FI122028B - Sieniperäiset endoglukanaasit, niiden tuotto ja käyttö - Google Patents

Sieniperäiset endoglukanaasit, niiden tuotto ja käyttö Download PDF

Info

Publication number
FI122028B
FI122028B FI20086250A FI20086250A FI122028B FI 122028 B FI122028 B FI 122028B FI 20086250 A FI20086250 A FI 20086250A FI 20086250 A FI20086250 A FI 20086250A FI 122028 B FI122028 B FI 122028B
Authority
FI
Finland
Prior art keywords
trichoderma
sequence
dsm
endoglucanase
cel5a
Prior art date
Application number
FI20086250A
Other languages
English (en)
Swedish (sv)
Other versions
FI20086250A (fi
FI20086250A0 (fi
Inventor
Jari Vehmaanperae
Leena Valtakari
George Szakacs
Pentti Ojapalo
Marika Alapuranen
Terhi Puranen
Original Assignee
Ab Enzymes Oy
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Ab Enzymes Oy filed Critical Ab Enzymes Oy
Publication of FI20086250A0 publication Critical patent/FI20086250A0/fi
Priority to FI20086250A priority Critical patent/FI122028B/fi
Priority to BRPI0923794-1A priority patent/BRPI0923794A2/pt
Priority to MX2011007145A priority patent/MX2011007145A/es
Priority to DK09836129.8T priority patent/DK2370572T3/en
Priority to CN200980153611.7A priority patent/CN102272298B/zh
Priority to US13/142,630 priority patent/US8592195B2/en
Priority to EP09836129.8A priority patent/EP2370572B1/en
Priority to PCT/FI2009/051042 priority patent/WO2010076387A1/en
Publication of FI20086250A publication Critical patent/FI20086250A/fi
Application granted granted Critical
Publication of FI122028B publication Critical patent/FI122028B/fi
Priority to US14/057,401 priority patent/US9550984B2/en

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/24—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)
    • C12N9/2402—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing O- and S- glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12N9/2405—Glucanases
    • C12N9/2434—Glucanases acting on beta-1,4-glucosidic bonds
    • C12N9/2437—Cellulases (3.2.1.4; 3.2.1.74; 3.2.1.91; 3.2.1.150)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23K—FODDER
    • A23K20/00—Accessory food factors for animal feeding-stuffs
    • A23K20/10—Organic substances
    • A23K20/189—Enzymes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C11—ANIMAL OR VEGETABLE OILS, FATS, FATTY SUBSTANCES OR WAXES; FATTY ACIDS THEREFROM; DETERGENTS; CANDLES
    • C11D—DETERGENT COMPOSITIONS; USE OF SINGLE SUBSTANCES AS DETERGENTS; SOAP OR SOAP-MAKING; RESIN SOAPS; RECOVERY OF GLYCEROL
    • C11D3/00—Other compounding ingredients of detergent compositions covered in group C11D1/00
    • C11D3/16—Organic compounds
    • C11D3/38—Products with no well-defined composition, e.g. natural products
    • C11D3/386—Preparations containing enzymes, e.g. protease or amylase
    • C11D3/38645—Preparations containing enzymes, e.g. protease or amylase containing cellulase
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/52—Genes encoding for enzymes or proenzymes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
    • C12P19/02—Monosaccharides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
    • C12P19/14—Preparation of compounds containing saccharide radicals produced by the action of a carbohydrase (EC 3.2.x), e.g. by alpha-amylase, e.g. by cellulase, hemicellulase
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y302/00—Hydrolases acting on glycosyl compounds, i.e. glycosylases (3.2)
    • C12Y302/01—Glycosidases, i.e. enzymes hydrolysing O- and S-glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12Y302/01004—Cellulase (3.2.1.4), i.e. endo-1,4-beta-glucanase
    • D—TEXTILES; PAPER
    • D06—TREATMENT OF TEXTILES OR THE LIKE; LAUNDERING; FLEXIBLE MATERIALS NOT OTHERWISE PROVIDED FOR
    • D06M—TREATMENT, NOT PROVIDED FOR ELSEWHERE IN CLASS D06, OF FIBRES, THREADS, YARNS, FABRICS, FEATHERS OR FIBROUS GOODS MADE FROM SUCH MATERIALS
    • D06M16/00—Biochemical treatment of fibres, threads, yarns, fabrics, or fibrous goods made from such materials, e.g. enzymatic
    • D—TEXTILES; PAPER
    • D06—TREATMENT OF TEXTILES OR THE LIKE; LAUNDERING; FLEXIBLE MATERIALS NOT OTHERWISE PROVIDED FOR
    • D06M—TREATMENT, NOT PROVIDED FOR ELSEWHERE IN CLASS D06, OF FIBRES, THREADS, YARNS, FABRICS, FEATHERS OR FIBROUS GOODS MADE FROM SUCH MATERIALS
    • D06M16/00—Biochemical treatment of fibres, threads, yarns, fabrics, or fibrous goods made from such materials, e.g. enzymatic
    • D06M16/003—Biochemical treatment of fibres, threads, yarns, fabrics, or fibrous goods made from such materials, e.g. enzymatic with enzymes or microorganisms
    • D—TEXTILES; PAPER
    • D21—PAPER-MAKING; PRODUCTION OF CELLULOSE
    • D21C—PRODUCTION OF CELLULOSE BY REMOVING NON-CELLULOSE SUBSTANCES FROM CELLULOSE-CONTAINING MATERIALS; REGENERATION OF PULPING LIQUORS; APPARATUS THEREFOR
    • D21C5/00—Other processes for obtaining cellulose, e.g. cooking cotton linters ; Processes characterised by the choice of cellulose-containing starting materials
    • D21C5/005—Treatment of cellulose-containing material with microorganisms or enzymes
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02P—CLIMATE CHANGE MITIGATION TECHNOLOGIES IN THE PRODUCTION OR PROCESSING OF GOODS
    • Y02P20/00—Technologies relating to chemical industry
    • Y02P20/50—Improvements relating to the production of bulk chemicals
    • Y02P20/52—Improvements relating to the production of bulk chemicals using catalysts, e.g. selective catalysts

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Polymers & Plastics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Animal Husbandry (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Textile Engineering (AREA)
  • Oil, Petroleum & Natural Gas (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Detergent Compositions (AREA)
  • Chemical Or Physical Treatment Of Fibers (AREA)

Description

Sieniperäiset endoglukanaasit, niiden tuotto ja käyttö
Keksinnön ala Tämä keksintö koskee uudenlaisia sieniperäisiä endoglukanaaseja, niiden tuottamista sekä keinoja niiden tuottamiseksi. Tämä keksintö koskee li-5 säksi entsyymivalmisteita, jotka käsittävät vähintään yhtä uudenlaista endoglu-kanaasia, sekä menetelmiä selluloosapitoisen materiaalin käsittelemiseksi näillä entsyymivalmisteilla. Tämä keksintö koskee vielä lisäksi näitä endoglukanaaseja käsittäviä pesuainekoostumuksia ja eläinrehua.
Keksinnön tausta 10 Sellulaasit kuuluvat teollisuudessa kaikkein laajimmin käytettäviin entsyymeihin. Niitä käytetään yleisesti tekstiiliteollisuudessa, pesuaineteolli-suudessa, sellu-ja paperiteollisuudessa, rehu-ja ruokateollisuudessa, esimerkiksi leivonnassa, sekä lignoselluloosapitoisen materiaalin käsittelyssä esimerkiksi bioetanolin tuotantoa varten jne. Sellulaasikoostumusten luonne vaikeut-15 taa sellulaasien tarkoituksenmukaista käyttöä, koska nämä koostumukset ovat usein entsyymiseoksia, joilla on useita erilaisia aktiivisuuksia ja substraattis-pesifisyyksiä. Tästä syystä on yritetty aikaansaada sellulaaseja, joilla on ainoastaan halutut aktiivisuudet. Kunkin sellulaasin ainutlaatuiset ominaisuudet tekevät joistakin niistä sopivampia tiettyihin tarkoituksiin kuin muista sellulaaseis-20 ta.
Kankaan käsittelyssä sellulaasit hyökkäävät puuvillasäikeitä muodostavien selluloosamolekyylien ketjuihin ja vaikuttavat siten kankaan ominaisuuksiin.
Tekstiiliteollisuudessa ’’kivipesty” tai kulunut ulkonäkö on ollut viime ^ 25 vuosina farmarikankaiden valmistajien kiinnostuksen kohteena. Perinteinen ki-
O
^ vipesu hohkakivillä heikentää kankaan lujuutta ja rasittaa pesulaitteita. Suun- o taus on ollut kohti entsymaattisia farmarikankaan pintakäsittelyprosesseja, ja o? sellulaasit ovat korvanneet hohkakivet tai niitä käytetään yhdessä hohkakivien g kanssa antamaan kankaalle sen halutun ’’kuluneen” ulkonäön. Kontrolloidut
CL
30 entsyymikäsittelyt aiheuttavat vähemmän vaurioita vaatekappaleille ja koneille
O
^ sekä poistavat kivien hävittämistarpeen.
CD
g Tekstiiliteollisuus käyttää sellulaaseja lisäksi bioviimeistelyyn, so.
° nyppyjen poiston tuottaman pysyvän parannuksen aikaansaamiseen, sekä nyppyyntymiskestävyyden parantamiseen, pintarakenteen kirkastamiseen vä-35 hentyneen nukkaisuuden kautta, tekstiilien käsittelyn kuten pehmeyden, siley- 2 den ja silkkimäisen tunnun parantamiseen, tekstiilin laskeutuvuuden ja kirkkaampien värien parantamiseen sekä kosteuden imukyvyn parantamiseen.
Sellulaasit käsittävät katalyyttisen domeenin tai ytimen (CD), joka ilmentää sellulaasiaktiivisuutta. Sellulaasimolekyyli voi käsittää katalyyttisen 5 domeenin lisäksi yhden tai useamman selluloosaa sitovan domeenin (CBD:t), joita kutsutaan myös hiilihydraatteja sitoviksi domeeneiksi tai moduuleiksi (CBD/CBM), jotka voivat sijaita katalyyttisen domeenin joko N- tai C-päässä. CBD:illä on hiilihydraatteja sitovaa aktiivisuutta, ja ne helpottavat entsymaattista toimintaa kiinteillä substraateilla. Katalyyttinen ydin ja CBD ovat tyypillisesti 10 toisiinsa yhdistettyjä joustavan ja erittäin glykosyloidun linkkerialueen kautta.
Sellulaasit, jotka hyökkäävät ensisijassa säikeen pintaan, ovat erityisen käyttökelpoisia indigovärillä värjätyn farmarikankaan kivipesussa, koska väri on säikeen pinnalla. Farmarikankaan käsittelyyn käytetyt sellulaasit jaetaan yleensä kahteen pääluokkaan: happamat ja neutraalit sellulaasit. Happa-15 mat sellulaasit toimivat tyypillisesti pH-välillä 4,5-5,5 ja neutraalit sellulaasit pH-välillä 6-8. Kun happamia sellulaaseja käytetään puuvillakankaan käsittelyyn, ne yleensä tarvitsevat lyhyemmän pesuajan kuin neutraalit sellulaasit. Happamia sellulaaseja käytetään erityisesti bioviimeistelyssä (nyppyjen poistossa) sekä lisäksi farmarikankaan käsittelyssä (biokivipesussa). Biokivipesus-20 sa käytettävät happamat sellulaasit ovat pääasiassa peräisin Trichoderma ree-seistä (Hypocrea jecorinan suvullinen muoto) ja neutraalit sellulaasit ovat peräisin useista erilaisista sienistä, esimerkiksi suvuista Melanocarpus, Humicola, Thielavia, Myceliophthora, Fusarium, Acremonium ja Chrysosporium (Haakana et ai. 2004). T. reesei -entsyymeihin kuuluvat esimerkiksi glykosidiperheestä 5 25 (endoglukanaasi II, EGII), perheestä 7 (sellobiohydrolaasi I, CBHI) ja perheestä 12 (endoglukanaasi III, EGIII; Ward et ai. 1993) peräisin olevat sellulaasit o sekä perheestä 45 ja perheestä 7 peräisin olevat neutraalit sellulaasit, useim-
CVI
^ miten endoglukanaasit (Henrissat, 1991; Henrissat ja Bairoch, 1993).
° Endoglukanaasien teollisten käyttöjen laaja kirjo on luonut tarpeen 00 30 kaupallisille endoglukanaasituotteille, joilla on haluttu toimintakyky halutuissa | olosuhteissa kuten halutuilla pH- ja lämpötilaväleillä. EGII- ja EGIII -entsyy- o meiksi luokiteltuja happamia sellulaaseja on kuvattu käytettäviksi mm. tekstiili- en käsittelyssä. Esimerkiksi julkaisu W02007/118935 kuvaa Cel5 (EGII) -ent-o syymien käytön tekstiilien pintakäsittelyssä. EP 586 375 B1 kuvaa pesuaine- ^ 35 koostumukset, jotka käsittävät perusteellisesti karakterisoitua Trichoderma
spp. EGIII -entsyymiä, jonka pH-optimi on 5,5-6,0, jonka pi on 7,2-8,0 ja MW
3 23-28 kDa. Patenttijulkaisu US2007/0026420 kuvaa menetelmän geenien saamiseksi uudenlaisille entsyymeille, joilla on tiettyjä yhteisiä konservoituneita sekvenssejä Trichoderma reeseistä peräisin olevan EGIII:n kanssa. EGIII:n kuten sellulaasien ominaisuuksista ei anneta esimerkkejä, mutta 35-65 °C:n 5 lämpötilan odotetaan olevan sopiva näille entsyymeille.
Suurin osa teollisesti käytettävistä entsyymeistä toimii paremmin kohotetuissa lämpötiloissa, tavallisesti noin >50 °C:n lämpötiloissa, mutta energiansäästösyistä, paremman värinpysyvyyden ja vaatekappaleiden kutistumisen vähentämisen vuoksi on tarvetta entsyymeille, joilla on hyvä toiminta-10 kyky alemmissa lämpötilatasoissa, so. <50 °C:n lämpötiloissa, esimerkiksi noin 30-40 °C:ssa tai jopa 20-40 °C:ssa. Tällaisia kylmäaktiivisia entsyymejä on kuvattu esimerkiksi bakteereissa, erityisesti Bacilluksella. Bakteeriperäisten entsyymien tuottaminen teollisiin sovelluksiin on kuitenkin monimutkaista ja työlästä verrattuna sieniperäisten entsyymien tuottamiseen. Mahdollisista kyl-15 mäaktiivisista sieniperäisistä endoglukanaaseista on silti yhä hyvin vähän tietoja.
Siten on olemassa jatkuvaa tarvetta uusille ja edullisille endoglu-kanaaseille, joilla on halutut ominaisuudet ja lämpötilaprofiilit. Esillä oleva keksintö täyttää tämän tarpeen.
20 Keksinnön lyhyt kuvaus
Esillä oleva keksintö tarjoaa nyt käyttöön uudenlaisia endoglu-kanaaseja, joilla on ainutlaatuinen lämpötila- tai pH-profiili. Ainutlaatuiset läm-pötilaominaisuudet tarkoittavat, että mitään huomattavaa toimintakyvyn alenemista ei havaita, kun lämpötila on alle 50 °C, esimerkiksi noin 40 °C, noin 25 30 °C tai jopa alhaisempi. Endoglukanaasit ovat käyttökelpoisia erilaisissa sel- ^ lulaasien sovellutuksissa kuten kankaiden käsittelyssä, erityisesti farmarikan- ^ kaan käsittelyssä ja nyppyjen poistossa.
LT) 9 Esillä oleva keksintö tarjoaa käyttöön uudenlaiset endoglukanaasit, ° jotka kuuluvat glykosyylihydrolaasiperheeseen 12, so. EGIIl-polypeptideihin, | 30 jotka voivat olla peräisin Trichodermasta tai Hypocreasta. Tämä keksintö kos- 0 kee erityisesti sieniperäistä endoglukanaasipolypeptidiä, joka kuuluu glykosyy- £3 lihydrolaasiperheeseen 12 ja joka käsittää aminohapposekvenssin, jolla on vä- o hintään 60-prosenttinen sekvenssi-identtisyys sekvenssin nro 64, vähintään o ^ 85-prosenttinen sekvenssi-identtisyys sekvenssin nro 66, vähintään 83-pro- 35 senttinen sekvenssi-identtisyys sekvenssin nro 68 tai vähintään 63-prosentti- 4 nen sekvenssi-identtisyys sekvenssin nro 70 kanssa, tai sen entsymaattisesti aktiivista fragmenttia.
Lisäksi tässä kuvataan endoglukanaasit, jotka kuuluvat glykosyyli-hydrolaasiperheeseen 5, so. EGII-polypeptideihin, jotka voivat olla peräisin 5 sienestä Trichoderma tai Hypocrea. Tämä keksintö koskee erityisesti sieniperäistä endoglukanaasipolypeptidiä, joka kuuluu glykosyylihydrolaasiperhee-seen 5 ja joka käsittää aminohapposekvenssin, jolla on vähintään 77-prosenttinen sekvenssi-identtisyys sekvenssin nro 42, vähintään 70-pro-senttinen sekvenssi-identtisyys sekvenssin nro 44, vähintään 78-prosenttinen 10 sekvenssi-identtisyys sekvenssin nro 46, vähintään 70-prosenttinen sekvenssi-identtisyys sekvenssin nro 48, vähintään 72-prosenttinen sekvenssi-identtisyys sekvenssin nro 50, vähintään 78-prosenttinen sekvenssi-identtisyys sekvenssin nro 52, vähintään 94-prosenttinen sekvenssi-identtisyys sekvenssin nro 54, vähintään 72-prosenttinen sekvenssi-identtisyys sekvenssin nro 56, vähintään 15 82-prosenttinen sekvenssi-identtisyys sekvenssin nro 58 tai vähintään 73-prosenttinen sekvenssi-identtisyys sekvenssin nro 60 kanssa, tai sen entsymaattisesti aktiivista fragmenttia.
Edelleen tässä kuvataan endoglukanaasit, jotka kuuluvat glykosyyli-hydrolaasiperheeseen 5, so. EGII-polypeptideihin, jotka voivat olla peräisin 20 muista sienistä kuin Trichodermasta tai Hypocreasta, kuten sienistä Penicilli-um, Fusarium tai Geomyces. Tämä keksintö koskee erityisesti sieniperäistä endoglukanaasipolypeptidiä, joka kuuluu glykosyylihydrolaasiperheeseen 5 ja joka käsittää aminohapposekvenssin, jolla on vähintään 70-prosenttinen sekvenssi-identtisyys sekvenssin nro 72, vähintään 72-prosenttinen sekvenssi-25 identtisyys sekvenssin nro 74, vähintään 72-prosenttinen sekvenssi-identtisyys sekvenssin nro 76, vähintään 91-prosenttinen sekvenssi-identtisyys sekvens-5 sin nro 78, vähintään 61-prosenttinen sekvenssi-identtisyys sekvenssin nro 80
(M
^ tai vähintään 62-prosenttinen sekvenssi-identtisyys sekvenssin nro 82 kanssa, ° tai sen entsymaattisesti aktiivista fragmenttia.
00 30 Tämä keksintö koskee lisäksi keksinnön mukaista endoglukanaasia | käsittävää entsyymivalmistetta sekä mainittua entsyymiä tai entsyymivalmistet- o ta käsittäviä pesuainekoostumuksia ja eläinrehua.
m Tämä keksintö koskee lisäksi eristettyä polynukleotidia, joka vali-o taan ryhmästä, joka koostuu seuraavista:
(M
5 a) nukleotidisekvenssi, jolla on sekvenssin nro 63, 65, 67 tai 69 mukainen sekvenssi tai edellä kuvattua endoglukanaasipolypeptidiä koodaava sekvenssi, b) kohdan a) juosteelle komplementaarinen juoste; tai 5 c) sekvenssi, joka on geneettisen koodin suhteen degeneroitunut minkä tahansa kohdan a) tai b) mukaisesta sekvenssistä.
Tämä keksintö koskee lisäksi mainitun polynukleotidin käsittävää ekspressiovektoria, mainitun ekspressiovektorin käsittävää isäntäsolua sekä E. coli -kantaa, joka sisältää mainitun polynukleotidin ja jolla on tunnusnumero 10 DSM 18643, DSM 19420, DSM 19899 tai DSM 19896.
Tämä keksintö tarjoaa vielä lisäksi käyttöön menetelmän endoglu-kanaasipolypeptidin tuottamiseksi, joka menetelmä käsittää vaiheet, joissa isäntäsolu transformoidaan mainittua polypeptidiä koodaavalla ekspressiovek-torilla ja mainittua isäntäsolua viljellään olosuhteissa, jotka mahdollistavat mai-15 nitun polypeptidin ilmentämisen, ja mainittu polypeptidi otetaan mahdollisesti talteen ja puhdistetaan.
Lopuksi tämä keksintö tarjoaa käyttöön prosessin selluloosapitoisen materiaalin käsittelemiseksi, jolloin mainittu prosessi käsittää selluloosapitoisen materiaalin saattamisen kosketukseen tämän keksinnön mukaisen endoglu-20 kanaasipolypeptidin tai entsyymivalmisteen kanssa. Esimerkki tällaisesta menetelmästä on lignoselluloosabiomassan käsitteleminen esimerkiksi bioetanolin tuotantoa varten.
Tämän keksinnön spesifiset suoritusmuodot esitetään epäitsenäisissä patenttivaatimuksissa. Esillä olevan keksinnön muut tavoitteet, yksityis-25 kohdat ja edut tulevat ilmeisiksi seuraavista piirustuksista, yksityiskohtaisesta selityksestä ja esimerkeistä. On kuitenkin ymmärrettävä, että kuvauksessa, pii- 5 rustuksissa ja esimerkeissä annetut suoritusmuodot ovat ainoastaan havain-
(M
^ nollistavia tarkoituksia varten ja että erilaiset muutokset ja modifikaatiot ovat ° patenttivaatimusten suojapiirissä mahdollisia.
CO
g 30 Piirustusten lyhyt kuvaus
CL
Kuvio 1 on kaavamainen piirros Trichoderma reesei -protoplastien £3 transformaatiossa käytetyistä ekspressiokaseteista Cel45-rekombinantti prote- o Unien ylituottamista varten.
o ^ Kuvio 2 A) esittää Trichodermasta tai Hypocreasta peräisin olevien 35 rekombinanttisten Cel5A/EGII-proteiinivalmisteiden pH-optimit, B) esittää Tri chodermasta peräisin olevien rekombinanttisten Cel12A/EGIII-proteiinivalmis- 6 teiden pH-optimit ja C) esittää muista sienistä kuin Trichodermasta peräisin olevien rekombinanttisten Cel5A/EGII-proteiinivalmisteiden pH-optimit; D) esittää Trichodermasta tai Hypocreasta peräisin olevien rekombinanttisten Cel5A/EGII-proteiinivalmisteiden lämpötilakestävyyden, E) esittää Trichoder-5 masta peräisin olevien rekombinanttisten Cel12A/EGIII-proteiinivalmisteiden lämpötilakestävyyden ja F) esittää muista sienistä kuin Trichodermasta peräisin olevien rekombinanttisten EGII/Cel5-proteiinivalmisteiden lämpötilakestävyyden.
Kuviot 3-5 esittävät Trichodermasta peräisin olevien rekombinant-10 tisten Cel12A/EGIII-proteiinivalmisteiden lämpötilaprofiilit farmarikankaan käsittelyssä.
Kuvio 6 esittää Fusariumista peräisin olevan rekombinanttisen Cel12A/EGII-proteiinivalmisteen pH-profiilin farmarikankaan käsittelyssä.
Kuvio 7 esittää Cel12-rekombinanttivalmisteen 7s_RF6193_Cel12A 15 toimintakyvyn bioviimeistelyssä (nukanpoisto) 40 °C:ssa kontrollinäytteeseen verrattuna, jossa ei ole entsyymiä.
Keksinnön yksityiskohtainen kuvaus Tämä keksintö perustuu tutkimuksiin, joissa sieniviljelmäkokoelmas-ta seulottiin selluloosaa hajottavaa matalan lämpötilan aktiivisuutta. Sienikanto-20 ja viljeltiin 20 °C:ssa 3-7 päivää erilaisia tuottoalustoja käyttäen. Supernatantit otettiin talteen ja selluloosaa hajottavaa aktiivisuutta testattiin karboksimetyyli-selluloosaa (CMC) ja hydroksietyyliselluloosaa (HEC) vastaan 30 °C ja 50 °C:n lämpötiloissa matalien lämpötilaprofiilien seulomiseksi. Suotuisimpia kantoja testattiin edelleen pienimittaisissa biologisen kivipesun sovellutuksissa 4-7 25 päivän 20 °C:ssa viljelemisen jälkeen. Alustavan seulonnan jälkeen 13 kantaa ^ valittiin genomisten kirjastojen rakentamiseen ja kirjastoja seulottiin edelleen ^ ce/5:n ja ce/12:n suhteen. Positiiviset faagikloonit subkloonattiin bakteerivekto- in 9 reihin ja varmistettiin sekvensoimalla ennen DSMZ:ään tallettamista. Cel5- tai ° Cel12-entsyymien tuottamiseksi haluttuja aktiivisuuksia koodaavat geenit fuu- ϊε 30 sioitiin Trichoderma reesein cbf7l/ce/7A-promoottoriin. Transkription lopetus
CL
varmistettiin T. reesein cbh'\IceHA-terminaattorilla, ja amc/S-markkeria käytettä tiin positiivisten kloonien seulontaan. Vektorirungosta eristettiin lineaariset eks- o pressiokasetit ja ne transformoitiin T. reesei -protoplasteihin, joiden tärkeimmät o cvi sellulaasit oli poistettu. Puhdistettuja transformantteja viljeltiin 7 päivää sellu- 35 laaseja indusoivassa elatusaineessa ja endoglukanaasiaktiivisuus testattiin viljelmän supernatantista. Myös lämpötila- ja phl-ominaisuudet testattiin. Materi- 7 aali suurimittaiseen sovellutukseen saatiin 28 °C:n laboratoriobioreaktoriviljel-mistä, jotka kestivät 3-4 päivää, minkä jälkeen materiaali suodatettiin ja väke-vöitiin tarvittaessa.
Viljelmien supernatantit testattiin farmarikangaskäsittelyssä pesuko-5 neessa eri lämpötiloissa yhtä kaupallista Cel5- ja yhtä kaupallista Cell2-valmistetta referensseinä käyttäen. Saatu biokivipesun vaikutus arvioitiin värin reflektanssimittauksella. Useimmat entsyymeistä osoittivat farmarikangasso-vellutuksessa erinomaista toimintakykyä myös matalissa lämpötiloissa. Entsyymeillä havaittiin myös olevan erinomainen tai hyvä nyppyjä poistava vaiku-10 tus. Cel5-entsyymin havaittiin yllättävästi olevan neutraali sellulaasi, mikä poikkeaa aikaisemmin kuvatuista tämän sellulaasiperheen entsyymeistä, joiden tiedetään olevan happamia sellulaaseja.
Esillä oleva keksintö tarjoaa käyttöön uudenlaiset sieniperäiset Cel12-endoglukanaasipolypeptidit, joilla on olennainen toimintakyky matalissa 15 lämpötiloissa. Sen lisäksi tässä kuvataan uudenlaiset sieniperäiset Cel5-endoglukanaasipolypeptidit, joilla on erinomainen toimintakyky neutraalissa pH:ssa. Tässä julkaisussa käytettyinä ’’polypeptidi” ja ’’proteiini” ovat synonyymejä.
Tässä yhteydessä ’’sieniperäinen” tarkoittaa, että endoglukanaasi tai 20 sitä koodaava pölynukleotidi voi olla peräisin sienestä ja erityisesti rihmasienes-tä, kuten suvusta Trichoderma, Hypocrea, Penicillium, Geomyces tai Fusari-um. Tämän keksinnön spesifisen suoritusmuodon mukaisesti endoglukanaasi on peräisin lajista T. gamsii, H. rufa / T. viridae, H. atroviridis, T. harzianum, T. fertile, H. koningiopsis, P. spinulosum, P. griseofulvum, G. pannorum tai F. cf 25 equiseti. Edullisimmin polynukleotidi tai polypeptidi on peräisin kannasta Trichoderma sp. RF6193 (CBS121354), Trichoderma gamsii RF6208 (CBS o 119563), Hypocrea rufa / Trichoderma viride RF6310 (CBS 118970), Hypocrea
CM
^ atroviridis RF6323 (CBS 119561), Trichoderma harzianum RF6482 (CBS
° 119562), Trichoderma harzianum RF6541 (CBS 119957), Trichoderma fertile 00 30 RF6601 (CBS 121357), Hypocrea koningiopsis RF6604 (CBS 119960), Peni- | cillium spinulosum RF6286 (CBS 121355), Penicillium griseofulvum Dierckx o RF6288 (CBS 119565), Geomyces pannorum RF6293 (CBS 119567), Geo- myces pannorum RF6547 (CBS 121356) tai Fusarium cf. equiseti RF6318 o (CBS 119568).
^ 35 Mikrobilähteen yhteydessä käsite ’’peräisin jostakin” tarkoittaa, että mainittu spesifinen mikrobilähde voi luonnossa esiintyessään tuottaa polypep- 8 tidiä tai että polypeptidiä koodaava polynukleotidi voidaan eristää mainitusta mikrobilähteestä ja mahdollisesti ilmentää isäntäsolusta, johon mainitusta mik-robilähteestä peräisin oleva polypeptidiä koodaava polynukleotidi on lisätty. Tämä ei kuitenkaan sulje pois sekvenssin vähäisiä modifikaatioita esimerkiksi 5 yhden tai muutaman aminohapon tai nukleotidin substituutiolla, deleetiolla ja/tai insertiolla niin kauan kuin koodatun ja eritetyn proteiinin entsymaattinen aktiivisuus säilyy.
Esillä olevan keksinnön yhteydessä ’’endoglukanaasi” (”EG”) tarkoittaa entsyymejä, jotka luokitellaan luokkaan E.C. 3.2.1.4. Ne ovat 1,4-beeta-D-10 glukaani-4-glukanohydrolaaseja ja katalysoivat 1,4-beeta-D-glykosidisidosten endohydrolyysiä glukoosipolymeereissä kuten selluloosassa. Jotkin endoglu-kanaasit voivat lisäksi hydrolysoida esimerkiksi 1,4-sidoksia beeta-D-glukaa-neissa, jotka sisältävät myös 1,3-sidoksia. Ne voidaan sen vuoksi luokitella en-do-1,3(4)-beetaglukanaaseiksi (E.C. 3.2.1.6). Entsyymi voi siten katalysoida 15 monien substraattien reaktioita ja kuulua moniin luokkiin. Tämän keksinnön mukaiset endoglukanaasit voivat mahdollisesti sisältää signaalisekvenssin sekä yhden tai useamman selluloosaa sitovan domeenin (CBD:n), joka on katalyyttiseen domeeniin tai ytimeen (CD) yhdistynyt.
’’Glykosyylihydrolaasiperhe 5” ja ’’glykosyylihydrolaasiperhe 12” tar-20 koittavat glykosyylihydrolaasiperheitä kuten ne on määritelty julkaisuissa Hen-rissat, 1991, ja Henrissat ja Bairoch, 1993, 1996, joihin tässä viitataan. Gly-kosyylihydrolaasiperheeseen 5 kuuluvia endoglukanaaseja koodaavia geenejä kutsutaan nimellä ce/5 tai egl2 ja koodattuja endoglukanaaseja kutsutaan nimellä Cel5 tai endoglukanaasi II (EGII). Glykosyylihydrolaasiperheeseen 12 25 kuuluvia endoglukanaaseja koodaavia geenejä kutsutaan vastaavasti nimellä ce/12 tai eg/3 ja koodattuja endoglukanaaseja kutsutaan nimellä Cell2 tai en- o doglukanaasi III (EGIII).
cv ^ Jotkin endoglukanaasit osoittavat olennaista toimintakykyä matalas- ° sa lämpötilassa. Tässä yhteydessä ’’olennainen toimintakyky” tarkoittaa, että 00 30 entsyymit osoittavat erinomaista toimintakykyä, kun niitä käytetään vähintään | yhden tyyppisessä sellulaasin sovellusprosessissa, kuten esimerkiksi tekstii- o lien biokivipesussa ja/tai tekstiilien bioviimeistelyssä tai pesussa. Tässä julkai-
LO
™ sussa käytettynä käsite ’’kylmäaktiivinen” tai ’’matala lämpötila” tarkoittaa läm- o pötilaa, joka on <50 °C, erityisesti <45 °C, edullisesti <40 °C, esimerkiksi w 35 <30 °C.
9 Tämän keksinnön yhden suoritusmuodon mukaisesti endoglukanaa-si käsittää aminohapposekvenssin, jolla on vähintään 60-prosenttinen sekvenssi-identtisyys sekvenssin nro 64, vähintään 85-prosenttinen sekvenssi-identtisyys sekvenssin nro 66, vähintään 83-prosenttinen sekvenssi-identtisyys 5 sekvenssin nro 68, vähintään 63-prosenttinen sekvenssi-identtisyys sekvenssin nro 70 kanssa, tai sen entsymaattisesti aktiivisen fragmentin. Edullisesti endoglukanaasi käsittää aminohapposekvenssin, jolla on vähintään 90-pro-senttinen, edullisesti vähintään 95-prosenttinen ja edullisimmin vähintään 98-prosenttinen tai 99-prosenttinen sekvenssi-identtisyys sekvenssin nro 64, 66, 10 68 tai 70 kanssa, tai sen entsymaattisesti aktiivisen fragmentin.
Esillä olevassa yhteydessä käytettynä käsite ’’identtisyys” tarkoittaa kahden aminohapposekvenssin välistä globaalista identtisyyttä toisiinsa verrattuna vastaavan geenin koodaamasta ensimmäisestä aminohaposta viimeiseen aminohappoon. Esillä olevan keksinnön tarkoituksiin identtisyys määritetään 15 edullisesti tunnettujen tietokoneohjelmien avulla tavallisia algoritmeja käyttäen. Esimerkki tällaisesta ohjelmasta on Clone Manager Suite, joka on ohjelma, joka sisältää ohjelmisto-osan Align Part ja jota myy Scientific & Educational Software -yhtiö, Durham, NC, USA. Esillä olevan keksinnön mukaisesti ident-tisyysasteen määrittämiseen käytettiin erityisesti ohjelmaversiota ’’Clone Ma-20 nager 7 Align Plus 5” ja sen toimintoja ’’Compare Two Sequences/Glo-bal/Compare DNA sequences”. Tässä tapauksessa käytettiin seuraavista lähteistä saatavia algoritmeja: Hirschberg, D.S. (1975) A linear space algorithm for computing longest common subsequences, Commun. Assoc. Comput. Mach. 18: 341 - 343; Myers, E.W. ja W. Miller. (1988) Optimal alignments in 25 linear space, CABIOS 4:1, 11 - 17; Chao, K-M, W.R. Pearson ja W. Miller. (1992) Aligning two sequences within a specified diagonal band, CA-BIOS 8:5, 5 481 - 487. Alan ammattilainen tietää, että tulokset ovat vertailukelpoisia aino-
(M
^ asiaan, jos sekvenssin toisiaan vastaavat domeenit rinnastetaan. Näin ollen ^ esimerkiksi sellaisten sellulaasisekvenssien, jotka sisältävät CBD- tai signaa- 00 30 lisekvenssejä, vertailu sellaisiin sekvensseihin, joissa näitä osia ei ole, on tar- £ koituksettomana poissuljettua.
o ’’Entsymaattisesti aktiivinen fragmentti” tarkoittaa tietyn aminohap- m posekvenssin osaa, joka on riittävän pitkä, jotta sillä olisi haluttu entsymaatti-o nen aktiivisuus. Toisin sanoen fragmentti voi olla esimerkiksi vain polypeptidin ^ 35 kypsä osa tai jopa kypsän osan alisekvenssi. Fragmentti voi sisältää tai olla si sältämättä linkkerin ja CBD-domeenin. Tarkemmin sanottuna entsymaattinen 10 aktiivisuus tarkoittaa sellulaasiaktiivisuutta, jolla on katalyyttinen kyky hydrolysoida selluloosaa tai sen johdoksia, kuten endoglukanaasi- tai beetagluka-naasiaktiivisuutta. Endoglukanaasi- ja/tai beetaglukanaasiaktiivisuuden lisäksi joillakin sellulaaseilla voi lisäksi olla hemisellulaasi- ja/tai ksylanaasiaktiivisuut-5 ta. Entsymaattinen aktiivisuus voidaan määrittää kuten esimerkissä 1 kuvataan.
Tämän keksinnön mukaiset polynukleotidit voivat olla joko DNA:ta tai RNA:ta. Tämän keksinnön yhden suoritusmuodon mukaisesti endoglu-kanaaseja koodaa polynukleotidi, jolla on sekvenssin nro 63, 65, 67 tai 69, tai 10 sen fragmentti, joka on riittävän pitkä koodaamaan entsymaattisesti aktiivista endoglukanaasia. Endoglukanaaseja koodaa edullisesti polynukleotidi, joka on samanlainen kuin mikä sisältyy kantaan E. coli DSM 18643, DSM 19420, DSM 19899 tai DSM 19896.
Tämän keksinnön mukaiset endoglukanaasit ovat edullisesti rekom-15 binanttiproteiineja. Ne valmistetaan kätevästi yleisesti tunnetulla rekombinantti-DNA-tekniikalla heterologisessa tai homologisessa isännässä. Edullisesti endoglukanaasi yliekspressoidaan sieni-isännässä. Lyhyesti kerrottuna endoglukanaasia koodaava polynukleotidi kloonataan ja lisätään ekspressiovektoriin, transformoidaan isäntäsoluun ja ilmennetään.
20 ’’Ekspressiovektori” on kloonausplasmidi tai vektori, joka kykenee ilmentämään endoglukanaasiproteiineja koodaavaa DNA:ta sen jälkeen, kun ekspressiovektori on transformoitu haluttuun isäntään. Kun käytetään sieni-isäntää, kiinnostava geeni viedään sieni-isäntään edullisesti osana kloonaus-tai ekspressiokuljetinta, joka integroituu sienen kromosomiin tai sallii kiinnosta-25 van geenin integroitua isännän kromosomiin. Integraatioprosessin aikana myös muita kloonaus- tai ekspressiokuljettimen osana olevia sekvenssejä voi o integroitua yhdessä mainitun DNA:n kanssa. Ekspressiovektori tai sen osat
CM
^ voidaan lisäksi kohdistaa ennaltamäärättyihin lokuksiin sienissä. Haluttu geeni ^ voidaan vaihtoehtoisesti aikaansaada itsenäisesti replikoituvana plasmidina.
00 30 Endoglukanaasiproteiineja koodaava DNA sijoitetaan edullisesti £ vektorissa olevien tiettyjen kontrollisekvenssien kuten promoottorisekvenssien o kontrollin alaiseksi (so. yhdistetään toiminnallisesti niihin). Transformaation ai to kana nämä kontrollisekvenssit integroituvat isäntägenomiin yhdessä kiinnosta-o van geenin kanssa. Kontrollisekvenssit voivat vaihtoehtoisesti olla integroitu- ^ 35 miskohdan kontrollisekvenssejä.
11
Ekspressiovektorin ekspression kontrollisekvenssit vaihtelevat riippuen siitä, onko vektori suunniteltu ilmentämään tiettyä geeniä prokaryootti-sessa vai eukaryoottisessa isännässä. Ekspression kontrollisekvenssit voivat sisältää transkription säätelyelementtejä, kuten promoottoreita, tehostajaele-5 menttejä ja transkription lopetussekvenssejä, ja/tai translaation säätelyelementtejä, kuten translaation aloitus-ja lopetuskohtia.
Polynukleotidimolekyylin, kuten DNA:n, sanotaan kykenevän ilmentämään polypeptidiä, jos polynukleotidimolekyyli sisältää transkription säätely-tiedot sisältävät ekspression kontrollisekvenssit ja tällaiset sekvenssit ovat toi-10 minnallisesti yhdistettyjä polypeptidiä koodaavaan nukleotidisekvenssiin.
Toiminnallinen yhdistäminen on yhdistämistä, jossa sekvenssi on yhdistetty säätelevään sekvenssiin (tai sekvensseihin) sillä tavalla, että sekvenssin ilmentäminen tulee säätelevän sekvenssin vaikutuksen tai kontrollin alaiseksi. Kahden DNA-sekvenssin (kuten promoottorialueen sekvenssi yhdis-15 tettynä proteiinia koodaavan sekvenssin 5'-päähän) sanotaan olevan toiminnallisesti yhdistetty, jos promoottorin toiminta johtaa transkriptioon.
Tämän keksinnön mukaiset vektorit voivat lisäksi käsittää muita toiminnallisesti yhdistettyjä sääteleviä elementtejä, kuten tehostajasekvenssejä.
Edullisessa suoritusmuodossa rakennetaan geneettisesti stabiilit 20 transformantit, jolloin proteiineja koodaava DNA integroidaan isännän kromosomiin sellaisella vektorilla transformoimalla, joka voi sisältää sekvenssejä, jotka edistävät mainitun vektorin integroitumista kromosomiin.
Solut, jotka ovat integroineet endoglukanaasiproteiineja koodaavan DNA:n stabiilisti kromosomeihinsa, voidaan selektoida esimerkiksi lisätyllä 25 markkerilla (markkereina), homologisella tai heterologisella, joka mahdollistaa niiden isäntäsolujen selektoimisen, jotka sisältävät ekspressiovektorin kro-5 mosomissa; markkeri voi aikaansaada esimerkiksi resistenssin biosideille,
CV
^ esimerkiksi antibiooteille tai raskasmetalleille kuten kuparille, tai markkerit voi- ^ vat komplementoida isäntäkromosomin auksotrofista mutaatiota jne. Selektoi- 00 30 tava markkeri voi olla esimerkiksi selektiogeeni, joka on suoraan yhdistetty il- £ mennettäviin DNA-geenisekvensseihin tai joka on lisätty samaan soluun sa- o manaikaisella transformaatiolla. Myös muita selektiojärjestelmiä voidaan käyt-
LO
S tää.
o Kun endoglukanaasia koodaavan DNA:n sisältävä ekspressiovektori ^ 35 on valmistettu, se lisätään sopivaan isäntäsoluun millä tahansa monista erilai sista alalla tunnetuista sopivista keinoista, esimerkiksi transformaatiolla. Trans- 12 formaation jälkeen vastaanottajasoluja kasvatetaan yleensä sopivassa selektiivisessä elatusaineessa, jolla selektoidaan transformoituneiden solujen kasvua.
Sopivia ekspressio- ja tuottoisäntäjärjestelmiä ovat esimerkiksi sieni-isännille Trichoderma (EP 244 234) tai Aspergillus, kuten A. oryzaelle tai A.
5 nigerille (julkaisut WO 97/08325 ja WO 95/33386, US-patentti nro 5 843 745, US-patentti nro 5 770 418), kehitetty tuottojärjestelmä tai Fusariumille, kuten F. oxysporumille (Malardier et ai., 1989) tai Chrysosporium luckowenselle, kehitetty tuottojärjestelmä. Tämän keksinnön edullisen suoritusmuodon mukaan voidaan käyttää osittain sellulaasi- ja/tai hemisellulaasi- ja/tai proteaasipuut-10 teellisiä isäntä kantoja. Bakteereille kehitettyjä sopivia tuottojärjestelmiä ovat Bacillukselle, esimerkiksi B. subtilikselle, B. licheniformikselle, B. amyloliquefa-ciensikselle tai E. colille kehitetty tuottojärjestelmä tai sädesienelle Streptomy-ces kehitetty tuottojärjestelmä. Hiivoille kehitettyjä sopivia tuottojärjestelmiä ovat järjestelmät, jotka on kehitetty hiivoille Saccharomyces, Shizosaccharo-15 myces, Pichia pastoris tai Hansenula. Lisäksi mahdollisia ovat tuottojärjestel-mät muissa mikrobeissa, esimerkiksi bioetanolituotantoon tarkoitetuissa yhdistetyn prosessoinnin fermentatiivisissa mikrobeissa, tai nisäkässoluissa tai kasveissa.
Kloonatun geenisekvenssin (-sekvenssien) ilmentäminen johtaa ha-20 lutun proteiinin tuotantoon tai tämän proteiinin fragmentin tuotantoon. Tämä ilmentäminen voi tapahtua transformoiduissa soluissa jatkuvalla tavalla tai kontrolloidulla tavalla.
Tämän keksinnön mukaisten entsyymivalmisteiden saamiseksi halutut ominaisuudet omaavia isäntiä (tämä tarkoittaa isäntiä, jotka kykenevät il-25 mentämään taloudellisesti järkeviä määriä endoglukanaasiproteiineja) viljellään sopivissa olosuhteissa, ja halutut entsyymit erittyvät edullisesti isännistä viljel-5 män elatusaineeseen ja otetaan mahdollisesti talteen mainitusta viljelmän ela-
C\J
^ tusaineesta alalla tunnetuilla menetelmillä. Tällaisen tuotannon isäntä on edul- ^ lisesti rihmasieni, kuten Trichoderma tai Aspergillus, ja erityisesti T. reesei.
00 30 Esillä olevassa yhteydessä käytettynä ’’entsyymivalmiste” tarkoittaa | mitä tahansa entsyymituotetta, joka sisältää vähintään yhden tässä julkaisussa o kuvatun uudenlaisen endoglukanaasin. Tällainen entsyymivalmiste voi siten ol in ™ la käytetty viljelmän elatusaine tai suodos. Käytetty viljelmän elatusaine tarkoit- o taa isännän viljelmän elatusainetta, joka käsittää tuotettuja entsyymejä. Edulli- ™ 35 sesti isäntäsolut erotellaan mainitusta elatusaineesta tuoton jälkeen. Tällaiset valmisteet voidaan haluttaessa kylmäkuivata tai entsymaattinen aktiivisuus 13 voidaan muuten väkevöidä ja/tai stabiloida säilytystä varten. Haluttu entsyymi voidaan tarvittaessa eristää ja puhdistaa edelleen tavanomaisten menetelmien avulla, kuten suodattamalla, uuttamalla, saostamalla, kromatografialla, affini-teettikromatografialla, elektroforeesilla tai vastaavalla.
5 Tämän keksinnön etuna on kuitenkin se, että viljelmän elatusainetta isäntäsolujen kanssa tai ilman niitä voidaan käyttää entsyymivalmisteena sellaisenaan ilman lisäpuhdistusta, koska endoglukanaasiproteiinit voidaan erittää viljelmän elatusaineeseen ja ne osoittavat aktiivisuutta käytetyn elatusaineen ympäröivissä olosuhteissa. Entsyymivalmisteet ovat hyvin taloudellisia aikaan-10 saataviksi ja käytettäviksi, koska spesifisen entsyymin puhdistaminen viljelmän elatusaineesta ei ole välttämätöntä.
Yhden tai useamman endoglukanaasiproteiinin lisäksi entsyymivalmisteet voivat käsittää yhtä tai useampaa muuta entsyymiä, joita voivat olla esimerkiksi muut sellulaasit, amylaasit, lipaasit, proteaasit, hemisellulaasit, ksy-15 lanaasit, pektinaasit ja/tai oksidaasit kuten lakkaasit, peroksidaasit ja katalaa si. Ennen endoglukanaasiproteiinilla käsittelemistä tai sen aikana tai sen jälkeen voidaan tehdä vaihtoehtoisesti toinen entsyymikäsittely. Entsyymikäsittely voi käsittää esimerkiksi yhden tai useamman amylaasikäsittelyn (esimerkiksi farmarikankaan liimanpoistoa varten), yhden tai useamman sellulaasikäsittelyn 20 ja/tai yhden tai useamman peroksidaasi- ja/tai lakkaasikäsittelyn. Riippuu sovellutuksesta, mitä muita entsyymejä entsyymivalmisteeseen sisällytetään tai mitä muita entsyymejä entsyymi käsittelyssä käytetään.
Endoglukanaasiproteiinin lisäksi entsyymivalmiste voi sisältää lisäaineita, kuten stabilointiaineita, puskureita, säilöntäaineita, pinta-aktiivisia ai-25 neita ja/tai viljelmän elatusaineen aineosia. Edullisia lisäaineita ovat sellaiset, joita käytetään yleisesti sellaisissa entsyymivalmisteissa, jotka on tarkoitettu 5 siihen sovellutukseen, johon entsyymivalmistetta käytetään.
CM
^ Entsyymivalmisteet voidaan tarjota käyttöön nestemäisinä tai kiin- ^ teinä, esimerkiksi kuivattuna jauheena tai rakeina, erityisesti pölyämättöminä 00 30 rakeina, tai stabiloituna nesteenä. On ajateltavissa, että entsyymivalmisteita | voidaan edelleen rikastaa spesifisen hyödykkeen vaatimusten täyttämiseksi o erilaisissa sovellutuksissa, esimerkiksi tekstiiliteollisuudessa. Isännän erittämi- m gj en entsyymiaktiivisuuksien seos voi olla edullinen tietyssä teollisessa sovellu- § tuksessa, esimerkiksi bioviimeistelyssä ja biokivipesussa.
^ 35 Endoglukanaasiproteiinit ja niiden valmisteet ovat käyttökelpoisia esimerkiksi tekstiili-, rehu- ja elintarvikesovelluksissa, esimerkiksi leivontaso- 14 vellutuksissa, biomassan hydrolysoinnissa, esimerkiksi bioetanolin tuotannossa, sekä kasviöljy-, pesuaine- sekä selluloosa- ja paperiteollisuudessa. Niitä voidaan käyttää minkä tahansa selluloosapitoisen materiaalin käsittelyyn, kuten tekstiilimateriaalin, muassa tai eläinrehussa käytettyjen kasvien tai kasvi-5 peräisen materiaalin käsittelyyn, öljyn uuttamiseen tarkoitetun kasvimateriaalin käsittelyyn tai puusta peräisin olevan mekaanisen tai kemiallisen selluloosan tai kierrätyskuidun käsittelyyn. Niitä voidaan lisätä myös pesuaineisiin esimerkiksi kankaan huolto-ominaisuuksien parantamiseksi nyppyyntymisen eston, harmaantumisen eston, värien kirkastamisen ja pehmentämisen kautta sekä 10 tekstiilien puhdistustehon, esimerkiksi tahranpoiston parantamiseksi. Pesu-ainekoostumukset sisältävät tavallisesti lisäksi apuaineita, kuten pinta-aktiivisia aineita (anionisia, ionittomia, kationisia ja amfolyyttisiä pinta-aktiivisia aineita), tehoaineita ja muita mahdollisia aineosia, kuten harmaantumisen estoaineita ja tahroja suspendoivia aineita, optisia kirkasteita, valkaisuaineita, väriaineita ja 15 pigmenttejä sekä hydrolaaseja.
Esillä olevassa yhteydessä ’’selluloosapitoinen materiaali” tarkoittaa mitä tahansa materiaalia, joka käsittää merkittävänä aineosana selluloosaa tai sen johdoksia. Selluloosapitoinen materiaali saatetaan kosketukseen tehokkaan määrän proteiinia kanssa sopivissa olosuhteissa, kuten sopivassa pH:ssa 20 ja lämpötilassa, ja reaktion annetaan jatkua riittävän pitkän ajan, jotta entsy-maattinen reaktio tapahtuu. Kuvattuja Cel12-endoglukanaaseja käytetään edullisesti lämpötilavälillä noin 20-60 °C ja edullisemmin noin 30-50 °C, nimenomaisesta käytettävästä entsyymistä riippuen. Käyttökelpoiset lämpötilat voivat olla <50 °C, esimerkiksi <45 °C tai ^40 °C tai jopa ^30 °C. Sopiva pH-25 väli on noin 2-8, edullisesti noin 3-6,5 ja erityisesti noin 4-6. Yhden spesifisen suoritusmuodon mukaan pH on noin 4,5-5,5 tai noin 5,0-5,5. Kuvattuja Cel5-o endoglukanaaseja käytetään noin 30-70 °C:n lämpötilassa, edullisesti noin
CM
^ 50-60 °C:ssa, ja pH-välillä noin 2-7, edullisesti noin 4-6 ja erityisesti noin 5-6, ° paitsi Fusariumista peräisin olevaa endoglukanaasia, jota käytetään sovellu- 00 30 tuksessa edullisesti pH-välillä noin 4-10, edullisemmin 5-8, vielä edullisem- | min 6-7, erityisesti noin 6,5, sekä 50-60 °C:n lämpötilassa.
o Endoglukanaasit ovat erityisen käyttökelpoisia tekstiilimateriaalien, m kuten kankaiden ja vaatekappaleiden tai langan käsittelyyn. Tekstiilimateriaali o voidaan valmistaa luonnossa esiintyvistä selluloosaa sisältävistä kuiduista tai ^ 35 ihmisen valmistamista selluloosaa sisältävistä kuiduista tai näiden sekoituksis ta tai synteettisten kuitujen ja selluloosaa sisältävien kuitujen seoksista. Sellu- 15 loosaa sisältävä materiaali on edullisesti puuvillaa, erityisesti farmarikangasta. Tarmarikankaalla” tarkoitetaan tämän keksinnön yhteydessä farkkukangasta, tavallisesti farkkuvaatekappaleita, erityisesti farmarihousuja. Farmarikangas on edullisesti indigovärjättyä farmarikangasta. Farmarikangasta voidaan käsitellä 5 myös indigon johdoksilla tai indigolla yhdessä jonkin muun väriaineen kanssa, esimerkkinä farmarikankaan indigovärjäys rikkipohjan kanssa.
Kuvatut endoglukanaasit ovat erityisen käyttökelpoisia tekstiiliteollisuudessa, edullisesti bioviimeistelyssä ja biokivipesussa.
Kivipesussa on kolme vaihetta: liimanpoisto, hankaus ja jälkikäsittely.
10 Ensimmäinen vaihe, liimanpoistoprosessi, on tavallisesti farmarihousujen ensimmäinen märkäkäsittely ja tarkoittaa tärkkelyksen tai muiden liima-aineiden poistamista, joita on tavallisesti käytetty loimilankoihin vaurioiden estämiseksi kudontaprosessin aikana. Tärkkelyspitoisten liima-aineiden poistoon käytetään alfa-amylaaseja parannettua ja tasalaatuista märkäprosessointia varten. Lii- 15 manpoiston jälkeen farmarihousut yleensä huuhdellaan vedellä tai ne viedään suoraan hankausvaiheeseen.
Toinen vaihe, hankaus, voidaan tehdä entsyymeillä tai hohkakivillä tai molemmilla. Joka tapauksissa värin poistamiseen tarvitaan mekaanista toimintaa, ja käsittely tehdään yleensä pesukoneissa kuten rumpupesukoneissa.
20 Käsite ’’kulunut” tarkoittaa farmarikankaan ulkonäköä, jolloin kangasta on käsitelty sellulaasientsyymeillä tai kivillä tai molemmilla. Synonyymisiä ilmauksia ovat ’’kivipesty ulkonäkö” tai ’’kulunut ulkonäkö”. Epätasaisen värinpoiston tuloksena on kontrasteja värjäytyneiden alueiden ja niiden alueiden välillä, joista väri on poistettu.
25 Hankausta seuraa yleensä kolmas vaihe, jälkikäsittely, joka sisältää pesu- ja huuhteluvaiheet, joiden aikana voidaan käyttää pesuaineita, optisia o kirkasteita, valkaisuaineita tai huuhteluaineita. Entsymaattisen käsittelyn jäl-
CM
^ keen reaktio tulee pysäyttää käsiteltyjen materiaalien vaurioitumisen estämi- ^ seksi esimerkiksi lämpötila- ja/tai pH-inaktivoinnilla, jolloin viimeksi mainittu kä- 00 30 sittää perusteellisen huuhtelun ja/tai pesuaineen poispesemisen. Tämä varmis- | taa sen, että kuidun mekaaninen lujuus ei edelleen heikkene entsyymin jatku- o van läsnäolon kautta, m
Esillä olevassa yhteydessä käytettynä kankaan tai vaatekappaleen o ’’biokivipesu” tarkoittaa entsyymien käyttöä hohkakivien sijasta tai niiden lisäksi ^ 35 kankaan tai vaatekappaleen, erityisesti farmarikankaan, käsittelyyn.
16
Kuten yllä todettiin, sellulaasilla käsitteleminen voi kokonaan korvata hohkakivillä käsittelemisen. Sellulaasikäsittely voidaan kuitenkin haluttaessa myös yhdistää hohkakivikäsittelyyn voimakkaasti hankautuneen pintakäsittelyn tuottamiseksi.
5 Endoglukanaasit ovat käyttökelpoisia myös kankaiden ja vaatekap paleiden bioviimeistelyssä. ’’Biologinen pintakäsittely” (jota kutsutaan myös nimellä nyppyjen poisto, nukanpoisto, karvanpoisto tai biologinen viimeistely) tarkoittaa entsyymien käyttöä selluloosapitoisten kuitujen kontrolloidussa hyd-rolyysissä kankaan tai langan pinnan modifioimiseksi sellaisella tavalla, joka 10 pysyvästi estää nyppyyntymistaipumusta, parantaa kankaan tuntua kuten pehmeyttä ja sileyttä, kirkastaa pintarakenteen vähentämällä nukkaantumista, mikä johtaa värien kirkastumiseen ja voi myös auttaa kankaan laskeutuvuutta, kosteuden imukykyä ja värjäytyvyyttä.
Muihin käyttöihin kuuluvat käyttö pesuainekoostumuksissa kan-15 kaanhuolto-ominaisuuksien parantamiseksi nyppyyntymisen eston, harmaan-tumiseneston, värien kirkastamisen ja pehmentämisen kautta sekä tekstiilien puhdistustehon, esimerkiksi tahranpoiston parantamiseksi.
Entsymaattinen nyppyjen poisto voidaan tehdä missä tahansa vaiheessa tekstiilin märkäprosessoinnin aikana, edullisesti mahdollisen liiman-20 poiston ja/tai valkaisun jälkeen, ja voidaan käyttää samanlaisia olosuhteita kuin biokivipesussa. Tekstiilejä voidaan käsitellä myös vaatekappaleiden muodossa.
Nestesuhde (nesteen tilavuuden suhde kankaan painoa kohden) biokivipesussa ja bioviimeistelyssä voi olla vaihteluvälillä 3:1-20:1, edullisesti 25 5:1-10:1. Käsittelyaika voi olla 15 minuuttia-90 minuuttia ja edullisesti 30 mi- nuuttia-60 minuuttia. On korostettava, että entsyymiannos riippuu suuresti o kangastyypistä, laitteistosta, prosessiolosuhteista (pH, lämpötila, nestesuhde,
CM
^ käsittelyaika, farmarikankaan määrä, prosessin skaala) sekä entsyymivalmis- ^ teen tyypistä ja vastaavista. Alan ammattilainen kykenee määrittelemään sopi- 00 30 vat annokset ja olosuhteet.
| Tämän keksinnön mukainen menetelmä selluloosapitoisen materi- o aalin käsittelyyn sisältää myös lignoselluloosapitoisen materiaalin hydrolysoin- m nin esimerkiksi bioetanolituotantoa varten. Yksi esimerkki yhdistetyn biopro-o sessoinnin (CBP) käytöstä lignoselluloosapitoisen materiaalin hydrolyysissä ^ 35 kuvataan esimerkiksi julkaisussa van Zyl et ai., teoksessa Adv Biochem Eng
Biotechnol. 2007;108:205 - 235.
Tätä keksintöä havainnollistetaan tarkemmin seuraavilla ei-rajoitta- villa esimerkeillä.
17
Esimerkki 1. Selluloosaa hajottavaa matalan lämpötilan aktiivisuutta ilmentävien kantojen seulonta 5 Roal Oy -yhtiön viljelmäkokoelman noin 180 sienikannan kykyä tuot taa selluloosaa hajottavaa matalan lämpötilan aktiivisuutta testattiin. Sienikanto-ja viljeltiin 100 ml:n tilavuudessa pyörivässä ravistelijassa (200 rpm) 20 °C:n lämpötilassa 3-7 päivää. Testattiin useita tuottoalustoja, jotka sisälsivät hiilen lähteenä Solka Floc -selluloosaa. Viljelyn jälkeen solut ja muut kiinteät aineet 10 kerättiin sentrifugoimalla ja supernatantti otettiin talteen. Jos valmistetta ei käytetty välittömästi, sitä säilytettiin erinä -20 °C:ssa.
Matalampien lämpötilojen entsyymiaktiivisuuden arvoimiseksi ravis-tuspulloviljelmävalmistetta analysoitiin 30 °C:ssa ja 50 °C:ssa yhden tunnin ajan. Kaikista ravistuspullojen supernatanteista määritettiin seuraavat aktiivi-15 suudet:
Endoglukanaasiaktiivisuus (CMCaasi-aktiivisuus): Tämä määritettiin 3-prosenttinen (paino/tilavuus) karboksimetyylisel-luloosa (CMC) substraattina 50 mM sitraattipuskurissa, olennaisesti siten kuin on kuvattu julkaisuissa Bailey ja Nevalainen, 1981; Haakana et ai., 2004. Pel-20 kistävät sokerit mitattiin DNS-reagenssilla. Määritys tehtiin sekä pH-arvossa 5,0 että pH-arvossa 7,0.
Endoglukanaasiaktiivisuus (ECU-aktiivisuus): Tämä määritettiin 1-prosenttinen (paino/tilavuus) hydroksietyylisellu-loosa (HEC) substraattina 50 mM sitraattipuskurissa, olennaisesti siten kuin on 25 kuvattu julkaisussa Bailey ja Nevalainen 1981. Pelkistävät sokerit mitattiin ^ DNS-reagenssilla. Määritys tehtiin sekä pH-arvossa 5,0 että pH-arvossa 7,0.
™ Kantojen viljelmien supernatanttivalmisteet testattiin pienen mitta-
LO
9 kaavan biologisen kivipesun sovellutuksessa LP-2 Launder Ometer -laitteella co seuraavasti. Noin 7,2 g farmarikangastilkkuja (12 x 12 cm), joille oli tehty lii- | 30 manpoisto, ladattiin teräspalloihin 1,2 litran säiliöihin, jotka sisälsivät 100 ml
Mcllvaine-puskuria ja 100 ml viljelmän supernatanttia, ja Launder Ometer K -laitetta käytettiin 30 °C:ssa 120 minuuttia. Emäksisen pesun ja pesuainepe- o sun jälkeen kangasnäytteet huuhdeltiin huolellisesti lämpimällä vedellä ja ilma- o kuivattiin. Tulokset arvioitiin sekä silmämääräisesti että mittaamalla väri reflek-35 tanssiarvoina (tietoja ei esitetä).
18
Alustavan seulonnan jälkeen sovellutusten lisätutkimuksiin valittiin 13 kantaa (Trichoderma sp. RF6193, Trichoderma gamsii RF6208, Hypocrea rufa / Trichoderma viride RF6310, Hypocrea atroviridis RF6323, Trichoderma harzianum RF6482 ja RF6541, Trichoderma fertile RF6601, Hypocrea konin-5 giopsis RF6604, Penicillium spinuiosum RF6286, Penicillium griseofulvum Dierckx RF6288, Geomyces pannorum RF6293 ja RF6547 sekä Fusarium cf. equiseti RF6318). Tätä tarkoitusta varten kantaa RF6193 viljeltiin 200 ml:n tilavuudessa pyörivällä ravistelijalla (200 rpm) 20° C:n lämpötilassa 7 päivää kompleksisessa laktoosipohjaisessa sellulaaseja indusoivassa elatusaineessa 10 (Joutsjoki et ai. 1993), joka oli puskuroitu 5-prosenttisella KFbPCMIa. Kantoja RF6208, RF6310, RF6547, RF6601 ja RF6604 viljeltiin 200 ml:n tilavuudessa pyörivällä ravistelijalla (200 rpm) 20° C:n lämpötilassa 4-7 päivää elatusaineessa, joka sisältää seuraavia aineita (g/litra): Solka Floc -selluloosa 6,0, vehnälese 4,0, koivun ksylaani 2,0, maissirankkijauhe 1,0, soijajauhe 1,0, jo-15 hanneksenleipäpuujauhe 2,0, CaCC>3 2,0, (NH4)2HP04 1,5, KH2PO4 0,5, MgSCVFhO 0,5, NaCI 0,5, hivenaineliuos nro 1 0,5, hivenaineliuos nro 2 0,5, parafiiniöljy 0,5; pH säädettiin arvoon to 6,4. Hivenaineliuos nro 1 (mg/litra): MnSC>4 1,6, ZnSOV^O 3,45, C0CI2H2O 2,0; hivenaineliuos nro 2 (mg/litra): FeSCV^O 5,0. Kantoja RF6323, RF6482 ja RF6541 viljeltiin 200 ml:n tilavuu-20 dessa pyörivällä ravistelijalla (200 rpm) 20 °C:n lämpötilassa 7 päivää elatus-aineessa, joka sisältää seuraavia aineita (g/litra): Solka Floc -selluloosa 10,0, maissirankkijauhe 1,5, soijajauhe 0,5, CaC03 0,5, (NH4)2HPC>4 1,5, KH2PO4 2,0, MgS04'H20 0,5, NaCI 0,5, NH4NO3 0,5, Tween-80 0,5, hivenaineliuos nro 1 0,5, hivenaineliuos nro 2 0,5, parafiiniöljy 0,5; pH säädettiin arvoon 6,4. Hi-25 venaineliuos nro 1 (mg/litra): MnSC>4 1,6, ZnSCV^O 3,45, C0CI2H2O 2,0; hivenaineliuos nro 2 (mg/litra): FeS04’H20 5,0. Kantoja RF6288, RF6293 ja o RF6318 viljeltiin 200 ml:n tilavuudessa pyörivällä ravistelijalla (200 rpm)
CM
^ 20 °C:n lämpötilassa 4-6 päivää elatusaineessa, joka sisältää seuraavia ainei- ° ta (g/litra): Solka Floc -selluloosa 30,0, maissirankkijauhe 9,0, soijajauho 1,5, ° 30 CaC03 1,5, (NH4)2HP04 4,5, KH2P04 6,0, MgS04H20 1,5, NaCI 0,5, NH4NO3 £ 1,5, Tween-80 0,5, hivenaineliuos nro 1 0,5, hivenaineliuos nro 2 0,5, para- o fiiniöljy 0,5; pH säädettiin arvoon 6,4. Hivenaineliuos nro 1 (mg/litre): MnS04 1,6, ZnSCV^O 3,45, C0CI2H2O 2,0; hivenaineliuos nro 2 (mg/litre): Fe-o S04’H20 5,0. Kantaa RF6286 viljeltiin 200 ml:n tilavuudessa pyörivällä raviste- ^ 35 lijalla (200 rpm) 20 °C:n lämpötilassa 4-6 päivää elatusaineessa, joka sisältää seuraavia aineita (g/litra): Solka Floc -selluloosa 18,0, vehnälese 12,0, koivun 19 ksylaani 6,0, maissirankkijauhe 3,0, soijajauhe 3,0, johanneksenleipäpuujauhe 6,0, CaC03 6,0, (NH4)2HP04 4,5, KH2P04 1,5, MgS04'H20 1,5, NaCI 0,5, hi-venaineliuos nro1 0,5, hivenaineliuos nro2 0,5, parafiiniöljy 0,5; pH säädettiin arvoon 6,4. Hivenaineliuos nro 1 (mg/litra): MnS04 1,6, ZnS04’H20 3,45, 5 CoCI2'H20 2,0; hivenaineliuos nro 2 (mg/litra): FeS04'H20 5,0.
Esimerkki 2. Endoglukanaasigeenien kloonaus kannoista Trichoderma sp. RF6193, Trichoderma gamsii RF6208, Hypocrea rufa / Trichoderma vi-ride RF6310, Hypocrea atroviridis RF6323, Trichoderma harzianum RF6482 ja RF6541, Trichoderma fertile RF6601, Hypocrea koningiopsis 10 RF6604, Penicillium spinulosum RF6286, Penicillium griseofulvum
Dierckx RF6288, Geomyces pannorum RF6293 ja RF6547 sekä Fusarium cf. equiseti RF6318 DNA:n (plasmidien, DNA-fragmenttien) eristykseen ja entsyymikäsit-telyihin, E. coli -transformaatioihin jne. käytettiin tavanomaisia molekyylibiolo-15 gian menetelmiä. Käytetyt perusmenetelmät kuvataan tavallisissa molekyylibiologian käsikirjoissa, esimerkiksi teoksissa Sambrook et ai. (1989) sekä Sambrookja Russell (2001).
Kantojen Trichoderma sp. RF6193, Trichoderma gamsii RF6208, Hypocrea rufa / Trichoderma viride RF6310, Hypocrea atroviridis RF6323, 20 Trichoderma harzianum RF6482 ja RF6541, Trichoderma fertile RF6601, Hypocrea koningiopsis RF6604 ja Penicillium griseofulvum Dierckx RF6288 ge-nomiset kirjastot tehtiin Lambda FIXS®ll/Xho I Partial Fill-in Vector kit -tarvikepakkauksen avulla (Stratagene, USA) sen toimittajan ohjeiden mukaisesti. Kromosomaaliset DNA:t, jotka oli eristetty julkaisun Raeder ja Broda 25 (1985) mukaisesti, digestoitiin osittain Sau3A:lla. Digestoidut DNA:t fraktioitiin ^ koon mukaan ja valitun kokoisten fragmenttien (6-23 kb) päät täytettiin ja yh- ™ distettiin ligaatiolla Xhol-digestoituihin Lambda FIXS® Il -vektorin käsivarsiin. Li-
LO
9 gaatioseokset pakattiin Gigapack III Gold -pakkausuutteilla valmistajan ohjei- o den mukaisesti (Stratagene, USA).
ir 30 Kantojen Penicillium spinulosum RF6286, Geomyces pannorum
CL
RF6293 ja RF6547 sekä Fusarium cf. equiseti RF6318 genomisten kirjastojen oj rakentamiseen käytettiin Lambda DASH®II/Sa/77HI -vektoria (Stratagene, USA) § vektorin toimittajan ohjeiden mukaisesti. Kromosomaaliset DNA:t, jotka oli eris- o <n tetty julkaisun Raeder ja Broda (1985) mukaan, digestoitiin osittain Sau3A\Ma.
35 Digestoidut DNA:t fraktioitiin koon perusteella ja valitun kokoiset fragmentit (5-20 kb) yhdistettiin ligaatiolla SamHI-digestoituihin lambda-vektorin käsivarsiin.
Ligaatioseokset pakattiin Gigapack III Gold -pakkausuutteilla valmistajan ohjei den mukaisesti (Stratagene, USA).
Rakennettujen genomisten kirjastojen titterit esitetään taulukossa 1.
20
Taulukko 1. Rakennettujen genomisten kirjastojen titterit
Kanta Genomisen kir- Monistetun genomi- jaston titteri sen kirjaston titteri __pfu/ml (x 106)__pfu/ml (x 108)
Trichoderma sp. RF6193__0,20__1^2_
Trichoderma gamsii RF6208 1,84 163,0
Hypocrea rufa / Trichoderma viride RF6310 0,08 18,0
Hypocrea atroviridis RF6323 0,30 119,0
Trichoderma harzianum RF6482 0,02 2,0
Trichoderma harzianum RF6541 0,97 50,0
Trichoderma fertile RF6601 2,30 120,0
Hypocrea koningiopsis RF6604 1,10 110,0
Penicillium spinulosum RF6286 1,10 4,4
Penicillium griseofulvum Dierckx RF6288 0,07__2^3_
Geomyces pannorum RF6293 0,38 100,0
Geomyces pannorum RF6547 0,15 5,5
Fusarium cf. equiseti RF6318 0,46__60,0_ 5
Genomisten kirjastojen seulontaan tarkoitettujen koettimien saamiseksi käytettiin monia erilaisia lähestymistapoja. Ensin käytettiin T. reesein eg/2/ce/5A.sta ja egl3lceh 2A:sta peräisin olevia heterologisia koettimia kanto-jen Trichoderma gamsii RF6208, Hypocrea rufa / Trichoderma viride RF6310, ^ 10 Hypocrea atroviridis RF6323, Trichoderma harzianum RF6482 ja RF6541 sekä g Hypocrea koningiopsis RF6604 genomisten kirjastojen seulontaan. DIG- ό leimattu T. reesein egl2/cel5A-koetin monistettiin käyttämällä alukkeita 5'- x GAGCTCTGGGGTCCGATT-3' (sekvenssi nro 1) ja 5'- * CGATGCAGTATGCGCCCA-3' (sekvenssi nro 2) PCR-reaktiossa, jossa oli 50 g 15 mM Tris-HCI, pH 9,0, 15 mM (NH^SO^ 0,1 % Triton X-100:a, 1,5 mM MgCb,
CM
g 0,2 mM dNTP:eitä (PCR DIG -leimausseos, Roche), 2 μΜ kutakin aluketta se- o kä 1-2 yksikköä Dynazyme EXT -DNA-polymeraasia (Finnzymes, Suomi) ja noin 0,4 pg pALK433-plasmidi-DNA:ta, joka sisälsi T. reesein eg/2/ce/5A:n osittaisen geenifragmentin. PCR-reaktioiden olosuhteet olivat seuraavat: 5 mi- 21 nuutin ensimmäinen denaturaatio 95 °C:ssa, sen jälkeen 30 sykliä, jokaisessa 1 minuutti 95 °C:ssa, 1 minuutin hybridisoiminen 55 °C:ssa (±5 °C:n gradientti) ja 2 minuutin pidentäminen 72 °C:ssa, sekä lopullinen pidennys 72 °C:ssa 10 minuutin ajan. T reesein eg/3/ce/12A-koetin monistettiin vastaavasti käyttämäl-5 lä alukkeita 5'-ATGAAGTTCCTTCAAGTC-3' (sekvenssi nro 3) ja 5'-TTAGTTGATAGATGCGG-3' (sekvenssi nro 4) sekä pALK1976-plasmidi-DNA-templaattia, joka sisälsi T reesein eg/3/ce/12a-geenifragmentin.
Homologiset koettimet kantojen Trichoderma sp. RF6193 ja Tricho-derma fertile RF6601 genomisten kirjastojen seulontaan monistettiin PCR:llä 10 käyttämällä vastaavaa genomista DNA:ta reaktioissa templaattina. Ensin suunniteltiin ja testattiin useita alukkeita (degeneroituneita oligoja) PCR-reaktioissa (taulukko 3, sekvenssit nro 10-18). Heterologiset alukkeet suunniteltiin rinnastamalla kantojen Trichoderma gamsii RF6208, Hypocrea rufa / Trichoderma viride RF6310 ja Trichoderma harzianum RF6482 eg/2/ce/5A- ja 15 eg/3/ce/12A-geenisekvenssit, jotka kloonattiin projektin ensimmäisessä vaiheessa. PCR-reaktioseoksissa oli 50 mM Tris-HCI, pH 9,0, 15 mM (NH4)2SC>4, 0,1 % Triton X-100:a, 15 mM MgCb, 0,2 mM dNTP:itä, 1 μΜ kutakin aluketta sekä 1-2 yksikköä Dynazyme EXT -DNA-polymeraasia (Finnzymes, Suomi) ja 0,5-1 pg genomista DNA:ta. PCR-reaktioiden olosuhteet olivat seuraavat: 5 20 minuutin ensimmäinen denaturaatio 95 °C:ssa, sen jälkeen 30 sykliä, jokaisessa 1 minuutti 95 °C:ssa, 1 minuutin hybridisoiminen 45 °C:ssa (±5 °C:n gradientti) ja 2 minuutin pidentäminen 72 °C:ssa, sekä lopullinen pidentäminen 72 °C:ssa 10 minuutin ajan.
Kantojen Penicillium spinulosum RF6286, Geomyces pannorum 25 RF6547 ja Fusarium cf. equiseti RF6318 genomisia kirjastoja seulottiin koetti milla, jotka monistettiin PCR:llä degeneroituneita alukkeita ja vastaavaa geno-o mistä DNA:ta templaattina käyttäen. Heterologisten alukkeiden sekvenssit pe-
CVI
^ rustuivat konservoituneisiin endoglukanaasisekvensseihin (taulukko 3, sek- ° venssit nro 19-22). Konservoituneet sekvenssit tunnistettiin rinnastamalla kan- o 00 30 tojen Talaromyces emersonii AAL33639, Thermoascus aurantiacus | AAL88714, Aspergillus oryzae BAD72778, Aspergillus niger CAA11965, Eme- o ricella nidulans BAA82592, Chaetomium globosum EAQ92953, Humicola inso-
LO
lens Q12624, Aspergillus aculeatus BAA29030, Aspergillus terreus o AAW68436, Aspergillus fumigatus XP_755286, Volvariella volvacea ^ 35 AAG59832, Aspergillus kawachii BAB62317, Macrophomina phaseolina AAB51451 ja Humicola grosea var. thermoidea BAA12676 aiemmin julkaistut 22 aminohapposekvenssit. PCR-reaktioseoksissa oli 10 mM Tris-HCI, pH 8,8, 50 mM KCI, 0,1 % Triton X-100:a, 1,5 mM MgCI2, 0,1 mM dNTP:itä, 1 μΜ kutakin aluketta ja 1-2 yksikköä Dynazyme II -DNA-polymeraasia (Finnzymes, Suomi) sekä 0,5-1 pg genomista DNA:ta. PCR-reaktioiden olosuhteet olivat 5 seuraavat: 5 minuuttia ensimmäinen denaturaatio 95 °C:ssa, sen jälkeen 30 sykliä, jokaisessa 1 minuutti 95 °C:ssa, 30 sekunnin hybridisoiminen 52,5 °C:ssa (±7,5 °C:n gradientti) ja 1 minuutin pidentäminen 72 °C:ssa, sekä lopullinen pidentäminen 72 °C:ssa 5 minuutin ajan.
Homologinen koetin Penicillium griseofulvum Dierckx RF6288:n ge-10 nomisen kirjaston seulontaan saatiin käyttämällä homologisten alukkeiden sekvenssejä, jotka perustuivat Penicillium griseofulvum Dierckx RF6288:n CCE2-proteiinin peptidien aminohapposekvensseihin. CCE2-proteiini detektoi-tiin Penicillium griseofulvum Dierckx RF6288 -kannan viljelmän supernatanteis-ta SDS-PAGE:n avulla. Peptidimassan sormenjälkianalyysiä ja sisäisten pepti-15 dien määrittämistä varten CCE2-proteiinivyöhyke leikattiin SDS-PAGE:sta ja proteiini pelkistettiin ditiotreitolilla ja alkyloitiin jodiasetamidilla ennen trypsiini-digestiota. Sähkösumutusionisaatio-kvadrupoli-lentoajan tandem-massaspek-trit de novo -sekvensointia varten tuotettiin Q-TOF (Micromass) -laitteella.
Penicillium griseofulvum Dierckx RF6288:n CCE2-proteiinin sisäiset 20 peptidisekvenssit esitetään taulukossa 2 (sekvenssit nro 5-9). Sisäisiä peptidejä käytettiin edelleen taulukossa 3 esitettyjen homologisten alukkeiden suunnittelemiseen (sekvenssit nro 23-28). Koetin syntetisoitiin PCR-reaktio-seoksissa, joissa oli 10 mM Tris-HCI, pH 8,8, 50 mM KCI, 0,1 % Triton X-100:a, 1,5 mM MgCb, 0,1 mM dNTP:itä, 1 μΜ kutakin aluketta sekä 1-2 yksik-25 köä Dynazyme II -DNA-polymeraasia (Finnzymes, Suomi) ja 0,5-1 pg genomista DNA:ta. PCR-reaktioiden olosuhteet olivat seuraavat: 5 minuuttia en-o simmäinen denaturaatio 95 °C:ssa, sen jälkeen 30 sykliä, jokaisessa 1 minuutti
CM
^ 95 °C:ssa, 30 sekunnin hybridisoiminen 52,5 °C:ssa (±7,5 °C:n gradientti) ja 1 ° minuutin pidentäminen 72 °C:ssa, sekä lopullinen pidentäminen 72 °C:ssa 5
O
00 30 minuutin ajan.
X
en
CL
O
m
CM
CD
00 o o
CM
23
Taulukko 2. Penicillium griseofulvum Dierckx RF6288:n CCE2-proteiinista määritetyt sisäiset peptidisekvenssit
Peptidi Sekvenssi Sekvenssi nro
Peptidi 1 VVAATQ/KWL/I K/Q__5
Peptidi 2 L/IL/ITSTTDFAAFWK/Q__6
Peptidi 3 SGAYAVL/IDPHNFGR__7_
Peptidi 4 VPFAMER__8
Peptidi 5 L/IGEFAGPFEGENK 9_ l/L = leusiinilla ja isoleusiinilla on sama molekyylimassa, eikä niitä voida erottaa ESI-MS/MS-analyysissä Q/K = glutamiinin ja lysiinin molekyylimassa eroaa toisistaan ainoastaan 0,036 Da:lla, eikä niitä voida 5 erottaa ESI-MS/MS-analyysissä
Koetin Geomyces pannorum RF6293:n genomisen kirjaston seulontaan syntetisoitiin alukkeilla, jotka perustuivat Penicillium griseofulvum Dierckx RF6288:n CCE2-proteiinin peptidien aminohapposekvensseihin, kuten edellä 10 kuvattiin. Heterologinen koetin syntetisoitiin PCR-reaktiolla CCE2_1F- ja CCE2_3R-alukkeiden kanssa (taulukot 3 ja 4) käyttämällä Geomyces pannorum RF6289:n genomista DNA:ta templaattina. PCR-reaktioseoksissa oli 10 mM Tris-HCI, pH 8,8, 50 mM KCI, 0,1 % Triton X-100:a, 1,5 mM MgCI2, 0,1 mM dNTP:itä, 1 μΜ kutakin aluketta sekä 1-2 yksikköä Dynazyme II -DNA-15 polymeraasia (Finnzymes, Suomi) ja 0,5-1 pg genomista DNA:ta. PCR-reak-tioiden olosuhteet olivat seuraavat: 5 minuuttia ensimmäinen denaturaatio 95 °C:ssa, sen jälkeen 30 sykliä, jokaisessa 1 minuutti 95 °C:ssa, 30 sekunnin hybridisoiminen 52,5 °C:ssa (±7,5 °C:n gradientti) ja 12 minuutin pidentäminen 72 °C:ssa, sekä lopullinen pidentäminen 72 °C:ssa 5 minuutin ajan.
δ
C\J
i
LO
O
o
CO
X
cc
CL
o
LO
C\1
CD
00
O
O
CM
24
Taulukko 3. Degeneroituneet oligonukleotidit, joita testattiin PCR-alukkeina koettimien monistamiseksi endoglukanaasigeenin seulomiseen kannoista Trichoderma sp. RF6193, Trichoderma fertile RF6601, Penicillium spinulosum RF6286, Geomyces pannorum RF6547 ja RF6293 5 sekä Fusarium cf. equiseti RF6318 ja Penicillium griseofulvum Dierckx RF6288
Oligonukleotidi Pituus Sekvenssi'3 Sekvenssi (bp) nro
Cel5_cons_A_1 20 CCYGTYGGHTGGCARTAYYT (s)__10
Cel5_cons_A_2__20 GGHCCTACWAAYGCYCARTT (s)__11
Cel5_cons_A_3 17 GAYATHCAYAAYTAYGC (s)(e 12
Cel5_cons_B_1 20 GTRCCRGAGTTRT CNG ART C(as) 13
Cel5_cons_B_2__17 SWRTCNARRTAYTTRTG (as)__14
Cel12_cons_A_1 20 GGAGACTWYG ARCTYAT GAT (s)(e 15
Cell 2_cons_A_2 20 GGNGAYTWYGARYTNATGAT(s) 16
Cel12_cons_B_1 20 GSCT CRGTDCCRAAYT GGTA(as) 17
Cel12_cons_B_2 18 YTCNGTNCCRAAYTGRTA (as) 18
Cel5_S1__17 TTYGAYACNAAYAAYGA (s)__19
Cel5_S2__17 ATGCAYCARTAYCTNGA (s)__20
Cel5_AS1__17 TCNAGRTAYTGRTGCAT (as)__21
Cel5_AS2__24 CCACCASGGSCCSGCSGCCCACCA (as)__22 CCE21F__20 GTNCCNTTYGCNATGGARCG (s, peptidi 4)__23 CCE2 2F__17 GAYCCNCAYAAYTTYGG (s, peptidi 3)_ 24 CCE2 3R__17 CCRAARTTRTGNGGRTC (as, peptidi 3)__25 CCE2 4F__20 GAYTTYGCNGCNTTYTGGAA (s, peptidi 2)__26 ΪΙ CCE2 5R 20 TTCCARAANGCNGCRAARTC (as, peptidi 2) 27 o---- ^ CCE2 6R_ 20 TCRAASGGSCCSGCRAAYTC (as, peptidi 5) 28 O <a D = A tai G tai T, Fl = A tai C tai T, R = A tai G, S = C tai G, W = A tai T, N = A tai G tai T tai C, Y = T tai O C; sulkeissa oleva ”s” = sense-juoste, sulkeissa oleva ”as” = antisense-juoste, sulkeissa oleva ’’peptidi” = x aluke, perustuu taulukossa 2 kuvattuun sisäiseen peptidiin.
£ 10 § Useista reaktioista saatiin DNA-tuotteita, joilla oli odotetut koot (ar- oo vioitu julkaistuista endoglukanaasisekvensseistä). Kaikkein spesifisimmistä
O
° PCR-reaktioista eristettiin odotetun kokoiset DNA-fragmentit, ja ne kloonattiin pCR® 4-TOPO®-vektoriin (Invitrogen, USA). Insertit karakterisoitiin sekvensoi-15 maila ja tekemällä Southern blot -hybridisaatiot genomisiin DNA:ihin, jotka oli 25 digestoitu eri restriktioentsyymeillä. Taulukossa 4 esitetään PCR-fragmentit, jotka valittiin käytettäviksi koettimina kantojen Trichoderma sp. RF6193, Tricho-derma fertile RF6601, Penicillium spinulosum RF6286, Geomyces pannorum RF6547 ja RF6293, Fusarium cf. equiseti RF6318 sekä Penicillium griseoful-5 vum Dierckx RF6288 genomisten kirjastojen seulontaan.
Taulukko 4. PCR-reaktioissa käytetyt alukkeet ja kantojen Trichoderma sp. RF6193, Trichoderma fertile RF6601, Penicillium spinulosum RF6286, Geomyces pannorum RF6547 ja RF6293, Fusarium cf. equiseti RF6318 sekä Penicillium griseofulvum Dierckx RF6288 genomisten kirjastojen 10 endoglukanaasigeenien seulontaan valitut koettimet. Genominen temp-laatti-DNAja koetinfragmentin sisältävän plasmidin nimi esitetään.
Geeni Eteenpäin suun- Taaksepäin PCR- Saatu Sekv. Plasmidin tautunut aluke suuntautunut reaktiossa fragmentti nro insertti aluke templaattina (kb)
käytetty genominen DNA
RF6193_ce/5A Cel5_cons_A_1 Cel5_cons_B_1 RF6193 0,5 kb 29 pALK2319 RF6193_ce/5B Cel5_cons_A_3 Cel5_cons_B_1 RF6193 0,5 kb 30 pALK2321 RF6193_ce/12A Cel12_cons_A_1 Cel12_cons_B_1 RF6193 0,4 kb 31 pALK2323 RF6601_ce/5A Cel5_cons_A_1 Cel5_cons_B_1 RF6601 0,4 kb 32 pALK2320 RF6601_ce/5B Cel5_cons_A_3 Cel5_cons_B_1 RF6601 0,5 kb 33 pALK2322 RF6601_ce/12A Cel12_cons_A_1 Cel12_cons_B_1 RF6601 0,5 kb 34 pALK2324 RF6286_ce/5A Cel5_S2 Cel5_AS2 RF6286 0,3 kb 35 pALK2239 RF6286_ce/5B Cel5_S2 Cel5_AS2 RF6286 0,3 kb 36 pALK2240 RF6318_ce/5A Cel5_S2 Cel5_AS2 RF6318 0,3 kb 37 pALK2048 O RF6547 ce/5A Cel5 S2 Cel5 AS2 RF6547 0,3 kb 38 pALK2242 (M -=------- lq RF6288_ce/5A CCE2_1F CCE2_5R RF6288 0,3 kb 39 pALK2029
O
^ RF6293_ce/5A CCE2_1F CCE2_3R RF6289 0,2 kb 40 pALK2033 oo x en
Kaikista näistä koettimista päätellyillä aminohapposekvensseillä oli § homologiaa useiden julkaistujen EGII/Cel5A- ja/tai EGII/Cel12A-sekvenssien
(M
<g 15 kanssa (BLAST-ohjelma, versio 2.2.9 NCBI:ssä, National Center for Biotech- o nology Information; Altschul et ai., 1990).
26
Taulukossa 4 lueteltujen plasmidien insertit leimattiin digoksigeniinil-la sen toimittajan ohjeiden mukaisesti (Roche, Saksa). T. reesein egl2/cel5A-ja eg/3/ce/12A-geenifragmentit leimattiin digoksigeniinilla vastaavasti, jotta niitä käytettäisiin kantojen Trichoderma gamsii RF6208, Hypocrea rufa / Trichoder-5 ma viride RF6310, Hypocrea atroviridis RF6323, Hypocrea viridescens RF6331 ja RF6603, Trichoderma harzianum RF6482 ja RF6541 sekä Hypocrea koningiopsis RF6604 genomisten kirjastojen seulontaan. Monistetut geno-miset kirjastot (1 x 105-6 x 105 plakkia) seulottiin leimatuilla koetinfragmenteil-la. Filttereiden hybridisaatiolämpötila oli 63-68 °C, ja filttereitä pestiin 2 x 5 mi-10 nuuttia huoneenlämmössä käyttämällä liuosta 2 x SSC / 0,1 % SDS, jonka jälkeen seurasi 2x15 minuuttia 63-68 °C:ssa liuoksessa 0,1-1 x SSC / 0,1 % SDS. Jokaisesta hybridisaatiosta saatiin useita positiivisia plakkeja. Jokaisesta seulonnasta puhdistettiin kahdesta viiteen voimakkaasti hybridisoituvaa plakkia. Faagi-DNA:t eristettiin ja karakterisoitiin Southern blot -hybridisaatioilla. Va-15 litut, koettimeen hybridisoituvat restriktiofragmentit subkloonattiin pBluescript II KS+ -vektoriin ja kloonien merkitykselliset alueet sekvensoitiin.
Kaikkiaan kloonattiin 16 egl2/cel5-geeniä; yksi egl2/cel5-geeni kannoista Hypocrea rufa / Trichoderma viride RF6310, Hypocrea atroviridis RF6323, Trichoderma harzianum RF6482, Hypocrea koningiopsis RF6604, Penicillium 20 griseofulvum Dierckx RF6288, Geomyces pannorum RF6293 ja RF6547 sekä Fusarium cf. equiseti RF6318 ja kaksi egl2/cel5-geeniä kannoista Trichoderma sp. RF6193, Trichoderma gamsii RF6208, Trichoderma fertile RF6601 ja Penicillium spinulosum RF6286. Lisäksi viisi egl3/cel12-geeniä kloonattiin kannoista Trichoderma sp. RF6193, Trichoderma gamsii RF6208, Trichoderma harzi-25 anum RF6482 ja RF6541 sekä Trichoderma fertile RF6601. Taulukossa 5 esitetään yhteenvetona tiedot koettimista, joita käytettiin geenien seulontaan, faa-o gikloonit, joista geenit eristettiin, valitut restriktiofragmentit, jotka sisältävät täy-
<M
^ sipituiset geenit sekä niiden promoottori- ja terminaattorialueet, plasmidien ni- ° met sekä näitä plasmideja sisältävien E. coli -kantojen DSM-talletusnumerot.
CO
X
cc
CL
O
LO
C\l
CO
00
O
O
CM
Taulukko 5. Endoglukanaasigeenien kloonaamiseen käytetyt koettimet, faagiklooni ja valitut subloonit, plasmidin numero ja vastaavan E. coli -kannan talletusnumero 27
Geeni Seulonnassa Faagi- pBluescript II Plasmidi E. colin käytetty klooni KS+:aan subkloo- nro talletusnro koetin nattu fragmentti 7g_RF6208_ce/5A T. reesei ce/5A F15 6,7 kb Sa/I pALK2121 DSM 19418 7g_RF6208_ce/5B T. reesei ce/5A F11 4,7 kb Xho\ pALK2120 DSM 18639
Hr_RF6310_ce/5A T. reesei ce/5A F2 4,0 kb EcoRI__pALK2118 DSM 18638
Ha_RF6323_ce/5A T. reesei ce/5A F22 4,3 kb BamHI pALK2123 DSM 19963 r/7_RF6482_ce/5A T. reesei ce/5A F42 2,5 kb EcoRI pALK2128 DSM 18642 H/c_RF6604_ce/5A T. reesei ce/5A F65A 4,5kbX/7ol__pALK2158 DSM 19419 7s_RF6193_ce/5A pALK2319 F81 2,8 kb EamHI pALK2330 DSM 19894 7s_RF6193_ce/5B pALK2321 F91A 3,0kbXbal pALK2331 DSM 19895 7f_RF6601_ce/5A pALK2320__F101A 7,0kbXfeal__pALK2359 DSM 21129 77_RF6601_ce/5B pALK2322 F107 5,6 kb Kpn\ pALK2366 DSM 19898 7g_RF6208_cel12A T. reesei ce/12A F16 2,7 kb EcoRI pALK2122 DSM 18640 r/7_RF6482_ce/12A T. reese/ce/12A F46 2,5 kb Xba\ pALK2129 DSM 18643 r/7_RF6541_ce/12A T. reese/ce/12A F80 2,2 kb H/ndlll pALK2165 DSM 19420 fs_RF6193_ce/12A pALK2323 F128 4,0 kbXbal pALK2367 DSM 19899 77_RF6601 _ce/12A pALK2324 F113 4,0kbXbal pALK2333 DSM 19896
Ps_RF6286_ce/5A pALK2239 F125 3,0 kb Psfl pALK2248 DSM 19960
Ps_RF6286_ce/5B pALK2240 F132 5,4 kb EcoRI pALK2249 DSM 19961
Pg_RF6288_ce/5A pALK2029 F61 4,4, kb Xbal pALK2031 DSM 18505 ^ Fe_RF6318_ce/5A pALK2048 F114 5,0 kb EcoRI pALK2225 DSM 19172 O------ ^ Gp_RF6293_ce/5A pALK2033 F73 4,4 kb Hindlll pALK2044 DSM 18914 ιό O Gp_RF6547_ce/5A pALK2242 F137 3,0 kb Hindlll pALK2250 DSM 19962
O
co | 5 Merkitykselliset tiedot geeneistä ja päätellyistä proteiinisekvensseis- 0 tä (sekvenssit nro 41-82) esitetään vastaavasti yhteenvetona taulukossa 6 ja eu taulukossa 7.
CD
00 o o
(M
28
Taulukko 6. Yhteenveto kannoista Trichoderma sp. RF6193, Trichoderma gamsii RF6208, Hypocrea rufa / Trichoderma viride RF6310, Hypocrea atroviridis RF6323, Trichoderma harzianum RF6482 ja RF6541, Trichoderma fertile RF6601, Hypocrea koningiopsis RF6604, Penicillium spinu-5 losum RF6286, Penicillium griseofulvum Dierckx RF6288, Geomyces pannorum RF6293 ja RF6547 sekä Fusarium cf. equiseti RF6318 eristetyistä endoglukanaasigeeneistä
Geeni Pituus Koodaava Intronien Intronien pituudet Sekvenssi intronien alue (bp)(b lukumäärä (bp) nro kanssa __(bpf_____ 7g_RF6208_ce/5A 1257 1254 - 41 7g_RF6208_ce/5B 1269 1266 - 43
Hr_RF6310_ce/5A 1257 1254 - 45
Ha_RF6323_ce/5A 1269 1266 - 47 r/7_RF6482_ce/5A 1278 1275 - 49 H/c_RF6604_ce/5A 1257 1254 - 51 T s_RF6193_ce/5A 1260 1257 - 53 T s_RF6193_ce/5B 1275 1272 - 55 77_RF6601_ce/5A 1311 1308 - 57 77_RF6601_ce/5B__1272 1269__-___59 7g_RF6208_ce/12A 825 699 2 58,65 61 r/?_RF6482_ce/12A 820 711 2 53,53 63 f/7_RF6541_ce/12A__831__705__2__56, 67__65 7s_RF6193_ce/12A 834 705 2 58,68 67 77_RF6601 _ce/12 A 817 705 2 53,56 69 o «M Ps_RF6286_ce/5A 1282 993 5 55,62,57,64,49 71 I------ O Ps_RF6286_ce/5B 1444 1239 4 50,47,54,51 73 g Pg_RF6288_ce/5A 1408 1200 4 55,52,50,48 75 ^ Fe_RF6318_ce/5A 1193 1128 1 62 77
CL
Gp_RF6293_ce/5A 1095 999 2 48,45 79
O
OJ Gp_RF6547_ce/5A 1284 1158 2 59,54 81 CD ,------ g (a STOP-kodoni sisältyy tähän.
^ (b STOP-kodonia ei sisälly tähän.
29
Taulukko 7. Yhteenveto kannoista Trichoderma sp. RF6193, Trichoderma gamsii RF6208, Hypocrea rufa / Trichoderma viride RF6310, Hypocrea at-roviridis RF6323, Trichoderma harzianum RF6482 ja RF6541, Trichoderma fertile RF6601, Hypocrea koningiopsis RF6604, Penicillium spinu-5 losum RF6286, Penicillium griseofulvum Dierckx RF6288, Geomyces pannorum RF6293 ja RF6547 sekä Fusarium cf. equiseti RF6318 saatujen endoglukanaasigeenien sekvensseistä päätellyistä aminohapposekvensseistä
Endoglukanaasi- Aminoh. ss NN:n CBD(b Ennustettu Ennustettu Sekv.
proteiini lukumäärä pituus(a MW (Da), pl nro _____ss ei sisälly10 (ss ei sisälly)__ 7g_RF6208_ce/5A__418__21__T23 -158__42142__4J58__42 7~g_RF6208_ce/5B__422__21__Q23 - V58__42200__M3__44
Hr_RF6310_ce/5A__418__21__T23 -158__42085__4^86__46
Ha_R F6323_ce/5 A__422__21__Q23 -158__42424__4,29 48 r/7_RF6482_ce/5A__425__23__Q23 -160__42604__4^54__50 H/c_RF6604_ce/5A__418__21__T23 - V58__42133__4,85 52
Ts_RF6193_ce/5A__419__21__Q22 -157__42261__5,08 54
Ts RF6193 ce/5B__424__23__Q25 -160__42440__4,54__56 77_RF6601_ce/5A__436__17__Q18-153__44368__5,29 58 77_RF6601_ce/5B__423__21__Q22 - V57__42237__4,59 60 7g_RF6208_ce/12A 233__16___23374__5,49 62
Th RF6482 ce/12A 237__16___25003__4,18 64 777_RF6541_ce/12A 235__16___23810__5^9__66 7~s_RF6193_ce/12A 235__16___23793__6,06 68 77_RF6601_ce/12A__235__16___24826__4,12 70
Ps_RF6286_ce/5A 331 17 34762 3,92 72
O
«M Ps_RF6286_ce/5B__414__16 T379-L414 42630__4,13 74 O Pg_RF6288_ce/5A 400 18 G365 - L400 40921 4,64 76 I ------- O Pe RF6318 ce/5A__376__16__Q17-Q52__40030__5,86 78 x Gp RF6293 ce/5A 333 18 34114 4,03 80 cn -----------
Gp_RF6547_ce/5A 392 18 Q19-V54 39927 5,40 82 § (a Signaalisekvenssin ennuste tehtiin ohjelmalla SignalP V3.0 (Nielsen et ai., 1997; Bendtsen et ai., 2004); NN-arvo
(M
00 10 saatiin neuraaliverkostoja käyttämällä.
§ (b Selluloosaa sitova domeeni (CBD); CBD-alueen aminohapot on merkitty [M1 (Met nro 1) sisältyy numerointiin].
CM
10 Ennustettu signaalisekvenssi ei sisältynyt tähän. Ennuste tehtiin ExPASy-palvelimen Compute pl/MW -työkalulla (Gasteiger et ai., 2003).
30
Taulukossa 8 esitetään kannoista Trichoderman/Hypocrean pääteltyjen EGII/Cel5-sekvenssien vertailu toisiinsa. Kannoista Penicillium spinu-losum RF6286, Penicillium griseofulvum Dierckx RF6288, Geomyces panno-rum RF6293 ja RF6547 ja Fusarium cf. equiseti RF6318 pääteltyjen EGII/Cel5-5 sekvenssien sekä täysipitkiä aminohapposekvenssejä että ydinproteiineja ilman CBD-aluetta vertailtiin toisiinsa taulukoissa 9 ja 10. Kannoista Trichoder-ma sp. RF6193, Trichoderma gamsii RF6208, Trichoderma harzianum RF6482 ja RF6541 sekä Trichoderma fertile RF6601 pääteltyjä Cell2/EGIII-sek-venssejä vertailtiin vastaavasti (taulukko 11). Identtisyysasteen määrittämiseen 10 käytettiin ohjelmaa Clone Manager (versio 9) ja toimintoja ’’Compare Two Se-quences/Global/Compare sequences as amino acids/BLOSUM62 scoring matrix”.
Taulukko 8. Identtisyysarvot (%), jotka saatiin kantojen Trichoderma sp. RF6193, Trichoderma gamsii RF6208, Hypocrea rufa / Trichoderma viride 15 RF6310, Hypocrea atroviridis RF6323, Trichoderma harzianum RF6482,
Trichoderma fertile RF6601 ja Hypocrea koningiopsis RF6604 pääteltyjen EGII/Cel5-aminohapposekvenssien rinnastuksesta. Rinnastettiin täysipit-kät aminohapposekvenssit, jotka sisältävät signaalisekvenssit. Identtisyysasteen määrittämiseen käytettiin ohjelmaa Clone Manager 9 20 (Compare Two Sequences/Global/Compare sequences as amino ac-ids/BLOSUM62 scoring matrix).
RF6208 RF6310 RF6604 RF6208 RF6323 RF6482 RF6193 RF6193 RF6601 RF6601
Cel5A Cel5A Cel5A Cel5B Cel5A Cel5A Cel5A Cel5B Cel5A Cel5B
RF6208 Cel5A |1||||||| 95 90 67 66 68 78 66 73 70 RF6310 Cel5A ||||||||| 90 68 67 69 78 67 73 70 £ RF6604 Cel5A llllllll 71 69 70 78 69 72 72
(M
, RF6208 Cel5B ilSOllii 95 83 70 81 67 80 tn 9 RF6323_Cel5A 111111111 84 70 82 67 80
O
CO RF6482 Cel5A ||||||||| 72 92 68 79 ir RF6193 Cel5A 11:1111111 72 84 74
CL
0 RF6193_Cel5B |||||||ll 68 79 m ................1111111111 (M RF6601 Cel5A 72 CD - O RF6601 Cel5B llllllll O --
(M
31
Taulukko 9. Identtisyysarvot (%), jotka saatiin kantojen Penicillium spinu-losum RF6286, Penicillium griseofulvum Dierckx RF6288, Geomyces pannorum RF6293 ja RF6547 sekä Fusarium cf. equiseti RF6318 pääteltyjen EGII/Cel5-aminohapposekvenssien rinnastuksesta. Rinnastet-5 tiin täysipitkät aminohapposekvenssit, jotka sisältävät signaalisekvenssit. Identtisyysasteen määrittämiseen käytettiin ohjelmaa Clone Manager 9 (Compare Two Sequences/Global/Compare sequences as amino acids/BLOSUM62 scoring matrix).
RF6286_Cel5A RF6286_Cel5B RF6288_Cel5A RF6293_Cel5A RF6318_Cel5A RF6547_Cel5A RF6286_Cel5A !!!!!!||ΐ|||||||| 56 55 58 52 50 RF6236 Cel5B 71 49 39 42 RF6238 Cel5A ||||!!!11!|||||||| 52 43 44 RF6293 Cel5A 46 48 RF6318_Cel5A 54 RF6547 Cel5A2 _ 10 Taulukko 10. Identtisyysarvot (%), jotka saatiin kantojen Penicillium spi-nulosum RF6286, Penicillium griseofulvum Dierckx RF6288, Geomyces pannorum RF6293 ja RF6547 sekä Fusarium cf. equiseti RF6318 pääteltyjen EGII/Cel5-aminohapposekvenssien rinnastuksesta. Rinnastettiin ydinsekvenssit, joista puuttuvat signaalisekvenssi ja linkkeri-CBD-15 alueet. Identtisyysasteen määrittämiseen käytettiin ohjelmaa Clone Manager 9 (Compare Two Sequences/Global/Compare sequences as amino acids/BLOSUM62 scoring matrix).
RF6286_Cel5A RF6286_Cel5B RF6288_Cel5A RF6293_Cel5A RF6318_Cel5A RF6547_Cel5A
o RF6286 Cel5A !111111|§1!111111 71 68 59 60 60 (M - LO RF6286_Cel5B illllll^iillllllll 77 63 55 61
O
q RF6288 Col5A !|||||||||11||||||||| 64 59 62
CO
RF6293_Cel5A lllllilllllll 54 58 x £ RF6318_Cel5A 57
O RF6547 Cel5A
LO ----
(M
CD
00
O
O
(M
32
Taulukko 11. Identtisyysarvot (%), jotka saatiin kantojen Trichoderma sp. RF6193, Trichoderma gamsii RF6208, Trichoderma harzianum RF6482 ja RF6541 sekä Trichoderma fertile RF6601 pääteltyjen EGIII/Cel12-amino-happosekvenssien rinnastuksesta. Rinnastettiin täysipitkät aminohappo-5 sekvenssit, jotka sisältävät signaalisekvenssit. Identtisyysasteen määrittämiseen käytettiin ohjelmaa Clone Manager 9 (Compare Two Se-quences/Global/Compare sequences as amino acids/BLOSUM62 scoring matrix).
RF6208 RF6482 RF6541 RF6193 RF6601
__Cel12A Cel12A Cel12A Cel12A Cel12A
RF6208_Cel12A 100 55 76 73 57 RF6482_Cel12A 100 62 60 89 RF6541_Cel12A 10.0.......... 89 63 RF6193_Cel12A 100 63
RF6601_Cel12A_100 I
10 Taulukossa 12 esitetään kantojen Trichoderma sp. RF6193, Tricho derma gamsii RF6208, Hypocrea rufa / Trichoderma viride RF6310, Hypocrea atroviridis RF6323, Trichoderma harzianum RF6482 ja RF6541, Trichoderma fertile RF6601, Hypocrea koningiopsis RF6604, Penicillium spinulosum RF6286, Penicillium griseofulvum Dierckx RF6288, Geomyces pannorum 15 RF6293 ja RF6547 sekä Fusarium cf. equiseti RF6318 pääteltyjen endoglu- kanaasisekvenssien vertailu tietokannoista löytyneisiin sekvensseihin.
δ
(M
i tn o i o 00
X
en
CL
o m
(M
CD
00 o o
(M
33
Taulukko 12. Kantojen Trichoderma sp. RF6193, Trichoderma gamsii RF6208, Hypocrea rufa / Trichoderma viride RF6310, Hypocrea atroviridis RF6323, Trichoderma harzianum RF6482 ja RF6541, Trichoderma fertile RF6601, Hypocrea koningiopsis RF6604, Penicillium spinulosum RF6286, 5 Penicillium griseofulvum Dierckx RF6288, Geomyces pannorum RF6293 ja RF6547 sekä Fusarium cf. equiseti RF6318 pääteltyjen endogluka-naasisekvenssien kanssa suurimman identtisyyden omaavat sekvenssit. Rinnastettiin täysipitkät aminohapposekvenssit, jotka sisältävät signaa-lisekvenssit. Tietokantahaku tehtiin käyttämällä BLAST (tblastn, nr/nt da-10 tabase) -hakua, ja identtisyysasteen määrittämiseen käytettiin Clone Manager 9 -ohjelmaa (Compare Two Sequences/Global/Compare sequences as amino acids/BLOSUM62 scoring matrix).
Eliö ja tunnusnumero__Identtisyys (%)
Tg_RF6208_Cel5A 100
Trichoderma viride, AY343987 76
Trichoderma sp., AY466436 76
Tg_RF620 8_Ce15B 100
Trichoderma viride, AY343987 69 Är_RF6310_Cel5A 100
Trichoderma sp., AY466436 77
Ha_RF632 3_Ce15A 100
Trichoderma viride, AY343987 69
Th_RF6482_Cel5A 100
Trichoderma viride, AY343987 71 HJfc_RF6604_Cel5A 100
Trichoderma viride, AY343987 77
O
Trichoderma sp., AY466436 77 ιό O Ts_RF 619 3_Ce15A 100
Trichoderma sp., AY466436 93 x Ts_RF6193_Cel5B 100 Q.
Trichoderma viride, AY343987 71
O
lO rf_RF660l_Cel5A 100 oo Trichoderma viride, AY343987 81
O
® Trichoderma sp., AY466436 81 rf_RF660l_Cel5B 100
Trichoderma viride, AY343987 72 34
Tg_RF62 O 8_Cell2A 100
Trichoderma viride, AF435070 96 rh_RF6482_Cell2A 100
Hypocrea schweinitzii, AF435068 59 rh_RF6541_Cell2A 100
Hypocrea schweinitzii, AF435068 84 rs_RF6193_Cell2A 100
Hypocrea schweinitzii, AF435068 82
Tf_RF6 60l_Cell2A 100
Trichoderma reesei, AB003694 61
Ps_RF62 8 6_Cel5A 100
Aspergillus niger, AF331518 69
Ps_RF6286_Cel5B 100
Neosartorya fischeri, XM_001261833 71
Pg_RF6288_Cel5A 100
Aspergillus clavatus, XM_001268255 71
Aspergillus fumigatus, XM_745950 71
Fe_RF6318_Cel5A 100
Gibberella zeae, XM_383971 90
Gp_RF6293_Cel5A 100
Thermoascus aurantiacus var. levisporus, AY847014 60
Macrophomina phaseolina, U14948 60
Gp_RF6547_Cel5A 100
Neurospora crassa, XM_959066 61
Chaetomium globosum, XM_001220408 61 δ
(M
in o o
CO
X
cn
CL
o in
(M
CD
00 o o
(M
35
Taulukko 13. Patenttijulkaisun sekvenssien suurin identtisyys kantojen Trichoderma sp. RF6193, Trichoderma harzianum RF6482 ja RF 6541, Trichoderma fertile RF6601, Geomyces pan noru m RF6293 ja Fusarium cf. equiseti RF6318 pääteltyjen endoglukanaasisekvenssien kanssa. Rinnas-5 tettiin täysipitkät aminohapposekvenssit, jotka sisälsivät signaalise-kvenssit. The Chemical Abstracts Service (CAS) Registry System-, DGE-GE-ja Patended Protein Sequences NCBI -tietokantahaut tehtiin BLAST:n avulla, ja identtisyysasteen määrittämiseen käytettiin ohjelmaa Clone Manager 9 (Compare Two Sequences/Global/Compare sequences as 10 amino acids/BLOSUM62 scoring matrix).
Eliö ja tunnusnumero Identtisyys (%)
Gp_RF6293_Cel5A 100 JP2928265 B2, SEQ ID: 1 21
Fe_RF6318_Cel5A 100 US7314 974 B2, SEQ ID: 3197 57 rh_RF6482_Cell2A 100 US200700264 20 AI, SEQ ID: 9 59 rh_RF6541_Cell2A 100 US20070026420 AI, SEQ ID; 8_ 82 rs_RF6193_Cell2A 100 US20070026420 AI, SEQ ID: 8 81
Tf_RF6 60l_Cell2A 100 US20070026420 AI, SEQ ID: 9 62
Esimerkki 3. Rekombinanttiendoglukanaasiproteiiniien tuottaminen Tri-o choderma reeseissä g Rakennettiin ekspressioplasmidit kannoista Trichoderma sp.
ό 15 RF6193, Trichoderma gamsii RF6208, Hypocrea rufa / Trichoderma viride x RF6310, Hypocrea atroviridis RF6323, Trichoderma harzianum RF6482 ja “ RF6541, Trichoderma fertile RF6601, Hypocrea koningiopsis RF6604, Penicil- § Hum spinulosum RF6286, Penicillium griseofulvum Dierckx RF6288, Geomy- C\l g ces pannorum RF6293 ja RF6547 sekä Fusarium cf. equiseti RF6318 peräisin o 20 olevien rekombinanttiendoglukanaasiproteiinien yliekspressiota Trichoderma reeseissä varten. Rakennetut ekspressioplasmidit luetellaan taulukossa 14. egl2/cel5- ja eg/3/ce/12 -rekombinanttigeenit, jotka sisälsivät omat signaalisek- 36 venssinsä, fuusioitiin täsmälleen T. reesein cb/7l/ce/7A-promoottoriin. Transkription lopetus varmistettiin T. reesein cjb/?1/ce/7A-terminaattorilla ja A. nidu-lansin amc/S-markkerigeeniä käytettiin transformanttien selektioon, kuten julkaisussa Paloheimo et ai. (2003) kuvataan. Lineaariset ekspressiokasetit (ku-5 vio 1) eristettiin vektorirungoista EcoRI- tai Λ/ofl-digestion jälkeen, ja kasetit transformoitiin T. reesein A47- ja/tai A51-protoplasteihin (molemmista kannoista on poistettu neljää tärkeintä sellulaasia CBHI/Cel7A, CBHII/Cel6A, EGI/Cel7B ja EGII/Cel5A koodaavat geenit). Transformaatiot tehtiin kuten julkaisussa Penttilä et ai. (1987) käyttäen julkaisussa Karhunen et ai. (1993) kulo vattuja muunnelmia ja selektoimalla asetamidilla ainoana typen lähteenä (amc/S-markkerigeeni). Transformantit puhdistettiin selektiomaljoilla yksittäisten kuromaitiöiden kautta ennen niiden sporulaatiota PD:llä.
δ
(M
i tn o i o 00
X
en
CL
o m
(M
CD
00 o o
(M
37
Taulukko 14. Ekspressiokasetit, jotka rakennettiin kannoista Trichoderma sp. RF6193, Trichoderma gamsii RF6208, Hypocrea rufa / Trichoderma vi-ride RF6310, Hypocrea atroviridis RF6323, Trichoderma harzianum RF6482 ja RF6541, Trichoderma fertile RF6601, Hypocrea koningiopsis 5 RF6604, Penicillium spinulosum RF6286, Penicillium griseofulvum
Dierckx RF6288, Geomyces pannorum RF6293 ja RF6547 sekä Fusarium cf. equiseti RF6318 peräisin olevien endoglukanaasiproteiinien ylituotta-miseksi Trichoderma reeseissä. Ekspressiokasettien kokonaisrakenne oli kuviossa 1 kuvatun kaltainen. Kloonatut egl2lcel5- ja eg/3/ce/12-geenit 10 fuusioitiin täsmälleen T. reesein cb/7l/ce/7A-promoottoriin.
Endoglukanaasiproteiini Ekspressioplasmidi__Ekspressiokasetti(a Terminaattori(b 7g_RF6208 ce/5A__pALK2302__9,1 kb EcoRI__451 bp (Pvu\\)
Tg_RF6208 ce/5B__pALK2144__9,3 kb EcoRI__614 bp (Xba\)
Hr RF6310 ce/5A__pALK2142__9,1 kb EcoRI__504 bp (PvuH)
Ha RF6323 ce/5A__pALK2146__8,8 kb EcoRI__216 bp (SaroHI) 7/7_RF6482_ce/5A__pALK2138__8,9 kb EcoRI__263 bp (SpeI)
Hk RF6604 ce/5A__pALK2318__8,9 kb EcoRI__275 bp (Xba\)
Ts RF6193 ce/5A__pALK2361__8,8 kb EcoRI__123 bp (H/hdlll)
Ts RF6193 ce/5B__pALK2363__9,3 kb Nott__633 bp (Xba\) 77_RF6601_ce/5A__pALK2365__9,2 kb EcoRI__502 bp (H/ndlll)
Tf RF6601 ce/5B__pALK2369__8,7 kb Nott__47 bp (C/al)
Tg RF6208 ce/12A__pALK2148__8,6 kb Nott__390 bp (Nru\)
Th RF6482 ce/12A__pALK2140__8,7 kb EcoRI__480 bp (Spel) 7T-7 RF6541 ce/12A__pALK2314__8,3 kb EcoRI__90 bp (Spel) 7s_RF6193 ce/12A__pALK2376__8,3 kb EcoRI__123 bp (H/ndlll)
Tf RF6601 ce/12A__pALK2371__8,2 kb EcoRI__43 bp (Sapl)
Ps RF6286 ce/5A__pALK2455__8,6 kb Nott__187 bp (SM) ^ Ps_RF6286 ce/5B__pALK2458__9,2 kb Nott__409 bp {BamH\)
O
^ Pg_RF6288_ce/5A__pALK2037__8,9 kb Nott__145 bp (Xhol) o Fe RF6318 ce/5A pALK2233 9,0 kb Nott 409 bp (Sapl) I ™ ™ o Gp RF6293 ce/5A__pALK2212__9,0 kb Nott__539 bp (Pstt) -r Gp_RF6547_ce/5A pALK2461 8,9 kb Nott 182bp(EcoRV) cc Q- ' Ekspressiokasetti T. reesein transformaatioon eristettiin vektorirungosta EcoRI- tai A/oil-digestiolla.
O (b Kloonatun rekombinanttigeenin STOP-kodonin jälkeisten nukleotidien määrä, joka sisällytettiin eks- Φ pressiokasettiin. Sulkumerkkien sisällä esitetään ekspressiokasetin rakentamisessa käytetty restrik- o tiokohta genomisen geenifragmentin 3'-päässä.
o w 15 38
Transformanttien endoglukanaasituotanto analysoitiin ravistuspullo-viljelmien viljelmäsupernatanteista (50 ml). Transformantteja kasvatettiin 7 päivää kompleksisessa laktoosipohjaisessa sellulaaseja indusoivassa elatusai-neessa (Joutsjoki et al. 1993), joka oli puskuroitu 5-prosenttisella KH2P04:lla.
5 Endoglukanaasiaktiivisuus määritettiin 3-prosenttinen (paino/tilavuus) karbok-simetyyliselluloosa (CMC) substraattina 50 mM sitraattipuskurissa julkaisujen Bailey ja Nevalainen, 1981, ja Haakana et ai., 2004, mukaisesti tai käyttämällä vaihtoehtoisesti 1-prosenttista (paino/tilavuus) hydroksietyyliselluloosaa (HEC) substraattina, kuten julkaisussa Bailey ja Nevalainen, 1981, kuvataan. Valittu-10 jen transformanttien genotyypit varmistettiin Southern blot -kokeilla, joihin sisällytettiin lukuisia genomisia digestejä, ja vastaavaa ekspressiokasettia käytettiin koettimena. Rekombinanttiendoglukanaasiproteiinien heterologista tuottoa analysoitiin SDS-PAGE:lla ja sitä seuraavalla Coomassie-värjäyksellä.
Rekombinanttiendoglukanaasin entsyymivalmisteet karakterisoitiin 15 pH-optimin ja lämpötilakestävyyden suhteen. Ylliuotettujen endoglukanaasipro-teiinien pH-optimit määritettiin yleisessä Mcllvaine-puskurissa pH-vaihtelu-välillä 2,0-8,0 käyttämällä 3-prosenttista (paino/tilavuus) karboksimetyylisellu-loosaa (CMC) substraattina (kuvio 2 A-C). Rekombinanttisten endoglukanaasi-proteiinien lämpötilakestävyys määritettiin mittaamalla CMCaasiaktiivisuus 20 yleisessä Mcllvaine-puskurissa optimi-pH:ssa 1 tunnin reaktioajalla (kuvio 2D-F).
Valittuja endoglukanaasia tuottavia transformantteja viljeltiin labora-toriobioreaktoreissa 28 °C:ssa edellä osoitetussa elatusaineessa 3-4 päivää pH-kontrollilla 4,4 ± 0,2 (NH3/H3PO4), jotta saataisiin materiaalia sovellusteste-25 jä varten. Supernatantit kerättiin talteen sentrifugoimalla ja Seitz-K 150- ja EK-suodattimien läpi suodattamalla (Pali SeitzSchenk Filtersystems GmbH, Bad o Kreuznach, Saksa).
CM
0 Esimerkki 4. Cel12A-rekombinanttiproteiinien toimintakyky farmarikan- g kaan käsittelyssä eri lämpötiloissa 1 30 Cel12A-rekombinanttiproteiineilta, jotka oli tuotettu esimerkissä 3 kuvatulla tavalla Trichodermaa isäntänä käyttäen, testattiin niiden kyky farma-rikankaan biologiseen kivipesuun eri lämpötiloissa samanlaisen kuluneen ul-o konäön tuottamiseksi kuin hohkakivillä aikaansaatu ulkonäkö. Vertailuksi käy- ° tettiin kaupallista sellulaasia ECOSTONE®L900 (Roal Oy, Suomi), joka on 35 Trichoderma reesein Cel5-rikastettu sellulaasivalmiste, ja Cel5-sellulaasia In-diAge® Super L (Genencor International), joka on Cel12-valmiste.
39
Indigovärjätystä twill-farmarikankaasta valmistettua, englantilaiselta toimittajalta hankittua yhtä farmarihousuparia käytettiin kokeen päämateriaali-na ECOSTONE® A200 -alfa-amylaasilla tehdyn liimanpoiston jälkeen ja täyte-materiaalina käytettiin kahta Apache-farmarihousuparia (Labels Fashion Limi-5 ted, U.K.), joille oli tehty liimanpoisto. Sellulaasikäsittelyt tehtiin Electroluxin Wascator FOM 71 CLS -pesuimurilla taulukossa 15 kuvatuissa olosuhteissa.
Taulukko 15. Sellulaasikäsittelyissä käytetyt koeolosuhteet/prosessipara-metrit
Prosessi parameter!
Farmarikankaan määrä 1,6 kg
Vesi 17 litraa
Puskuri/pH-kontrolli (pH 5/6) pH 5, säädetty etikkahapolla, pH 6, säädetty Na2HP04 H20:lla ja sitruunahapolla
Aika 55 min
Lämpötila 30, 40, 50 tai 60 °C
Sellulaasiannos Taulukon 16 mukainen 10 Happamia entsyymejä annosteltiin endoglukanaasiaktiivisuutena (ECU), paitsi IndiAge® Super L:ää, jonka pH-optimin vaihteluväli on valmistajan tietoihin perustuen 5,5-6,5, neutraalin sellulaasin aktiivisuusyksikköinä (NCU) kankaan painoa kohden. Neutraalin sellulaasin aktiivisuus mitattiin pelkistävien sokereiden vapautumisena karboksimetyyliselluloosasta (3-prosenttinen CMC) 15 50 °C:ssa 50 mM Hepes-puskurissa, pH 7,0 (Haakana et ai. 2004). Endoglu- kanaasiaktiviisuus (ECU-aktiivisuus) mitattiin pH:ssa 4,8, 1-prosenttisen (pai-no/tilavuus) hydroksietyyliselluloosan (HEC) kanssa, kuten esimerkissä 1 ku-5 vattiin. IndiAge® Super L:n annostus vastaa 1,6-2,4-prosenttista entsyymiä
CM
^ vaatekappaleen painosta; entsyymin suositeltu annostus on valmistajan tie- ^ 20 töihin perustuen 0,5-3 %. Sellulaasientsyymi inaktivoitiin nesteen poisvalutta- 00 misen jälkeen nostamalla pH-arvo yli 11:een lisäämällä 4,2 g NaOH:a (10 mi- | nuuttia, 40 °C) ja huuhtelemalla kolme kertaa. Farmarihousut kuivattiin o rumpukuivaajassa.
LO
Kokeen päämateriaalin biologisen kivipesun vaikutelmaa tai han-§ 25 kautumisen tasoa arvioitiin mittaamalla väriä reflektanssiarvoina Minolta CM
^ 2500 -spektrofotometrillä käyttämällä väriavaruuden L*a*b*-koordinaatteja (va lonlähde D65/2°). Väri farmarikankaan etu- ja takapuolelta mitattiin liimanpois- 40 ton jälkeen (so. ennen sellulaasikäsittelyä) sekä sellulaasikäsittelyn jälkeen. Farmarikankaan etupuolen jokainen mittaus oli noin 40 mittauksen keskiarvo. Tulokset esitetään taulukossa 16 ja kuvioissa 3-5.
Yhtä Cel45-entsyymivalmisteista, T/?_6482_Cel12:ta, oli testattu jo 5 aiemmin eri lämpötiloissa käyttämällä vertailuun ECOSTONE®L900:a. Koejärjestelmä biologiselle kivipesulle oli samanlainen kuin edellä kuvattu, paitsi että ndigovärjätystä twill-farmarikankaasta valmistettua, englantilaiselta toimittajalta hankittua yhtä farmarihousuparia indigovärjätystä twill-farmarikankaasta valmistetun, englantilaiselta toimittajalta hankitun yhden farmarihousuparin lisäksi 10 käytettiin kahta palaa (lahkeet) Ukos Sportin (Belgia) Atlanta- ja Nostalgy-farmarikankaasta (kaikkiaan 1,1 kg). Lisäksi arvioitiin sellulaasikäsittelyn vaikutuksia kuten edellä kuvattiin, paitsi taulukossa 17 esitetyt lopulliset tulokset, jotka perustuvat kolmen eri farmarikankaan keskimääräisiin mittauksiin, yhtä farmarihousuparia δ cv
LO
O
O
CO
X
cc
CL
o
LO
CV
CO
CO
o o cv 41
Taulukko 16. Cel12-rekombinanttivalmisteilla eri lämpötiloissa käsitellyn farmarikankaan etupuolen värimittaukset. Käsittelyä kaupallisilla entsyymivalmisteilla käytettiin vertailuksi. L* tarkoittaa kirkkautta.
Entsyymi Aktiivisuus/g Ennen sellu- Sellulaasikäsittelyn vaate- Olosuhteet laasikäsittelyä jälkeen L*:n kappaletta lisäys
Farmarihousuerä 03/08 L* L* r/?_RF6541_Cel12A 75 ECU/g 60 °C, pH 5 16,76 20,02 3,26 r/?_RF6541_Cel12A 75 ECU/g 50 °C, pH 5 16,96 21,83 4,87 77?_RF6541_Cel12A 75 ECU/g 40 °C, pH 5 16,86__208__3,94 77?_RF6541_Cel12A 75 ECU/g 30 °C, pH 5 16,85__106__2,75 7~s_6193_Cel12A__150 ECU/g 60 °C, pH 5 16,79__19,16__2,37 7s_6193_Cel12A__150 ECU/g 50 °C, pH 5 16,83__21,52__4,69 7s_6193_Cel12A__150 ECU/g 40 °C, pH 5 16,85__22,99__6,14 7s_6193_Cel12A__150 ECU/g 30 °C, pH 5 16,91__22,28__5,37 77?_6482_Cel12A_ 375 ECU/g 50 °C, pH 5 16,5__23,42__6,92 77?_6482_Cel 12A_ 375 ECU/g 30 °C, pH 5 16,42 20,8 4,38 ECOSTONE® L900 750 ECU/g 50 °C, pH 5 17,09__21,94__4,85 ECOSTONE® L900 750 ECU/g 40 °C, pH 5 16,69__20,46__3,77
IndiAge® Super L 500 NCU/g 30 °C, pH 6 16,88__20,25__3,37
IndiAge® Super L 750 NCU/g 40 °C, pH 6 16,77__21,65__4,88 ^ IndiAge® Super L 750 NCU/g 30 °C, pH 6 16,71 20,83 4,12 o------
(M
LO
cp Farmarihousuera 06/08 __ m 7T_RF6601_Cel12A 250 ECU/g 60 °C, pH 5 16,85__19,97__3,12 £ 77_RF6601_Cel 12A 250 ECU/g 50 °C, pH 5 16,84 20,94 4,10 CL------ 77_RF6601_Cel12A 250 ECU/g 40 °C, pH 5 16,97__20,58__3,61 o3 Tf RF6601 Cel12A 250 ECU/g 30 °C, pH 5 16,94 20,06 3,12 co —------ oo o______ ECOSTONE® L900 750 ECU/g |40 °C, pH 5 16,74__21,67__4,93 42
Taulukko 17. 77i_6482_Cel12A:n ja ECOSTONE® L900:n lämpö-tilaprofiilit farmarikankaan käsittelyssä (55 min, pH 5)
Entsyymi_ Lämpötila (°C) L*:n suhteellinen lisäys (%) T/7_6482_Cel12A__60__94_ __50__100_ __40__85_ __30__88_ ECOSTONE® L900__60__100_ __50__76_ __40__61_ | 30 | 58
Taulukon 16 ja 17 ja kuvioiden 3-5 tulokset osoittavat, että Cell2-5 rekombinanttientsyymeillä aikaansaatiin samanlainen tai jopa parempi biologisen kivipesun vaikutus kuin kaupallisilla farmarikangasentsyymeillä. 7"/?_RF6541_Cel12A osoittaa optimaalista toimintakykyä 50 °C:ssa, optimaalinen vaihteluväli 7s_6193_cel12A:lle on 30-40 °C ja 7T7_6601_cel12A:lle 40-50 °C. T/?_6482_Cel12A toimii hyvin laajalla vaihteluvälillä 30 °C-60 °C (optimi 10 50 °C). Kaikilla Cel12-rekombinanttientsyymeillä oli matalampi lämpötilaprofiili kuin kaupallisella ECOSTONE®L900:lla, jolla on optimaalinen toimintakyky 60 °C:ssa.
Ts_6193_cel12A:lla oli parempi toimintakykysuhde 30 °C / 40 °C
(87 %) IndiAge® Super L:ään (84 %) verrattuna, joka toisin kuin muut tässä 15 testatut sellulaasit on sellulaasi, jonka optimaalinen pH-väli on valmistajan tuo- ^ tetietojen mukaisesti 5,5-6,5 ja jonka optimaalinen lämpötilaväli on 40-45 °C.
δ
CM
Esimerkki 5. Fe_6318_cel5A-proteiinin toimintakyky farmarikankaan kä-
O
^ sittelyssä eri pH-arvoissa
CO
x Fe_6318_cel5A-rekombinanttiproteiinilta, joka oli tuotettu esimerkis- * 20 sä 3 kuvatulla tavalla Trichodermaa isäntänä käyttäen, testattiin sen kyky far- g mankankaan biologiseen kivipesuun eri pH-arvoissa samanlaisen kuluneen ui-
C\J
£ konäön tuottamiseksi kuin hohkakivillä aikaansaatu ulkonäkö.
00 o Farmarikangas (farmarihousuerä 03/2008) ja koejärjestelmä biologi
selle kivipesulle olivat kuten esimerkissä 4, paitsi että lämpötila oli 50 °C ja pH
43 5-7 (säädetty puskurilla). Myös sellulaasikäsittelyn vaikutusta arvioitiin kuten esimerkissä 4.
Tulokset esitetään taulukossa 18 ja kuviossa 6, jotka osoittavat, että Fe_6318_cel5:llä on erinomainen biologisen kivipesun vaikutus, että valmiste 5 toimii pH-välillä 6-7 (optimi-pH 6,5) ja että pH:ssa 5 toimintakyky laskee huomattavasti. Tämä on ainutlaatuista muihin perheen 5 entsyymeihin verrattuna, jotka ovat tyypillisesti happamia sellulaaseja.
Taulukko 18. Rekombinanttiproteiinilla Fe_6318_cel5A eri pH-arvoissa 50 °C:ssa käsitellyn farmarikankaan etupuolen värimittaukset. L* tarkoit-10 taa kirkkautta
Ennen sellu- Sellulaasikäsittelyn L*:n pH laasikäsittelyä__jälkeen_ lisäys ____L*__ 5 __16,57__19,66__3,09 6 __16,74__21,41__4,67 6,5__16,42__21,85__5,43 7 16,6 21,11 4,51
Esimerkki 6. Fe_6318_cel5A-proteiinin toimintakyky farmarikankaan pintakäsittelyssä eri lämpötiloissa
Fe_6318_Cel5A-rekombinanttiproteiinilta, joka oli tuotettu esimer-15 kissä 3 kuvatulla tavalla Trichodermaa isäntänä käyttäen, testattiin sen kyky farmarikankaan biologiseen kivipesuun eri lämpötiloissa samanlaisen kuluneen ulkonäön tuottamiseksi kuin hohkakivillä aikaansaatu ulkonäkö ja proteiinia £ verrattiin kaupalliseen neutraaliin Cel45-sellulaasiin ECOSTONE® N400.
^ Biologisen kivipesun koejärjestelmä oli kuten esimerkissä 4, paitsi 9 20 että koemateriaalina käytettiin indigovärjätystä twill-farmarikankaasta valmistet-
O
tua, englantilaiselta toimittajalta hankittua kahta farmarihousuparia (1,3 kg) c ECOSTONE® A200 alfa-amylaasilla tehdyn liimanpoiston jälkeen, ja kokeen 0 pH oli 6. Myös sellulaasikäsittelyn vaikutusta arvioitiin kuten esimerkissä 4.
£3 Tulokset esitetään taulukossa 19 ja kuviossa 6, jotka osoittavat, että o 25 Fe_6318_Cel5A:lla on yhtä hyvä vaikutus kuin kaupallisella neutraalilla selluni laasilla ECOSTONE® N400.
Taulukko 19. Fe_6318_Cel5A-rekombinanttiproteiinilla eri lämpötiloissa (55 min, pH 6,5) käsitellyn farmarikankaan etupuolen värimittaukset. L* tarkoittaa kirkkautta 44
Entsyymi Aktiivisuus/g Lämpötila Ennen sellu- Sellulaasi- L*:n vaatekappaletta °C laasikäsittelyä/ käsittelyn lisäys L* jälkeen / L* ECOSTONE ®N400 1500 NCU/g__50__17,53__23,31__5,79
Fe_6318_Cel5A__750 NCU/g__60__17,58__24,73__7,16
Fe_6318_Cel5A__750 NCU/g__50__17,48__23,63__6,16
Fe_6318_Cel5A__750 NCU/g__40__17,60__22,23__4,64
Fe_6318_Cel5A 750 NCU/g 30__17,16__21,01__3,85 5 Esimerkki 7. Cell2- ja Cel5-rekombinanttiproteiinien toimintakyky biovii-meistelyssä (nyppyjen/nukan poisto)
Valittujen Cell2- ja Cel5-rekombinanttiproteiinien, jotka oli tuotettu esimerkissä 3 kuvatulla tavalla Trichodermaa isäntänä käyttäen, kykyä puuvil-laneuleen nyppyjen/nukan poistoon testattiin ja verrattiin kaupalliseen valmis-10 teeseen ECOSTONE®L900:aan, joka on Cel5-rikastettu Trichoderma reesei -sellulaasivalmiste, jota tyypillisesti käytetään biologisen pintakäsittelyn formu-laatioissa. Sellulaasikäsittelyt tehtiin Electroluxin Wascator FOM 71 CLS -pesuimurilla taulukossa 20 kuvatuissa olosuhteissa.
Sataprosenttisesta puuvillasta valmistettua kolmilankaista fleece-15 kangasta (tyyppi 9761, Orneule, Suomi) käytettiin koemateriaalina täytemateri-aalin kanssa. Kangasta esipestiin ensin 10 minuuttia 50 °C:ssa ja huuhdeltiin 3 o kertaa. Sen jälkeen puuvillaneuloskangasta käsiteltiin sellulaasilla 50 °C:ssa g 60 minuutin ajan. Entsyymit annosteltiin happamana endoglukanaasiaktiivisuu- ό tena (ECU), poikkeuksena Fe_6318_Cel5A, jota annosteltiin neutraalin sellu-
CO
20 laasin aktiivisuusyksikköinä (NCU) kankaan painoa kohden, kuten esimerkeistä sä 1 ja 4 kuvattiin. Nesteen poisvaluttamisen jälkeen entsyymi inaktivoitiin (10 g minuuttia 40/50 °C:ssa) nostamalla pH-arvo yli 11:een natriumhydroksidilla.
S Kangasta huuhdeltiin sitten kolme kertaa ja kuivattiin rumpukuivaajalla.
o o
CM
45
Taulukko 20. Biologisissa pintakäsittelyissä käytetyt koeolosuhteet/prosessiparametrit
Prosessiparametri
Kankaan määrä 1,0 kg
Vesi 15 Itraa pH-kontrolli pH 5/6 etikkahapolla (80-prosenttinen)
Aika 60 minuuttia Lämpötila__40/50 °C_
Sellulaasiannos Taulukon 21 mukainen
Kangasnäytteitä arvioitiin silmämääräisesti sen mukaan, paljonko 5 havaittiin pintasäikeitä ja nukkaa. Kunkin arvioinnin tulos kvantitoitiin merkitsemällä tulos standardien muodostamaan skaalaan verrattuna. Nämä standardit olivat saman kankaan paloja, jotka oli pesty eri määrillä sellulaasia, ja niiden pintasäikeiden tai nukan intensiteetin vaihteluväli oli numerovälillä 1-5 puolen yksikön välimatkoin. Numero 0 oli kontrollinäyte, jota käsiteltiin ilman entsyy-10 miä. Mitä suurempi numero, sen parempi nyppyjen poiston tai karvanpoiston vaikutus. Numero 5 tarkoittaa, että pintasäikeet tai nukka olivat poistuneet.
Tulokset esitetään taulukossa 21. 7s_6193_cel12A:lla ja 7T7_6482_cel12A:lla oli erinomainen ja T/i_RF6541_cel12A:lla ja
Fe_6318_cel5A:lla hyvä nyppyjen poiston tai karvanpoiston vaikutus samalla 15 aktiivisuusannoksella, jota käytettiin farmarikankaan käsittelyssä aiemmissa esimerkeissä. Ts_6193_cel12A:lla oli yhtä hyvä toimintakyky 40 °C:ssa kuin 50 °C:ssa.
δ
(M
tn o i o 00
X
en
CL
o m
(M
CD
00 o o
(M
46
Taulukko 21. Biologisten pintakäsittelyjen tulokset
Entsyymi Aktiivisuus/ T, pH Arviointi __g kangasta___
Kontrolli__0__50 °C, pH 5 0 ECOSTONE®L9QO 612 ECU/g 50 °C, pH 5 4 77i_RF6541_Cel12A 61 ECU/g 50 °C, pH 5 3,5 77i_6482 Cell2A 375 ECU/g 50 °C, pH 5 4,5 7s_6193_Cel12A 150 ECU/g 50 °C, pH 5 5
Ts_6193_Cel12A__150 ECU/g 40 °C, pH 5__5
Ts_6193_Cel12A__75 ECU/g 40 °C, pH 5 4,5
Fe_6318_Cel5A__750 NCU/g 50 °C, pH 6__3
Fe_6318_Cel5A 1500 NCU/g 50 °C, pH 6 4 4—5 osoittaa erinomaista nyppyyntymisen/nukkaantumisen eston vaikutusta, 3 osoittaa hyvää nyppyjen/nukan poiston vaikutusta ja 0 osoittaa, ettei ole lainkaan nyppyjen/nukan poiston vaikutusta (kontrollikäsittely ilman entsyymiä) 5 δ
(M
LO
o o co
X
cc
CL
o
LO
C\J
CO
oo o o
CVJ
AI
Kirjallisuusviitteet
Altschul SF, W Gish, W Miller, EW Myers ja DJ Lipman. 1990. Basic local alignment search tool. J. Mol. Biol. 215:403 - 410.
5 Bailey M ja Nevalainen H. 1981. Induction, isolation and testing of stable Trichoderma reesei mutants with improved production of solubilizing cellulase. Enzyme Microb. Technol. 3:153 -157.
Bendtsen JD, H Nielsen, G von Heijne ja S Brunak. 2004. Improved prediction of signal peptides: SignalP 3.0. J. Mol.Biol. 340:783 - 795.
10 Gasteiger E, A Gattiker, C Hoogland, I Ivanyi, RD Appel ja A Bai- roch. 2003. ExPASy: the proteomics server for in-depth protein knowledge and analysis. Nucleic Acids Res. 31:3 784 - 3 788.
Haakana H, Miettinen-Oinonen A, Joutsjoki V, Mäntylä A, Suominen P ja Vehmaanperä J. 2004. Cloning of cellulase genes from Meianocarpus al-15 bomyces and their efficient expression in Trichoderma reesei. Enzyme Microb. Technol. 34:159 - 167.
Henrissat B. (1991) A classification of glycosyl hydrolases based on amino acid sequence similarities. Biochem. J. 280:309 - 316.
Henrissat B. ja Bairoch A. (1993) New families in the classification 20 of glycosyl hydrolases based on amino acid sequence similarities. Biochem. J. 293: 781 - 788.
Henrissat B. ja Bairoch A. (1996).Updating the sequence-based classification of glycosyl hydrolases. Biochem. J. 316:695 - 696.
Joutsjoki, W, TK Torkkeli ja KMH Nevalainen. 1993. Transfor-
25 mation of Trichoderma reesei with the Hormoconis resinae glucoamylase P
^ (gamP) gene: production of a heterologous glucoamylase by Trichoderma ™ reesei. Curr. Genet. 24:223-228.
in 9 Karhunen T, A Mäntylä, KMH Nevalainen ja PL Suominen. 1993.
8 High frequency one-step gene replacement in Trichoderma reesei. I. Endoglu-
Ee 30 canase I overproduction. Mol. Gen. Genet. 241:515 - 522.
Q_
Malardier L, Daboussi MJ , Julien J, Roussel F, Scazzocchio C ja ou Brygoo Y. 1989. Cloning of the nitrate reductase gene (niaD) of Aspergillus
CO
§ nidulans and its use for transformation of Fusarium oxysporum. Gene 15:147 - ° 156.
48
Needleman S. ja Wunsch C. (1970) A general method applicable to the search for similarities in the amino acid sequence of two proteins. Journal of Molecular Biology 48, 443 - 453.
Nielsen H, J Engelbrecht, S Brunak ja G von Heijne. 1997. Identifi-5 cation of prokaryotic and eykaryotic signal peptides and prediction of thier cleavage sites. Protein Engineering 10:1 - 6.
Nierstrasz V.A. ja Warmoeskerken M.M.C.G. (2003) Process engineering and industrial enzyme applications. Teoksessa Textile processing with enzymes. A. Cavaco-Paulo ja G. M. Giibitz (toim.) Woodhead Publishing Ltd, 10 Cambridge, s.120 - 157.
Paloheimo M, A Mäntylä, J Kallio ja P Suominen. 2003. High-yield production of a bacterial xylanase in the filamentous fungus Trichoderma reesei requires a carrier polypeptide with an intact domain structure. Appi. Env. Microbiol. 69:7 073-7 082.
15 Penttilä M, H Nevalainen, M Rättö, E Salminen ja J Knowles. 1987.
A versatile transformation system for the cellulolytic filamentous fungus Trichoderma reesei. Gene 61:155 -164.
Raeder U ja P Broda. 1985. Rapid preparation of DNA from filamentous fungi. Lett. Appi. Microbiol. 1:17- 20.
20 Rice P, Longden I ja Bleasby A. (2000). EMBOSS: The European
Molecular Biology Open Software Suite. Trends in Genetics 16:276 - 277.
Sambrook J, EF Fritsch ja T Maniatis. 1989. Molecular cloning, a laboratory manual. Cold Spring Harbor Laboratory, New York, US.
Sambrook J ja DW Russell. 2001. Molecular cloning, a laboratory 25 manual. Cold Spring Harbor Laboratory, New York, US.
Ward M, Wu S, Dauberman GW, Larenas E, Bower B, Rey M, 5 Clarkson K ja Bott R. 1992 Proceedings of the 2nd TRICEL symposium on
CM
^ Trichoderma reesei cellulases and other hydrolases, Espoo, Suomi, 1993, ° toim. Suominen P ja Reinikainen T. Foundation for Biotechonological and in- 00 30 dustrual fermentation Research 8 (1993):153 - 158.
1 van Zyl WH, Lynd LR, den Haan R, McBride JE. 2007 Consolidated o bioprocessing for bioethanol production using Saccharomyces cerevisiae. Adv
Biochem Eng Biotechnol;108:205 - 235.
00 o o
CM
49
Sekvenssit
Sekvenssi Sekvenssi _nro__ 1 Oligonukleotidialuke, jota käytettiin T. reesein eg/2/ce/5A-geenifragmentin monista- __miseen_ 2 Oligonukleotidialuke, jota käytettiin T. reesein eg/2/ce/5A-geenifragmentin monista- __miseen_ 3 Oligonukleotidialuke, jota käytettiin T. reesein eg/3/ce/12A-geenifragmentin monis- __tamiseen_ 4 Oligonukleotidialuke, jota käytettiin T. reesein eg/3/ce/12A-geenifragmentin monis- __tamiseen_ _5__Peptidi 1 P. griseofulvum Dierckx RF6288:n CCE2-proteiinista_ _6__Peptidi 2 P. griseofulvum Dierckx RF6288:n CCE2-proteiinista_ _7__Peptidi 3 P. griseofulvum Dierckx RF6288:n CCE2-proteiinista_ _8__Peptidi 4 P. griseofulvum Dierckx RF6288:n CCE2-proteiinista_ _9__Peptidi 5 P.m griseofulvum Dierckx RF6288:n CCE2-proteiinista_ _10__Oligonukleotidialuke Cel5_cons_A_1_ _11__Oligonukleotidialuke Cel5_cons_A_2_ _12__Oligonukleotidialuke Cel5_cons_A_3_ _13__Oligonukleotidialuke Cel5_cons_B_1_ _14__Oligonukleotidialuke Cel5_cons_B_2_ _15__Oligonukleotidialuke Cel12_cons_A_1_ _16__Oligonukleotidialuke Cel12_cons_A_2_ _17__Oligonukleotidialuke Cel12_cons_B_1_ _18__Oligonukleotidialuke Cel12_cons_B_2_ _19__Oligonukleotidialuke Cel5 S1_ _20__Oligonukleotidialuke Cel5_S2_ _21__Oligonukleotidialuke Cel5 AS1_ _22__Oligonukleotidialuke Cel5_AS2_ ^ 23__Oligonukleotidialuke CCE2_1F_ ^ 24__Oligonukleotidialuke CCE2_2F_ o 25__Oligonukleotidialuke CCE2_3R_ o 26__Oligonukleotidialuke CCE2_4F_ _27__Oligonukleotidialuke CCE2_5R_ £ 28__Oligonukleotidialuke CCE2 6R_ o 29 PCR-fragmetti, joka saatiin Trichoderma sp. RF6193:sta alukkeilla Cel5_cons_A_1 dj ja Cel5 cons B 1 cd--------- g 30 PCR-fragmentti, joka saatiin Trichoderma sp. RF6193:sta alukkeilla Cel5_cons_A_3 ^__ja Cel5_cons_B_1_ 31 PCR-fragmentti, joka saatiin Trichoderma sp. RF6193:sta alukkeilla __Cel12_cons_A_1 ja Cel12_cons_B_1_ 50 32 PCR-fragmentti, joka saatiin Trichoderma fertile RF6601:stä alukkeilla __Cel5_cons A 1 ja Cel5_cons B 1_ 33 PCR-fragmentti, joka saatiin Trichoderma fertile RF6601:stä alukkeilla __Cel5_cons_A_3 ja Cel5_cons B 1_ 34 PCR-fragmentti, joka saatiin Trichoderma fertile RF6601:stä alukkeilla __Cel12_cons_A_1 ja Cel12 cons B 1_ 35 PCR-fragmentti, joka saatmPenicillium spinuiosum RF6286:sta alukkeilla Cel5_S2 ja __Cel5_AS2_ 36 PCR-fragmentti, joka saatiin Penicillium spinuiosum RF6286:sta alukkeilla Cel5_S2 __ja Cel5 AS2_ 37 PCR-fragmentti, joka saatiin Fusarium cf. equiseti RF6318:sta alukkeilla Cel5_S2 ja __Cel5 AS2_ 38 PCR-fragmentti, joka saatiin Geomyces pannorum RF6547:stä alukkeilla Cel5_S2 ja __Cel5_AS2_ 39 PCR-fragmentti, joka saatiin Penicillium griseofulvum Dierckx RF6288:sta alukkeilla __CCE21F ja CCE2_5R_
40 PCR-fragmentti, joka saatiin Geomyces pannorum RF6289:stä alukkeilla CCE2_1F
__ja CCE2_3R_ _41__Trichoderma gamsii RF6208:n ce/5A-geenin nukleotidisekvenssi_ _42__Trichoderma gamsii RF6208:n Cel5A:n päätelty aminohapposekvenssi_ _43__Trichoderma gamsii RF6208:n ce/5B-geenin nukleotidisekvenssi_ _44__Trichoderma gamsii RF6208:n Cel5B:n päätelty aminohapposekvenssi_ _45__Hypocrea rufa / Trichoderma viride RF6310:n ce/5A-geenin nukleotidisekvenssi_ 46 Hypocrea rufa / Trichoderma viride RF6310:n Cel5A:n päätelty aminohappose- __kvenssi_ _A7__Hypocrea atroviridis RF6323:n ce/5A-geenin nukleotidisekvenssi_ _48__Hypocrea atroviridis RF6323:n Cel5A:n päätelty aminohapposekvenssi_ _49__Trichoderma harzianum RF6482:n ce/5A-geenin nukleotidisekvenssi_ _50__Trichoderma harzianum RF6482:n Cel5A:n päätelty aminohapposekvenssi_ _51__Hypocrea koningiopsis RF6604:n ce/5A-geenin nukleotidisekvenssi_ i- _52__Hypocrea koningiopsis RF6604:n Cel5A:n päätelty aminohapposekvenssi_ o _53__Trichoderma sp. RF6193:n ce/5A-geenin nukleotidisekvenssi_ ^ _54__Trichoderma sp. RF6193:n Cel5A:n päätelty aminohapposekvenssi_ 55 Trichoderma sp. RF6193:n ce/5B-geenin nukleotidisekvenssi o-- co 56__Trichoderma sp. RF6193:n Cel5B:n päätelty aminohapposekvenssi_ g 57__Trichoderma fertile RF6601:n ce/5A-geenin nukleotidisekvenssi_ _58__Trichoderma fertile RF6601:n Cel5A:n päätelty aminohapposekvenssi_ § 59 Trichoderma fertile RF6601:n ce/5B-geenin nukleotidisekvenssi cm-- g _60__Trichoderma fertile RF6601:n Cel5B:n päätelty aminohapposekvenssi_ § 61__Trichoderma gamsii RF6208:n ce/12A-geenin nukleotidisekvenssi_ ^ 62__Trichoderma gamsii RF6208:n Cel12A:n päätelty aminohapposekvenssi_ _63__Trichoderma harzianum RF6482:n ce/12A-geenin nukleotidisekvenssi_ _64__Trichoderma harzianum RF6482:n Cel12A:n päätelty aminohapposekvenssi_ 51 _65__Trichoderma harzianum RF6541:n ce/12A-geenin nukleotidisekvenssi_ _66__Trichoderma harzianum RF6541:n Cel12A:n päätelty aminohapposekvenssi_ _67__Trichoderma sp. RF6193:n ce/12A-geenin nukleotidisekvenssi_ _68__Trichoderma sp. RF6193:n Cel12A:n päätelty aminohapposekvenssi_ _69__Trichoderma fertile RF6601:n ce/12A-geenin nukleotidisekvenssi_ _70__Trichoderma fertile RF6601:n Cel12A:n päätelty aminohapposekvenssi_ _71__Penicillium spinulosum RF6286:n ce/5/\-geenin nukleotidisekvenssi_ _72__Penicillium spinulosum RF6286:n Cel5A:n päätelty aminohapposekvenssi_ _73__Penicillium spinulosum RF6286:n ce/5B-geenin nukleotidisekvenssi_ _74__Penicillium spinulosum RF6286:n Cel5B:n päätelty aminohapposekvenssi_ _75__Penicillium griseofulvum Dierckx RF6288:n ce/5/\-geenin nukleotidisekvenssi_ _76__Penicillium griseofulvum Dierckx RF6288:n Cel5A:n päätelty aminohapposekvenssi _77__Fusarium cf. equiseti RF6318:n ce/5/\-geenin nukleotidisekvenssi_ _78__Fusarium cf. equiseti RF6318:n Cel5A:n päätelty aminohapposekvenssi_ _79__Geomyces pannorum RF6293:n ce/5/\-geenin nukleotidisekvenssi_ _80__Geomyces pannorum RF6293:n Cel5A:n päätelty aminohapposekvenssi_ _81__Geomyces pannorum RF6547:n ce/5/\-geenin nukleotidisekvenssi_ _82__Geomyces pannorum RF6547:n Cel5A:n päätelty aminohapposekvenssi_ δ
(M
m o o
CO
X
en
CL
o m
(M
CD
00 o o
(M
52
Talletetut mikrobit
Talletettu kanta Viljelmäkokoelma Talletuspäivä Tunnus- ____numero_
Trichoderma sp. RF6193__t)__7,6.2007__CBS 121354
Trichoderma gamsii RF6208__1)__7,4.2006__CBS 119563
Hypocrea rufa I Trichoderma 1) 8.12.2005 CBS 118970 viride RF6310____
Hypocrea atroviridis RF6323__1)__7,4.2006__CBS 119561
Trichoderma harzianum RF6482 1)__7,4.2006__CBS 119562
Trichoderma harzianum RF6541 1)__16.6.2006__CBS 119957
Trichoderma fertile RF6601__1]__7,6.2007__CBS 121357
Hypocrea koningiopsis RF6604 1)__16.6.2006__CBS 119960
Penicillium spinuiosum RF6286 1)__7.6.2007__CBS 121355
Penicillium griseofulvum 1) 7.4.2006 CBS 119565
Dierckx RF6288____
Geomyces pannorum RF6293__1)__7.4.2006__CBS 119567
Geomyces pannorum RF6547__1}__7.6.2007__CBS 121356
Fusarium cf. equiseti RF6318__1)__7.4.2006__CBS 119568 E.coli, jossa on pALK2121__2)__7.6.2007__DSM 19418 E.coli, jossa on pALK2120__2)__21.9.2006__DSM 18639 E.coli, jossa on pALK2118__2)__21.9.2006__DSM 18638 E.coli, jossa on pALK2123__2)__5.12,2007__DSM 19963 E.coli, jossa on pALK2128__2]__21.9.2006__DSM 18642 E.coli, jossa on pALK2158__2)__7.6.2007__DSM 19419 E.coli, jossa on pALK2330__2]__15.11.2007__DSM 19894 E.coli, jossa on pALK2331__2)__15.11.2007__DSM 19895 E.coli, jossa on pALK2359__2)__4.2.2008__DSM 21129 E.coli, jossa on pALK2366__2)__15.11.2007__DSM 19898 E.coli, jossa on pALK2122__2)__21.9.2006__DSM 18640 E.coli, jossa on pALK2129__2)__21.9.2006__DSM 18643 ^ E.coli, jossa on pALK2165__2)__7.6.2007__DSM 19420 g E.coli, jossa on pALK2367__2)__15.11.2007__DSM 19899 ™ E.coli, jossa on pALK2333__2)__15.11.2007__DSM 19896 § E.coli, jossa on pALK2248__2)__5.12.2007__DSM 19960 ό E.coli, jossa on pALK2249__2)__5.12.2007__DSM 19961 00 E.coli, jossa on pALK2031__2)__2.8.2006__DSM 18505 | E.coli, jossa on pALK2225__2)__16.3.2007__DSM 19172 E.coli, jossa on pALK2044__2)__10.1.2007__DSM 18914 S E.coli, jossa on pALK2250 2) [5.12.2007 DSM 19962 oo 1) Centraalbureau Voor Schimmelcultures osoitteessa Upsalalaan 8, 3508 AD, Utrecht, o o Alankomaat
(M
se 7B, D-38124 Braunschweig, Saksa 5 2) Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (DSMZ), Inhoffenstras-

Claims (18)

1. Sieniperäinen endoglukanaasipolypeptidi, joka kuuluu glykosyyli-hydrolaasien perheeseen 12, ja joka käsittää aminohapposekvenssin, jolla on 5 vähintään 60-prosenttinen identtisyys sekvenssin nro 64, vähintään 85-pro-senttinen identtisyys sekvenssin nro 66, vähintään 83-prosenttinen identtisyys sekvenssin nro 68 tai vähintään 63-prosenttinen identtisyys sekvenssin nro 70 kanssa, tai sen sellulaasiaktiivinen fragmentti.
2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen endoglukanaasipolypeptidi, joka 10 on peräisin sienestä Trichoderma tai Hypocrea, edullisesti sienestä T. har- zianum tai T. fertile, edullisimmin sienestä Trichoderma sp. RF6193 (CBS121354), T. harzianum RF6482 (CBS 119562), T. harzianum RF6541 (CBS 119957) tai T. fertile RF6601 (CBS 121357).
3. Patenttivaatimuksen 1 mukainen endoglukanaasipolypeptidi, jolla 15 on vähintään 90-prosenttinen, edullisesti vähintään 95-prosenttinen ja edullisimmin vähintään 98-prosenttinen identtisyys sekvenssin nro 64, 66, 68 tai 70 kanssa, tai sen sellulaasiaktiivinen fragmentti.
4. Patenttivaatimuksen 3 mukainen endoglukanaasipolypeptidi, jolla on sekvenssin nro 64, 66, 68, tai 70 mukainen aminohapposekvenssi.
5. Eristetty polynukleotidi, joka valitaan ryhmästä, joka koostuu seu- raavista: a) nukleotidisekvenssi, jolla on sekvenssin nro 63, 65, 67 tai 69 mukainen sekvenssi, tai sekvenssi, joka koodaa patenttivaatimuksen 1 mukaista endoglukanaasipolypeptidiä, 25 b) juoste, joka on komplementaarinen juosteelle a), tai c) sekvenssi, joka on degeneroitunut geneettisen koodin suhteen 5 minkä tahansa kohdan a) tai b) mukaisesta sekvenssistä. (M
^ 6. Patenttivaatimuksen 5 mukainen polynukleotidi, joka vastaa E. ° co//-kannan DSM 18643, DSM 19420, DSM 19899 tai DSM 19896 sisältämää O 00 30 polynukleotidia.
7. Ekspressiovektori, joka sisältää patenttivaatimuksen 5 mukaisen o polynukleotidin. m
8. Isäntäsolu, joka sisältää patenttivaatimuksen 7 mukaisen eks- § pressiovektorin. ^ 35
9. Menetelmä patenttivaatimuksen 1 mukaisen endoglukanaasipo- lypeptidin valmistamiseksi, joka käsittää vaiheet, joissa isäntäsolu transformoi- daan ekspressiovektorilla, joka koodaa mainittua polypeptidiä, ja viljellään mainittu isäntäsolu olosuhteissa, jotka mahdollistavat mainitun polypeptidin ekspression, ja valinnaisesti polypeptidi otetaan talteen ja puhdistetaan.
10. Entsyymi valmiste, joka sisältää patenttivaatimuksen 1 mukaisen 5 endoglukanaasipolypeptidin.
11. Menetelmä selluloosapitoisen materiaalin käsittelemiseksi, joka menetelmä käsittää vaiheen, jossa selluloosapitoinen materiaali saatetaan kosketukseen patenttivaatimuksen 1 mukaisen endoglukanaasipolypeptidin tai patenttivaatimuksen 10 mukaisen entsyymivalmisteen kanssa.
12. Patenttivaatimuksen 11 mukainen menetelmä, jossa käsittely suoritetaan lämpötilassa <50 °C, edullisesti <40 °C.
13. Patenttivaatimuksen 12 mukainen menetelmä, joka suoritetaan pH:ssa noin 4-6, edullisesti 4,5-5,5, ja edullisimmin 5,0-5,5.
14. Patenttivaatimuksen 11 mukainen menetelmä, joka on biokivi-15 pesu tai bioviimeistely.
15. Patenttivaatimuksen 11 mukainen menetelmä, joka on lignosel-luloosapitoisen materiaalin hydrolyysi tai elintarvikesovellus.
16. Pesuainekoostumus, joka käsittää patenttivaatimuksen 1 mukaisen endoglukanaasipolypeptidin tai patenttivaatimuksen 10 mukaisen ent- 20 syymivalmisteen.
17. Eläinrehu, joka käsittää patenttivaatimuksen 1 mukaisen endoglukanaasipolypeptidin tai patenttivaatimuksen 10 mukaisen entsyymivalmisteen.
18. E. coli-kanta, jolla on talletusnumero DSM 18643, DSM 19420, 25 DSM 19899 tai DSM 19896. δ (M tn o i o 00 X en CL o m (M CD 00 o o (M
FI20086250A 2008-12-30 2008-12-30 Sieniperäiset endoglukanaasit, niiden tuotto ja käyttö FI122028B (fi)

Priority Applications (9)

Application Number Priority Date Filing Date Title
FI20086250A FI122028B (fi) 2008-12-30 2008-12-30 Sieniperäiset endoglukanaasit, niiden tuotto ja käyttö
CN200980153611.7A CN102272298B (zh) 2008-12-30 2009-12-28 真菌内切葡聚糖酶、它们的生产和应用
MX2011007145A MX2011007145A (es) 2008-12-30 2009-12-28 Endonucleasas fungicas, su produccion y uso.
DK09836129.8T DK2370572T3 (en) 2008-12-30 2009-12-28 FUNGI ENDOGLUCANASES, THEIR PREPARATION AND USE
BRPI0923794-1A BRPI0923794A2 (pt) 2008-12-30 2009-12-28 Polipeptídeo de endoglicanase fúngicade e método para sua produção, polinucleotídeo, vetor de expressão, célula hospedeira, preparação de enzima, processo para o tratamento de material celulósico, composição de detergente e ração para animal
US13/142,630 US8592195B2 (en) 2008-12-30 2009-12-28 Fungal endoglucanases, their production and use
EP09836129.8A EP2370572B1 (en) 2008-12-30 2009-12-28 Fungal endoglucanases, their production and use
PCT/FI2009/051042 WO2010076387A1 (en) 2008-12-30 2009-12-28 Fungal endoglucanases, their production and use
US14/057,401 US9550984B2 (en) 2008-12-30 2013-10-18 Fungal endoglucanases, their production and use

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
FI20086250 2008-12-30
FI20086250A FI122028B (fi) 2008-12-30 2008-12-30 Sieniperäiset endoglukanaasit, niiden tuotto ja käyttö

Publications (3)

Publication Number Publication Date
FI20086250A0 FI20086250A0 (fi) 2008-12-30
FI20086250A FI20086250A (fi) 2010-07-01
FI122028B true FI122028B (fi) 2011-07-29

Family

ID=40240645

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
FI20086250A FI122028B (fi) 2008-12-30 2008-12-30 Sieniperäiset endoglukanaasit, niiden tuotto ja käyttö

Country Status (8)

Country Link
US (2) US8592195B2 (fi)
EP (1) EP2370572B1 (fi)
CN (1) CN102272298B (fi)
BR (1) BRPI0923794A2 (fi)
DK (1) DK2370572T3 (fi)
FI (1) FI122028B (fi)
MX (1) MX2011007145A (fi)
WO (1) WO2010076387A1 (fi)

Families Citing this family (18)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US8609388B2 (en) * 2010-03-11 2013-12-17 Novozymes A/S Modified family 5 cellulases and uses thereof
WO2012030849A1 (en) 2010-08-30 2012-03-08 Novozymes A/S Polypeptides having xylanase activity and polynucleotides encoding same
DK2735611T3 (en) 2010-08-30 2019-01-28 Novozymes As POLYPEPTIDES WITH CELLULOLYSE INCREASING ACTIVITY AND POLYNUCLEOTIDES CODING THEM
US9267126B2 (en) * 2010-08-30 2016-02-23 Novozymes, Inc. Polypeptides having endoglucanase activity and polynucleotides encoding same
WO2012030811A1 (en) 2010-08-30 2012-03-08 Novozymes A/S Polypeptides having cellobiohydrolase activity and polynucleotides encoding same
EP2611901B1 (en) 2010-08-30 2016-05-11 Novozymes A/S Polypeptides having beta-glucosidase activity, beta-xylosidase activity, or beta-glucosidase and beta-xylosidase activity and polynucleotides encoding same
US8906689B2 (en) 2010-12-21 2014-12-09 Codexis, Inc. Endoglucanase variants
JP6003077B2 (ja) * 2012-02-15 2016-10-05 株式会社豊田中央研究所 糖加水分解酵素の細胞外発現の増強剤及びその利用
BR112014022943A2 (pt) * 2012-03-16 2017-07-18 Bp Corp North America Inc polipeptídeos que possuem atividade de endoglicanase
US8778639B1 (en) * 2013-02-12 2014-07-15 Novozymes Inc. Polypeptides having endoglucanase activity and polynucleotides encoding same
US8771993B1 (en) * 2013-02-12 2014-07-08 Novozymes A/S Polypeptides having endoglucanse activity and polynucleotides encoding same
AU2014296572A1 (en) * 2013-07-29 2016-02-18 Danisco Us Inc. Variant enzymes
WO2015110504A1 (en) * 2014-01-23 2015-07-30 Novozymes A/S Variants of gh family 5 endoglucanase and polynucleotides encoding same
CN108601362A (zh) * 2016-02-10 2018-09-28 诺维信公司 包含经纤维素酶处理的纤维的烘焙产品的制备
CN106591264B (zh) * 2017-03-02 2019-07-23 福建省农业科学院农业工程技术研究所 一种内切葡聚糖酶促进因子
US20210238621A1 (en) * 2018-08-22 2021-08-05 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Compositions and methods for producing enzymes useful in industrial and food stuff applications
WO2021037994A1 (en) 2019-08-30 2021-03-04 Ab Enzymes Gmbh Use of gh12 cellulases in preparing bakery products comprising rye-flour
EP4052581A1 (en) 2021-03-03 2022-09-07 AB Enzymes GmbH Use of gh12 cellulases in spelt, oat, barley, and / or millet baking

Family Cites Families (14)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5475101A (en) * 1990-10-05 1995-12-12 Genencor International, Inc. DNA sequence encoding endoglucanase III cellulase
DK81293D0 (da) * 1993-07-06 1993-07-06 Novo Nordisk As Enzym
WO1995033837A1 (en) 1994-06-03 1995-12-14 Novo Nordisk Biotech, Inc. Purified scytalidium laccases and nucleic acids encoding same
FR2720902B1 (fr) 1994-06-09 1996-08-23 Gervais Danone Sa Produit alimentaire multicouches présentant une couche barrière consommable.
US5770418A (en) 1994-06-24 1998-06-23 Novo Nordisk A/S Purified polyporus laccases and nucleic acids encoding same
US6008029A (en) 1995-08-25 1999-12-28 Novo Nordisk Biotech Inc. Purified coprinus laccases and nucleic acids encoding the same
US6407046B1 (en) * 1998-09-03 2002-06-18 Genencor International, Inc. Mutant EGIII cellulase, DNA encoding such EGIII compositions and methods for obtaining same
US6187732B1 (en) * 1998-09-03 2001-02-13 Genencor International, Inc. Mutant EGIII cellulase, DNA encoding such EGIII compositions and methods for obtaining same
US7977051B2 (en) 1999-04-10 2011-07-12 Danisco Us Inc. EGIII-like enzymes, DNA encoding such enzymes and methods for producing such enzymes
AU2099301A (en) * 1999-12-23 2001-07-09 Genencor International, Inc. Method for obtaining proteins having improved functional characteristics
DK1305432T3 (da) * 2000-08-04 2010-12-06 Genencor Int Muterede trichoderma reesei EGIII-cellulaser, DNA, der koder for sådanne EGIII-sammensætninger og fremgangsmåder til at frembringe samme
US6623949B1 (en) 2000-08-04 2003-09-23 Genencor International, Inc. Variant EGIII-like cellulase compositions
FI118340B (fi) 2005-04-29 2007-10-15 Ab Enzymes Oy Sellulaasifuusioproteiineja, niiden tuotto ja käyttö
RU2458127C2 (ru) 2006-04-13 2012-08-10 Аб Энзимз Оу Целлюлозные белки слияния и их применение

Also Published As

Publication number Publication date
FI20086250A (fi) 2010-07-01
US20110269213A1 (en) 2011-11-03
US20140099678A1 (en) 2014-04-10
BRPI0923794A2 (pt) 2020-06-02
EP2370572A4 (en) 2012-12-12
US8592195B2 (en) 2013-11-26
US9550984B2 (en) 2017-01-24
WO2010076387A1 (en) 2010-07-08
CN102272298B (zh) 2014-07-16
EP2370572A1 (en) 2011-10-05
FI20086250A0 (fi) 2008-12-30
MX2011007145A (es) 2011-09-26
CN102272298A (zh) 2011-12-07
DK2370572T3 (en) 2017-05-22
EP2370572B1 (en) 2017-04-19

Similar Documents

Publication Publication Date Title
FI122028B (fi) Sieniperäiset endoglukanaasit, niiden tuotto ja käyttö
FI122029B (fi) Sieniperäiset endoglukanaasit, niiden tuotto ja käyttö
EP1969123B1 (en) Novel enzymes
RU2458127C2 (ru) Целлюлозные белки слияния и их применение
US7256032B2 (en) Enzymes
US7741093B2 (en) Cellulases and their uses
JP2001523463A (ja) 放線菌類により産生されるセルラーゼとその産生方法
JP2001523464A (ja) 放線菌類により産生されるセルラーゼとその産生方法
EP1874927A1 (en) Improved cellulases
US7361487B2 (en) Enzyme fusion proteins and their use
FI119325B (fi) Uusia endoglukanaasi polypeptidejä ja niiden tuotto ja käyttö
FI119434B (fi) Entsyymifuusioproteiineja ja niiden käyttö

Legal Events

Date Code Title Description
FG Patent granted

Ref document number: 122028

Country of ref document: FI

MM Patent lapsed