JPH02115196A

JPH02115196A - エリスロポエチンの精製法

Info

Publication number: JPH02115196A
Application number: JP1232690A
Authority: JP
Inventors: Edwin Howard Merrifield; エドウィン・ハワード・メリフィールド
Original assignee: BIOCLONES Pty Ltd
Current assignee: BIOCLONES Pty Ltd
Priority date: 1988-09-07
Filing date: 1989-09-07
Publication date: 1990-04-27
Also published as: AU4104889A; EP0358463A1

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】発明の分野本発明は、外因性ＤＮＡ配列の原核生物または真核生物
宿主発現の産物であるヒト・エリスロポエチン（ＥＰＯ
）糖蛋白を、それを含有する培養物から精製する方法お
よびかく得られたヒトＥＰＯ糖蛋白に関する。

発明の背景ＥＰＯは分子量が約３４０００ダルトンの酸性糖蛋白で
ある。該ポリペプチド鎖は１６６個のアミノ酸よりなり
、リーダー鎖が２７個のアミノ酸で、糖含量は２４−３
１％である。ＥＰＯは哺乳動物における赤血球細胞形成
の一次レギュレーターである。ＥＰＯは、骨髄中の原始
前駆体細胞を、ヘモグロビンを成熟させ、合成し、かつ
赤血球細胞として循環系に放出される前赤芽球へ変換す
るのを刺激することによって赤血球生産を増加させる。

ＥＰＯは腎臓によって産生される。

ＤＮＡ組換え技術の出現前においては、貧血ヒツジの血
漿からの精製によって少量のＥＰＯが得られ、ヒトＥＰ
Ｏは無形成貧血患者の尿から得られていた。ヒトＥＰＯ
精製の１つの方法は、ティ・ミャケ、シイ・ワンプおよ
びイー・ゴールドワサー（Ｔ　Ｍｉｙａｋｅ、　ＣＫｕ
ｎｇ　ａｎｄ　Ｅ　Ｇｏｌｄｗａｓｓｅｒ）による「ヒ
ト・エリスロボエチンの精製（Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏ
ｎｏｒ　Ｈｕｍａｎ　ＥｒＹｔ、ｈｒｏｐｏｉｅｔｉｎ
）Ｊなる標題の報告文、ザ・ジャーナル・オブ・バイオ
口・ジカル・ケミストリー（丁ｈｅ　Ｊｏｕｒｎａｌ　
ｏｆ　Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）、
２５２巻、１５号、５５５８−５５６４頁、１９７７年
、に詳細に記載されている。この報告文に従い、無形成
貧血患者の尿由来のヒトＥＰＯが見たところ均質に精製
された。イオン交換クロマトグラフィー、エタノール沈
澱、ゲル濾過、および吸着クロマトグラフィーを含む７
エ程法により、７０４００ユニット／ｍｇ蛋白の効力の
ものが２１　％の収率で調製された。これは、９３０の
純化ファクター（ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｆａｃｔ
ｏｒ）を示す。該精製されたホルモンはｐ　Ｈ’ｌのポ
リアクリルアミドゲルにおいて、ｐＨ７のドデンル硫酸
ナトリウムの存在において、およびｐＨ６のＴｒｉｔｏ
ｎ　Ｘ−１００の存在において単一の成分を有していた
。ドデシル硫酸ナトリウムゲル電気泳動によって、効力
および分子サイズが同一であるがｐ　Ｈ９における移動
度がわずかに異なる２つの画分が分画の最終工程で得ら
れた。

ヒト・エリスロボエチンについての引き続いて（７）　
研究成果は、エム・ニス・ドーダル、エフ・エフ・ワン
プおよびイー・ゴールドワサー（Ｍ　Ｓ　Ｄ。

ｒｄａｌ、Ｆ　Ｆ　Ｗａｎｇ　ａｎｄ　Ｅ　Ｇｏｌｄｗ
ａｓｓｅｒ）による「エリスロポエチン作用における炭
化水素の役割（ＴｈｅＲｏｌｅ　ｏｆ　Ｃａｒｂｏｈｙ
ｄｒａＬｅ　ｉｎ　Ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｉｅｔｉｎ　Ａ
ｃｔｉｏｎ）Ｊなる標題の報告文、エンドクリノロジー
（Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ）、１１６巻、６号、２
２９３−２２９９頁、１９８５年、に報告されている。

この報告文はミャケら（Ｍｉｙａｋｅ　ａｔ　ａｌ）に
よる報告文に詳細に記載されている方法で得られＩ：ヒ
トＥＰＯの２つの形態の炭化水素組成を扱っている。ド
ルダールら（Ｄｏｒｄａｌ　ｅｔ　ａｌ）によって決定
されたごとくσ−ＥＰＯおよびβ−ＥＰＯと名付けられ
た２つの画分の炭化水素組成を以下の表に記載する。

第１表ＥＰＯの炭化水素組成糖（ｎｇ／μｇ）ｔ　−ＥＰＯＩ−ＥＰＯＰフコース　　　　１８土３．５　　１６士０．４　　　
　ＮＳＣガラクトース　　５６土６．４　　４８±０．
７　　　　ＮＳＤマンノース　　　４１土６．０　　３
４±４．２　　　　Ｎ５ＤＮ−アセチル　　６９±０．
９　　４８±３．２　　Ｐ＜０．００１グルコサミンＮ−アセチル１３０±１７，７９５土７．６Ｐ＜０．０５ノイラミン酸この報告文は、ヒト尿由来のＥＰＯはその炭化水素組成
に関して不均質であることを示す。

エクスベレンチア（Ｅｘｐｅｒｅｎｔｉａ）、２９．７
５８Ｘ（１９７３）の注において、シーバー、イスコブ
およびウィンターハルター（Ｓｉｅｂｅｒ、１ｓｃｏｖ
ｅ　ａｎｄＷｉｎｔｅｒｈａｌｔ６ｒ）は、安息香酸吸
着によって糖蛋白含量について、およびサイズの均一性
についてすでに選択されたヒトｖＰ、ＥＰＯの調製物の
さらなる精製にコンカナバリン−Ａ−セファロースを適
用したことを報告している。Ｃａｎ−Ａ−セファロース
カラムに非付着性の物質はずべての初期ＥＰＯ活性を含
んでいた。彼らは、レクチンを用いるアフィニティーク
ロマトグラフィーによって、同様のサイズの不純物糖蛋
白（該不純物糖蛋白はそれに付着しないＥＰＯと共にレ
クチンに付着している）をＥＰＯ調製物から選択的に除
くことができると結論した。

［不溶化したフィトヘマグルチニン上でのヒト尿エリス
ロポエチンおよび顆粒細胞コロニー刺激因子のクロマト
グラフィー（Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ　ｏｆＨｕ
ｍａｎ　Ｕｒｉｎａｒｙ　Ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｉｅｔｉ
ｎ　ａｎｄ　ＧｒａｎｕｌｏｃｙｔｅＣｏｌｏｎｙ−５
ｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ　Ｆａｃｔｏｒ　ｏｎ　Ｉｎｓｏ
ｌｕｂｌｉｚｅｄｐｈｙｔｏｈａｅｍａｇｇｔｕｔｉｎ
ｉｎ）」なる標題の後期の報告文、バイオシミ力・工・
バイオフィジカ・アクタ（Ｂｉ−ｏｃｈｉｍｉｃａ　ｅ
ｔ　Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ　Ａｃｔａ）、４９６（１９
７７）１４６−１５４において、シーバー（Ｓｉｅｂｅ
ｒ）は、ヒト尿ＥＰＯが、アガロースまたは多孔性ガラ
スにカップリングしたフィトヘマグルチニン、インゲン
マメ属ゴガツササゲ（Ｐｈａｓｅｏ　１ｕｓ）からのレ
クチンに吸着され、塩化マグネシウム飽和溶液によって
定量的な溶出されてその部分的精製物が達成されること
を報告している。シーバー（Ｓ　１ｅｂｅｒ）によって
用いられたＥＰＯは、最初、安息香酸への吸着、イオン
交換クロマトグラフィーによるさらなる精製、およびあ
る場合にはコンカナバリン−Ａ−セファロース上でのさ
らなるアフィニティークロマトグラフィー、ゲル濾過お
よびリン酸カルシウム上でのクロマトグラフィーによっ
て尿から抽出された。ヒト尿ＥＰ○のＤＥＡＥ−セルロ
ース−１８’ＩＪＩ　Ｋ　料をフィトヘマグルチニン−
セファ０−ス上のクロマトグラフィーに付すと、実質的
にすべての活性が結合された。ＭｇＣ０，２の飽和溶液
でほとんど定量的な溶出を行って１１゜８倍増加した特
異的活性を有する物質が得られた。

さらに、安息香酸への吸着およびＤＥＡＥセルロース、
コンカナバリン−Ａ−セファロース、セファデックスｃ
−ｉｏｏおよびリン酸カルシウム上のクロマトグラフィ
ーによってすでに精製されたヒ）１ｉＥＰＯの試料をフ
ィトヘマグルチニン−セファロース上のクロマトグラフ
ィーに付すと、さらに６．７倍の特異的活性の増加が達
成された。この物質は、電気泳動に付すと、３つのブロ
ードなバンド、１つのシャープなバンドおよび種々の非
常に弱いバンドを示した。かくして、該精製法はＥＰＯ
を含有する均質な調製物を得るには至もなかっｔこ。

［エリスロポエチン：レクチンーアガロース誘導体での
アフィニティークロマトグラフィーによる単離（Ｅｒｙ
ｔｈｒｏｐｏｉｅｔｉｎ：　ｌ５ｏｌａｔｉｏｎ　ｂｙ
　ａｆｆｉｎｉｔｙｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ　ｗ
ｉｔｈ　Ｉｅｃｔｉｎ−ａｇａｒｏｓｅ　ｄｅｒｉｖａ
ｔ−ｉｖｅｓ）Ｊ、プロシーディングズ・オブ・ナショ
ナル・アカデミ−・オブ・サンエンシズ（Ｐｒｏｃ、　
Ｎａｔｌ。

Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　）Ｕ　Ｓ　Ａ、　７４巻、１０
号、４６３３−４６３５頁、１９７７年８月、なる探題
の報告文において、スピバク、スモールおよびホレンベ
ルグ（Ｓｐｉｖａｋ、Ｓｍａ１１　ａｎｄ　Ｈｏ１１ｅ
ｎｂｅｒｇ）は、アガロース−結合レクチンを用いるア
フィニティークロマトグラフィーを用いてヒツジ血漿お
よびヒト尿ＥＰ○の粗製調製物からＥＰＯを単離したこ
とを報告している。６種のレクチン（麦芽凝集素、フィ
トヘマグルチニン、リンナス・コミュニス（Ｒｉｃｉ−
ｎｕｓ　ｃｏｍｍｕｎｉｓ）　ｌ　２０、大豆凝集素、
フンカナバリンＡ１およびリムリン（ｌｉｍｕｌｉｎ）
）が調べられた。麦芽凝集素−アガロースおよびフィト
ヘマグルチニン−アガロース誘導体のみがエリスロポエ
チンについて有意な親和性を有していた。ヒト尿ＥＰＯ
については、麦芽凝集素−アガロースカラムを用い、適
当なＮ−アセチルグルコサミンのごとき適当なレクチン
−特異的糖で溶出し、ＥＰＯは９５％を越える最初の出
発蛋白から分離でき、その結果８倍の精製および４０％
の回収が達成された。著者らによると、回収されたＥＰ
Ｏの特異的活性および糖溶出物からの蛋白の電気泳動分
析により、アフィニティークロマトグラフィーによって
精製された物質は、出発物質よりはるかに少ない成分よ
り成るものの、なおＥＰ○以外に多数の蛋白を含有する
ことが示された。

「エリスロボエチンの部分的精製についての固定化レク
チンおよび他のりガントの使用（Ｕｓｅ　ｏｆＩｍｍｏ
ｂｉｌｉｚｅｄＬｅｃｔｉｎｓａｎｄＯｔｈｅｒＬｉｇ
ａｎｄｓｆｏｒｔｈｅ　Ｐａｒｔｉａｌ　Ｐｕｒｉｆｉ
ｃａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｉｅｔｉｎ）
」、ブラッド（Ｂｌｏｏｄ）、５２巻、６号（１２月）
、１９７８年、なる標題のさらなる報告文において、ス
ビバク、スモール、シャーペルおよびホレンベルグ（Ｓ
ｐｉｖａｋ、　Ｓｍａ１１、　５ｈａｐｅｒ　ａｎｄ　
）（ｏ１１ｅｎｂｅｒｇ）は、該ホルモンの粗製調製物
中の汚染蛋白がらＥＰＯを単離するための種々のアフィ
ニティー吸着剤の能力について報告している。彼らは、
アフィニティータロマドグラフィーはＥＰＯの部分的精
製を達成するのに用いることができるが、均質に精製さ
れたＥＰＯを得るには、アフィニティークロマトグラフ
ィー以外に他の分離技術に頼る必要があると結論した。

ヒト尿ＥＰＯについては、彼らはアガロース−結合Ｃｏ
ｎ−Ａ上のクロマトグラフィーで２倍の精製および８０
％回収を得；アガロース−結合ＷＧＡまたはＰＨＡで、
該ホルモンをアフィニティー吸着剤から放出させるのに
選択した剤に依存して、２ないし８倍の精製を達成した
。

それらのデータは、ＥＰＯをアガロース−ＷＧＡから溶
出させるにおいて、二糖Ｎ、Ｎ−ジアセチルキトビオー
スは単糖Ｎ−アセチルグルコサミンよりも効果的であり
、一方、塩酸グアニジンはアガロース−ＰＨＡをリガン
ドとして使用した場合に効果的な溶出剤であることを示
している。

「疎水性相互作用クロマトグラフィーを用いるヒト・エ
リスロボエチンの単離についての新しい調製方法（Ａ　
Ｎｅｗ　Ｐｒｅｐａｒａｔｉｖｅ　Ｍｅｔｈｏｄ　ｆｏ
ｒ　ｌ５ｏｌａｔｉｏｎ　　ｏｆ　　Ｈｕｍａｎ　　Ｅ
ｒｙｔｈｒｏｐｏｉｅｔｉｎ　　ｗｉｔｈ　　Ｈｙｄｒ
ｏｐｈｏｂ−ｉｃ　Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ　Ｃｈｒｏ
ｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）ｊ　、ブラッド（Ｂｌｏｏｄ）
、５６巻、４号（１０月）、１９８０年、６２０頁、な
る標題の報告文において、リー・ファン（Ｌｅｅ−Ｈｕ
ａｎｇ）は、フェニル−セファロースＣＬＪＢ上の疎水
性相互作用クロマトグラフィーを用いるヒト尿ＥＰＯの
単離についての新しい調製方法について報告している。

この報告文において、リー・ファン（Ｌｅｅ−Ｈｕａｎ
ｇ）は、Ｃｏｎ−Ａ−セファロース４Ｂ、続いてのＷＧ
−セファロース６ＭＢまたはＰＨＡ　（Ｅ）−セファロ
ース４Ｂ上のアフィニティークロマトグラフィーは粗製
尿濃縮物の剋理における最初の工程として同等に有用で
あると述べている。しかしながら、銀色素および他の不
純物がこれらのレクチンに不可逆的に結合し、それらの
能力の十分な再生は可能ではなかった。これらのカラム
の価格およびそれらの維持は例外的に高いものであった
。加えて、溶出剤Ｎ−アセチルグルコサミンまたはＮ、
Ｎ−ジアセチルキトビオースはＮａＯＨおよびエチレン
グリコールよりもかなり高価である。操作費用は大き過
ぎて、それらのレクチンを粗製尿試料の調製処理にルー
チン的に使用するには適さない。しかしながら、最初の
疎水性相互作用クロマトグラフィーの後、後期段階にお
いてこれらの技術を精製手法への取り入れるのは価値あ
ることが判明した。尿素色素の大部分はフェニル−セフ
ァロースＣＬ４Ｂによって除去され、かくして、これら
のレクチンの十分な再生を達成することができる。

「急速５工程法によるヒト・エリスロポエチンの均質物
への精製（Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｈｕｍａ
ｎ　Ｅｒｙｔ−ｈｒｏｐｏｉｅｔｉｎ　ｔｏ　Ｈｏｍｏ
ｇｅｎｅｉｔｙ　ｂｙ　ａ　Ｒａｐｉｄ　Ｆｉｖｅ−３
Ｌｅｐ　Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅ）Ｊ　、ブラッド（Ｂｌｏ
ｏｄ）、６７巻、１号（１月）、１９８６年、７１ない
し７９頁、なる標題の報告文において、クリスタル、バ
ンクラツ、ファルバーおよびスマート（Ｋｒｙｓｔａｌ
、　Ｐａｎｋｒａｔｚ、Ｆａｒｂｅｒ　ａｎｄ　Ｓｍａ
ｒｔ）は、５工程法を用いてヒト尿ＥＰＯを精製して収
率２５％で８００００／ｍｇの能力を持つ調製物を得た
ことを報告している。該５工程は、（１）ＣＭアフィー
ゲルブル−（Ａｆｆｉ−Ｇｅｌ　Ｂｌｕｅ）上のアフィ
ニティークロマトグラフィー　（２）クロマトフオーカ
シング、（３）麦芽レクチン（またはヒドロキシル−ア
パタイト）クロマトグラフィー　（４）フェニルカラム
を用いる逆相高速液体クロマトグラフィ＝（ＨＰＬＣ）
、および（５）調製ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアク
リルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）を含む。

この報告文の著者がクロマトフォー力シング工程からの
ある種のＥＰＯ調製物は麦芽分別によく適合していない
、すなわちＥＰＯ活性のほとんどはレクチンに結合しな
いことを指摘しているのは注目すべきである。これらの
場合、著者はヒドロキンルーアパタイトクロマトグラフ
ィーを用いた。

要約すると、いくつかの報告文はレクチン類を用いるヒ
トＲ試料からのＥＰＯの部分的精製を教示するが、この
プロセスはＥＰＯの精製についての単一工程プロセスと
して効果的でなく、さらにこのプロセスを用いると特異
的活性が最大１２倍の精製が達成できるにすぎないと結
論される。

ＤＮＡ組換え技術の出現とともに、ヒトＥＰ○の第一次
構造コンフォメーションの一部またはすべておよび生物
学的特性の１またはそれ以上を有する糖蛋白が産生され
てきた（該糖蛋白は外因性ＤＮＡ配列の原核生物または
真核生物宿主発現の産物である）。例えば、ＥＰＯまた
はその同族体のアミノ酸残基の配列の一部またはすべて
についてコード付けするゲノミックＤＮＡ、ｃＤＮＡお
よび製造されたＤＮＡ配列が、使用される自律複製プラ
スミドまたはウィルスベクターに組み込まれて培地中の
細菌、酵母またはを椎動物細胞のごとき適当な原核生物
または真核生物宿主細胞を形質転換またはトランスフェ
クトすることが行われてきた。かかる細胞の培養の結果
、ＥＰＯについてコード付けする遺伝子または遺伝子類
が発現され、ヒトＥＰＯの一次構造コンフォメージョン
の一部またはすべておよび生物学的特性の１またはそれ
以上ををするポリペプチドが産生され、次いで、細胞培
養においてかかるポリペプチドがグリコジル化されてＥ
ＰＯ［蛋白が産生される。培養培地または細胞溶解物も
しくは断片からの単離に際し、ＤＮＡ配列発現の産物は
、例えば、ヒトまたはサル種起源のＥＰＯの免疫学的特
性ならびにｉｎ　ｖｉｔｒｏおよびｉｎ　ｖｉｖｏ生物
学的活性を示す。これらの遺伝子工学によるＥＰＯ糖蛋
白はそれらの精製について新しい方法が開発されるのを
必要としている。

ヘウィソク・アンド・シーク（Ｈｅｗｉｃｋ　ａｎｄ　
５ｅｅ−ｈｒａ）に与えられた米国特許第４６７７１９
５号は、２８０ナノメーターにおいて吸光度単位当り少
なくとも約８００００　１Ｕの特異的活性を有する部分
的に精製されたＥＰＯを逆相高速液体クロマトグラフィ
ーによって処理し、次いで逆相高速液体クロマトグラフ
ィー上で単一のピークとして移動しかつ２８０ナノメー
タにおける吸光度単位当り少なくとも＋６００００　１
０の特異的活性によって特徴付けられる均質なヒトＥＰ
Ｏをそれから溶出させることを特徴とする（無形成貧血
に罹った患者の血液または尿からのもの、または細胞培
養および発酵法によるＥＰＯの産生用生物中に導入され
た遺伝子工学ベクターの発現からのものであってもよい
）ヒトＥＰＯの精製法を開示している。しかしながら、
この精製法は、ヒトＥＰＯを含有する少量の培養物を扱
うことができるにすぎず、しかも費用がかかるという不
利を有している。

かくして、外因性ＤＮＡ配列の原核生物または真核生物
宿主発現の産物であるヒトＥＰＯ糖蛋白の精製法の改良
が望まれている。

発明の開示本発明により、（ａ）レクチンが付着するクロマトグラフィーで用いる
のに適した支持体に培養物を接触させて選択的にヒトＥ
ＰＯ糖蛋白を結合させ；次いで、（ｂ）適当な溶出剤で
該支持体からヒトＥＰＯ糖蛋白を溶出させる工程を包含
することを特徴とする外因性ＤＮＡ配列の原核生物また
は真核生物宿主発現の産物であるヒトＥＰＯ糖蛋白を、
それを含有する培養物から精製する方法が提供される。

本発明の方法は、工程（ａ）に先立つ培養物から工程（
ｂ）の後の溶出物にかけて５０倍、より好ま゛しくは８
０倍、ＥＰＯの特異的活性を増加させる。

好ましくは、本発明の方法は、例えば、クロマトグラフ
ィーによってヒトＥＰＯ糖蛋白を溶出物から分離するこ
とよりなる第３の工程、すなわち工程（Ｃ）を含む。

工程（ｂ）において、適当な溶出剤は好ましくはＮ−ア
セチルグルコサミンである。

精製されるべき培養物はいずれの先行精製工程にも付さ
れていない１種またはそれ以上のヒトＥＰＯ糖蛋白を含
有する培養物上澄みであってよい。

別法として、精製されるべき培養物は、１種またはそれ
以上のヒトＥＰＯ糖蛋白を含有する培養物上澄みをアフ
ィニティークロマトグラフィー支持体と接触させてヒト
ＥＰＯｆ１１？ｉ白または糖蛋白類を選択的に結合させ
、次いで適当な溶出剤でヒトＥＰＯＭ蛋白または糖蛋白
類を該支持体から溶出させて溶出物を得ることよりなる
前処理工程からの溶出物であってもよい。

好ましくは、ヒトＥＰＯは、ジエイ・ニス・ボウエル、
ケイ・エル・バーフナ−、アール・ブイ・レボ、および
ジェイ・ダブリュー・アダムソン（Ｊ　Ｓ　Ｐｏｗｅ１
１、にＬ　Ｂｅｒｋｎｅｒ、　ＲＶ　Ｌｅｖｏ、　ａｎ
ｄ　Ｊ　ＷＡｄａｍｓｏｎ’）、プロシーディングズ・
オブ・ナショナル・アカデミ−・オブ・サイエンシズ（
Ｐｒｏｃ、　Ｎａ−ｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　）
、８３巻、６４６５ないし６４４９頁、１９８６年９月
、の方法に従い、哺乳動物細胞系、より好ましくはベビ
ー・ハムスター腎細胞系によって産生されたものである
。

本発明のもう１つの態様により、本発明の方法による産
生物が提供される。

本発明の方法は、得られる産生物が実質的に均質である
ように、培養物に含有され得る他のヒトＥＰＯ糖蛋白よ
りも特定のヒトＥＰＯ糖蛋白または特定のクラスのヒト
ＥＰＯ糖蛋白類について選択的であると考えられる。

本発明のさらなる態様により、腎臓病についての腎透析
中の患者で見い出される貧血、癌に伴う貧血、無形成貧
血、血液喪失に起因する貧血、慢性腎臓病に伴う貧血を
包含する貧血の治療に用いるだめの、および供血に先立
って赤血球細胞質量を増加させるための本発明の方法に
よる産生物が提供される。

本発明のなおさらなる態様により、本発明の方法による
産生物を含有する医薬組成物が提供される。

本発明の第１の態様は、外因性ＤＮＡ配列の原核生物ま
たは真核生物宿主発現の産物であるヒトＥＰＯ糖蛋白を
それを含有する培地から精製する方法である。

本発明の方法の第１の工程では、レクチンが付着するク
ロマトグラフィーで用いるのに適した支持体に培養物を
接触させて選択的にヒトＥＰＯ糖蛋白を結合させる。

該支持体は、レクチンの活性を変化させることなくレク
チンを付着させることができるいずれの適当な支持体で
あってもよい。適当な支持体はセファロースである。

レクチンはいずれの適当なレクチンであってもよい。レ
クチンはＮ−アセチルグルコサミンおよび／まｔ；は（
Ｎ−アセチルノイラミン酸としても公知である）シアル
酸残基を認識できなければならない。例えば、レクチン
はジャガイモレクチンまたは麦芽レクチンであってよい
。好ましいレクチンは麦芽レクチンである。

一般に、レクチンが付着する支持体は、ヒトＥＰＯ糖蛋
白を含有する培養物がカラムを通過できるように適当な
カラム中に入れる。

本発明の方法はヒトＥＰＯ糖蛋白を含有する培養物を最
初に精製してなくても実施できることは注目すべきであ
る。かくして、該培養物は、例えば、いずれの先行精製
工程にも付されていない１種またはそれ以上のヒトＥＰ
○糖蛋白を含有する培養物上澄みであってもよい。

別法として、精製すべき培養物は、１種またはそれ以上
のヒトＥＰＯ糖蛋白を含有する培養物上澄みをアフィニ
ティークロマトグラフィー支持体と接触させてヒトＥＰ
Ｏ糖蛋白または糖蛋白類を選択的に結合させ、次いで適
当な溶出剤でヒトＥＰＯ糖蛋白または糖蛋白類を該支持
体から溶出させて溶出物を得ることよりなる前処理工程
からの溶出物であってもよい。該支持体は、例えば、ブ
ルー・セファ０−ス（Ｂｌｕｅ　５ｅｐｈａｒｏｓｅ）
のごときセフ７０−スであってよく、溶出剤は塩化ナト
リウムのリン酸ナトリウムのごとき適当な緩衝液中溶液
であってよい。

本発明の方法の第２の工程において、該支持体に結合し
たヒトＥＰＯ糖蛋白を適当な溶出剤でそこから溶出させ
る。好ましい溶出剤はＮ−アセチルグルコサミンである
。

本発明の方法の第３の任意的工程では、ヒトＥＰＯ糖蛋
白を溶出剤から分離する。ヒｌ−Ｅ　Ｐ　Ｏ糖蛋白を溶
出剤および他の少量不純物から分離する好ましい方法は
、例えばＤＥＡＥ−セファロースカラム上のクロマトグ
ラフィーによる。

出発培養物は培養物上澄みであってもよいか、あるいは
１種またはそれ以上のヒトＥＰＯ糖蛋白を含有していて
もよい培養物上澄みから得たものであってもよい。好ま
しくは、培養物上澄みは哺乳動物細胞系によって産生さ
れたもの、好ましくはベビー・ハムスター腎細胞系によ
って産生されたものである。

本発明の方法は培養物中に見い出すことができる他のヒ
トＥＰＯ糖蛋白よりも特定のヒトＥＰＯ糖蛋白または特
定のクラスのヒトＥＰＯ糖蛋白類について選択すること
が判明した。

本発明の方法を用いると、蛋白１ｍｇ当り２０００Ｕの
特異的活性を有する培養物から、標準的な公知濃度、す
なわち１罰当り組換体ヒトＥＰＯ５０μｇを用いて決定
して蛋白１ｍｇ当り２０００００　Ｕ±１００００　　
Ｕの特異的活性を有する組換体ヒトＥＰＯ糖蛋白を産生
できた。すなわち、特異的活性の１００倍増加である。

これは、従前の公知プロセスを利用して行ったものより
も特異的活性がかなり改良されている。

本発明の第２の態様は均質に精製されたヒトＥＰＯまた
はヒトＥＰＯ類のクラスであると考えられる本発明の方
法による産生物である。

本発明の方法による産生物は種々のタイプの貧血の治療
に用いることができ、この目的にはかがる使用に適した
医薬組成物に処方できる。

衷亙久以下に実施例を挙げて本発明をさらに詳しく説明する。

実施例１本実施例は２工程法を用いる細胞培養物上澄み流体（Ｃ
Ｓ　Ｆ）から直接にヒト組換体ＥＰ○を精製する方法に
関する。

粗製細胞培養物上澄み流体をリン酸ナトリウム（ｐＨ７
，０−７，５、終濃度０．０１Ｍ）で緩衝化し、麦芽レ
クチン−セファロースカラムに直接適用する。このカラ
ムを５倍容量の０．０１Ｍ！Ｊン酸ナトツナトリウム緩
衝液して非結合物質を除去し、次いで、０．０１Ｍリン
酸ナトリウム緩衝液中の０．２Ｍ　Ｎ−アセチルグルコ
サミンで溶出してＥＰＯを放出させる。このカラムから
溶出した物質を、あらかじめリン酸塩緩衝液（０，０１
Ｍ、ｐＨ７，０）で平衡化したＤＥＡＥ−セファロース
カラムに直接ポンプを使用して導入する。

該カラムを１０倍容量の緩衝液で洗浄してＮ−アセチル
グルコサミンの完全除去を確実とし、次いでリン酸緩衝
生理食塩水（ＰＢＳ）で溶出して結合ＥＰＯを放出させ
る。

コーマシーブルーおよび銀染色両法で可視化した場合、
精製ＥＰＯは５ＤＳ−ＰＡＧＥ　（用いた１５％ゲル）
上で単一のバンドとして移動した。

逆相ＨＰＬＣによる分析は、以下の条件下、精製ＥＰＯ
は単一ピークとして溶出され、保持時間は３６−３７分
であることを示した。

カラム：ベックマン・ウルトラポア（Ｂｅｃｋｍａｎ口
１ｔｒａｐｏｒｅ）　　ＲＰＳＣＣ３４，６ｍｍ内径ｘ
　　７５ｃｍ溶媒Ａ：氷水中０．０５％トリフルオロ酢酸溶媒Ｂニア
セトニトリル中の０．０５％トリフルオロ酢酸グラジェント：１分当り１％にて０％Ｂないし７０％検出：２０６ｎｍにおけるＵＶ吸吸光木本法より調製した物質をクリスタル・シイ（Ｋｒｙｓ
ｔａｌ　Ｇ、　）、イクスペリメンタル・ヘマトロジ−
（Ｅｘｐ、　ＨｅｍａＬｏｌ、）、Ｉ　１　（１９８３
）６４９の３Ｈ−チミジンアッセイに従って生物学的活
性について検定すると、蛋白１ミリグラム当り２０００
００ユニット以上の特異的活性を呈する。

前記実施例の６回の試行の結果を以下の第２表に記載す
る。

第２表Ｃ３Ｆ　　ＥＰＯ試行Ｎｏ　　（ｍｆｆ）　（μｇ）ＷＧＬ　　ＤＥＡＥ　　ＷＧＬについての（μｇ）　　
（μｇ）％収率１５４　　１３３　　６１．６１５６　　１３７　　６２．４１５６　　１４８　　６２．４１５５　　１２２　　６２．０１５３　　１３４　　６１．２６　　　　２０　２５０　１５１　　１２７　　６０．
４Ｃ３Ｆ−培養物上澄み流体ＷＧＬ＝麦芽レクチン支持体上で回収されたＥＰＯ量ＤＥＡＥ＝ＤＥＡＥ−セファロース上で溶出剤の除去後
に回収されたＥＰＯ量結果は、麦芽レクチン支持体上で少なくとも６１−６２
％の一致する収率を示す。

残存するＥＰＯは０．１Ｍ　Ｎ−アセチルノイラミン酸
および最終的には４Ｍ塩酸グアニジニウムのごときカオ
トロピック（ｃｈａｏｔｒｏｐｉｃ）剤でカラムを順次
溶出させることによって回収できる。

実施例２細胞培養物上澄み流体（Ｃ５Ｆ）から直接にヒト組換体
ＥＰＯを精製する別法として、Ｃ５Ｆをまず以下の前処
理に付す。

１．５ｍＱ／分で供給するよう設定したマルチチャネル
襦動ポンプを用い、ブルー−セファロースＣＬ−６Ｂ（
ファルマシア（Ｐｈａｒｍａｃ　１ａ））を含有する４
本カラム（ｌｏｍｆ２ゲルキャバンティ）に、粗製Ｃ３
Ｆ（４００ｍ１２／カラム）をポンプで送り込む。粗製
溶液を負荷した後、該カラムを同液速にて０．０１Ｍリ
ン酸ナトリウム緩衝液ｐＨ７，０（２０ｍＱｌカラム）
で洗浄する。

次いで、圧倒的にＥＰＯを含有する結合物質を０．０μ
Ｍリン酸ナトリウム緩衝液ｐＨ７，０（２０ｍＱ／カラ
ム）中の１Ｍ塩化ナトリウムで該カラムから溶出させる
。この段階で、逆相ＨＰＬＣによって検定して調製物は
６５％の純度であり、ブルー−セファロースからの回収
率は８０％である。

ブルー−セファロースは血清アルブミンの除去で第一に
使用されるかなりブロードな特異性のアフィニティー・
マトリックスである。該マトリックスはゲル１ｍＱ当り
１．７−２−３μモルのチバクロンブルー（Ｃ４ｂａｃ
ｒｏｎ　Ｂｌｕｅ）Ｆ　３　Ｇ　−Ａ　（商品名）を含
有する。

次いで、この前処理工程により得られた調製物を実施例
１に記載した２工程法に付す。

本発明の方法により、容易かつ経済的に、ヒトＥＰＯ糖
蛋白を含有する培養物からかなりの量のヒトＥＰＯ糖蛋
白を回収することが可能となる。

さらに、本発明の方法は、精製されるべきヒトＥＰＯを
含有する多量の培養物を扱うことができるという利点を
有する。

発明の背景に記載したごとき先行技術を考慮しても、先
行技術が特異的活性の最大１２倍増加を教示するとして
、本発明の方法が出発培養物と溶出物の間で特異的活性
を１００倍増加させるのは予期せぬことである。さらに
、本発明の方法はＥＰＯを含有する培養物の先行精製な
くして利用できることも予期せぬことである。最後に、
本発明の方法により実質的に均質である産生物が得られ
ることも予期せぬことである。

特許出願人　バイオクローンズ・リミテッド（プロプリエタリ）

Claims

【特許請求の範囲】

（１）（ａ）レクチンが付着するクロマトグラフィーで
用いるのに適した支持体に培養物を接触させて選択的に
ヒト・エリスロポエチン（ＥＰＯ）糖蛋白を結合させ；
次いで、（ｂ）適当な溶出剤で該支持体からヒトＥＰＯ糖蛋白を
溶出させる工程を包含することを特徴とする外因性ＤＮ
Ａ配列の原核生物または真核生物宿主発現の産物である
ヒトＥＰＯ糖蛋白を、それを含有する培養物から精製す
る方法。
（２）（ｃ）ヒトＥＰＯ糖蛋白を該溶出剤から分離する
第３の工程を包含する請求項第（１）記載の方法。
（３）該工程（ｃ）において、ヒトＥＰＯ糖蛋白をクロ
マトグラフィーによって該溶出剤から分離する請求項第
（２）記載の方法。
（４）該工程（ａ）において、該支持体がセファロース
である請求項第（１）ないし第（３）いずれか１つに記
載の方法。
（５）該工程（ａ）において、該レクチンがジャガイモ
・レクチンである請求項第（１）ないし第（４）いずれ
か１つに記載の方法。
（６）該工程（ａ）において、該レクチンが麦芽レクチ
ンである請求項第（１）ないし第（４）いずれか１つに
記載の方法。
（７）該工程（ｂ）において、該溶出剤がＮ−アセチル
グルコサミンである請求項第（１）ないし第（６）いず
れか１つに記載の方法。
（８）該培養物がいずれの先行精製工程にも付されてい
ない１種またはそれ以上のヒトＥＰＯ糖蛋白を含有する
培養物上澄みである請求項第（１）ないし第（７）いず
れか１つに記載の方法。
（９）該培養物上澄みが哺乳動物細胞系によって産生さ
れたものである請求項第（８）記載の方法。
（１０）該培養物上澄みがベビー・ハムスター腎臓細胞
系によって産生されたものである請求項第（９）記載の
方法。
（１１）該培養物が、１種またはそれ以上のヒトＥＰＯ
糖蛋白を含有する培養物上澄みをアフィニティークロマ
トグラフィー支持体に接触させてヒトＥＰＯ糖蛋白また
は糖蛋白類を選択的に結合させ、次いで溶出物を得るの
に適した溶出剤で該支持体からヒトＥＰＯ糖蛋白または
糖蛋白類を溶出させることよりなる前処理工程からの溶
出物である請求項第（１）ないし第（７）いずれか１つ
に記載の方法。
（１２）該培養物上澄みが哺乳動物細胞系によって産生
されたものである請求項第（１１）記載の方法。
（１３）該培養物上澄みがベビー・ハムスター腎臓細胞
系によつて産生されたものである請求項第（１２）記載
の方法。
（１４）ヒトＥＰＯ糖蛋白を含有する培養物から請求項
第（１）ないし第（１３）いずれか１つに記載した方法
によって得た外因性ＤＮＡ配列の原核生物または真核生
物宿主発現の産物であつて、蛋白１ｍｇ当り２００００
０Ｕの特異的活性を有することを特徴とする精製したヒ
トＥＰＯ糖蛋白。
（１５）腎臓病についての腎透析中の患者で見い出され
る貧血、癌に伴う貧血、無形成貧血、血液喪失に起因す
る貧血、慢性腎臓病に伴う貧血を包含する貧血の治療用
の、および供血に先立って赤血球細胞質量を増加させる
ための請求項第（１４）記載の精製したヒトＥＰＯ糖蛋
白。
（１６）請求項第（１４）記載の精製したヒトＥＰＯ糖
蛋白を活性成分として含有することを特徴とする医薬組
成物。