JPH0381290A - 精製されたアルブミン溶液の製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明はヒト又は動物の生理学的溶液からの精製アルブ
ミン溶液の製造方法、特にイオン交換クロマトグラフィ
ーを用いる精製による製造方法に関する。

本発明を要約すれば、血漿又は血漿画分のようなヒト又
は動物の生理学的溶液から精製されたアルブミンを製造
する方法が提供され、本方法は陰イオン活性剤を用いる
脱脂質（ｄｅｌ　１ｐｉｄａｔｅ）処理法及びイオン交
換樹脂を用いる二回のクロマトグラフィー分離工程を含
んでおり、本発明による方法を適用することによって、
安定で治療用として適当な、純度の大きいアルブミン溶
液を得ることが可能であることである。　通常の血清か
ら注射可能なアルブミン溶液を製造する種々な方法が多
年の間知られていた。これらの方法にはコーン（Ｃｏｈ
ｎ）又はキストラ−（Ｋｉｓｔ−１ｅｒ）及びニッチマ
ン（Ｎｉｔｓｃｈ＋ｍａｎｎ）の慣用法を用いるエタノ
ール沈澱法、及び数種のクロマトグラフィーカラムを含
む各種の精製方法が含まれている。原料物質は新鮮又は
凍結した血漿、低温沈澱物の上澄液、又は成極の蛋白質
が既に除去された画分であることができる。

高性能の精製方式の開発は、カーリング（Ｃｕｒ　ｌ−
ｊｎｇ）、ベルグレア　（Ｂｅｒｇ１５ｆ）、リンドキ
スト（Ｌｆｎｄ−ｑｕｉｓｔ）及びエリクソン（Ｅｒｉ
ｋｓｓｏｎ）　（Ｖｏｘ　Ｓａｎｇｕｉｎ−ｉｓ３３．
１９７７．９７−１０７及び米国特許第４．０８６．２
２２号）により記載されている。特に各種の型式のイオ
ン交換樹脂を供給するファルマシア（Ｐｈａｒｎ＋ａｃ
　ｉａ）社（７アルマシア・ファイン・ケミカルズ［Ｐ
ｈａｒ■−ａｃｉａ　Ｆｉｎｅ　Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ］
−ウプサラースエーデン）により開発されたこの技術は
多数の血液輸血センター（ヨーロッパ、カナダ、オース
トラリア等）で広く使用されている。

しかしこれらの精製方法はアルブミンとの生化学的な類
似性のために、リボ蛋白質型、特にσ−リポ蛋白質の成
極の混入物質の完全な除去を保証するものではない。

これらの分子は加熱下で不安定であることが認められて
おり、変性により、パスツール殺曹法の際の、アルブミ
ン溶液中に臨床的な使用には適当でない、粒状物又は或
程度の濁りの出現の原因となるものと思われる。分子量
又は電荷の差異を基礎とする慣用の方法を用いて、これ
らの混入物を排除することは困難である。そこで本出願
者は従来技術に記載された追加的クロマトグラフィー工
程よりは一層効率的である、これらのリボ蛋白質混入物
を抽出し、排除する方法を開発した。この方法は好適に
は非変性的（ｎｏｎ−ｄｅｎａｔｕ、ｒａｔ　ｉｎｇ）
陰イオン性活性剤を用いる、アルブミン溶液の膜脂質工
程を含んでいる。

本方法は又イオン交換樹脂を用いるクロマトグラフ的分
離及び吸着されたアルブミンの溶離の二段階を含み、第
一の段階は慣用的なアルブミンの分離のためであり、第
二の段階は活性剤及び脱脂質の結果生じる生成物を除去
し、そして高度に精製されたアルブミン溶液を回収する
ために使用される。得られたアルブミン溶液はパスツー
ル殺曹して保存すると安定であるという長所を有してい
る。

本発明の脱脂質処理は最初のクロマトグラフィーカラム
から溶離されたアルブミン溶液を陰イオン性活性剤と長
期間接触させることか成る。この活性剤はトウイーン（
Ｔｗｅｅｎ）及びトリトン（Ｔｒｉｔｏｎ）型の活性剤
から選択することができる。特にトウィーン８０の場合
、その濃度が蛋白質１ｇ当たり０゜０５ないし０．２５
９の間であり、アルブミン溶液の８容量当たりトウィー
ン８０を１容量に調節して使用すれば、極めて良好な結
果が得られる。

この脱脂質処理はかなり長期の接触により、−層好適に
は２５℃で５時間以上の場合、又は接触時間が短くても
温度が高い場合、より詳細には６０℃で１時間の接触に
よって実施することができる。後者の場合アルブミンを
安定化させるカプリル酸ナトリウムのような薬剤を添加
することが必要である。

本発明による方法はヒト又は動物に拘らず、新鮮な又は
凍結した全血漿として、又は低温沈澱の上澄液としてア
ルブミンを含む、任意の生理学的溶液について行うこと
ができる；コーン又はキストラ−及びニッチマンの方法
によるエタノールを用いて血漿を沈澱させた後の上澄液
、又は他の有用な蛋白質が既に取り出されている血漿画
分も利用することができる。原料物質を胎盤から誘導す
ることもできる。

最初のクロマトグラフィーにかける前に、アルブミンを
含むこの初期溶液は、蛋白質含量を１５ないし１８ｇ／
αに、酢酸ナトリウムの使用により伝導率を１．５ない
し２ｍＳ　（ミリ−シーメンス）に、及び酢酸又はソー
ダを用いてｐＨを５゜０ないし８．０に調節される。

このように調節されたアルブミン溶液を、イオン交換樹
脂を用いる第一のクロマトグラフィーカラムにかける。

ＤＥＡＥセファロース、例えばファルマシアにより供給
される“ＤＥＡＥセファロースＣｌ−６Ｂフアースト・
フロー（ｆａｓｔ　ｆｌｏｗ）”のカラムにより、アル
ブミンの良好な選択吸着が得られる。

クロマトグラフィーカラム上に吸着されたアルブミンは
少なくともｐＨ１（等電点、約４．７に等しい）以下の
値に、より詳細には４．０ないし４．７の間の値に緩衝
液のｐＨを下げることによって溶離される。

本発明による方法は脱脂質処理後に最初のクロマトグラ
フィーと同じ型式で及び同じ条件下での、第二のクロマ
トグラフィーカラムによる分離を含んでいる。

この第二のクロマトグラフィー段階によりトウィーン及
びリボ蛋白質混入物を除去することができる。それらの
完全な除去を保証するために、アルブミンを吸着したカ
ラムは、上記のようにｐＨ値を４ないし４．７に下げる
ことによりアルブミンを溶離する前に、緩衝溶液で数回
連続的に洗浄される。

溶離されたアルブミン溶液は次いで治療用として適合し
た生理学的条件下で４ないし２５％の最終濃度に、及び
より正確には６．５ないし７．０のｐＨｓ及び８０ない
し３５０ｍｏｓＭのモル浸透圧濃度に調節される。

本発明による方法は次いでアルブミン１ｇ当たりカプリ
ル酸ナトリウムを０．０１２ないし０．０１５９の濃度
で添加することによって、事前に安定化されたアルブミ
ン溶液をパスツール殺菌することを含んでいる。このパ
スツール殺菌は少なくとも１０時間６０℃以上に加熱す
ることにより行われる。この処理後、溶液は完全に透明
で保存時に安定である。

本発明の具体化の他の方法によれば、アルブミン溶液は
パスツール殺菌されず、カプリル酸ナトリウムも添加さ
れない；この場合は溶剤−活性剤を用いる慣用の方法に
よってウィルス不活性化処理を受ける。

本発明は又上記に記載された方法により精製されたアル
ブミン溶液に関する。該溶液は治療用として特に適当で
ある。

精製され、パスツール殺菌しないアルブミンは真核細胞
の試験管内培養に有利に使用することができる。

下記の実施例は本発明を例証するために役立つものであ
るが、それにより本発明の範囲を制限するものではない
。

実施例　１： 原料物質は例えばコーンの上澄液Ｉ＋ｎ＋Ｉ［［（コー
ン等、Ｊ、　Ａｍ、　Ｃｈｅｗ、　Ｓｏｃ、　６８．１
９４６．４５９−４７５）又はそれと等価のキストラ−
及びニッチマン（Ｖｏｗ　Ｓａｎｇｕｉｎｉｓ　７．１
９６２．４１４−４２４）の慣用法によるＡ＋１である
。この物質は浸透処理を受けた蒸留水（“注射用製剤″
級品質の）で透析される。

溶液は１５ないし１．８ｇ／２の蛋白質濃度に調節され
る。

ｐＨは酢酸又はソーダを用い、６．０又は原料物質の関
数として５．０ないし８．０の値に１１１ｗＩされる。

溶液の伝導率は酢酸ナトリウムを用い、１゜８　ｍ　Ｓ
又は１．５ないし２．０ｍＳの値に調節される。

ａ−クロマトグラフィー 溶液をＤＥＡＥセファロースＣＬ、６Ｂ−７アースト・
７０−（ファルマシア）のカラム上で最初のクロマトグ
ラフイー工程に処する。クロマトグラフィーカラムはｐ
Ｈ６，０で酢酸ナトリウム緩衝液と平衡させる。カラム
を流出する緩衝液が１．８±０．１ｍＳの伝導率及び６
．０±０．１のｐＨを有する時にゲルは平衡に達してい
る。

試料はゲル２０４当たり蛋白質４６５ｇの比率で注入さ
れる。流速は毎時間約１００１２に調節される。試料が
通過した後、基線への戻りは平衡緩衝液により確認され
る。

次いでｐ）Ｉを５．２５に下げると、トランスフェリン
を脱着し、・溶離することかできる。

アルブミンは次いでｐＨを少なくともそのｐＨ４（４，
７）以下に下げることによりカラムから溶離される；酢
酸塩緩衝液はｐＨ４，５及び伝導率１．８ｍＳに調整さ
れる。

溶離されたアルブミン溶液は約１００ないし１５０ｇ／
（１まで濃縮され、次いで酢酸塩を除去するために水で
透析される。

次いでアルブミン溶液のｐＨを７．０に、モル浸透圧濃
度を２５０ないし３５０ｍｏｓＭに調節する：その濃度
は４ないし５％に又は２０又は２５％に調節される。

ｂ、脱脂質処理 引き続く加熱及びパスツール殺菌のための安定剤として
、蛋白質１ｇ当たりカプリル酸塩０．０１５９の比率で
、カプリル酸ナトリウムをアルブミン溶液に添加する（
これらの処理が行われない時にはカプリル酸塩を添加し
ない）。次いで溶液を滅菌濾過体に通す。

４％アルブミン溶液に対し０．５％（Ｖ／Ｖ）、又は２
０％アルブミン溶液に対し２．５％（Ｖ／■）の比率で
アルブミン溶液中に混和するために、トウィーン８０を
加熱滅菌水中で１０％に希釈する。（ｖ　／　ｖはアル
ブミン溶液ｌ容量当たりの純粋のトウィーンの容量で表
される）。

次いで混合物はニ ー少なくとも１時間６０℃に加熱されるか、−又は緩や
かに撹拌しながら少なくとも５時間、２５ｅＯで接触さ
せたまま放置される。

Ｃ，クロマトグラフィー 最初のクロマトグラフィー工程で使用された条件と同じ
条件下でＤＥＡＥセファロースＣＬ６Ｂのカラムが使用
される。

アルブミンはカラムに吸着され、トウィーン８０はα−
リポ蛋白質のような脂質型の化合物と一緒に濾液中に取
り除かれる。

トウィーン８０を完全に除去するために、カラムはその
緩衝液装入容量の１０倍の緩衝液で洗浄される。

アルブミンは緩衝液のｐＨを４．５に下げることにより
前と同じ条件下で溶離される。

溶離されたアルブミン溶液は生理学的条件、即ち６．５
ないし７．０のｐＨｓ及び８０ないし３５Ｑｍｏ　ｓＭ
のモル浸透圧濃度に調節される。溶液を濾過し、フラス
コ中に入れ、６０℃以上に少なくとも１０時間加熱する
（薬局方により定められた規則に従って）ことによって
滅菌する。

このパスツール穀筒は溶剤−活性剤を用いる通常のウィ
ルス不活性化処理により代用することもできる。

実施例　２　：免疫電気泳動分析による本方法の効果の
提示 最終的なアルブミン溶液の品質を最初のクロマトグラフ
ィーカラムから得られた溶液と比較する。

結果は第１図に示されている。

第１図は対照血漿（下段）と並んで示されたアルブミン
溶液（上段）の三つの電気泳動図を示している： Ｉ　Ａ、：アルブミン溶液をトウィーン８０で処理する
前の、抗ヒト全血漿抗血清の存在における電気泳動図； １Ｂ：抗−アポＡ特異性免疫血清の存在におけるＡと同
じ電気泳動図； ＩＣ：アルブミン溶液をトウィーン８０で処理した後の
、抗ヒト全血漿抗血清の存在における電気泳動図である
。

第１Ｂ図は第１Ａ図と比較すべきであり、ｆｆ−リポ蛋
白質の円弧の特定が可能である。

第ｉｃ図はトウィーン８０での処理後、溶液中のα−リ
ポ蛋白質の円弧の消失を示している。

本発明の主なる特徴及び態様は以下の通りである。

１、脱脂質処理を含むことを特徴とする、アルブミンを
含むヒト又は動物の生理学的溶液から精製されたアルブ
ミンを製造する方法。

２、脱脂質処理が非変性的陰イオン活性剤を用いて行わ
れる、上記ｌに記載の方法。

３、イオン交換樹脂を用いるクロマトグラフィー及び吸
着されたアルブミンの溶離の二工程を含む、上記ｌ又は
２に記載の方法。

４、脱脂質処理が最初のクロマトグラフィー工程から溶
離したアルブミンに適用される、上記２又は３に記載の
方法。

５、脱脂質処理が活性剤と２５℃で５時間以上の間の接
触から成る、上記２ないし４の任意の項に記載の方法。

６、脱脂質処理が安定剤としてカプリル酸ナトリウムの
存在において活性剤と６０℃で約１時間の間の接触から
成る、上記２ないし４の任意の項に記載の方法。

７、活性剤が蛋白質１ｇ当たり０．０５ないし０．２５
９の濃度のトウィーン８０である、上記５又は６に記載
の方法。

８、トウィーン８０の濃度がアルブミン８容量当たりト
ウィーンｌ容量の比率に調節される、上記７に記載の方
法。

９、始めの生理学的溶液が完全な血漿又は血漿画分、低
温沈澱の上澄液又はエタノールで沈澱後の上澄液又はア
ルブミンを含む任意の他の血漿溶液である、上記ｌない
し８の任意の項に記載の方法。

１０、原料溶液が１１５ないしＢｙ　／（ｌの蛋白質濃
度にｍ節される、上記９に記載の方法。

１１、初期溶液が酢酸ナトリウムで１．５ないし２ｍＳ
の伝導率に、及び酢酸で５．０ないし８゜０のｐＨに調
節される、上記９又はＩＯに記載の方法。

１２、初期溶液がアルブミンを吸着するＤＥＡＥセファ
ロース型のイオン交換樹脂を用いる最初のクロマトグラ
フィーカラム上に注入される、上記ｌないし１１の任意
の項に記載の方法。

１３、クロマトグラフィーカラム上に吸着されたアルブ
ミンが緩衝液のｐＨを４ないし４．７の値まで下げるこ
とによって溶離される、上記工ないし１２の任意の項に
記載の方法。

１４、上記４ないし８に記載の脱脂質処理を受けたアル
ブミン溶液が、アルブミンを吸着し、トウィーン及び脱
脂質処理から生じる生成物を排除するＤＥＡＥセファロ
ース型のイオン交換樹脂を用いる第二のクロマトグラフ
ィーカラム上に注入される、上記１ないし１３の任意の
項に記載の方法。

１５、トウィーン及び脱脂質処理から生じる生成物の完
全な排除が緩衝溶液を用いるクロマトグラフィーカラム
の一連の連続的な洗浄により保証される、上記１４ｊこ
記載の方法。

１６、クロマトグラフィーカラム上に吸着されたアルブ
ミンが、緩衝液のｐＨを４ないし４．７の値に下げるこ
とによって溶離される、上記１４又は１５に記載の方法
。

１７、溶離されたアルブミン溶液が治療用に適合する生
理学的条件下で４ないし２５％の最終濃度に調節される
、上記ｌないし１６の任意の項に記載の方法。

１８、アルブミン溶液が６．５ないし’１０のｐＨ１及
び８０ないし３５０ｍｏ　ｓＭのモル浸透圧濃度に調節
される、上記１７に記載の方法。

１９、パスツール殺菌のための安定剤としてカプリル酸
ナトリウムがアルブミン１ｇ当たり０゜０１２ないしＯ
，０１５ｇの濃度で添加される、上記１７又は１８に記
載の方法。

２０、アルブミン溶液が少なくとも１０時間に互って６
０℃以上に加熱されることによりパスツール殺菌に付さ
れる、上記ｌないし１９の任意の項に記載の方法。

２１、アルブミン溶液が溶剤−活性剤を用いるウィルス
不活性化処理に付され、パスツール殺菌を受けない、上
記１ないし１８の任意の項に記載の方法。

２２、上記ｌないし２１に記載の任意の項に記載の方法
を用いて得られる、治療用の精製されたアルブミン溶液
。

２３、上記１ないし１８及び２１に記載の任意の項によ
る方法を用いて得られる、試験管内細胞培養に使用でき
る精製されたアルブミン溶液。

【図面の簡単な説明】

第１図は本発明による脱脂質処理の前と後のアルブミン
溶液−の免疫電気泳動図を示す写真であり、対照血漿（
下段）と並んで示されたアルブミン溶液（上段）の三つ
の電気泳動図を示している。 ＦＩＧＬＪＲＥ　１ ）

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、脱脂質処理を含むことを特徴とする、アルブミンを
   含むヒト又は動物の生理学的溶液から精製されたアルブ
   ミンを製造する方法。 ２、特許請求の範囲１項に記載の方法を用いて得られる
   、治療用の精製されたアルブミン溶液。 ３、特許請求の範囲１項に記載の方法を用いて得られる
   、試験管内細胞培養に使用できる精製されたアルブミン
   溶液。