JP2000505902A - 生物学的流体中の標的分子をイムノアッセイにより検出するためのセンサー積層体及び多区画流体送達装置 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 生物学的流体中の標的分子をイムノアッセイにより検出するためのセンサー積層体であって、リガンドへの結合性を高めるように処理されたポリマー材料を有する反応性支持層を含有するセンサー積層体、及びこれらセンサー積層体を製造及び使用する方法が提供される。生物学的流体中の標的分子の検出に際してこのセンサー積層体と共に使用するための多区画流体送達装置も提供される。

Description

【発明の詳細な説明】 生物学的流体中の標的分子をイムノアッセイにより 検出するためのセンサー積層体及び多区画流体送達装置発明の分野 本発明は、生物学的流体中の標的分子をイムノアッセイにより検出するのに有 用なセンサー積層体及びこれらセンサー積層体を製造する方法に関する。本発明 は、このセンサー積層体と合わせて使用することができる多区画流体送達装置も 提供する。このセンサー積層体とこの多区画流体送達装置で標的分子を検出する 方法も開示されている。発明の背景 イムノアッセイ法により種々の生物学的流体中の物質を検出することは周知で あり、種々の異なる目的に頻繁に使用されている。例には、種々の疾患及び状態 の診断のために、血液、尿、唾液又は他の生物学的流体中の抗体を病原体の存在 の指標として検出することが含まれる。生物学的流体の他のイムノアッセイには 、妊娠試験及び血中アルコール濃度を測定する試験が含まれる。そのような試験 は液体アッセイとして行われるが、標的分子についてのリガンドを不動化させた 固体支持体上にサンプルをスポッティングし、特異的結合複合体の存在を検出す るのが、より簡単で便利なことが多い。今日、最も広まっているイムノアッセイ 固相フォーマットは、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）である。 ＥＬＩＳＡの用具は、典型的には、９６ウェルマイクロタイタープレートであ って、その内表面が、サンプル中に存在する標的分子に特異的なリガンドでコー トされたものを含んでなる。このリガンドの固相への結合又は付着は、化学反応 ではなくて、マイクロタイタープレートのポリスチレンマトリックスと抗体の間 での物理的又は非共有結合的相互作用から生じていると考えられる。標的分子を 含有すると考えられるサンプルをこのマイクロタイタープレートと接触させると 、そのリガンドとサンプル中のあらゆる標的分子との間に結合が生じる。次いで 、 あらゆる未結合標的分子が数回の洗浄段階によりそのプレートウェルから除かれ る。次いで、標的分子を特異的に認識しかつシグナル発生酵素に連結している第 ２リガンドが添加される。サンプル中の標的分子の存在の指標である酵素の検出 は、典型的には、色彩変化をもたらす試薬の添加により行われる。 しかしながら、ＥＬＩＳＡの材料のようなイムノアッセイに使用されるリガン ドは、細菌性及びウイルス性分解産物の抗原性材料から構成されることが多い。 粗製分解産物は、要求される材料を得るためには、大量の病原性微生物を培養し なければならないという欠点がある。更に、関連微生物の抗原性材料は、標的分 子のその関連微生物との交叉反応のために偽陽性を呈することが多い。 このため、今日では、組換えタンパク質もアッセイ開発のために使用されてい る。組換えタンパク質は、病原性微生物からの他のタンパク質の存在なしに、宿 主細胞に大量のタンパク質を産生させ得るという利点を有している。かくして、 ずっと純粋なリガンドを得ることが可能である。しかしながら、組換えタンパク 質上の免疫学的に関連性のない部分に比較してエピトープの量が限定されている ために、この組換えタンパク質でも偽陽性反応を行いがちである。イムノアッセ イの特異性を最大にしようと、合成ペプチドも使用されている。しかしながら、 合成ペプチドの欠点は、感度が低いことである。 更に、ＥＬＩＳＡの実施には、非常に時間を要する。例えば、エイズウイルス をスクリーニングするための確立された方法では、まず、ＥＬＩＳＡを行ってか ら、ウェスタンブロットによって陽性の確認を行う。一般に、ＥＬＩＳＡは４時 間を要し、そして一晩のインキュベーション時間を包含するウェスタンブロット は約２０時間を要する。この方法は血液サンプルの日常的なスクリーニングには 適するかも知れないが、臓器についての最大虚血時間が経過する前に結果を出す ことが要求される臓器移植の状況でのスクリーニングには適していない。 ＥＬＩＳＡに伴う偽陽性結果及び低感度の問題を克服しようと、酵素結合免疫 濾過アッセイ（ＥＬＩＦＡ）と言われる類似の技術が、つい最近になって開発さ れた。ＥＬＩＦＡは、リガンドを含有する初期溶液をニトロセルロースメンブラ ンで濾過してそれをそのメンブランに結合させるという利点があることを除いて は、ＥＬＩＳＡと非常に類似して機能する。マイクロタイタープレートの表面に 結合するリガンドのレベルに比較して、ずっと高いレベルのリガンドがメンブラ ンに結合するという点で、この濾過過程は“免疫濃度”を高める。次いで、サン プル中の標的分子は、ＥＬＩＳＡ法におけるように、インキュベーションにより リガンドに結合する。しかしながら、あらゆる未結合標的分子は、そのメンブラ ンを通して濾過することにより、そのメンブランから廃液チャンバー中に除かれ る。結合した分子は、そのメンブラン上に着色生成物を析出させることによって 検出される。 このタイプの多孔質固体支持体は、サンプルの本体を支持体から除去するのを 可能にする一方で、標的分子が不動化されたリガンドに結合したまま表面に残る ので、理論的には非常に有用である。しかしながら、実際は、支持体を通過する サンプルの流れが遅くて、このタイプのアッセイもやはり非常に時間を要するの で、かなりの困難が存在する。 従って、より迅速で及び／又は信頼できるイムノアッセイを行うための、幾つ かの別種の固体支持体をベースとするイムノアッセイ及び方法論が開発されてき た。 例えば、ＰＣＴ出願ＷＯ９５／２６５０４には、標的分子と多孔質固体支持体 上に不動化されたリガンドとの間の特異的結合複合体の検出を包含するアッセイ が記載されており、そこでは、サンプルを添加した後に支持体の表面を拭うこと により、そのアッセイの信頼性が簡単に改善されている。 Hiraokaら（米国特許第５,５６９,５８９号）は、酵素の存在下で拡散性材料 を形成する非拡散性支持体を含有する支持層、及びその非拡散性材料を更に断裂 するための断裂用酵素を含有する試薬層を含んでなる、イムノアッセイのための 装置を開示している。かくして、このアッセイでは、標的分子、その標的分子と 高分子量化合物との連結生成物及び酵素標識抗体の間の反応により生じる酵素活 性の変化を測定することにより、その標的分子が定量的に分析される。 Ashiharaら（米国特許第５,６０３,８９８号）は、イムノアッセイのための類 似の乾燥型分析装置を開示している。この装置は、酵素イムノアッセイに従って サンプル中の標的分子を測定するための少なくとも１の水透過性層を含有する装 置であって、水溶性高分子支持体、及びサンプル中のリガンドと反応する抗体 とその水溶性高分子支持体上で作用する能力がある酵素の酵素−抗体結合体を含 んでなる。 Kangら（米国特許第５,５５９,０４１号）は、カーボンブラック及びそのカー ボンブラックにカップリングするリガンドを含んでなる、種々の態様のイムノア ッセイ装置を開示している。一つの態様では、特異的リガンド−標的分子複合体 を生成するように働くことができる標識試薬を第１フィルター要素に通して均一 に含浸させる。液体サンプルは、収容パッドから出ると、第１フィルター要素中 のその試薬と接触し、そこで反応して、特異的リガンド−標的分子複合体を形成 することになる。次いで、そのサンプルを、第１フィルター要素の隣に位置しか つ収容パッドの遠位に位置する第２フィルター要素であって、サンプル中に含有 される多くの成分の通過を妨害するが、あらゆる特異的リガンド−標的分子複合 体のウィッキングメンブラン（wicking membrane）上への通過を許すように働く ことができる第２フィルター要素に通して移動させる。標識された標的分子が存 在すれば、そのウィッキングメンブラン中にあるアッセイ指示ゾーンに結合して 、可視シグナルを形成することになる。 ＷＯ９６／１５４５３は、２つの分かれたメンブランユニットと考えられる一 連の積層されたメンブランにサンプルを通過させることにより、そのサンプル中 の選択されたタンパク質を同定するか又はその量を定量的に測定する方法を開示 している。その第１メンブランユニットは、反応用メンブランと毛管接触するよ うに重ねられた分離用メンブランを含んでなる。この第１ユニットの分離用メン ブランは、微孔質の親水性非対称メンブランであって、その平均気孔サイズは、 頂部から底部に向かって減少している。第１ユニットの反応用メンブランは、行 われる測定に干渉するであろうタンパク質のような汚染物質を除去するように機 能する。これは、反応用メンブランの上に充分な数の抗体を不動化させて、実質 的に全ての汚染物質をそれらと反応させ、それによって、反応用メンブランに不 動化又は不可逆的に結合させることによって達成される。第２メンブランユニッ トは、捕捉用メンブランと毛管接触するように重ねられた収集用メンブランを含 んでなる。この収集用メンブランは、測定されるべきタンパク質の第１エピトー プに対する抗体を含有し、そして捕捉用メンブランは、測定されるべきタンパク 質の第２エピトープに対する抗体を含有する。 ＥＰ０４２００２１Ａ２は、サンプル中のリガンドー分析対象物の存在又は量 を、そのリガンドと結合する能力がある不動化されたリガンド受容体を有する多 孔質湿潤性メンブラン固相を用いて測定する方法を開示しており、そこでは、そ のメンブランが水溶剤をベースとする接着剤を用いて支持体に積層されている。 この方法により支持体に積層されたメンブランには、ニトロセルロースメンブラ ン及びポリ二フッ化ビニリデン（ＰＶＤＦ）メンブランが含まれる。 ＷＯ９５／０６２５２は、多メンブラン系を用いて免疫学的物質を同定する方 法であって、免疫学的物質を含有していると考えられる液体サンプルと、それと の結合体であってマーカーとカップリングしたものとの水性混合物を、その結合 体及びマーカーとカップリングしたその結合体と反応するがその免疫学的物質と 結合したときにはその結合体と反応しないか又はその免疫学的物質と結合したと きにその結合体と反応するがその結合体単独若しくはマーカーとカップリングし た結合体とは反応しない不動化された免疫学的試薬を包含する多孔質メンブラン からなる選択された相の上に分散させることを含んでなる方法を開示している。 ＥＬＩＳＡの感度を向上させるための他の試みには、支持体の結合能力を向上 させるものが含まれる。そのような試みの幾つかは、リガンドとの化学結合を形 成するように、表面の化学的構造を変化させることに向けられてきた。例えば、 米国特許第４,９３３,４１０号は、ポリスチレン支持体を、その支持体の表面を ポリスチレン不溶性溶剤中でヒドロキシルメチルアミドと反応させることにより 活性化させることを開示している。同じく、米国特許第４,１１９,５８９号は、 少なくとも２の第二アミン基を有する化合物を、その第二アミン基をイミノクロ リド基に転化することにより、活性化させることを開示している。固体支持体を まず、吸着、イオン結合、閉じ込め又は共有結合によりリガンドと結合する不活 性タンパク質でコートすることにより、その支持体の結合能力を向上させる方法 も、米国特許第４,２１０,４１８号に記載されている。 磨砕又はサンダー仕上げのような溶剤処理又は機械的手段による固体支持体の 活性化により、ポリマー性固体支持体の結合能力及び親和性の両方を向上させる 方法が、米国特許第５,４２４,２１９号に記載されている。 選択された抗体、即ち、抗リン脂質症候群に特異的な抗体についてのＥＬＩＳ Ａアッセイの特異性を向上させる方法であって、負電荷又は孤立電子対及び／又 は負電荷又は孤立電子対を含有するフリーラジカルを電子ビームを介して導入す る方法が、米国特許第５,４７２,８８３号に記載されている。 従って、信頼性がありかつ迅速な結果をもたらす固体支持体をベースとしたイ ムノアッセイの必要性が依然として存在する。発明の要旨 本発明の目的は、生物学的流体中の選択された標的分子をイムノアッセイによ り検出するためのセンサー積層体であって、標的分子についてのリガンドであっ てポリマー材料に結合したものを含む反応性支持層を含んでなり、該ポリマー材 料が、該リガンドの該ポリマー材料への結合性を高めるように処理されたもので ある、センサー積層体を提供することである。 本発明のもう１つの目的は、反応性支持層を含んでなるセンサー積層体を製造 する方法を提供することである。 本発明のいま１つの目的は、種々の流体のセンサー積層体への順序立てられた 送達を行うための、該センサー積層体と組み合わされて使用され得る多区画流体 送達装置を提供することである。本発明の送達装置は、中空シリンジ及び穿孔部 材及び該中空シリンジ内に入れられた制御された量の種々の流体を分けて収容す るための多数の個別の区画群を含んでなる。流体は、各区画の穿孔で、それら個 別の区画群から中空シリンジ中に予め決められた順序で放出される。 本発明のいま１つの目的は、生物学的流体中の選択された標的分子の検出にお いて該センサー積層体と多区画流体送達装置を使用する方法を提供することであ る。 本発明のいま１つの目的は、選択された標的分子の検出のためのキットであっ て、センサー積層体と多区画流体送達装置を含んでなるキットを提供することで ある。図面の簡単な説明 図１は、吸収層上に重ねられた反応性支持層を含んでなるセンサー積層体の側 断面図を示す。 図２は、唾液サンプル中の標的分子を検出するのに有用なセンサー積層体の一 つの態様であって、ポリマー基層、該ポリマー基層上に重ねられた反応性支持層 及び該反応性支持層上に重ねられた唾液活性化層を含んでなるセンサー積層体の 側断面図を示す。 図３は、唾液サンプル中の標的分子を検出するのに有用なセンサー積層体の好 ましい態様であって、ポリマー基層と反応性支持層の間に吸収層が配置されたセ ンサー積層体の側断面図を示す。 図４は、多区画流体送達装置の第１態様の概略図を提供する。 図５は、多区画流体送達装置の第２態様の概略図を提供する。 図６は、図５に示した多区画流体送達装置に用いることができる、プランジャ ー、センサー積層体及び穿孔装置の好ましい態様の概略図を提供する。 図７は、図５に示した多区画流体送達装置の多数の区画を分けるメンブランを 含んでなる仕切りの一つの態様の上面図を提供する。 図８は、図７に示したメンブランの断面図を提供する。 図９は、図５に示した多区画流体送達装置の多数の区画を分けるメンブランの 好ましい態様の上面図を提供する。発明の詳細な説明 最近の多数の研究は、ＨＩＶ抗体のような、疾患検出のための試験混合物とし て、血液と唾液の直接的相互関係を明らかにしている。歯肉溝液は、血清に非常 に似ている口内に存在する血清漏出液である。この唾液漏出液は、血液濃厚物に 匹敵するＨＩＶ抗体の血液濃厚度を示すので、特別に適合化された酵素結合免疫 吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）を用いて正確な試験ができる。最近の研究は、Heli cobacter pyloriが唾液中に抗原／抗体の類似の存在を有することを明らかにし ている。 H．pyloriは、十二指腸潰瘍及び胃潰瘍の両方の発症における周知の原因因子 である。H．pylori感染は、十二指腸潰瘍の患者の９０％を越えて及び消化器潰 瘍の患者の約６５％に存在することが報告されている。これら細菌は、世界中で 抗潰瘍治療を受けている３億５千５百万人の人々について原因となった主要な因 子である。更に、H．pylori感染と胃癌発生の間の因果関係も開示されている。 H．pyloriによる感染は、アンピシリン及びメトロニダゾールのような抗微生 物薬と制酸薬からなる組合せ療法で容易に治療される。更に、H．pyloriの正確 な診断で早急に抗微生物薬を介在させると、概して、胃潰瘍及び十二指腸潰瘍及 び胃癌の発症を阻止できる。しかしながら、H．pylori感染は臨床的症状を呈す るが、しばしば、潜伏性であったり無症状であったりする。従って、これら患者 の治療は、潰瘍や胃癌のようなH．pylori合併症による比較的遅い段階で行われ るに過ぎない。従って、医学的専門家により行われるか又は自己診断試験として 患者によりなされる、簡単なH．pylori“試験キット”の必要性が存在する。 Campylobacter pyloriとも言われるH．pyloriについての最も最近の診断法は 、コストがかかり、臨床的環境で行うのが難しく、全体の時間が長く、及び／又 は患者にとって過度に苦痛を伴うものであるので不快である。例えば、一回の試 験には、組織の生検材料を得るために、管を患者の口から胃及び十二指腸の中に 通すことが含まれる。もう１つの試験には、尿素を含有する溶液を消費した患者 の息の中に放出される二酸化炭素の増加量を測定することが含まれる。H．pylor iは、消化された尿素から二酸化炭素を放出するウレアーゼ酵素を含有している 。しかしながら、二酸化炭素の変化を検出するには、コストのかかる計測機械を 要する。¹⁴Ｃ標識二酸化炭素を包含する類似の試験は、検出するのがより容易な¹⁴ Ｃ標識二酸化炭素の生成をもたらす。しかしながら、この試験は、患者を放射 能に曝すことを包含するので望ましくない。 Blaserら（米国特許第５,４５９,０４１号）は、C．pyloriの少なくとも断片 を含む抗原性組成物であって、抗体反応を示し、C．pyloriの殆どの株に共通で あり、そして未感染個体中に存在する抗体によっては実質的に認識されないとい う充分な独自性を示す、豊富な濃度の少なくとも１の断片を有する抗原性組成物 を開示している。“少なくとも断片”という用語により、完全な細菌（そっくり そのままの微生物）並びにその部分を包含することが意味される。血液中での この“抗原／抗体複合体”の形成を検出する好ましい技術には、ＥＬＩＳＡ、間 接蛍光アッセイ及びリポソームをベースとするアッセイが含まれる。血液サンプ ルの分析には、ウェスタンブロット法も提案されている。 Crippsら（米国特許第５,４２０,０１４号）は、唾液サンプル中のH．pylori についての迅速なin vitro試験を開示している。唾液を含む粘液性分泌物中の免 疫応答は、体から抗原が排除された後に急速に減衰する。従って、粘液性分泌物 中での抗体の存在は、その時点での感染を反映する。例えば、微生物感染の場合 には、粘液性分泌物中の抗体は、消化管におけるような微生物の集落形成の現状 を反映するので、その時点の感染を追跡するのに有用である。対照的に、血清抗 体は、微生物が体から排除された後も数時間は持続する。従って、陽性の血清抗 体試験は、過去及び現時点の抗原への接触の両方を反映するので、臨床医にとっ てはあまり役に立たない。Crippsらは、標準的なＥＬＩＳＡサンドイッチアッセ イを用いて、H．pylori抗原に特異的な粘液性分泌物中のＩｇＧを検出する方法 を開示している。 しかしながら、標準的なＥＬＩＳＡは、しばしば、時間と労力がかかり過ぎて 患者が来院している間に医師が日常的に行うことができない。更に、ＥＬＩＳＡ からの偽陽性結果が高頻度であることが、ＥＬＩＳＡイムノアッセイによる無症 状患者の最後的診断を疑わしいものにしている。 今回、電子ビームによるポリマー材料中のフリーラジカルの形成開始が、その ポリマー材料へのリガンドの結合性を高めることが分かった。電子ビーム活性化 に曝されたポリスチレン表面が、選択されたリガンドについて著しく向上した親 和性を示した。更に、電子ビーム処理ポリスチレンと選択されたリガンドの間の 結合は強い。固体ポリスチレン支持体へのリガンドの結合は、３つの基本的要素 、即ち、容量、親和性及び安定性を有する。容量は、支持体の表面積当たりに結 合することができる物質の最大量である。親和性は、リガンドと支持体の間の引 力の度合いである。安定性は、リガンドと支持体の間で結合を行うレベルである 。先行技術の方法は、主として、固体支持体の容量を高めることに焦点を置いて きた。というのは、親和性と安定性は、特定ポリマー材料の生来の特徴であると 信じられてきたからである。本発明では“高められた結合性”という用語により 、 リガンドについてのポリマー材料の容量、親和性及び安定性が向上したことを意 味する。本発明は、生物学的流体中の選択された標的分子を検出するためのセン サー積層体であって、選択された標的分子についてのリガンドであってポリマー 材料に結合したものを含む反応性支持層を含んでなり、該ポリマー材料が、該リ ガンドの該ポリマー材料への結合性を高めるように処理されたものである、セン サー積層体を提供する。反応性支持層のリガンドの、ポリマー基層への高められ た結合性は、混和のような処理により又は化学的グラフト化により達成される。 グラフト化に使用される技術には、フリーラジカル形成開始の工程が含まれ、例 えば、電子ビーム処理又は音響化学技術を包含するがこれらに限定されない照射 技術により例示される。好ましい態様においては、図１に示すように、反応性支 持層３に加えて、センサー積層体１は、更に、その反応性支持層３の下方に吸収 層５を含む。この層に使用することができる吸収性材料の例は、ポリアクリル酸 塩を有するセルロース紙である。しかしながら、この開示で当業者には自明であ ろうが、過剰な生物学的流体と本センサー積層体に結合する標的分子を検出する のに使用される流体とを吸収できるあらゆる材料を用いることができる。 かくして、本発明のセンサー積層体は、唾液のような生物学的流体中のH．pyl ori抗体のような標的分子を検出するための、苦痛を伴わず、安価で信頼性のあ る手段を提供する。唾液サンプル中の標的分子の検出に有用な本発明の一態様を 図２に示す。この態様では、センサー積層体１は、ポリマー基層２；そのポリマ ー基層２の上に重ねられた反応性支持層３；及びその反応性支持層３の上に重ね られた唾液活性化層４を含んでなる。この態様では、ポリマー基層２は、適する 非孔質ポリマーから構成される。適するポリマーの例には、ポリスチレン、ポリ シロキサン、ポリスチレン−ブタジエンコポリマー、ポリエチレン、ポリプロピ レン、エチレン酢酸ビニル、ポリ塩化ビニル、テトラフルオロエチレン、ポリカ ーボネート及びポリスルホンであって、それらを非孔質にする繊維サイズを有す るものが含まれるが、これらに限定されない。反応性支持層３は、その層全体に わたって広く散在しかつポリマー材料に結合した、標的分子についての選択され たリガンドから構成され、そのポリマー材料は、そのリガンドのそのポリマー材 料への結合性を高めるように処理されている。反応性支持層に使用すること ができるポリマー材料の例にも、ポリスチレン、ポリシロキサン、ポリスチレン −ブタジエンコポリマー、ポリエチレン、ポリプロピレン、エチレン酢酸ビニル 、ポリ塩化ビニル、テトラフルオロエチレン、ポリカーボネート及びポリスルホ ンが含まれるが、これらに限定されない。最上部の唾液活性化層４は、ポリビニ ルピロリドン中の３％クエン酸のような可溶性物質から構成され、これは、豊富 な量の唾液が出るのを促進しかつこの層の上に載せられた唾液サンプル中の標的 分子が下方にある反応性支持層３の中に拡散するのを可能にする。この態様では 、センサー積層体１が直接口の中に入れられ、唾液サンプルが最上部の唾液活性 化層４上に集まる。そのサンプルは反応性支持層３の中に拡散し、そこでサンプ ル中の標的分子がリガンドに結合する。次いで、反応性支持層３を、結合した標 的分子の検出のためにＥＬＩＳＡで日常的に使用される標準的検出試薬と接触さ せることによって、結合した標的分子が検出される。例えば、一つの態様におい ては、検出試薬は、検出できるように標識された標識分子についての第２リガン ドを含むことができる。検出可能な標識の例には、フルオレセインイソチオシア ネートのような蛍光物質又はホースラディッシュペルオキシダーゼのような発色 物質が含まれる。そのような標識の検出に必要な追加の試薬は当該技術分野で周 知である。 好ましい態様においては、図３に示すように、本センサー積層体１は、更に、 ポリマー基層２と反応性支持層３の間に配置された吸収層５を含んでなる。この 態様では、ポリマー基層２は、吸収層５への良好な接着を提供する何らかの適す る透過性ポリマーシートを含む。例には、ポリスチレン、ポリシロキサン、ポリ スチレン−ブタジエンコポリマー、ポリエチレン、ポリプロピレン、エチレン酢 酸ビニル、ポリ塩化ビニル、テトラフルオロエチレン、ポリカーボネート及びポ リスルホンであって、それらを透過性にする繊維サイズを有するものが含まれる が、これらに限定されない。ポリマ−基層に接着した吸収層は、過剰な生物学的 流体と反応性支持層３に結合した標的分子を検出するのに使用される種々の流体 とを吸収するポリアクリル酸塩を有するセルロース紙のような多孔質で透過性の 材料を含んでなる。 本発明は、センサー積層体を製造する方法であって、センサー積層体の選択さ れたリガンドがポリマー材料に化学的に結合して反応性支持層を形成する方法も 提供する。この方法では、センサー積層体は、電子化学産業において周知かつ日 常的に使用されている積層技術及びコーティング技術を用いる加工技術により製 造される。しかしながら、これら技術は、化学的及び放射線活性化結合法を用い て、リガンドをポリマー材料中に一体化させるために手を加えられている。一つ の態様においては、ポリマー材料は、リガンドとの接触の前に照射される。また 、ポリマー材料をリガンドの存在下での照射によって処理してもよい。表面吸着 後に劣化する慣用的な方法とは対照的に、これら方法は、ポリマー材料へのリガ ンドの化学結合を増進させ、それは、容量、親和性及び安定性の向上を包含する 。 一つの態様では、本発明のセンサー積層体は、ポリスチレンフェルトの大きな シートから打ち抜かれて適当な大きさにされたポリマー基層から調製される。そ のポリスチレンフェルトは電子ビームで照射される。照射されたポリスチレンフ ェルトは、食塩加リン酸緩衝液；０.０１Ｍナトリウム−カリウム−リン酸緩衝 液、０.００２７Ｍ塩化カリウム、Ｏ.Ｏ１３７Ｍ塩化ナトリウム，ｐＨ７.４； 又は０.０５Ｍ炭酸−重炭酸塩緩衝液，ｐＨ９.６のようなコーティング緩衝液で 適当な濃度に希釈されたリガンドのサンプル中で、室温で約２時間インキュベー トすることにより、リガンドでコートされる。未結合リガンドを除去するために 、そのリガンドコーテッドポリスチレンフェルトをＰＢＳ＋０.１％Tween20のよ うな洗浄用緩衝液で３回洗浄する。未結合リガンド結合部位をブロックするため に、そのリガンドコーテッドポリスチレンフェルトをＰＢＳ＋０.５％ Tween20 のようなブロッキング緩衝液で室温で２時間インキュベートする。次いで、その リガンドコーテッドポリスチレンフェルトを再度洗浄してブロッキング緩衝液を 除去する。次いで、センサー積層体として役目を果たすところのこのリガンドコ ーテッドポリスチレンフェルトサンプルを乾燥させる。 本発明は、生物学的流体中の標的分子を検出するのに本センサー積層体を使用 する方法も提供する。好ましい態様においては、本センサー積層体は、唾液サン プル中のH．pylori抗体の検出に使用される。この方法では、センサー積層体を ＰＢＳ緩衝液で湿らせる。次いで、生物学的サンプル、即ち、唾液をそのセンサ ー積層体に加えて、サンプル中の標的分子、即ち、H．pylori抗体をそのセン サー積層体のリガンドに結合させることができる。次いで、そのセンサー積層体 を洗浄用緩衝液で洗浄して、サンプルの未結合成分をセンサー積層体から洗い落 とす。次いで、センサー積層体に結合した標的分子を認識しかつそれと結合する 抗体コーテッド染色ラテックス粒子をそのセンサー積層体に加える。次いで、そ のセンサー積層体を再度洗浄して、あらゆる未結合ラテックス粒子をセンサー積 層体から洗い落とす。標的分子は、センサー積層体上に結合したラテックス粒子 から生じる色により検出される。また、別法では、皮膚から放出される標的分子 を検出するために、本発明のセンサー積層体を皮膚パッチの中に組み入れてもよ い。 また、本発明は、その好ましい態様が図４〜９に示されるところの、制御され た量の諸流体をセンサー積層体に予め決められた順序で送達するために、該セン サー積層体と一緒に本法で使用することができる多区画流体送達装置も提供する 。好ましい態様においては、シリンジ中の流体は、当業者によりＥＬＩＳで日常 的に使用される諸流体であって、本発明のセンサー積層体の反応性支持層に結合 した標的分子を検出するために必要とされる流体でもある。この多区画流体送達 装置の中に入れられることができる流体の例には、標的分子についての標識され た第２リガンドを含む流体、該第２リカンドの標識を検出するための手段を含有 する流体、及び洗浄用緩衝液が含まれるが、これらに限定されない。最も簡単な 形態では、多区画流体送達装置６は、穿孔部材７と、中空シリンジ９内に入れら れた制御された量の種々の流体を分けて収容するための多数の個別の区画群８と を含んでなる。流体は、穿孔部材７による、中空シリンジ９中の個別の各区画８ の穿孔で、それら区画８から予め決められた順に放出される。 一つの態様においては、図４に示すように、多区画流体送達装置６は、遠位末 端及び近位末端を有する中空シリンジ９を含む。シリンジ９の近位末端は封じら れている。このシリンジの遠位末端は開放されていて、固定手段１９、好ましく はネジ山を有し、それに、液体又は気体の中空シリンジ９内への制御された送達 のためのノズル１０とバルブ１１が取り付けられている。第１スライド式ピスト ン１２が、シリンジ９の内側においてその遠位末端に配置されている。低強度中 央部分を有する第２スライド式ピストン１３が、中空シリンジ９の内側において その近位末端に配置されている。この第２スライド式ピストン１３の低強度中央 部分は、その第２スライド式ピストン１３が穿孔部材７の方に移動することで、 穿孔部材７によりピストン１３に孔があき易くする。各々が固定量又は固定容量 の流体を含有する、この態様ではポリマーバッグである、多数の区画８が第１ス ライド式ピストン１２と第２スライド式ピストン１３の間に配置されている。好 ましくはこの態様においては注射針である穿孔部材７が、封じられた近位末端を 貫いて中空シリンジ９の中に挿入されているので、ノズル１０及びバルブ１１を 通って気体又は液体が中空シリンジ９の内側に入ると、中空シリンジ９の内側に 生じる圧力が、第１ピストン１２及び第２ピストン１３と各々の流体を含有する 多数の区画８とを中空シリンジ９の近位末端及び穿孔部材７の方にスライドさせ る。シリンジ９の内側での気体又は液体の流れ及び圧力を調節しながら低強度中 央部分を有する第２ピストンを穿孔部材７に押しやることにより、穿孔部材７に よってシリンジ９の近位末端に最も近い第１の区画８に孔があけられてこの区画 から流体が放出されるというようにして、各々の液体の制御された順序での放出 が可能になる。反応に要求される全ての流体が放出されるまで、継続的圧力がそ の次々の区画８の穿孔と流体の放出をもたらす。好ましい態様においては、流体 送達装置６からの流体は、注射針７を通ってシリンジ９からある管の中に流れ出 て、その管の他端には、既に生物学的サンプルに曝されたセンサー積層体が取り 付けられている。この態様では、センサー積層体は、生物学的サンプルに曝され た後にそのセンサー積層体を管の一端に挿入できるように設計された処理ドック を更に含んでなる。その後、その管の他端に多区画流体送達装置を挿入すれば、 シリンジから射出される処理液体の経路ができる。それら流体は、制御された環 境において十分に規定されたやり方でかつ適正な順序及び間隔で、センサー積層 体を通過することになる。 別の態様においては、図５に示すように、多区画流体送達装置６は、遠位末端 及び近位末端を有する中空シリンジ９と、その中空シリンジ９の遠位末端で液体 を別々に収容するための多数の区画８を含有する取り外し可能なキャップ１６と を含む。回転ハンドル１４がシリンジ９の近位末端に配置され、それは中空シリ ンジ９の内側でプランジャー１５に一体的に連結している。このプランジャーも 遠位末端と近位末端を有している。プランジャー１５は、それがそれの近位末端 において回転ハンドル１４に連結しているところの中空シリンジ９の内側の近位 末端から、それがそれの遠位末端においてセンサー積層体１及び穿孔部材７にく っ付いているところの中空シリンジ９の遠位末端の方に連続している。センサー 積層体１は、吸収層５の上に重ねられた反応性支持層３を含むのが好ましい。図 ５に示すように、センサー積層体は、プランジャー１５の遠位末端と穿孔部材７ の間に配置されてもよい。また別に、図６に示すように、１又はそれを越えるセ ンサー積層体１を、プランジャー１５の遠位末端の各々の側であって、中空シリ ンジ９の内側に平行に延びる各々の側に配置してもよい。この好ましい態様では 、孔をあけた後に、各々の個別の区画内の流体の全容量が確実に放出されるよう に各々の区画が開くのを助けるために、プランジャーの遠位末端において、２つ の穿孔部材７の間に吸収体２０が取り付けられている。この態様では、嵌合式キ ャップ１６の各々の多数の区画８は、仕切り１８によって、好ましくは図７、８ 又は９に示すようなメンブランによって分けられているので、生物学的サンプル 中の標的分子の検出に必要な流体を、嵌合式キャップ１６の個別の区画内に別々 に収容することができる。図７〜９に示すように、メンブランの表面は、選択さ れた領域においてそのメンブランの断面の厚さを小さくするため、応力カミソリ で形作られるか又は彫られる。その結果、孔があけられると、その応力カミソリ 傷に沿って好ましいやり方でメンブランに裂け目ができることにより、個別の区 画内の全ての流体が放出されることになる。好ましい態様においては、図９に示 すように、応力カミソリ傷はＳ字型である。センサー積層体に結合したあらゆる 標的分子を簡単に目視検出できるように試験キャップ１６が更に拡大読み取り領 域１７を含むのも好ましい。この態様では、嵌合式キャップ１６は、シリンジ９ の遠位末端から取り外され、生物学的サンプルがこのキャップの中に入れられる 。次いで、そのキャップ１６がシリンジ９の遠位末端に嵌められて、生物学的サ ンプルがセンサー積層体１と接触し、そのサンプル中のあらゆる標的分子がセン サー積層体１の反応性支持層３に結合できるようになる。次いで、回転ハンドル １４を回転させると、プランジャー１５、センサー積層体１及び穿孔部材７がシ リンジ９の遠位末端の方に移動してキャップ16内に伸び、穿孔部材７が逐次的に 各々の区画８の各々の仕切り１８に孔をあけることによって、それら流体が決め られた順序で放出され、センサー積層体１上に結合したあらゆる標的分子が検出 される。 以下の非限定的実施例で、本発明を更に説明する。実施例 実施例１：ポリスチレン繊維の製造 ポリスチレンを１９０〜２００℃に加熱することにより融解させる。その融解 表面から糸を選んで３０〜５０μＭの直径に引き取る。それら繊維を見掛け２〜 ３ｍｍの長さに切断する。 実施例２：ポリスチレンフィルターの製造 実験的に、２５ｃｍ²のポリスチレンフィルターを一度に製造した。これには 、２〜３ｍｍの長さを有する０.５ｇのポリスチレン切断繊維が使用され、これ は０.２ｋｇ／ｍ²の重量に対応する。それら繊維を不活性表面上に広げて互いに 離す。次いで、それら繊維を必要な面積に集める。４５％エタノール及び５５％ ２−ブタドン（メチルエチルケトン）からなる混合溶媒を添加する。これは０. ６Ｌ／ｍ²に相当する。次いで、それら繊維を１ｋｇ／リニア−ｃｍの圧力でシ リンダーによりローラー圧縮する。ローラーをそれら繊維上に全部で５回通過さ せる。その不活性表面とローラーとの接着を避けることが重要である。過剰の溶 媒を吸引により即座に取り除いて、そのフィルターを熱風で乾燥させる。 このポリスチレンフィルターをエタノールで洗浄して乾燥させる。次いで、そ のフィルターをCURETRONと呼ばれる面ビーム型電子ビーム処理システム（EBC-20 0-AAS型，Nissin-High Voltage，Co．Ltd.，京都，615）を用いて、次の条件下 で電子ビーム処理する： 電圧： １９０ｋＶ 電流： ４ｍＡ コンベヤ速度： ４ｍ／分 雰囲気： ６Ｎｍ³／分窒素

【手続補正書】特許法第１８４条の８第１項 【提出日】１９９９年１月１５日（１９９９．１．１５） 【補正内容】請求の範囲の差し替え用紙の翻訳文：原翻訳文第１７〜１９頁と差し替える 請求の範囲 １．生物学的流体サンプル中の選択された標的分子をイムノアッセイにより 検出するためのセンサー積層体１であって、選択された標的分子についてのリガ ンドであって電子ビーム又は音響化学処理によりポリマー材料に化学的に結合し たものを含む反応性支持層３を含んでなり、該処理が該リガンドの該ポリマー材 料への結合性を高めるためのものであるセンサー積層体１であって、前記反応性 支持層の下方に吸収層５を更に含んでなることを特徴とするセンサー積層体１。 ２．更にポリマー材料がフリーラジカルの形成を開始するように処理されて いる、請求項１のセンサー積層体。 ３．前記吸収層の下方にポリマー基層２を更に含んでなる、請求項２のセン サー積層体。 ４．前記反応性支持層の上に重ねられた唾液活性化層４を更に含んでなる、 請求項２又は３のセンサー積層体。 ５．唾液サンプル中のH．pylori抗体を検出するために適合化された、請求 項１〜４のいずれか１項のセンサー積層体。 ６．皮膚から放出される標的分子を検出するために皮膚パッチの中に組み入 れられた、請求項１〜５のいずれか１項のセンサー積層体。 ７．多数の液体の処理ドックへの逐次的送達により標的分子をアッセイする ための多区画流体送達装置６と前記処理ドックであって： （ａ）内側及び外側並びに近位及び遠位末端を有する中空シリンジ９； （ｂ）該中空シリンジの内側に配置された穿孔部材７； （ｃ）該中空シリンジの内側に配置された種々の流体を分けて収容するため の、該穿孔部材に隣接する多数の個別の区画群８； （ｄ）生物学的サンプルに曝した後にセンサー積層体１の挿入を可能にする ように適合化された処理ドック；及び （ｅ）使用時にシリンジ９の内側に圧力をかけて多数の区画群８を穿孔部材 ７の方に押しやるための手段 を含んでなる多区画流体送達装置と処理ドック。 ８．圧力をかける手段が、液体又は気体の中空シリンジの内側への制御され た送達のためのノズル１０及びバルブ１１を含んでなる、請求項７の装置。 ９．多数の区画群８が、中空シリンジの内側においてその遠位末端に配置さ れている第１スライド式ピストン１２及び該中空シリンジの内側において穿孔部 材に隣接してその近位末端に配置されている、穿孔されることができる第２スラ イド式ピストン１３により、境界が定められている、請求項７又は８の装置。 １０．多数の個別の区画群８が、個別の区画群内の液体を封じるための仕切り により分けられている、請求項７〜９のいずれか１項の装置。 １１．圧力をかける手段が、中空シリンジに配置された回転ハンドル１４と、 該中空シリンジの内側の近位末端からその遠位末端の方に伸びるプランジャー１ ５であって、該回転ハンドルに連結している近位末端を含んでなるプランジャー とを含んでなり、該回転ハンドルを回転させると、該プランジャー、該センサー 積層体及び該穿孔部材が該中空シリンジの遠位末端の方に移動する結果、各々の 区画８が逐次的に孔をあけられて、液体が決められた順序で該センサー積層体に 放出されるようになっている、請求項７の装置。 １２．請求項１〜６のいずれか１項のセンサー積層体を含んでなる、請求項８ 〜１１のいずれか１項の装置。 １３．中空シリンジがキャップ１６内でその近位末端において停止しており、 前記キャップが多数の個別の区画群８の少なくとも１を収容できるようになって いる、請求項７の装置。 １４．生物学的流体中の選択された標的分子を検出する方法であって、請求項 １〜６のいずれか１項のセンサー積層体を生物学的流体と接触させること、及び 該センサー積層体の反応性支持層に結合した標的分子を検出することを含んでな る方法。 １５．結合した標的分子が、多区画流体送達装置からの流体の逐次的適用によ り検出される、請求項１４の方法。 １６．生物学的流体中の選択された標的分子を検出する方法であって： （ａ）請求項１３の多区画流体送達装置の中空シリンジ９のキャップ１６を 取り外し； （ｂ）選択された標的分子を含有すると考えられる生物学的流体を該キャッ プ内の多数の区画群８の最上部に載せ； （ｃ）該中空シリンジのキャップを該中空シリンジに戻して、該生物学的流 体がセンサー積層体１と接触して該生物学的流体中の標的分子が該センサー積層 体の反応性支持層に結合できるようにし； （ｄ）該多区画流体送達装置の回転ハンドル１４を回転させて、プランジャ ー１５、センサー積層体１及び穿孔部材７を該キャップ内に移動させ、多数の個 別の区画群８の各々の仕切りに孔をあけ、該標的分子を検出することができる流 体を逐次的順序で該センサー積層体上に放出させ；そして （ｅ）該標的分子を検出する ことを含んでなる方法。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．生物学的流体サンプル中の選択された標的分子をイムノアッセイにより 検出するためのセンサー積層体であって、選択された標的分子についてのリガン ドであってポリマー材料に結合したものを含む反応性支持層を含んでなり、該ポ リマー材料が、該リガンドの該ポリマー材料への結合性を高めるように処理され たものであるセンサー積層体。 ２．ポリマー材料がフリーラジカルの形成を開始するように処理されている 、請求項１のセンサー積層体。 ３．ポリマー材料が電子ビーム処理又は音響化学技術により化学的にグラフ ト化される、請求項２のセンサー積層体。 ４．前記反応性支持層の下方に吸収層を更に含んでなる、請求項１のセンサ ー積層体。 ５．前記吸収層の下方にポリマー基層を更に含んでなる、請求項４のセンサ ー積層体。 ６．前記反応性支持層上に重ねられた唾液活性化層を更に含んでなる、請求 項５のセンサー積層体。 ７．請求項１のセンサー積層体を製造する方法であって、センサー積層体の 反応性支持層のポリマー材料を照射して、該ポリマー材料へのリガンドの結合性 を高めることを含んでなる方法。 ８．多数の流体の逐次的送達のための多区画流体送達装置であって： （ａ）内側及び外側並びに近位及び遠位末端を有する中空シリンジ； （ｂ）該中空シリンジの内側に配置された穿孔部材；及び （ｃ）該中空シリンジの内側に配置された種々の流体を分けて収容するため の、該穿孔部材に隣接する多数の個別の区画群であって、該区画群の穿孔が該収 納された流体の逐次的放出をもたらすようにされた区画群 を含んでなる多区画流体送達装置。 ９．多数の流体の逐次的送達のための多区画流体送達装置であって： （ａ）内側及び外側並びに近位及び遠位末端を有する中空シリンジであって 、 該中空シリンジの該近位末端が封じられ、該遠位末端が開放されかつ固定手段を 有している中空シリンジ； （ｂ）該中空シリンジの封じられた近位末端を貫いている穿孔部材； （ｃ）液体又は気体の該中空シリンジの内側への制御された送達のための、 該中空シリンジの遠位末端に固定されているノズル及びバルブ； （ｄ）該中空シリンジの内側において該遠位末端に配置されている第１スラ イド式ピストン； （ｅ）該中空シリンジの内側において該穿孔部材に対して遠位の近位末端に 配置されている、穿孔されることができる第２スライド式ピストン；及び （ｆ）該第１スライド式ピストン及び該第２スライド式ピストンの間に配置 された、各々の区画が固定量又は固定容量の液体を含有する多数の区画群であっ て、該ノズル及びバルブを通って気体又は液体が該中空シリンジの内側に入ると 、該中空シリンジの内側に生じる圧力が、該第１及び第２ピストンと各々の流体 を含有する該多数の区画群とを該シリンジの近位末端及び穿孔部材の方にスライ ドさせるようになっている多数の区画群 を含んでなる多区画流体送達装置。 １０．多数の流体の逐次的送達のための多区画流体送達装置であって： （ａ）内側及び外側並びに近位及び遠位末端を有する中空シリンジであって 、前記遠位末端が取り外し可能なキャップを含んでなる中空シリンジ； （ｂ）該中空シリンジの該取り外し可能なキャップ内に配置された、種々の 流体を別々に収容するための多数の個別の区画群； （ｃ）それら個別の区画群の中に流体を封じるための仕切り； （ｄ）該中空シリンジの近位末端に配置された回転ハンドル； （ｅ）該中空シリンジの内側の近位末端から該中空シリンジの内側の遠位末 端の方に伸びるプランジャーであって、遠位末端と近位末端とを有しかつ該回転 ハンドルに一体的に連結しているプランジャー； （ｆ）該プランジャーの遠位末端に取り付けられている請求項１のセンサー 積層体；及び （ｇ）該プランジャーの遠位末端に取り付けられている穿孔部材 を含んでなり、該回転ハンドルを回転させると、該プランジャー、該センサー積 層体及び該穿孔部材が該中空シリンジの遠位末端の方に移動して該キャップ内に 伸びる結果、該穿孔部材が逐次的に各々の区画の各々の仕切りに孔をあけること によって、該流体が決められた順序で該センサー積層体上に放出されるようにな っている多区画流体送達装置。 １１．生物学的流体中の選択された標的分子を検出する方法であって、請求項 １のセンサー積層体を生物学的流体と接触させること、及び該センサー積層体の 反応性支持層に結合したあらゆる標的分子を検出することを含んでなる方法。 １２．結合した標的分子が、多区画流体送達装置からの流体の逐次的適用によ り検出される、請求項１１の方法。 １３．生物学的流体中の選択された標的分子を検出する方法であって： （ａ）請求項１０の多区画流体送達装置の中空シリンジのキャップを取り外 し； （ｂ）選択された標的分子を含有すると考えられる生物学的流体を該キャッ プ内の多数の区画群の最上部に載せ； （ｃ）該中空シリンジのキャップを該中空シリンジに戻して、該生物学的流 体がセンサー積層体と接触しそして該生物学的流体中の標的分子が該センサー積 層体の反応性支持層に結合できるようにし； （ｄ）該多区画流体送達装置の回転ハンドルを回転させて、プランジャー、 該センサー積層体及び穿孔部材を該キャップ内に移動させ、多数の個別の区画群 の各々の仕切りに孔をあけ、該標的分子を検出することができる流体を逐次的順 序で該センサー積層体上に放出させ；そして （ｅ）該該標的分子を検出する ことを含んでなる方法。 １４．生物学的流体中の選択された標的分子を検出するためのキットであって 、請求項１のセンサー積層体を含んでなるキット。 １５．更に多区画流体送達装置を含んでなる、請求項１４のキット。 １６．生物学的流体中の選択された標的分子を検出するためのキットであって 、請求項１０の多区画流体送達装置を含んでなるキット。