCTCT TCATCATGCC GATTGACACC CTCCACAAGC CAAGAGAAAC TTAAGTTGTA ATTTTTCTAA CTCCAAGCCT TCTATATAAA CACGTATTGG ATGTGAAGTT GTTGCATAAC TTGCATTGAA CAATAGAAAT AACAACAAAG AAAATAAGTG AAAAAAGAAA TATG.
17. 17. Patenttivaatimuksen 13 mukainen DNA-sekvenssi, tunnettu siitå, ettå se on identtinen Lbc3-geenin edeltåvien 5'-alu-eiden kanssa, jolla geenillå on sekvenssi: TATGAAGATT AAAAAATACA CTCATATATA TGCCATAAGA ACCAACAAAA GTACTATTTA AGAAAAGAAA AAAAAAACCT GCTACATAAT TTCCAATCTT GTAGATTTAT TTCTTTTATT TTTATAAAGG AGAGTTAAAA AAATTACAAA ATAAAAATAG TGAACATCGT CTAAGCATTT TTATATAAGA TGAATTTTAA AAATATAATT TTTTTGTCTA AATCGTATGT ATCTTGTCTT AGAGCCATTT TTGTTTAAAT TGGATAAGAT CACACTATAA AGTTCTTCCT CCGAGTTTGA TATAAAAAAA ATTGTTTCCC TTTTGATTAT TGGATAAAAT CTCGTAGTGA CATTATATTA AAAAAATTAG GGCTCAATTT TTATTAGTAT AGTTTGCATA AATTTTAACT TAAAAATAGA GAAAATCTGG AAAAGGGACT GTTAAAAAGT GTGATATTAG AAATTTGTCG GATATATTAA TATTTTATTT TATATGGAAA CTAAAAAAAT ΑΤΛΤΑΤΤΑΑΑ ATTTTAAATT CAGAATAATA CTTAAATTAT TTATTTACTG AAAATGAGTT GATTTAAGTT TTTGAAAAGA TGATTGTCTC TTCACCATAC CAATTGATCA CCCTCCTCCA ACAAGCCAAG AGAGACATAA GTTTTATTAG TTATTCTGAT CACTCTTCAA GCCTTCTATA TAAATAAGTA TTGGATGTGA AGTTGTTGCA TAACTTGCAT TGAACAATTA ATAGAAATAA CAGAAAAGTA GAAAAGAAAT ATG.
18. 18. Yhdistelmå-DNA-sekvenssi kåytettåvåksi patenttivaati-musten 1-12 mukaisissa menetelmisså, tunnettu siitå, ettå se sisåltåå sen geenin, jota halutaan ilmentåå sekå minkå ta-hansa patenttivaatimuksen 12-17 mukaisen DNA-sekvenssin.
19. 19. Plasmidi, jota voidaan kåyttåå patenttivaatimuksen 1 mukaisessa menetelmåsså kloramfenikoli-asetyyli-transferaa-sin (CAT) valmistamiseksi, tunnettu siitå, ettå se on nimet- 32 ty YEP Lb CAT:ksi ja ilman CAT-geeniå sisåltåå promootto-risekvenssin ja signaalisekvenssin DNA-sekvenssisså, joka sisåltåå edeltåvån soijapapuleghemoglobiinigeenin Lbc3 5'-alueen ja jonka rakenne on esitetty kaaviossa 6.
20. 20. Plasmidi, jota voidaan kåyttåå patenttivaatimuksen 1 mukaisessa menetelmåsså neomysiinifosfotransferaasi (NPT) II:n valmistamiseksi, tunnettu siitå, ettå se on nimetty YEP 5 Lb Km:ksi ja ilman NPT II-geeniå sisåltåå promoottorisek-venssin ja signaalisekvenssin DNA-sekvenssisså, joka sisåltåå edeltåvån soijapapuleghemoglobiinigeenin Lbc3 5'-alu-een ja jonka rakenne on esitetty kaaviossa 8.