FI68519C - Foerfarande foer framstaellning av interferon - Google Patents
Foerfarande foer framstaellning av interferon Download PDFInfo
- Publication number
- FI68519C FI68519C FI800147A FI800147A FI68519C FI 68519 C FI68519 C FI 68519C FI 800147 A FI800147 A FI 800147A FI 800147 A FI800147 A FI 800147A FI 68519 C FI68519 C FI 68519C
- Authority
- FI
- Finland
- Prior art keywords
- interferon
- cells
- type
- human
- animal
- Prior art date
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
- C07K14/555—Interferons [IFN]
- C07K14/57—IFN-gamma
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
- Y10S435/811—Interferon
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Zoology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Description
1 -n, KUULUTUSJULKAISU , B 11 UTLÄG G NIN G SSKRI FT 6851 9 C (45) Γ a ten UI my"r.:;L'tty 10 10 1925 Patent rerddclat (51) Kv.ik.*/int.ci.4 A 61 K **5/02, C 07 K 15/26, v ; C 12 P 21/00 (21) Patenttihakemus — Patentansfikning 8001 k7 (22) Hakemispäivä — Ansökningsdag ] ~j 01 80 (F«) (23) Alkupäivä — Giltighetsdag 17.01 .80 (41) Tullut julkiseksi — Blivit offentlig ig qη gg
Patentti- ja rekisterihallitus Nähtäväksipanon ja kuul.julkaisun pvm.— jq n/· or
Patent- och registerstyrelsen ' ' Ansökan utlagd och utl.skriften publicerad Δ0 ·u · 5 (32)(33)(31) Pyydetty etuoikeus — Begärd prioritet 1 8.01.79 Japan i-Japan (JP) ^5^-1979 (71) Ken Hayashibara, 9-8, ΐι-chome, H igashi furumatsu, Okayama-shi , Okayama,
Shin Ashida, 148-3, Uchidekasugacho, Ashiya-shi, Hyogo, Japani-Japan(jP) (72) Kaname Sugimoto, Okayama, Shokichi Yuen, Okayama, Japani-Japan(jP) (7*0 Berggren Oy Ab (5*0 Menetelmä interferonin valmistamiseksi - Förfarande för framställning av interferon Tämä keksintö koskee menetelmää ihmisspesifisen, lajia XI olevan interferonin valmistamiseksi, jota voidaan käyttää valmistettaessa sellaisia terapeuttisia ja profylaktisia aineita, jotka ovat tehokkaita lajia II olevalla interferonilla parannettavia sairauksia vastaan.
Interferonilla tarkoitetaan ks. Shigeyasu Kobayashi, "Interferon", julkaisijana Kodansha Co. Ltd., Tokyo, Japan (1975), D.A.J.
Tyrell, "Interferon and Its Clinical Potential", julkaisijana William Heineman Medical Books Ltd. (London) (1976), ja "Protein, Nucleic Acid and Enzyme", vol. 21 n:o 4 (1976), sellaista prote-iinipitoista ainetta, joka on intra- tai ekstrasellulaarisesti aikaansaatu saattamalla elävät solut interferoni-indusorin, esimerkiksi virusten, bakteerien, protozoan, riketsian, nukleiinihapon, endotoksiinin tai polysakkaridin vaikutuksen alaiseksi, ja joka ei-spesifisesti estää eri virusten lisääntymisen soluissa. Johtuen interferonin virusten lisääntymistä estävästä vaikutuksesta sitä on sen keksimisestä saakka pidetty lupaavana terapeuttisena ja suojaavana aineena virusten aiheuttamia tauteja vastaan. Viime aikoina on _ _ ΊΓ~ 2 68519 osoitettu, että interferoni toimii kasvainten muodostumista estävänä aineena myös ei-virusperäisten kasvainten kohdalla, ja siksi interferonin saamiseksi lääkkeeksi kohdistuu suuria odotuksia.
Termiin interferoni sisältyy sekä lajia I että lajia II oleva interferoni, joista edellinen lajia I oleva interferoni tai klassinen interferoni, jonka molekyylipaino on noin 1-3 x 10^ on aikaansaatu saattamalla elävät solut virusperäisten infektioiden vaixtuuksen alaiseksi ja jälkimmäinen lajia II oleva interferoni tai immuuni-interferoni, jonka molekyylipaino on noin 4-7 x 10^ on aikaansaatu lymfosyyteissä mitogeenien stimulaation tai antigeenien avulla. L.B. Epsteinin mukaan "Texas Reports on Biology and Medicine", voi. 35, pp. 41-56 (1977), julkaisijana University of Texas Medical Branch, Galveston,
Texas, USA, lajia II oleva interferoni ei ole yhtä stabiili kuin lajia I oleva interferoni voimakkaissa olosuhteissa, pH:n ollessa alle 2 tai yli 10, ja/tai lämpötilan ollessa yli 56°C. Koska lajia II olevalla interferonilla on kuitenkin läheinen yhteys immunoreaktioihin, sillä odotetaan olevan paljon paremmat terapeuttiset ja suojaavat vaikutukset interferonilla parannettavissa sairauksissa kuin lajia I olevalla interferonilla.
Johtuen interferonin korkeasta lajispesifisyydestä ei sellaisella interferonilla, joka on saatu muualta kuin elävistä ih-missoluista, ole terapeuttista ja suojaavaa vaikutusta ihmisten sairauksissa. Tähän saakka leukosyyttejä on käytetty lajia II olevan interferonin valmistamiseen. Lajia II olevan interferonin valmistaminen suurissa määrissä alhaisin kustannuksin leukosyyttien avulla on melko vaikeaa, koska leukosyytit täytyy erottaa ja valmistaa tuoreesta verestä, eivätkä ne kestä pitkiä säilytysaikoja. Olosuhteista johtuen ei lajia II olevan interferonin, joka on mahdollinen terapeuttinen ja suojaava aine ihmisten sairauksiin, kaupallinen valmistus ole toteutunut .
Tämän keksinnön tekijät ovat tutkineet eri valmistusmenetelmiä, joita voitaisiin helposti käyttää lajia II olevan interferonin valmistamiseen kaupallisessa mittakaavassa, sekä mahdollisuuksia käyttää tätä interferonia terapeuttisena ja suojaavana aineena. Tällöin 6851 9 havaittiin, että lajia II olevaa interferonia, jolla on korkea tiitteriarvo, ei pystytty saamaan suuria määriä siirtämällä lajia II olevaa interferonia tuottavia, pysyviä ihmissoluja ravinto-alustaan ja antamalla lisääntyä in vitro. Sen sijaan havaittiin, että ihmisspesifistä, lajia II olevaa interferonia voidaan valmistaa siten, että a) pysyviä ihmissoluja, jotka kykenevät tuottamaan ihmisspesifistä, lajia II olevaa interferonia, siirretään muuhun lämminveriseen eläimeen, eläintä ruokitaan, niin että ihmissolut voivat lisääntymiseensä käyttää hyväkseen eläimen ruumiinnestettä, eläimessä täten muodostunut kasvain uutetaan ja hajotetaan lisääntyneiden ihmissolujen saamiseksi, lisääntyneet ihmissolut saatetaan sekä lajia I että lajia II olevan interferoni-indusorin tehokkaan määrän vaikutuksen alaiseksi in vivo tai in vitro sellaisissa olosuhteissa, jotka ovat sopivia akkumuloimaan olennainen määrä ihmisspesifistä, lajia II olevaa interferonia, ja akkumuloitu ihmisspesifinen, lajia II oleva interferoni otetaan talteen sinänsä tunnetulla tavalla, tai b) pysyviä ihmissoluja, jotka kykenevät tuottamaan ihmisspesifistä, lajia II olevaa interferonia, suspendoidaan ravintoalustaan, joka on sijoitettu diffuusiokammioon, jossa on suodatinkalvo, diffuusiokammio suljetaan muun lämminverisen eläimen sisään tai sijoitetaan sen päälle siten, että diffuusiokammiossa olevat ihmissolut pääsevät kosketukseen eläimen ruumiinnesteen kanssa, eläintä ruokitaan niin, että ihmissolut voivat lisääntymiseensä käyttää hyväkseen eläimen ruumiinnestettä, lisääntyneet ihmissolut kerätään diffuusiokammiosta, lisääntyneet ihmissolut saatetaan sekä lajia I että lajia II olevan interferoni-indusorin tehokkaan määrän vaikutuksen alaiseksi in vivo tai in vitro ihmisspesifisen, lajia II olevan interferonin olennaisen määrän akkumuloimiseksi, ja akkumuloitu ihmisspesifi-nen, lajia II oleva interferoni otetaan talteen sinänsä tunnetulla tavalla. Lisäksi havaittiin, että tämän keksinnön mukaisen menetelmän mukaan valmistettu, lajia II oleva interferoni on erinomainen terapeuttinen ja suojaava aine lajia II olevalla interferonilla parannettavia sairauksia vastaan.
Tämän keksinnön mukainen menetelmä eroaa tavanomaisista menetelmistä, joissa elävät solut lisääntyvät in vitro, ja sen eduiksi voidaan _________ _ Il 6851 9 lukea, että ravintoalustaan ei tarvitse lisätä lainkaan tai vain vähän kallista seerumia, että pysyvien ihmissolujen lisään-tymisolosuhteita voidaan helpommin ylläpitää ja kontrolloida, ja että lajia II olevaa interferonia, jolla on korkea tiitteri-arvo, voidaan helposti saada. Keksinnön mukaisessa menetelmässä pysyvät ihmissolut voidaan helposti saada lisääntymään muun lämminverisen eläimen kehossa käyttämällä ruumiin nestettä, joko siirtämällä solut kehoon tai asettamalla eläimen kehoon sisälle tai ulkopuolelle diffuusiokammio, jossa olevaan ravintoalustaan edellä mainitut solut on suspendoitu. Tällöin eläintä voidaan ruokkia tavalliseen tapaan. Erikoisesti verratessa tavanomaisiin menetelmiin, joissa solut lisääntyvät in vitro, on tämän keksinnön mukaisella menetelmällä lisäksi etuna se, että solujen lisääntyminen on vakaampaa, että lisääntymisaste on korkeampi, ja että lajia II olevan interferonin saanto solua kohden on paljon korkeampi .
Mitä hyvänsä pysyviä ihmissoluja voidaan käyttää edellyttäen, että ne siirrettynä muun lämminverisen eläimen kehoon lisääntyvät helposti; esimerkiksi HPBr-ALL solu, MOLT-3 solu, P 12/- 5 68519
Ichikawa solu, HPB-MLT solu, p 8/Seki solu, JBL solu, HC1 solu ja P 10/Shibata solu, jotka on selostettu artikkelissa "Protein, Nucleic Acid and Enzyme", vol. 23, n:o 6, pp. 697-711 (1978), Namalva solu, joka on selostettu artikkelissa "Journal of Clinical Microbiology", voi. 1, pp. 116-117 (1975), ja BALL-1 solu, TALL-1 solu ja NALL-1 solu, jotka on selostettu artikkelissa I. Miyoshi, "Nature", vol. 267, pp. 843-844 (1977). Erikoisesti ihmisen varhaisimusolulinjat ovat edullisia. Tässä keksinnön mukaisessa menetelmässä käytettävät pysyvät ihmisso-lut voidaan valita edellä lueteltujen solujen joukosta, vaikkakaan niihin ei tarvitse rajoittua. Ennen lajia II olevan interferonin induktiota edellä mainittuja soluja voidaan käyttää yksinään tai seoksina. Erikoisesti kun lajia II olevan interferonin tuottamiseen käytettävät pysyvät ihmissolut ovat leukosyyttejä, erityisesti lymfosyyttejä, voi sellaisen soluseoksen käyttö, joka sisältää B lymfosyyttejä (B solu) ja T lymfosyyttejä (T solu) edellä mainittujen pysyvien ihmissolujen lisäksi, vielä lisätä saadun lajia II olevan interferonin aktiivisuutta. Edellä mainittuihin pysyviin ihmissoluihin voidaan haluttaessa lisätä tuoreesta ihmisen verestä valmistettuja leukosyyttejä.
Tässä keksinnössä voidaan käyttää mitä tahansa lämminveristä eläintä, kunhan pysyvät ihmissolut voivat lisääntyä sen kehossa: esimerkiksi lintuja, kuten kana ja kyyhkynen, ja nisäkkäitä, kuten koira, kissa, apina, vuohi, sika, nauta, hevonen, kaniini, marsu, rotta, hamsteri, hiiri ja karvaton hiiri. Koska ihmissolujen siirto edellä mainittujen eläinten kehoon pyrkii aiheuttamaan epätoivottuja immunoreaktioita, olisi näiden reaktioiden mahdollisimman suureksi vähentämiseksi valittava mah-sollisimman varhaisessa kehitysvaiheessa olevia eläimiä, kuten muna, alkio, sikiö, vastasyntynyt tai eläimen poikanen. Immu-noreaktioiden vähentämiseksi eläintä voidaan ennen solujen siirtoa säteilyttää noin 200-600 REM:in röntgen- tai γ-säteilyan-noksilla tai eläimeen voidaan ruiskuttaa antiseerumia tai muuta immunoreaktioita alentavaa ainetta. Karvaton hiiri, myös täysikasvuinen, on edullinen lämminverinen eläin, koska se ei ole niin taipuvainen muodostamaan epätoivottuja immunoreaktioita, ja siihen voidaan siirtää pysyviä ihmissoluja ja solut saada lisääntymään nopeasti ilman esikäsittelyjä. Lisääntyneitä ihmissoluja siirtämällä lämminverisen eläimen kehosta toi-
__-- TT
6 68519 seen voidaan solujen lisääntyminen saada tasaisemmaksi ja solujen tuottaman lajia II olevan interferonin saanto paljon suuremmaksi; esimerkiksi pysyvät ihmissolut siirretään hamstereihin, joissa ne lisääntyvät, ja sitten ne kerätään ja siirretään karvattomiin hiiriin. Tässä tapauksessa lisääntyneitä soluja voidaan siirtää edelleen yhdestä lämminverisestä eläimestä toiseen, joka kuuluu samaan lajiin, sukuun, luokkaan tai ryhmään. Pysyviä ihmissoluja voidaan myös siirtää mihin eläimen kehon osaan tahansa, kunhan ne lisääntyvät siellä helposti, esimerkiksi vatsaontelon sisään, laskimon sisäisesti, ihon alle tai sikiökalvon sisään.
Sen sijaan, että pysyviä ihmissoluja siirretään ja niiden annetaan lisääntyä muun lämminverisen eläimen kehossa, voidaan mitkä tahansa yllämainituista soluista saada lisääntymään ymppäämällä ne muun lämminverisen eläimen kehoon tavanomaisessa diffuusiokammiossa, joka on sijoitettu, esimerkiksi vatsaontelon sisään niin, että solut voivat käyttää ruumiin nestettä. Tämän keksinnön mukaisessa menetelmässä voidaan käyttää eri muotoisia ja eri kokoisia kammioita, joissa tulee olla suodatinkalvo, esimerkiksi membraanisuodatin, ultrasuoda-tin tai kuitusuodatin estämään solujen vuoto. Erityisesti sellaiset kammiot, joiden suodatinvälikalvon huokoskoko on -7 -5 luokkaa 10 - 10 m ovat edullisia. Jos on tarpeellista, voi daan diffuusiokammio suunnitella sijoitettavaksi myös esimerkiksi eläimen kehon ulkopuolelle niin, että eläimen ruumiin neste voi virrata kammion läpi ja että kammioon ympättyjen ihmisen kestosolujen kehittymistä voidaan seurata kammion sivuun asennetusta ikkunasta. Diffuusiokammio voidaan myös suunnitella niin, että se voidaan ajoittain kytkeä irti eläimen kehosta ilman, että eläin olisi lopetettava. Tällöin solut voivat lisääntyä eläimen kehossa koko sen eliniän ajan ja näin voidaan edelleen lisätä lisääntyneiden ihmissolujen saantoa eläintä kohden. Edelleen sellaisen menetelmän eduksi, jossa käytetään edellä mainittua diffuusiokammiota, voidaan mainita sen lisäksi, että lisääntyneet solut voidaan helposti kerätä, koska näiden solujen ja eläimen solujen välillä ei ole suoraa yhteyttä, se seikka, että eri lämminverisiä eläimiä voidaan käyttää'ilman niiden esikäsittelyä immunoreaktioiden vähentämiseksi, koska immunoreaktioiden esiintyminen on epätodennäköisempää .
7 6851 9 Tämän keksinnön mukainen menetelmä on sikäli sovelias, että eläintä, johon pysyvät ihmissolut on siirretty, voidaan ruokkia tavalliseen tapaan ja ettei solujen siirron jälkeen tarvita mitään erikoistoimenpiteitä. Siirrettyjen pysyvien ihmisso-lujen riittävään lisääntymiseen tarvittava aika on tavallisesti noin 1-10 viikkoon.
7 12
Lisääntyneiden ihmissolujen määrän todettiin olevan 10 - 10 tai enemmän eläintä kohden. Toisin sanoen tämän keksinnön mukainen menetelmä on erittäin edullinen lajia II olevan interferonin valmistuksessa, koska eläimen kehoon tai diffuusiokam- mioon siirrettyjen tai ympättyjen solujen lukumäärä kasvaa 2 7 noin 10 - 10 -kertaiseksi tai enemmän tämän menetelmän mukaan, mikä on noin 10 - 10-kertainen määrä tai enemmän kuin jos samoja soluja ympätään ja niiden annetaan lisääntyä ravintoliuoksessa in vitro.
Lajia II olevan interferonin induktioon voidaan käyttää mitä menetelmää tahansa, kunhan lajia II olevaa interferonia saadaan lisääntyneiden elävien ihmissolujen avulla. Solut voidaan saattaa lajia II olevan interferoni-indusorin vaikutuksen alaiseksi lisääntymispaikassaan. Esimerkiksi ihmissolut, jotka ovat lisääntyneet vesivatsassa tai ihonsisäisissä suurissa kasvain-soluissa voidaan saattaa lajia II olevan interferoni-indusorin vaikutuksen alaiseksi in vivo ja saatu lajia II oleva interferoni puhdistetaan ja erotetaan vesivatsasta tai kasvaimista. Lisääntyneet solut voidaan myös vasta eristämisen jälkeen saattaa lajia II olevan interferoni-indusorin vaikutuksen alaiseksi in vitro lajia II olevan interferonin saamiseksi. Esimerkiksi vesivatsasta saadut tai ihonsisäisistä suurista kasvainsoluis-ta eristetyt ja dissosioidut lisääntyneet ihmissolut suspen-doidaan ravintoalustaan, jonka lämpötila pidetään 20-40°C:ssa pitoisuuden saamiseksi 10 - 10 soluun millilitraa kohden, saatetaan lajia II olevan interferoni-indusorin vaikutuksen alaiseksi. Tämän jälkeen saatu lajia II oleva interferoni puhdistetaan ja erotetaan. Kun ihmissolujen annetaan lisääntyä diffuusiokammiossa, solut voidaan saattaa lajia II olevan interferoni-indusorin vaikutuksen alaiseksi samassa kammiossa, in vivo, tai kammiosta siirtämisen jälkeen in vitro.
____.- - ΤΓ 8 68519
Lajia II olevan interferonin tuotannossa voidaan haluttaessa lajia II olevan interferonin määrää lisätä edelleen tunnetuilla menetelmillä, kuten "priming"-menetelmällä käyttämällä erittäin ihmislaji-spesifistä interferonia ja/tai super-induktio-menetelmällä käyttämällä metaboliittista inhibiittoria. Edelleen lajia II olevan interferonin saantoa eläintä kohden voidaan edelleen lisätä joillakin seuraavista menetelmistä: (1) menetelmä, jossa lisääntyneet solut saatetaan lajia II olevan interferoni-indusorin vaikutuksen alaiseksi in vivo ja solujen eristämisen jälkeen eläimen kehosta tai kehon osasta solut saatetaan lajia II olevan interferoni-indusorin vaikutuksen alaiseksi in vitro lajia II olevan interferonin tuottamiseksi .
(2) menetelmä, jossa sellaisia ihmissoluja, _joita on jo käytetty kerran tai toistuvasti lajia II olevan interferonin tuottamiseen saatetaan lajia II olevan interferoni-indusorin vaikutuksen alaiseksi in vivo tai in vitro lajia II olevan interferonin tuottamiseksi, ja (3) menetelmä, jossa diffuusiokammio, joka on asennettu eläimen kehoon sisälle tai ulkopuolelle kytketään irti ajoittain lisääntyneiden ihmissolujen määrän lisäämiseksi.
Lajia II olevista interferoni-indusoreista yleensä mitogeenit, kuten kasvi-hemagglutiniini, concanavaliini A, "pork weed mitogen", 1ipopolysakkaridi, polysakkaridi, endotoksiini ja bakteerit ovat edullisia. Valonherkille soluille myös antigeeni toimii lajia II olevana interferoni-indusorina. Yllä mainittuja lajia II olevia interferoni-indusoreja käytetään tavallisesti noin 0,001 ^ug - 10 mg/ml pitoisuuksina. Lisäksi käyttämällä yhtä tai useampaa lajia I olevaa interferoni-indusoria, esimerkiksi viruksia, nukleiinihappoa ja polynukleotidejä yhdessä lajia II olevan interferoni-indusorin kanssa lisää edelleen lajia II olevan interferonin saantoa ja mahdollistaa myös lajia I ja lajia II olevien interferonien samanaikaisen saannon.
Saatu lajia II oleva interferoni voidaan puhdistaa ja erottaa 6851 9 helposti tavanomaisin puhdistus- ja erotusmenetelmin, esimerkiksi "säestämällä", dialyysillä, suodattamalla, sentrifugoi-malla, konsentroimalla ja kylmäkuivaamalla. Jos halutaan puhtaampi lajia II oleva interferonivalmiste, saavutetaan korkein puhtausaste tavanomaisilla menetelmillä, esimerkiksi adsorptio- tai desorptio-ioninvaihdolla, geelisuodatuksella, affini-teettikromatografiän avulla, isoelektriseen pisteeseen perustuvalla erottamisella ja elektroforeesilla yhdistettynä edellä mainittuihin menetelmiin.
Erittäin ihmisiaji-spesifisten lajia I ja lajia II olevien interferonien aktiivisuudet määritettiin tavanomaisella pesäkkeiden vähenemiseen perustuvalla menetelmällä ihmisen amnion-solujen avulla, joita on selostettu artikkelissa "Protein, Nucleic Acid and Enzyme", voi. 20, n:o 6, pp. 616-634 (1975), julkaisijana Kyoritsu Shuppan Co., Ltd., Tokyo, Japan.
Hemagglutinaatioyksikkö määritettiin menetelmällä, jonka on esittänyt J.E. Salk, "Journal of Immunology", voi. 49, pp. 87-98 (1944) .
Seuraavassa kokeessa A kuvataan lajia II olevan interferonin valmistusta tämän keksinnön mukaan.
Koe A
In vitro tai in vivo lisääntyneiden solujen interferonin tuotto
Koe A-l Lisääntyminen in vitro BALL-1 solut ympättiin RPMI-1640 väliaineeseen, johon oli lisätty 20 % sikiöasteella olevan naudan seerumia pH:n ollessa 7,2. Soluja viljeltiin suspensiona lämpötilassa 37°C. Lisääntyneet solut pestiin seerumivapaalla RPMI-1640 väliaineella pH:n ollessa 7,2 ja suspendoitiin samankoostumuksiseen tuoree-
C
seen väliaineeseen solupitoisuuden saamiseksi noin 1 x 10 solua/millilitra.
Koe A-2 Lisääntyminen in vivo
Vastasyntyneisiin hamstereihin ruiskutettiin antiseerumia, joka oli valmistettu kaniineista tunnetun menetelmän mukaan, alentamaan niiden immunoreaktioita. Tämän jälkeen niihin siir- __- τη - ' ' 10 6851 9 rettiin ihonsisäisesti BALL-1 soluja. Hamstereita ruokittiin tavalliseen tapaan kolmen viikon ajan. Ihonsisäiset suuret kasvaimet eristettiin, pilkottiin ja dissosioitiin trypsiiniä sisältävään fysiologiseen suolaliuokseen lisääntyneiden solujen keräämiseksi. Näin saadut solut pestiin seerumivapaalla RPMI-1640 väliaineella pH:n ollessa 7,2 ja suspendoitiin samankoos-tumuksiseen tuoreeseen väliaineeseen solupitoisuuden saamiseksi noin 1 x 106 solua/millilitra.
Koe A-3 Interferonin tuottaminen
Kokeissa A-l ja A-2 saadut BALL-1 solususpensiot, joiden solu-pitoisuus oli noin 1 x 106 solua/millilitra saatettiin kasvu-hemagglutiniinin ja/tai Sendai viruksen vaikutuksen alaisiksi interferonin tuottamiseksi. Erikoisesti kun kasvihemaggluti-niinia käytettiin yksinään, sitä lisättiin suspensioihin noin 100 yUg millilitraa kohden ja seosta inkuboitiin 3 päivää interferonin tuottamiseksi. Kun Sendai virusta käytettiin yksinään, sitä lisättiin suspensioihin noin 300 hemagglutinaa-tioyksikön verran millilitraa kohden ja seosta inkuboitiin yhden päivän ajan interferonin tuottamiseksi. Kun sekä kasvi-hemagglutiniinia että Sendai virusta käytettiin yhdessä, suspensioihin lisättiin ensin kasvihemagglutiniinia noin 100 ^,ug millilitraa kohden ja seosta inkuboitiin 37°C:ssa kahden päivän ajan ja tämän jälkeen lisättiin Sendai virusta noin 300 hemagglutinaatioyksikön verran millilitraa kohden ja seosta inkuboitiin vielä yhden päivän ajan 37°C:ssa interferonin tuottamiseksi .
Näin saadut interferonia sisältävät suspensiot sentrifugoitiin.
Saadut liuokset konsentroitiin ultrasuodatuksen avulla, jolloin molekyylipainon mukainen läpipääsyraja oli 6000, ja fraktioitiin molekyylipainon mukaan dekstraanigeelin avulla. Saatujen lajia I olevan interferonin, jonka molekyylipaino on noin 25 000, ja lajia II olevan interferonin, jonka molekyylipaino on noin 50 000, aktiivisuudet määritettiin suspension interfe-roniaktiivisuuden millilitraa kohden arvioimiseksi inkuboinnin jälkeen. Tulokset on esitetty taulukossa 1.
11 6851 9
Taulukko 1
Lisääntyminen
Interferoni indusori in vitro in vivo kasvihemagglutiniini 20 400 (20) (400)
Sendai virus 1700 6700 (0) (0) kasvihemagglutiniini + 1740 24 000
Sendai virus (30) (11 000) huomautus: Määritetty kokonaisinterferoniaktiivisuus inku- boinnin jälkeen on ilmoitettu yksikköä/millilitraa suspensiota, lajia II olevan interferonin aktiivisuus on ilmoitettu suluissa joka valmisteelle.
Taulakossa 1 esitetyistä tuloksista ilmenee, että solut, jotka ovat lisääntyneet in vitro tuottavat vähän interferonia, ja solut, jotka ovat lisääntyneet in vivo tuottavat paljon interferonia. Sekä in vitro että in vivo lisääntyneet solut tuottivat lajia I olevaa interferonia kun se saatettiin Sendai viruksen vaikutuksen alaiseksi. In vivo lisääntyneillä soluilla oli kuitenkin 4-kertainen aktiivisuus verrattuna in vitro lisääntyneisiin soluihin. Käytettäessä indusoreina kasvihemaggluti-niinia ja/tai Sendai virusta huomattiin interferoniaktiivisuuk-sien perusteella indusoreilla olevan huomattava synergistinen vaikutus tuotettaessa lajia I ja lajia II olevaa interferonia in vivo lisääntyneillä soluilla. Erityisesti käyttämällä indu-sorinä kasvihemagglutiniinin ja Sendai viruksen yhdistelmää oli saadun lajia II olevan interferonin aktiivisuus 28 kertaa suurempi kuin käyttämällä hemagglutiniinia yksinään. Käyttämällä in vitro lisääntyneitä soluja ei synergististä vaikutusta kuitenkaan havaittu.
Tämän keksinnön mukaisesta lajia II olevan interferonin valmistuksesta on seuraavassa esitetty useita suoritusmuotoja.
Esimerkki A
Lajia II olevan interferonin valmistus 6851 9
Esimerkki A-l Täysikasvuisiin karvattomiin hiiriin siirrettiin ihonsisäisesti ihmisen pysyviä BALL-1 soluja ja eläimiä ruokittiin tavalliseen tapaan kolmen viikon ajana. Ihonsisäiset suuret kasvaimet, noin 10 g eläintä kohden, eristettiin, pilkottiin ja dissosioi-tiin trypsiiniä sisältävään fysiologiseen suolaliuokseen lisääntyneiden solujen keräämiseksi. Solut pestiin Eagle MEM-vällaineella, johon oli lisätty 5 tilavuus-% ihmisen seerumia pH:n ollessa 7,2 ja suspendoitiin samankoostumuksiseen tuoree-seen Väliaineeseen solupitoisuuden saamiseksi noin 5 x 10 solua/millilitra lämpötilassa 37®C. Tähän suspensioon lisättiin osittain puhdistettua erittäin ihmis-spesifistä interferonia noin 100 yksikköä/millilitra ja seosta inkuboitiin noin 2 tuntia. Kasvihemagglutiniinia lisättiin sitten seokseen noin 200 ^ug/millilitra. Tämän jälkeen seosta inkuboitiin samassa lämpötilassa edelleen kolme päivää lajia II olevan interferonin tuottamiseksi. Inkuboitu seos sentrifugoitiin noin 1000 x g lämpötilassa 4°C sakan, kuten solun orgaanisten jätteiden poistamiseksi, ja saatua liuosta dialysoitiin 0,01 M fosfaattipuskurissa pH 7,2:een puskuroitua fysiologista suolaliuosta vastaan 24 tunnin ajan. Tämän jälkeen saatu liuos suodatettiin varovaisesti suodatinkalvon avulla ja lajia II olevaa interferonia sisältävä suodos konsentroitiin ja kylmäkuivattiin jauheeksi .
Jauheen lajia II olevan interferonin aktiivisuus oli noin 1 500 000 yksikköä eläintä kohden.
Esimerkki A-2 Täysikasvuisiin karvattomiin hiiriin siirrettiin vatsaontelonsi-säisesti ihmisen pysyviä"BALL-1 ja TALL-1.soluja ja eläimiä ruokittiin tavalliseen tapaan viiden viikon ajan. sen jälkeen eläimiin ruiskutettiin vatsaontelon sisäisesti 1 mg kasvihemagglutiniinia ja 24 tunnin jälkeen noin 3000 hemagglutinaatio-yksikköä Newcastlen sairautta aiheuttavaa virusta, joka oli etukäteen lähes inaktivoitu ultr aviolettisäteilyttämällä. Karvattomat hiiret lopetettiin ja niiden vesivatsat kerättiin 24 tunnin kuluttua ruiskutuksesta. Vesivatsat sentrifugoitiin noin 1000 x g lämpötilassa 4°C sakan, kuten solun orgaanisten jätteiden poistamiseksi. Saatua liuosta dialysoitiin 0,01 M fosfaattipusku- li 13 6851 9 rilla pH 7,2:een puskuroitua fysiologista suolaliuosta vastaan 15 tunnin ajan. Tämän jälkeen saatu liuos suodatettiin ja konsentroitiin varovasti suodatinkalvon avulla interferonia sisältävän konsentraatin saamiseksi.
Konsentraatin kokonaisinterferoniaktiivisuus oli noin 800 000 yksikköä 10 eläintä kohden, josta noin 300 000 yksikköä oli lajia II olevan interferonin aktiivisuutta.
Esimerkki A-3
Vastasyntyneisiin hamstereihin ruiskutettiin antiseerumia, joka oli valmistettu kaniineista tunnetun menetelmän mukaan, alentamaan niiden immunoreaktiota. Tämän jälkeen niihin siirrettiin ihonsisäisesti ihmisen pysyviä JBL soluja. Hamstereita ruokittiin tavalliseen rapaan neljän viikon ajan. Ihonsisäi-set suuret kasvaimet, noin 30 g hamsteria kohden, eristettiin ja käsiteltiin samalla lailla kuin esimerkissä A-l. Lisääntyneet solut pestiin RPMI-1640 väliaineella, johon oli lisätty 10 tilavuus-% sikiöasteella olevan naudan seerumia pH:n ollessa 7,4 ja suspendoitiin samankoostumuksiseen tuoreeseen väliaineeseen solupitoisuuden saamiseksi noin 2 x 10^ solua/milli-litra lämpötilan ollessa 37°C. Tähän seokseen lisättiin osittain puhdistettua erittäin ihmis-spesifistä lajia II olevaa interferonia noin 200 yksikköä/millilitra ja seosta inkuboi-tiin lämpötilassa 37°C tunnin ajan. Inkuboituun seokseen lisättiin sitten concanavaliini A:ta noin 500 ^.ug/millilitra, seosta inkuboitiin 3 päivää, sitten lisättiin Sendai virusta noin 300 hemagglutinaatioyksikköä/millilitra ja seosta inkuboitiin 16 tuntia interferonin tuottamiseksi. Seos puhdistettiin ja konsentroitiin varovasti suodatinkalvon avulla kuten esimerkissä A-2 interferonia sisältävän liuoksen saamiseksi.
Liuoksen kokonaisinterferoniaktiivisuus oli noin 17 000 000 yksikköä hamsteria kohden, josta noin 6 000 000 yksikköä oli lajia II olevan interferonin aktiivisuutta.
Esimerkki A-4
Vastasyntyneisiin rottiin siirrettiin laskimonsisäisesti ihmisen pysyviä Namalva soluja ja» eläimiä ruokittiin tavalliseen tapaan neljän viikon ajan. Ihonsisäiset suuret kasvaimet, 14 6851 9 noin 50 g rottaa kohden, eristettiin, pilkottiin ja disso-sioitiin kuten esimerkissä A-l. Lisääntyneitä soluja käsiteltiin kuten esimerkissä A-l, paitsi että Maruyama ymppiä lisättiin noin 1 ^ug/millilitra kasvihemagglutiniinin sijasta lajia II olevan interferonin tuottamiseksi. Saatu lajia II oleva interferoni puhdistettiin ja saatu lajia II olevaa interferonia sisältävä liuos kylmäkuivattiin jauheeksi kuten esimerkissä A-l.
Jauheen lajia II olevan interferonin aktiivisuus oli noin 8 000 000 yksikköä rottaa kohden.
Esimerkki A-5
Aluksi täysikasvuisia hiiriä säteilytettiin noin 400 REMin röntgensäteilyannoksilla niiden immunoreaktioiden alentamiseksi ja sitten niihin siirrettiin ihonsisäisesti ihmisen pysyviä TALL-1 soluja. Eläimiä ruokittiin tavalliseen tapaan kolmen νϋκοη ajan. Ihonsisäisten suurten kasvainten, noin 10 g hiirtä kohden, eristämisen ja pilkkomisen jälkeen kasvainso-lut dissosioitiin kuten esimerkissä A-l. Soluja käsiteltiin kuten esimerkissä A-3 interferonin tuottamiseksi. Saatu interferoni puhdistettiin ja konsentroitiin kuten esimerkissä A-2 interferonia sisältävän konsentraatin saamiseksi.
Konsentraatin kokonaisinterferoniaktiivisuus oli noin 9 000 000 yksikköä hiirtä kohden, josta noin 3 000 000 yksikköä oli lajia II olevan interferonin aktiivisuutta.
Esimerkki A-6
Aluksi hamstereihin siirrettiin ihonsisäisesti ihmisen pysyviä MOLT-3 soluja samalla lailla kuin esimerkissä A-3 ja eläimiä ruokittiin tavalliseen tapaan kolmen viikon ajan solujen lisäämiseksi. Sen jälkeen lisääntyneet solut siirrettiin vatsa-ontelonsisäisesti kymmenen päivän ikäisiin karvattomiin hiiriin ja eläimiä ruokittiin tavalliseen tapaan edelleen viiden viikon ajan. Eläimet lopetettiin vesivatsojen keräämiseksi. Saadut vesivatsat sentrifugoitiin lisääntyneiden solujen keräämiseksi. Solut pestiin ja käsiteltiin kuten esimerkissä A-l lajia II olevan interferonin saamiseksi. Saatu lajia II oleva interferoni puhdistettiin ja konsentroitiin kuten esi- 15 6851 9 merkissä A-2 lajia II olevaa interferonia sisältäväksi kon-sentraatiksi.
Konsentraatin lajia II olevan interferonin aktiivisuus oli noin 500 000 yksikköä eläintä kohden.
Esimerkki A-7
Ihmisen pysyviä JBL soluja suspendoitiin fysiologiseen suolaliuokseen muovisessa sylinterinmuotoisessa diffuusiokammiossa, jossa oli suodatinvälikalvo, jonka huokoskoko oli 0,5 ^u ja kapasiteetti noin 10 millilitraa. Kammiot sijoitettiin täysikasvuisiin rottiin vatsaontelonsisäisesti. Rottia ruokittiin tavalliseen tapaan neljän viikon ajan, jonka jälkeen kammiot poistectiin. Lisääntyneiden solujen pitoisuus kammioissa oli g noin b x 10 solua/millilitra, mikä on noin 1000-kertainen määrä verrattuna ravintoalustassa in vitro käyttämällä CO2 inku-baattoria saatuihin solupitoisuuksiin. Saatujen solujen suspensioon lisättiin MOLT-3 soluja, jotka on valmistettu esimerkin A-6 mukaan, noin 20 tilavuus-% pitoisuuteen ja seosta käsiteltiin kuten esimerkissä A-l lajia II olevan interferonin tuottamiseksi. Saatu lajia II oleva interferoni puhdistettiin ja konsentroitiin lajia II olevaa interferonia sisältäväksi kon-sentraatiksi, joka sitten kylmäkuivattiin jauheeksi.
Jauheen lajia II olevan interferonin aktiivisuus oli noin 4 000 000 yksikköä rottaa kohden.
Esimerkki A-8
Ihmisen pysyviä NALL-1 soluja siirrettiin sikiöasteella olevien munien, joita oli inkuboitu etukäteen lämpötilassa 37°C viiden päivän ajan, sikiökalvon sisään ja munia inkuboitiin edelleen samassa lämpötilassa seitsemän päivän ajan. Munat avattiin ja lisääntyneet solut kerättiin. Solususpensioon lisättiin 1/1 tilavuussuhteessa TALL-1 soluja, jotka valmistettiin kuten esimerkissä A5 ja seosta käsiteltiin kuten esimerkissä A-l lajia II olevan interferonin tuottamiseksi. Saatu lajia II oleva interferoni puhdistettiin ja konsentroitiin kuten esimerkissä A-2 lajia II olevaa interferonia sisältäväksi konsentraatiksi.
1·6 6851 9
Konsentraatin lajia II olevan interferonin aktiivisuus oli noin 300 000 yksikköä 10 sikiöastee]la olevaa munaa kohden.
Esimerkki A-9
Esimerkin A-l mukaisen menetelmän mukaan valmistettu jauhe puhdistettiin edelleen varovaisesti pH:n vaihdellessa välillä 4-9 tavanomaisin menetelmin kuten adsorptio- ja desorptio-ioninvaihdolla, fraktioimalla molekyylipainon mukaan geelisuo-datuksen avulla, konsentroimalla ja varovaisesti suodattamalla, kuten on selitetty Bodon selostuksessa "Symposium on Preparation, Standardization and Clinical Use of Interferon. 11th International Immunobiological Symposium. 8 & 9 June (1977), Zagreb, Yogoslavia". Näin saatiin hyvin puhdistettu interfero-nivalmiste, jonka spesifinen aktiivisuus oli 2 x 10 yksikköä mg proteiinia kohden ja interferonin saanto oli noin 40 %.
Kokeen B tulokset osoittavat, että edellä olevien esimerkkien mukaisten menetelmien mukaan saatua lajia II olevaa interferonia voidaan käyttää yksinään, yhdessä lajia I olevan interferonin kanssa tai yhden tai useampien muiden aineiden kanssa seoksissa tehokkaana terapeuttisena ja/tai suojaavana aineena, joko ruiskeena tai ulkoisesti tai sisäisesti lääkkeenä lajia II oleviin interferonilla parannettavissa oleviin sairauksiin.
Koe B
Lajia II olevan interferonin terapeuttiset ja suojaavat vaikutukset interferonilla parannettavissa olevissa sairauksissa.
Koe B-l
Virusperäisten sairauksien hoito lajia II olevalla interferonilla (inhiboiva vaikutus virusten lisääntymiseen in vitro)
Primääriviljelmässä 6 cm halkaisijaltaan olevissa Petrimaljoissa muodostuneiden ihmisen sikiöasteella olevien keuhkosolujen yksisoluiseen kerrokseen lisättiin 0,1, 1,0 tai 10,0 yksikköä lajia II olevaa interferonia, joka valmistettiin esimerkin A-9 menetelmän mukaan. Seoksia inkuboitiin 5 tilavuus-% CC^a sisältävässä inkubaattorissa lämpötilassa 37°C 20 tunnin ajan. Soluihin lisättiin Varicella-Zoster viruksia ja ihmisen Cyto-melago-viruksia sellaiset määrät, että ilman lajia II olevaa interferonia muodostuu 100 pesäkettä. Näitä seoksia inkuboi- 17 6851 9 tiin ja muodostuneiden pesäkkeiden lukumäärä laskettiin.
Lajia II olevan interferonin virusten lisääntymistä estävä vaikutus määritettiin seuraavan yhtälön avulla.
Vähentyneiden pesäkkeiden määrä (%) = —-— x 100 jossa A on pesäkkeiden lukumäärä ilman lajia II olevan interferonin vaikutusta ja B on pesäkkeiden lukumäärä lajia II olevan interferonin läsnäollessa. Tulokset on esitetty taulukossa 2 .
Taulukko 2
Lajia II oleva Varicella-Zoster virus Ihmisen Cytomega- interferoni_lo virus_ 0 yksikköä 0 % 0 % 0,1 yksikköä 6 % 6 % 1,0 yksikköä 49 % 54 % 10,0 yksikköä 88 % 83 %
Taulukossa 2 esitettyjen tulosten perusteella on ilmeistä, että tässä keksinnössä käytetty lajia II oleva interferoni esti tehokkaasti sairauksia aiheuttavien virusten kasvun. Kokeen mukaan ei lajia II olevan interferonin lisääminen aiheuttanut epänormaaleja muutoksia ihmissoluissa.
Koe B-2
Ei-virusperäisten sairauksien hoito lajia II olevalla interferonilla (1) Kasvainsolujen lisääntymisen estäminen in vitro
Esimerkin A-9 menetelmän mukaan valmistettua lajia II olevaa interferonia lisättiin RPMI-1640 väliaineeseen, johon oli lisätty 15 tilavuus-% sikiöasteella olevan naudan seerumia, niin että lopullinen pitoisuus oli 5, 50 tai 500 yksikköä/milli-litra. Seoksiin lisättiin eri kasvainsoluja niin, että pitoisuus oli 5 x 10^ solua/millilitra. Seoksia inkuboitiin 5 tilavuus-% C02:a sisältävässä inkubaattorissa lämpötilassa 37°C viiden päivän ajan ja solujen lukumäärä millilitrassa väliainetta laskettiin. Kontrollikokeet suoritettiin muuten kuten edellä esitetyt kokeet paitsi, että lajia II oleva interfero- 6851 9 1 8 ni inaktivoitiin etukäteen kuumentamalla lämpötilassa 100°C 30 minuutin ajan.
Lajia II olevan interferonin kasvainsolujen lisääntymistä estävä vaikutus määriteltiin seuraavan yhtälön avulla.
Solujen lisääntymisen inhibitio (%) (A - 5 x 105) - (B - 5 x 105) = - x 100 (A - 5 x 105) jossa A on kontrollikokeen solujen lukumäärä ja B on solujen lukumäärä kokeessa, jossa käytettiin lajia II olevaa interferonia. Tulokset on esitetty taulukossa 3.
Taulukossa 3 esitettyjen tulosten perusteella on ilmeistä, että tässä keksinnössä käytetty lajia II oleva interferoni esti tehokkaasti sellaisten kasvainsolujen kuin BALL-1 solun, TALL-1 solun, NALL-1 solun ja JBL solun lisääntymisen ja tehokkaasti vaikuttava pitoisuus oli välillä 5-500 yksikköä/mil-lilitra.
Taulukko 3
Lajia II olevan , .
I c Ihmisen kasvainsolu interferonin -- - - — . , -
pitoisuus BALL-1 TALL-1 NALL-1 JBL
(yksikköä/ml) 5 +17 % +13 % +19 % +18 % 50 +55 % +59 % +61 % +50 % 500 +84 % +80 % +86 % +89 % (2) Kasvainsolujen lisääntymisen estäminen in vivo
Koe suoritettiin kahdeksalla noin 2 kuukauden ikäisellä karvattomalla hiirellä.
TALL-1 soluja siirrettiin ihonsisäisesti kaikkiin kahdeksaan karvattomaan hiireen noin 7,5 x 106 solua/eläin. Toisena päivänä siirron jälkeen 4 eläimelle annettiin vatsaontelonsisäi-sesti viikossa kolme kertaa ruiskeena 1000 yksikköä lajia II olevaa interferonia, joka valmistettiin esimerkin A-6 menetelmän mukaan, kaikkiaan 20 ruisketta. 48 päivän kuluttua eläimet lopetettiin ja suurten kasvainten solujen märkäpainot punnit- tiin. Kontrollikoe suoritettiin neljällä jäljellä olevalla karvattomalla hiirellä muuten kuten edellinen koe, paitsi että niille ei annettu lajia II olevaa interferonia.
19 6851 9
Tulokset on esitetty taulukossa 4.
Taulukko 4
Koe n:o Kontrolli Lajia II olevalla interferonilla käsi- _______telty karvaton hiiri 1 5,6 g 1,3 g 2 4,5 g 0,8 g 3 9,0 g 0 g 4 6,3 g 0 g
Keskimääräinen paino 6,3 g 0,5 g (3) Kasvainsolujen lisääntymisen estäminen in vivo
Koe suoritettiin kahdeksalla noin 2 kuukauden ikäisellä karvattomalla hiirellä.
Kasvainsoluja siirrettiin ihonsisäisesti kaikkiin kahdeksaan 7 karvattomaan hiireen noin 1 x 10 solua/eläin. Toisella viikolla siirron jälkeen 4 eläimelle annettiin vatsaontelonsisäi-sesti viikossa kaksi kertaa ruiskeena 1000 yksikköä lajia II olevaa interferonia, joka valmistettiin esimerkin A-2 menetelmän mukaan, kaikkiaan 8 ruisketta. 42 päivän kuluttua eläimet lopetettiin ja suurten kasvainsolujen märkäpainot punnittiin. Kontrollikoe suoritettiin neljällä jäljellä olevalla karvattomalla hiirellä muuten kuten edellinen koe paitsi että niille ei annettu lajia II olevaa interferonia. Tulokset on esitetty taulukossa 5.
Taulukko 5
Koe n:o Kontrolli Lajia II olevalla interferonilla käsi-_telty karvaton hiiri 1 4,7 g 0,5 g 2 6,2 g 0,5 g 3 15,3 g 0,5 g 4 16,9 g 0,8 g
Keskimääräinen paino 10,8 g 0,6 g 20 6851 9
Taulukoissa 4 ja 5 esitettyjen tulosten perusteella on ilmeistä, että lajia II olevat interferoniruiskeet estivät kasvainten muodostumista ja estivät jo olemassa olevien kasvainten leviämistä. Suurten kasvainsolujen märkäpainot olivat lajia II olevalla interferonilla käsitellyillä karvattomilla hiirillä paljon pienemmät kuin kontrollieläimillä. Edelleen, lajia II olevalla interferonilla käsitellyt karvattomat hiiret osoittivat parempaa ruokahalua ja olivat aktiivisempia kuin kontrollieläimet.
Koe C
Akuutti toksisuus
Esimerkin A-9 menetelmän mukaan valmistetun lajia II olevan interferonivalmisteen akuuttia toksisuutta testattiin 20 päivän ikäisillä hiirillä. Mainitun lajia II olevan interferoni-valmisteen toksisuus havaittiin erittäin alhaiseksi: LD^g-arvo oli 20 000 000 yksikköä tai enemmän kiloa kohden kun kyseessä oli vatsaontelonsisäinen ruiskutus.
Edellisten kokeiden perusteella on ilmeistä, että tässä keksinnössä mainittuja lajia II olevia interferoniherkkiä sairauksia voidaan hoitaa ja estää tämän keksinnön mukaisesti valmistetulla interferonilla, esimerkiksi virusten aiheuttamista sairauksista epideeminen sarveis-sidekalvontulehdus, rokahtu-nut sarveiskalvontulehdus, influenssa, vihurirokko ja seerumi-maksatulehdus ja ei-virusten aiheuttamista sairauksista leukemia ja luusarkooma.
Terapeuttisia ja suojaavia aineita, jotka sisältävät lajia II olevaa interferonia ja joita voidaan käyttää mainittuihin lajia II oleviin interferoniherkkiin sairauksiin, voidaan valmistaa eri muodoissa ja faaseissa käytön mukaan, esimerkiksi nestemäisenä, kuten sumute, silmänhuuhteluaine, nenätipat, kurlausvesi ja ruiske, tahnamaisena, kuten voide ja kiinteänä valmisteena,, kuten jauhe, rae ja tabletti. Aineet ovat riittävän tehokkaita, kun ne sisältävät lajia II olevaa interferonia 1-10 000 000 yksikköä/gramma. Haluttaessa voidaan lajia II olevaa interferonia käyttää yhdessä tai seoksena yhden tai useamman aineen, esimerkiksi terapeuttisen aineen, liuottimen, täyteaineen ja stabilisaattorin kanssa.
6851 9 21
Erityisesti, koska interferoni laskimon sisäisesti ruiskutettuna noin 10 minuutin kuluessa helposti poistuu verestä ja erittyy systeemistä, interferonihoito tiputuksen avulla, esimerkiksi yhdistämällä interferoni sokeriliuostiputukseen, mahdollistaa hoitoajan pidentämisen, jolloin tiputettu interferoni voidaan kokonaan tehokkaasti käyttää hyväksi ja jolloin interferonin terapeuttista ja suojaavaa vaikutusta interfero-niherkissä sairauksissa voidaan edelleen parantaa.
Claims (12)
1. Menetelmä ihmisspesifisen, lajia II olevan interferonin valmistamiseksi, tunnettu siitä, että pysyviä ihmis-soluja, jotka kykenevät tuottamaan ihmisspesifistä, lajia II olevaa interferonia, siirretään muuhun lämminveriseen eläimeen, eläintä ruokitaan, niin että ihmissolut voivat lisääntymiseensä käyttää hyväkseen eläimen ruumiinnestettä, eläimessä täten muodostunut kasvain uutetaan ja hajotetaan lisääntyneiden ihmis-solujen saamiseksi, lisääntyneet ihmissolut saatetaan sekä lajia I että lajia II olevan interferoni-indusorin tehokkaan määrän vaikutuksen alaiseksi in vivo tai in vitro sellaisissa olosuhteissa, jotka ovat sopivia akkumuloimaan olennaisen määrän ihmis-spesifistä, lajia II olevaa interferonia, ja akkumuloitu ihmis-spesifinen, lajia II oleva interferoni otetaan talteen sinänsä tunnetulla tavalla.
2. Menetelmä ihmisspesifisen, lajia II olevan interferonin valmistamiseksi, tunnettu siitä, että pysyviä ihmissoluja, jotka kykenevät tuottamaan ihmisspesifistä, lajia II olevaa interferonia, suspendoidaan ravintoalustaan, joka on sijoitettu diffuusiokammioon, jossa on suodatinkalvo, diffuusiokammio suljetaan muun lämminverisen eläimen sisään tai sijoitetaan sen päälle siten, että diffuusiokammiossa olevat ihmissolut pääsevät kosketukseen eläimen ruumiinnesteen kanssa, eläintä ruokitaan, niin että ihmissolut voivat lisääntymiseensä käyttää hyväkseen eläimen ruumiinnestettä, lisääntyneet ihmissolut kerätään diffuusiokammiosta, lisääntyneet ihmissolut saatetaan sekä lajia I että lajia II olevan interferoni-indusorin tehokkaan määrän vaikutuksen alaiseksi in vivo tai in vitro ihmis-spesifisen, lajia II olevan interferonin olennaisen määrän akku-muloimiseksi, ja akkumuloitu ihmisspesifinen, lajia II oleva interferoni otetaan talteen sinänsä tunnetulla tavalla.
3. Patenttivaatimuksen 1 tai 2 mukainen menetelmä, tunnet-t u siitä, että pysyvät ihmissolut, jotka kykenevät tuottamaan II 6851 9 ihmisspesifistä, lajia II olevaa interferonia, ovat pysyviä ihmisen varhaisimusoluja.
4. Patenttivaatimuksen 1 tai 2 mukainen menetelmä, tunnet-t u siitä, että pysyvät ihmissolut, jotka kykenevät tuottamaan ihmisspesifistä, lajia II olevaa interferonia, ovat BALL-1-soluja, NALL-1-soluja, TALL-1-soluja, JBL-soluja, Namalva-soluja tai MOLT-3-soluja.
5. Patenttivaatimuksen 1 tai 2 mukainen menetelmä, tunnet-t u siitä, että käytetään useampaa kuin yhtä pysyvää ihmissolu-tyyppiä.
6. Patenttivaatimuksen 1 tai 2 mukainen menetelmä, tunnet-t u siitä, että muu lämminverinen eläin on siipikarjaa tai nisäkäs.
7. Patenttivaatimuksen 1 tai 2 mukainen menetelmä, tunnet-t u siitä, että muu lämminverinen eläin on kana, hamsteri, rotta, hiiri tai karvaton hiiri.
8. Patenttivaatimuksen 2 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että diffuusiokammiossa on yksi tai useampi membraanisuo- -7 datin, ultrasuodatin tai ontto kuitu, jonka huokoskoko on 10 10-5 m.
9. Patenttivaatimuksen 1 tai 2 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että lisääntyneet ihmissolut saatetaan lajia II olevan interferoni-indusorin vaikutuksen alaiseksi pitoisuudessa 0,001 ,ug - 10 mg/ml solususpensiota ja lämpötilassa 20-24°C.
10. Patenttivaatimuksen 1 tai 2 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että indusori- ja talteenottovaiheet käsittävät sen, että lisääntyneitä ihmissoluja viljellään in vitro-viljely-väliaineella, joka sisältää tehokkaita määriä sekä lajia I että lajia II olevaa interferoni-indusoria, sellaisissa olosuhteissa, jotka ovat sopivia akkumuloimaan olennaisen määrän ihmisspesifistä, _ .. __ TT— 24 6851 9 lajia II olevaa interferonia, ja akkumuloitu ihmisspesifinen, lajia II oleva interferoni otetaan talteen viljelyksestä sinänsä tunnetulla tavalla.
11. Patenttivaatimuksen 1 tai 2 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että lajia II oleva interferoni-indusori on kasvihemagglutiniini tai concanavaliini A.
12. Patenttivaatimuksen 1 tai 2 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että lajia I oleva interferoni-indusori on Sendai-virus tai Newcastle-tautivirus.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP454479A JPS5598118A (en) | 1979-01-18 | 1979-01-18 | Preparation of type-2 interferon and drug containing the same |
| JP454479 | 1979-01-18 |
Publications (3)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| FI800147A FI800147A (fi) | 1980-07-19 |
| FI68519B FI68519B (fi) | 1985-06-28 |
| FI68519C true FI68519C (fi) | 1985-10-10 |
Family
ID=11586983
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| FI800147A FI68519C (fi) | 1979-01-18 | 1980-01-17 | Foerfarande foer framstaellning av interferon |
Country Status (16)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US4285929A (fi) |
| JP (1) | JPS5598118A (fi) |
| AU (1) | AU536477B2 (fi) |
| BE (1) | BE881217A (fi) |
| CA (1) | CA1135622A (fi) |
| CH (1) | CH650801A5 (fi) |
| DE (1) | DE3001585C2 (fi) |
| DK (1) | DK169479B1 (fi) |
| ES (1) | ES8103162A1 (fi) |
| FI (1) | FI68519C (fi) |
| FR (1) | FR2446637A1 (fi) |
| GB (1) | GB2040292B (fi) |
| IT (1) | IT1143056B (fi) |
| NL (1) | NL8000291A (fi) |
| NO (1) | NO156051C (fi) |
| SE (2) | SE451797B (fi) |
Families Citing this family (42)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS55154919A (en) * | 1979-05-24 | 1980-12-02 | Hayashibara Takeshi | Preparation of interferon |
| US4497796A (en) * | 1980-03-26 | 1985-02-05 | The Regents Of The University Of California | Gene transfer in intact mammals |
| US4396601A (en) * | 1980-03-26 | 1983-08-02 | The Regents Of The University Of Calif. | Gene transfer in intact mammals |
| JPS5825439B2 (ja) * | 1980-12-30 | 1983-05-27 | 株式会社林原生物化学研究所 | ヒト副甲状腺ホルモンの製造方法 |
| US4621053A (en) * | 1980-07-30 | 1986-11-04 | Kabushiki Kaisha Hayashibara Seibutsu Kagaku Kenkyujo | Process for the production of human peptide hormones |
| JPS5826317B2 (ja) * | 1980-12-30 | 1983-06-02 | 株式会社 林原生物化学研究所 | ヒト甲状腺刺激ホルモンの製造方法 |
| JPS6045849B2 (ja) * | 1980-08-25 | 1985-10-12 | 林原 健 | ヒトエリトロポエチンの製造方法 |
| JPS5743696A (en) * | 1980-08-27 | 1982-03-11 | Hayashibara Biochem Lab Inc | Preparation of human luteinizing hormone |
| JPS585671B2 (ja) * | 1980-08-27 | 1983-02-01 | 株式会社 林原生物化学研究所 | ヒト卵胞刺激ホルモンの製造方法 |
| JPS5852634B2 (ja) * | 1980-12-05 | 1983-11-24 | 株式会社林原生物化学研究所 | ウロキナ−ゼの製造法 |
| JPS609795B2 (ja) * | 1980-12-11 | 1985-03-13 | 株式会社林原生物化学研究所 | ヒト上皮細胞成長因子の製造方法 |
| JPS6030657B2 (ja) * | 1980-12-31 | 1985-07-17 | 株式会社林原生物化学研究所 | ヒト細胞増殖促進因子の製造方法 |
| JPS6030654B2 (ja) * | 1980-12-31 | 1985-07-17 | 株式会社林原生物化学研究所 | ヒトコロニ−刺激因子の製造方法 |
| SE8204382L (sv) * | 1981-07-21 | 1983-01-22 | Hayashibara Biochem Lab | Sett att framstella malcellysfaktor och anvendning derav |
| US4507281A (en) * | 1981-10-13 | 1985-03-26 | Exovir, Inc. | Interferon-containing compositions |
| US5582824A (en) * | 1981-10-19 | 1996-12-10 | Genentech, Inc. | Recombinant DES-CYS-TYR-CYS human immune interferon |
| US5096705A (en) * | 1981-10-19 | 1992-03-17 | Genentech, Inc. | Human immune interferon |
| AU561343B2 (en) * | 1981-10-19 | 1987-05-07 | Genentech Inc. | Human immune interferon by recombinant dna |
| JPS58110548A (ja) * | 1981-12-24 | 1983-07-01 | Asahi Chem Ind Co Ltd | 新規な生理活性ペプチド |
| JPS58126786A (ja) * | 1982-01-25 | 1983-07-28 | Hayashibara Biochem Lab Inc | ヒトカリクレインの製造方法 |
| US4624917A (en) * | 1982-02-17 | 1986-11-25 | Kabushiki Kaisha Hayashibara Seibutsu Kagaku Kenkyujo | Process for the production of human T-cell growth factor |
| FR2523155B1 (fr) * | 1982-03-11 | 1987-10-16 | Hayashibara Biochem Lab | Preparation de facteur de croissance des cellules t humaines |
| US6936694B1 (en) | 1982-05-06 | 2005-08-30 | Intermune, Inc. | Manufacture and expression of large structural genes |
| ATE52693T1 (de) * | 1982-10-25 | 1990-06-15 | Genentech Inc | Synergistische humaninterferonaktivitaet. |
| US4683199A (en) * | 1983-01-31 | 1987-07-28 | Sloan-Kettering Institute For Cancer Research | Interleukin-2 dependent cytotoxic T-cell clones |
| US4599306A (en) * | 1983-04-15 | 1986-07-08 | Amgen | Monoclonal antibodies which specifically bind to human immune interferon |
| US4723000A (en) * | 1983-07-05 | 1988-02-02 | Biospectrum, Inc. | Human interferon gamma and interleukin-2 |
| MX9203641A (es) * | 1983-12-16 | 1992-07-01 | Genentech Inc | Interferones gamma recombinantes que poseen estabilidad mejorada y metodos biotecnologicos para su obtencion. |
| US4855238A (en) * | 1983-12-16 | 1989-08-08 | Genentech, Inc. | Recombinant gamma interferons having enhanced stability and methods therefor |
| JPS60155137A (ja) * | 1984-01-23 | 1985-08-15 | Takeda Chem Ind Ltd | 高濃度ヒトγ型インタ−フエロン水溶液の製造法 |
| DE3436638C2 (de) * | 1984-10-05 | 1992-10-08 | Bioferon biochemische Substanzen GmbH & Co, 7958 Laupheim | Verwendung von Interferon-gamma (IFN-gamma) enthaltenden Präparationen zur Behandlung rheumatischer Erkrankungen |
| DE3436637A1 (de) * | 1984-10-05 | 1986-04-10 | Bioferon biochemische Substanzen GmbH & Co, 7958 Laupheim | Verwendung von interferon-gamma (ifn-gamma) enthaltenden praeparationen zur behandlung von schmerzen |
| DE3521733A1 (de) * | 1985-06-18 | 1986-12-18 | Bioferon biochemische Substanzen GmbH & Co, 7958 Laupheim | Verwendung von interferon-gamma (ifn-gamma) enthaltenden praeparationen zur systemischen behandlung von tumoren und viruserkrankungen in niedriger dosierung |
| IL76591A0 (en) * | 1984-10-05 | 1986-02-28 | Bioferon Biochem Substanz | Pharmaceutical compositions containing ifn-ypsilon and processes for the preparation thereof |
| US5019385A (en) * | 1984-11-09 | 1991-05-28 | Kabushiki Kaisha Hayashibara Seibutsu Kagaku Kenkyujo | Novel lymphopine LK 2 and pharmaceutic compositions containing same |
| JPS61137828A (ja) * | 1984-12-07 | 1986-06-25 | Shionogi & Co Ltd | γ−インタ−フエロン製剤組成物 |
| CA1340698C (en) * | 1986-07-25 | 1999-08-10 | Kabushiki Kaisha Hayashibara Seibutsu Kaguku Kenkyujo | Preparation and uses of interferon-gamma |
| DE3731255A1 (de) * | 1987-09-17 | 1989-04-06 | Boehringer Ingelheim Int | Stabilisierung von therapeutisch wirksamen proteinen in pharmazeutischen zubereitungen |
| US5849282A (en) * | 1990-05-09 | 1998-12-15 | Otsuka Pharmaceutical Co., Ltd. | Method of treating colon, renal, and lung carcinomas with γ-interferon and Ser71 !-interleukin-1β |
| ATE212235T1 (de) * | 1991-04-08 | 2002-02-15 | Sumitomo Pharma | Poröse feste zubereitung, die eine physiologische aktive proteinverbindung enthält |
| EP1013667B1 (en) * | 1998-11-09 | 2006-10-11 | Nippon Biologicals, Inc. | Process for preparation of cytokine using a sendai virus expression system |
| CA2870740C (en) | 2012-04-23 | 2017-06-13 | General Electric Company | Turbine airfoil with local wall thickness control |
Family Cites Families (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| BR6914761D0 (pt) * | 1969-01-17 | 1973-03-08 | Merck & Co Inc | Processos quimicos |
| JPS5134442B2 (fi) * | 1972-05-04 | 1976-09-27 | ||
| GB2016015B (en) * | 1978-01-22 | 1982-05-06 | Hayashibara Co | Method of preparing interferon and preparations containing interferon |
| JPS5654158A (en) * | 1979-10-09 | 1981-05-14 | Hitachi Ltd | Control system for call waiting |
-
1979
- 1979-01-18 JP JP454479A patent/JPS5598118A/ja active Granted
-
1980
- 1980-01-07 US US06/109,861 patent/US4285929A/en not_active Expired - Lifetime
- 1980-01-10 DK DK011880A patent/DK169479B1/da active
- 1980-01-11 SE SE8000243A patent/SE451797B/sv unknown
- 1980-01-11 AU AU54561/80A patent/AU536477B2/en not_active Ceased
- 1980-01-16 CH CH341/80A patent/CH650801A5/fr not_active IP Right Cessation
- 1980-01-17 CA CA000343891A patent/CA1135622A/en not_active Expired
- 1980-01-17 FI FI800147A patent/FI68519C/fi not_active IP Right Cessation
- 1980-01-17 NO NO800105A patent/NO156051C/no unknown
- 1980-01-17 DE DE3001585A patent/DE3001585C2/de not_active Expired
- 1980-01-17 IT IT47632/80A patent/IT1143056B/it active
- 1980-01-17 BE BE0/199020A patent/BE881217A/fr not_active IP Right Cessation
- 1980-01-17 GB GB8001662A patent/GB2040292B/en not_active Expired
- 1980-01-17 NL NL8000291A patent/NL8000291A/nl not_active Application Discontinuation
- 1980-01-18 FR FR8001063A patent/FR2446637A1/fr active Granted
- 1980-01-18 ES ES487852A patent/ES8103162A1/es not_active Expired
-
1987
- 1987-05-06 SE SE8701856A patent/SE456741B/sv unknown
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| SE8701856L (sv) | 1987-05-06 |
| FI800147A (fi) | 1980-07-19 |
| IT8047632A0 (it) | 1980-01-17 |
| DK169479B1 (da) | 1994-11-07 |
| NO156051C (no) | 1987-07-15 |
| SE8000243L (sv) | 1980-07-19 |
| FR2446637A1 (fr) | 1980-08-14 |
| NO800105L (no) | 1980-07-21 |
| SE8701856D0 (sv) | 1987-05-06 |
| NL8000291A (nl) | 1980-07-22 |
| AU536477B2 (en) | 1984-05-10 |
| FR2446637B1 (fi) | 1983-07-18 |
| JPS5598118A (en) | 1980-07-25 |
| CH650801A5 (fr) | 1985-08-15 |
| AU5456180A (en) | 1980-07-24 |
| IT1143056B (it) | 1986-10-22 |
| SE451797B (sv) | 1987-11-02 |
| ES487852A0 (es) | 1981-02-16 |
| FI68519B (fi) | 1985-06-28 |
| SE456741B (sv) | 1988-10-31 |
| GB2040292B (en) | 1983-04-13 |
| GB2040292A (en) | 1980-08-28 |
| DE3001585A1 (de) | 1980-07-31 |
| CA1135622A (en) | 1982-11-16 |
| JPS631296B2 (fi) | 1988-01-12 |
| US4285929A (en) | 1981-08-25 |
| DE3001585C2 (de) | 1985-05-15 |
| DK11880A (da) | 1980-07-19 |
| ES8103162A1 (es) | 1981-02-16 |
| NO156051B (no) | 1987-04-06 |
| BE881217A (fr) | 1980-07-17 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| FI68519C (fi) | Foerfarande foer framstaellning av interferon | |
| FI66428C (fi) | Foerfarande foer framstaellning av maenniskospecifikt interferon | |
| FI72143C (fi) | Foerfarande foer framstaellning av maenniskointerferon. | |
| KR930000188B1 (ko) | 신규 림포카인(lymphokine), 이 림포카인에 특이적인 모노클로날 항체 및 이들의 제조방법 | |
| US4328207A (en) | Process for preparing mouse interferon | |
| Mazuski et al. | Direct effects of endotoxin on hepatocytes: Synthesis of a specific secretory protein | |
| US5002878A (en) | Novel lymphokine, monoclonal antibody specific to the lymphokine, and their production and uses | |
| CA1295241C (en) | Lymphokine and its production and uses | |
| JPH0214039B2 (fi) | ||
| KR830001817B1 (ko) | 타이프ⅱ 인터페론의 제조방법 | |
| JPS5888322A (ja) | 標的細胞障害性因子を含有する悪性腫瘍治療剤とその製造方法 | |
| JPS63152993A (ja) | γ―インターフェロンの製造方法 | |
| KR820001174B1 (ko) | 사람 특이성 인터페론의 제조법 | |
| JPS5815921A (ja) | 抗リンホトキシン感受性疾患剤 | |
| JPS61263929A (ja) | 抗タイプ２インターフェロン感受性疾患剤 | |
| JPS61115026A (ja) | 新リンホカイン２の製造方法 | |
| JPH0526468B2 (fi) | ||
| JPS61115027A (ja) | 新リンホカイン２とその製法および用途 | |
| GB2066822A (en) | Process for preparing mouse interferon | |
| JPS61115099A (ja) | モノクロ−ナル抗体とその製法 | |
| JPH0532032B2 (fi) | ||
| JPS61115028A (ja) | 抗腫瘍効果増強剤 | |
| JPS58320B2 (ja) | マウスインタ−フエロンの製造方法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MM | Patent lapsed |
Owner name: ASHIDA, SHIN Owner name: HAYASHIBARA, KEN |