FI73130B - Foerfarande foer framstaellning av renat insulin laempat foer beredning av foer kliniskt bruk anvaendbara injicerbara insulinberedningar. - Google Patents
Foerfarande foer framstaellning av renat insulin laempat foer beredning av foer kliniskt bruk anvaendbara injicerbara insulinberedningar. Download PDFInfo
- Publication number
- FI73130B FI73130B FI793110A FI793110A FI73130B FI 73130 B FI73130 B FI 73130B FI 793110 A FI793110 A FI 793110A FI 793110 A FI793110 A FI 793110A FI 73130 B FI73130 B FI 73130B
- Authority
- FI
- Finland
- Prior art keywords
- insulin
- foer
- antibodies
- bovine
- preparations
- Prior art date
Links
Landscapes
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Description
[775£^7| KUULUTUSJULKAISU n- [Β^ 11> UTLÄGGN,NGSSKRIFT 30 C Patentti nyöm.etty l4>Sgiy '45* Patent r:.oJ :el-it 10 00 U07 (51) Kv.lk4/lnt.CI.4 A 61 K 37/26, C 07 K 7/*+0
S UOMI-FI N LAN D
(H) (21) Patenttihakemus - Patentansökning 793110 (22) Hakemispäivä - Ansökningsdag 08.10.79
Patentti-ja rekisterihallitus (23) Alkupäivä-Giltighetsdag 31.07.69
Patent- och registarstyrelsen (41) TuNut julkiseksi - Biivit offentiig 08.10.79 (44) Nähtäväksipanon ja kuul.julkaisun pvm. - 29.05.87
Ansökan utlagd och utl.skriften publicerad (86) Kv. hakemus-int. ansökan (32)(33)(31) Pyydetty etuoikeus - Begärd prioritet 09.08.68 Iso-Britannia-Storbritannien(GB) 38081 /68 (71) Novo Terapeutisk Laboratorium A/S , Fug 1 ebakkeve j 115, KeSbenhavn, Tanska-Danma rk(DK) (72) Jörgen Sohi ichtkru 1 1 , Br«5nsh^j, Tanska-Danmark(DK) (7*0 Oy Kolster Ab (5*0 Menetelmä kliiniseen käyttöön soveltuvien, injektoitavien insuliini-valmisteiden valmistukseen soveltuvan puhdistetun insuliinin valmistamiseksi - Förfarande för framstä11 ning av renat insulin lämpat för beredning av för kliniskt bruk användbara injicerbara insu1inbered-n i ngar (62) Jakamalla erotettu hakemuksesta 2276/69 -Avdelad fran ansökan 2276/69 Tämä keksintö koskee menetelmää kliiniseen käyttöön soveltuvien, injektoitavien insuliinivalmisteiden valmistukseen soveltuvan puhdistetun insuliinin valmistamiseksi, jolloin lähdetään kaupallisesta tai raa'asta härän ja/tai sian insuliinista, joita insuliinivalmisteita annettaessa ei muodostu insuliinin vasta-ainei-: ta tai tällaisia esiintyy hyvin vähäisessä määrin, ja jotka insu- liinivalmisteet epäjatkuvan polyakryyliamidigeelielektroforeesi-analyysin (DISC PAGE) mukaan ovat oleellisesti yksikomponenttisia.
Keksinnön mukaiselle menetelmälle on tunnusomaista, että sian ja/tai härän haimakudoksesta saatua kaupallista tai raakaa : insuliinia puhdistetaan poistamalla siitä sekä haimasta peräisin olevat proteiinit, joiden molekyvlipaino on yli 6000, että antigeeniset insuliinia muistuttavat aineet, joiden molekyylipaino 2 73130 on noin 6000, edullisesti geelisuodattamaila ja pylväskromatcgra-foimalla ioninvaihtajän avulla, jolloin kerätään ne jakeet, jotka vastaavat insuliinihuipun keskeistä, suurinta osaa.
Insuliiniterapian ensimmäisten vuosien aikana, jolloin käytettiin amorfisen insuliinin injektoitavia liuoksia, olivat allergiset ihoreaktiot yleisiä. Otettaessa käytäntöön kiteisen insuliinin injektoitavat liuokset, vähenivät ihoreaktioiden lukuisuus ja vaikeus ja ne eliminoituivat käytännöllisesti katsoen, kun potilaat siirtyivät käyttämään uudelleenkiteytetyn insuliinin liuoksia. Nykyään kaikki kliiniseen käyttöön tarkoitetut kaupalliset insuliini-valmisteet valmistetaan kiteisestä insuliinista.
Edellämainitun ihon allergisuuden aiheutti todennäköisesti haimasta peräisin oleva proteiinimateriaali, jota on läsnä epäpuhtauksina huomattavia määriä amorfisessa insuliinissa, pienemmässä määrässä kiteytetyssä insuliinissa ja vain mitättömiä määriä, jos lainkaan, uudelleenkiteytetyssä insuliinissa.
Muita sivuvaikutuksia, kuin ne, jotka selitetään johtuvaksi itse insuliinimolekyylin luonteesta ei ole luettu nykyaikaisten in-suliinivalmisteiden, jotka sisältävät uudelleen kiteytettyä insuliinia, syyksi. Muutamien kuukausien hoidon jälkeen on sokeritautisen potilaan seerumin todettu sisältävän immunoglobuliineja, jotka yhdistyvät insuliinin kanssa in vitro ja in vivo. (Tällaisia insuliinilla käsitellyistä marsuista saatuja seerumeja käytetään nykyään tavanomaisesti insuliinin immunologiseen määritykseen.) Tämä sivuvaikutus on ei-toivottava useista syistä: 1. Insuliinin vasta-aineiden muodostuminen osoittaa kehon jatkuvan antagonistisen tilan oleellista hormoonia, insuliinia vastaan.
2. Tämä tila on todennäköisesti haitallinen kehon soluille, esim. ^'.'-soluille, jotka ovat tuhoutuneet kaniineissa immunisoitaessa insuliinilla ja apuaineella. Otaksutaan, että myöhemmät dia-beettiset komplikaatiot, kuten veritauti voivat tulla pahoiksi.
3. On todettu, että insuliinin vasta-aineiden korkea määrä aiheuttaa toisinaan insuliinin vastustuskykyä, so. korkean annostar-peen ja metabolisen kontrollin puuttumisen.
4. On arvioitu, että sokeritautia sairastavan väestön varsinainen annostarve ylittää paljon sen tarpeen, mikä olisi välttämä- 3 731 30 töntä, että vasta-aineen muodostuminen voitaisiin välttää.
5. Eräissä potilaissa sitovat vasta-aineet naudasta valmistettua insuliinia paljon voimakkaammin kuin siasta valmistettua insuliinia ja on todettu verensokeriniukkuustapauksia sen jälkeen kun on vaihdettu insuliinivalmisteiden laatukoostumusta.
6. Kun insuliinin vasta-aineita alkaa muodostua potilaassa, tapahtuu samanaikaisesti suurenemista kiertävän eksogeenisen seerumi-insuliinin konsentraatiossa. Osa seerumi-insuliinista sitoutuu vasta-aineisiin. Kokonaisinsuliinin ja vieläpä vapaan insuliinin konsentraatiot voivat saavuttaa arvoja, jotka ovat 10 - 100 kertaa suuremmat kuin normaali fysiologinen konsentraatio. Nämä korkeat määrät ovat haitallisia kudoksille. Ne voivat edistää valtimon hau-rauskovetustautia ja ne voivat vahingoittaa vielä elossa olevia fi-soluja. On osoitettu, että korkeilla insuliinin konsentraatioilla voi olla ehkäisevä vaikutus /4-solun sekredaatioon.
Insuliinin vasta-aineiden kehittymisen takana olevaa mekanismia ja näiden aineiden ominaisuuksia on tutkittu kasvavalla kiinnostuksella viimeisten 5-10 vuoden ajan. On huomattu, että insuliinin laji näyttää olevan määräävä tekijä vasta-aineiden kehittymisessä. Naudasta saatu insuliini, joka eroaa (3 aminohappoasemaa) ihmisessä muodostuneesta insuliinista enemmän kuin siasta saatu insuliini (1 aminohappoasema), on kuten voidaan odottaa, enemmän antigeeninen kuin siasta saatu insuliini. Toisaalta siasta saatu insuliini aiheuttaa siasta saatua insuliinia vastaan vaikuttavien vasta-aineiden muodostumisen myöskin sioissa. Mitään selitystä ei tälle viimemainitulle huomiolle ole löydetty, joskin on kokeeksi oletettu, että epänormaalin korkeat siasta saadun insuliinin konsentraatiot injektiomuodossa voivat yllyttää siassa olevaa immunologista "apparaattia" tuottamaan vasta-aineita sen omaa insuliinia vastaan.
Aikaisemmin oli alan asiantuntijan käsitys se, että insuliini sinänsä, vereen injektoituna, aiheutti insuliinivasta-aineiden muodostumisen. Nyt on kuitenkin yllättäen havaittu, että puhdistamalla insuliini erittäin huolellisesti voidaan valmistaa insuliinia, joka vereen injektoituna ei aiheuta lainkaan tai ei ainakaan merkitsevää insuliinivasta-aineiden muodostumista. Näin puhdasta sian ja härän insuliinia (eli MC-insuliinia) ei ole aikaisemmin valmistettu.
Siten keksinnön mukaisesti valmistettu insuliini on puhdas, ja on yllättävää, että se on erittäin vähäisessä määrin tai ei lainkaan antigeeninen.
4 731 30
Julkaisuista Biochem. 4 (1965) 1044 ja Biochem. J. 106 (1968) 531 tunnetaan kalan insuliini, joka on aivan eri aine kuin sian tai härän insuliini. Kalan insuliini ei ole puhdistettu siten, että tuloksena olisi monokomponenttinen tuote. Julkaisusta ei ilmene, onko kalan insuliini vailla antigeenisyyttä.
Julkaisussa J. Biol. Chem. 235 (1960) 2294 on selitetty menetelmä insuliinin valmistamiseksi. Tämäkään insuliini ei ole monokomponenttinen .
GB-patentin 871 541 ja US-patentin 3 069 323 mukaisilla menetelmillä ei myöskään voida valmistaa monokomponenttista insuliinia. GB-patentissa on vain yksi insuliinia koskeva esimerkki (n:o 14). Insuliinin antigeenisyyttä ei ole esitetty, eikä myöskään ole mainittu, miten saadaan monokomponenttista insuliinia.
GB-patentin 1 054 523 ja FI-patentin 30 528 mukaisilla menetelmillä ei myöskään saada monokomponenttista insuliinia.
Esillä oleva keksintö tarjoaa ratkaisun probleemaan, jonka muodostaa kehon vastustuskyvyttömyys tunnettuja insuliinivalmistei-ta vastaan. Keksinnön mukaisesti valmistettu insuliini ei aiheuta kehon antagonistista reaktiota, eli ei muodostu insuliinin vasta-aineita, tai tällaisia muodostuu hyvin vähäisessä määrässä, koska uusi insuliinivalmiste on vapaa määrätyistä aineista, joita on aina ollut läsnä tunnetuntyyppisissä insuliinivalmisteissa, mainittujen aineiden molekyylipainon ollessa korkeampi kuin insuliinin. Aikaisemmin otaksuttiin, että itse insuliini aikaansai insuliinin vasta-aineet, mutta nyt on siis yllättäen ilmennyt, että syynä ei ole insuliini-molekyyli vaan mainitut epäpuhtaudet, joiden aineiden molekyyli-painot ovat korkeammat kuin insuliinin.
Keksinnön mukaisesti valmistettu insuliini ei myöskään sisällä sellaisia insuliinia muistuttavia aineita, joiden molekyylipai-no on kutakuinkin sama kuin insuliinin, mutta jotka hiukan eroavat insuliinista kemiallisen koostumuksensa puolesta, esimerkiksi mono-desamidoinsuliinia ja ainetta, joka näyttää olevan! insuliinin arginii-nijohdannaista, joilla aineilla on jonkinasteista antigeenisyyttä. Uuden insuliinivalmisteen pH:n tulee edullisesti olla noin 7 mono-desamidoinsuliinin muodostumisen pysyttämiseksi minimissään varastoinnin aikana.
5 731 30
Eräs tunnettu menetelmä kooltaan erilaisten proteiinimolekyy-lien erottamiseksi on liuottaa proteiiniseos liuottimeen, johon molekyylit dissosioituvat ja johtaa liuos molekyyliseulan läpi, esim. sellaisen orgaanisen aineen muodostaman pylvään läpi, joka on ristisidottu kolmiulotteiseksi verkoksi, jolla on määrätty huokossuuruus. On osoitettu, että kiteinen insuliini, joka on liuotettu 1-m etikkahappoon, voidaan fraktioida Sephadex ® G-50-pylvään avulla vastaavasti komponenteiksi a), b) ja c). Nämä komponentit voidaan erottaa liuoksistaan tavanomaisten menetelmien avulla, esim. suolaamalla pois liuoksesta, saostamalla reaktioltaan neutraalilla sinkkisuolalla, kuivaamalla jäähdyttäen jne. Komponentin a) määrä voi olla 2-5 paino-% kiteytetystä insuliinista ja vähemmän kuin 1 paino-% uudelleen kiteytetystä insuliinista. Komponentin b) määrä voi olla kummassakin tapauksessa 4 - 8 %. Komponentti b) voidaan edelleen hajottaa useiksi proteiineiksi, joilla on likimain sama molekyylikoko, mutta jotka eroavat varauksensa puolesta^ Tämä on osoitettu käyttämällä anioninvaihtoainetta DEAE Sephadex k-'A 50 ja komponentin b) (härkä) liuosta 7-m virtsa-aineliuoksessa, joka on puskuroitu 0,04-m TRIS:illä (tris(hydroksimetyyli)-aminometaani) pH-arvoon 7,7, NaCl-gradientti 0 - 0,2-m, ks. kuvio 1, jossa huiput numero 4, 6 ja 7 vastaavat tunnettuja aineita: vastaavasti proinsu-liinia, välituotetta ja dimeeriä. Muita aineita ei ole vielä identifioitu. Nämä aineet voidaan kaikki erottaa liuoksistaan tunnettu-jen menetelmien avulla.
: Komponentti c) voidaan- hajottaa ioninvaihtokromatografiän avulla. Se sisältää pääfraktion, joka on puhdasta insuliinia, mono-desamido-insuliinia sekä fraktion, jota tässä kutsutaan "arginiini-insuliiniksi", koska se sisältää enemmän arginiinia kuin insulii-nimolekyylissä läsnäolevan määrän. Mono-desamidoinsuliinin fraktio komponentissa c) vaihtelee ja on riippuvainen insuliinin "alkuperästä". Komponenttia c) on yleensä 3-10 paino-%. Arginiini-insu-liinia voi olla 2-3 paino-% komponentista c).
* Kuvioissa 2a ja 2b on esitetty tulokset fraktioista, jolloin : kuvio 2a esittää graafisesti uudelleen kiteytetylle insuliinille ; suoritettua geelisuodatusta: Sephadex® G 50, 1-m etikkahappo; abs- kissalla on tilavuus, ja ordinaatalla absorptio. Kuvio 2b esittää : graafisesti kuvion 2a fraktiolle C anioninvaihtajaa käyttäen suo- • ritettua kromatografiaa; abskissalla on tilavuus ja ordinaatalla absorptio.
73130
Kuviossa 2c on esitetty fraktioiden komponentit sellaisina kuin ne on saatu polyakryyliamidigeeli-elektroforeesin (PAGE) avulla, joka on suoritettu levymenetelmän mukaan, jonka ovat kuvanneet Ornstein ja Davis, käyttäen 7,5 % polyakryyliamidia ja pH-arvoa 8,9.
On todettu, että organismi sietää uusia insuliinivalmisteita yllättäen paremmin kuin tunnettuja insuliinivalmisteita. Selitys tähän on siinä, että tunnetuissa insuliinivalmisteissa läsnäolevat komponentit a) ja b) sisältävät ei-odotetusti voimakkaasti antigeenisiä ja ilmeisesti diabetogeenisiä aineita, kun taas uudet insu-liinivalmisteet ovat yllättäen ei-antigeenisiä.
Suoritetuissa myrkyllisyyskokeissa käytettiin koe-eläiminä kaniineja, koska ne osoittavat samantyyppistä seerumin vasta-aine-reaktiota kuin ihmiset, kun niitä käsitellään tunnetuilla insulii-nivalmisteilla, so. samanlaisia vasta-aineen ominaisuuksia insuliinin sitomiskapasiteettiin ja insuliiniin kohdistuvaan affiniteettiin nähden. (Marsut tuottaisivat vasta-aineita, joilla on paljon suurempi aktiviteetti ja kapasiteetti. Kaniineissa muodostunut insuliini eroaa ihmisessä muodostuneesta insuliinista vain B 30-asemassa, joka on seriini kaniineilla ja treoniini ihmisillä. Marsu-insuliini eroaa toisaalta ihmis-insuliinista 18-asemassa).
Kaniineihin ruiskutettiin kolmesti viikossa vakio proteiini-annos, 40 μq liuotettuna 1 ml:ssa 0,04-m natriumfosfaattipuskuri-liuosta pH-arvossa 7,4. Kysymyksen ollessa insuliinista, tämä määrä vastaa noin 0,5 kansainvälistä yksikköä kiloa kohti, mikä on likimain keskimääräinen annossuuruus sokeritaudin hoidossa. Seerumin vasta-ainemäärät tutkittiin säännöllisin väliajoin tavanomaisia me- 1 25 netelmiä käyttäen. Määrä ilmaistaan sinä %-määränä lisätystä I-insuliinista (nauta), joka on sitoutunut näytteessä oleviin vasta-aineisiin. Eräitä tuloksia on esitetty kuviossa 3.
Abskissalla päivien lukumäärä, ordinaatalla % sitoutunutta 125 I-insuliinia (nauta). Käyrä 1: komponentti a) (nauta), käyrä 2: komponentin b) fraktio 3 (kuvio 1, nauta), käyrä 3: dimeeri (nauta), käyrä 4: proinsuliini (nauta), käyrä 5: uudelleen kiteytetty insuliini (nauta), käyrä 6: puhdas insuliini (nauta).
7 731 30
Tuloksista on kaksi erittäin yllättäviä ja odotusten vastaisia : 1. Insuliinivalmiste, joka käsittää uuden puhtaan insuliinin, ei aikaansaa vasta-aineita insuliinia vastaan.
2. Komponentti a), joka ei ole insuliinia, aiheuttaa tavattoman runsaan vasta-aineen muodostuksen insuliinia vastaan. Todennäköisin selitys tähän on se, että se sisältää jotain, joka on toistaiseksi tuntemattomalla tavalla kemiallisesti sukua insuliinille.
3. Tavallinen erittäin puhdas insuliini, so. uudelleen kiteytetty insuliini synnyttää vasta-aineita kuten se tekee ihmisissäkin.
4. Aineet, jotka kuuluvat komponenttiin b), nimittäin n:o 3 (katso kuviota 1), dimeeri ja proinsuliini, ovat antigeenisiä aiheuttaen vasta-aineiden muodostumisen insuliinia vastaan.
Kuviossa ei ole esitetty sitä havaintoa, että komponentin c) "arginiini-insuliini" tuotti vähäisen, mutta merkittävän määrän vasta-ainetta 45 päivän jälkeen.
Sietokokeen kuluessa ilmeni eräissä kaniineissa pyrkimystä kohonneiden verisokeriarvojen muodostumiseen, nimittäin niissä kaniineissa, joihin oli ruiskutettu komponenttia b), ja erityisesti niissä kaniineissa, jotka olivat saaneet yhtä komponentin b) frak-tioista, nimittäin dimeeriä. Dimeeri ei aikaansaa suurinta vasta--· aineiden määrää, mutta tuntemattomista syistä olivat verensokeriar- vot näissä eläimissä korkeimmat. Tätä komponentin b) ja dimeerin vaikutusta voidaan kutsua diabetogeeniseksi tai anti-insuliinin tapaiseksi, sillä itse asiassa näyttää siltä, että eläimet ovat tulleet vastustuskykyisiksi insuliinia vastaan, kuten kuviossa 4 on esitetty. Abskissalla minuutit insuliini-injektion antamisen jälkeen, ordinaatalla seerumin glukoosi mg/100 ml. Käyrä 1: dimeeri (nauta), käyrä 2: puhdas insuliini (nauta).
14 viikkoa kestäneen dimeerillä käsittelyn (nauta, 40 ^g kolmessa viikossa) jälkeen kaniinit paastosivat 16 tuntia ja sen jäl-; keen niille annettiin suonensisäisesti insuliinia (0,5 kansainvälis tä yksikköä kiloa kohti). Kaniinien vertailuryhmää oli käsitelty valmisteella, joka sisälsi puhdasta insuliinia. Kuviossa 4 esitetyistä seerumi-glukoosikäyristä käy ilmi, että vertailukaniinit rea-: goivat insuliiniin odotetulla tavalla, kun taas komponentista b) saadulla dimeerillä käsitellyt kaniinit olivat vastustuskykyisiä insuliinia vastaan. Vastustuskyky voi selittää veren sokeriarvojen 8 73130 kohoamisen, mutta itse ilmiötä ei ole vielä selvitetty. Se näyttää olevan samanlainen kuin vastustuskyky, joka kehittyy eräissä potilaissa käsittelyn aikana hoidettaessa heitä tunnetuilla insuliini-valmisteilla. Otaksutaan, että kliininen vastustuskyky voidaan välttää käyttämällä insuliinivalmisteita, jotka ovat vapaat komponentista b) ja dimeeristä.
Edellä esitettyjen havaintojen hyväksikäyttämiseksi, jotka koskevat kaupallisessa insuliinissa läsnäolevien epäpuhtauksien biologisia ominaisuuksia, insuliini puhdistetaan määrässä, jota ei ole toistaiseksi käytetty kaupallisessa mittakaavassa. Välttämätön puhdistaminen voidaan suorittaa periaatteessa hyvin monenlaisten menetelmien avulla, joilla proteiinit voidaan puhdistaa; suositeltava menetelmä on puhdistaminen geelisuodattamalla ja pylväskromato-grafoimalla.
Lähtöaineena käytetyn insuliinin sisältämien haimasta peräisin olevien proteiinien, joiden molekyylipaino on yli noin 6000, poistaminen voidaan aikaansaada suorittamalla insuliinille geelisuo-datus. On edullista suorittaa geelisuodatus vesipitoisessa väliaineessa, joka voi sisältää veden kanssa sekoittuvia ei-vesimäisiä nesteitä, mutta haluttaessa on myöskin mahdollista suorittaa geeli-suodatus orgaanisissa liuottimissa, jotka sisältävät jonkin verran vettä. Vesipitoista väliainetta käytettäessä on suositeltava pH-alue 2-4. Insuliinin stabiliteetti pH-arvon 2 alapuolella ja pH-arvon 9 yläpuolella on heikko, joten insuliinin degradaatiotuottei-ta muodostuu prosessin aikana näillä pH-alueilla. Hyvin alhainen tai hyvin korkea pH on tämän vuoksi vähemmän sopiva. pH-aluetta 4 -9 voidaan käyttää, jos insuliinin liukoisuutta parannetaan, esim. lisäämällä virtsa-ainetta, jolla myöskin on kyky hajoittaa assosi-aatiotuotteita, joita voi muodostua insuliinimolekyylien välillä ja insuliinimolekyylien ja epäpuhtauksien välillä neutraalin reaktion vaiheilla. Työskenneltäessä alhaisessa pH-arvossa on orgaanisen hapon/ kuten etikkahapon käyttäminen suositeltavaa pH:n säätämiseksi, mutta voidaan myös käyttää väkeviä mineraalihappoja, 0,5 - 4-m etikkahapon konsentraatio on edullinen.
9 73130 Lämpötila ei ole kriittinen geelisuodatukselle ja sitä rajoittavat pääasiallisesti insuliinin stabiliteetti ja liukoisuus. Tällöin on edullista työskennellä suunnilleen huoneen lämpötilassa, esim. välillä 20 - 25°C. Fraktiot, jotka eluoituvat ennen insuliinia sisältävää komponenttia c), heitetään pois. Komponentin c) fraktiot, jotka ovat vapaat aineesta, jonka molekyylipaino on suurempi kuin 6000, yhdistetään ja insuliini voidaan ottaa talteen, esim. haihduttamalla, suolaamalla pois liuoksesta tai saostamalla sinkki-ioneilla. Insuliinia voidaan käyttää sellaisenaan tai kiteytyksen jälkeen farmaseuttisten insuliinivalmisteiden valmistukseen.
Keksinnön mukaisesti poistetaan myös insuliinia muistuttavat aineet, joilla on miltei sama molekyylipaino kuin insuliinilla, mutta jotka hiukan eroavat insuliinista kemiallisen koostumuksensa puolesta, esimerkiksi mono-desamido-insuliini, ja aine, joka näyttää olevan insuliinin arginiinijohdannainen. Suositeltava menetelmä ar-giniinijohdannaisen ja deamidoituneen insuliinin poistamiseksi on pylväskromatografia ioninvaihtoainetta käyttäen. Melkein kaikkia kaupasta saatavia ioninvaihtajia, jotka sallivat insuliinimolekyylin läpitunkeutumisen, voidaan käyttää edellyttäen, että menetelmä suoritetaan väliaineessa, jossa insuliinimolekyylit eivät muodosta aggregaatteja keskenään tai epäpuhtauksien kanssa.
Seuraavassa taulukossa on esitetty esimerkkejä sopivista aineista insuliinin puhdistamiseksi.
10 731 3 0
Pylvään täytteet insuliinin kromatograafista puhdistamista varten
Aineet Sideaineet Synteettiset Johdetut luonnon yhdisteistä
Polyak- Poly- Poly- Dekst- Sellu- Algiini- ryyli- sty- akryy- raani, loosa happo amidi reeni lihap- risti- po kytket ty
Geelisuodatus- Bio-Gel Sephadex aineet P-10 G 50
Bio-Gel Sephadex P-30 G 75
Anioninvaihta- jalajit Dowex 1 QAE-
Sephadex
Voimakkaasti emäksisiä ryhmiä
Heikosti DEAE
emäksisiä Bio-Gel DEAE- sellu- ryhmiä DM Sephadex loosa
Ratio- Voiirak- Dowex SE- Fosfory- nin kaasti 50 W Sephadex loitu vaihta- happamia sellu- jala- ryhmiä loosa j it
Heikosti Bio-Gel Amber- CM- CM-sel- Algiini- happamia CM lite Sephadex luloosa happo ryhmiä CG 50
Ioninvaihtoprosessi voidaan suorittaa vettä sisältävällä orgaanisella liuotineluentilla ja on edullista, että orgaaninen liuotin on veden kanssa sekoittuva. Esimerkkejä tällaisista liuottimista ovat tetrametyylivirtsa-aine, dimetyyliformamidi, dioksaani, veden kanssa sekoittuvat ketonit, kuten asetoni, sekä alemmat alkoholit, kuten metanoli, etanoli ja propanolit. Edullisia ovat alkoholit, joita voidaan käyttää konsentraatiossa 30-80 % (til./til.), edullisesti konsentraatioissa 50 - 70 % (til./til.).
„ 73130
Kun eluentti sisältää vähemmän kuin 50 % (til./til.) veden kanssa sekoittuvaa orgaanista liuotinta, voidaan sitä kutsua vesipitoiseksi väliaineeksi ja sellaisissa tapauksissa orgaaninen liuotin voidaan korvata virtsa-aineella käytettynä sellaisessa määrässä, että saadaan 4 - 8-molaarisia, edullisesti noin 7-molaarisia liuoksia. Käytettäessä virtsa-aineen liuosta on sen oltava vapaa ammo-niumsyanaatista, koska syanaatti-ioni reagoi insuliinimolekvylissä olevan aminoryhmän kanssa.
Eluentti sisältää aina puskuriainetta eluentin pH-arvon säätämiseksi. On edullista työskennellä vakio pH-arvossa. Käytettäessä kationinvaihtajaa on eluentin pH-arvon oltava välillä 3 - 6,5, edullisesti välillä 4-6, ja käytettäessä anioninvaihtajaa on eluentin pH-arvon oltava välillä 5,5 - 10, edullisesti välillä 6-9.
Mainitut pH-arvot mitataan lasielektrodilla, joka on tavalliseen tapaan säädetty standardipuskuriliuokseen nähden.
Sopivia puskuriaineita voidaan löytää käytettävissä olevasta kirjallisuudesta.
On edullista, että lämpötila on verraten vakio ioninvaihto-operation aikana. Lämpötila voidaan valita väliltä -10 - 40°C, edullisesti väliltä 0 - 30°C, paitsi silloin kun eluentti on virtsa-aineen vesiliuos, jolloin on edullista pitää lämpötila 5°C:n alapuolella.
Puhdistusprosessissa käytetään insuliinilähtöaineena yleensä kaupallista insuliinia, so. amorfista insuliinia tai kiteistä insuliinia, joka on voitu kiteyttää useita kertoja. Voidaan myös käyttää raakaa insuliinia, kuten insuliinia sisältävää suolakakkua, jota muodostuu otettaessa insuliinia talteen haimarauhasista ja joka yleensä sisältää 10-30 paino-% insuliinia, mutta suuret epäpuhtaus-pitoisuudet tekevät tämän lähtöaineen vähemmän sopivaksi keksinnön mukaiseen puhdistukseen. Parempaa lähtöainetta voidaan saada suorittamalla suolakakun liuokselle isoelektrinen saostus säätämällä liuoksen pH arvoon 5,5 ja erottamalla sakka sentrifugoimalla.
Puhdistusvaiheiden tuloksena on aina sellainen puhdistettu insuliiniliuosfraktio, josta insuliini voidaan ottaa talteen tavalliseen tapaan, esim. haihduttamalla, suolaamalla pois liuoksesta tai saostamalla sinkki-ionien läsnäollessa. Insuliini voidaan haluttaessa kiteyttää ja siitä voidaan valmistaa injektoitavia insuliinival-misteita kuten alalla on tunnettua.
,2 731 30
Keksinnön mukaista insuliinin puhdistusta selostetaan ~au-raavien esimerkkien avulla.
Esimerkki 1a 5 kg hienolaatuista Sephadex® G 50 (valmistaja PHARMACIA, Upsala, Ruotsi) turvotetaan 1-m etikkahapossa ja hienoimmat osaset poistetaan dekantoimalla. Ainetta käytetään pylvään pakkaamiseen, jonka halkaisija on 15 cm ja korkeus 130 cm. Pylväs tasapainoite-taan 1-m etikkahapolla.
10 g sian insuliinia, joka on kiteytetty kertaalleen sitraat-tipuskuriliuoksesta, liuotetaan seokseen, jossa on 390 ml 1-m etik-kahappoa ja 8 ml 1-n hydrokloridia. Tämä liuos kaadetaan pylvääseen. Eluointi suoritetaan 1-m etikkahapolla nopeudella 1 litra/tunti.
200 ml:n suuruiset fraktiot kootaan.
Ekstinktiot arvolla 276 nm mitataan ja esitetään graafisesti, jolloin fraktionumerot ovat abskissalla. Fraktiot, jotka vastaavat insuliinihuipun (korkeimman huipun) keskeistä pääosaa, yhdistetään ja insuliini saostetaan lisäämällä 200 g natriumkloridia yhtä litraa kohti nestettä. Sakka erotetaan sentrifugoimalla ja sille suoritetaan tunnettuun tapaan isoelektrinen saostus ja kiteytys asetaat-tia sisältävästä sitraattipuskuriliuoksesta. Saanto on 8 g kiteistä insuliinia, joka on vapaa haima-alkuperää olevista proteiineista, joiden molekyylipaino on yli noin 6000.
Esimerkki 1b
Kiteinen puhdistettu insuliini, joka on saatu esimerkissä la kuvatulla tavalla, puhdistetaan edelleen ioninvaihtokromatografiän avulla käyttäen Amberlite-ioninvaihtohartsia. Valmistetaan virtsa-aineen 7-m liuoksia ja ne deionisoidaan johtamalla ne sekakerros-ioninvaihtohartsia (Amberlite MB-1) sisältävien pylväiden läpi. Tätä deionisoitua virtsa-ainetta käytetään sen jälkeen puskuriliuoksen valmistukseen: 0,13-m natriumfosfaatti - 7-m virtsa-aine - 1 % n-butanoli, pH 6,00 25°C:ssa. Puskuriliuos säilytetään ja käytetään 4,0°C:ssa, 1,5 kg Amberlite CG 50 Type II käsitellään seuraavilla aineilla: 1) vesi; 2) asetoni; 3) vesi + natriumhydroksidi; 4) vesi; 5) vesi + hydrokloridi ja 6) vesi. Pestyä hartsia suspendoidaan 5 litraan puskuriliuosta. Suspension pH laskee välittömästi ja aina muutaman minuutin päästä lisätään noin 30 ml:n suuruiset annokset 40-% (paino/til.) hydrokloridia pH:n pitämiseksi arvossa noin 6,0.
13 731 30
Kun suspension pH pysyy arvossa 6,00 15 minuutin hämmentämisen jälkeen, hämmennetään seosta yli yön 4°C:ssa. Hartsi suodatetaan ja pestään 30 litralla puskuriliuosta 8 tunnin ajan. Lopullisen suo-doksen pH-arvon tulee olla sama kuin sisäänvirtaavan puskuriliuoksen. Tätä materiaalia käytetään pylvään täyttämiseksi, jonka halkaisija on 7,5 cm ja korkeus 80 cm. Pylväs tasapainotetaan puskuri-liuoksen avulla.
15 g insuliinia, joka on valmistettu esimerkissä 1a kuvatun menetelmän avulla, pannaan pylvääseen 10-% (paino/til.) liuoksena puskuriliuoksessa. Eluointi suoritetaan puskuriliuoksella 4°C:n lämpötilassa ja nopeudella 200 ml/tunti. 100 ml:n suuruiset fraktiot kootaan.
Ekstinktiot arvolla 276 nm mitataan ja esitetään graafisesti, jolloin fraktionumerot ovat abskissalla. Fraktiot, jotka vastaavat insuliinihuipun (korkeimman huipun) keskeistä pääosaa, yhdistetään ja insuliini saostetaan lisäämällä 2 litraa vettä, 15 ml 4-n hydrokloridia ja 600 g natriumkloridia litraa kohti nestettä. Sakka erotetaan sentrifugoimalla ja sille suoritetaan tunnettuun tapaan isoelektrinen saostus ja kiteytys asetonia sisältävästä sitraattipuskuriliuoksesta.
Saanto on 10 g kiteistä insuliinia, joka sisältää vain yhtä komponenttia suoritettaessa sille polyakryyliamidigeelielektrofo-reesi. Kiteinen insuliini on toisin sanoen katsottava puhtaaksi insuliiniksi.
Claims (2)
1. Menetelmä kliiniseen käyttöön soveltuvien, injektoitavien insuliinivalmisteiden valmistukseen soveltuvan puhdistetun insuliinin valmistamiseksi lähtien kaupallisesta tai raa' asta härän ja/tai sian insuliinista, joita insuliinivalmistei-ta annettaessa ei muodostu insuliinin vasta-aineita tai tällaisia esiintyy hyvin vähäisessä määrin, ja jotka insuliinivalmis-teet epäjatkuvan polyakryyliamidigeelielektroforeesianalyysin (DISC PAGE) mukaan ovat oleellisesti yksikomponenttisia, tunnettu siitä, että sian ja/tai härän haimakudoksesta saatua kaupallista tai raakaa insuliinia puhdistetaan poistamalla siitä sekä haimasta peräisin olevat proteiinit, joiden mole-kyylipaino on yli 6000, että antigeeniset insuliinia muistuttavat aineet, joiden molekyylipaino on noin 6000, edullisesti geelisuodattamalla ja pylväskromatografoimalla ioninvaihtajän avulla, jolloin kerätään ne jakeet, jotka vastaavat insuliini-huipun keskeistä, suurinta osaa.
2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että insuliini on härän insuliini, joka on kiteytetty teräväsärmäisinä romboedreina, joilla on tasomaiset kidepinnat.
Applications Claiming Priority (4)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
GB3808168 | 1968-08-09 | ||
GB38081/68A GB1285023A (en) | 1968-08-09 | 1968-08-09 | Improvements in or relating to injectable insulin preparations |
FI227669 | 1969-07-31 | ||
FI227669 | 1969-07-31 |
Publications (3)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
FI793110A FI793110A (fi) | 1979-10-08 |
FI73130B true FI73130B (fi) | 1987-05-29 |
FI73130C FI73130C (fi) | 1987-09-10 |
Family
ID=26156582
Family Applications (2)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
FI750290A FI52522C (fi) | 1968-08-09 | 1975-02-03 | Foerfarande foer rening av insulin |
FI793110A FI73130C (fi) | 1968-08-09 | 1979-10-08 | Foerfarande foer framstaellning av renat insulin laempat foer beredning av foer kliniskt bruk anvaendbara injicerbara insulinberedningar. |
Family Applications Before (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
FI750290A FI52522C (fi) | 1968-08-09 | 1975-02-03 | Foerfarande foer rening av insulin |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
FI (2) | FI52522C (fi) |
-
1975
- 1975-02-03 FI FI750290A patent/FI52522C/fi not_active IP Right Cessation
-
1979
- 1979-10-08 FI FI793110A patent/FI73130C/fi not_active IP Right Cessation
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
FI750290A (fi) | 1975-02-03 |
FI73130C (fi) | 1987-09-10 |
FI52522C (fi) | 1979-05-15 |
FI52522B (fi) | 1977-06-30 |
FI793110A (fi) | 1979-10-08 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
FI66751C (fi) | Foerfarande foer framstaellning av ett stabilt insulinpreparatmed laongtidsverkan | |
DE69330087T2 (de) | System zur lokalisierung und kommunikation mit mobilen fahrzeugen | |
DE69519454T2 (de) | Protein, das Interferon-Gamma Herstellung induziert und monoklonaler Antikörper dagegen | |
FR2501692A1 (fr) | Nouveau produit d'erythropoietine et procede pour sa preparation | |
JPH11506739A (ja) | 脂肪酸アシル化蛋白質のゲル化削減法 | |
EP0061138B1 (en) | Angiotropins of leukocytes and inflamed tissue: a new class of natural chemotropic protein mitogens for specific induction of directional growth of blood vessels, neovascularization of tissues and morphogenesis of blood vessel patterns, process for their biotechnical preparation and pharmaceutical compositions | |
DE3922089A1 (de) | Neue proteine und ihre herstellung | |
EP1781697A2 (en) | Novel carbamylated epo and method for its production | |
NO304190B1 (no) | Rent parathyroid hormon, fremgangsmÕte for dets fremstilling samt farmasoytisk sammensetning inneholdende det | |
JPS6222799A (ja) | 血液凝固阻害作用を有する新規ポリペプチド | |
KR930003665B1 (ko) | 에리스로포이에틴의 정제방법 | |
US3907676A (en) | Process for purifying insulin | |
IE912444A1 (en) | Growth hormone crystals and a process for production of these GH-crystals | |
EP1012191B1 (de) | VERFAHREN ZUR GEWINNUNG VON HOCHREINEM vWF ODER FACTOR VIII/vWF-KOMPLEX | |
JP2002511484A (ja) | Ca++を含有する溶出液を用いたタンパク質の新規な分離方法 | |
JPH0381290A (ja) | 精製されたアルブミン溶液の製造方法 | |
EP1008603B1 (en) | Soluble polypeptides consisting on the first coiled coil domain of human and mouse epimorphin. | |
JP2566919B2 (ja) | α−インタ−フエロンの製造方法 | |
FI73130B (fi) | Foerfarande foer framstaellning av renat insulin laempat foer beredning av foer kliniskt bruk anvaendbara injicerbara insulinberedningar. | |
EP0013826A1 (en) | Process for purifying insulin and insulin so prepared | |
EP0301374A2 (de) | Verfahren zur Reinigung des plazentaren Gewebeproteins PP4 | |
JPS6042336A (ja) | 免疫グロブリンの製造方法 | |
CS225117B2 (en) | The purification of insulin | |
JPH02115196A (ja) | エリスロポエチンの精製法 | |
KR100730902B1 (ko) | 글리코실화된 단백질과 비글리코실화된 단백질을 분리하는방법 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
MM | Patent lapsed |
Owner name: NOVO TERAPEUTISK LABORATORIUM A/S |