FI79854C - Foerfarande foer framstaellning av ett laekemedelspreparat som innehaoller ett insulinderivat. - Google Patents

Description

1 79854

Menetelmä insuliinijohdannaista sisältävän lääkevalmisteen valmistamiseksi

Sokeritaudin terapiassa käytetään nykyisin yleises-5 ti verensokeria alentavan hormonin, insuliinin valmisteita parenteraalisesti. Insuliinin ja sen metabolian erityisluonteesta johtuu, että yksinkertaisen liuoksen vaikutusaika on erittäin lyhyt, jolloin siis diabeetikon verensokerin pysyvä kontrolli vaatii käytettäväksi kestoinfuusio-10 ta annostuslaitteella, useampikertaista injektiota vuorokaudessa tai hidastetusti vaikuttavaa insuliinivalmistet-ta. Hidastetusti vaikuttavista valmisteista on tällöin erityistä merkitystä sellaisilla insuliinin olomuodoilla, jotka ovat injektiokohdassa niukkaliukoisia (esim. kitei-15 siä tai amorfisia). Näihin kuuluvat esimerkiksi sinkki- insuliinikiteet tai protamiini-insuliinikiteet, jotka hitaasti liuetessaan vapauttavat insuliinia tietyn ajanjakson aikana.

Terapiassa on osoittautunut olevan erittäin suurek-20 si avuksi, jos on ollut käytettävissä erilaisia insuliini-valmisteita, jotka vastaavat mahdollisimman tarkasti yksittäisen potilaan tarpeita. Ei-optimaalisen annostuksen yhteydessä keskustellaan välittömien vaikutusten, kuten hyper- ja hypoglykeemisen vaikutuksen ohella esiintyvistä 25 sokeritaudin myöhäiskomplikaatioista, joita ovat esimerkiksi verkkokalvosairaus, hermosairaus, munuaissairaus, mikro- ja makro-verisuonitaudit.

Sokeritautisen insuliininpuute johtaa siihen, että keho ei enää pysty saavuttamaan luonnollista hormonitasa-30 painoa.

Keksinnön tarkoituksena on esittää insuliinijohdannaista aktiiviyhdisteenä sisältävä farmaseuttinen valmiste, jonka avulla sokeritaudissa voidaan paremmin lähestyä luonnollista hormonitasapainoa ja jonka avulla se voidaan 35 ylläpitää paremmin kuin insuliinin tähän asti käytetyillä 2 79854 tavallisilla muodoilla.

Tämä saavutetaan keksinnön mukaisesti yhden tai useamman insuliinijohdannaisen avulla, jonka B-ketjussa C-terminaalin alueella on orgaaninen, luonteeltaan emäk-5 sinen ryhmä tai vastaavasti sellaisen farmaseuttisen valmisteen avulla, joka sisältää tällaista insuliinijohdannaista vaikuttavana aineena.

Sellaiset insuliinijohdannaiset, joiden B-ketjun C-terminaalissa on ryhmä Arg-OH tai Arg-Arg-OH, ovat tun-10 nettuja. Tiedetään, että näitä johdannaisia syntyy luonnollisina välituotteina proinsuliinin entsymaattisesti muuttuessa in vivo insuliiniksi, ja niitä on voitu osoittaa olevan vähäisinä määrinä haimauutteessa. Mainitut ryhmät lohkeavat normaalisti trypsiinin ja/tai karboksipep-15 tidaasi B:n tai samankaltaista spesifisyyttä omaavan entsyymin vaikutuksesta, jolloin vapautuu luonnollista insuliinia.

Keksinnön kohteena on menetelmä fysiologisesti hyväksyttävästä kantajasta ja vaikuttavasta aineesta koos-20 tuvan lääkevalmisteen valmistamiseksi, joka sisältää vaikuttavana aineena insuliinijohdannaista, jonka isoelekt-rinen piste on 5,8 - 8,5 ja jolla on kaava I, AI j—S-S—j A21

25 H-1 Gly A-Ketju Asn -OH

0 1 I <!>

SS

30 o o B2 B r1-jVal B-Ketju | r30_r31 jossa 35 R1 on H tai H-Phe, 3 79354 R30 on Ala, Thr tai Ser, ja ^ R31 on koliinitähde (-OCH2-CH2-N-(CH3 )3 ), Arg, Lys tai Arg-ja/tai Lys-yksikköjen di- tai tripeptiditähde, jolloin Arg- tai Lys-jäännösten terminaaliset COOH-ryhmät voivat 5 myös olla esteröityjä koliinilla tai yksinkertaisilla alkoholeilla tai amidoituja yksinkertaisilla typpiemäksillä, tai sen fysiologisesti hyväksyttävää suolaa. Menetelmälle on tunnusomaista, että muodostetaan vaikuttavasta aineesta ja kantajasta liuos tai suspensio, jolloin kantaja sisäl-10 tää a3 ) tavanomaista isotoniseksi tekevää ainetta, a2 ) tavanomaista säilöntäainetta, a3 ) puskuria ja/tai a4 ) 0-100 pg sinkkiä/100 I.U. ja/tai muita tavanomaisia hidastavan vaikutuksen omaavia apuaineita.

Erityisen edullisia ovat insuliinijohdannaiset, 15 joiden Bl-asemassa on fenyylialaniini. Lisäksi edullisia ovat sellaiset, joiden B30-asemassa on Ala, Thr tai Ser.

Keksinnön mukaisten yhdisteiden A-ketJulia ja ketjulla (B2-29) on tarkoituksenmukaisesti nauta- tai sika-insuliininsekvenssi ja varsinkin ihmisinsuliinin sekvens-20 si.

Aminohappotähteet voivat olla toisistaan riippumatta D- tai L-konfiguraatiossa. Edullisesti kaikkien näiden tähteiden konfiguraatio on kuitenkin L.

Geneettisesti koodattavissa olevia ovat seuraavat 25 L-aminohapot:

Gly, Ala, Ser, Thr, Vai, Leu, Ile, Asp, Asn, Glu, Gin,

Cys, Met, Arg, Lys, His, Tyr, Phe, Trp, Pro (neutraalit aminohapot on alleviivattu).

Neutraalilla, luonnossa esiintyvällä aminohapolla 30 tarkoitetaan varsinkin seuraavia: Gly, Ala, Ser, Thr, Vai, Leu, Ile, Asn, Gin, Cys, Met, Tyr, Phe, Pro tai Hyp. Emäksisellä, luonnossa esiintyvällä aminohapolla tarkoitetaan varsinkin seuraavia; Arg, Lys, Hyi, Orn, Cit ja His.

Keksinnön mukaisten yhdisteiden B-ketjun C-terminaa-35 Iin vapaan karboksiryhmän mahdollisina suojaryhminä tulevat 4 79854 kysymykseen ennen kaikkea esteri- ja amidiryhmät, edullisesti (Ci-CgUlkoksi, (C3-C6)sykloalkyylioksi, NH2, (Cj^-Cg) alkyyliami- no, di (Cj^-Cg) alkyyliamino, tai emäksiset ryhmät, kuten amino- (C2-Cg) alkoksi , (C^C^j) alkyyliamino (C2~Cg) alkoksi, di(C1-Cj})- 5 alkyyliamino (C_-C,) alkoksi, tri (C, -C.) ammonio (C_-C,.) alkoksi, amino(C -C^)alkyyliamino, [(C -C.) alkyyliamino] -(C -C,,)-2 o r 14 δ o alkyyliamino, [di(C^-C^)alkyyliamino] -(C^-C^)alkyyliamino tai |tri(C^-C^)alkyyliammonio] -(C2~Cg)alkyyliamino, varsinkin -0- IcH_”] -NR-, -0- [CH_] -NR-.-NH- [chJ -NR- tai -NH-u 2Jp 2 L 2Jp 3 *-2Jp2 10 LCH2Jp-NR3' 3oissa P = 2-6, ja symbolit R ovat samoja tai erilaisia ja merkitsevät vetyä tai (C^-C^)-alkyyliä.

Keksinnön mukaisista insuliinijohdannaisista mainittakoon erityisesti seuraavat, joihin keksintö ei kuitenkaan rajoitu: B1 B 31

15 Des-Phe -sikainsuliini-Arg -OH

B1 B 31

Des-Phe -ihmisinsuliini-Arg -OH

oi R31 o o o

Des-Phe -sikainsuliini-Arg -Arg -OH

B1 b31 B32

Des-Phe -ihmisinsuliini-Arg -Arg -OH

B31

Sikainsuliini-Arg -OCH., B31 ^ 20 Ihmisinsuliini-Arg -OCH.

B31 ^

Nautainsuliini-Arg -OCH- B31 3 2

Sikainsuliini-Arg -Arg -OCH., B 31 B3 2 ^

Ihmisinsuliini-Arg -Arg -OCH^

Des-ThrB^^-Ihmisinsuliini-ValB^®-ArgB^^-OH

B 3 1

25 Ihmisinsuliini-Lys -OH

B 3 1

Ihmisinsuliini-D-Arg -OH

xu · 1· · n n B31 _ B32

Ihmisinsulnni-D-Arg -Arg -OH

B 31 B 3 2

Ihmisinsuliini-Arg -D-Arg -OH

tu · · i · · · t B31 Λ B32 Λττ

Ihmisinsulnni-Lys -Arg -OH

B 31 B 3 2

30 Ihmisinsuliini-Arg -Lys -OH

B 3 1

Ihmisinsuliini-Argininol

Ihmisinsulnni-Val -Arg -OH

. . . . . . B31 . . ,B32

Ihraisinsuluni-Arg -Arginol T. . . . . . . t B31 . B32 Β33λ„

Ihmismsulxini-Lys -Arg -Arg OH

B 3 1 35 Ihmisinsuliini-Arg -NH —,--, 5 79854 B31 B3 2

Ihmisinsuliini-Arg -Arg -NH—,-i /-/ B 31 5 Ihmisinsuliini-Arg -NH9 B 31 3 2

Ihmisinsuliini-Arg -Arg -NH„ B 31 ^

Ihmisinsuliini-Orn -OH

B 31 B 3 2

Ihmisinsuliini-Leu -Cit -OH

Ihmisinsuliini-(B30)-0(^2(^-^2

10 Ihmisinsuliini-(B30)-NH-CH9CH -NH

B 31 £2. 2

Ihmisinsuliini-Arg -0-CH--CH -NH9 B 31 ^ ^ ^

Ihmisinsuliini-Arg -CH2-CH2~N0(CH^)^

Ihmisinsuliini-(B30)-0-CH2-CH2_Nq(CH3)-j Ihmisinsuliini- (B30) -NH-CH--CH -N (CH-,)

QO 1 ^ 2 J Φ-J

15 Ihmisinsuliini-Leu -0-CH9-CH -CH9-N(C Η^) R31 R32 ^ ^ 3¾)

Ihmisinsuliini-Trp -Trp -Trp0J -NH(CH2)g~N/f (CH2)3CH3J3

Kaavan I mukaisia insuliijohdannaisia valmistetaan siten, että

20 a) des-oktapeptidi (B23-30)-insuliini, jonka kaava on II

A1 p S-S-η A21 1 -!---------

S - Gly A-Ketiu Asn ~0H

1 I

25 1 1 (II) • B 2___ 1 B22

S -R1- Vai B-Kst·]!!__Arg |-0H

.1 1

jossa R on Phe tai sidos, ja S on protonisolvolyyttisesti 30 tai ^-eliminoinnilla poistettavissa oleva aminosuojaryhmä, kuten tert-butyylioksikarbonyyli (Boc), tert-amyylioksikar-bonyyli (Aoc) tai metyylisulfonyylietyllioksikarbonyyli (Msc), kondensoidaan peptidin kanssa, jonka kaava on III

35 H-Gly-Phe-Phe-Tyr(S2)-Thr(S2)-Pro-Lys(S3)-R30-R31 (III) 6 79354 30 31 2 jossa R tai R merkitsevät edellä määriteltyä, S on vety, t 3

Bz1 tai Bu , ja S on uretaanisuojaryhmä, kuten Boc, Moc, Fmoc tai Z, jolloin tähteissä R30 ja R31 olevat vapaat COOH-, OH-, SH- ΝΗ2~, guanidino- ja/tai imidatsoli-ryhmät ovat tarvittaes- 5 sa sinänsä tunnetulla tavalla suojattuna, ja mahdollisesti läsnäolevat suojaryhmät poistetaan sinänsä tunnetulla tavalla, b) kaavan I mukainen des-B30-insuliini, jossa kaavassa R on H tai H-Phe, ja C-termiini R3^-R ^ merkitsee yhdessä OH-ryhmää, saatetaan trypsiinin tai trypsiininkaltaisen endopeptidaasin 10 läsnäollessa reagoimaan yhdisteen kanssa, jonka kaava on IV H—R30-R31 (IV) jossa R3^ ja R31 merkitsevät edellä määriteltyä ja jossa läsnäolevat vapaat COOH-, OH-, SH-, t*>-NH2-, guanidino- ja/tai imidatsoli-ryhmät ovat tarvittaessa suojattuja sinänsä tunne-15 tulla tavalla, tämän jälkeen mahdollisesti läsnäolevat suoja-ryhmät poistetaan sinänsä tunnetulla tavalla, tai c) sellaisen insuliinijohdannaisen valmistamiseksi, jonka 31 R :ssä on L-konfiguraatiossa olevat aminohappotähteet, proinsuliini, proinsuliinianalogi tai preproinsuliinianalogi 20 tai näiden yhdisteiden välituote pilkotaan kemiallisesti ja/tai entsymaattisesti.

Menetelmävaihtoehdossa a) esimerkiksi desoktapeptidi-α*Ά 1 OfB 1 (B23-30)-insuliinin N , N -bis-Boc-johdannainen saatetaan reagoimaan analogisesti US-patenttijulkaisussa 4 029 642 kuva-25 tun menetelmän kanssa ekvivalenttisen määrän kanssa kaavan III mukaista yhdistettä, jolloin kondensointiaineena käytetään jonkin verran ylimäärin disykloheksyylikarbodi-imidiä 1-hyd-roksibentsotriatsolin läsnäollessa.

Koska tässä menetelmävaihtoehdossa ei tavallisesti tar-30 vita karboksiryhmien suojausta, ei insuliinijohdannainen normaalisti pääse vaurioitumaan esteröinnissä eikä alkalisessa saippuoinnissa. Reagoimaton desoktapeptidi ja peptidi, joka A21 syntyy yhdisteen IV kondensoituessa Asp -0H:n kanssa, ovat erilaisen molekyylipainon ja varausluvun vuoksi helposti ero-35 tettavissa partitiokromatografisesti Sephadex -LH 20:llä 7 79354 (r) tai geelikromatografiällä Sephadex^-G 75:llä tai G-50 super-fine-laadulla.

Tert-butyylisuojaryhmien poistamiseksi täytyy reaktio-tuotetta käsitellä trifluorietikkahapolla 30-60 minuuttia 5 huoneen lämpötilassa. Tämä reaktio ei vahingoita insuliinijohdannaista. Jos N-suojaryhmäksi valitaan metyylisulfonyylietyy-lioksikarbonyyliryhmä, niin sen poistamiseen y®-eliminoimalla tarvitaan alkalikäsittely. Reaktio-olosuhteet ovat sellaiset (esim. 0,1-n NaOH, 0°C, 5 sek), ettei insuliinijohdannainen 10 vahingoitu. Lähtöaineena käytetty sian N**A\ -bis-Boc-des- B23_30-oktapeptidi-insuliini valmistetaan esimerkiksi seuraa-valla tavalla:

Sikainsuliini saatetaan reagoimaan dimetyyliformamidin, dimetyylisulfoksidin ja veden seoksessa N-etyylimorfoliinin 15 läsnäollessa tert-butyylioksikarbonyyli-N-hydroksisukkinimidi- ®*A 1 esterin (ylimäärin) kanssa. Tällöin saadaan odotettu N , *B1 *B29 . . _ . ... .

N , N -tns-Boc-insulnnx.

Tämän yhdisteen liuokseen dimetyyliformamidissa ja tris-puskurissa (pH 7,5) lisätään sitten trypsiiniä pieninä 20 annoksina niin kauan, kunnes elektroforeesin mukaan lähtöai- A1 c*B 1 netta ei voida todeta. N , N -bis-Boc-des-B23_3Q~oktapep-tidi-insuliini puhdistetaan partitiokromatografiällä Sephadej^ LH: 11a.

Tämä yhdiste saatetaan sitten reagoimaan 1 moolin kanssa 25 kaavan III mukaista peptidiä, joka valmistetaan peptidikemiasta tunnetulla tavalla, 1-2 moolin kanssa 1-hydroksibentsotriatsolia ja noin 0,9 moolin kanssa disykloheksyylikarbodi-imidiä dimetyyliformamidissa noin pH-arvossa 7-8 (vrt. Chem.Ber. 103 (1970), sivu 788).

30 Raakatuote puhdistetaan partitiokromatografiällä, ja suojaryhmä poistetaan käsittelemällä trifluorietikkahappo/ anisoliseoksella huoneen lämpötilassa. Saostamalla eetterillä, isoelektrisellä saostuksella vedestä ja kromatografioimalla (6)

Sephadex^ G 75:llä tai g 50:llä (superfine) saadaan yhdiste 35 elektroforeettisesti puhtaana ja voidaan kiteyttää tunnetulla 8 79354 tavalla. Näin. saatu insuliini johdannainen on biologisesti täysin aktiivinen.

Lähtöaineina käytetyt des-Phe31-insuliinit ovat tunnettuja esimerkiksi DE-patenttijulkaisusta 2 005 658 tai 5 EP-hakemusjulkaisusta 46 979.

Menetelmävaihtoehdossa b) lähtöaineina käytetyt des-B30-insuliinit ovat tunnettuja esimerkiksi EP-hakemusjulkaisusta 46 979 tai artikkelista Hoppe-Seyler's Z.Physiol. Chem. 359 (1978), 799. Menetelmävaihtoehdossa b) käytetty kaavan IV 10 mukainen lähtöaine valmistetaan peptidikemiasta tunnetulla tavalla. Yhdisteen IV sopivia suojaryhmiä on kuvattu yksityiskohtaisesti teoksessa M. Bodanzky et ai., Peptide Synthesis, Ind. Ed. 1976, Wiley & Sons.

Des-B30-insuliini ja kaavan IV mukainen yhdiste kon-15 densoidaan analogisesti US-patenttijulkaisussa 4 320 196 kuvatun menetelmän kanssa trypsiinin tai trypsiininkaltaisen endopeptidaasin läsnäollessa orgaanisen liuottimen ja veden seoksessa pH-arvossa 5-9 lämpötilassa 20-40°C. Saatu insuliini johdannainen voidaan eristää peptidikemiasta tunnetuin me-20 netelmin.

Menetelmävaihtoehdon c) lähtöaine saadaan sensijaan geeniteknisin menetelmin ihmisen tai kädellisten proinsuliinis-ta. Johdannaiset Arg(B31) ja di-Arg(B31-32) saadaan siitä yksinkertaisesti käsittelemällä trypsiinillä tai trypsiininkal-25 täisellä entsyymillä. Lisäksi voidaan myös suhteellisen helposti konstruoida plasmideja, jotka vastaavia preproinsuliini-johdannaisia pilkkomalla johtavat uusiin insuliinijohdannaisiin, koska ne kohdissa B31 tai B32 luonnossa esiintyvän ar-giniinin sijasta koodaavat muita neutraaleja tai emäksisiä 30 aminohappoja.

Proinsuliinin valmistus käyttäen rekombinaatio-DNA-menetelmää vaatii DNA-sekvenssin muodostamisen, joka koodaa proinsuliinin aminohapposekvenssiä, mikä voidaan toteuttaa joko eristämällä, konstruoimalla tai molempien yhdistelmällä.

35 Proinsuliini viedään sitten lukemisvaiheessa sopivaan vilje- 9 79854 ly- ja ekspressiokantajaan. Kantaja toimii sopivan mikro-organismin transformoijana, ja näin saatu transformoitu mikro-organismi saatetaan sitten fermentointiolosuhteisiin, jotka johtavat proinsuliinipitoisen vektorin lisäkopioiden muodos-5 tumiseen ja proinsuliinin, proinsuliinijohdannaisen tai pro-insuliiniesituotteen (esim. preproinsuliinijohdannainen) ekspressoitumiseen.

Jos ekspressiotuotteena on proinsuliinin esituote, niin tällainen tuote sisältää tavallisesti proinsuliiniamino-10 happosekvenssin, jonka pääteasemassa oleva aminoryhmä on liittynyt proteiinin osaan, jonka se geenisekvenssi normaalisti ilmaisee, johon proinsuliini tai proinsuliinijohdannainen on sijoitettu. Proinsuliiniaminohapposekvenssi on liitetty pro-teiiniosaan spesifisesti pilkottavissa olevaan kohtaan, jo-15 ka on esimerkiksi metioniini. Saatu proinsuliiniaminohapposek-venssi lohkaistaan fuusioidusta geenituotteesta esimerkiksi DE-hakemusjulkaisussa 3 232 036 kuvatulla tavalla ja proinsuliini puhdistetaan ja eristetään.

Tällä tavalla saadun proinsuliinin tai proinsuliini-20 johdannaisen entsymaattinen pilkkominen tapahtuu analogisesti julkaisussa Excerpta Medica International Congress Series No. 231, sivu 292 ff tai DE-hakemusjulkaisussa 3 209 184 kuvatulla menetelmällä.

Kuvatuilla puolisynteettisillä menetelmillä voidaan 25 tunnettujen arginiini(B30)- ja diarginiini(B31-32)-johdannaisten lisäksi sekä geeniteknologisilla menetelmillä saatavien 31 johdannaisten lisäksi, joissa R :ssä on luonnollinen L-amino- happo, valmistaa joukko uusia insuliinijohdannaisia, joiden tunnusmerkkinä on yksi tai useampia emäksisiä ryhmiä ja/tai 30 vapaan karboksyyliryhmän puuttuminen, joten molekyylin netto- B1 varaus on natiivi-insuliinin tai des-Phe -insuliinin varauksen suhteen kasvanut vähintään yhdellä positiivisella varauksella.

Näitä ovat esimerkiksi johdannaiset, joiden B31-asemassa 35 luonnollisten aminohappojen L-lysiinin, L-histidiinin tai 10 79854 L-arginiinin sijasta on näiden D-enantiomeerit, tai sopivat D- tai L-aminohappoanalogit, joiden sivuketjussa on emäksinen ryhmittymä (esim. ornitiini, hydroksilysiini). Aminohapon sijasta B31- asemassa voi olla esimerkiksi kolinesteriryhmä, 5 jolloin positiivisten varausten luku kasvaa kahdella. B31-asemassa olevassa aminohapossa tai aminohappoanalogissa voi olla vapaa karboksyylipääteasema/ tai karboksyyliryhmä voi olla esteröity yksinkertaisella alkoholilla (esim. metanoli, etanoli) tai amidoitu yksinkertaisella typpiemäksellä (esim.

10 ammoniakki, mono- tai dimetyyliamiini); se voi lisäksi olla esteröity esim. koliinilla. Seuraavassa B32-asemassa voi olla esimerkiksi neutraali tai myös muu luonnollinen emäksinen aminohappo tai jokin edellä kuvatuista aminohappojohdannaisis-ta; analogisesti sen karboksyyliryhmä voi olla vapaa tai es-15 teröity tai amidoitu. Myös tässä tapauksessa voi olla esimerkiksi koliiniesteriryhmä tai vielä lisänä neutraali tai emäksinen aminohappo tai aminohappoanalogi.

Kaikille näille insuliinijohdannaisille on yhteistä, että molekyylin pinnalla olevan yhden tai useamman positii-20 visen lisävarauksen johdosta molekyyli on saanut neutraali-alueeseen siirtyneen isoelektrisen pisteen. Riippuen johdannaisesta on mitattu isoelektrisiä pisteitä välillä 5,8-8,5, varsinkin 6,2-8,2 isoelektrisessä polttopisteessä mitattuna. Näin ollen johdannaiset ovat neutraalialueella niukkaliukoi-25 sempia kuin natiivi-insuliini tai proinsuliini, joiden iso-elektrinen piste ja siten maksimaalinen liukenemattomuus on pH-arvossa 5,4, kun ne sensijaan neutraalialueella ovat normaalisti liuenneina.

Insuliinin ja proinsuliinin liukoisuusominaisuuksiin 30 voidaan vaikuttaa isoelektrisen pisteen yläpuolella olevalla alueella, so. terapeuttisesti erityisen mielenkiintoisella alueella, lisäämällä sinkki-ioneja. Sinkki vaikuttaa tällöin kestotuoteperiaatteella siten, että se stabiloi insuliinin heksameerisen rakenteen ja kiteytymistaipumuksen. Ihonalai-35 sessa kudoksessa nämä aggregaatit jälleen liukenevat.

(( 11 79854

Toisena periaatteena insuliinin tai proinsuliinin kestotuotteen valmistamiseksi käytetään kiteyttämistä kompleksina emäksisen proteiinin, esim. globiinin tai protamiinin kanssa.

5 Kun proinsuliinia käytetään liuoksena tai jonakin edellä mainittuna kestotuotteena, tarvitaan natiivisen täysin vaikuttavan insuliinin vapauttamiseksi lisäksi proteolyyttinen hajotus. Proinsuliinilla on sellaisenaan vain noin 1/8 insuliinin biologisesta vaikutuksesta, koska - näin oletetaan -10 osa biologisesti aktiivisesta pinta-alueesta, reseptorisidon-ta-alueesta on proinsuliinissa läsnäolevan C-peptidin suojaama. Proinsuliinina sokeritaudin hoidossa ei kuitenkaan voida käyttää kuin homologista, so. ihmisen sekvenssin sisältävää proinsuliinia (vrt. esim. DE-hakemusjulkaisu 3 232 036). He-15 terologisella proinsuliinilla on merkitsevä immuuniutta aiheuttava vaikutus. Tässä yhteydessä on huomattava, että myös ihmisen proinsuliinien C-peptidiosassa on vaihteluita.

B31

Sikainsuliini-Arg OH:lla ja vastaavalla diarginiini-johdannaisella on Chance'n (Excerpta Medica International 20 Congress Serie No. 231, sivut 292, 293) tutkimusten mukaan vain 62-66 % natiivisen sikainsuliinin aktiivisuudesta.

B31

Yllättäen on nyt keksitty, että insuliini-Arg B 31 B3 2 OH:11a, insuliini-Arg -Arg -OH:lla ja muilla insuliini-johdannaisilla, joiden B-ketjun C-terminaalissa on emäksisen 25 luonteen omaava orgaaninen ryhmä, on päinvastoin kuin proinsuliinilla suunnilleen yhtä korkea biologinen aktiivisuus kuin natiivisella insuliinilla.

Periaate, jolla keksinnön mukaisista valmisteista vapautuu lääkeainetta hidastetusti, on lisäksi täysin uusi 30 periaate, jota voidaan käyttää ilman kestotuoteapulaitetta, kuten sinkkiä tai protamiinisulfaattia. Kestotuote perustuu proteiinikemiaan olennaisesti liittyvään fysikaaliseen periaatteeseen, so. insuliinin niukkaliukoisuuteen isoelektri-sessä pisteessä. Insuliinin uudelleenliukeneminen fysiologi-35 sissa olosuhteissa saavutetaan mahdollisesti lisänä olevien emäksisten ryhmien lohkeamisen ansiosta, joka lohkeaminen ta- 12 79354 pahtuu johdannaisesta riippuen käsiteltäessä trypsiinillä tai trypsiininkaltaisella entsyymillä ja/tai karboksipepti-daasi B:llä tai karboksipeptidaasi B:n kaltaisella entsyymillä ja/tai estraasiaktiivisella entsyymillä. Kulloinkin lohkais-5 tut ryhmät ovat joko puhtaasti fysiologisia metaboliitteja, kuten aminohappoja, ornitiinia tai koliinia, tai myös helposti metaboloituvia, fysiologisesti haitattomia aineita.

Näissä uusissa lääkkeissä aktiivisina aineina käytetyt insuliinijohdannaiset eroavat myös kirjallisuudessa kuvatuis-10 ta välituotteista, jotka sisältävät vielä osia heterologisesta C-peptidistä, siinä suhteessa, että ne eivät ole vahvemmin immunogeenisia kuin vastaava insuliini.

Edellä mainitut Chance'n liian alhaiset aktiivisuus-arvot johtuvat mahdollisesti tutkittujen fraktioiden riittä-15 mättömästä puhtaudesta tai systemaattisesti mittausvirheestä. Näiden yhdisteiden käyttöä lääkkeiden tehoaineina ei kuitenkaan tähän mennessä (ja ehkä tästä syystä) ole esitetty.

Keksinnön mukaiset valmisteet sisältävät tehoaineena yhtä tai useampaa uusista kaavan I mukaisista insuliinijohdan- * * * B 31 B 3 2 20 naisista tai insuliini-Arg -Arg -OH:ta.

Niillä on edullisesti pH-arvo 2,5-8,5, ne sisältävät sopivaa isotoniseksi tekevää ainetta, sopivaa säilöntäainet-ta ja mahdollisesti sopivaa puskuria pH-alueen 5,0-8,5 saamiseksi.

25

Keksinnön mukaisten johdannaisten tyypillisiä käyttömuotoja ovat valmisteet, jotka isoelektrisen pisteen alapuolella ovat liuoksina fysiologisesti hyväksyttävässä kantajassa. Tällöin liuoksen pH on tyypillisesti 5,0 eli selvästi korkeampi kuin happamilla perinteisillä insuliinivalmisteilla 30 (tyypillisesti pH=3,0). Lähempänä neutraalia oleva injektio-•· iuos on selvästi edullinen mm. paremman siedettävyytensä vuoksi.

Toinen tyypillinen käyttömuoto on kuvattujen johdannaisten amorfisen tai kiteisen sakan suspensio fysiologisesti hyväksyttävässä kantajassa neutraalissa pH-arvossa.

35 On kuitenkin myös mahdollista vahvistaa johdannaisille ominaista niukkaliukoisuutta fysiologisella pH-alueella käyt- 13 79854 täen lisäksi kestovalmisteiden periaatetta, kuten lisäämällä sinkkiä tai protamiinisulfaattia. Lisätty sinkkimäärä voi tällöin olla korkeintaan 100 μg Zn^+/100 insuliiniyksikköä, tyy- 2 + pillisesti noin 50 jug Zn /100 insuliiniyksikköä. Protamiini-5 määrä voi olla 0,28-0,6 mg 100 yksikköä kohti (laskettu pro-tamiinisulfaattina). Tällä tavalla voidaan valmistaa erittäin kauan vaikuttavia valmisteita, joilla tulevaisuudessa tulee olemaan laajempaa käyttöä kuin tähän mennessä, koska juuri insuliinin perusmäärä näyttää olevan terapeuttisesti edulli-nen. Tämä on jo tunnustettu tosiasia insuliiniannostuslait-teiden terapeuttisen käytön yhteydessä.

Fysiologisesti vaarattomaksi ja insuliinijohdannaisen kanssa yhteensopivaksi kantaja-aineeksi sopii steriili vesi-liuos, joka on tehty veren kanssa isotoniseksi tavallisella 15 tavalla, esim. lisäämällä glyserolia, natriumkloridia, glukoo-isa, ja joka lisäksi sisältää jotakin tavallisista säilöntäaineista, esim. fenolia, m-kresolia tai p-hydroksibentsoehappo-esteriä. Kantaja voi lisäksi sisältää puskuria, esim. natrium-asetaattia, natriumsitraattia, natriumfosfaattia. pH-arvon 20 säätämiseen käytetään laimeita happoja (tyypillisesti HCl) tai emäksiä (tyypillisesti NaOH).

Insuliinijohdannaiset voivat olla keksinnön mukaisissa valmisteissa myös alkali- tai ammoniumsuoloina. Mielivaltai-nen määrä yhtä tai useampaa kaavan I mukaista insuliinijohdan-25 naista voi olla seoksena muiden tällaisten insuliini johdannaisten kanssa toisistaan riippumatta liuenneena tai amorfisessa ja/tai kiteisessä muodossa.

Toisinaan on edullista lisätä keksinnön mukaiseen valmisteeseen sopiva määrä sopivaa stabisaattoria, joka estää 30 proteiinin saostumisen sen joutuessa lämmön ja mekaanisten vaikutusten alaisena kosketuksiin erilaisten materiaalien kanssa. Tällaiset stabilisaattorit ovat tunnettuja esimerkiksi EP-hake-musjulkaisusta 18 609, DE-hakemusjulkaisusta 3 240 177 tai WO-patenttihakemuksesta 83/00288.

: 35 Keksinnön mukaisissa valmisteissa, joihin on sovellettu yhtä tunnetuista kestovalmisteperiaatteista, kuten protamiini- 14 79854 sulfaatin, globiinin tai sinkin käyttöä sopivina määrinä, voidaan tällaista kestovalmisteperiaatetta soveltaa koko tehoaine-määrän yhteydessä tai osan yhteydessä tai seoksessa olevan yhden tai useamman kaavan I mukaisen insuliinijohdannaisen yh-5 teydessä. Valmiste voi sisältää erilaisia kaavan I mukaisia insuliinijohdannaisia useiden erilaisten hidastavasti vaikuttavien apuaineiden kanssa.

Keksinnön mukaisilla terapeuttisilla valmisteilla voidaan siis ilmeisesti saavuttaa monenlaisia ja erittäin hienos-10 ti säädettäviä vaikutusominaisuuksia; täten edellä jo mainittujen sokeritaudin myöhäiskomplikaatioiden suhteen näyttää mahdolliselta saada aikaan parannusta.

Keksintöä valaistaan edelleen seuraavilla esimerkeillä:

Valmistusesimerkki 1 15 Ihmisinsuliini-(B30)-0-CH2“CH2-N®(CH3) 5 g sikainsuliinia liuotetaan 45 ml:aan dimetyyliforma-midia, 25 ml:aan dimetyylisulfoksidia, 0,5 ml:aan N-etyylimor-foliinia ja 2,5 ml:aan vettä. Liuokseen lisätään sekoittaen huoneen lämpötilassa 1,5 g tert-butyylioksikarbonyyli-N-20 hydroksisukkinimidiä, ja reaktion annetaan tapahtua 6 tuntia. Reaktio keskeytetään sitten lisäämällä 1 tippa jääetikkaa, : tuote saostetaan eetterillä ja suodatetaan. Suodatettu jään nös liuotetaan 360 ml:aan dimetyyliformamidia, ja liuos laimennetaan 320 ml :11a trispuskuria (0,05-m, CaC^^olaari-25 suus 0,01, pH 7,5). Liuokseen lisätään aina tunnin väliajoin 36°C:ssa 20 mg trypsiiniä.

Kaikkiaan 12 lisäyksen jälkeen pH säädetään arvoon 4,5 ja liuos haihdutetaan kuiviin. Puhdistamalla jäännös partitio ns) kromatografiällä Sephadex^-LH 20 patsaassa (8 x 200 cm) sys-30 teemillä n-butanoli-jääetikka-vesi (2:1:10) saadaan 3,25 g N*^ , Ν°*Β^ -bis-Boc-des-B22_3Q°ktaPePti<3i"insuliinia (sika), joka ei happamen ja emäksisen elektroforeesin mukaan sisällä enää lähtöainetta. Substanssin aminohappoanalyysi on odotetun j mukainen. Näytteessä, josta Boc-ryhmät on lohkaistu, ei ha- 35 väitä lainkaan insuliiniaktiivisuutta. Tämä materiaali (3,25 g) liuotetaan yhdessä 1-hydroksibentsotriatsolin (100 mg), HCl* is 79854

Gly-Phe-Phe-Tyr (Bufc) -Thr-Prp-Lys (Boc) -Thr (But) -OCH2CH2-N (CH-j) ’ HCl:n (750 mg) ja N-etyylimorfoliinin (0,5 ml) kanssa 30 ml:aan dimetyyliformamidia. Liuokseen lisätään sitten huoneen lämpötilassa 120 mg disykloheksyylikarbodi-imidiä. Erottunut di-5 sykloheksyyliurea suodatetaan ja tuote saostetaan lisäämällä eetteriä.

Sakka suodatetaan, pestään eetterillä ja kuivataan.

S)

Tuote esipuhdistetaan partitiokromatografiällä Sephadex^LH 20:llä käyttäen samaa systeemiä kuin edellä. Pääpiikistä eriste-10 tään 2,6 g materiaalia saostamalla asetoni/eetteri-seoksella. Kuivattu, vielä suojaamaton johdannainen saatetaan reagoimaan huoneen lämpötilassa trifluorietikkahapon (5 ml) ja anisolin (1 ml) seoksen kanssa 60 minuutin ajan. Jäillä jäähdytetystä liuoksesta saostetaan sitten raakatuote lisäämällä eetteriä.

15 Sakka suodatetaan, pestään eetterillä ja kuivataan.

Tuote esipuhdistetaan partitiokromatografiällä Sephadex^-LH 20:llä käyttäen samaa systeemiä kuin edellä. Pääpiikistä eristetään 2,6 g materiaalia saostamalla asetoni/eetteri-seoksella. Kuivattu, vielä suojaamaton johdannainen saatetaan reagoi-20 maan huoneen lämpötilassa trifluorietikkahapon (5 ml) ja anisolin (1 ml) seoksen kanssa 60 minuutin ajan. Jäillä jäähdytetystä liuoksesta saostetaan sitten raakatuote lisäämällä . eetteriä. Kuivattu sakka liuotetaan veteen, saostetaan ammo- '] niakin vesiliuoksella ja lingotaan. Tuote puhdistetaan 10-%: ; (fh 25 isessa etikkahapossa Sephadex -G 50 superfinella tai G 75:llä.

Halutun piikin fraktioista voidaan ihmisinsuliini-(B30)- OCH2CH2N®(CH3)3 eristää kylmäkuivaamalla (ssanto kiteytyksen jälkeen: 1,2 g). Näin saadulla insuliinijohdannaisella on :: biologisessa kokeessa samantasoinen vaikutus kuin ihmisinsu- :: 30 liinilla.

Kaavan III mukainen oktapepti valmistetaan tavallisella peptidikondensaatiomenetelmällä seuraavan kondensaatio-kaavion mukaisesti: 35 ie 79854 •Kaavan XII mukaisen oktapeptidin synteesikaavio

Gly Phe__Phe_Tyr_Thr___Pro ' Lys__Thr n Z-OH H· •OBu1' DCC/HOBt Ψ t Z--"--OBu1' H /Pd Bufc BOC Bufc Z OH H---OBu1' 2/OH H-OMe z/oH ' W. Okoliini ‘ DCC/HOBt DCC/HOBt DCC/HOBt | Bufc I BOC | Bufc Z--:--OBufc 2 L-1--OMe j ZjZ-y Okoliini TFE H2/Pd H2/Pd | Bu1'^ BOC I Eufc 15 Z--OH li/----OMe Z-OH hZ----/okoliini DCC/HOBt DCC/HOBt I Bufc I EOC But Z__!----1 Z__OMe Z--Z_/Oko1 iini

NaOH H2/Pd 20 - Bu1 j BOC | Bufc Z----Z_OH H__Z_/Okoliini DCC/HOBt

Bufc J BOC Bufc Z / * / / ---------—<—---»--------------------—---^-Okol iini 25 i2/Pd

But| . BOC Bufc äL-----------: L------------V _/Okoliini

Aminohappo- ja alkuaineanalyysiarvot ovat teorian mukaiset.

30 17 79854

Valmistusesimerkki 2 — gTT B 3 2

Sikainsuliini-Arg -Arg -OH:n valmistus käsittelemällä sika-proinsuliinia trypsiinillä 350 mg sikaproinsuliinia liuostetaan 25 ml:aan 0,1-m 5 tris-HCl-puskuria, pH 7,5. Liuokseen lisätään huoneen lämpötilassa 500 ug trypsiiniä, jolloin liuos joidenkin tuntien kuluessa samenee. Reaktion päätyttyä sakka lingotaan, se liuotetaan happameen väliaineeseen ja analysoidaan asetaattikalvo-elektroforeesilla tai HPLC-kromatografiällä. Tuote saostetaan 10 uudelleen ja pestään sekä tavallisen jatkokäsittelyn jälkeen puhdistetaan kationivaihtajalla 0,05-m asetaatilla (pH 4,0) NaCl-gradientilla 0,5-m asti. Tuotetta sisältävät fraktiot yhdistetään ja tuote saostetaan, pestään ja kiteytetään uudelleen, jolloin saadaan 104 mg aminohappoanalyysillä identifioitua 15 ja HPLC:n ja isoelektrisen polttopistemäärityksen mukaan yhte- B 31 B 3 2 näiseksi todettua sikainsuliini-Arg -Arg -OH:ta.

Analogisesti saadaan vastaavasta B31-asemassa modifioidusta sikaproinsuliinista insuliinijohdannainen sikainsulii- . „ B31 B32 ni-Lys -Arg -OH.

20 Lääkevalmisteet

Esimerkki 1 B 31 B 3 2

Insuliini-Arg -Arg -OH:n (sika, valmistettu sian proinsuliinista trypsiinipilkkomalla) heikosti hapan liuos-koostumus, joka sisältää 40 I.U./ml, ja sen kestovaikutus 25 10 ml:n kokonaistilavuuteen vettä liuotetaan seuraavat aineosat: B 31 B 3 2

Insuliini-Arg -Arg -OH (sika) 14,5 mg (27 I.U./mg)

Glukoosimonohydraatti, kiteinen 540,0 mg p-hydroksibentsoehappometyyliesteri 10,0 mg 30 pH-arvo säädetään 1-n HC1- tai 1-n NaOH-liuoksella 4,5:ksi.

Tällä liuoksella saatiin annoksella 0,4 I.U./kg kaniinilla selvä kestovaikutus. Verensokerikäyrän pinta-ala on sama kuin standardivalmisteella, joka sisältää 40 I.U./ml.

is 79854

Esimerkki 2

Ihmisinsuliini-(B30)-koliiniesteri, valmistettu puoli-synteettisesti sikainsuliinista; neutraalikoostumus, joka sisältää 40 I.U./ml, ja sen kestovaikutus 5 Liuotetaan 10 ml:n kokonaismäärään vettä seuraavat aineosat: Ihmisinsuliini-(B30)-koliiniesteri 14,3 mg (28 I.U./mg)

Natriumdivetyfosfaatti-dihydraatti 21,0 mg m-kresoli 27,0 mg 10 Glyseroli 160 mg pH-arvo säädetään lisäämällä 1-n HCl- tai 1-n NaOH-liuosta 7,3:ksi.

Tällä liuoksella on annoksena 0,4 I.U./kg kaniinille selvä kestovaikutus.

15 Esimerkki 3

Sikainsuliinista puolisynteettisesti valmistettu ihmis-B 31 insuliini-Arg -OH kiteisen NPH-valmisteen muodossa, joka sisältää 40 I.U./ml, ja sen vahvasti hidastettu vaikutus Liuotetaan 10 ml:n kokonaismäärään vettä seuraavat 20 aineosat: B 31

Ihmisinsuliini-Arg -OH 14,5 mg (27,5 I.U./mg)

Protamiinisulfaatti 1,3 mg

Natriumdivetyfosfaatti-dihydraatti 21,0 mg 25 m-kresoli 15,0 mg

Fenoli 6,0 mg

Glyseroli 160 mg pH-arvo säädetään lisäämällä 1-n HCl- tai 1-n NaOH-liuosta 7,3:ksi.

30 Tällaisella kidesuspensiolla on annoksena 0,4 I.U./kg kaniinille vahvasti hidastettu vaikutus.

Esimerkki 4 B 3 1 B 31

Ihmisinsuliini-Arg -0H:n ja ihmisinsuliini-Arg B 3 2

Arg -OH:n seos, jotka molemmat on valmistettu puolisynteet-35 tisesti sikainsuliinista, sinkkipitoisena suspensiona, joka

II

19 79854 sisältää 40 I.U./ml, ja valmisteen vahvasti hidastettu vaikutus

Liuotetaan 10 ml:n kokonaismäärään vettä seuraavat aineosat: B 31 5 Ihmisinsuliini-Arg -OH 7,3 mg (21,5 I.U./mg) B 31 B 3 2

Ihmisinsuliini-Arg -Arg -OH 7,3 mg (27,0 I.U./mg)

Sinkkikloridi, vedetön 0,46 mg 10 Natriumasetaatti 14,0 mg p-hydroksibentsoehappometyyliesteri 10,0 mg

NaCl 80,0 mg pH-arvo säädetään lisäämällä 1-n HCl- tai 1-n NaOH-liuosta 7,0:ksi.

15 Tällä suspensiolla on annoksena 0,4 I.U./kg kaniinille vahvasti hidastettu vaikutus.

Esimerkki 5

Puolisynteettisesti sikainsuliinista valmistettu ih-B31 B 3 2 misinsuliini-Arg -Lys -OCH^ heikosti happamena liuosval-20 misteena, joka sisältää 100 I.U./ml, ja sen vahvasti hidastettu vaikutus

Liuotetaan 10 ml:n kokonaismäärään vettä seuraavat aineosat: B 31 b32

Ihmisinsuliini-Arg -Lys -OCH3 37,0 mg 25 (27,0 I.U./mg)

Natriumasetaatti 14,0 mg p-hydroksibentsoehappometyyliesteri 10,0 mg

NaCl 80,0 mg pH-arvo säädetään lisäämällä 1-n HCl- tai 1-n NaOH-liuosta 30 6,0:ksi Tällä liuoksella on kaniinille annostettuna hidastettu vaikutus.

20 7 S354

Esimerkki 6

Trypsiinillä pilkkomalla bakteerialkuperää olevasta kädellisten preproinsuliinista valmistettu ihmisinsuliini- B31 B31

Arg -OH NPH-kiteiden muodossa seoksena ihmisinsuliini-Arg B 3 2 5 Arg -OH:n kanssa, joka on valmistettu bakteerialkuperää olevasta kädellisten preproinsuliinista pilkkomalla trypsiinillä.

Liuotetaan 10 ml:n kokonaismäärään vettä seuraavat aineosat: 331

Ihmisinsuliini-Arg -OH 11/1 mg 10 (27,5 I.U./mg)

Ihmisinsulnni-Arg -Arg -OH 3,7 mg (27,0 I.U./mg)

Protamiinisulfaatti 1,0 mg

Natriumdivetyfosfaatti.2Η^Ο 21,0 mg 15 m-kresoli 15,0 mg

Fenoli 6,0 mg

Glyseroli 160 mg pH-arvo säädetään lisäämällä 1-n NaOH- tai 1-n HCl-liuosta 7,2:ksi.

: 20 Tällä suspensiolla saadaan kaniinilla (0,4 I.U./kg) .: vahvasti hidastettu vaikutus.

Il

Claims (3)

21 79354

1. Menetelmä fysiologisesti hyväksyttävästä kantajasta ja vaikuttavasta aineesta koostuvan lääkevalmisteen 5 valmistamiseksi, joka sisältää vaikuttavana aineena insuliini johdannaista , jonka isoelektrinen piste on 5,8 - 8,5 ja jolla on kaava I, AI |—S-S—j A21 1° H-j Gly A-Ketju Asn |-OH 11 i i 15 29 b2 B y r1- Val B-Ketju | p30_R31 jossa

20 R1 on H tai H-Phe, on Ala, Thr tai Ser, ja ^ 31 ^ R on koliinitähde (-OCH2-CH2-N(CH^)2, Arg, Lys tai Arg- ja/tai Lys-yksikköjen di- tai tripeptiditähde, jolloin Arg- tai Lys-jäännösten terminaaliset COOH-ryhmät voivat 25 olla myös esteröityjä koliinilla tai yksinkertaisilla alkoholeilla tai amidoituja yksinkertaisilla typpiemäksillä, tai sen fysiologisesti hyväksyttävää suolaa, tunnet-t u siitä, että muodostetaan vaikuttavasta aineesta ja kantajasta liuos tai suspensio, jolloin kantaja sisältää 30 a^) tavanomaista isotoniseksi tekevää ainetta, a2> tavan omaista säilöntäainetta, a^) puskuria ja/tai a4) 0-100 pg : : sinkkiä/100 I.U. ja/tai muita tavanomaisia hidastavan vai kutuksen omaavia apuaineita.

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, t u n -35 n e t t u siitä, että valmiste sisältää vaikuttavana aineena insuliini-B31-Arg-OH:ta tai insuliini-B31-Arg-B32-Arg-OH:ta. 22 79854

3. Patenttivaatimuksen 1 tai 2 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että kaavan I mukainen insuliini johdannainen esiintyy seoksena, joka koostuu a) liuenneista ja b) amorfisista ja/tai kiteisistä aineosista. li 23 79854