JP2566919B2 - α−インタ−フエロンの製造方法 - Google Patents
α−インタ−フエロンの製造方法Info
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- C07K14/555—Interferons [IFN]
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Description
【発明の詳細な説明】 本発明は、抗ウイルス活性および免疫調節活性を有す
る、きわめて純粋な、非免疫原性の、均一なα−インタ
ーフエロンの製造方法、その蛋白質自体、ならびにその
使用に関する。
る、きわめて純粋な、非免疫原性の、均一なα−インタ
ーフエロンの製造方法、その蛋白質自体、ならびにその
使用に関する。
インターフエロンは生体内で天然に生じる蛋白質であ
り、きわめて広範囲の動物種に認められる。それらに固
有の抗ウイルス作用および免疫調節作用により、初期に
は、広範囲の応用に適するものと考えられた。試験の結
果、インターフエロンにはいくつかの種類があることが
明らかにされた。α，βおよびγ−インターフエロンに
加えて、最近、ω−インターフエロンが発見され、その
構造も解明されている。
り、きわめて広範囲の動物種に認められる。それらに固
有の抗ウイルス作用および免疫調節作用により、初期に
は、広範囲の応用に適するものと考えられた。試験の結
果、インターフエロンにはいくつかの種類があることが
明らかにされた。α，βおよびγ−インターフエロンに
加えて、最近、ω−インターフエロンが発見され、その
構造も解明されている。
ウイルス疾患や癌に対する有効な薬剤としてインター
フエロンには大きな期待が寄せられ、天然材料から得ら
れたインターフエロンプレパレーシヨンを用いた臨床試
験が早くから行われてきたが、重篤な副作用も生じてい
る。これらの試験に用いられたプレパレーシヨンは、労
の多い精製操作後にも、別種のインターフエロンや多く
の場合他の蛋白質の複合混合物を含有していた。この理
由には一部のインターフエロンが多かれ少なかれ互いに
異なる亜種を有することも関係がある。たとえばα−イ
ンターフエロンには20以上もの種類が知られている。
フエロンには大きな期待が寄せられ、天然材料から得ら
れたインターフエロンプレパレーシヨンを用いた臨床試
験が早くから行われてきたが、重篤な副作用も生じてい
る。これらの試験に用いられたプレパレーシヨンは、労
の多い精製操作後にも、別種のインターフエロンや多く
の場合他の蛋白質の複合混合物を含有していた。この理
由には一部のインターフエロンが多かれ少なかれ互いに
異なる亜種を有することも関係がある。たとえばα−イ
ンターフエロンには20以上もの種類が知られている。
遺伝子工学でインターフエロンを製造することによつ
てのみ、純粋なインターフエロンプレパレーシヨンによ
る試験の実施が可能になつた。
てのみ、純粋なインターフエロンプレパレーシヨンによ
る試験の実施が可能になつた。
これらの臨床試験に用いられたインターフエロンには
組換えα２−インターフエロン（αＡとも呼ばれる）も
包含されている。この蛋白質の精製は、ヒト蛋白質を微
生物によつて産生させた場合とくに重要である。宿主生
物起源の夾雑物は、この生成物をヒトに用いた場合に免
疫防御反応を起こさせる可能性があり、生命の危険さえ
考えられる。しかしながら、現在、この種の夾雑物の除
去についてはほとんど問題が提起されていないし、現在
利用できるきわめて鋭敏な分析方法でも内毒素はきわめ
て微量濃度しか検出されない。インターフエロンの研究
分野でも、事実上内毒素を含まないインターフエロンを
得ることができる精製方法が開発されてきた［たとえば
ステヘリン（Staehelin）ほか：ジヤーナル：オブ・バ
イオロジカル・ケミストリー（J.Biol.Chem.）、256、9
750（1981）］。
組換えα２−インターフエロン（αＡとも呼ばれる）も
包含されている。この蛋白質の精製は、ヒト蛋白質を微
生物によつて産生させた場合とくに重要である。宿主生
物起源の夾雑物は、この生成物をヒトに用いた場合に免
疫防御反応を起こさせる可能性があり、生命の危険さえ
考えられる。しかしながら、現在、この種の夾雑物の除
去についてはほとんど問題が提起されていないし、現在
利用できるきわめて鋭敏な分析方法でも内毒素はきわめ
て微量濃度しか検出されない。インターフエロンの研究
分野でも、事実上内毒素を含まないインターフエロンを
得ることができる精製方法が開発されてきた［たとえば
ステヘリン（Staehelin）ほか：ジヤーナル：オブ・バ
イオロジカル・ケミストリー（J.Biol.Chem.）、256、9
750（1981）］。
臨床試験に用いられるrec.α−インターフエロンはす
べて、事実上内毒素を含んでいない。
べて、事実上内毒素を含んでいない。
したがつて、インターフエロン治療を中断しなければ
ならないほどの重篤な副作用を生じたことはまつたく驚
くべきことであつた。一部のrec.α−インターフエロン
は、驚くべきことに、免疫原性であることが明らかにさ
れた。インターフエロンに対する抗体が刺激されたので
ある［ケサダ（Quesada）ほか：ジヤーナル・オブ・ザ
・ナシヨナル・キヤンサー・インステイチユート（J.Na
tl.Cancer Inst.）、70、No.6、1041〜1046（1983）；
プロツマン（Protzman）ほか；ジヤーナル・オブ・イミ
ユノロジカル・メソツズ（J.Immunol.Methods）、75、3
17〜323（1984）］。
ならないほどの重篤な副作用を生じたことはまつたく驚
くべきことであつた。一部のrec.α−インターフエロン
は、驚くべきことに、免疫原性であることが明らかにさ
れた。インターフエロンに対する抗体が刺激されたので
ある［ケサダ（Quesada）ほか：ジヤーナル・オブ・ザ
・ナシヨナル・キヤンサー・インステイチユート（J.Na
tl.Cancer Inst.）、70、No.6、1041〜1046（1983）；
プロツマン（Protzman）ほか；ジヤーナル・オブ・イミ
ユノロジカル・メソツズ（J.Immunol.Methods）、75、3
17〜323（1984）］。
これらの抗体がインターフエロンの活性に影響する
と、重大な効果を招くことになる可能性がある。なぜな
らば、この場合、それらrec.α−インターフエロンに作
用するばかりでなく、rec.α−インターフエロンは生体
自身のインターフエロンと同一なので、生体自身のイン
ターフエロンにも同様に作用するからである。
と、重大な効果を招くことになる可能性がある。なぜな
らば、この場合、それらrec.α−インターフエロンに作
用するばかりでなく、rec.α−インターフエロンは生体
自身のインターフエロンと同一なので、生体自身のイン
ターフエロンにも同様に作用するからである。
この問題点は、これらの抗体が、インターフエロン治
療を中止したのちも作用を続けることであり、そのため
疾患の経過に悪化を招いたり、ウイルス感染に対する生
体自身の制御機構を弱めたり、生体が他の感染症に罹患
しやすくする等の可能性がある。
療を中止したのちも作用を続けることであり、そのため
疾患の経過に悪化を招いたり、ウイルス感染に対する生
体自身の制御機構を弱めたり、生体が他の感染症に罹患
しやすくする等の可能性がある。
これらの効果はすでに動物に対する試験で確認されて
いる。したがつて、薬剤治療の安定性を最大にするとの
観点から、rec.α２インターフエロンは純粋で、エンド
トキシンを含まず、完全に非免疫原性でなければならな
い。
いる。したがつて、薬剤治療の安定性を最大にするとの
観点から、rec.α２インターフエロンは純粋で、エンド
トキシンを含まず、完全に非免疫原性でなければならな
い。
本発明の目的は、したがつて、抗ウイルス活性および
免疫調節活性を有する非免疫原性インターフエロンの製
造方法を開発することにある。
免疫調節活性を有する非免疫原性インターフエロンの製
造方法を開発することにある。
試験に用いられたプレパレーシヨンは第一にそのアミ
ノ酸配列に、わずかな変動による差がある。
ノ酸配列に、わずかな変動による差がある。
臨床試験に用いられた蛋白質の一次構造における構造
的な差異のほかに、遺伝子工学によつて製造されたα−
インターフエロンは常に、インターフエロンのモノマ
ー、短縮された分子、還元されたインターフエロン、オ
リゴマー型等の混合物である（たとえばEPA108,585、11
0,302および118,808参照）。これらの型の中にはin vit
roで同じ活性を示すものもあるが、活性が低下する場合
があり、また免疫原性をもつ可能性も考えられる（EPA1
08,585および110,302参照）。
的な差異のほかに、遺伝子工学によつて製造されたα−
インターフエロンは常に、インターフエロンのモノマ
ー、短縮された分子、還元されたインターフエロン、オ
リゴマー型等の混合物である（たとえばEPA108,585、11
0,302および118,808参照）。これらの型の中にはin vit
roで同じ活性を示すものもあるが、活性が低下する場合
があり、また免疫原性をもつ可能性も考えられる（EPA1
08,585および110,302参照）。
これらの特許出願には、これらの型のインターフエロ
ンを分離する方法が記載されている。
ンを分離する方法が記載されている。
EPA108,585には、インターフエロンプローブを28〜40
℃、pH3〜５においてある時間インキユベートして“移
動の遅いモノマー”とオリゴマーを分離する方法が述べ
られている。
℃、pH3〜５においてある時間インキユベートして“移
動の遅いモノマー”とオリゴマーを分離する方法が述べ
られている。
EPA110,302には、レドツクス系での還元によつてオリ
ゴマーからモノマーを生成させる方法が述べられてい
る。
ゴマーからモノマーを生成させる方法が述べられてい
る。
最後に、EPA118,808には、組換えα−インターフエロ
ンを、金属キレート樹脂を用いてオリゴマー型から精製
する方法が記載されている。
ンを、金属キレート樹脂を用いてオリゴマー型から精製
する方法が記載されている。
これらの方法で得られたインターフエロンは、モノマ
ーインターフエロンをほとんど定量的に含有するものと
思われるが、免疫原性の試験は行なわれていない。
ーインターフエロンをほとんど定量的に含有するものと
思われるが、免疫原性の試験は行なわれていない。
発明者らの詳細な分析的検討によれば、組換え法で製
造されたα−インターフエロンは異なる型のインターフ
エロンの混合物であり、各型の濃度は様々に変動するこ
とが明らかにされている。
造されたα−インターフエロンは異なる型のインターフ
エロンの混合物であり、各型の濃度は様々に変動するこ
とが明らかにされている。
これらは、インターフエロンのオリゴマー、テトラマ
ー、トリマーおよびダイマー、メチオニンインターフエ
ロン、インターフエロンの還元型およびフラグメント
と、驚くべきことにインターフエロンの様々なモノマー
型を包含している。
ー、トリマーおよびダイマー、メチオニンインターフエ
ロン、インターフエロンの還元型およびフラグメント
と、驚くべきことにインターフエロンの様々なモノマー
型を包含している。
オリゴマーは分子量70,000以上のα−インターフエロ
ンであり、還元型α−インターフエロンは遊離のSH基を
もつ蛋白質であり、メチオニンインターフエロンはＮ末
端にメチオニンが付加されているα−インターフエロン
（α−インターフエロンの微生物学的製造方法によつて
生じる）である。
ンであり、還元型α−インターフエロンは遊離のSH基を
もつ蛋白質であり、メチオニンインターフエロンはＮ末
端にメチオニンが付加されているα−インターフエロン
（α−インターフエロンの微生物学的製造方法によつて
生じる）である。
分析の結果、様々なモノマー型は、α−インターフエ
ロンの別個のＳ−Ｓ異性体であることが明らかにされて
いる。
ロンの別個のＳ−Ｓ異性体であることが明らかにされて
いる。
これらの異性体を言葉の上で区別するために、もつと
も多く存在するα−インターフエロンモノマーの異性体
を以下、非天然モノマーと呼ぶことにする。もつとも多
く存在するα−インターフエロンは天然モノマーインタ
ーフエロンと呼ぶ。しかしながら、非天然モノマーの語
はそれが天然材料に存在する可能性を否定するものでは
ない。
も多く存在するα−インターフエロンモノマーの異性体
を以下、非天然モノマーと呼ぶことにする。もつとも多
く存在するα−インターフエロンは天然モノマーインタ
ーフエロンと呼ぶ。しかしながら、非天然モノマーの語
はそれが天然材料に存在する可能性を否定するものでは
ない。
たとえば、α２インターフエロンを製造するための大
腸菌発酵混合物中には、７種の異なるインターフエロン
成分が検出できた（K1〜K7）。
腸菌発酵混合物中には、７種の異なるインターフエロン
成分が検出できた（K1〜K7）。
分析の結果、これらはオリゴマー、ダイマーおよびト
リマー、メチオニンインターフエロン、還元型インター
フエロン、ならびに位置１と98および29と138のアミノ
酸の間にジスルフイド橋を有する天然モノマーインター
フエロンのＳ−Ｓ異性体であることが明らかにされた
［ウエツツエル（Wetzel）ほか：ジヤーナル・オブ・イ
ンターフエロン・リサーチ（J.Interferon Res.）、第
１巻、第３号、381〜391（1981）参照］。
リマー、メチオニンインターフエロン、還元型インター
フエロン、ならびに位置１と98および29と138のアミノ
酸の間にジスルフイド橋を有する天然モノマーインター
フエロンのＳ−Ｓ異性体であることが明らかにされた
［ウエツツエル（Wetzel）ほか：ジヤーナル・オブ・イ
ンターフエロン・リサーチ（J.Interferon Res.）、第
１巻、第３号、381〜391（1981）参照］。
前述のように、rec.α−インターフエロンの免疫原性
の理由については不明である。しかしならが、生体自身
のインターフエロンと異なるすべての型のα−インター
フエロンが免疫原性活性を有することも自明である。こ
れらの型には短縮インターフエロン、ダイマーおよびオ
リゴマー、ならびにジスルフイド橋結合が異なる非天然
モノマーも包含させる。
の理由については不明である。しかしならが、生体自身
のインターフエロンと異なるすべての型のα−インター
フエロンが免疫原性活性を有することも自明である。こ
れらの型には短縮インターフエロン、ダイマーおよびオ
リゴマー、ならびにジスルフイド橋結合が異なる非天然
モノマーも包含させる。
免疫原性の原因がまだ明らかでない限り、これらの型
の生成を何らかの作用で促進する可能性が考えられる条
件をrec.α−インターフエロンの製造過程に用いるべき
ではない。これはインターフエロンの精製さえも、本来
の性質を危険にさらすことのない可能な限り緩和な条件
で実施すべきことを意味する。高温や還元剤等もこれら
の条件の中に包含される。
の生成を何らかの作用で促進する可能性が考えられる条
件をrec.α−インターフエロンの製造過程に用いるべき
ではない。これはインターフエロンの精製さえも、本来
の性質を危険にさらすことのない可能な限り緩和な条件
で実施すべきことを意味する。高温や還元剤等もこれら
の条件の中に包含される。
精製の全工程で、たとえば金属キレート樹脂や類似の
問題をもつ試薬の使用の結果生じるような、外因性物質
の導入が起こらないことを確実にする努力が必要であ
る。
問題をもつ試薬の使用の結果生じるような、外因性物質
の導入が起こらないことを確実にする努力が必要であ
る。
本発明は主たる特許請求の範囲に示したような特徴を
有する組換えα−インターフエロンの製造方法に関す
る。この方法は、別の種からのインターフエロンたとえ
ばヒトまたは動物α−インターフエロンの製造および精
製に適している。製造に用いる宿主生物は原核生物また
は真核生物、たとえば大腸菌またはビール酵母菌、好ま
しくは大腸菌である。各種宿主生物の培養条件について
は、本技術分野の熟練者にはよく知られているとおりで
ある。
有する組換えα−インターフエロンの製造方法に関す
る。この方法は、別の種からのインターフエロンたとえ
ばヒトまたは動物α−インターフエロンの製造および精
製に適している。製造に用いる宿主生物は原核生物また
は真核生物、たとえば大腸菌またはビール酵母菌、好ま
しくは大腸菌である。各種宿主生物の培養条件について
は、本技術分野の熟練者にはよく知られているとおりで
ある。
驚くべきことに、生育時間はα−インターフエロンの
収率に影響するのみでなく、インターフエロン混合物の
組成をきめる決定的な因子であることが発見された。す
なわち、大腸菌を用いた場合、インターフエロン混合物
の組成は、生育時間に応じてメチオニンインターフエロ
ン量が変化する。
収率に影響するのみでなく、インターフエロン混合物の
組成をきめる決定的な因子であることが発見された。す
なわち、大腸菌を用いた場合、インターフエロン混合物
の組成は、生育時間に応じてメチオニンインターフエロ
ン量が変化する。
したがって、宿主生物によつて産生されるα−インタ
ーフエロン誘導体の生成を、最善の生育時間の指標とし
て短時間間隔でチエツクすることは有利である。すなわ
ち、適当な時点で、たとえばメチオニンインターフエロ
ンの生成が20％以下、好ましくは５％以下、さらに好ま
しくは１％以下の時点で産生を中断することによつて、
本発明の以後の精製工程に理想的な前提条件をもつ純粋
なインターフエロンが得られる。
ーフエロン誘導体の生成を、最善の生育時間の指標とし
て短時間間隔でチエツクすることは有利である。すなわ
ち、適当な時点で、たとえばメチオニンインターフエロ
ンの生成が20％以下、好ましくは５％以下、さらに好ま
しくは１％以下の時点で産生を中断することによつて、
本発明の以後の精製工程に理想的な前提条件をもつ純粋
なインターフエロンが得られる。
この方法は酸安定性のα−インターフエロンの製造に
とくに適している。たとえば細胞をホモゲナイザーによ
りpH2で破壊するDE34 32 196.9の方法が使用できる。
とくに適している。たとえば細胞をホモゲナイザーによ
りpH2で破壊するDE34 32 196.9の方法が使用できる。
双頭クロマトグラフィーを用いることにより、すなわ
ち、異なる吸着剤と適当な洗浄および溶出溶液を用いた
継続的クロマトグラフイー段階によつて、驚くべきこと
に、大部分の不純物は除去できることも明らかにされ
た。セルロース予備カラムに直接アフイニテイーカラム
を結合させた組合せを用いるのが好ましい。DE−52セル
ロースと、モノクロナール抗インターフエロンIgG−抗
体を、たとえばDE−OS 33 06 060に記載されているE
B1拮体をセフエロースのような担体に結合させて用いる
のが好ましい。
ち、異なる吸着剤と適当な洗浄および溶出溶液を用いた
継続的クロマトグラフイー段階によつて、驚くべきこと
に、大部分の不純物は除去できることも明らかにされ
た。セルロース予備カラムに直接アフイニテイーカラム
を結合させた組合せを用いるのが好ましい。DE−52セル
ロースと、モノクロナール抗インターフエロンIgG−抗
体を、たとえばDE−OS 33 06 060に記載されているE
B1拮体をセフエロースのような担体に結合させて用いる
のが好ましい。
トリス／食塩緩衝液pH5が洗浄液として適しているこ
とが明らかにされているが、インターフエロンと抗体の
結合に影響を与えないが夾雑物は洗い流し、また抗体カ
ラムの性質に悪影響を与える成分は予備カラムに残すよ
うな任意の洗浄液が使用できる。
とが明らかにされているが、インターフエロンと抗体の
結合に影響を与えないが夾雑物は洗い流し、また抗体カ
ラムの性質に悪影響を与える成分は予備カラムに残すよ
うな任意の洗浄液が使用できる。
インターフエロンに適当な溶出液は、たとえば、25％
エチレングリコール中0.1Mクエン酸であるが、類似の性
質をもつ他の溶出液もまた適当である。一般的には、溶
出液は精製すべき特定のα−インターフエロンに応じて
それに適合するように選択する必要がある。
エチレングリコール中0.1Mクエン酸であるが、類似の性
質をもつ他の溶出液もまた適当である。一般的には、溶
出液は精製すべき特定のα−インターフエロンに応じて
それに適合するように選択する必要がある。
“双頭溶出液”中の不純物の一部は、驚くべきこと
に、pH値を好ましくは4.0〜4.8、さらに好ましくは4.5
に緩衝することによつて除去し得た。pH値は、沈殿中の
モノマーα−インターフエロンが可能な限り少なくなる
ように選択されねばならない。
に、pH値を好ましくは4.0〜4.8、さらに好ましくは4.5
に緩衝することによつて除去し得た。pH値は、沈殿中の
モノマーα−インターフエロンが可能な限り少なくなる
ように選択されねばならない。
インターフエロンの最終的な精製は、陽イオン交換樹
脂、好ましくはMONO−Ｓ、HR10/10型陽イオン交換樹脂
を用いたクロマトグラフイーによつて行われた。高度に
精製されたα−インターフエロンの溶出には、pHを一定
にして濃度を変動させる（濃度勾配）たとえば酢酸アン
モニウム緩衝液のような揮発性緩衝液の平坦段階勾配が
使用された。濃度を一定にしてpHを変動させる（pH勾
配）も同様に使用可能である。重要な点は、溶出液によ
つて、インターフエロン夾雑物、産生される主たるモノ
マーのとくにＳ−Ｓ異性体が除去可能なことである。pH
範囲4.0〜5.0、好ましくはpH4.5で、酢酸アンモニウム
の直線濃度勾配が0.1〜1.0M、好ましくは0.1〜0.5Mにな
るように調製した緩衝液がとくにこの目的に適してい
る。しかもこの緩衝液は凍結乾燥によつて除去できるの
で、高純度に精製されたα−インターフエロンをはじめ
て、緩衝塩や沈殿剤を含まない固体として得ることがで
きる。
脂、好ましくはMONO−Ｓ、HR10/10型陽イオン交換樹脂
を用いたクロマトグラフイーによつて行われた。高度に
精製されたα−インターフエロンの溶出には、pHを一定
にして濃度を変動させる（濃度勾配）たとえば酢酸アン
モニウム緩衝液のような揮発性緩衝液の平坦段階勾配が
使用された。濃度を一定にしてpHを変動させる（pH勾
配）も同様に使用可能である。重要な点は、溶出液によ
つて、インターフエロン夾雑物、産生される主たるモノ
マーのとくにＳ−Ｓ異性体が除去可能なことである。pH
範囲4.0〜5.0、好ましくはpH4.5で、酢酸アンモニウム
の直線濃度勾配が0.1〜1.0M、好ましくは0.1〜0.5Mにな
るように調製した緩衝液がとくにこの目的に適してい
る。しかもこの緩衝液は凍結乾燥によつて除去できるの
で、高純度に精製されたα−インターフエロンをはじめ
て、緩衝塩や沈殿剤を含まない固体として得ることがで
きる。
本発明の方法は、異なる種のα−インターフエロン
で、相当する種に投与した場合に抗体の産生を刺激しな
いα−インターフエロンを製造する場合にとくに適して
いる。
で、相当する種に投与した場合に抗体の産生を刺激しな
いα−インターフエロンを製造する場合にとくに適して
いる。
本発明の方法は、インターフエロンの還元型やフラグ
メントを含まず、オリゴマー含量0.2％未満、ダイマー
／トリマー／テトラマー含量２％未満、メチオニンイン
ターフエロン含量５％未満、天然モノマーα−インター
フエロンからなるモノマー含量90％以上の均一、高純度
で、固体の、免疫原性のない、組換えα−インターフエ
ロンの製造にとくに有利であることが明らかにされてい
る。
メントを含まず、オリゴマー含量0.2％未満、ダイマー
／トリマー／テトラマー含量２％未満、メチオニンイン
ターフエロン含量５％未満、天然モノマーα−インター
フエロンからなるモノマー含量90％以上の均一、高純度
で、固体の、免疫原性のない、組換えα−インターフエ
ロンの製造にとくに有利であることが明らかにされてい
る。
本発明の方法は、アミノ酸配列： を有し、天然モノマーα−インターフエロンの場合は位
置１と98および29と138のシステイン間にジスルフイド
結合を含むヒトα−インターフエロンをコードする遺伝
子を含有する宿主生物で上記α−インターフエロンを製
造する場合に、とくに有利に使用できる。
置１と98および29と138のシステイン間にジスルフイド
結合を含むヒトα−インターフエロンをコードする遺伝
子を含有する宿主生物で上記α−インターフエロンを製
造する場合に、とくに有利に使用できる。
本発明はまた、本発明の方法によつて製造できる、組
換えα−インターフエロン、好ましくはメチオニンイン
ターフエロン含量20％未満、好ましくは５％未満、とく
に好ましくは１％未満の組換えα−インターフエロンも
包含する。
換えα−インターフエロン、好ましくはメチオニンイン
ターフエロン含量20％未満、好ましくは５％未満、とく
に好ましくは１％未満の組換えα−インターフエロンも
包含する。
宿主生物および発酵条件の選択により、組換え法によ
つて製造されるα−インターフエロンは、メチオニンイ
ンターフエロンのほかに、ダイマー、トリマー、テトラ
マーおよびオリゴマー、還元型およびフラグメント、な
らびに最も多く存在するモノマーα−インターフエロン
のＳ−Ｓ異性体を含有し、その含量は様々に変動する。
これらの夾雑物は、本発明の方法を用いることによつ
て、はじめて含量が抑えられまた排除することが可能に
なつた。
つて製造されるα−インターフエロンは、メチオニンイ
ンターフエロンのほかに、ダイマー、トリマー、テトラ
マーおよびオリゴマー、還元型およびフラグメント、な
らびに最も多く存在するモノマーα−インターフエロン
のＳ−Ｓ異性体を含有し、その含量は様々に変動する。
これらの夾雑物は、本発明の方法を用いることによつ
て、はじめて含量が抑えられまた排除することが可能に
なつた。
したがつて、本発明は、メチオニンインターフエロン
含量20％未満、好ましくは５％未満、さらに好ましくは
１％未満で、α−インターフエロンの還元型やフラグメ
ントを含まず、オリゴマー含量0.2％未満でダイマー／
トリマー／テトラマー含量２％未満、好ましくはオリゴ
マー、テトラマー、トリマーもしくはダイマーを含ま
ず、天然モノマー含量90％以上で好ましくは天然モノマ
ーα−インターフエロンのＳ−Ｓ異性体を含まない、均
一、純粋な組換えα−インターフエロンを提供する。
含量20％未満、好ましくは５％未満、さらに好ましくは
１％未満で、α−インターフエロンの還元型やフラグメ
ントを含まず、オリゴマー含量0.2％未満でダイマー／
トリマー／テトラマー含量２％未満、好ましくはオリゴ
マー、テトラマー、トリマーもしくはダイマーを含ま
ず、天然モノマー含量90％以上で好ましくは天然モノマ
ーα−インターフエロンのＳ−Ｓ異性体を含まない、均
一、純粋な組換えα−インターフエロンを提供する。
本発明はまた、特定の種に投与したときに抗体産生を
刺激しない様々な種のα−インターフエロン、また固体
インターフエロンを提供するものである。
刺激しない様々な種のα−インターフエロン、また固体
インターフエロンを提供するものである。
上述の性質を有する組換えヒトα−インターフエロ
ン、とくに次のアミノ酸配列： を有する組換えヒトα−インターフエロンが好ましい。
ン、とくに次のアミノ酸配列： を有する組換えヒトα−インターフエロンが好ましい。
アミノ酸配列： に相当し、メチオニンインターフエロン含量５％未満の
純粋な均一型で存在し、インターフエロンの還元型及び
フラグメントを含まず、オリゴマー含量0.2％未満、ダ
イマー／トリマー／テトラマー含量２％未満、モノマー
含量の95％以上がジスルフイド橋を位置１と98および29
と138に有する天然モノマーα−インターフエロンであ
る、組換え、非免疫原性、固体、ヒトα−インターフエ
ロンがとくに好ましい。
純粋な均一型で存在し、インターフエロンの還元型及び
フラグメントを含まず、オリゴマー含量0.2％未満、ダ
イマー／トリマー／テトラマー含量２％未満、モノマー
含量の95％以上がジスルフイド橋を位置１と98および29
と138に有する天然モノマーα−インターフエロンであ
る、組換え、非免疫原性、固体、ヒトα−インターフエ
ロンがとくに好ましい。
本発明の方法は、きわめて緩和な条件下に、不純物お
よびインターフエロン夾雑物を除去することを可能にし
た。本発明について、以下に、アミノ酸配列 を有するα2Argインターフエロンを例に用いてさらに詳
細に説明するが、他のα−インターフエロンも、本発明
の方法を用い、必要に応じて自明なわずかな改変を加え
て製造、精製できることは当然である。
よびインターフエロン夾雑物を除去することを可能にし
た。本発明について、以下に、アミノ酸配列 を有するα2Argインターフエロンを例に用いてさらに詳
細に説明するが、他のα−インターフエロンも、本発明
の方法を用い、必要に応じて自明なわずかな改変を加え
て製造、精製できることは当然である。
酸で沈殿させ、強冷凍結した生物体を１％酢酸中で撹
拌して解凍した。この操作および以後のすべての操作は
約５℃で実施した。
拌して解凍した。この操作および以後のすべての操作は
約５℃で実施した。
詳細は特許出願DE 34 32 196.9に記載されている
ように、細菌の細胞をホモゲナイザーにより破壊し、沈
殿補剤たとえばポリエチレンアミンPEI−600を0.1〜0.2
5％の濃度範囲で添加し、pHをNaOHを用いて7.5〜10.0に
調整し、懸濁液を数時間撹拌することにより、細胞から
蛋白質を抽出した。ついでpHを7.5に調整し、粗抽出液
を緩和な条件下に澄明化し、サンプルを採取して蛋白質
の定量およびインターフエロン試験を実施した。
ように、細菌の細胞をホモゲナイザーにより破壊し、沈
殿補剤たとえばポリエチレンアミンPEI−600を0.1〜0.2
5％の濃度範囲で添加し、pHをNaOHを用いて7.5〜10.0に
調整し、懸濁液を数時間撹拌することにより、細胞から
蛋白質を抽出した。ついでpHを7.5に調整し、粗抽出液
を緩和な条件下に澄明化し、サンプルを採取して蛋白質
の定量およびインターフエロン試験を実施した。
インターフエロンのようなポリペプチドは機械的剪断
力によつて損傷を受けやすいことが知られている［プロ
シーデイング・オブ・ソサイアテイ・オブ・エクスペリ
メンタル・バイオロジー・アンド・メデイシン（Proc.S
oc.Exp.Biol.Med.）、146、249〜253（1974）］にもか
かわらず、驚くべきことに、これらのpH条件下のこの方
法を用いることにより、粗インターフエロンを高収率で
得ることができた。
力によつて損傷を受けやすいことが知られている［プロ
シーデイング・オブ・ソサイアテイ・オブ・エクスペリ
メンタル・バイオロジー・アンド・メデイシン（Proc.S
oc.Exp.Biol.Med.）、146、249〜253（1974）］にもか
かわらず、驚くべきことに、これらのpH条件下のこの方
法を用いることにより、粗インターフエロンを高収率で
得ることができた。
別の発酵バツチについて調べた結果、混合物の組成は
発酵条件の函数として変動することが明らかにされた。
発酵条件の函数として変動することが明らかにされた。
とくに、成分１、すなわち除去がきわめて難しい成分
であるメチオニンα−インターフエロンの割合は発酵時
間によつて変動し、メチオニンα−インターフエロンは
発酵８〜９時間後にはわずかしか生成しなかつた。
であるメチオニンα−インターフエロンの割合は発酵時
間によつて変動し、メチオニンα−インターフエロンは
発酵８〜９時間後にはわずかしか生成しなかつた。
したがつて、発酵を適当な時点で中止することによ
り、メチオニンインターフエロンを含まないインターフ
エロンプレパレーシヨンを得ることが可能であつた。
り、メチオニンインターフエロンを含まないインターフ
エロンプレパレーシヨンを得ることが可能であつた。
澄明化した粗溶液に固体硫酸アンモニウムを65％飽和
まで加えた。硫酸アンモニウムが完全に溶解したのち、
混合物を一定保冷し、生成した沈殿を分離し、使用時ま
で−20℃に保存した。
まで加えた。硫酸アンモニウムが完全に溶解したのち、
混合物を一定保冷し、生成した沈殿を分離し、使用時ま
で−20℃に保存した。
インターフエロン試験のためのサンプルを澄明な上清
から再び採取し、インターフエロンの沈殿をモニタリン
グした。上清に５％以上のインターフエロンが残つてい
てはいけない。
から再び採取し、インターフエロンの沈殿をモニタリン
グした。上清に５％以上のインターフエロンが残つてい
てはいけない。
硫酸アンモニウムペレツトを0.01M NaClに溶解し、N
aOHでpH7.5に調整し、この溶液を２時間撹拌した。不溶
の分画を除去し、場合によつては0.01M NaClでもう１
回抽出した。
aOHでpH7.5に調整し、この溶液を２時間撹拌した。不溶
の分画を除去し、場合によつては0.01M NaClでもう１
回抽出した。
澄明な溶液を合し、滅菌、ハイロジエンフリーの透析
カートリツジを用いて0.01M NaClで透析した。インタ
ーフエロン溶液の浸透圧は２〜３回実行後に約390〜430
mOsmol/になる。澄明な溶液からインターフエロン試
験用のサンプルを採取した。
カートリツジを用いて0.01M NaClで透析した。インタ
ーフエロン溶液の浸透圧は２〜３回実行後に約390〜430
mOsmol/になる。澄明な溶液からインターフエロン試
験用のサンプルを採取した。
以後の精製には、双頭クロマトグラフイー、すなわち
セルロース予備カラムと次の高度に特異的なモノクロナ
ール抗体を用いたアフイニテイークロマトグラフイーと
の組合せを用いた。予備カラム、イオン交換樹脂カラム
は難溶性サンプル成分を抗体カラムに入れないように用
いられた。予備カラムは、DE−52セルロース［ウオツト
マン（Whatman）社］をトリス／食塩緩衝液pH7.5と完全
に撹拌し、クロマトグラフイーカラムに充填して調製す
る。吸着剤はその緩衝液で、溶出液のpHおよび浸透圧が
変動しなくなるまで洗浄した。予備カラムの場合、生物
体1gに対して0.025Mトリス／塩酸＋0.2M NaCl中DE−52
セルロース0.5〜1.0g用い、各精製ごとに新たに調製し
た。
セルロース予備カラムと次の高度に特異的なモノクロナ
ール抗体を用いたアフイニテイークロマトグラフイーと
の組合せを用いた。予備カラム、イオン交換樹脂カラム
は難溶性サンプル成分を抗体カラムに入れないように用
いられた。予備カラムは、DE−52セルロース［ウオツト
マン（Whatman）社］をトリス／食塩緩衝液pH7.5と完全
に撹拌し、クロマトグラフイーカラムに充填して調製す
る。吸着剤はその緩衝液で、溶出液のpHおよび浸透圧が
変動しなくなるまで洗浄した。予備カラムの場合、生物
体1gに対して0.025Mトリス／塩酸＋0.2M NaCl中DE−52
セルロース0.5〜1.0g用い、各精製ごとに新たに調製し
た。
抗体カラムには、マウス腹水から得られた精製モノク
ロナール抗インターフエロン−IgGを担体としてのBrCN
活性化セフアロース4B［フアルマシア（Pharmacia）
社］に結合させて用いた。完成したカラム材料は、ナト
リウムアジドを加えたリン酸緩衝食塩溶液（PBS）中に
とり、冷蔵庫に保存した。最初の使用時または長期間保
存したのちには、使用前に抗体を25％エチレングリコー
ル中0.1Mクエン酸で洗浄して、可溶性成分を除去し、つ
いで中性になるまでPBSで洗浄した。抗体カラムでは生
物体1gに対してカラム容量0.2〜1.0mlを要し、このカラ
ムは数回使用できた。透析インターフエロン溶液をまず
ポンプで両カラム（予備カラムおよび抗体カラム）に通
し、溶出液の280nmにおける吸収を測定してモニタリン
グを行つた。インターフエロン溶液の適用後、トリス／
食塩緩衝液pH7.5で、溶出液中の蛋白含量が1/20のプラ
トーな値に低下するまで洗浄した。インターフエロンが
抗体カラムに結合したことを調べるため、溶出液のイン
ターフエロン含量を試験した。抗体カラムを予備カラム
から分離し、溶出液中に蛋白質が検出できなくなるま
で、トリス／食塩緩衝液pH7.5で抗体カラムを洗浄し
た。
ロナール抗インターフエロン−IgGを担体としてのBrCN
活性化セフアロース4B［フアルマシア（Pharmacia）
社］に結合させて用いた。完成したカラム材料は、ナト
リウムアジドを加えたリン酸緩衝食塩溶液（PBS）中に
とり、冷蔵庫に保存した。最初の使用時または長期間保
存したのちには、使用前に抗体を25％エチレングリコー
ル中0.1Mクエン酸で洗浄して、可溶性成分を除去し、つ
いで中性になるまでPBSで洗浄した。抗体カラムでは生
物体1gに対してカラム容量0.2〜1.0mlを要し、このカラ
ムは数回使用できた。透析インターフエロン溶液をまず
ポンプで両カラム（予備カラムおよび抗体カラム）に通
し、溶出液の280nmにおける吸収を測定してモニタリン
グを行つた。インターフエロン溶液の適用後、トリス／
食塩緩衝液pH7.5で、溶出液中の蛋白含量が1/20のプラ
トーな値に低下するまで洗浄した。インターフエロンが
抗体カラムに結合したことを調べるため、溶出液のイン
ターフエロン含量を試験した。抗体カラムを予備カラム
から分離し、溶出液中に蛋白質が検出できなくなるま
で、トリス／食塩緩衝液pH7.5で抗体カラムを洗浄し
た。
抗体に結合したインターフエロンの溶出は25％エチレ
ングリコール中0.1Mクエン酸を用いて行い、溶出液の28
0nmにおける吸収をモニタリングした。インターフエロ
ンを含む蛋白質ピークを集めた。インターフエロンのプ
ールは最終的な精製まで−20℃に保存した。インターフ
エロン試験、蛋白質の定量および逆相HPLC分析により、
この精製後に60〜90％の純度のIFN−αが得られている
ことがわかつた。このインターフエロンのプールは、オ
リゴマー型のほかに、SH基が遊離の還元型、ダイマー、
トリマー、テトラマーおよび非天然モノマーを含有し
た。これらの成分はすべて生物学的にまた免疫学的にIF
Nとしての特徴を有する。これらの成分の一部は、驚く
べきことに、pH4.5（アンモニア）で沈殿させて除去す
ることができた。硫黄橋が還元されている成分、すなわ
ち遊離SH基をもつ成分の分画（成分５および６）が、こ
の方法でとくに低下した。沈殿の分析によると、モノマ
ーインターフエロンの沈殿はごくわずかである。
ングリコール中0.1Mクエン酸を用いて行い、溶出液の28
0nmにおける吸収をモニタリングした。インターフエロ
ンを含む蛋白質ピークを集めた。インターフエロンのプ
ールは最終的な精製まで−20℃に保存した。インターフ
エロン試験、蛋白質の定量および逆相HPLC分析により、
この精製後に60〜90％の純度のIFN−αが得られている
ことがわかつた。このインターフエロンのプールは、オ
リゴマー型のほかに、SH基が遊離の還元型、ダイマー、
トリマー、テトラマーおよび非天然モノマーを含有し
た。これらの成分はすべて生物学的にまた免疫学的にIF
Nとしての特徴を有する。これらの成分の一部は、驚く
べきことに、pH4.5（アンモニア）で沈殿させて除去す
ることができた。硫黄橋が還元されている成分、すなわ
ち遊離SH基をもつ成分の分画（成分５および６）が、こ
の方法でとくに低下した。沈殿の分析によると、モノマ
ーインターフエロンの沈殿はごくわずかである。
最終的精製はフアマシア社製FPLC装置を用いMONO−Ｓ
カラム、HR10/10型（陽イオン交換樹脂で実施した。こ
の装置には60mgまでの蛋白質を負荷できた。このカラム
材料は、例外的な分離活性をもつ高速イオン交換樹脂か
ら構成されていて、比較的大量の蛋白質を精製するにも
かかわらず、最終的精製には数時間を要するにすぎずな
い。緩衝液は滅菌ろ過したのちに使用し、この操作は室
温で実施できた。
カラム、HR10/10型（陽イオン交換樹脂で実施した。こ
の装置には60mgまでの蛋白質を負荷できた。このカラム
材料は、例外的な分離活性をもつ高速イオン交換樹脂か
ら構成されていて、比較的大量の蛋白質を精製するにも
かかわらず、最終的精製には数時間を要するにすぎずな
い。緩衝液は滅菌ろ過したのちに使用し、この操作は室
温で実施できた。
沈殿後に得られた澄明な上清をカラムに適用した。FP
LC分離に使用する緩衝液はとくに重要であつた。それは
インターフエロン成分が明瞭に識別できるようにインタ
ーフエロンを溶出可能であると同時に、完全に除去でき
るものでなければならない。酢酸アンモニウムは一連の
勾配で用いるとインターフエロンを溶出し、上記の性質
を備えている。インターフエロンは小さな肩をもつ鋭い
ピークとして溶出した。型の分画（K3）および続いて溶
出する分画（K5〜K7）は純粋なインターフエロンの主ピ
ークから分離した。純粋なインターフエロンのピークを
集め、その一部をとり、HPLC分析、SDSゲル電気泳動、
蛋白質の定量、インターフエロン試験およびエンドトキ
シンの定量に付した。
LC分離に使用する緩衝液はとくに重要であつた。それは
インターフエロン成分が明瞭に識別できるようにインタ
ーフエロンを溶出可能であると同時に、完全に除去でき
るものでなければならない。酢酸アンモニウムは一連の
勾配で用いるとインターフエロンを溶出し、上記の性質
を備えている。インターフエロンは小さな肩をもつ鋭い
ピークとして溶出した。型の分画（K3）および続いて溶
出する分画（K5〜K7）は純粋なインターフエロンの主ピ
ークから分離した。純粋なインターフエロンのピークを
集め、その一部をとり、HPLC分析、SDSゲル電気泳動、
蛋白質の定量、インターフエロン試験およびエンドトキ
シンの定量に付した。
このクロマトグラフイーにより、事実上すべての成分
が主ピークから分離されて均一なインターフエロンが得
られ、ゲル浸透HPLCでのモノマー含量は99％以上の値を
示した。逆相HPLCでも約１％の非天然モノが認められた
にすぎず、クロマト泳動での非天然モノマーの割合は2.
5％であつた。
が主ピークから分離されて均一なインターフエロンが得
られ、ゲル浸透HPLCでのモノマー含量は99％以上の値を
示した。逆相HPLCでも約１％の非天然モノが認められた
にすぎず、クロマト泳動での非天然モノマーの割合は2.
5％であつた。
MONO−Ｓカラムは再使用前に0.5M NaCl＋0.1Mリン酸
Na、pH8.0で洗浄して不純物を除去した。保存は25％エ
タノール中で行つた。
Na、pH8.0で洗浄して不純物を除去した。保存は25％エ
タノール中で行つた。
揮発性緩衝液は凍結乾燥で完全で除去された。このた
めには、IFNプールをオートクレーブ滅菌凍結アンプル
（容量8ml）に2mlを越えないように移した。この量は１
アンプル中純粋なインターフエロン１〜約mgに相当す
る。次に、アンプルを予め洗浄し、オートクレープ滅菌
した凍結用の栓で密閉し、少なくとも−20℃に冷却し
た。凍結乾燥は1torr以下の真空下−10℃で実施した。
緩衝液を除去したのち、温度を25℃に上昇させ、凍結乾
燥を少なくとも１時間継続した。真空を止め、栓を直ち
に押し込んだ。アルミニウム環でシールしたのち、アン
プルは冷蔵庫に−20℃で保存した。
めには、IFNプールをオートクレーブ滅菌凍結アンプル
（容量8ml）に2mlを越えないように移した。この量は１
アンプル中純粋なインターフエロン１〜約mgに相当す
る。次に、アンプルを予め洗浄し、オートクレープ滅菌
した凍結用の栓で密閉し、少なくとも−20℃に冷却し
た。凍結乾燥は1torr以下の真空下−10℃で実施した。
緩衝液を除去したのち、温度を25℃に上昇させ、凍結乾
燥を少なくとも１時間継続した。真空を止め、栓を直ち
に押し込んだ。アルミニウム環でシールしたのち、アン
プルは冷蔵庫に−20℃で保存した。
以上述べたように、発酵における注意深い指導（比較
的早期の収穫）と本発明の方法により、はじめて、イン
ターフエロン含量の点で純度が98％以上であるのみなら
ず、各種インターフエロン成分についての均一性の点で
も天然モノマーインターフエロン含量95％以上のα−イ
ンターフエロンの製造が可能になつた。
的早期の収穫）と本発明の方法により、はじめて、イン
ターフエロン含量の点で純度が98％以上であるのみなら
ず、各種インターフエロン成分についての均一性の点で
も天然モノマーインターフエロン含量95％以上のα−イ
ンターフエロンの製造が可能になつた。
高い純度と均一性はまた、インターフエロンを塩や緩
衝剤成分を含まない固体として得ることもはじめて可能
にした。したがつて、インターフエロンを何カ月も安定
剤なしで保存することもはじめて可能にした。これは、
従来アルブミンによつて常に安定化されたインターフエ
ロンに比べて、保存、輸送または医薬製剤の開発に、き
わめて重要な利点である。４℃に11カ月間保存したのち
も、含量の低下はまつたく認められなかつた。
衝剤成分を含まない固体として得ることもはじめて可能
にした。したがつて、インターフエロンを何カ月も安定
剤なしで保存することもはじめて可能にした。これは、
従来アルブミンによつて常に安定化されたインターフエ
ロンに比べて、保存、輸送または医薬製剤の開発に、き
わめて重要な利点である。４℃に11カ月間保存したのち
も、含量の低下はまつたく認められなかつた。
EPA83 734に記載されている結晶性ヒト白血球インタ
ーフエロンは沈殿剤としてのポリエチレングリコールの
結晶とインターフエロンからなり、表示から誤解するよ
うな純粋な、均一な、結晶性のインターフエロンではな
い。
ーフエロンは沈殿剤としてのポリエチレングリコールの
結晶とインターフエロンからなり、表示から誤解するよ
うな純粋な、均一な、結晶性のインターフエロンではな
い。
本発明の方法で製造されたα−インターフエロンは、
すでに公知のように、ヒト血清アルブミンを加えて溶解
し、無菌になるまでろ過し、特定の応用に応じて適当な
濃度とし、無菌状態でバイアルに充填された。
すでに公知のように、ヒト血清アルブミンを加えて溶解
し、無菌になるまでろ過し、特定の応用に応じて適当な
濃度とし、無菌状態でバイアルに充填された。
臨床試験により、本発明によつて製造されたα−イン
ターフエロンは非免疫原性で、きわめて耐容性に優れて
いることが明らかにされた。
ターフエロンは非免疫原性で、きわめて耐容性に優れて
いることが明らかにされた。
1985年１月までに、計75名、腫瘍の患者58例、ウイル
ス疾患患者17例が非免疫原性α−インターフエロンで治
療されている。
ス疾患患者17例が非免疫原性α−インターフエロンで治
療されている。
治療期間中の通じて抗体が刺激された患者は１例もな
い。治療期間は15週またはそれ以上で、一部の例につい
ては35週までの治療が行われている。
い。治療期間は15週またはそれ以上で、一部の例につい
ては35週までの治療が行われている。
本発明の方法により、天然モノマーインターフエロン
という意味で均一な、塩および緩衝剤成分を含まない、
非免疫原性の、高度に純粋なα２−インターフエロンの
製造がはじめて可能になつたのである。
という意味で均一な、塩および緩衝剤成分を含まない、
非免疫原性の、高度に純粋なα２−インターフエロンの
製造がはじめて可能になつたのである。
公知方法でのアミノ酸配列解析によれば、以下のアミ
ノ酸配列： を有することが明らかにされた。
ノ酸配列： を有することが明らかにされた。
本発明はとくに、以下の各項を包含する。
すなわち、組換えα−インターフエロンの製造方法に
おいて、インターフエロン遺伝子を含有する宿主生物を
慣用条件で培養し、通常の生育期間後に細胞を殺滅、収
穫し、発現インターフエロンを常法で取り出し、細胞を
わずかにアルカリ性のメジウム中で除去し、インターフ
エロンを濃縮して双頭クロマトグラフイーによる予備精
製に付し、溶出液のpHを4.0〜4.8に調製して不純物を除
き、インターフエロンを最終的に、陽イオン交換樹脂上
溶出液として揮発性緩衝液を用いたクロマトグラフイー
に付して精製し、ついで凍結乾燥することを特徴とする
製造方法、 宿主生物は大腸菌であることを特徴とする製造方法、 細胞はメチオニンインターフエロンの生成が20％未
満、好ましくは５％未満、さらに好ましくは１％未満の
時点で殺滅することを特徴とする製造方法、 細胞はpH2においてホモゲナイザーで破壊し、インタ
ーフエロンを取り出すことを特徴とする製造方法、 双頭クロマトグラフイーは予備セルロースカラムとア
フイニテイークロマトグラフイーからなり、精製すべき
物質を両カラムを通して適当な洗浄溶液で洗浄し、つい
でα−インターフエロンをアフイニテイーカラムから適
当な溶出剤で溶出することを特徴とする製造方法、 予備カラムにはDE−52セルロースを充填し、アフイニ
テイーカラムには担体に結合させたモノクロナール抗−
インターフエロンIgG抗体を充填し、精製すべき物質は
両カラムを通してトリス−食塩緩衝液pH7.5で洗浄し、
ついでα−インターフエロンをアフイニテイーカラムか
ら25％エチレングリコール中0.1Mクエン酸で溶出するこ
とを特徴とする製造方法、 モノクロナール抗体EB1を用いることを特徴とする製
造方法、 双頭クロマトグラフイーからの溶出液のpHを4.5に調
製して不純物を除去することを特徴とする製造方法、 最終的な精製にはMONO−Ｓ、HR10/10型陽イオン交換
樹脂を用いることを特徴とする製造方法、 0.1〜1.0M好ましくは0.1〜0.5M酢酸アンモニウム緩衝
液pH4.0〜5.0好ましくは4.5から調製した直線濃度勾配
で溶出することを特徴とする製造方法、 固体α−インターフエロンを製造することを特徴とす
る製造方法、 メチオニンインターフエロン含量５％未満、インター
フエロンの還元型およびフラグメントを含まず、オリゴ
マー含量0.2％未満、ダイマー／トリマー／テトラマー
含量％２未満で、モノマー含量の90％以上は天然モノマ
ーインターフエロンである均一な、純粋を組換えインタ
ーフエロンの製造方法、 アミノ酸配列： を有するヒトα−インターフエロンをコードする遺伝子
を含有する宿主生物を用いることを特徴とする製造方法 以上述べたいずれかの方法による、アミノ酸配列： を有し、メチオニンインターフエロン含量５％未満、α
−インターフエロンの還元型およびフラグメントを含ま
ず、オリゴマー含量0.2％未満、ダイマー／トリマー／
テトラマー含量％２未満で、天然モノマーα−インター
フエロンであつて位置１と98および29と138のシステイ
ンの間にジスルフイド橋をもつ、均一な、純粋な組換え
ヒトα−インターフエロンの製造方法を提供する。
おいて、インターフエロン遺伝子を含有する宿主生物を
慣用条件で培養し、通常の生育期間後に細胞を殺滅、収
穫し、発現インターフエロンを常法で取り出し、細胞を
わずかにアルカリ性のメジウム中で除去し、インターフ
エロンを濃縮して双頭クロマトグラフイーによる予備精
製に付し、溶出液のpHを4.0〜4.8に調製して不純物を除
き、インターフエロンを最終的に、陽イオン交換樹脂上
溶出液として揮発性緩衝液を用いたクロマトグラフイー
に付して精製し、ついで凍結乾燥することを特徴とする
製造方法、 宿主生物は大腸菌であることを特徴とする製造方法、 細胞はメチオニンインターフエロンの生成が20％未
満、好ましくは５％未満、さらに好ましくは１％未満の
時点で殺滅することを特徴とする製造方法、 細胞はpH2においてホモゲナイザーで破壊し、インタ
ーフエロンを取り出すことを特徴とする製造方法、 双頭クロマトグラフイーは予備セルロースカラムとア
フイニテイークロマトグラフイーからなり、精製すべき
物質を両カラムを通して適当な洗浄溶液で洗浄し、つい
でα−インターフエロンをアフイニテイーカラムから適
当な溶出剤で溶出することを特徴とする製造方法、 予備カラムにはDE−52セルロースを充填し、アフイニ
テイーカラムには担体に結合させたモノクロナール抗−
インターフエロンIgG抗体を充填し、精製すべき物質は
両カラムを通してトリス−食塩緩衝液pH7.5で洗浄し、
ついでα−インターフエロンをアフイニテイーカラムか
ら25％エチレングリコール中0.1Mクエン酸で溶出するこ
とを特徴とする製造方法、 モノクロナール抗体EB1を用いることを特徴とする製
造方法、 双頭クロマトグラフイーからの溶出液のpHを4.5に調
製して不純物を除去することを特徴とする製造方法、 最終的な精製にはMONO−Ｓ、HR10/10型陽イオン交換
樹脂を用いることを特徴とする製造方法、 0.1〜1.0M好ましくは0.1〜0.5M酢酸アンモニウム緩衝
液pH4.0〜5.0好ましくは4.5から調製した直線濃度勾配
で溶出することを特徴とする製造方法、 固体α−インターフエロンを製造することを特徴とす
る製造方法、 メチオニンインターフエロン含量５％未満、インター
フエロンの還元型およびフラグメントを含まず、オリゴ
マー含量0.2％未満、ダイマー／トリマー／テトラマー
含量％２未満で、モノマー含量の90％以上は天然モノマ
ーインターフエロンである均一な、純粋を組換えインタ
ーフエロンの製造方法、 アミノ酸配列： を有するヒトα−インターフエロンをコードする遺伝子
を含有する宿主生物を用いることを特徴とする製造方法 以上述べたいずれかの方法による、アミノ酸配列： を有し、メチオニンインターフエロン含量５％未満、α
−インターフエロンの還元型およびフラグメントを含ま
ず、オリゴマー含量0.2％未満、ダイマー／トリマー／
テトラマー含量％２未満で、天然モノマーα−インター
フエロンであつて位置１と98および29と138のシステイ
ンの間にジスルフイド橋をもつ、均一な、純粋な組換え
ヒトα−インターフエロンの製造方法を提供する。
また、本発明はさらに、本発明の方法によつて製造さ
れたインターフエロンを包含する。
れたインターフエロンを包含する。
すなわち、メチオニンインターフエンロン含量20％未
満、好ましくは５％未満、さらに好ましくは１％未満の
均一な、純粋な形に得られるα−インターフエロン α−インターフエロンの還元型およびフラグメントを
含まず、オリゴマー含量0.2％未満、ダイマー／トリマ
ー／テトラマー含量％２未満で均一、純粋な形のα−イ
ンターフエロン オリゴマーおよびダイマー／トリマー／テトラマーを
含まないα−インターフエロン モノマー含量の90％以上が天然モノマーα−インター
フエロンであるα−インターフエロン 非天然モノマーインターフエロンを含まないα−イン
ターフエロン 抗体を刺激しないことを特徴とするα−インターフエ
ロン、 固体として得られることを特徴とするα−インターフ
エロン、 本発明によるヒトα−インターフエロン、 アミノ酸配列： を有することを特徴とするα−インターフエロン、 アミノ酸配列： に相当に、メチオニンインターフエロン含量５％未満、
オリゴマー含量0.2％未満、ダイマー／トリマー／テト
ラマー含量％２未満、α−インターフエロンの還元型お
よびフラグメントを含まず、モノマー含量の90％以上は
位置１と98、29と138のシステインの間にジスルフイド
橋をもつ天然モノマーα−インターフエロンであり、均
一な、純粋な形の組換えヒトα−インターフエロンを提
供する。
満、好ましくは５％未満、さらに好ましくは１％未満の
均一な、純粋な形に得られるα−インターフエロン α−インターフエロンの還元型およびフラグメントを
含まず、オリゴマー含量0.2％未満、ダイマー／トリマ
ー／テトラマー含量％２未満で均一、純粋な形のα−イ
ンターフエロン オリゴマーおよびダイマー／トリマー／テトラマーを
含まないα−インターフエロン モノマー含量の90％以上が天然モノマーα−インター
フエロンであるα−インターフエロン 非天然モノマーインターフエロンを含まないα−イン
ターフエロン 抗体を刺激しないことを特徴とするα−インターフエ
ロン、 固体として得られることを特徴とするα−インターフ
エロン、 本発明によるヒトα−インターフエロン、 アミノ酸配列： を有することを特徴とするα−インターフエロン、 アミノ酸配列： に相当に、メチオニンインターフエロン含量５％未満、
オリゴマー含量0.2％未満、ダイマー／トリマー／テト
ラマー含量％２未満、α−インターフエロンの還元型お
よびフラグメントを含まず、モノマー含量の90％以上は
位置１と98、29と138のシステインの間にジスルフイド
橋をもつ天然モノマーα−インターフエロンであり、均
一な、純粋な形の組換えヒトα−インターフエロンを提
供する。
さらに本発明は、本発明によるα−インターフエロン
の、ウイルス疾患および腫瘍の治療への使用、 本発明のα−インターフエロンと１種もしくは２種以
上の不活性医薬用賦形剤および／または担体を含有する
ことを特徴とする治療用医薬組成物を包含する。
の、ウイルス疾患および腫瘍の治療への使用、 本発明のα−インターフエロンと１種もしくは２種以
上の不活性医薬用賦形剤および／または担体を含有する
ことを特徴とする治療用医薬組成物を包含する。
次に本発明を以下の実施例によりさらに詳細に説明す
るが、これは本発明を例示するものであつて、いかなる
意味においても本発明を限定するものではない 発酵混合物に関しては、とくに、本発明の方法、制限
なく広い範囲内で使用できる。すなわち、機械的分解後
に匹敵するIFNの生成を与える他の宿主生物の生物体、
またEBI−１モノクロナール抗体と同様に特異的に反応
するα−インターフエロンたとえばIFN−α１の使用も
可能である。インターフエロンαとのホモロジーが低い
他のインターフエロンも、相当する特異性の高いモノク
ロナール抗体を使用すれば本発明の方法によつて精製で
きる。
るが、これは本発明を例示するものであつて、いかなる
意味においても本発明を限定するものではない 発酵混合物に関しては、とくに、本発明の方法、制限
なく広い範囲内で使用できる。すなわち、機械的分解後
に匹敵するIFNの生成を与える他の宿主生物の生物体、
またEBI−１モノクロナール抗体と同様に特異的に反応
するα−インターフエロンたとえばIFN−α１の使用も
可能である。インターフエロンαとのホモロジーが低い
他のインターフエロンも、相当する特異性の高いモノク
ロナール抗体を使用すれば本発明の方法によつて精製で
きる。
例１（大腸菌混合物:IFN−α2Arg;28℃） ａ） −20℃に保存していた酸沈殿生物体251gを１％酢
酸2500mlに取り、氷浴中で0.5時間撹拌し、ウルトラツ
ラツクス（Ultraturax）45/6型を用いて１分間、２回ホ
モゲナイズした。ポリミン（polymin）Ｐを最終濃度が
0.25％になるように加え、5N NaOHを用いてpHを10.0に
調製し、混合物を２時間氷浴上で混合し、最後に5N HC
lを用いてpHを7.50に調整した。
酸2500mlに取り、氷浴中で0.5時間撹拌し、ウルトラツ
ラツクス（Ultraturax）45/6型を用いて１分間、２回ホ
モゲナイズした。ポリミン（polymin）Ｐを最終濃度が
0.25％になるように加え、5N NaOHを用いてpHを10.0に
調製し、混合物を２時間氷浴上で混合し、最後に5N HC
lを用いてpHを7.50に調整した。
クライスト・クリオフユージ（Christ Cryofuge）６
−6S中、3000rpmで１時間遠心分離すると、 蛋白質含量5330mgの澄明な粗抽出液が生成する。比活性
は3.21×106I.U./mg蛋白質と計算できる。
−6S中、3000rpmで１時間遠心分離すると、 蛋白質含量5330mgの澄明な粗抽出液が生成する。比活性
は3.21×106I.U./mg蛋白質と計算できる。
ｂ） 硫酸アンモニウムを65％飽和に達するまで加えた
（430g/抽出液）。混合物を一夜４〜８℃に保存し、
生成した沈殿をベツクマン（Beckman）J2−21高速遠心
分離機ローターJA10により、４℃、10,000rpmで１時間
遠心分離した。澄明な上清3,120mlは粗抽出液中に含ま
れていたインターフエロンの0.7％（120×106I.U.）を
含有した。
（430g/抽出液）。混合物を一夜４〜８℃に保存し、
生成した沈殿をベツクマン（Beckman）J2−21高速遠心
分離機ローターJA10により、４℃、10,000rpmで１時間
遠心分離した。澄明な上清3,120mlは粗抽出液中に含ま
れていたインターフエロンの0.7％（120×106I.U.）を
含有した。
ペレツトを0.01M NaClに取り、４〜８℃で２時間撹
拌した。5N NaOHを用いてpHを7.50に調整し、この溶液
を上述したと同様にして遠心分離して澄明化した。澄明
な溶液を透析カートリツジ［ネフロス・アレグロ（Neph
ross Allegro,オルガノン・テクニカ（Organon Technik
a）社］を用い390mOsmol/とし、0.01M NaClで透析し
た。インターフエロン含量は13.3×109I.U. であつた。
拌した。5N NaOHを用いてpHを7.50に調整し、この溶液
を上述したと同様にして遠心分離して澄明化した。澄明
な溶液を透析カートリツジ［ネフロス・アレグロ（Neph
ross Allegro,オルガノン・テクニカ（Organon Technik
a）社］を用い390mOsmol/とし、0.01M NaClで透析し
た。インターフエロン含量は13.3×109I.U. であつた。
ｃ） 透析液をついでクロマトグラフイーに付した（双
頭クロマトグラフイー）。予備カラムにはトリス／食塩
緩衝液pH7.5（0.025Mトリス／塩酸＋0.2M NaCl）中DE5
2−セルロース末［ウオツトマン（Whatman社製）125gを
用いた。これは生物体1gに対してカラム材料0.5gに相当
する。アフイニテイーカラムにはBrCN活性化セフアロー
ス4B［フアルマシア（Pharmacia）社］に結合させたモ
ノクロナール抗−インターフエロンIgG（EBI1）を用い
た。最終カラム材料はリン酸緩衝食塩溶液（PBS）中ナ
トリウムアジドとともに４〜８℃で保存した。使用前に
抗体カラムを25％エチレングリコール中0.1Mクエン酸で
洗浄し、ついで中性になるまでPBSで洗つた。抗体カラ
ムでは生物体1gに0.2〜1.0mlのカラム容量を要した。透
析インターフエロン溶液をまずポンプで両カラム（予備
カラムおよび抗体カラム）に通し、溶出液を280nmの吸
収の測定によりモニタリングした。インターフエロン溶
液適用後、トリス／食塩緩衝液pH7.5で、溶出液中の蛋
白質量が1/20のプラトー値に低下するまで溶出した。つ
いで抗体カラムを予備カラムから分離し、それだけをト
リス／食塩緩衝液pH7.5で溶出液中に蛋白質が検出でき
なくなるまで洗浄した。
頭クロマトグラフイー）。予備カラムにはトリス／食塩
緩衝液pH7.5（0.025Mトリス／塩酸＋0.2M NaCl）中DE5
2−セルロース末［ウオツトマン（Whatman社製）125gを
用いた。これは生物体1gに対してカラム材料0.5gに相当
する。アフイニテイーカラムにはBrCN活性化セフアロー
ス4B［フアルマシア（Pharmacia）社］に結合させたモ
ノクロナール抗−インターフエロンIgG（EBI1）を用い
た。最終カラム材料はリン酸緩衝食塩溶液（PBS）中ナ
トリウムアジドとともに４〜８℃で保存した。使用前に
抗体カラムを25％エチレングリコール中0.1Mクエン酸で
洗浄し、ついで中性になるまでPBSで洗つた。抗体カラ
ムでは生物体1gに0.2〜1.0mlのカラム容量を要した。透
析インターフエロン溶液をまずポンプで両カラム（予備
カラムおよび抗体カラム）に通し、溶出液を280nmの吸
収の測定によりモニタリングした。インターフエロン溶
液適用後、トリス／食塩緩衝液pH7.5で、溶出液中の蛋
白質量が1/20のプラトー値に低下するまで溶出した。つ
いで抗体カラムを予備カラムから分離し、それだけをト
リス／食塩緩衝液pH7.5で溶出液中に蛋白質が検出でき
なくなるまで洗浄した。
抗体に結合したインターフエロンの溶出は25％エチレ
ングリコール中0.1Mクエン酸を用いて行い、再び溶出液
を280nmの吸収によつてモニタリングした。インターフ
エロンを含む蛋白質ピークを集めた。
ングリコール中0.1Mクエン酸を用いて行い、再び溶出液
を280nmの吸収によつてモニタリングした。インターフ
エロンを含む蛋白質ピークを集めた。
の溶出液16.8mlが得られた。総蛋白質量は54.4mgで、比
活性は226×106I.U./mg蛋白質と計算される。
活性は226×106I.U./mg蛋白質と計算される。
ｄ） さらに精製するため、溶出液のpHをアンモニアで
4.5に調整し、生成した沈殿を除去した。澄明な上清（1
8.3ml）は、蛋白質46.3mgを含有し、粗蛋白質に基づく
インターフエロン含量は11.8×109I.U.であつた。これ
は収量69％に相当した（225×106I.U./mg蛋白質）。
4.5に調整し、生成した沈殿を除去した。澄明な上清（1
8.3ml）は、蛋白質46.3mgを含有し、粗蛋白質に基づく
インターフエロン含量は11.8×109I.U.であつた。これ
は収量69％に相当した（225×106I.U./mg蛋白質）。
ｅ） 最終精製はフアルマシア（Pharmacia）製のEPLC
装置を用いMONO−Ｓカラム、HR10/10型（陽イオン交換
樹脂）で実施した。
装置を用いMONO−Ｓカラム、HR10/10型（陽イオン交換
樹脂）で実施した。
沈殿後に得られた澄明な上清を、予め0.1M酢酸アンモ
ニウム緩衝液pH4.5〜5.0で洗浄したカラムに適用し、つ
いでこのカラムを280nmの吸収がはじめの値に戻るまで
洗浄した。吸着したインターフエロンの溶出は、0.5M酢
酸アンモニウムpH4.5〜5.0を添加していく平坦塩勾配で
実施した。インターフエロンは鋭いピークとして溶出し
た。肩の分画（K3）および後れて溶出した分画（K5〜K
7）は、純粋なインターフエロンの主ピークから分離し
た。純粋なインターフエロンのピークを集め、その一部
をとつてHPLC解析、SDSゲル電気泳動、蛋白質定量、イ
ンターフエロン試験およびエンドトキシンの定量を行つ
た。型分画（9.1ml）に計4.1mgの蛋白質が含まれ、イン
ターフエロン含量は1.33×109I.U.（7.7％）、比活性は
324×106I.U./mg蛋白質であつた。
ニウム緩衝液pH4.5〜5.0で洗浄したカラムに適用し、つ
いでこのカラムを280nmの吸収がはじめの値に戻るまで
洗浄した。吸着したインターフエロンの溶出は、0.5M酢
酸アンモニウムpH4.5〜5.0を添加していく平坦塩勾配で
実施した。インターフエロンは鋭いピークとして溶出し
た。肩の分画（K3）および後れて溶出した分画（K5〜K
7）は、純粋なインターフエロンの主ピークから分離し
た。純粋なインターフエロンのピークを集め、その一部
をとつてHPLC解析、SDSゲル電気泳動、蛋白質定量、イ
ンターフエロン試験およびエンドトキシンの定量を行つ
た。型分画（9.1ml）に計4.1mgの蛋白質が含まれ、イン
ターフエロン含量は1.33×109I.U.（7.7％）、比活性は
324×106I.U./mg蛋白質であつた。
主プール9.8mlはきわめて純粋なインターフエロン5.1
8×109I.U.を含有し、総蛋白質量は16.1mg、比活性は32
2×106I.U./ml蛋白質であつた。
8×109I.U.を含有し、総蛋白質量は16.1mg、比活性は32
2×106I.U./ml蛋白質であつた。
第１表に、この精製の各段階の追跡結果を、第２表に
この精製方法によつて得られたα−インターフエロンの
純度検定の結果を示す。
この精製方法によつて得られたα−インターフエロンの
純度検定の結果を示す。
f;α） IFNプールを、オートクレープで滅菌した凍結
アンプル（容量8ml）に最高2mlまでのバツチで分取し
た。これは１アンプルあたり純粋なインターフエロン１
〜約8mgに相当する。ついでアンプルを、予め洗浄し、
オートクレーブで滅菌した凍結栓でシールし、少なくと
も−20℃に冷却した。凍結乾燥は1torr以下の真空下、
−10℃で行つた。緩衝液を除去したのち、温度を25℃に
上昇させ、少なくとも１時間真空乾燥を続けた。真空を
止め、直ちに栓をかたく押し込んだ。アルミニウムシー
ルを付したのち、アンプルは冷蔵庫内または−20℃にて
保存した。
アンプル（容量8ml）に最高2mlまでのバツチで分取し
た。これは１アンプルあたり純粋なインターフエロン１
〜約8mgに相当する。ついでアンプルを、予め洗浄し、
オートクレーブで滅菌した凍結栓でシールし、少なくと
も−20℃に冷却した。凍結乾燥は1torr以下の真空下、
−10℃で行つた。緩衝液を除去したのち、温度を25℃に
上昇させ、少なくとも１時間真空乾燥を続けた。真空を
止め、直ちに栓をかたく押し込んだ。アルミニウムシー
ルを付したのち、アンプルは冷蔵庫内または−20℃にて
保存した。
β） 安定性を調べるために、４種の別の発酵混合物
を、例1aからf;αまで個別に、ただし同じ方法で精製し
たのち、凍結乾燥した。凍結乾燥混合物をIRMA希釈緩衝
液に溶解し、ヒトIFNα用NK2−IRMA［セルテク（Cellte
ch）社（英）を用いて分析した。
を、例1aからf;αまで個別に、ただし同じ方法で精製し
たのち、凍結乾燥した。凍結乾燥混合物をIRMA希釈緩衝
液に溶解し、ヒトIFNα用NK2−IRMA［セルテク（Cellte
ch）社（英）を用いて分析した。
結果を第３表に示す。
凍結乾燥による力価の低下は認められなかつた。
凍結乾燥物質を約４℃（冷蔵庫）に11カ月間保存した
のち、0.1M酢酸アンモニウムに溶解し、純度（ゲル浸透
HPLC）および含量（NK2−IRMA試験）を調べた。
のち、0.1M酢酸アンモニウムに溶解し、純度（ゲル浸透
HPLC）および含量（NK2−IRMA試験）を調べた。
結果を第４表に示す。
例２ インターフエロン成分の組成に及ぼす発酵時間の影響
を試験するために、発酵混合物（大腸菌HB101;28℃）か
ら、８、９、10または11時間後にサンプルを採取し、常
法でpH2の酸性にして沈殿させ、本発明の方法を用いて
精製し、分析した。第５表は、サンプル中のK1、K2およ
びK3含量を示している（K1:Met−IFN、K2:天然IFN、K3:
非天然IFN）。値はクロマト泳動によつて求めた。
を試験するために、発酵混合物（大腸菌HB101;28℃）か
ら、８、９、10または11時間後にサンプルを採取し、常
法でpH2の酸性にして沈殿させ、本発明の方法を用いて
精製し、分析した。第５表は、サンプル中のK1、K2およ
びK3含量を示している（K1:Met−IFN、K2:天然IFN、K3:
非天然IFN）。値はクロマト泳動によつて求めた。
例３ EBI1抗体のCNBr活性化セファロース4Bへの結合（DE−OS
33 06 060参照） EBI−１抗体をまず0.5M NaCl/0.2M NaHCO3、pH8.4
に溶解し（できる限り少量の緩衝液）、この緩衝液で、
外液に硫酸イオンが検出されなくなるまで（塩化バリウ
ム使用）透析した。アンモニウムイオンは担体への結合
を妨害するので、硫酸アンモニウムを注意深く除去する
ことが必須である。ついで蛋白質濃度を5mg/ml緩衝液に
調整した。結合には担体としてCNBr活性化セフアロース
4B［フアルマシア（Pharmacia）］を用いた。まず、製
造業者の指示（同封されたリーフレツト）に従つて予備
的洗浄を行つた。EBI−１抗体25mgあたり活性化セフア
ロース1gを使用した。結合は、上記緩衝液中、pH8.4、
室温で２時間実施した。ついでEBI−１セフアロースを
吸引濾過し、指示リーフレツトに従つて洗浄した。使用
したEBI−１抗体の５％以上がろ液中に残つてはならな
い。完成したEBI−１セフアロースはPBS/アジド中、冷
却下に保存した。
33 06 060参照） EBI−１抗体をまず0.5M NaCl/0.2M NaHCO3、pH8.4
に溶解し（できる限り少量の緩衝液）、この緩衝液で、
外液に硫酸イオンが検出されなくなるまで（塩化バリウ
ム使用）透析した。アンモニウムイオンは担体への結合
を妨害するので、硫酸アンモニウムを注意深く除去する
ことが必須である。ついで蛋白質濃度を5mg/ml緩衝液に
調整した。結合には担体としてCNBr活性化セフアロース
4B［フアルマシア（Pharmacia）］を用いた。まず、製
造業者の指示（同封されたリーフレツト）に従つて予備
的洗浄を行つた。EBI−１抗体25mgあたり活性化セフア
ロース1gを使用した。結合は、上記緩衝液中、pH8.4、
室温で２時間実施した。ついでEBI−１セフアロースを
吸引濾過し、指示リーフレツトに従つて洗浄した。使用
したEBI−１抗体の５％以上がろ液中に残つてはならな
い。完成したEBI−１セフアロースはPBS/アジド中、冷
却下に保存した。
PBS/アジド:PBS:7.30g塩化ナトリウムp.A.（メルク640
4）、3.00gNa2HPO4×2H2O p.A.（メルク6580）、1.15g
NaH2PO4×H2O p.A.（メルク6346）を溶解し、全量1,
000mlとした。pH7.0、アジド：きわめて純粋なナトリウ
ムアジド（メルク6688）を1.0g/、PBSに加えた。完成
した溶液を滅菌ろ過し（孔径0.2ミクロン）、冷却保存
した。
4）、3.00gNa2HPO4×2H2O p.A.（メルク6580）、1.15g
NaH2PO4×H2O p.A.（メルク6346）を溶解し、全量1,
000mlとした。pH7.0、アジド：きわめて純粋なナトリウ
ムアジド（メルク6688）を1.0g/、PBSに加えた。完成
した溶液を滅菌ろ過し（孔径0.2ミクロン）、冷却保存
した。
インターフエロン抗体の検定（中和検定）材料 細胞：ヒト肺癌細胞“Ａ−549"（ATCC CCL185） ウイルス：脳心筋炎ウイルス（EMC）、ATCC VR129 インターフエロン標準:HS−11（１アンプル“HS−11"は
凍結乾燥ヒトIFNrα−Ａを水1.2mlに取り、12,000IU/ml
とする） 組織培養プレート：蓋付、平坦底部の96ウエル、径6.4m
m、組織培養処理［コーニング、ニユーヨーク（Cornin
g,New York）］ メジウム： DMEM＝ダルベツコ改良イーグルメジウム、グルタミン含
有、炭酸水素ナトリウム含有せず、flow cat.no.10−33
1−24（1F−017D） HEPES シグマNo.H−3375 TRICINE カルビオケミ（Calbiochem）No.33468、Ａ級 FCS＝胎仔ウシ血清（ベーリンガー・マンハイム） ヒト血清アルブミン＝ベーリング・インステイチユート
（Behring Inst.）20％、輸液用 抗生物質＝チアムリン水素フマール酸塩、バイオケミ
（Biochemie） Kundl/Tirol＝オーストリア［サンド（Sandoz）］ 生育メジウム＝DMEM＋10％FCS/56℃で30分間 不活性化 ＋13mM HEPES ＋ 6mM TRICINE ＋1.6g/ NaHCO3 抗生物質 なし pH7.2〜7.4 検定メジウム＝生育メジウムと同じであるがFCSは５％
でなく10％とし、チアムリン５μ/mlを添加 希釈メジウム＝生育メジウムと同じであるが、血清を含
まず、チアムリン５μg/ml添加 ウイルスメジウム＝生育メジウムと同じであるが、血清
を含まず、チアムリン５μg/mlヒト血清アルブミン3.5m
g/ml添加 メチルバイオレツト保存溶液： メチルバイオレツト（メルク1402） 6g エタノール 100ml 約50℃で溶解、ろ過 メチルバイオレツト使用液 保存溶液 50ml 水（中性） 950ml 細胞は永久細胞系として処理した。細胞をトリプシニ
ゼーシヨンにより増殖させ、生育メジウムで希釈した。
検定には、細胞を血球計数器で数え、１ウエル1mlあた
り細胞４〜５×104個の接種溶液を得るために検定メジ
ウムに懸濁し、皿上に分布させた。接種は、37℃、CO2
含量５％、相対湿度80％の大気下に行つた。通常８〜24
時間で単層が完成した。この時点で、インターフエロン
と血清希釈液を別個の試験管に調製した。
凍結乾燥ヒトIFNrα−Ａを水1.2mlに取り、12,000IU/ml
とする） 組織培養プレート：蓋付、平坦底部の96ウエル、径6.4m
m、組織培養処理［コーニング、ニユーヨーク（Cornin
g,New York）］ メジウム： DMEM＝ダルベツコ改良イーグルメジウム、グルタミン含
有、炭酸水素ナトリウム含有せず、flow cat.no.10−33
1−24（1F−017D） HEPES シグマNo.H−3375 TRICINE カルビオケミ（Calbiochem）No.33468、Ａ級 FCS＝胎仔ウシ血清（ベーリンガー・マンハイム） ヒト血清アルブミン＝ベーリング・インステイチユート
（Behring Inst.）20％、輸液用 抗生物質＝チアムリン水素フマール酸塩、バイオケミ
（Biochemie） Kundl/Tirol＝オーストリア［サンド（Sandoz）］ 生育メジウム＝DMEM＋10％FCS/56℃で30分間 不活性化 ＋13mM HEPES ＋ 6mM TRICINE ＋1.6g/ NaHCO3 抗生物質 なし pH7.2〜7.4 検定メジウム＝生育メジウムと同じであるがFCSは５％
でなく10％とし、チアムリン５μ/mlを添加 希釈メジウム＝生育メジウムと同じであるが、血清を含
まず、チアムリン５μg/ml添加 ウイルスメジウム＝生育メジウムと同じであるが、血清
を含まず、チアムリン５μg/mlヒト血清アルブミン3.5m
g/ml添加 メチルバイオレツト保存溶液： メチルバイオレツト（メルク1402） 6g エタノール 100ml 約50℃で溶解、ろ過 メチルバイオレツト使用液 保存溶液 50ml 水（中性） 950ml 細胞は永久細胞系として処理した。細胞をトリプシニ
ゼーシヨンにより増殖させ、生育メジウムで希釈した。
検定には、細胞を血球計数器で数え、１ウエル1mlあた
り細胞４〜５×104個の接種溶液を得るために検定メジ
ウムに懸濁し、皿上に分布させた。接種は、37℃、CO2
含量５％、相対湿度80％の大気下に行つた。通常８〜24
時間で単層が完成した。この時点で、インターフエロン
と血清希釈液を別個の試験管に調製した。
対照皿ではHS−11希釈1:1,000、1:2,000から1:32,000
までを37℃で１時間インキユベートした。
までを37℃で１時間インキユベートした。
試験皿では血清サンプルを、HS−11を各管の最終濃度
が10IU HS−11/mlになる十分な量含有する希釈メジウ
ムにより1:2、1:4、1:8から1:64まで順次希釈し、つい
で37℃で１時間インキユベートした。
が10IU HS−11/mlになる十分な量含有する希釈メジウ
ムにより1:2、1:4、1:8から1:64まで順次希釈し、つい
で37℃で１時間インキユベートした。
皿を傾瀉して各ウエルを希釈メジウム100ml（シリー
ズ２、３、10および11）または希釈100μ（シリーズ
４〜９）を充填した。皿を37℃で４時間インキユベート
した。ついで皿を各ウエルあたり100μのウイルスメ
ジウム（ウイルスは含まない）および50μのウイルス
稀釈液（シリーズ３、11、４〜９）で覆い、36時間以内
に約90％の細胞変性効果を達成させ、再びインキユベー
トした。24時間に、顕微鏡観察のために、細胞をメチル
バイオレツトで染色した。
ズ２、３、10および11）または希釈100μ（シリーズ
４〜９）を充填した。皿を37℃で４時間インキユベート
した。ついで皿を各ウエルあたり100μのウイルスメ
ジウム（ウイルスは含まない）および50μのウイルス
稀釈液（シリーズ３、11、４〜９）で覆い、36時間以内
に約90％の細胞変性効果を達成させ、再びインキユベー
トした。24時間に、顕微鏡観察のために、細胞をメチル
バイオレツトで染色した。
結果は第12a〜12f図に示す。
方法 分析には以下の方法を用いた。
蛋白質の定量 バイオラツド蛋白質定量法：この方法は染料クーマシ
ー・ブリリアント・ブルーを用い、蛋白質／染料複合体
を595nmで測定した。標準にはウシ血清アルブミンを用
いた。
ー・ブリリアント・ブルーを用い、蛋白質／染料複合体
を595nmで測定した。標準にはウシ血清アルブミンを用
いた。
面積測定法：ゲル浸透HPLCで記録された214nmのピーク
面積を測定した。結果を、検量物質ウシ血清アルブミ
ン、オバルブミン、トリプシノーゲンおよびリゾチーム
からのフアクターを用いて変換した。この測定法は、と
くに双頭クロマトグラフイー精製段階、pH4.5沈殿およ
びMONO−Ｓ FPLC後のプレパレーシヨンに単独でまたは
併用して使用した。
面積を測定した。結果を、検量物質ウシ血清アルブミ
ン、オバルブミン、トリプシノーゲンおよびリゾチーム
からのフアクターを用いて変換した。この測定法は、と
くに双頭クロマトグラフイー精製段階、pH4.5沈殿およ
びMONO−Ｓ FPLC後のプレパレーシヨンに単独でまたは
併用して使用した。
インターフエロンの定量 セルテツク（Celltech、英）社から市販されているヒ
トα−インターフエロン用“NH2−IRMA"を用いた。標準
には、生物学的検定（WISH細胞および水疱性口内炎ウイ
ルスのプラーク低下試験）により国際標準69/19に調整
した実験用標準“HS−11"を用いた。
トα−インターフエロン用“NH2−IRMA"を用いた。標準
には、生物学的検定（WISH細胞および水疱性口内炎ウイ
ルスのプラーク低下試験）により国際標準69/19に調整
した実験用標準“HS−11"を用いた。
SDS−ゲル電気泳動 レムリ［Laemmli:ネイシヤー（Nature）、227、680
（1980）］の方法を用いた。蛋白質の染色にはクーマシ
ー・ブリリアント・ブルーを使用した。純度チエツクに
は20μｇのインターフエロンを用いた。
（1980）］の方法を用いた。蛋白質の染色にはクーマシ
ー・ブリリアント・ブルーを使用した。純度チエツクに
は20μｇのインターフエロンを用いた。
クロマト泳動 ボドらの方法［Bodo ＆ Adolf:セパレーシヨン・アン
ド・キヤラクタリゼーシヨン・オブ・ヒユーマン・アイ
エフエヌ−アルフア・サブタイプス・イン・ザ・バイオ
ロジー・オブ・ザ・インターフエロン・システム（Sepa
ration and characterization of Human IFN−α Sub−
Types in the Biology of the Interferon System）、1
13〜118頁、エルセビア（Elsevier）、デメイヤーほか
（E.DeMaeyer ＆ H.Schelleckens）編］により、MONO−
Ｐクロマト泳動カラムHR5/20（フアルマシア（Pharmaci
a）］をpH範囲４〜７で用いた。流出速度が高めるため
に25％1,2−プロパンジオールに代えて25％アセトニト
リルを含む緩衝液を用いた。蛋白質濃度は280nmで記録
し、pHは自動的に記録した。分析するサンプルは、凍結
乾燥し、水に1g/mlになるように溶解し、ついで緩衝液
Ａ（pH7.1）で５倍容に希釈した。各分析に、インター
フエロン0.2〜1.0mgを用いた。
ド・キヤラクタリゼーシヨン・オブ・ヒユーマン・アイ
エフエヌ−アルフア・サブタイプス・イン・ザ・バイオ
ロジー・オブ・ザ・インターフエロン・システム（Sepa
ration and characterization of Human IFN−α Sub−
Types in the Biology of the Interferon System）、1
13〜118頁、エルセビア（Elsevier）、デメイヤーほか
（E.DeMaeyer ＆ H.Schelleckens）編］により、MONO−
Ｐクロマト泳動カラムHR5/20（フアルマシア（Pharmaci
a）］をpH範囲４〜７で用いた。流出速度が高めるため
に25％1,2−プロパンジオールに代えて25％アセトニト
リルを含む緩衝液を用いた。蛋白質濃度は280nmで記録
し、pHは自動的に記録した。分析するサンプルは、凍結
乾燥し、水に1g/mlになるように溶解し、ついで緩衝液
Ａ（pH7.1）で５倍容に希釈した。各分析に、インター
フエロン0.2〜1.0mgを用いた。
ゲル浸透HPLC（高速液体クロマトグラフイー） 固定相:WATERS Ｉ−125;2×（300mm×7.8mm）；粒子径
10μｍ 移動相： 0.5M Na2SO4 0.02M NaH2PO4、NaOHでpH7.0に調整 0.04％ツイーン20 25％プロピレングリコール 流速:0.5ml/分 検出:214nmにおける紫外部吸収 分子量検量： ウシ血清アルブミン M66,000 オバルブミン M45,000 トリプシノーゲン M24,000 リゾチーム M14,300 逆相HPLC（高速液体クロマトグラフイー） 固定相:Bakerbond WPC18;250mm×4.6mm;粒子径５μm;孔
径30nm 移動相： A:0.1％トリフルオロ酢酸／水、pH2.2 B:0.1％トリフルオロ酢酸／アセトニトリル 勾配プログラム： ０〜２分:45％Ｂ ２〜32分:45〜53％Ｂ 32〜40分:53％Ｂ 40〜50分:45％Ｂ 流速:1ml/分 検出:214nmにおける紫外部吸収
10μｍ 移動相： 0.5M Na2SO4 0.02M NaH2PO4、NaOHでpH7.0に調整 0.04％ツイーン20 25％プロピレングリコール 流速:0.5ml/分 検出:214nmにおける紫外部吸収 分子量検量： ウシ血清アルブミン M66,000 オバルブミン M45,000 トリプシノーゲン M24,000 リゾチーム M14,300 逆相HPLC（高速液体クロマトグラフイー） 固定相:Bakerbond WPC18;250mm×4.6mm;粒子径５μm;孔
径30nm 移動相： A:0.1％トリフルオロ酢酸／水、pH2.2 B:0.1％トリフルオロ酢酸／アセトニトリル 勾配プログラム： ０〜２分:45％Ｂ ２〜32分:45〜53％Ｂ 32〜40分:53％Ｂ 40〜50分:45％Ｂ 流速:1ml/分 検出:214nmにおける紫外部吸収
第１図は、双頭クロマトグラフイー後の酸性溶出液の逆
相HPLCのクロマトグラムである。K1〜K7が認められる。 第２図は、双頭クロマトグラフイー後の酸性溶出液のゲ
ル浸透HPLCのクロマトグラムである。 第３図は、pH4.5での沈殿後の逆相HPLCのクロマトグラ
ムである。成分K1、K2、K3およびK6が認められる。 第４図は、pH4.5での沈殿後のゲル浸透HPLCのクロマト
グラムである。 第５図は、0.1〜0.5M酢酸アンモニウム勾配による、pH
4.5でのMONO−Ｓ上FPLCのクロマトグラムである。 第６図はMONO−Ｓピークの肩分画の逆相HPLCにおけるク
ロマトグラムである。 第７図は、MONO−Ｓピークの肩分画のゲル浸透HPLCにお
けるクロマトグラムである。 第８図は、MONO−Ｓピークの主分画の逆相HPLCにおける
クロマトグラムである。 第９図は、MONO−Ｓピークの主分画の浸透ゲルHPLCにお
けるクロマトグラムである。 第10図は、MONO−Ｓピークの主分画のクロマト泳動にお
けるクロマトグラムである。 第11図は、双頭クロマトグラフイー後の酸性溶出液のゲ
ル電気泳動の写真である。K1〜K7成分は逆相HPLCによつ
て分離された。 第12a図〜第12f図は、抗IFN−α抗体試験の結果であ
る。試験方法は、中和検定法（10IU/ml IFNα/A−599/E
MC）である。患者総数75例、腫瘍患者58例、うち抗体刺
激をみない例58例、ウイルス感染症患者17例、うち抗体
刺激をみない者17例である。 第13図は、抗インターフエロン−α抗体定量法のダイア
グラムである。
相HPLCのクロマトグラムである。K1〜K7が認められる。 第２図は、双頭クロマトグラフイー後の酸性溶出液のゲ
ル浸透HPLCのクロマトグラムである。 第３図は、pH4.5での沈殿後の逆相HPLCのクロマトグラ
ムである。成分K1、K2、K3およびK6が認められる。 第４図は、pH4.5での沈殿後のゲル浸透HPLCのクロマト
グラムである。 第５図は、0.1〜0.5M酢酸アンモニウム勾配による、pH
4.5でのMONO−Ｓ上FPLCのクロマトグラムである。 第６図はMONO−Ｓピークの肩分画の逆相HPLCにおけるク
ロマトグラムである。 第７図は、MONO−Ｓピークの肩分画のゲル浸透HPLCにお
けるクロマトグラムである。 第８図は、MONO−Ｓピークの主分画の逆相HPLCにおける
クロマトグラムである。 第９図は、MONO−Ｓピークの主分画の浸透ゲルHPLCにお
けるクロマトグラムである。 第10図は、MONO−Ｓピークの主分画のクロマト泳動にお
けるクロマトグラムである。 第11図は、双頭クロマトグラフイー後の酸性溶出液のゲ
ル電気泳動の写真である。K1〜K7成分は逆相HPLCによつ
て分離された。 第12a図〜第12f図は、抗IFN−α抗体試験の結果であ
る。試験方法は、中和検定法（10IU/ml IFNα/A−599/E
MC）である。患者総数75例、腫瘍患者58例、うち抗体刺
激をみない例58例、ウイルス感染症患者17例、うち抗体
刺激をみない者17例である。 第13図は、抗インターフエロン−α抗体定量法のダイア
グラムである。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 エドガー フアルクナー オーストリア国 ウイーン，ストロベル ガツセ ９ (72)発明者 シルビア ヨツタ リンドナー オーストリア国 ペルクトルトスドル フ，ゾセンストラーセ ６ (56)参考文献 特開 昭57−79897（ＪＰ，Ａ) 特開 昭55−94320（ＪＰ，Ａ) 特開 昭59−25689（ＪＰ，Ａ) 特開 昭59−132892（ＪＰ，Ａ) 欧州特許43980（ＥＰ，Ａ)
Claims (7)
- 【請求項１】インターフェロン遺伝子、好ましくはアミ
ノ酸配列： を有するヒトα−インターフェロンをコードする遺伝子
を含有する宿主生物、好ましくは大腸菌を慣用条件で培
養し、通常の生育期間後、好ましくはメチオニンインタ
ーフェロンの生成が20％未満、好ましくは５％未満、と
くに好ましくは１％未満の時点で、細胞を殺滅、好まし
くはpH2においてホモゲナイザー中で破壊して収穫し、
発現インターフェロンを常法で取り出し、細胞残屑をわ
ずかにアルカリ性のメジウム中で除去し、インターフェ
ロンを濃縮して、異なる吸着剤を用いた２本のカラムを
互に直接連結して、第１のカラムから出た溶出液が直接
第２のカラムに入るようにしたクロマトグラフィー（以
下、これを双頭クロマトグラフィーという。）による予
備精製に付し、溶出液のpHを4.0〜4.8に調整して不純物
を除去し、インターフェロンを最終的に陽イオン交換カ
ラム上、好ましくはMONO−Ｓ、HR10/10型陽イオン交換
樹脂と溶出液として揮発性緩衝液、望ましくは、0.1〜
1.0M、好ましくは0.1〜0.5M酢酸アンモニウム緩衝液か
ら調製した直線濃度勾配、pH4.0〜5.0好ましくはpH4.5
を用いてクロマトグラフィーに付して精製し、ついで凍
結乾燥することを特徴とする組換えα−インターフェロ
ンの製造方法。 - 【請求項２】双頭クロマトグラフィーは、予備セルロー
スカラム好ましくはDE−52セルロースとアフィニティー
クロマトグラフィー好ましくは担体に結合させたモノク
ロナール抗インターフェロンIgG抗体、さらに特定すれ
ばモノクロナール抗体EBI1からなり、精製すべき物質
は、両カラムを通して適当な洗浄液好ましくはトリス−
NaCl緩衝液pH7.5で洗浄し、ついでα−インターフェロ
ンをアフィニティーカラムから適当な溶出液好ましくは
25％エチレングリコール中0.1Mクエン酸で溶出する特許
請求の範囲第１項記載の製造方法。 - 【請求項３】双頭クロマトグラフィーからの溶出液はpH
を4.5に調整して不純物を除去する特許請求の範囲第１
項および第２項のいずれかに記載の製造方法。 - 【請求項４】メチオニンインターフェロン含量５％未満
で、還元型やα−インターフェロンのフラグメントを含
まず、オリゴマー含量0.2％未満、ダイマー／トリマー
／テトラマー含量２％未満で、モノマー含量の90％以上
が天然モノマーインターフェロンからなる、均一、純粋
な組換えα−インターフェロンを製造する特許請求の範
囲第１項から第３項までのいずれかに記載の製造方法。 - 【請求項５】メチオニンインターフェロン含量５％未満
で、還元型やα−インターフェロンのフラグメントを含
まず、オリゴマー含量0.2％未満、ダイマー／トリマー
／テトラマー含量２％未満で、天然モノマーインターフ
ェロンは位置１と98および29と138のシスティンの間に
ジスルフィドを有し、アミノ酸配列： を有する、均一、純粋な組換えα−インターフェロンを
製造する特許請求の範囲第１項から第４項までのいずれ
かに記載の製造方法。 - 【請求項６】固体α−インターフェロンを製造する特許
請求の範囲第１項から第５項までのいずれかに記載の製
造方法。 - 【請求項７】非免疫原性α−インターフェロンを製造す
る特許請求の範囲第１項から第６項までのいずれかに記
載の製造方法。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE3515336A DE3515336C2 (de) | 1985-04-27 | 1985-04-27 | Verfahren zur Herstellung und Reinigung von â-Interferon |
| DE3515336.9 | 1985-04-27 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS61282098A JPS61282098A (ja) | 1986-12-12 |
| JP2566919B2 true JP2566919B2 (ja) | 1996-12-25 |
Family
ID=6269344
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP61099256A Expired - Lifetime JP2566919B2 (ja) | 1985-04-27 | 1986-04-28 | α−インタ−フエロンの製造方法 |
Country Status (20)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0203382B1 (ja) |
| JP (1) | JP2566919B2 (ja) |
| KR (1) | KR940010024B1 (ja) |
| AT (1) | ATE94588T1 (ja) |
| AU (1) | AU598460B2 (ja) |
| CA (1) | CA1340281C (ja) |
| DE (2) | DE3515336C2 (ja) |
| DK (1) | DK186486A (ja) |
| ES (1) | ES8707554A1 (ja) |
| FI (1) | FI861748A (ja) |
| GR (1) | GR861093B (ja) |
| HU (1) | HU202883B (ja) |
| IE (1) | IE61444B1 (ja) |
| IL (1) | IL78604A (ja) |
| NO (1) | NO166727C (ja) |
| NZ (1) | NZ215969A (ja) |
| PH (1) | PH30912A (ja) |
| PT (1) | PT82452B (ja) |
| SU (1) | SU1591814A3 (ja) |
| ZA (1) | ZA863108B (ja) |
Families Citing this family (9)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4748234A (en) * | 1985-06-26 | 1988-05-31 | Cetus Corporation | Process for recovering refractile bodies containing heterologous proteins from microbial hosts |
| DE3813124A1 (de) * | 1988-04-15 | 1989-10-26 | Krieg Benno | Destillierbare pufferloesungen und ihre anwendungen |
| ES2161793T3 (es) * | 1994-04-09 | 2001-12-16 | Hoffmann La Roche | Proceso para la produccion de alfa-interferona. |
| KR100369582B1 (ko) * | 1995-09-04 | 2003-04-03 | 동아제약 주식회사 | 재조합알파-인터페론의정제방법 |
| HU228265B1 (en) * | 1998-11-12 | 2013-02-28 | Merck Sharp & Dohme | Methods of conversion of interferon isoforms and products thereof |
| ITBO20010426A1 (it) * | 2001-07-06 | 2003-01-06 | Alfa Wassermann Spa | Processo per la purificazione di proteine farmacologicamente attive mediante cromatografia in scambio cationico |
| US6967241B2 (en) | 2002-09-06 | 2005-11-22 | Genentech, Inc. | Process for protein extraction |
| GB0818228D0 (en) * | 2008-10-06 | 2008-11-12 | Avecia Biolog Ltd | Purification process |
| CN114814000B (zh) * | 2022-03-30 | 2024-07-23 | 深圳科兴药业有限公司 | 重组人干扰素的含量检测方法 |
Family Cites Families (9)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| ZA796175B (en) * | 1978-11-24 | 1980-11-26 | Hoffmann La Roche | Purified proteins and process therefor |
| FI77877C (fi) * | 1979-04-20 | 1989-05-10 | Technobiotic Ltd | Foerfarande foer framstaellning och rening av human le-formig interferonprotein. |
| ZA814375B (en) * | 1980-07-01 | 1982-07-28 | Hoffmann La Roche | Interferons and process for their preparation |
| CH657141A5 (de) * | 1980-07-01 | 1986-08-15 | Hoffmann La Roche | Dns-sequenzen, rekombinante expressionsvektoren zur mikrobiellen herstellung von human-leukozyten-interferonen und transformierte mikroorganismen. |
| US4364863A (en) * | 1980-12-29 | 1982-12-21 | Schering Corporation | Extraction of interferon from bacteria |
| DE3220116A1 (de) * | 1982-05-28 | 1983-12-01 | Dr. Karl Thomae Gmbh, 7950 Biberach | Mikrobiologisch hergestellte (alpha)- und ss-interferone, dna-sequenzen, die fuer diese interferone codieren, mikroorganismen, die diese genetische information enthalten, und verfahren zu ihrer herstellung |
| US4534906A (en) * | 1982-11-01 | 1985-08-13 | Genentech, Inc. | Removal of impurities from human leukocyte interferon preparations |
| EP0116201B1 (en) * | 1983-01-12 | 1992-04-22 | Chiron Corporation | Secretory expression in eukaryotes |
| DE3306060A1 (de) * | 1983-02-22 | 1984-08-23 | Boehringer Ingelheim International GmbH, 6507 Ingelheim | Neue immunglobulin-produzierende hybridzellinien, deren verwendung und verfahren zu deren herstellung |
-
1985
- 1985-04-27 DE DE3515336A patent/DE3515336C2/de not_active Expired - Fee Related
-
1986
- 1986-04-23 DK DK186486A patent/DK186486A/da not_active Application Discontinuation
- 1986-04-23 IL IL78604A patent/IL78604A/xx not_active IP Right Cessation
- 1986-04-24 GR GR861093A patent/GR861093B/el unknown
- 1986-04-24 PT PT82452A patent/PT82452B/pt not_active IP Right Cessation
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