JPH02501260A - 合成遺伝子を使用した酵母細胞でのブタ成長ホルモンの生産方法 - Google Patents
合成遺伝子を使用した酵母細胞でのブタ成長ホルモンの生産方法Info
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
合成遺伝子を使用した酵母細胞でのブタ成長ホルモンの生産方法[発明の背景]
この発明は、ブタの成長率および飼料効率を改善するため酵母細胞でブタ成長ホ
ルモンを合成遺伝子によって生産する方法に関するものである。
従来、養豚業者は、成長を促進し飼料効率を高めるため、高タンパク質含有飼料
または合成ステロイドを使用してきた。しかしステロイド補充飼料は速やかに代
謝されず、体内に長期間残留し、ヒトに有害な影響があることが判明したため、
文明国ではその使用を禁止している。
この点を考慮して、この発明の発明者は、遺伝子操作技術により酵母でブタ成長
ホルモンを経済的かつ大量に生産し得ることを発見し、この発見を養豚業に適用
しようと考えた。
したがって、本発明者らは、酵母細胞を使用した結果、別の既知方法[シーバー
ブら、DNA、2巻(1983年)、37頁]と異なった方法で、N−末端がA
laから始まる天然成熟ブタ成長ホルモンを大量生産し得る方法を発見し、この
発明を完成した。
[発明の要約]
この発明の目的は、酵母を形質発現ベクターの宿主として使用することによるブ
タ成長ホルモンの生産方法を提供することにある。
即ち、酵母を形質発現ベクターの宿主として使用することによるブタ成長ホルモ
ンの生産方法は、(a)ブタ成長ホルモンのアミノ酸配列に基づいて、Sac
I 、Xba IおよびSal I制限酵素部位を有するオリゴヌクレオチドを
合成し、(b)ライゲーション・ストラブジーに基づいて連結した合成オリゴヌ
クレオチドのC−末−Xba I /5alI断片を、Xba I /Sat
I制限酵素で処理したエシェリヒア・コリベクターpUc18へクローニングし
、’(C) Sac I /Xba I制限酵素で処理した合成オリゴヌクレオ
チドのN−末端Sac I /Xba I断片を、上記のクローン化したベクタ
ーへクローニングしてN−末端部分を転子およびN−末端合成アダブタ−をプロ
モーターおよびターミネータ−を含んだエシェリヒア・コリ・ベクターへクロー
ニングしてプロモーター−N−末端合成アダブタ−を有するブタ成長ホルモン遺
伝子−ター乍ネーターからなるカセットを作成し、(e)カセットを酵母形質発
現ベクターへ再クローニングし、(f)得られたベクターを酵f&細胞で形質発
現することからなる。
N−末端合成アダブタ−遺伝子は下記のNC0IおよびSac I制限酵素部位
を有する塩基配列である。
NcoI部位 ’ Sac工部位
得られた形質発現ベクターは、プロモーター−N−末端合成アダブタ−を有する
ブタ成長ホルモン遺伝子−ターミネータ−、完全な2ミクロン遺伝子、Leu
2d遺伝子および複製起源からなるカセットをクローニングしたベクター(PC
I/1−PGH)である。
図面の簡単な説明
長ホルモン遺伝子に対応する合成オリゴヌクレオチドである。
第2図はオリゴヌクレオチドのライゲーション・ストラブジーである。
第3図はエシェリヒア・コリのベクター(pUc18)へ合成オリゴヌクレオチ
ドをクローン化するクローニング・ストラブジーの略図である。
第4図は確認したブタ成長ホルモン遺伝子の塩基配列および推定アミノ酸配列で
ある。
第5図はエシェリヒア・コリのベクター(pPGAP)およびブタ成長ホルモン
を酵母で生産する酵母形質発現ベクター(pci/1)のクローニング手順であ
る。
第6図は酵!細胞で生産されたブタ成長ホルモンを5DS−ポリアクリルアミド
ゲル電気泳動により確認した結果である。
[好ましい態様の詳細な説明]
頁]によって報告されたブタ成長ホルモンのアミノ酸配列に基づき酵母細胞で優
勢に利用されるアミノ酸コドンを有するブタ成長ホルモン遺伝子の塩基配列を選
び、N−末端がAlaで始まる天然状態の成熟ブタ成長ホルモンの全遺伝子をホ
スホアミデート法により、遺伝子シンセサイザー(アプライド・バイオシステム
、モデル380B、米国)で化学的に合成した。
合成オリゴヌクレオチドを第2図に示すようにライゲーションし、これをエシェ
リヒア・コリのベクター、pUc18[ノーランダーら、ジーン、36巻(19
83年)、101〜106頁]ヘクローニングして552塩基対のSac I
/Sal I制限断片を含んだベクターpPGH(552)を作成したが、この
ものは579塩基対の成熟ブタ成長ホルモン遺伝子のN−末端領域を有していな
い(第3図参照)。
完全なブタ成長ホルモン遺伝子を含んだクローンを作成し、これを酵母宿主で形
質発現するため、pPGH(552)からSac I /5a11断片を分離し
、プロモーターおよびターミネータ−遺伝子を含んだベクターpPGAP[クロ
ーンチック・ラボ、パロ・アルド、CA94303、米国、ホランド、J、P、
&ホランド、J、J、、ザ・ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー
、255巻、2596〜2605(1980年)、ビッタ−1G、A、&イーガ
ン、K、M、、ジ、−シ、32巻、263〜274頁(1984年)、20B−
12、ズー、X、L、ら、モレキュラー・アンド・ジェネラル・ジェネティッ′
クス、9194.31〜41頁(1984年)、ATCC34025]のNeo
1部位および5alI部位の間へ挿入してpPGAP−PGH(579)を得
た[ここで化学的に合成された該アダプターはNCOI制限酵素部位、開始コド
ンおよびN−末端領域に対応する若干のアミノ酸コドンからなる] (実施例3
参照)。
pPGAP−PGH(579)をBamHI制限酵素で処理して、プロモーター
、ブタ成長ホルモン遺伝子およびターミネータ−を含んだBam旧断片(約19
70塩基対)を分離する。BamHI断片をエシェリヒア・コリおよび酵母で自
動的に複製される酵母形質発現ベクターpci/1 [ATCC37115ニブ
レークら、プロシーディングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミ−・オプ・サ
イエンシズ・オプ・ザ−USA、81巻(1984年)、4642頁]のBam
H■制限酵素部位へ挿入し、PCI/1−PGHを作成した(第5図参照)。
ヒネンらの方法を用いて、酵母形質発現ベクターを酵母株DCO4[イースト・
ジェネティック・ストック・センター、ブローチ、J、R,&ヒックス、J、B
、、セル、21巻、501頁(1980年)〕ヘクローニングした。実施例5に
示したように、形質転換した酵母細胞を2%グルコースを含有するYEPD培地
で24時間培養すると、ブタ成長ホルモンは細胞の増殖速度に依存して生産され
、OD、、、=20で、培養1リットル当り200mgのブタ成長ホルモンを得
ることができた。
以下に実施例をあげてこの発明を説明する。実施例は単に発明を説明するための
ものであって、発明の範囲を限定する目的をもつものではない。
実施例1
ブタ成長ホルモン遺伝子の合成オリゴヌクレオチドのライゲーションおよびベク
ターpUc18へのクローニング第1図に示した遺伝子配列を有する合成オリゴ
ヌクレオチドから完全なブタ成長ホルモン遺伝子を得るため、第2図のようなラ
イゲーション・ストラテジーおよび5acl 、Sal I 、 Xbal等の
制限部位を含んだベクターpUc18を使用した。
合成オリゴヌクレオチドからのXbalおよびSal I制限断片の3゛−末端
に対応する各オリゴヌクレオチド(U7−U14/L8−Li2)をオリゴヌク
レオチドのODハ。がそれぞれ0.05に等しい量を取り、別々に乾燥した。5
0mM トリス−HCl (pH7,5) 、1mMATP、1mM DTTお
よび10 m M M g Clxを含有する全量30μlのtffr液にT4
ポリヌクレオチドキナーゼ4単位を添加し、37℃で30分間反応してオリゴヌ
クレオチドの5“−末端残基をリン酸化した。オリゴヌクレオチドをプールし、
これと同量のフェノールおよびクロロホルム混合液で処理した後、エタノールで
沈殿した。沈殿を60mM )リス−HCl (pH7,5)、1mMDTTお
よび10mM MgC1,を含有する緩衝液53μlに溶解した。この溶液を9
5℃の水浴に加え、温度が徐々に室温に下がるにつれて各オリゴヌクレオチドが
相補的配列と塩基対を作るよう、6時間室温に保った。
T4 DNAリガーゼ(20単位)および10mM ATP 5μmを加え、オ
リゴヌクレオチドの5′−および3°−末端を室温で1゜分間ライゲーションし
た。上記の溶液をフェノールおよびクロロホルム混合液で処理し、エタノールで
沈殿した。
沈殿した核酸に60mM )リス(pH7,6)、10mMMgCIzおよび1
00mM NaClを含有する緩衝液の存在で、Xba IおよびSal 1制
限酵素それぞれ10単位を加え、37℃で1時間反応した。
200〜300塩基対に対応するバンドをゲルから切り出した。!気溶出後、沈
殿を蒸留水20μlに溶解した。
DNA 3μlおよびXba Iおよび5ail制限酵素で切断したベクターp
Uc18 10ngを60mM )リス−HCl (PH7,5)、10mMD
TT、10mM MgC1,,1mM ATPおよびT4DNAリガーゼ10単
位を含有するライゲーション溶液の存在で、14℃で16時間ライゲーションし
た。
エシェリヒア・コリJM103 [BRL社、米国、メツシング、J9、メソッ
ズ・イン・エンザイモロジー、103巻、20〜78頁(1983年)]受容細
胞をライゲーション反応物へ加え、ハナハンの方法[ジャーナル・オブ・モレキ
ュラー・バイオロジー、116巻、557頁(1983年)〕により37℃で形
質転換した。
バーンボイムおよびドリーの方法[ヌクレイツク・アシツズ・リサーチ、7巻、
1513頁(1979年)]を用いて、白色コロニーからp3”−PGHを含有
するクローンを選び出した。
一方、第3図に示したように、完全なブタ成長ホルモン遺伝子の5′−末端Sa
c IおよびXba I制限断片に対応するオリゴヌクレオチド(Ul−U7/
L2−L8)を上記と同様の方法によってライゲーションし、Sac Iおよび
Xba I制限酵素で切断したp3’−PGHべのジデオキシ配列決定法[プロ
シーデイングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミ−・オブ・サイエンシズ・オ
プ・ザ・USA、74巻、5473〜5477頁]によってヌクレオチド配列を
確認した(第4図参照)。
実施例2
酵母細胞で形質発現する合成ブタ成長ホルモン遺伝子の操作pPGH(552)
は完全なブタ成長ホルモンの5−残基における9個のアミノ酸を含んでおらず、
完全なブタ成長ホルモン遺伝子をクローニングし、それを酵母細胞で形質発現す
るため、5′−末端の欠損部分を遺祉子シンセサイザーによって合成した。酵母
細胞によって選択的に使用されるコドンを選ぶことにより、Ncal制限酵素部
位を含んだアダプター、開始コドンおよび8個のアミノ酸に対応するコドンを合
成し、他方の末端にはSaf:I制限酵素部位を合成した(第5図参照)。
クローニングの方法は、下記のようにpPGH(552)をSac!およびSa
t I制限酵素で処理して、552塩基対に対応する制限酵素切断断片を得、ア
ガロース電気泳動に掛けてこの断片を分離した。この断片および合成アダプター
を、プロモーターおよびターミネータ−を含んだベクターpPGAPのNco
1およびSal I制限酵素部位の間へ挿入した。詳細な方法は下記の通りであ
る。実施例1に記載のように、各合成アダプターの5”−末端をT4ポリヌクレ
オチドキナーゼでリン酸化した。各リン酸化溶液1μm、pPGH(552)か
ら分離したSac I /Sal I断片3μ! (30ng>およびNeo
Iおよび5alI制限酵素で切断したベクターpPGAP 1μl(7ng)を
混合し、15分間65℃に保った。徐々に室温に冷却した。10mM ATP
2μl、10倍濃厚なライゲーション反応t!街液2μl、リガーゼ1μlおよ
び蒸留水8μlを加え、14℃で16時間反応した。
実施例1の方法に基づき、上記の反応物をエシェリヒア・コリHBIO1[AT
CC37017]ヘクローニングし、酵母で形質発現するためのプロモーター、
完全なブタ成長ホルモン遺伝子およびターミネータ−を含んだpPGAP−PG
Hを作成した。
ベクターpPGAPはグリセルアルデヒド−3′−リン酸デヒドロゲナーゼプロ
モーター、細胞の増殖にしたがって形質発現される構成プロモーターおよびター
ミネータ−を含有している。pPGAP−PGHをBaI!l旧制限酵素で処理
して、グリセルアルデヒド−3′−リン酸デヒドロゲナーゼプロモーター、ブタ
成長ホルモン遺伝子およびグリセルアルデヒド−3′−リン酸デヒドロゲナーゼ
ターミネータ−を含んだ約1970塩基対のBamHI制限断片を分離した。
BamH1制限断片を、酵母細胞で複製可能な形質発現ベクターpci/1のB
an)l 1制限酵素部位へ挿入して、PCI/1−PGHを作成した(第5図
参照)。
pci/1−PGH遺伝子を、ヒネンの方法[プワシーデイングズ・オブ・ザ・
ナショナル・アカデミ−・オプ・サイエンシズ・オプ・ザ・USA、75巻(1
978年)、1929頁]により、酵母株DCO4ヘクローニングした。
30℃で5日間培養後、ブタ成長ホルモン遺伝子を含んだ組換え体クローンを採
取し、実施例3に記載の方法により同定見た。
案施例3
ブタ成長ホルモンを生産する酵母の培養およびその同定ベクターPCI/1−P
GHで形質転換した酵f&細胞各3mlを、ロイシン無含肴培地(培地1リット
ル当り、アミノ酸無含有酵母望素塩基6.7g、Leu−欠乏アミノ酸すツプル
メント0.25 gおよび6%グルコース含有)中で、30℃で24時間培養し
た。培養を2%ペプトン、1%酵母抽出物および2%グルコースを含有するYE
PD培地100m1へ加え、30℃で24時間培養した。
得られたOD&、。は約40に等しかった。その10(OD、、。)に相当する
フラクションを取り、遠心した。これを10mM)リス−MCI (pH7,5
)、1mMEDTA、2mM フェニルメチルスルホニルフルオリドおよび8M
尿素を含有するMm液400μ“lに溶解し、直径0.45mmの同量のガラス
ピーズを加えて激しく振とうした。細胞壁を破壊した後、ウシ成長中ルモンを緩
衝液へ溶出し、溶出液の4μlを12.5%5DS−ポリアクリルアミドゲルで
電気泳動に掛けた。
その結果を第6図に示す。
8枠はバイオ・ラド社からのタンパク質の標準分子量を表す。
1枠および5枠はブタ成長ホルモン遺伝子を含んでいないベクタ2〜4枠はブタ
成長ホルモン遺伝子を含んでいるベクターpci/1−PGHで形質転換した酵
母細胞の全タンパク質を表す。
第6図2〜4枠に示したまうに、ブタ成長ホルモンは約22Kdのバンドに全タ
ンパク質の10%に対応する量で出現することがゲルスキャンニングによって明
らかである。
確認されたアミノ酸配列(バイオメジカル・リソース・センター、ユニバージテ
ィー・オブ・カリフォルニア、サン・フランシシスコ)により、アラニンから始
まる成熟ブタ成長ホルモンが認められ、イン・ビボでそのメチオニンがアミノペ
プチダーゼによってプロセスされるものと考えられる。
■ヨ(5’−3F) :遺伝子配列
PGH:ライゲーシジン・ストラテジー5acl Xbal Sail
Fig、3
Fig、4
Fig、5
F i g、6
国際調査報告
Claims (2)
- (1)(a)ブタ成長ホルモンのアミノ酸配列に基づいて、SacI、XbaI およびSac1制限酵素部位および酵母で優勢に使用されるコドンを有するオリ ゴヌクレオチドを合成し、(b)ブタ成長ホルモン遺伝子およびN−末端合成ア ダプターをプロモーターおよびク_ミネ_ターを含んだエシェリヒア・コリ・ベ クタへクローニングしてブロモーター−ブタ成長ホルモン遺伝子−ターミネータ −からなるカセットを作成し、(c)このカセットを酵母形質発現ベクターへ再 クローニングし、(d)得られたベクターを酵母細胞で形質発現することからな るブタ成長ホルモンの生産方法。
- (2)N−末端合成アダプターが下記のNcoIおよびSac1制限酵素部位 【配列があります】 を有する塩基配列である請求の範囲第1項記載のブタ成長ホルモンの生産方法。
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