CN110484462B

CN110484462B - 申氏杆菌属新物种及其应用

Info

Publication number: CN110484462B
Application number: CN201910613434.1A
Authority: CN
Inventors: 张玉琴; 邓阳; 姜竹鸣; 孙烨; 王浩; 张涛; 苏静; 余利岩
Original assignee: Institute of Medicinal Biotechnology of CAMS
Current assignee: Institute of Medicinal Biotechnology of CAMS
Priority date: 2019-07-09
Filing date: 2019-07-09
Publication date: 2021-03-16
Anticipated expiration: 2039-07-09
Also published as: CN110484462A

Abstract

本发明公开了申氏杆菌属新物种及其应用。本发明提供了Shinella glucanica J1A816，其在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏号为CGMCC No.18003。本发明菌株J1A816具有内切葡聚糖酶活性，可以降解纤维素，是一株功能性的申氏杆菌属新物种，在污水处理、环境治理、土壤改良、菌肥制剂生产等方面将具有广泛的应用前景。

Description

申氏杆菌属新物种及其应用

技术领域

本发明涉及微生物领域，具体涉及申氏杆菌属新物种及其应用。

背景技术

申氏杆菌属(Shinella)隶属于细菌域(Bacteria)-变形菌门(Proteobacteria)-α-变形杆菌纲(Alph aproteobacteria)-根瘤菌目(Rhizobiales)-根瘤菌科(Rhizobiaceae)。1967年，K.Crabtree和Elizabeth McCoy在研究活性污泥絮状体的形成时，分离获得一株在污泥中具有形成絮凝体能力的菌株ATCC 19623，根据这株菌的表型特征，初步命名为生枝动胶菌(Zoogloea ramigera)(Crabtree,K.&McCoy,E.(1967).Zoogloea ramigera Itzigsohn,identification and description.Request for anOpinion as to the status of the generic name Zoogloea.Int J Syst Bacteriol17,1–10.)。2006年，Dong-Shan An等从菌株生理生化特征和细胞化学分类学角度对菌株Z.ramigera ATCC 19623进行了分析，将其更名为谷粒申氏杆菌(Shinella granuli)，并将其作为模式种建立了申氏杆菌属(Shinella)(An,D.S.,Im,W.T.,Yang,H.C.&Lee,S.T.(2006).Shinella granuli gen.nov.,sp.nov.,and proposal of the reclassificationof Zoogloea ramigera ATCC 19623as Shinella zoogloeoides sp.nov.Int J SystEvol Microbiol 56,443–448.)。目前，该属包含8个有效描述种。

申氏杆菌属菌株的来源环境广泛，如垃圾处理厂(Lee,M.,Woo,S.G.&Ten,L.N.(2011).Shinella daejeonensis sp.nov.,a nitrate-reducing bacterium isolatedfrom sludge of a leachate treatment plant.Int J Syst Evol Microbiol 61,2123–2128.)、土壤(Matsui,T.,Shinzato,N.,Tamaki,H.,Muramatsu,M.&Hanada,S.(2009).Shinella yambaruensis sp.nov.,a 3-methyl-sulfolane-assimilating bacteriumisolated from soil.Int J Syst Evol Microbiol 59,536–539.)、净水过滤芯的颗粒(An,D.S.,Im,W.T.,Yang,H.C.&Lee,S.T.(2006).Shinella granuli gen.nov.,sp.nov.,and proposal of the reclassification of Zoogloea ramigera ATCC 19623asShinella zoogloeoides sp.nov.Int J Syst Evol Microbiol56,443–448.)、生活垃圾(Vaz-Moreira,I.,Faria,C.,Lopes,A.R.,Svensson,L.A.,Moore,E.R.B.,Nunes,O.C.&Manaia,C.M.(2010).Shinella fusca sp.nov.,isolated from domestic wastecompost.Int J Syst Evol Microbiol 60,144–148.)、植物结瘤(Lin,D.X.,Wang,E.T.,Tang,H.,Han,T.X.,He,Y.R.,Guan,S.H.&Chen,W.X.(2008).Shinella kummerowiaesp.nov.,a symbiotic bacterium isolated from root nodules of the herbal legumeKummerowia stipulacea.Int J Syst Evol Microbiol 58,1409–1413.)、碳氢化合物污染的沙滩(Subhash Y.and Lee S.S.(2016).Shinella curvatasp.nov.,isolated fromhydrocarbon-contaminated desert sands.Int J Syst Evol Microbiol 66,3929–3934)等环境。总体而言，申氏杆菌多数是从有机物丰富的环境中分离得到的，因此，其对有机物的降解能力及其应用也备受关注。比如：对4-氨基苯磺酸盐的降解(Biala,S.,Chadha,P.,&Saini,H.S.(2014).Biodegradation of 4-aminobenzenesulfonate by indigenousisolate Shinella yambaruensis SA1 and its validation by genotoxic analysis.Biotechnol.Bioprocess.Eng.19,1034–1041.)、对氯苯酞的降解(Liang,B.,Wang,G.,Zhao,Y.,Chen,K.,Li,S.,&Jiang,J.(2011).Facilitation of bacterial adaptation tochlorothalonil-contaminated sites by horizontal transfer of thechlorothalonil hydrolytic dehalogenase gene.Appl.Environ.Microbiol.77,4268–4272.)、对苯酚的降解(Sepehr S.,Shahnavaz B.,Asoodeh A.&Karrabi M(2019).Biodegradation of phenol by cold-tolerant bacteria isolated from alpinesoils of Binaloud Mountains in Iran.J Environ Sci Health ATox Hazard SubstEnviron Eng54,367-379.)、对诺尼古丁(Qiu J.,Li N.,Lu Z.,Yang Y.,Ma Y.,Niu L.,HeJ.&Liu W(2016).Conversion of nornicotine to 6-hydroxy-nornicotine and 6-hydroxy-myosmine by Shinella sp.strain HZN7.Appl Microbiol Biotechnol 100,10019-10029.)的降解以及对吡啶的降解(Bai,Y.,Sun,Q.,Zhao,C.,Wen,D.&Tang,X.(2009).Aerobic degradation of pyridine by a new bacterial strain,Shinellazoogloeoides BC026.J.Ind.Microbiol.Biotechnol.36,1391–1400.)，而尚未发现关于申氏菌降解纤维素的报道。

纤维素是自然界中最丰富的一类可再生性碳水化合物资源，其结构十分复杂，微生物在其生物质转化过程中起着关键作用。微生物产生的内切葡聚糖酶是纤维素降解和转化的关键酶系。内切葡聚糖酶产生菌能直接降解改性纤维素CMC-Na，因此，应用CMC-Na作为底物可快速筛选具内切葡聚糖酶活性的菌株(Zhou X,Chen H,Li Z.CMCase activityassay as a method for cellulase adsorption analysis.Enzyme Microbiol Technol,2004,35(5):455-459.)。

发明内容

本发明的目的是提供一申氏杆菌属新物种及其应用。

第一方面，本发明要求保护一申氏杆菌属新物种。

本发明所要求保护的申氏杆菌属新物种具体为Shinella glucanica J1A816。其在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏号为CGMCC No.18003。

第二方面，本发明要求保护一种菌剂。

本发明所要求保护的菌剂的活性成分为所述Shinella glucanica J1A816。

上述菌剂中，所述菌剂还可以包括载体。所述载体可为固体载体或液体载体。所述固体载体可为矿物材料、植物材料或高分子化合物；所述矿物材料可为粘土、滑石、高岭土、蒙脱石、白碳、沸石、硅石和硅藻土中的至少一种；所述植物材料可为玉米粉、豆粉和淀粉中的至少一种；所述高分子化合物可为聚乙烯醇和/或聚二醇。所述液体载体可为有机溶剂、植物油、矿物油或水；所述有机溶剂可为癸烷和/或十二烷。所述菌剂中，所述活性成分可以以被培养的活细胞、活细胞的发酵液、细胞培养物的滤液或细胞与滤液的混合物的形式存在。所述菌剂剂型可为多种剂型，如液剂、乳剂、悬浮剂、粉剂、颗粒剂、可湿性粉剂或水分散粒剂。

根据需要，所述菌剂中还可添加表面活性剂(如吐温20、吐温80等)、粘合剂、稳定剂(如抗氧化剂)、pH调节剂等。

第三方面，本发明要求保护所述Shinella glucanica J1A816或所述菌剂在如下任一中的应用：

(A1)制备内切葡聚糖酶；

(A2)制备具有内切葡聚糖酶活性的产品。

第四方面，本发明要求保护所述Shinella glucanica J1A816或所述菌剂在如下任一中的应用：

(B1)降解纤维素；

(B2)制备用于降解纤维素的产品。

第五方面，本发明要求保护所述Shinella glucanica J1A816或所述菌剂在如下任一中的应用：

(C1)污水处理；

(C2)环境治理；

(C3)土壤改良；

(C4)菌肥制剂生产。

第六方面，本发明要求保护如下任一物质：

(D1)利用所述Shinella glucanica J1A816或所述菌剂制备的内切葡聚糖酶或具有内切葡聚糖酶活性的产品；

(D2)利用所述Shinella glucanica J1A816或所述菌剂制备的用于降解纤维素的产品。

进一步地，在(D1)中，所述产品的活性成分可为所述Shinella glucanicaJ1A816，或可为利用所述Shinella glucanica J1A816或所述菌剂制备的内切葡聚糖酶。

进一步地，在(D2)中，所述产品的活性成分可为所述Shinella glucanicaJ1A816，或可为利用所述Shinella glucanica J1A816或所述菌剂制备的内切葡聚糖酶。

第七方面，本发明要求保护所述Shinella glucanica J1A816在制备所述菌剂中的应用。

第八方面，本发明要求保护如下菌株或其应用：

所述菌株为Shinella glucanica菌种中菌株；所述Shinella glucanica菌种中菌株的16S rRNA基因序列与SEQ ID No.1相比至少具有98.7％以上的相似性；所述Shinellaglucanica菌种中菌株为革兰氏阴性好氧细菌；所述Shinella glucanica菌种中菌株在28℃下，R2A培养基上培养72小时后，可形成湿润，光滑和奶油色菌落；所述Shinellaglucanica菌种中菌株的生长耐受范围是4-40℃、0-3％NaCl和pH 6.0-8.0，最适生长条件是28℃、0-1％NaCl、pH 7；所述Shinella glucanica菌种中菌株的氧化酶检测为阳性，硝酸盐还原阴性；能利用麦芽糖、L-鼠李糖、蔗糖和纤维二糖为唯一碳源；所述Shinellaglucanica菌种中菌株的主要脂肪酸是C_16:0、C_18:1ω7c 11-methyl、C_19:0cycloω8c和Summedfeatures 8(C₁₈₁ω7c和/或C_18:1ω6c)；所述Shinella glucanica菌种中菌株的极性脂成分包括二磷脂酰甘油(DPG)、磷脂酰甘油(PG)、磷脂酰乙醇胺(PE)、羟基磷脂酰乙醇胺(OH-PE)、磷脂酰胆碱(PC)。

所述应用为所述菌株在如下任一中的应用：

(A1)制备内切葡聚糖酶；

(A2)制备具有内切葡聚糖酶活性的产品；

(B1)降解纤维素；

(B2)制备用于降解纤维素的产品；

(C1)污水处理；

(C2)环境治理；

(C3)土壤改良；

(C4)菌肥制剂生产。

实验证明，本发明菌株J1A816代表了申氏杆菌属的一个新物种，命名为Shinellaglucanica。同时证明了本发明菌株具有内切葡聚糖酶活性，可以降解纤维素，是一株功能性的申氏杆菌属新物种，在污水处理、环境治理、土壤改良、菌肥制剂生产等方面将具有广泛的应用前景。

保藏说明

建议的分类命名：Shinella glucanica

参椐的生物材料(株)：J1A816

保藏机构：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心

保藏机构简称：CGMCC

地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号

保藏日期：2019年6月19日

保藏中心登记入册编号：CGMCC No.18003

附图说明

图1为菌株J1A816的极性脂成分检测结果。

图2为菌株J1A816的内切葡聚糖酶活性筛选图片。

图3为基于菌株J1A816和根瘤菌科相关种的16S rRNA基因序列构建***发育树。***发育树以Bradyrhizobium japonicum USDA 6^T(GenBank accession no.AB231927)为外群。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1、菌株J1A816的分离及鉴定

一、菌株J1A816的分离

本发明菌株J1A816分离自内蒙古巴丹吉林沙漠的土壤样品，具体分离操作如下：使用R2A培养基作为分离培养基，具体成分为：葡萄糖0.5g、可溶性淀粉0.5g、

蛋白胨0.5g、酵母浸膏0.5g、酸水解酪素0.5g、丙酮酸钠0.3g、磷酸氢二钾0.3g、七水合硫酸镁0.05g、琼脂15g、加ddH₂O定容至1L、pH值7.2。

分离筛选方法：取2g土样于18的生理盐水中，振荡30min左右后，取混合液稀释至10^-4后，取少量菌(0.2-0.3mL)悬液涂布于R2A培养基平板上，30℃培养2-3周左右。挑取微生物多样性较好的平板，将其中菌苔完整且形态特征各异的单菌落接种于R2A平板上划线培养，得到纯培养物，以便后续研究。同时所获得的纯菌株以20％(v/v)甘油作为保护剂，进行液氮保藏和-80℃冷冻保藏。获得一株与冻胶菌样申氏菌Shinella zoogloeoides DSM287^T最近缘(16S rRNA基因相似性为98.2％)的新种，菌株编号为J1A816。

二、菌株J1A816的鉴定

菌株J1A816在28℃条件下，生长于R2A培养基(美国BD培养基)上，对这株菌进行形态学、生理生化、细胞化学及基因水平的研究，其他特殊情况将予以说明。

1、菌株J1A816的细胞形态观察和生理生化特征检测

菌株J1A816的生长温度检测范围为4、15、28、30、37、40和45℃；生长盐浓度(NaCl)检测范围为0-15％(0-15g/100ml)的几个(0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15)浓度梯度；生长pH检测范围为pH4-11之间的几个(4、5、6、7、8、9、10、11)梯度。菌株的生理生化特征使用API50CH、API ZYM，以及BiOLOG GEN III碳源等检测试剂盒检测。其他菌株生理特征，包括革兰氏染色属性、氧需求、接触酶活性、氧化酶活性、明胶水解活性，淀粉水解活性和纤维素水解活性，主要参照《放线菌***鉴定手册》进行(XuLH.Actinomycetesystematics:principles,methodsand practices[M].Beijing:Science Press,2007,93-108.)。

鉴定结果显示，菌株J1A816为革兰氏染色阴性细菌，好氧。菌株在28℃下，R2A培养基上培养72小时后，可形成湿润，光滑和奶油色菌落。菌株的生长耐受范围是4-40℃、0-3％NaCl和pH 6.0-8.0，最适生长条件是28℃、0-1％NaCl、pH 7。

菌株J1A816氧化酶检测为阳性，硝酸盐还原阴性；能利用麦芽糖、L-鼠李糖、蔗糖和纤维二糖为唯一碳源。

菌株J1A816与近缘菌种代表菌株S.zoogloeoides DSM 287^T、S.yambaruensisDSM 18801^T、S.daejeonensis JCM 16236^T、S.kummerowiae JCM 14778^T、S.curvata JCM31239^T、S.granuli JCM 13254^T代表菌株的生理生化特征差异见表1。

表1菌株J1A816与申氏杆菌属近缘对照菌株生理生化特征差异表

注：表中，+表示为阳性，-表示为阴性。

由表1所示结果可见，本发明菌株J1A816与已发表的申氏杆菌的近缘菌株在部分生理生化特征上存在明显差异。

2、菌株J1A816的细胞化学特征检测

通过GC气相色谱、HPLC液相色谱和TLC薄层色谱检测菌株J1A816的脂肪酸、醌类型、极性脂等细胞化学组分(Sasser M.Identification of bacteria by gasghromatography of cellular fatty acids,MIDI Technical Note 101.Newark,DE:MIDIinc；1990.Minnikin DE,O’Donnell AG,Goodfellow M,Alderson G,Athalye M et al.Anintegrated procedure for the extraction of bacterial isoprenoid quinones andpolar lipids.J Microbiol Methods 1984；2:233–241.)。菌株J1A816的脂肪酸成分见表2，结果显示菌株J1A816的主要脂肪酸是C_16:0、C_18:1ω7c 11-methyl、C_19:0cycloω8c和Summed features 8(C₁₈₁ω7c和/或C_18:1ω6c)(表2)。在菌株J1A816中，极性脂成分包括二磷脂酰甘油(DPG)、磷脂酰甘油(PG)、磷脂酰乙醇胺(PE)、羟基磷脂酰乙醇胺(OH-PE)、磷脂酰胆碱(PC)，如图1所示。

表2菌株J1A816的脂肪酸成分

3、菌株的内切葡聚糖酶活性检测

菌株J1A816的内切葡聚糖酶活性，利用羟甲基纤维素钠CMC-Na作为平板中的唯一碳源进行平板筛选(Reinhold-Hurek B,Hurek T,Claeyssens M,et al.Cloning,expression in Escherichia coli,and characterization of cellulolytic enzymesof Azoarcus sp.,a root-invading diazotroph.J Bacteriol,1993,175(21):7056-7065.)。具体步骤如下：配制CMC-Na筛选培养基(配方：(NH₄)₂SO₄ 4g，NaCl 0.1g，MgSO₄·7H₂0 0.1g，氯化钙0.1g，酵母提取物0.5g，Fe(Ⅲ)EDTA0.033g，CMC-Na 2g，琼脂15g，用ddH₂O补足至1L，pH 7.0)，将处于对数生长期的菌株J1A816，挑取单菌落接种于CMC-Na筛选培养基上，培养3天后，采用刚果红染液对菌株J1A816的内切葡聚糖酶活性进行检测，如图2所示菌株J1A816周围产生了明显的透明圈，说明菌株J1A816具有较好的内切葡聚糖酶活性。并采用相同的实验方法进行复筛验证发现与初筛相同的实验结果(Teather R M,Wood PJ.Use of Congo red-polysaccharide interactions in enumeration andcharacterization of cellulolytic bacteria from the bovine rumen.Appl EnvironMicrobiol,1982,43(4):777-80.)。

4、菌株***进化地位的确定

提取菌株J1A816的基因组DNA进行测序，并将其中的16S rRNA基因序列(SEQ IDNo.1)在国际权威细菌分类学分析数据库(http://www.ezbiocloud.net/)中进行在线比对(Kim OS,Cho YJ,Lee K,et al.2012,Introducing EzTaxon-e:a prokaryotic 16S rRNAgene sequence database with phylotypes that represent uncultured species.IntJ Syst Evol Microbiol,62:716-721.)。结果显示本发明菌株J1A816与申氏杆菌属的菌种相似性最高。本发明菌株J1A816的16S rRNA基因序列与已知菌种(S.zoogloeoides DSM287^T)的最高相似性是98.2％，该值低于98.7％(划分细菌物种的阈值)。依据来自于参考文献“Stackebrandt E,Ebers J.2006,Taxonomic parameters revisited:tarnished goldstandards.Microbiol Today,33:152-155.”。说明菌株J1A816是申氏杆菌属的1个新种。

选取申氏杆菌属所有有效种菌株以及根瘤菌科中与申氏杆菌属邻近属部分种菌株的16S rRNA基因序列构建***进化树(图3)。

综上所述，本发明菌株J1A816与现有申氏菌属菌种有部分明显的特征差异，包括表型、生理生化及细胞化学组分等方面。同时基于基因水平的***进化分析进一步说明了菌株J1A816能区别于现有申氏菌属的各有效种，充分证明了本发明菌株J1A816代表了申氏菌属的一个新物种，命名为Shinella glucanica。同时通过产内切葡聚糖酶能力检测，也证明了本发明菌株具有纤维素降解能力，在纤维素降解方面具有广泛的应用前景。可用于污水处理、环境治理、土壤改良、菌肥制剂生产等方面。

菌株Shinella glucanica J1A816已经于2019年6月19日保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，其保藏编号为CGMCC 18003。

<110> 中国医学科学院医药生物技术研究所

<120> 申氏杆菌属新物种及其应用

<130> GNCLN191597

<160> 1

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 1315

<212> DNA

<213> Shinella glucanica

<400> 1

gcgtgggaat ctacccatct ctacggaata actcagggaa acttgtgcta ataccgtata 60

cgcccttcgg gggaaagatt tatcggagat ggatgagccc gcgttggatt agctagttgg 120

tggggtaaag gcctaccaag gcgacgatcc atagctggtc tgagaggatg atcagccaca 180

ttgggactga gacacggccc aaactcctac gggaggcagc agtggggaat attggacaat 240

gggcgcaagc ctgatccagc catgccgcgt gagtgatgaa ggccctaggg ttgtaaagct 300

ctttcaccgg tgaagataat gacggtaacc ggagaagaag ccccggctaa cttcgtgcca 360

gcagccgcgg taatacgaag ggggctagcg ttgttcggaa ttactgggcg taaagcgcac 420

gtaggcgggt atttaagtca ggggtgaaat cccagagctc aactctggaa ctgcctttga 480

tactgggtac ctagagtatg gaagaggtga gtggaattcc gagtgtagag gtgaaattcg 540

tagatattcg gaggaacacc agtggcgaag gcggctcact ggtccattac tgacgctgag 600

gtgcgaaagc gtggggagca aacaggatta gataccctgg tagtccacgc cgtaaacgat 660

gaatgttagc cgtcggcatg catgcatgtc ggtggcgcag ctaacgcatt aaacattccg 720

cctggggagt acggtcgcaa gattaaaact caaaggaatt gacgggggcc cgcacaagcg 780

gtggagcatg tggtttaatt cgaagcaacg cgcagaacct taccagccct tgacatcccg 840

atcgcggaca gtggagacat tgtccttcag ttaggctgga tcggagacag gtgctgcatg 900

gctgtcgtca gctcgtgtcg tgagatgttt gggttaagtc ccgcaacgag cgcaaccctc 960

gcccttagtt gccagcattc agttgggcac tcttaagggg actgcccggt gataagccca 1020

aaaggaaagg tggggatgac gtcaagtcct catggccctt acgggctggg ctacacacgt 1080

gctacaatgg tggtgacagt gggcagcgag acagcgatgt cgagctaatc tccaaaagcc 1140

atctcagttc ggattgcact ctgcaactcg agtgcatgaa gttggaatcg ctagtaatcg 1200

cggatcagca tgccgcggtg aatacgttcc cgggccttgt acacaccgcc cgtcacacca 1260

tgggagttgg ttttacccga aggcgatgcg ctaaccgcaa ggaggcagtc gacca 1315

Claims

1.Shinella glucanica J1A816，其在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏号为CGMCC No.18003。

2.一种菌剂，其活性成分为权利要求1所述的Shinella glucanica J1A816。

3.权利要求1所述的Shinella glucanica J1A816或权利要求2所述的菌剂在如下任一中的应用：

（A1）制备内切葡聚糖酶；

（A2）制备具有内切葡聚糖酶活性的产品。

4.权利要求1所述的Shinella glucanica J1A816或权利要求2所述的菌剂在如下任一中的应用：

（B1）降解纤维素；

（B2）制备用于降解纤维素的产品。

5.权利要求1所述的Shinella glucanica J1A816或权利要求2所述的菌剂在如下任一中的应用：

（C1）污水处理；

（C2）环境治理；

（C3）土壤改良；

（C4）菌肥制剂生产。

6.如下任一物质：

（D1）利用权利要求1所述的Shinella glucanica J1A816或权利要求2所述的菌剂制备的具有内切葡聚糖酶活性的产品；所述产品的活性成分为所述Shinella glucanicaJ1A816；

（D2）利用权利要求1所述的Shinella glucanica J1A816或权利要求2所述的菌剂制备的用于降解纤维素的产品；所述产品的活性成分为所述Shinella glucanica J1A816。

7.权利要求1所述的Shinella glucanica J1A816在制备权利要求2所述菌剂中的应用。