JPH03143385A - 酵母細胞 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、Ｓｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓ属の酵母細胞
類およびポリペプチド類の製造方法に関する。

生物工学関連の真核性蛋白質類の発現のために、特定の
要求に合わせて選択される種々の宿主系か存在している
。最も頻繁に使用される宿主生物は、Ｅｓｃｈｃｒｉｃ
ｈｉａ　ｃｏｌｔであり、原核性宿主生物の最もよく知
られた代表的なものであり、また５ａｃｃｈａｒｏｌＩ
ｌｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｃおよび動物組織培養
物が真核性宿主細胞として使用される。例えば、糖蛋白
質の発現が必要な場合等、ある種の目的のためには、Ｅ
、ｅｏｌｉまたは他の原核性生物は、それらがグリコシ
ル化の能力を欠いているために不適当である。他方にお
いて、組織培養における蛋白質の入量生産は、未だに煩
雑かつ高価なものであるため、多くの場合に選択される
生物は、良く特徴付けがなされたＳａｃｃｈａｒｏｍｙ
ｃｅｓ属の酵母である。

Ｓ、ｃｅｒｅｖｉｓｉａｃは、例えばＭＣＩ　（Ｋｕｒ
ｊａｎおよび１１ｃｒｓｋｏｗｉｔｚ、　１９８２）　
、β−エンドルフィンまたはα−インターフェロン（Ｂ
ｉｔｔｅｒら、１９８４）等のポリペプチド類のような
小さい蛋白質を効率的に分泌するが、高分子量の蛋白質
は、細胞原形質空間（Ｅｍｒら、１９８１）または細胞
質内に捕捉され、しかして成長速度の減少、あるいは細
胞の死さえも引起こす。

従って、本発明の目的は、選択的に外来ＤＮＡによりコ
ードされた蛋白質を培芥培地中に分泌することができる
改良された真核性発現系を提供することである。

この目的は、ＳｃｈｗａｎｎｌｏＩＩｙｃｅｓ属の酵母
細胞であって、 ａ）レギユロンとして作用する第１のＤＮＡ配列、ｂ）
シグナルペプチドをコードする選択的な第２のＤＮＡ配
列、 Ｃ）外来蛋白質をコードする第３のＤＮＡ配列、および
、 ｄ）ターミネータとして作用する選択的な第４のＤＮＡ
配列 を含んでなる、少なくとも１個の発現カセットを含有す
る酵母細胞によりｊｌＶ決された。

その他の課題を含む本発明は、以下の記述、例示および
図面によって、更に詳細に記述される。

図面の簡１７１−な記述 第１図 Ａ：　α−アミラーゼをコードするＡＭＹ］遺伝子およ
びその５′と３′非コード領域の制限地図。

Ｂ：　　ＡＭＹＩ遺伝子およびその隣接領域のヌクレオ
チド配列。５′領域において、転写開始部位は、配列上
側の破線により示されている。構造遺伝子内において、
推定されるシグナルペプチド切断部位は、星印により示
されている。２個の可能なグリコシル化部位、４位のジ
スルフィド結合形成が予想されるシスティン残ｕ　（Ａ
’、ｏｒｙｚａｅ酵素との相同性から法論される）は、
下線を付しである。３′末端領域において、転写停止シ
グナルＴＡＧ、　、　、　ＴＡＴＧＴ　、　、　、　Ｔ
ＴＴは、実線により示されている。

第２図 Ａ：　グルコアミラーゼをコードするＧＡＭＩ遺伝子お
よびその５′と３′非コード領域の制限地図。

Ｂ：　　ＧＡＭ］遺伝子およびその隣接領域のヌクレオ
チド配列。５′領域において、転写開始部位は破線によ
り示されている。構造遺伝子において、推定されるシグ
ナルペプチド切断部位は、星印により示されている。

第３図 Ｍ１３　　Ｘｈｏ　１．１．８ｋｂプロモ一タ断片とα
アミラーゼ遺伝子の約０．４ｋｂ構造遺伝子断片を含む
ＥｃｏＲＩ　−８ｅａ　Ｉ断片は、ＥｃｏＲＩおよび５
ＩＩａ、　Ｉによりあらかじめ消化されたＭ１３ｎ＋ｐ
８中にサブクローン化された。部位指向変異誘発により
、Ｘｈｏ　Ｉ一部位がＡＴＧコドンの直前に押入された
： ＊＊＊ ５’　　、、ＴＡＡＡＡＴＡＡＡＡＧＣＴＣＧＡＧＡＴ
ＧＡＧＡＴＴＴ、、、３’部位指向変累誘発により交換
された塩基の位置は、アステリクスにより示されている
。

第４図 ｐ　Ｍ　ａ　Ｇ　Ａ　Ｍ　−Ｂ　／　Ｓ　０グルコアミ
ラーゼ遺ｈミ子およびその５′と３′隣接領域を含むｈ
ｌ　Ｈ断片は、ベクターｐＭＡＣ５二８　（Ｋｒａｍｅ
ｒら、１９８４）のＢａｍＨ１部位中にサブクローン化
された。

間隙化二重Ｄ　Ｎ　Ａ　（ｇａｐｐｃｄ　ｄｕｐｌｅｘ
　Ｄ　Ｎ　Ａ）法（ＫｒａＩ！ｌｃｒら、１．９８４）
を用いた部位指向変異誘発により、Ｂａｎ１ｌｌ　　１
部位およびＳａｔ　　１部位が翻訳開始コドンＡＴＧの
直前に挿入された：＊　＊０＊＊＊　＊＊ ５’、、ＣＴＣＡＴＧＡＣＴＧＴＧＴＣＧＡＣＧＧＡＴ
ＣＣＡＡＧＡ′ｒＧＡＴＴｉ”ｌ’ｌ”、、、、３　。

部位特異的変異誘発により影響を受けた位置が、アステ
リクスでボされている。

第５図 ＹＲｐ７αＧＡＭ、該ＧＡ、Ｍ遺伝子は、ｐ　Ｍ　ａ　
ＧＡＭ−Ｂ／ＳからＳａｌ　　Ｉ断ハとしてｔＢ離され
、Ｍｌ　３　ａ　ＸｈｏのＸｈｏ　１部位に連結された
（第３図）。

α−アミラーゼプロモータＣＡＭ遺伝子融合物を保持す
るＢｇｌ　ＩＩ断片を、Ｓ、ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅベク
タＹＲｐ７の車−のＢａｍＨＩ部位に連結してプラスミ
ドＹＲｐ７αＧＡＭを牛じた。

第６図 グルコアミラーゼ遺伝子のプロモータおよびシグナル配
列を用いた外来遺伝子発現のためのＳ、ｏｃｃｉｄｅｎ
ｔａｌ　ｉｓベクターの構築。

ａ：　完全なＣＡＭプロモータおよびＧＡＭコド配列の
始めの２０８ｂｌ）を含むｐ　Ｂ　ＲＳ　ｗ　Ａ　ＲＳ
ＣＡＭ由来の４．　　Ｏｋｂ　Ｅｃｏｌ？　Ｉ　−Ｐｖ
ｕ　ＩＩ断片の、ＥｃｏＲＩ　／　Ｐｖｕ　ｎ切断ｐＢ
Ｒ３２２への挿入によりベクターｐＢＲＧＡＭを生じる
。

ｂ：　塩基対位置＋］］２からのセルラーゼをコードす
る構造遺伝子を含むプラスミドＩ）ＣＴ６０３由来の３
．４．ｋｂ　Ｐｖｕ　　ＩＩ断片の、プラスミドｐＢＲ
ＧＡＭのＰｖｕ　Ｉｆ部位への抑大によりベクターｐＢ
ＲＧｃ１を牛しる。

Ｃ：　プラスミドｐＢＲＧｃ１山来の５．５ｋｌ＞Ｂｇ
ｌ　Ｕ−ＰｓＬ　Ｉ断片の、Ｉｌａｍｌｌ　　Ｉ　／　
Ｐｓｔ　Ｉ　Ｅ７Ｊ断ｐＣＪＤ５−１への挿入。生した
プラスミド１）　Ｍ　Ｐ　Ｇ　Ｃ］　−１は、Ｇ　Ａ　
Ｍ５　’非コード領域の３２１　ｂｐおよびｃｅｉ　Ｄ
遺ｆｚｉ子の→−１−１２位に融合したＣＡＭＡＭコー
ド領域めの２０８ｂｐを含んでいる。

ｄ：　プラスミドｐＢＲＧｃ］由来の６．　５ｋｂ１３
ａｍｌｌ　　Ｉ　−Ｐｓｔ　Ｉ　ｔｊＪｉＪ’＋のＢａ
ｍ１ｌ　　Ｉ　／　Ｐｓｔ　Ｉ　ＩＪＪ断ｐＣＪＤ５−
１への挿入。生じたプラスミドｐＭＰＧｃ１−２は、Ｇ
ＡＭ５’非コード領域の１．３ｋｂおよびｅｅｌ　Ｄの
＋１１２位に融合したＧＡＭコード領域の始めの２０８
ｂｐを含んでいる。

第７図 異なった形質転換体： ＮＧＡ５８　：　ｐＭＰＡＧＣ。

ＮＧＡ５８　：　ｐＭＰＰＧＣ。

ＮＧＡ５８　：　ｐＭＰＧｃｌ−１、 ＮＧＡ５８　：　ｐＭＰＧＣｌ−２ による定性的エンドグルカナーゼＤ活性アッセイ（コン
ゴレッド染色）を用いたプロモータの研究。

ａ：　２％マルトース上での生育 ｂ：　４％グルコース上での生育 第８図 ＡＤＨＩプロモータの制御下における外来遺伝子発現の
ためのＳ、ｏｃｃ＋／ｄｅｎｔａｌ　ｊｓベクターの構
築。

ａ：　プラスミドｐＦＭ２−１の１．．４５ｋｂＢａｍ
ｌｌ　　Ｉ　−９ａｌ　　Ｉ　　ＡＤＨ１プロモ一タ断
片の、あらかじめＢａｍ１ｌ　　Ｉ　／Ｓａｌ　　Ｉ　
ＵＪ断されたｐＣＪＤ５−１への抑大によりプラスミド
ｐＭＰＡＤＨ１を生じる。

ｂ：　　Ｉ）ＪＤｃｇ−１５の３．　２ｋｂ　Ｓａｌ　
Ｉ断片のｐＭＰＡＤＨｌのＳａ、Ｉ　　１部位への挿入
により、ｐＭＰＡＧを生じる。

Ｃ：　プラスミドｐＭＰＧｃ１−２中のＣＡＭプロモー
タ（第６Ｄ図）のインビボ組換えによるプラスミドｐＭ
ＰＡＧ由来のＡＤＨＩプロモータへの交換によりプラス
ミドｐＭＰＡＧＣを生じる。

第９図 ＰＤＣプロモータの制御下における外来遺伝子発現のた
めのＳ、ｏｃｃｉｄ＋３ｎＬａｌ　ｉｓベクターの構築
。

ａ：　　ＣＡＭ遺伝子に融合したＰＤＣプロモータを含
むプラスミドｐＪＤｅｇ−１５由来の６．０ｋｂＳｐｈ
　Ｉ　−Ａｖａ　Ｉ断片の、あらかじめＳｐｈ　Ｉ　−
Ａｖａ■切断されたＹＲｐＪＤ２への押入によりプラス
ミドｐＭＰＰＧを生じる。

ｂ＝　プラスミドｐＭＰＧＣ１−２中のＣＡＭプロモー
タ（第６Ｄ図）のインビボ組換えによるプラスミドｐＭ
ＰＰＧ由来のＰＤＣプロモータへの交換によりプラスミ
ドｐＭＰＰＧＣを土じる。

第１０図 Ｓ、ｏｃｃｉｄｃｎｔａｌ　ｔｓの形質転換のための独
立的複製べフタ−（ＳｗＡＲＳ２を含む）の構築。

プラスミドＹＲｐＪＤ２由来の３．２ｋｂ　　ＴＲＰ５
　　Ｂａｍ１ｌ　　Ｉ断ｎを、プラスミドｐＢＲ８ｗＡ
Ｒ５ＧＡＭ（第６Ａ図）の５．　５ｋｂ　Ｉ３ａｍｌｌ
　ｌ　−ｎｇｌ■断片に連結し、ｐＭＰＴＳ２−Ａおよ
びｐＭＰＴｓ２−Ｂを生じる。

本願を通じて用いられる略号 制限エンドヌクレアーゼ： Ａａ　　−ＡａｔｌＩ Ａ　　　−Ａｓｐ７１８ Ｂ　　　−Ｂａｍ１　　Ｉ Ｂｇ−Ｂｇ！ＩＩ Ｃ−Ｃ］ａＩ Ｅ　　　−ＥｃｏＲＩ ＥＶ　　−ＥｃｏＲＶ Ｈ−１１ｉｎｄ　　ＩＩＩ Ｐ　　　−ＰｖｕＩＩ Ｐｓ−ＰｓＬＩ Ｓ　　−８ａｌＩ Ｓｃ−３ｅａ１ １つ Ｓｍ−８ＩＩｌａ■ ５ｐ−８ｐｈＩ Ｘ　　　　−ＸｈｏＩ 本願を通じて種々の刊行物は、括弧中に第１著者と発行
年とを記して参考とする。該参考文献のすべての引用は
、該明細書の最後に付してあり、明ＩＩＩ書を直ちに追
えるようにアルファベット順に掲げである。これらの刊
行物の全体を、ここに記載され請求されている発明の時
点における当業者に知られていた技術状況を完全に記述
するために、本願に参尤として組入れる。

本発明による酵母分子は、所望のポリペプチドの効率的
発現を確丈にし、選択的にこれを分泌するために機能的
な連結により設計された３〜４個の異なった成分をもっ
て構成された発現カセットを含有することを特徴とする
。これらの成分は以ドのように定義される： ａ）　レギユロンとして作用する第１のＤＮＡ配列。

本願を通じて使用される″レギユロン”なる用語は、特
定の横進遺伝子の発現の制御に関勺、する同側−作用性
（ｃｉｓ−ａｃｔｉｎｇ）　Ｄ　Ｎ　Ａ配列を含む。従
って、該用語は、例えばプロモータならびに転写因子ま
たは転写制御に関与する他の蛋白質に認識される配列等
の与えられたコード配列に先行する配列を包含する。従
って、“第１のＤＮＡ配列”は、公知のプロモータに対
応する配列に限定されない。また、挿入、削除または置
換等を受け、なおもレギユロンとしての活性を保ってい
る天然に生じるレギユロン類に対応するＤＮＡ配列も含
まれる。更には、“レギユロン”なる用語は、化学的に
合成された、または遺伝子工学的方法により得られた転
写の制御に関与するＤＮＡ配列を包含する。

ｂ）　シグナルペプチドをコードする選択的な第２のＤ
ＮＡ配列。この第２のＤＮＡ配列の意味は、コードされ
たペプチドをそのＮ−末端に含む作意のポリペプチドの
分泌を支配する種々のＤＮＡ配列を含む。

Ｃ）外来蛋白質をコードする第３のＤＮＡ配列。

このコード配列は、該第３のＤＮＡ配列について適切な
読枠を保つためにシグナルペプチドをコードしている。

しかして融合は、当業者には周知の組換えＤＮＡ技術の
方法の適用を必要とする。適切な融合の設計を可能とす
る方法として、一般的にはＭａｎｉａｔｉｓら（１，９
８２）が参照され、ここに例えば制限断片末端の種々の
処理方法、リンカ−分子のクローニングおよび同様な処
理等、適切な方法が極めて詳細に記述されている。

第３のＤＮＡ配列によりコードされる蛋白質は、何らか
の必要性を示すものであれはいかなる蛋白質であっても
よい。分泌系は、小分子に限らず大分子量蛋白質の分泌
も可能とするものであるから、いずれの所望の蛋白質の
発現も可能である。例えば以下の議論が参考となる。

「１）　　ターミネータとして作用する選択的な第４の
ＤＮＡ配列。ターミネータとしては、各宿主生物におい
て転写を効率的に停止させるいずれの配列でも使用する
ことができる。ターミネータ類は、例えばヘアピン構造
を形成する傾向のある配列および／またはポリアデニル
化部位であってもよい。

好ましい実施態様において、該ターミネータは、第２の
ＤＮＡ配列、すなわちレギユロンが誘導された遺伝子と
同じ遺伝子から誘導される。

４つの成分は、公知の技術を用いて互いに結合される。

選択的に適切な融合は、例えば境界の配列決定により確
認されるであろう。

本発明による酵母細胞は、上記ＤＮＡ配列の一部または
全部を含む発現カセットを少なくとも１個含有する。こ
れは、任意の所望の蛋白質の１１業的発現のための便利
な道具を提供する。

好ましい実施態様において、前記第１および／または第
２および／または第４のＤＮＡ配列は、例えばα−アミ
ラーゼまたはグルコアミラーゼ等の多くの生物内でデン
プンとの接触により誘導される酵素であるデンプン分解
性酵素をコードする遺伝子から誘導される。該ＤＮＡ配
列は、ＤｅｂａｒｌｏｍｙｃｅｓＳ　５ａｃｃｈａｒｏ
ｎ＋ｙｃｅｓ　　、　　１、ｉｐｏｍｙｃｅｓ　　。

ＰｉｃｈｉａまたはＳａｅｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ属のひ
とつに属する酵母から誘導され得るが、Ｓｃｈｖａｎｎ
ｉｏｍｙｃｃｓ属の酵母が好ましい。

Ｓｃｌｖａｎｎ　ｉｏｍｙｃｅｓ属の酊母種は、それら
をデンプンを唯一の炭素源として生育可能とする効率的
な発現および分泌装置を有している。デンプンは、上澄
中に分泌される２稲類のデンプン分解酵素、すなわちα
−アミラーゼ（α−１，４−グルカン４−グルカノハイ
ドロラーゼ、ｕ、ｃ、３．２．１．Ｌ　）およびグルコ
アミラーゼ（シン、アミログルコシダーゼ）（α−１，
４−グルカングルコノ＼イドロラーゼ、ｌミ、（、’、
３．２．１．３　　；分枝除去活性を伴うＥ　、　Ｃ。

３．２．１．９．）によりグルコースに加水分解される
。

以前に５ＣｈＷａｎｎ１．０＋１１ｙｅＯ８ｃａｓｔｃ
ｌｌｉ、ＩおよびＳｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓ　ａｌ
ｌｕｒｉｓ　（Ｐｒｉｃｅら、１９７８）と称されてい
たＳｃｈｖａｎｎｉｏｍｙｃｃｓ　ｏｅｃｉｄｅｎＬａ
ｌｉｓのデンプン分解酵素は、充分に文献に記述されて
いる（Ｏｔｅｎｇ−Ｇｙａ、ｎｇ　ら、１９８１　；５
ｉｌｌｓ　ら、１９８２．１９８４　ａ、　　１９８４
　ｂ　ＨＷｉｌｓｏｎら、１９８２）。

Ｓｃｈｖａｎｎｉｏｍｙｃｃｓ属の酵母由来のα−アミ
ラーゼおよびグルコアミラーゼの遺伝子は、本発明者ら
によってＥＰ８７　１１０　３７０．１に開示されてい
る。しかしながら、その時点においては分泌を支配する
ＤＮＡまたはペプチドは同定されていなかった。更には
、酵母における効率的な発現および分泌系の確立のため
のそれらの使用は、当時は知られていなかった。

第１のＤＮＡ配列として、５ｅｈｖａｎｎｉｏｎｌｙｃ
ｃｓ　ａアミラーゼをコードする構造遺伝子に先行する
１、　　８ｋｂＢｇｌ　　ＩＩ　−Ｘｈｏ　Ｉ断片の部
分または全体、あるいはＳｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓ
　ｏｃｃｉｄｃｎｔａｌｉｓグルコアミラーゼをコード
する構造遺伝子に先行する１、　　３ｋｂ　ＢａｍＨＩ
　−Ｐｖｕ　ＩＩ断Ｊ４’の部分または全体を使用する
ことが好ましい。更に、より小さい断片のみを使用する
場合には、α−アミラーゼをコードする構造遺伝子に先
行する塩基−１から−５４０までの領域に対応するＤＮ
Ａ配列の部分または全体、あるいはグルコアミラーゼを
コードする構造遺伝子に先行する塩基−１から−３２０
までに対応するＤＮＡ配列の部分または全体を含むＤＮ
Ａ配列を使用することが好ましい。各々のＤＮＡ断片は
、デンプン、デクストリンマルトースにより誘発可能な
プロモータとして５６全に活性である。

転写制御に関与しない塩県または塩越対の置換は、なお
も本発明の精神のうちにあることは自明である。従って
、天然の変異物または合成の均等物もまた、本発明に包
含される。

Ｓｃｈｖａｎｎｉｏｍｙｃｃｓ属の酵母細胞において、
多くの他の酵母属から得た酵母遺伝子から誘導されるプ
ロモータ類を使用することも可能である。

Ｓａｅｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、
　ＫｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓＩａｅｔｉｓまたはＳｃ
ｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓ　ｏｃｃｉｄｅｎＬａｌｉｓ
から得られるＡＤＨ１、ＡＤＨ２、ＰＤＣ１、ＧＡＬ１
／１０、ＰＧＫおよびＧＡＰＤＩ（、またはＬＡＣ４の
発現に関与するレギユロン類が好ましい。

更には、例えばＥ、ｃｏｌｆＴ−ファージから得られる
レギユロンおよびターミネータ′：９のウィルスレギユ
ロンおよび／またはターミネータを使用することもでき
る。ファージ類は、それらの溶解機能を行なうための極
めて強い機能配列を有している。

好ましい実施態様において、ファージＴ７の配列を使用
し、これはＴ７　　ＲＮＡポリメラーゼの発現により制
御される。

全体の発現量を増大させるため、更には産生されたポリ
ペプチドの精製を容易にするために、ポリペプチドは培
養培地中に分泌されることが最も望ましい。本発明は、
誘発により極めて効串的に分泌されなければならないデ
ンプン分Ｍ’ｌｉ性、従って誘発可能な酵素の遺伝子か
ら誘導される貴重な利点を有するシグナル配列を提供す
る。更なる利点は、デンプン分解性酵素の誘発が、例え
ば特定のアミノ酸またはホスフェートを欠失するような
複雑な培地を必要とせず、単にデンプン含有培地に転移
すべき培養を必要とするのみであることである。大分子
量の蛋白質の分泌に好適に使用されるシグナル配列は、
以下のペプチド類の少なくとも１つの部分または全体を
含む： ａ）　　ＭｃｔＡｒｇＰｈｃＳｃｒＴｌ＋ｒＧ］ｕＧ］
ｙＰｈｃＴｈｒＳｃｒＬｙｓＶａＶａＩＡＩａＡＩａｌ
ＩｅＬｃｕＡｌａＰｈｃｓｅｒＡｒｇｌ−、ｃｕＶａｌ
ＳｅｒＡｌａｂ）　　ＭｅＬＡｒｇＰｌ＋ｃＳｅｒＴｌ
＋ｒＧＩｕＧＩｙＰｂｅＴＩ＋ｒＳｃｒＬｙｓＶａｌＶ
ａＩＡ　ｌ　ａＡｌ　ａｌ　ｌ　ｅ１、ｅｕＡｌ　ａＰ
ｈｅｓｅｒＡｒｇｌ−ｅｕＶａｌｓｅｒ八ｌ　ａｃｌ　
へＰｒｏｌｌｅｌｌｅＰｈｅＡｓｐＭｅＬＡｒｇ　　；
ｃ）　　ＮｅｔｌｌｅＰｈｅＬｅｕＬｙｓＬｅｕｌｌｅ
ＬｙｓＳｅｒｌｌｅＶａｌ！ＩｅＧＩｙＬｅｕＧＩｙＬ
ｅｕＶａｌＳｅｒＡＩａ　　；ｄ）　　ＭｅｔｌｌｅＰ
ｈｅＬｅｕＬｙｓＬｅｕｌｌｅＬｙｓＳｅｒｌｌｅＶａ
ｌｌｌｅＧＩｙＬｅｕＧＩｙＬｅｕＶａｌＳｅｒＡＩａ
ｌｌｅＧＩｎＡｌａＡｌａＰｒｏＡｌａ　　；ｅ）　　
ＭｃｔｌｌｃＰｈｃＬｃｕＬｙｓＬｃｕｌｌｃＬｙｓＳ
ｃｒｌｌｅＶａｌｌｌｃＧＩｙＬｃｕＧＩ　ｙＬｅｕＶ
ａｌｓｃｒＡ　ｌａｌ　１ｅＧＩ　ｎＡｌａ、Ａ　Ｉａ
ＰｒｏＡｌａＳｃｒＳｃｒｌｌｃＧＩｙＳｃｒＳｃｒＡ
ＩａＳｃｒＡＩａ。

別の実施態様において、上記のペプチド類は、以下のＤ
ＮＡ配列の全体または部分に対応するＤＮＡ配列により
コードされる： ａ）　　ＡＴＧＡＧＡＴＴＴＴＣＡＡＣＴＧＡＡＧＧＡ
ＴＴＴＡＣＡＡＧＴＡＡＡＧＴＴＧＴＴＧＣＡＧＣＡＡ
ＴＴＴＴＡＧＣＡＴＴＣＴＣＡＡＧＡＴＴＧＧ’ｉ’Ａ
ＴＣＴＣＣＴ　　；ｂ’）　　ＡＴＧＡにＡＴＴＴＴＣ
ＡＡＣＴＧＡＡＧＣ；ＡＴＴＴＡＣＡＡＧＴＡＡＡＧＴ
ＴＧＴＴＧＣＡＧＣＡＡＴＴＴＴＡＧＣＡＴＴＣＴＣＡ
ＡＧＡＴＴＧＧＴＡＴＣＴＧＣＴＣＡＡＣＣＧＡＴＴＡ
ＴＴＴＴＴＧＡＣＬＡＴＧＡＧ＾Ｃ〉　　＾ＴＧＡＴＴ
ＴＴＴＣＴＣＡＡＧＣＴＧＡＴＴＡＡＡＡＧＴＡＴＡＧ
ＴＡＡＴＴＧＧＴＴＴＧＧＧＡＴＴＡＧＴＴＡＧＴＧＣ
Ｔ　。

ｄ）　　　ＡＴＧＡＴＴＴＴＴＣＴＣ；ＡＡＧＣＴＧＡ
ＴＴＡ＾＾ＡＧＴＡＴＡＧＴＡＡＴＴＧＧＴＴＴＧＧＧ
ＡＴＴＡＧＴＴＡＧＴＧＣＴＡＴＣＣＡＡＧＣＡＧＣＣ
ＣＣＴＧＣＣ。

ｅ）　　ＡＴＧＡＴＴＴＴＴＣＴＧＡＡＧＣＴＧＡＴＴ
ＡＡＡＡＧＴＡＴＡＧＴＡＡＴＴＧＧＴＴＴＧＧＧＡＴ
ＴＡＧＴＴＡＧＴＧＣＴＡＴＣＣＡＡＧＣＡＧＣＣＣＣ
ＴＧＣＣＴＣＴＴＣＧＡＴＴＧＧＡＴＣＴＡＧＴＧＣＴ
ＴＣＡＧＣＡ。

同様な性質を有する残基によるアミノ酸の置換、および
遺伝子コードにより与えられる可能性に従っての別のコ
ドンの使用は、誘発による酵母細胞に対して何らの影響
も有さないであろうことが理解される。

本発明による酵母細胞において発現されるポリペプチド
は、第３のＤＮＡ配列によりコードされる。前記第３の
ＤＮＡ配列は、天然または合成ＤＮＡ、介Ｉ′ＩＥ配列
を含むＤＮＡさえも含んでもよい。

本発明による酵母細胞により発現される蛋白質の例は、
科学的または医学的目的のために極めて重要な蛋白質を
含み、例えば、セルラーゼ、インターロイキン、インタ
ーフェロン、インシュリン様成長因子、リンホカイン、
ヒト成長因子、神経成長因子、アプロチニン、インシュ
リン、ヒルジン、ホルモン類、血液凝固因子、Ｂ型肝炎
表面またはコア抗原、ウィルスまたは細菌ワクチン、あ
るいはヒト顆粒球／マクロファージコロニー刺激因子等
を含む。

本発明による酵母細胞は、発現カセットの構成要素とし
て、選択的にターミネータを含む。好ましいターミネー
タ類は、以下の属の一つの遺伝子から誘導される：　Ｓ
ａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　、　ＰＩｃｌ＋ｉａ。

Ｈａｎｓｅｎｕｌａ　％好ましくはＳｃｈｗ’ａｎｎｉ
ｏｍｙｃｃｓ０好ましいターミネータの例は、Ｓｃｈｗ
ａｎｎ　ｉｏ＋１１ｙｃｅｓ　ａ−アミラーゼ遺伝子ま
たはＳｃｌ＋ｖａｎｎｉｏｍｙｃｃｓグルコアミラーゼ
遺伝子から誘導されるもので、その部分または全体が使
用され得る。このようなターミネータは、Ｓｅｈｗａｎ
ｎｉｏｍｙｃｅｓ　ａ−アミラーゼ遺伝子のヌクレオチ
ド１５３７−１７４０、または ＳｃｈｗａｎｎｉｏＩＩｌｙｃｅｓグルコアミラーゼ遺
伝子のヌクレオチド２８７５−３３２０に含まれている
。

上記のいずれのＤＮＡ配列の場合にも、各々のＤＮＡ断
片の生物学的活性を損なうことがない修飾は、なお本発
明に含まれている。上記のＤＮＡ配列を、該遺伝ｒ−Ｉ
ｔｆｒｊ’＋の生物学的活性を損なうことなく若干変化
させる多くのｎＪ能性がある。

環状または線状ベクターに保持される上記構成要素から
なる発現カセットを保有する本発明による酵母細胞は、
選択的に１種以上の選択マーカ遺伝子を含む。本発明者
らは、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｃｓの形質転換に使用さ
れてきた多くのマーカ遺伝子、例えばＳａｃｃｈａｒｏ
ｍｙｅｃｓ　、、　）Ｉａｎｓｃｎｕｌａ　５Ｐｉｃｈ
ｊａまたは５ｃｈｖａｎｎｉｏｎ＋ｙｃｅｓから得るこ
とができるＴＲＰ５、ＬＥＵ２、ＡＤＥ１、ＡＤＥ２、
ＨＩＳ３、ＨＩＳ４、ＵＲＡ３、ＬＹＳ２等が、 Ｓｃｈｖａｎｎｊｏｍｙｃｅｓ　ｏｃｅｉｄｅｎｔａｌ
ｉｓにおいて機能性であることを示した。更には、形質
転換生物を選択するために、α−アミラーゼまたはグル
コアミラーゼのデンプン分解性を使用することも可能で
ある。相当する遺伝子は、単離され、特徴付けがなされ
ている。ＡＭＹＩおよびＧＡＭＩは、好ましくはＳｃｈ
ｗａｎｎｌｏｒａｙｃｅｓから得られる。

本発明による酵母細胞は、該発現カセットを、内在性酵
母染色体の一つへの挿入物として含んでもよい。更には
、宿主生物内において、該ベクタの独立的複製および安
定な維持を制御することができるＤＮＡ配列を、該酵母
細胞に導入することも可能である。前記ＤＮＡ配列は、
独立的複製の制御および安定な維持を各宿主生物におい
て可能とする、いわゆるＡＲ３配列である。前記ＤＮＡ
配列は、好ましくはＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｓ　
ｌ’ｔｃｈｌａ。

１１ａｎｓｅｎｕｌａまたはＫｌｕｙｖｅｒｏＩＩｌｙ
ｃｅｓ　、最も好ましくは、ｓｅｈｗａｎｎｉｏＩＩｙ
ｃｅｓから誘導される。

期待される宿主生物における効果的な複製を確実なもの
とするために、各宿主生物から誘導されたＡＲ８を使用
することが好ましい。

本発明は、一種類の新規なＳ　ｗ　Ａ　ＲＳ配列を提供
する。該ＤＮＡ配列ＳｗＡＲＳ２は、Ｓｃｈｗａｎｎｉ
ｏｍｙｃｅｓ酵母細胞におけるる該ベクターの独立的複
製の制御および安定な維持が可能である。

ＳｗＡＲＳの詳細な配列は、未だ決定されていない。Ｓ
ｗＡＲＳ２は、例えば第１０図に示されているように、
Ｓｅｈｖａｎｎｉｏｍｙｃｅｓのゲノムのグルコアミラ
ーゼ遺伝子の３′領域に局在化している。

ＳｗＡＲＳ２は、容易に同定され、この配列を提示する
什意のプラスミドの独立的複製を効率的に許容する。今
までに知られているＳｃｈｗａｎｎ　ｉｏｇｃｅｓの独
立的に複製する配列、ＳｗＡＲＳ１および５ＷＡＲ３２
は、第２図ａに示されているＥｃｏ　Ｒ■−断片（第１
０図参照）に隣接するＣ１ａ　ＩＢａＩＩＩＨＩ断片（
ＳｗＡＲＳ１）上、および／または第２Ａ図に示されて
いるＥｃｏＲＩ断片内に含まれるｌ１２ｅｏＲＩ　−Ｉ
３ｇＩ　ｎ断片上（Ｓ　ｗ　Ａ　ＲＳ　２　）に含まれ
ている。

Ｓ　ｗ　Ａ　ＲＳ配列については、いかなる場合におい
てもそれが天然に生じるままで使用する必要はない。例
えば１個以上のヌクレオチドまたは塩基対の削除、挿入
または置換による任意の修飾処理によって得られたＤＮ
Ａ配列は、該修飾が、本発明による酵母細胞の生物学的
機能を保持し、または改善する限り、本発明の範囲に含
まれる。

好ましい実施態様において、本発明による酵母細胞は、
ゲノム性Ｓｅｂｗａｎｎ）ｏｍｙｃｅｓＤ　Ｎ　Ａに相
同的なＤＮＡ配列を含む。相同的ＤＮＡの構造の供給は
、このような相同配列に隣接するＤＮＡ断片が相同的組
換えにより押入されることを可能とする。

従って、５ｃｈｖａｎｎｉｏｎ＋ｙｃｅｓのゲノムＤＮ
Ａのいずれの基本的遺伝子も提示せず、しかしながらそ
の発現生成物が各培地への添加物により袖先されるか、
あるいは各発現生成物が、形質転換酵母細胞に何らの重
大な影響を与えない遺伝子を提示するｔ目間配列を有す
ることが好ましい。

５ｗＡＲ５配列または任意の同等な配列、例えばいずれ
かの他の酵母種に由来するものが人手できない場合には
、該発現カセットは、独立的復製剤なしに使用すること
ができる。この場合には、発現カセットは、例えば相同
的組換えを介してゲノム中に組込まれる傾向がある。好
ましくは、数個のコピーが１個以上の染色体に押入され
る。

この場合には、数個のコピーの同時の転写および翻訳を
確実なものとするために、発現カセットの多数のコピー
が挿入されることが好ましい。

本発明による酵母細胞が、Ｓｃｌ＋ｗａｎｎ　ｉｏｍｙ
ｃｅｓ属の酵母から誘導される場合には、各外来遺伝子
の前記酵母細胞内での発現の後に観察されるポリペプチ
ド生成物は、所望の真核性蛋白質のものと類似するか、
または合致さえする。Ｓｅｈｖａｎｎｊｏｍｙｃｃｓ属
の酵母細胞は、従って真核性蛋白質の発現のために好ま
しい。

上記に諸論された本発明による酵母細胞は、ポリペプチ
ドの製造方法において使用することができ、酵母宿主が
適当な条件下で培養され、該ポリペプチドが、それ自体
公知の方法で回収される。

培養の条件は、使用される各宿主生物に依存する。

Ｓｃｈｗａｎｎｉｏｎ＋ｙｃｃｓ属の酵母についての培
養条件の例は、下記の例に示しである。本発明による酵
母によって産生されたポリペプチドは、特異的な吸着剤
の人手可能性等の発現された蛋白質の性質に依存して慣
用の精製方法により回収される。

好ましい実施態様において、Ｓｃｂｖａｎｎｉｏｍｙｃ
ｅｓｏｃｃｉｄｅｎｔａｌ　ｉＳ種の酵母細胞が宿主生
物として使用され、それぞれ炭素源としてのデンプン、
デクストリン、マルトースおよび／または植物生物材料
（ｂｉｏｎ＋ａｓｓ　）上で培養される。周知のように
、これらの炭素源は低価格で入手できる。

更に、５ｃｈｖａｎｎｉｏｎｌｙｃｅｓ属の細胞を単一
細胞蛋白質の産生に使用する可能性がある。該小−細胞
蛋白質は、必要に応じて何らかの使用のために更に供さ
れる。

好ましい実施態様において、本発明による方法において
産生されるポリペプチドは、例えばαアミラーゼまたは
グルコアミラーゼニ９のデンプン分解酵素である。これ
らの酵素は、例えば欣逍または製パン工程において更に
処理されてもよいデンプンの脱側鎖および分解のために
商業的に使用される。デンプン分解酵素については高い
要求がある。

更に本発明による方法の実施態様において、ポリペプチ
ドの産生は、先に述べたように酵母のα−アミラーゼま
たはグルコアミラーゼシグナル配列を含む発現カセット
を与え、および各発現カセットをＳａｃｃｈａｒｏｍｙ
ｃｃｓ　％　Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ　％Ｈａｎｓ
ｅｎｕｌａ　、　Ｐｉｃｈ＋ａまたはＳｅｈｉｚｏｓａ
ｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ属の一つの酵母に押入すること
により達成される。

各酵母宿主生物における外来蛋白質の産生および分泌は
、適切な誘発手段を適用することによりｉテロ なわれ、これにより産生された蛋白質は、酵母α−アミ
ラーゼまたはグルコアミラーゼシグナル配列の存７ｒに
より分泌される。本発明者等により行なわれた実験から
、これらのシグナル配列は実質的にいずれの酵母の属に
おいても認識されることか知られており、α−アミラー
ゼまたはグルコアミラーゼシグナル配列は、多くの異な
った酵母において成功裏に適用され得る。この場合にも
、Ｓｅｈｖａｎｎｊｏｍｙｃｃｓ　ｏｃｃｉｄｅｎｔａ
ｌ　ｉｓの各逍伝了から誘導したα−アミラーゼまたは
グルコアミラーゼシグナル配列を使用することか好まし
い。

要約すると、本発明による酵母細胞は、任意の所望の外
来遺伝子の形質転換および発現についてよく研究されて
いる。先に概略を示し、たように、真核性遺伝子に加え
原核性のものの発現も可能である。しかしながら、真核
性蛋］′−１質の発現のためには上述したＤＮＡ配列の
一部または全部を含むＳｅｈｖａｎｎｊｏｍｙｃｃｓ属
の酵母細胞が、最も好ましい酵母細胞である。

累なる酵母の属におけるα−アミラーゼおよびグ３フ ルコアミラーゼ遺伝子の発現の特徴付け；α−アミラー
ゼ遺伝子（第１Ｂ図）およびグルコアミラーゼ遺伝子（
第２Ｂ図）の演ｔｐされたアミノ酸配列のＮ−末端は、
分泌性■白質の皿型的なリーダー配列の特徴を示してい
る（Ｖｏｎ　ｌ＋ｃ］ｊｎｅ１９８３、ＰｅｒｌＩＩｌ
ａｎおよびＨａｌｖｏｒｓｓｏｎ　１９８３）。

Ｓ、ｏｃｃｔｄｅｎＬａｌ　ｉＳにより分泌される成熟
α−アミラーゼのＮ−末端アミノ酸は、八５ｐＶａｌＳ
ｅｒと決定された。このことは、Ａｒｇ３３とＡｓｐ　
３１との間の処理を示しており、これは通常とは異なり
、またシグナルペプチド切断の部位特累性についてのＹ
ｏｎ　１ｌｅｉｊｎｅｓモデルにも従わない。この推定
上のの切断部位は、Ｓ、ｃｅｒｅｖｌｓｉａｅ、　Ｐｌ
ｃｈｌａ　５ｔｉｐｉｄＩｓ　。

Ｋ、Ｌａｃｔｉｓ、　Ｓ、ｐｏｍｂｃおよび１１．ｐｏ
ｌｙｍｏｒｐｈａにおいて発現されるα−アミラーゼに
ついても確認された。

しかしながら、これらの酵母種においてＡＩａ２５およ
びＧＩｎ２６での間で処理が行なわれ、Ｎ−末端配列Ｇ
ＩｎＰｒｏｌｌｃを生じる。

Ｓ、ｏｃｃｌｄｃｎｔａｌ　ｉｓの培養物からｑｉ離さ
れるα−アミラーゼは、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル
上で５５ｋＤａの１ｉｔ−バンドに帰省し：引続くエン
ドグルコシダーゼＨ処理および次いてゲル電気泳動で’
５４　ｋＤａのｒｌｌ−バンドか観察され、このことは
、該蛋白質の可能なＮ−グリコシル化部餘２個のうちの
１個のみがグリコシル化に使用されていることを示して
いる。Ｓ、ｅｅｒｖｉｓ　ｉａｅにおいて分泌される蛋
白質にしばしば見出される高度のマンノースグリコシル
化が、Ｓ、ｏｃｅｊｄｅｎ１、ａｌ　ｉｓにおける分泌
では伴われないことは注目に値する。

α−アミラーゼおよびグルコアミラーゼ遺伝子の転写開
始部位およびプロモータ機能の同定ポリＡ−ｍＲＮＡの
Ｓ〕マツピング（Ｓｈａｒｐら、１９８０）によると、
α−アミラーゼ遺伝子の転写開始部位は、領域−４２〜
−３０中に局在化しく第１Ｂ図において関連する配列の
上の破線で示しである）、またグルコアミラーゼ遺伝子
の転写開始部位は、領域−７〜−１０（第２Ｂ図に下線
を付しである）に決定された。

α−アミラーゼグルコアミラーゼ融合遺伝子の横築 ３つ α−アミラーゼプロモータおよびグルコアミラーゼ構造
遺伝子を後の構築での使用が容易となるように、イζｊ
加的な制限部位を両遺伝子の翻訳開始コドンの前に、オ
リゴヌクレオチド指向変異誘発をＡＭＥＩ？ＳｌｌＡＭ
社のプロトコールに記載されているように使用して押入
した。疋しい変光誘発は、Ｓａｎｇｅｒ　（Ｉ　Ｑ　７
７）に従って配列決定することにより確認した。元のＳ
ｃｌ＋ｗａｎｎ）ｏ１１ｙｃｅｓ遺伝了と押入ポリリン
カーとの境界部分を下記に示す：α−アミラーゼ： ＊＊＊ ５“、、ＴＡＡＡＡＴＡＡＡＡＧＣＴＣＧＡＧＡＴＧＡ
ＧＡＴＴＴ、、、３、１１ｏＩ グルコアミラーゼ： ＊　＊＊＊’＊＊＊　＊ｔ ５’、、ＣＴＣＡＴＧＡＣＴＧＴＧＴＣＧＡＣＧＧＡＴ
ＣＣＡＡＧＡＴＧＡＴＴＴＴＴ、、、、３　。

Ｓａｌ　　Ｉ　　　Ｂａｍ　　ＨＩ この操作でプラスミドＭ１３αＸｈｏ　　（第３園）お
よびｐ　Ｍ　ａ　Ｇ　Ａ　Ｍ　−Ｂ　／　Ｓを生じた。

しかして、α−アミラーゼプロモータおよび構造グルコ
アミラーゼ遺伝子の両者は、適切なＤＮＡ断片としてプ
ラスミドＭ１３αＸｈｏおよびｐ　Ｍ　ａ　Ｇ　Ａ　Ｍ
　−Ｂ　／　Ｓから単離され得る。該ＧＡＭ遺伝子をｐ
ＭａＧＡＭ　　Ｂ／Ｓから３．　２ｋｂＳａｌ　　Ｉ断
１１として１ｌｔｉｌｉｌ１、Ｍ　１．３　ａ　ＸＩ＋
ｏのＸｌｌ０１部位に沖天した。α−アミラーゼプロモ
ータ／ＧＡＭ遺伝子融合物を保有するＢｇｌ　ＩＩ断片
を、Ｓ、ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅベクターＹ　Ｒｐ　７　
　（ＳＬｒｕｌ＋ｌら、１９７９）のＬｉｔ−のＢ　ａ
ｍ　ｌ（１部位に連結してプラスミドＹＲｐ７αＧＡＭ
を生成した（第５図）。

Ｓ、ｃｅｒｅｖｌｓｉａｅ株ＹＮＮ２７をこのプラスミ
ドで形質転換し、ＴＲＰ原栄養体性について選択した。

形質転換体は、活性グルコアミラーゼを培地上澄中に分
泌しく５０ＩＩＩＵ／ｍ１）、α−アミラーゼプロモー
ター断片が外来蛋白質の直接発現および分泌可能である
ことを示した。

適切なプロモータを用いた異なる酵母におけるα−アミ
ラーゼおよびグルコアミラーゼの分泌α−アミラーゼお
よびグルコアミラーゼ遺伝子の発現および該遺伝子産物
の分泌は、β−ガラクトシターゼ（ＬＡＣ４）遺伝子（
１３ｒｅｕｎｉｇら、１９８４）のプロモータの制御下
でに、１ａｃｔｉｓ中で検出することができる。α−ア
ミラーゼおよびグルコアミラーゼ遺伝子の発現および両
組白質の分泌は、Ａ　Ｄ　Ｈ１プロモータ（１？ｕｓｓ
ｃｌら、１９８３）またはＧＡＬ　１／１０プロモータ
（ＪｏｈｎｓｔｏｎおよびＤａｖｉｓ　、　１９８４）
の制御下で、Ｓ、ｐｏｍｂｃ中でも検出することができ
る。ＧＡＬ　ｌ／１０プロモータ（Ｊｏｈｎｓｔｏｎお
よびＤａｖｉｓ　、　］　９８４）　、ＤＨＡＳプロモ
ータ（Ｊａｎｏｗｉｃｚら、１９８５）　、ＭＯＸプロ
モータ（１，ｅｄｅｂｏｃｒら、１９８５）またはＦＭ
ＤＨプロモータ（ＥＰ８７　１１０　４１７．Ｏ）との
融合の後に、α−アミラーゼおよびグルコアミラーゼ遺
伝子の発現および両組白質の分泌は、１１ａｎｓｅｎｕ
ｌａ　ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａにおいて検出可能である。

外来遺伝子発現の模型としてのＣｌｏｓｔｒｉｄｌｔｕ
ｍｔｈｅｒｍｏｃｅｌ　ｆｕｎのセルラーゼエンドグル
カナーゼＤ（ＥＧＤ）を用いたＳ、ｏｃｃｉｄｅｎｔａ
ｌ　１ｓにおける発現および分泌の研究。

Ｓ、ｏｃｃｌｄｃｎｔａｌ　ｔｓにおける外来遺伝子の
発現の第１の例として、Ｃ，ｔｈＯｒｎｌＯＣＯＩ　Ｉ
ｕＩｍ由来の温度安定セルラーゼ、すなわちエンドグル
カナーゼ（ＥＧＤ）をコードするｅｅｌ　Ｄ遺伝子（Ｍ
ｉｌｌｅｔら、１９８５、Ｊｏｌｉｆｆら、１９８６ｂ
）を使用した。コノ系を使用する利点は： 容易に監現可能なＥＧＤの特異的反応、ＥＧＤ活性を有
するコロニーの迅速な定性的アッセイ（材料および方法
参照）、 翻訳生成物の特５ε的検出のためのＥＧＤに対する抗体
類の入手可能性 などである。

ｅｅｌ　Ｄ遺伝子との融合後のグルコアミラーゼプロモ
ータの特徴付は プラスミドを、Ｓ、ｏｃｃｔｄｅｎｔａｌ　ｉｓ由来の
レプリコン（ＳｗＡＲＳ１）（ＥＰ８７　１１０　３７
０．１）、選択マーカとしてのＳ、ｃｅｒｅｖｉｓｉａ
ｅ由来のＴＲＰ５遺伝子（ＺａｌｋｊｎおよびＹａｎｏ
ｖｓｋｉ、１９８２）、ならびに異なるプロモータ制御
下のＣＡＭ／ｅｅｌ　Ｄ遺伝子融合物を含めて構築した
。第１の工程において、プラスミドｐＢＲ８ｗＡＲ３Ｇ
ＡＭ（ｉ６Ａ図）から４．ＯｋｂのＥｃｏＲＩ　−Ｐｖ
ｕ■断片を単離し、ａｍｐ遺伝子および細菌オリジンを
含んだ２２９６　ｂｐ　　ｐ　Ｂ　Ｒ３２２Ｅｃｏｌ？
　　Ｉ　−Ｐｖｕ　ｎ断片に挿入し、プラスミドｐＢＲ
ＰＧＡＭ（第６Ａ図）を生成した。ｐＢＲ３２２配列に
加えて、このプラスミドは、ＧＡＭ遺伝子の５′非コー
ド領域の３．６ｋｂおよびグルコアミラーゼのＮ−末端
部（シグナル配列を含む）をコードする始めの２０８ｂ
ｐを有している。ｅｅｌ　Ｄ遺伝子のコードを含み、５
′のｌ１ｉｂｐを欠失しているプラスミドｐ　ＣＴ　６
０３　（ＪｏｌｌｌＴら、１９８６）由来の３．４ｋｂ
　　Ｐｖｕ　ＩＩ断片を、ｐＢＲＰＧＡＭの単一のＰｖ
ｕ　ＩＩに押入し、ｐＢＲＧｃｌを生成した（第６Ｂ図
）。このプラスミドにより形質転換されたＥ、ｃｏ目は
、コンゴレッド染色（材料および方法参照）による分析
で弱いカルボキシメチルセルラーゼ（ＣＭＣａｓｅ）活
性を生じ、グルコアミラーゼプロモータが、Ｅ、ｃｏｌ
ｉ中で僅かに発現していることが示される。Ｓ、ｏｃｃ
ｉｄｃｎｔａｌ　ｉｓ発現ベクターの構築のために、プ
ラスミドｐＣＪＤ５−１　（Ｅｐ８７１１０３７０．１
）をＢａｍ１ｌ　　Ｉ　／　ＰｓＬ　　Ｉにより切断し
、ｐＢＲＧｃ１由来の５．　５ｋｂ　　ｌ’３ｇｌ　Ｉ
ＩＰｓｔ　Ｔ断片または６．　５ｋｂ　Ｂａｍ１ｌ　Ｔ
　−Ｐｓｔ　Ｉ断片と連結して、それぞれｐＭＰＧｃｌ
−１，（第６Ｃ図）およびｐＭＰＧｃｌ−２（第６Ｄ図
）を生成した。両プラスミドは、ＣＡＭ／ｅｅｌ　Ｄの
読枠内融合物を共通して有しているが、ＣＡＭ遺伝子の
５′上流領域の長さにおいて異なっていた。ＮＧＡ２３
株のＵ■変異生生成後に単離されたＳ、ｏｅｃｉｄｅｎ
ｔａｌｉｓ　　Ｎ　Ｇ　Ａ　５　ｇ林（ｔｒｐ　５ａｄ
ｃ　）をこれらのプラスミドで形質転換し、形質転換体
をトリプトファン原栄養体性について選択し、セルラー
ゼ活性をコンゴレッドアッセイの方法で分析した。形質
転換体は、２％マルト−スにおける誘発条件下で成育し
た場合に活性ＥＧＤを庁生じた（第７Ａ図）。４％グル
コース中の抑制条件下では、コンゴレッドアッセイによ
る分析で活性は検出されなかった。ＮＧＡ５８　：　ｐ
ＭＰＧＣ１−１およびＮＧＡ５８　：　ｐＭＧＰＧｃｌ
−２形質転換体は、マルトース中の誘発条件下で成育し
た場合に活性ＥＧＤを培地中に分泌する。プラスミドｐ
ＭＰＧＣ１−２上の元来のまたは完全なグルコアミラー
ゼプロモータは、ｐＭＰＧｃｌ−１の遺伝子融合物中の
より短いプロモータに比べて２０倍高い活性を示した（
第１表）。しかしながら、０．３ｋｂプロモ一タ断片は
、なおもグルコースによる具化代謝産物抑制を導く制御
単泣を保有している（ｉ７Ａ図）。Ｎ−末端ＣＡＭ配列
の他の分泌蛋白質の数種のシグナルペプチダーゼ切断部
位（Ｖｏｎ　ｌ１ｅｉｊｎｃ、　１９８３　）との比較
は、アミノ酸残基Ａｌａ１９、Ａｌａ２５およびＡＩａ
３４以後の３種のｎＪ能なシグナルペプチダーゼ切断部
位を明らかにする。成熟グルコアミラーゼのＮ−末端ア
ミノ酸を決定するために、該蛋白質をＮ−末端アミノ酸
配列決定のために−Ｑｉ　Ｍ　した。しかしながら、Ｎ
−末端はブロックされ、従って配列決定はできなかった
。　Ｓ、ｏｃｃｉｄｅｎｔａｌｉｓにおけるＧＡＭシグ
ナル配列の正しい切断部αを確認するために、可能なシ
グナルペプチダーゼ切断部位とＰｖｕ　ＩＩ遺伝子勘合
部位との間を、インビトロ変穴誘発によりＧＡＭ／ｅｅ
ｌ　Ｄ融合物において削除し、活性ＥＧＤの分泌への影
響を調べた。

Ｓ、０ｅｅｉｄＯｎｔａｌ　ｉＳにおける外来遺伝子の
発現へのＳ、ｃｅｒｃｖｉｓｉａｃプロモータの使用の
研究プラスミドｐ　Ｆ　Ｍ　２−１．　　（Ｍ引ｊｃｒ
ら、１９８７）からＡＤＨ１プロモータ（Ｈ＋ｔｚｃｍ
ａｎ、　１９８１　）を１．４５ｋｂ　ＢａｍＨＩ　−
８ａｌ　　Ｉ断片として単離し、プラスミドｐＣＪＤ５
−１．（ＥＰ８７１１０３７０．１）にＢａｍＨＩおよ
びＳａｌ　　Ｉ切断の後に連結してｐＭＰＡＤＨＩ　（
第８Ａ図）を生成した。該ＣＡＭ遺伝子を、ｐＪＤｃｇ
−１５（下記参照）由来のＳａｌ　　Ｉ断片として切断
し、ｐＭＰＡＤＨｌ（第８Ｂ図）の単一のＳａｌ　　Ｉ
部位に押入してプラスミドｐＭＰＡＧ　（３８Ｂ図）を
生成した。インビボ組換え（Ｈａら、１．９８７）の方
法により、ｐＭＰＧｃｌ−２（第６Ｄ図）由来のＣＡＭ
プロモータをｐＭＰＡＧのＡＤＨＩプロモータにより置
換し、プラスミドｐＭＰＡＧＣ（第８Ｃ図）を導いた。

プラスミドｐＭＰＧＣ１−２をＢａｍ１ｌ　　Ｉにより
線型化し、ここにおいて、ｐＭＰＧｃ１２の固有のＢａ
ｍ１ｌ　　１部位は、ＴＲＰ５コード配列トクルコアミ
ラーゼプロモータとの間に局在している。Ａ　Ｄ　Ｈ１
プロモータを含むｐＭＰＡＧの２、　７５ｋｂ　　Ｃ１
ａ　Ｉ断片は、ＧＡＭ７−ド領域の＋２０８位までに加
えてＴ　ＲＰ’５遺伝子に対して相聞性を共有する。イ
ンビボ組換えのために、ＮＧＡ５ｇを約１０位過剰量の
Ｃ１ａ　Ｉ断片と共に、ｌｔｏらの１９８３の形質転換
プロトコールを用いて１１ａｍＨＩ線型化ｐＭＰＧｃ１
．−２で形質転換した。

組換え体を、４％グルコース上でＣＭＣを加水分解する
能力について選択した。これらの条件下でｅｅｌ　Ｄ発
現は、環状化ｐＭＰＧｃ１−２を有する形質転換体にお
いて抑制された。１４６個の形質転換体から、４％グル
コースの在住下でセルラゼを発現する７個のコロニーを
単離した。“インビボ”構築プラスミドｐＭＰＡＧＣを
含むＮＧＡ５８は、活性ＥＧ、Ｄを本質的に発現した（
第７図参照）。この結果は、新たに構築されたプラスミ
ドｐＭＰＡＤＨ１は、外来造伝子発現用ベクタ−として
機能することを示している。

他の丈験において、組換えプラスミドを、ＰＤＣプロモ
ータ（Ｄａｓおよびｌ−１ｏｌ　１ａｍｂｅｒｇ、　１
９８２　）の制御下のＣＡＭ／ｅｅｌ　Ｄ遺伝子融合物
の発現研究のためにインビボ組換えにより構築した。従
って、ＰＤＣプロモータに融合したグルコアミラゼ遺伝
子を保有するプラスミドｐＪＤｃｇ−１５（ＥＰ旦７　
１１０　３７０．１）由来の６．　０ｋｂＳｐｈ　Ｉ　
−Ａｖａ　Ｉ断片を、ＹＲｐＪＤ２　（ＥＰ８７１１０
　３７０．１）の各制限部位にサブクローン化し、プラ
スミドｐＭＰＰＧ　（第９Ａ図）を生成した。

インビボ組換えのためにｐＭＰＰＧをＣｌｅ　Ｉにより
切断し、Ｂａｍ１ｌ　　Ｉ線型化ｐＭＰＧＣ１−２と共
にＮＧＡ５８の形質転換に使用した。相同的組換えは、
ＰＤＣプロモータの制御下のＧＡＭ／ｅｅｌ　Ｄ融合物
を保有するプラスミドｐＭＰＰＧＣ（第９Ｂ図）を生成
した。この構築物は、グルコースにより誘発可能であり
、かつマルトースにより部分的に抑制可能なＳｃｈｗａ
ｎｎｉｏｒａｙｃｃｓ４つ ｏｃｃｉｄｅｎｔａｌ　ｉｓ　　Ｎ　Ｇ　Ａ　５８の発
現を導いた（第１表）。形質転換体を、定性的コンゴレ
ッドアッセイを使用して活性ＥＧＤの発現について分析
した（第７図）。この結果は、０．　３ｋｂ　　ＧＡＭ
プロモータ断片は制御された発現を導くが、１．．３ｋ
ｂ断片より効果的ではないことを示している（比較のた
めには第１表および第２Ａ図参照）。ＡＤＨ１プロモー
タ下の発現は、効率的な本質的発現を導く。発現の水準
は、１．３ｋｂ　　ＧＡＭプロモータに支配された誘発
された発現と同程度である。

プラスミドがインビボ組換えにより構築され得る事実は
、相同的組換えの証明であり、しかして、外来蛋白質の
工業的製造に必須な、 Ｓ、ｏｃｃｉｄｃｎｔａｌ　ｉｓのゲノムへの安定部位
指向性の組込みの可能性を与える。

Ｓ、ｏｃｃｉｄｃｎｔａｌ　ｉｓにおけるα−アミラー
ゼ遺伝子およびグルコアミラーゼ遺伝子の発現ならびに
、両遺伝子産物の分泌は、ホスホグリセラードキナーゼ
（ＰＧＫ）プロモータ（Ｄｏｂｓｏｎら、１９８２）、
グリセルアルデヒド−３−ホスフェートデヒドロゲナー
ゼ（ＧＡＰＤＨ）プロモータ（ｔ（ｏｌｌａｎｄおよび
１ｌｏｌｌａｎｄ　１．９７９）　、カバーケラチン（
ＣＵＰＩ）プロモータ（Ｋａｒｉｎら、１９８４、Ｂｕ
Ｌｔら１９８４）およびアルコールデヒドロゲナーゼ２
　（ＡＤＨ２またはＡＤＨ２）プロモータ（Ｒｕｓｓｅ
ｌ　Ｉ　　ら、１９８３、Ｂｅｊ、ｅｒら、１９８５）
あるいはガラクトキナーゼ（ＧＡＬ　１／１０）プロモ
ータ（ＪｏｈｎｓｔｏｎおよびＤａｖｉｓ　、　１９８
４）の制御下においても遠戚され得る。

ｐＪＤｃｇ−１５の構築： ＣＡＭ遺伝子をプラスミドｐＭａＧＡＭ　　Ｂ／Ｓ（第
４図）から３．２ｋｂ　　ＢａＩＩＨＩ　−８ａｌ　　
ｌＤＮＡ断片としてｑｉ離し、プラスミドｐＢＭ２７２
　（ＪｏｈｎｓｔｏｎおよびＤａｖｉｓ　、　１９８４
）の各制御部位に押入した。ＰＤＣプロモータをプラス
ミドｐ　ＣＰ　２０２　（Ｋｅｌ　Ｉｅｒｍａｎｎおよ
びｌｌｏ！　ｌｅｎｂｃｒｇ、　　１９８８）からＳａ
ｌ　　Ｉ　−３ｐｈ　　Ｉ断片としてｌｉｔ離し、ベク
ターＹ　Ｒｐ　７　（Ｓｔｒｕｈｌら、１９７Ｑ）の各
単一部位に連結した。ＰＤＣ１プロモータをＢａｍＨＩ
断片として単離可能とするために、ＣＡＭ逍伝子を含む
ｐＭａ、ＧＡＭ　　Ｂ／Ｓの３．　２ｋｂ　　ＳａＩ断
片をＰＤＣプロモータに単一のＳａｌ　　１部位を介し
て融合させた。ＰＤＣプロモータを含む得られたｒ３ａ
ＩＩｌｌｌ　　Ｉ断片を、ＣＡＭ遺伝子を含むｐＢＭ２
７２の単一のＢａｍ１ｌ　　Ｉ部位に連結した。最終的
なプラスミドをｐＪＤｃｇ−１５と称した（ｍ８８図）
。

ヒト顆粒球／マクロファージコロニー刺激因子（ｈＧＭ
−ＣＳＦ）の発現 ｈＧＭ−Ｃ８Ｆをコードする遺伝子（Ｃａｎｔｒｅｌら
、１９８５）は、Ｂｒ１ｔｔｓｈ　Ｂｔｏｔｃｃｈｎｏ
ｌｏｇｙ社から、Ｈｉｎｄ　　ｍ　−ＥｃｏＲＩ断片と
して人手した。

ｈＧＭ−Ｃ８Ｆ遺伝子の＋５２位を、Ａ　Ｄ　Ｈ１また
はＣＡＭプロモータの制御下に、ＣＡＭシグナル配列の
＋１０２位に融合した。この融合で、ＣＡＭシグナル配
列のエンドペプチダーゼ切ｌＩ′ｒ部位が、ｌ１ｒｉｔ
ｉｓｈ　Ｂｌｏｔｃｃ）＋ｎｏｌｏｇｙ社から提供され
た合成遺伝子に含まれるＮｅｔに連結され、成熟ｈＧＭ
−Ｃ８Ｆの第１のアミノ酸（ＡＩａ１８）に続くハイブ
リッド蛋白質を生ずる。この融合物を、Ｓ、ｏｃｃｉｄ
ｅｎｔａｌ　ｉｓ発現ベクターに押入し、ＮＧＡ５８中
に形質転換した。ウェスタンプロット分析は、ｈＧＭ−
Ｃ８Ｆ蛋白質の分泌を示した。

インターロイキン−２の発現 Ｉ　Ｌ−２（Ｔａｎｉｇｕｃｈｉ　ら、１．９８３）を
コードする遺伝子は、Ｂｒ１ｔｉｓｈ　Ｂｉｏｔｅｃｈ
ｎｏｌｏｇｙ社からＥｃｏｌ？　　Ｉ　−１１ｉｎｄｌ
ｌｌ断片として人手した。ＩＬ−２遺伝子の＋６１位を
、ＡＤＨＩまたはＣＡＭプロモータの制御下にＣＡＭシ
グナル配列の＋１０２位に融合した。この融合で、ＣＡ
Ｍシグナル配列のエンドペプチダーゼ切断部位が、Ｂｒ
１ｔｉｓｈＢｉｏＬｅｃｈｔ＋ｏｌｏｇｙ社から提供さ
れた合成遺伝子に含まれるＭｅＬに連結され、成熟Ｉ　
Ｌ−２の第１のアミノ酸（Ａｌａ　２１．　）に続くハ
イブリッド蛋白質を生ずる。この融合物をＳ、ｏｃｃｉ
ｄｅｎＬａｌｉｓ発現ベクターに押入し、ＮＣ；Ａ５８
中に形質転換した。ウェスタンプロット分析は、ＩＬ−
２蛋白質の分泌を示した。

付加的ＳｗＡＲＳ要素および新規選択可能マーカの単離 ＣＡＭ遺伝子のコード領域の下流に局在する新規ＳｗＡ
ＲＳ配列（ＳｗＡＲＳ２）が同定され得る。ＳｗＡＲＳ
２の機能を分析するために、Ｔｒｐ５遺伝子および５Ｗ
ＡＲ８２をｐ　Ｂ　Ｒ３２２中に含むベクターを構築し
、それぞれｐＭＰＴＳ２ＡおよびｐＭＰＴｓｌ−Ｂを生
成した（第１０図）。ｐＭＰＴＳ２−ＡおよびｐＭＰＴ
ｓ２−Ｂの構築のために、第２Ａ図に示されたＥｅｏＲ
Ｉ　−断片のプラスミドｐＢＲ８ｗＡＲ８１（ＥＰ８７
１１０３７０．１に開示されている）の単一のＰｃｏＲ
１部位への挿入により構築されたｐ　ＢＲ８ｗＡＲＳＧ
ＡＭの５．　５ｋｂ　　Ｂａｍ１ｌ　　Ｉ　−Ｂｇｌ　
ＩＩ断片を単離し、ＹＲｐＪＤ２から得た３、２ｋｂＢ
ａｍｌｉ　　Ｉ　　ＴＲＰ断片と連結した。

Ｓ、ｏｃｃｉｄｃｎｔａｌ　ｉｓの高頻度形質転換が、
このプラスミドを用いて得られた。

付加的な選択可能マーカとして、 Ｓ、ｏｃｃｉｄｅｎｔａｌ　ｉｓのＬＥＵ２遺伝子を！
１を離した。イソプロピルマレートデヒドロゲナーゼを
コードする該ＬＥＵ２遺伝子を、Ｓ、ｏｃｃｌ＋１ｅｎ
ｔａｌ　ｉｓ由来のコスミドケノムライブラリーを用い
た形質転換により、Ｓ、ｃｅｒｃｖｉｓｉａｃの変異株
ＡＨ２２（ｈｉｓ　４１ｃｕ２）　　（Ｈ１、ｎｎｃｎ
ら、１９７８）の機能性相補化によりクローン化した。

該ＬＥＵ２遺伝子は、Ｓｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓゲ
ノムＤＮＡの９ｋｂ　　ＥｃｏＲＩ断片上にあることが
見出され、その機能は、Ｓ、ｃｃｒｃｖｌｓｌａｃのＴ
ＲＰ遺伝子の押入により撤廃することができた。***さ
れたＬＥＵ２遺伝子を、相同的組換えによりＮＧＡ５８
のゲノムに組込み、新規株ＮＧＡ５８１　（ＴＲＰ５、
ＬＥＵ２、およびＡＤＥ）を生じた。

Ｓ、ｏｃｃｉｄｅｎｔａｌｉｓ　（ＥＰ８７１１０３７
０．　］）のクローン化ＨＩＳ４遺伝子を用いた同様な
実験により、株ＮＧＡ５８ｈ　　（ＴＲＰ５、Ｈ丁Ｓ４
、ＡＤＥ）を導いた。

ｓ、ｏｃｃｉｄｅｎｔａ＋　ｉｓにおける外来遺伝子発
現のためのＴ７　　ＲＮＡポリメラーゼならびにＴ７プ
ロモータおよびターミネータを用いた異種遺伝子の改良
された発現 Ｔ７　　ＲＮＡポリメラーゼ（Ｐｕｅｒｓｔら、１９８
６）は、構造遺伝子（ＤＬＩｎｌｌおよび５Ｌｕｄｌｅ
ｒ　、　１９８４）の翻訳開始コドン近傍のＢａｍ１ｌ
　　Ｉ制限部位を用いたα−アミラーゼ、ＣＡＭ　（０
，３ｋｂ断片）またはＰ　Ｄ　Ｃ等の適当なプロモータ
との融合、ならびに相同的クローン化遺伝子、例えばＨ
ＩＳ４、ＬＥＵ２、ＡＭＹｌおよびＧＡＭ等を介しての
ゲノムへの相同的組込みの後に、Ｓ、ｏｃｅｆｄｅｎｔ
ａｌ　ｉｓにおいて発現され得る。相同的クローン化配
列に隣接する融合物を含む好適な断片をｉＩｉ離し、Ｎ
ＧＡ５８を共−形質転換するためにｐＣＪＤ５−１（第
６Ｃ図）と共に使用し、０．５％のカザミノ酸Ｃｃａｓ
ａｍＩｎｏａｅｉｄｓ　）を含有するＹＮＢ上で選択し
た。組込まれたＴ７　　ＲＮＡポリメラーゼ遺伝子を含
むコロニーを、標的遺伝子において変５′コした形質転
換体を［ｌｉ離した後にサザン分析により同定すること
ができる。

外来遺伝子の発現のために、Ｓ、０ｅｅｉｄｅｌｌｔａ
ｌ　ｔｓ発現ベクターを、ＳｗＡＲＳ２、ＩＥ、ｃｏｌ
ｉのＣｏ１Ｅ？ｊｉ製オリジン、Ｓ、ｏｃｃｌｄｅｎｔ
ａｌ　ｉｓのための適当な選択マーカ（例えば、ＴＲＰ
５、ＨＩ　Ｓ　４、ＬＥＵ２）ならびにＴ７ポリメラー
ゼプロモータおよびプラスミドｐＡＲ２５２９（Ｐｕｅ
ｒｓｔら、１９８６）から単離されたターミネータ配列
を含むカセットを含めて構築し、　Ｍ　１．３ｍｐ１９
由来のポリリンカー配列により分離した。Ｔ７系の効率
の研究のために、Ｔ７プロモータ制御下のＧＡＭ／ｃｅ
ｌＤ融合物（ＧＡＭシグナル配列およびｐＭＰＧｃｌ−
２からＢａｍＨＩ−ＡＳｐ７１８断片として得られた構
造ｃｅｌＤ遺伝子）を、ポリリンカー配列のＢａｍ１ｌ
　　Ｉ−Ａｓｐ　７１８部位に押入することにより発現
させた。この系を使用して、活性セルラーゼが培養培地
中に分泌された。

飼料および方法 １、使用した微生物は、次のとおりである：Ｓｃｈｗａ
ｎｎｌｏＩＩｌｙｃｅｓ　　ｏｃｃｉｄｅｎｔａｌｉｓ
　　　ＮＧＡ２３：（ＤＳＭ　　３７９２）Ｓｃｌ＋ｗ
ａｎｎｌｏｍｙｃｅｓ　ｏｃｃｌｄｅｎｔａｌｉｓ　　
ＮＧ＾５８Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ　ＬａｃＬＩｓ
　　５ＤＩＩ　：　（ＤＳＭ　３７９５）Ｓｃｈｌｚｏ
ｓａｅｅｈａｒｏｍｙｅｅｓ　ｐｏｌｌｂｅ　　ＬＥＵ
Ｉ−３２１ｌｌｌ５５−３０３（ＤＳ　３７９Ｇ） Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｌｓｔａｅ　
　ＹＮＮ２７（ＵＲＡ３−５２１”ＲＰｌ−２９８，Ｇ
Ａ１、２） 使用したＥｓｃｌ＋ｅｒｉｃｈｌａ　ｃｏｌｉ株は、次
のとおりである。

ａｒａ−１４，ｐｒｏＡ２．ＩａｃＹｌ　　、　ｇａｌ
Ｋ２、ｒｐｓＬ２０　（Ｓｍ　　）。

ｘｙｌ−５、ｍｔｌ−１、ｓｕｐＥ４４）Ｓｃｈｗａｎ
ｎｉｏｍｙｃｅｓ　ｏｃｃｉｄｅｎｔａｌＩｓ株ＮＧＡ
５８（ＮＧＡ２３株のＵＶ変異誘発により単離された）
は、３０℃にて示された場合には適切なアミノ酸類と２
％の可溶性デンプンを補充したＹＮＢ　（アミノ酸非含
有の０，６７％酵ノリ窒素基底）中で成育させた。

Ｓ、ｃｅｒｅｖｔｓｌａｅ株ＹＮＮ２７　　（ＵＲＡ３
−５２、ＴＲＰＩ−’２８９、ＧＡＬ２）　　（ＳＬｌ
ｎｅｌ＋ｏｎ＋ｂ　ら、１９８０）　　；　Ｋ、Ｉａｃ
ｔｌｓ株５ＤＩＩ　　ＴＲＰＩ（Ｄａｓおよびｌｌｏｌ
ｌｅｎｂｅｒｇ、　１９８２）　　；　Ｓ、ｐｏｍｂｅ
株ＬＥＵ１．−３２、ＨＩＳ５−３０３　（Ｗ、Ｔ）、
１１ｅｙｅｒから入手）：これらの株は、上述のＳｃｈ
ｖａｎｎｊｏｍｙｃｅｓ　ｏｃｃｉｄｅｎｔａｌｊｓと
同様の条件下で、示しだ場合には２％可溶性デンプンを
２％グルコースに置換して成育させた。

Ｓ、ｏｃｃｉｄｅｎＬａｌ　ｉｓおよび１ｌａｎｓｅｎ
ｕｌａ　ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａのための培養培地は、０
−　２　Ｍ　　Ｎ　ａ　Ｐ　Ｏ４緩衝剤ｐＨ６，２を用
いて緩衝化し；　Ｓ、ｅｅｒｅｖｉｓｉａｅおよびに、
Ｉａｃｔｉｓのためのものは、０．１Ｍクエン酸緩衝剤
ｐＨ６、ならびにＳ、ｐｏｍｂｅのためのものは、０．
０５Ｍ酢酸緩衝剤ｐ）１６を用いて緩衝化した。

セルラーゼ（Ｊｏｌｉｒｆら、１９８６ａ）　、ａ−ア
ミラーゼおよびグルコアミラーゼ（Ｗｉｌｓｏｎおよび
ｌｎｇｌｃｄｃｗ、　］−９８２）についての最適ｐＨ
は、約ｐＨ６である。

Ｅ、ｃｏｌｉ　　ＨＢ　］　］０１　　（Ｂｏｌｉｖｅ
ｒ　ら、１９７７）は、ペニシリンＧ　（１５０ｕ　ｇ
／ｍｌ）と共にＬＢ培地（Ｍａｎｉａｔｉｓら、１９８
２）にて成育された。

３゜その他の方法 プラスミドＤＮＡは、ＣｓＣ１勾配遠心分離（Ｍａｎｉ
ａＮｓら、１９８２）またはＢｉｒｎｂｏｌｍおよびＤ
ｏｌｙ　（１，９７９）により記述されたプラスミドＤ
ＮＡの迅速アルカリ抽出のいずれかの方法により精製し
た。

酵母粗抽出物は、５ｃｈａｔｚ　（１，９７９）の方法
により調製した。酵母微小溶菌物は、５ｂｅｒｌＩｌａ
ｎら（１９８３）の方法により調製Ｉ〜た。

ＤＮＡ断片は、Ｇａｒｎｅｒらにより記述されているよ
うに、“低融点アガロース″処理により単離した。ザザ
ンハイブリッド化は、５ｏｕｔｈｅｒｎ　（１，−９７
５）により記述されているように行なった。

酵母の形質転換は、旧ｅｂｅら（１９８３）またはＩｔ
ｏら（１９８３）に従って行なった。形質転換体または
組込体は、セルラーゼの発現および分泌について、定性
的コンゴレッドアッセイ（ＴＯａｔｈＯｒおよびＷｏｏ
ｄ、　１９８２　；カルボキシメチルセルロース寒天下
板上のハロ形成）、またはＪｏｌｔｆｆら（１９８６ａ
）による定量的セルラーゼアッセイのいずれかにより試
験した。１　ｉ１１位（Ｕ）は、６０℃において毎分］
ｕ１１ｏ１のバラ−ニトロフェノールを放出する酵素量
として定義される。ウェスタン分析は、Ｔｏｖｂｉｎら
（１，９７９）により記述されているように行なった。

形質転換体または組込体は、α−アミラーゼの発現およ
び分泌について、Ｍｅｒｃｋ社、西ドイツの標準化α−
アミラーゼ試験、または以下の定性的デンプン分解試験
（ヨウ素による染色後のデンプン寒天平板上のハロ形成
）のいずれかを用いて試験した：この試験においては、
２−クロロ−４ニトロフエノールの形成速度を、３７℃
において０．１Ｍリン酸カリウム中、４０５ｎｍでの光
度計測により測定した。酵素単位（Ｕ）は、３７°Ｃに
おける毎分１ｕ１１ｏ１の２−クロロ−４−二トロフェ
ノール形成を触媒する酵素量として定義される。

グルコアミラーゼ活性は、停止アッセイ法により測定し
た ０　、　０５　Ｍ　　Ｋ　Ｈ２Ｐ　Ｏ４Ｎ　ａ　ＯＨ（
ｐＨ５，０）中、１０％可溶性デンプン中における５０
℃での試料の熟成後、生成するグルコース量をグルコー
スデヒドロゲナーゼ法（システム・グルコース・Ｍｅｒ
ｃｋ　）により測定した。生成されたＮＡＤＨの瓜は、
グルコース濃度に比例する。酊素単位は、５０℃におけ
るｌｕｍｏｌグルコース／分の形成に触媒作用する酵素
量として定義される。

第１表 ＧＡ５８ ｐＭＰＧｃｌ−１ ２，３ ０，１２ ５，３ ０，７３ ＮＧＡ５１１　　： ｐＭＰＧｃ１、−２ ２，０ ０，５３ ７，９ １，８３ ＧＡ５８ ＭＰＡＧｃ ＾Ｄｌ１１　　プロモータ ＮＧＡ５８　　： ｐ）ＩＰＰＧｃ ＰＤＣＩ−プロモータ ３．０ ０．５２ ５．９ １．０７ ２．２＊　　　　　　　０．４０＊ ４．５＊　　　　　　　０．６４＊ ２．９　　　　　　　０．１９ ７．２　　　　　　　０．３１ 形質転換体は、ＹＮＢ、、０．５％カザミノ酸、２％マ
ルトース、２０■／Ｄアデニンおよび０．２Ｍ　　Ｎａ
Ｐ緩衝液ｐ＋＋６゜２中で成育させた。

＊：４％グルコース中で成育された形質転換体参考文献 Ｂｃｉｃｒ　ｃｔ　ａ１、（１９８５）、　Ｍｏ１．Ｃ
ｃｌ１、Ｂｉｏ１、　５　　、１７４３−１７４９、 Ｂｉｒｎｂｏｉｍ　＆　Ｄｏｌｙ（１９７９）、　Ｎｕ
ｃ、Ａｃ１ｄｓ　Ｒｃｓ、　　７．１５１３−１５２３
゜ Ｂｉｔｔｅｒ　ｅｔ　ａ１、（１９８４）、　Ｐｒｏｅ
、Ｎａｔ１、Ａｃａｄ、Ｓｃｊ、ＵＳＡ８１．５３３０
−５３８４゜ Ｂｏｌｉｖａｒ　ｅＬ　ａ１、（１９７７）、　Ｇｅｎ
ｅ２．７５−９３゜Ｂｒｅｕｎｉｇ（１９８４）、　Ｎ
ｕｃ１、Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、１２．２３２７−２３４
１゜ＢｕＬｔ　ｅｔ　ａ１、（１９８４）、　Ｐｒｏｃ
、Ｎａｔ１、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ　８１゜３３３
２−３３３６゜ Ｃａｎｔｒｅｌｌ　ｅｔ　ａ１、（１９８５）、Ｐｒｏ
ｃ、Ｎａｔ１、Ａｃａｄ、Ｓｃｌ　ｔｌｓＡ８２．６２
５０−ｆｉ２５４゜ Ｄａｓ　＆　１１ｏ１１ｅｎｂｅｒｇ（１９８２）、Ｃ
ｕｒｒ、Ｇｅｎｅｔ、０．１２３（２８゜Ｄｏｂｓｏｎ
　ｅｔ　ａ１、（１９ｇ２）、　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ
１ｄｓ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ１０．２０２５−２［ｉ３７
゜ Ｄｕｎｎ　＆　５ｔｕｄｉｅｒ　（１９８４）、Ｐｒｏ
ｃ、Ｎａｔ１、Ａｃａｄ、５ｃｌＵＳＡ８１．２０３５
−２０３９ Ｅｌｌｒ　ａｔ　ａ１、（１９８３）、Ｐｒｏｃ、Ｎａ
ｔ１、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ　８０゜７０８０−７
０８４゜ Ｐｕｅｒｓｔ　ｅｔ　ａ１、（１９ｇ（ｉ）、　Ｐｒｏ
ｃ、Ｎａｔ１、Ａｅａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ８３、ｇ１２
２−８１．２６、 Ｇａｆ’ｎｅｒ　ｅｔ　ａ１、（１９８３）、　　Ｅｒ
ａｂｏ　Ｊ、　２．５８３−５９１１１１ｎｎｅｎ　ｅ
ｔ　ａ１、（１９７８）、　Ｐｒｏｃ、Ｎａｔ１、Ａｃ
ａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ７５．１９２９−１９３３゜ Ｈｌｔｚｃｍａｎ　ｅｔ　ａ１、（１９８１）、　Ｎａ
ｔｕｒｅ　２９４．７Ｊ、７−７２２゜Ｈｏ１ｌａｎｄ
　＆　Ｈｏ１ｌａｎｄ　（１９７９）、　　Ｊ、Ｂｉｏ
１、ｌＣｈｃｍ、　　２５４５４８Ｂ−５４７４゜ Ｉｔｏ　ａｔ　ａ１、（１９８３）　Ｊ、Ｂａｃｔｃｒ
ｉｏ１、　　１５３．１ｆｉ３−１６８゜Ｊａｎｏｗｌ
ｅｚ　ｅｔ　ａ１、（１９８５）、　　Ｎｕｃｌｅｉｃ
　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、　　９゜３０４３−３０８２゜ ＪｏｈｎｓＬｏｎ　＆Ｄａｖｉｓ　（１９８４）、　Ｈ
ｏ１．Ｃｅ１１．Ｂｉｏ１、　　４　。

１４４０−１４４８゜ Ｊｏｌｌ［’ｒ　ｅｔ　ａ１、（１９８６ａ）、　Ｂｉ
ｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ４．　８９６−９００゜ ＪｏＬｌｆ’ｆ’　ｅｔ　ａ１、（１９８８ｂ）、Ｎｕ
ｅ１、Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、１４．８（ｉ０５Ｋａｒｌ
ｎ　ｅｔ　ａ１、（１９８４）、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔ１、
Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ　８１゜３３７−３４１゜ Ｋｅｌｌｃｒｍａｎｎ　＆　ｔ（ｏｌｌｅｎｂｅｒｇ（
１９８８）、Ｃｕｒｒ、Ｇｅ、ｎｅｔｉｃｓ１４．３８
７−３４４゜ Ｋｌｅｂｅ　ｅｔ　ａ１、（Ｊ９８３）、Ｇｅｎｅ　２
５，３３３−３４１゜Ｋｒａｎ＋ｅｒ　ｅＬ　ａ１、（
１９８４）、Ｎｕｃ１、Ａｃ１ｄｓ、Ｉ？ｅｓ、　　１
２．９４４１９４５Ｇ。

Ｋｕｒｊａｎ　＆ｌ１ｅｒｓｋｏｖｉｔｚ（１９８２）
、　Ｃｅ１ｌ　　３０．９３３−９４３゜Ｌｅｄｅｂｏ
ｅｒ　　ｅｔ　　ａ１、（Ｊ９８５）、　　Ｎｕｅ１、
Ａｅｉｄｓ、Ｒｅｓ、　　９３０８３−３０８２゜ Ｈａ　ｅｔ　ａ１、（１９８７）、　　Ｇｅｎｅ　　８
　、　２０１−２１６゜Ｍａｎｉａｔｉｓ、Ｐｒ１ｔｓ
ｃｈ　＆　Ｓａｍｂｒｏｃｋ（１９８２）、）Ｉｏｌｅ
ｃｕｌａｒｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ　Ｌａｂｏｌａｔｏｒｙ
　ｍａｎｕａ１、ｃｏｌｄ　ＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｕ
ｒ　Ｌａｂｏｌａｔｏｒｙ　ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ　Ｙｏ
ｒｋ。

Ｍｉｌｌｅｔ　ａｔ　ａ１、＜１９８５）、ＦＥＭＳ　
Ｍｉｅｒｏｂｉｏ１、１、ｃｔｔ、２９゜１４５−１４
９゜ Ｍｕｌｌｅｒ　ｅｔ　ａ１、（１９８７）、　　Ｍｏ１
．Ｇｅｎ、Ｇｅｎｃｔｉｃｓ　２０７　　。

４２１−４２９゜ Ｏｔｃｎｇ−Ｇｙａｎｇ　ｅｔ　ａ１、（１９８１）、
　Ｚｅ＋ｔｓｃｈｒｉｆｔａｌ１ｇｅｍｅｊｎｅ　Ｍｉ
ｋｒｏｂｉｏｌｏｇＪｅ　　２１．　５３７−５４４゜
Ｐｅｒｌｍａｎ　ｅｔ　ａ１、（１９８３）、　　Ｊ、
Ｍｏ１．ＩＢ７．３９１−４０９Ｐｒｉｃｅ　ｅｔ　ａ
１、（１！１７Ｂ）、　Ｍｉｃｒｏｂｉｏ１、Ｒｅｖ、
４２．１６１−１９３゜Ｒｕ５ｓｅｌｌ　ｅｔ　ａ１、
（１９８３）、　　Ｊ、Ｂｉｏ１、Ｃｈｅｍ、２５８　
　、　２６７４２８８２゜ Ｓａｎｇｅｒ　ｅｔ　ａ１、（１９７７）、　　Ｐｒｏ
ｃ、Ｎａｔ１、Ａｃａｄ、Ｓｃｆ、１ＩＳＡ７４．５　
４８３−５　４８７゜ ５ｃｈａｔｚ（１９７９）、　ＭｅＬｈ、Ｒｒ＋ｚｙｍ
ｏ１．　Ｉｎ　　、４０−５０゜５ｈａｒｐ　ｅＬ　ａ
１、（１９８０）、ｔｎ：Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｂｎｚｙｍ
ｏ１、６５Ｓｈｅｒｍａｎ　ｅＬ　ａ１、（１９８３）
、　Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　ｙｅａｓｔｇｅｎｅｔｉｃ
ｓ　　Ｉｎ　Ｃ，Ｓ、Ｈ，ＬａｂｏｒａＬｏｒｙ、Ｃ，
Ｓ、１１．Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ。

Ｉｎ９　。

５ｉｌｌｓ　＆　Ｓｔｅｗａｒｔ　　（１９８２）、　
　Ｊ、Ｉｎ５ｔ、Ｂｒｅｗ、８８．　３１３３１６゜ ５ｉｌｌｓ　ｅｔ　ａ１、（１９８４ａ）、Ｊ、Ｉｎ５
ｔ、Ｂｒｅｖ、　　９０．３１１−３１４゜５ｉｌｌｓ
　ｅｔ　ａ１、（１９８４ｂ）、Ａｐｐ１、Ｍｊｃｒｏ
ｂ、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ。

２０．１２４−１２８゜ ５ｏｕｔｈｃｒｎ（１９７５）、Ｊ、Ｍｏ１．Ｂｉｏ１
、９８，５０３−５Ｌ７゜Ｓｔｉｎｃｈｏｍｂ　ａｔ　
ａ１、（１９８０）、　　Ｐｒｏｃ、Ｎａｔ１、Ａｅａ
ｄ、Ｓｅｔ。

ＵＳＡ　　７７．４　５５９−４　５６３゜５ｔｒｕｈ
ｌ　ｅｔ　ａ１、（１９７９）、　Ｐｒｏｃ、Ｎａｔ１
、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ７１ｉ、１０３５−１．０
３９゜ Ｔａｎ４ｇｕｃ１１ｊ　ｃｔ　ａ１、（１９８３）、Ｎ
ａｔｕｒｅ　３（１２，３（１５−３０’１、Ｔｅａｃ
ｈｅｒ　＆ｗｏｏｄ　（１９８２）、　Ａｐｐ１、Ｆｎ
ｖ、Ｍｉｃｒｏｂｉｏ１、４３゜７７７−７８（Ｊ。

Ｔｏｗｌ＋ｉｎ　　ｅｔ　　ａ１、（１９７９）、　　
Ｐｒｏｃ、ＮａＬ１、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ７６．
４３５０−４３５４゜ ｖｏｎ　１ｌｅｉｊｎｅ　（１９８３）、　Ｒｕｒ、Ｊ
、Ｂｉｏｃｈｅｍ、Ｉ３３．１７−２％１ｌｓｏｎ　＆
ｌｎｇｌｅｄｃｖ　（１９８２）、　Ａｐｐ１、Ｅｎｖ
ｉｒｏｎ。

Ｍｔｅｒｏｂｉｏ１、４４．３０１−３０７、Ｚａｌｋ
ｉｎ　＆　Ｙａｎｏｗｓｋｙ　　（１９８２）、　　Ｊ
、Ｂｉｏ１、Ｃｈｅｍ、２５７１４９１−１５０［１、 図面の簡単な説明 第１Ａ図及び第１Ｂ図は、ＡＭＹＩ遺伝子を示す図で、
第１．Ａ図は制限地図、第１Ｂ図はヌクレオチド配列を
示し１、 第２Ａ図及び第２Ｂ図は、ＣＡＭＩ遺伝了を示す図で、
第２Ａ図は制限地図、第２Ｂ図はヌクレオチド配列を示
し、 第３図は、プラスミドＭ１．３αｘｈｏの模式図、第４
図は、プラスミドＩ）　Ｍ　ａ　Ｇ　Ａ　Ｍ　−Ｂ　／
　Ｓの模式図、 第５図は、プラスミドＹＲｐ７αＧＡＭの模式第６Ａ図
〜第６Ｄ図は、ベクター類の構築を示す模式図であって
、第６Ａ図はｐＢＲＧＡＭ、第６Ｂ図はｐＢＲＧｃ１、
第６Ｃ図はｐＭＰＧｃｌ−１、第６Ｄ図はｐＭＰＧｃｌ
−２を示し、第７Ａ図及び第７Ｂ図は生物の形態、つま
り脂質転換体微生物の成育形態を示す写真図であって、
第７Ａ図は２％マルトース上、第７Ｂ図は４％グルコー
ス上での形態を示す図、 第８Ａ図〜第８Ｃ図は、プラスミド類の構築を示す模式
図であって、第８Ａ図はｐＭＰＡＤＨ１、第８Ｂ図はｐ
ＭＰＡＧ、第８Ｃ図はｐ　Ｍ　Ｐ　Ａ　Ｇ　Ｃを示す図
、 第９Ａ図及び第９Ｂ図は、プラスミド類の構築を示す模
式図であって、第９Ａ図はｐＭＰＰＧ。

第９Ｂ図はｐＭＰＰＧＣを示す図、ならびに第１０図は
、ベクターｐＭＰＴＳ２−Ａおよび、ｐＭＰＴＳ２−Ｂ
の構築を示す模式図である。

代理人　　浅　　村　　　　　皓 ＧＣＴＡＡＡＴＴＴ＾ ４ｅＯ ＴＴＡＡＣＣＧＡＧＣ ＾ＴＣＴＡＭＴＴＧ ＣＴＴＧＴＧＧＡＴＴ ＧＣＡＡＴＴＡＡＧＧ ＾ＴＧＴＡＧＧＴＧ丁 Ｔ＾＾ＴＴＡＴＧＴｒ ＡＡＡＴＣＣＡＡＴＣ ＧＡＡＣＣＧＧＣＴＡ ＾ＣＴＣＴＴＡＴＴＡ ＴＡｎＧτＧＣＧＴ ＴＣＡＡＡＡＧＧＣＧ ＴＴＧＴＡＧＴＣＧＴ ＴＴＣＡＡＴＡＧＴＧ ＡＡＡＣＡＡＴＴＡＡ ＧＡＡｆ３ＧＴＧＣＣＧ ＴＡＧＡＴＣＣＧＣＴ ＡＧＴＴＴＴＴＴＴＣ ＴＡＧＡＴＣＡＧ＾Ａ ＧＭＴＣＡＡＡＡＯ ＴＣＴ’ｒＡＣ：ＣＧＡＴ ＡＡＧＴＡＣ：ＭＴＧ ＧＴＣＴＧ＾ＡＡＡＴ ＣＣＣＡＧＣＴＧＧＴ ＴＧＴＣＴＡＭＧ＾ ＴＡＴＴＴＴＣＴＴ丁 ＴＧＴＡＣＴＧＡＴＡ ＣＡＴＡＣＧＴＡＧＴ ＣＣＡＴＣＡＴＴＡＴ ＡＡＴＧＴＴＴＴＧＧ ＴｒＡＴＴＡＡＡＡＴ ＧＴＡＴＡＭＴＴ＾ ＣＧＴＴＧＡＴＣＴＣＴＣＴＡＡＡＧＣＡＡ　　ＡＧＣ
ＴＧＴＴＡＴＴ　　ＣＴＡＣＡＡＴＡＣＴＡＧＡＧＡＴ
ＡＡＴＧ ＴＧＣＴＣＣＴＡＣ丁 ＡＣＡＧＡＧＡＧＴ＾ Ｃ：ＡＡＡＣＣＣＴＴＧ ＡＣＣＣＣＡＣＡＣＧ ＴＭＴＧＣＴＧＴ＾ ｍＡｃｃＴＡｃＡ ＣＴＣＴＴＧＡＭＴ ＾＾ＡＴＡＡＡＡＴ＾ ＧＧＴＡＣＣＴＧＡ ＭＧＡＡＡＡＣＡ＾ ＴＣＡＡＴＭＴＴτ ＴＴ＾丁ＣＡＴＡＣ＾ ＧＴＴＡＴＴＴＧＡＴ ＧＴＴＴＣＡＴＧＧＴ ＴＧＴＧＧＡＴＣＡＧ ＾＾ＴＴＭＧＣＣＧ ＴＣＡＡＧＴＴＧＡＡ Ｉ ＡＡＡＧＣＡＡＧＡＣ 第１Ｂ図（その１） −一一一一一一一」 手続補正書（自発） 平底２年　６月Ｉぢ日

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 （１）ａ）レギュロンとして作用する第１のＤＮＡ配列
   、 ｂ）場合により、シグナルペプチドをコードす第２のＤ
   ＮＡ配列、 ｃ）外来蛋白質をコードする第３のＤＮＡ配列、および ｄ）場合により、ターミネーターとして作用する第４の
   ＤＮＡ配列 を含んでなる、少なくとも１個の発現カセットを含むこ
   とを特徴とするＳｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓ属の酵母
   細胞。 （２）前記第１および／または第２および／または第４
   のＤＮＡ配列が、デンプン分解性酵素をコードする遺伝
   子から誘導されることを特徴とする請求項１に記載の酵
   母細胞。 （３）前記デンプン分解性酵素が、α−アミラーゼまた
   はグルコアミラーゼであることを特徴とする請求項２に
   記載の酵母細胞。 （４）前記第１および／または第２および／または第４
   のＤＮＡ配列が、Ｄｅｂａｒｉｏｍｙｃｅｓ、Ｓａｃｃ
   ｈａｒｏｍｙｃｏｐｓｅｓ、Ｌｉｐｏｍｙｃｅｓ、Ｐｉ
   ｃｈｉａ、またはＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ、好まし
   くはＳｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓ属の一員である酵母
   から誘導されることを特徴とする請求項１〜３のいずれ
   かに記載の酵母細胞。（５）前記酵母が、Ｓｃｈｗａｎ
   ｎｉｏｍｙｃｅｓｏｃｃｉｄｅｎｔａｌｉｓであること
   を特徴とする請求項４に記載の酵母細胞。 （６）前記第１のＤＮＡ配列が、Ｓｃｈｗａｎｎｉｏｍ
   ｙｃｅｓα−アミラーゼをコードする構造遺伝子に先行
   する１．８ｋｂのＢｇｌII−Ｘｈｏ I −断片、または
   Ｓｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓ　ｏｃｃｉｄｅｎｔａｌ
   ｉｓグルコアミラーゼをコードする構造遺伝子に先行す
   る１．３ｋｂのＢａｍＨ　 I −ＰｖｕII断片を含んで
   なることを特徴とする請求項１〜５のいずれかに記載の
   酵母細胞。 （７）前記第１のＤＮＡ配列が、α−アミラーゼをコー
   ドする構造遺伝子に先行する−１〜−５４０の塩基領域
   に対応しているＤＮＡ配列の一部または全部、あるいは
   、グルコアミラーゼをコードする構造遺伝子に先行する
   −１〜−３２０の塩基領域に対応しているＤＮＡ配列の
   一部または全部を含んでなることを特徴とする請求項５
   に記載の酵母細胞。 （８）前記第１のＤＮＡ配列が、以下のレギュロン： ａ）好ましくはＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖ
   ｉｓｉａｅから得られるレギュロンであるＡＤＨ１、Ａ
   ＤＨ２、ＰＤＣ１、ＧＡＬ１／１０、ＰＧＫ、ＧＡＰＤ
   Ｈ、ｂ）好ましくはＫｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓｌａｃ
   ｔｉｓから得られるレギュロンであるＬＡＣ４、または ｃ）好ましくはＳｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓから得ら
   れるレギュロンに対応するもの の一つに対応することを特徴とする請求項１〜５のいず
   れかに記載の酵母細胞。 （９）前記第１および／または第４のＤＮＡ分子が、好
   ましくはＥ．ｃｏｌｉファージＴ７由来のウィルス性プ
   ロモータおよび／またはターミネータに対応することを
   特徴とする請求項１〜５のいずれかに記載の酵母細胞。 （１０）前記第２のＤＮＡ配列が、次のペプチド： ａ）【遺伝子配列があります】 ｂ）【遺伝子配列があります】 ｃ）【遺伝子配列があります】 ｄ）【遺伝子配列があります】 ｅ）【遺伝子配列があります】 の少なくとも一つの全体または部分をコードすることを
   特徴とする請求項１〜９のいずれかに記載の酵母細胞。 （１１）前記ペプチドをコードするＤＮＡ配列が、 ａ）【遺伝子配列があります】 ｂ）【遺伝子配列があります】 ｃ）【遺伝子配列があります】 ｄ）【遺伝子配列があります】 ｅ）【遺伝子配列があります】 の一つの部分または全体に対応することを特徴とする請
   求項１０に記載の酵母細胞。 （１２）前記外来蛋白質をコードする第３のＤＮＡ配列
   が、セルラーゼ、インターロイキン、インシュリン様成
   長因子、インターフェロン、リンホカイン、ヒト成長因
   子、神経成長因子、アプロチニン、インシュリン、ヒル
   ジン、ホルモン類、血液凝固因子、Ｂ型肝炎表面もしく
   はコア抗原、ウィルスもしくは細菌ワクチンまたはヒト
   顆粒球／マクロファージコロニー刺激因子をコードする
   天然または合成ＤＮＡ配列であることを特徴とする請求
   項１〜１１のいずれかに記載の酵母細胞。 （１３）前記第４のＤＮＡ配列が、Ｓａｃｃｈａｒｏｍ
   ｙｃｅｓ、Ｐｉｃｈｉａ、Ｈａｎｓｅｎｕｌａ、好まし
   くはＳｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓ属の一員である酵母
   に由来することを特徴とする酵母細胞。 （１４）前記第４のＤＮＡ配列が、Ｓｃｈｗａｎｎｉｏ
   ｍｙｃｅｓα−アミラーゼ遺伝子のターミネータの部分
   もしくは全体、またはＳｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓグ
   ルコアミラーゼ遺伝子の部分もしくは全体に対応するこ
   とを特徴とする請求項１３に記載の酵母細胞。 （１５）前記ターミネータが、Ｓｃｈｗａｎｎｉｏｍｙ
   ｃｅｓα−アミラーゼ遺伝子のヌクレオチド１５３７〜
   １７４０またはＳｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓグルコア
   ミラーゼ遺伝子のヌクレオチド２８７５〜３３２０に含
   まれることを特徴とする請求項１４に記載の酵母細胞。 （１６）前記第１および／または第２および／または第
   ３および／または第４のＤＮＡ配列が、１個以上のヌク
   レオチドの挿入または削除または置換により修飾される
   と共に該ＤＮＡの生物学的活性が保持または改善されて
   いることを特徴とする請求項１〜１５のいずれかに記載
   の酵母細胞。 （１７）前記発現カセットが、選択的に１個以上の選択
   マーカ遺伝子を含む環状または線状ベクターに保有され
   ていることを特徴とする請求項１〜１６のいずれかに記
   載の酵母細胞。 （１８）前記ベクターが、 好ましくはＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ、Ｈａｎｓｅｎ
   ｕｌａ、ＰｉｃｈｉａもしくはＳｃｈｗａｎｎｉｏｍｙ
   ｃｅｓから得られるＴＲＰ５、ＬＥＵ２、ＡＤＥ１、Ａ
   ＤＥ２、ＨＩＳ３、ＨＩＳ４、ＵＲＡ３、ＬＹＳ２、好
   ましくは Ｓｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓから得られるＡＭＹ１ま
   たはＧＡＭ１の選択マーカ遺伝子のいずれかを含むこと
   を特徴とする請求項１７に記載の酵母細胞。 （１９）前記ベクターが、更に宿主生物内で該ベクター
   の独立的複製および安定な維持の調節が可能なＤＮＡ配
   列を含むことを特徴とする請求項１７および１８のいず
   れかに記載の酵母細胞。 （２０）前記ＤＮＡ配列が、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅ
   ｓ、Ｐｉｃｈｉａ、ＨａｎｓｅｎｕｌａまたはＫｌｕｙ
   ｖｅｒｏｍｙｃｅｓ、好ましくはＳｃｈｗａｎｎｉｏｍ
   ｙｃｅｓ属の一員のゲノムから誘導されることを特徴と
   する請求項１９に記載の酵母細胞。 （２１）前記ＤＮＡ配列が、独立して複製する配列ＡＲ
   Ｓ、好ましくは各宿主生物から誘導されるＡＲＳから選
   択されることを特徴とする請求項１９または２０のいず
   れかに記載の酵母細胞。 （２２）前記ＤＮＡ配列が、Ｓｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃ
   ｅｓ内で該ベクターの独立的複製および安定な維持の調
   節が可能なＳｗＡＲＳ１またはＳｗＡＲＳ２であること
   を特徴とする請求項２１に記載の酵母細胞。 （２３）前記ＤＮＡ配列が、Ｓｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃ
   ｅｓのゲノムＤＮＡのＣｌａ I −ＢａｍＨ I 断片（Ｓ
   ｗＡＲＳ１）またはＥｃｏＲ I −ＢａｍＨ I 断片（Ｓ
   ｗＡＲＳ２）上に含まれることを特徴とする請求項２２
   に記載の酵母細胞。 （２４）前記ＤＮＡ配列が、１個以上のヌクレオチドの
   削除、挿入または置換により修飾されると共にその生物
   学的機能が、保持または改善されていることを特徴とす
   る請求項１９〜２３のいずれかに記載の酵母細胞。 （２５）前記酵母細胞が、Ｓｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅ
   ｓのゲノムＤＮＡに相同ないずれかのＤＮＡ−配列、好
   ましくは該発現カセットに隣接する相同なＤＮＡ配列を
   含むことを特徴とする請求項１〜２４のいずれかに記載
   の酵母細胞。 （２６）該発現カセットが、場合により多重コピーをも
   って、好ましくは相同的組換えによってゲノム中に組込
   まれていることを特徴とする請求項１〜２５のいずれか
   に記載の酵母細胞。 （２７）該酵母細胞が、Ｓｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓ
   属から誘導され、グリコシル化可能であることを特徴と
   する請求項１〜２６のいずれかに記載の酵母細胞。 （２８）酵母宿主生物を適当な条件下に培養し、ポリペ
   プチドを自体公知の方法により回収するポリペプチドの
   製造方法において、前記酵母宿主が、請求項１〜２７の
   いずれかに記載の宿主であることを特徴とする製造方法
   。 （２９）宿主生物としてＳｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓ
   ｏｃｃｉｄｅｎｔａｌｉｓ種の酵母細胞を使用し、好ま
   しくは、デンプン、デキストリン、マルトースおよび／
   またはプラントバイオマス上で培養することを特徴とす
   る請求項２８に記載の方法。 （３０）Ｓｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓ属の酵母細胞が
   、単一の細胞蛋白質の製造に使用されることを特徴とす
   る請求項２８または２９のいずれかに記載の方法。 （３１）前記ポリペプチドが、α−アミラーゼまたはグ
   ルコアミラーゼであることを特徴とする請求項２８〜３
   ０のいずれかに記載の方法。 （３２）酵母α−アミラーゼまたはグルコアミラーゼ遺
   伝子のシグナル配列を、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ、
   Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ、Ｈａｎｓｅｎｕｌａ、Ｐ
   ｉｃｈｉａまたはＳｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃ
   ｅｓ属の酵母における外来蛋白質の産生および分泌のた
   めに使用することを特徴とする請求項２８に記載の方法
   。