FI115057B - Eristetty liukoinen CTL4A-proteiini, sitä sisältäviä fuusioproteiineja, sen ligandeja, sen tunnistavia monoklonaalisia vasta-aineita ja käyttötapoja - Google Patents

Eristetty liukoinen CTL4A-proteiini, sitä sisältäviä fuusioproteiineja, sen ligandeja, sen tunnistavia monoklonaalisia vasta-aineita ja käyttötapoja Download PDF

Info

Publication number
FI115057B
FI115057B FI20022285A FI20022285A FI115057B FI 115057 B FI115057 B FI 115057B FI 20022285 A FI20022285 A FI 20022285A FI 20022285 A FI20022285 A FI 20022285A FI 115057 B FI115057 B FI 115057B
Authority
FI
Finland
Prior art keywords
ctla4
amino acid
acid sequence
cells
extracellular domain
Prior art date
Application number
FI20022285A
Other languages
English (en)
Swedish (sv)
Other versions
FI20022285A (fi
Inventor
Jeffrey A Ledbetter
Peter S Linsley
Nitin Damle
William Brady
Original Assignee
Squibb Bristol Myers Co
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=24907003&utm_source=***_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=FI115057(B) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Squibb Bristol Myers Co filed Critical Squibb Bristol Myers Co
Publication of FI20022285A publication Critical patent/FI20022285A/fi
Application granted granted Critical
Publication of FI115057B publication Critical patent/FI115057B/fi

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/70503—Immunoglobulin superfamily
    • C07K14/70521—CD28, CD152
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • A61P31/18—Antivirals for RNA viruses for HIV
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/06—Immunosuppressants, e.g. drugs for graft rejection
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/08—Antiallergic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/715—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants for cytokines; for lymphokines; for interferons
    • C07K14/7155—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants for cytokines; for lymphokines; for interferons for interleukins [IL]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2803—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily
    • C07K16/2818—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily against CD28 or CD152
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2803—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily
    • C07K16/2827—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily against B7 molecules, e.g. CD80, CD86
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
    • C07K2319/02—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a signal sequence
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/30—Non-immunoglobulin-derived peptide or protein having an immunoglobulin constant or Fc region, or a fragment thereof, attached thereto
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/32—Fusion polypeptide fusions with soluble part of a cell surface receptor, "decoy receptors"
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S530/00—Chemistry: natural resins or derivatives; peptides or proteins; lignins or reaction products thereof
    • Y10S530/866—Chemistry: natural resins or derivatives; peptides or proteins; lignins or reaction products thereof involving immunoglobulin or antibody fragment, e.g. fab', fab, fv, fc, heavy chain or light chain
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S530/00—Chemistry: natural resins or derivatives; peptides or proteins; lignins or reaction products thereof
    • Y10S530/868—Chemistry: natural resins or derivatives; peptides or proteins; lignins or reaction products thereof involving autoimmunity, allergy, immediate hypersensitivity, delayed hypersensitivity, immunosuppression, or immunotolerance

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Pain & Pain Management (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • AIDS & HIV (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Pulmonology (AREA)
  • Microbiology (AREA)

Description

115057
Eristetty liukoinen CTL4A-proteiini, sitä sisältäviä fuusioproteiineja, sen ligandeja, sen tunnistavia monoklonaalisia vasta-aineita ja käyttötapoja 5 Keksinnön ala
Keksintö liittyy CTLA4-reseptorigeenin ilmentämiseen, tämän reseptorin ja B7-antigeenia ilmentävien solujen välisen vuorovaikutuksen tunnistamiseen ja menetelmiin sellaisten solujen välisten vuorovaikutusten säännöstele-10 miseksi, joihin liittyy CTLA4-reseptori.
Keksinnön tausta
Selkärankaisten immuunijärjestelmälle leimaa antavana piirteenä on kyky erottaa oma ("self") elimistö jostakin toisesta ("non-self") (vieraasta) elimistöstä. Tämä 15 ominaisuus on johtanut sellaisen järjestelmän kehittymiseen, jossa optimaalisen immuuniaktivaation saavuttamiseen tarvitaan useita signaaleja [Janeway, Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 54 (1989) 1 - 14]. T-solujen ja B-solu-jen vuorovaikutukset ovat välttämättömiä immuunivasteelle.
20 T-solujen ja B-solujen pinnalla esiintyvien monien kohe- siivisten molekyylien pitoisuudet lisääntyvät immuunivasteen aikana [Springer, et ai., (1987), edellä, Shaw ja :.· · Shimuzu, Current Opinion in Immunology, Kindt ja Long (toim.) 1 (1988) 92 - 97; ja Hemler, Immunology Today 9 ,* 25 (1988) 109 - 113]. Näiden molekyylien pitoisuuksien li- ;\j sääntyminen voi osaltaan selittää sen, miksi aktivoidut B- • » .·, : solut stimuloivat antigeenispesifistä T-solujen lisäänty- I t .···, mistä lepotilassa olevia B-soluja tehokkaammin [Kaiuchi, et ai., J. Immunol. 131 (1983) 109 - 114; Kreiger, et ai., 30 J. Immunol. 135 (1985) 2 937 - 2 945; McKenzie, J.
*;;; Immunol. 141 (1988) 2 907 - 2 911; ja Hawrylowicz ja ’···' Unanue, J. Immunol. 141 (1988) 4 083 - 4 088] .
T-lymfosyytti ("T-solu") -immuunivasteen muodostu-·;··;' minen on monimutkainen ilmiö, johon liittyy solujen väli- , \ 35 siä vuorovaikutuksia [Springer, et ai., A. Rev. Immunol. 5 ·· ; (1987) 223 - 252], jotka tapahtuvat varsinkin T-solujen ja 1 1 5057 2 apusolujen, kuten B-solujen välillä, sekä immuunijärjestelmän liukoisten välittäjäaineiden (sytokiinien tai lym-fokiinien) muodostuminen [Dinarello ja Mier, New Engl. Jour. Med 317 (1987) 940 - 945] . Tätä vastetta säätelevät 5 useat T-solujen pinnalla olevat reseptorit, joihin kuuluu T-solureseptorikompleksi [Weiss, et ai., Ann. Rev. Immunol. 4 (1986) 593 - 619] ja muita solun pinnalla olevia "apu"molekyylejä [Springer, et ai., (1987) edellä]. Monet näistä apumolekyyleistä ovat luonnossa esiintyviä solun 10 pinnan erinlaistumis (CD) -antigeenejä, jotka voidaan erottaa toisistaan sen perusteella, miten ne reagoivat solujen pintaa vastaan suunnattujen monoklonaalisten vasta-aineiden kanssa [McMichael, toim., Leukocyte Typing III, Oxford Univ. Press, Oxford, N.Y. (1987)].
15 Antigeenistä riippumattomat solujen väliset vuoro vaikutukset, joissa lymfosyyttien apumolekyylit ovat osallisina, ovat välttämättömiä immuunivasteelle [Springer, et ai., (1987), edellä]. Esimerkiksi T-soluun liittyvän proteiinin, CD2:n, sitoutuminen ligandiinsa LFA-3, joka on 20 laajalle levinnyt glykoproteiini [katsaus tähän on esitetty julkaisussa Shaw ja Shimuzu, edellä), on tärkeä T-solujen antigeenispesifisen aktivaation optimoimiselle · [Moingeon, et ai., Nature 339 (1988) 314]. Toiseen tär- • · keään adheesiojärjestelmään liittyy lymfosyyttien, makro- 25 fagien ja granulosyyttien pinnalla esiintyvän LFA-l-glyko- ;\j proteiinin [Springer, et ai., (1987), edellä; Shaw ja * · .·, ; Shimuzu (1988), edellä] sitoutuminen ligandeihinsa ICAM-1 * i · .···, (Makgoba, et ai., Nature 331 (1988) 86 - 88] ja ICAM-2 * i [Staunton, et ai., Nature 339 (1989) 61 - 64]. T-solujen , 30 apumolekyylit CD8 ja CD4 vahvistavat T-solujen adheesiota • » · vuorovaikutuksella MHC:n luokka I -molekyylien [Norment, et '*·*’ ai., Nature 336 (1988) 79 - 81] ja luokka II -molekyylien [Doyle ja Strominger, Nature 330 (1987) 256 - 259] kanssa, * · vastaavassa järjestyksessä mainittuna. "Solujen kulkeutu- , *, 35 mistä ohjaavat (homing) reseptorit" ovat tärkeitä lymfo- • * * • · · » * * » 3 115057 syyttien liikkumisen säännöstelyssä [Stoolman, Cell 56 (1989) 907 - 910] . VLA-glykoproteiinit ovat integriinejä, jotka vaikuttavat toimivan välittäjinä lymfosyyttien toiminnoissa, joissa tarvitaan adheesiota solunulkoisen mat-5 riksin komponentteihin (Hemler, edellä). CD2/LFA-3-, LFA-l/ICAM-1- ja ICAM-2- sekä VLA -adheesiojärjestelmät ovat jakaantuneina useisiin erilaisiin solutyyppeihin [Springer, et ai., (1987), edellä; Shaw ja Shimuzu (1988), edellä, ja Hemler, (1988), edellä).
10 Useita vuosia sitten tehtiin ehdotus, että B- lymfosyyttien aktivaatio vaatisi kahta signaalia [Bretscher ja Cohn, Science 169 (1970) 1 042 - 1 049], ja kaikkien lymfosyyttien arvellaan nykyisin tarvitsevan optimaaliseen aktivoitumiseen kahta signaalia, 15 antigeenille spesifistä eli klonaalista signaalia, sekä toista, antigeenin suhteen epäspesifistä signaalia (Janeway, edellä). Freeman, et ai. [J. Immunol. 143(8) (1989) 2 714 - 2 722] eristivät ja sekvenssoivat cDNA- kloonin, joka koodaa mAb-B7:n tunnistamaa B-solun 20 aktivaatioantigeenia [Freeman, et ai., J. Immunol. 138 (1987) 3 260]. Tällä cDNArlla transfektoitujen COS-solujen on osoitettu värjäytyvän sekä leimalla varustetulla mAb-*,· · B7:llä että mAb BB-l:llä [Clark, et ai., Human Immunol. 16 : ; : (1986) 100 - 113; Yokochi, et ai., J. Immunol. 128 (1981) 25 823; Freeman, et ai., (1989), edellä; ja Freedman, et ai., J (1987), edellä]. Lisäksi tämän antigeenin on havaittu • « .·, ; ilmentyvän muiden kehityslinjojen solujen, kuten t··/ monosyyttien, pinnalla (Freeman, et ai., edellä).
t ·
Auttaja-T-solun, (Thin) antigeenivasteeseen tarvit-30 tavia signaaleja muodostavat antigeeniä esittävät solut i » · ··*·' (APCrt). Ensimmäisen signaalin muodostuminen käynnistyy T- « · i solureseptorikompleksin [Weiss, J. Clin. Invest. 86 (1990)
;\j 1015] vuorovaikutuksesta antigeenin kanssa, jonka APC
• · ....: esittää MHC-kompleksin [major histocompatibility complex 35 (MHC)] luokka II -molekyylien yhteydessä APC:n pinnalla 4 115057 [Allen, Immunol. Today 8 (1987) 270]. Tämä antigeeni- spesifinen signaali ei ole riittävä täyden vasteen aikaansaamiseksi ja se voi toisen signaalin puuttuessa johtaa kloonin inaktivoitumiseen eli anergiaan [Schwartz, Science 5 248 (1990) 1 349]. Useissa kokeellisissa järjestelmissä on osoitettu tarvittavan toista, MHC:stä saatavaa "stimuloivaa rinnakkaissignaalia" [Schwartz, edellä; Weaver ja Unanue, Immunol. Today 11 (1990) 49] . Tämän (näiden) tois(t)en signaali(e)n molekulaarista luonnetta ei täysin 10 tunneta, vaikka joissakin tapauksissa on selvää, että "stimuloivina rinnakaissignaaleina" voivat toimia liukoiset molekyylit, kuten interleukiini (IL)-l (Weaver ja Unanue, edellä), ja solujen väliseen adheesioon liittyvät membraanireseptorit [Springer, Nature 346 (1990) 25] .
15 CD28-antigeeni, joka on immunoglobuliinien ylä- ryhmään kuuluva homodimeerinen glykoproteiini [Aruffo ja Seed, Proc. Natl. Acad. Sei. 84 (1987) 8 573 - 8 577], on useimmissa kypsissä humaani-T-soluissa esiintyvä apumole-kyyli [Damle, et ai., J. Immunol. 131 (1983) 2 296 - 20 2 300]. Nykyiset todisteet viittaavat siihen, että tämä molekyyli toimii T-solujen vaihtoehtoisessa aktivoitumis-reaktiotiessä, joka poikkeaa T-solureseptorikompleksin · ; : käynnistämästä reaktiosarjasta (June, et ai., Mol. Cell.
:V; Biol. 7 (1987) 4 472 - 4 481]. Monoklonaaliset vasta-ai- 25 neet (mAb:t), jotka kykenevät reagoimaan CD28-antigeenin .·, : kanssa, voivat tehostaa T-soluvasteita, jotka ovat käyn- .·, ; nistyneet useiden erilaisten polyklonaalisten stimulusten vaikutuksesta (katsaus tähän on esitetty julkaisussa June, ' ' et ai., edellä). Nämä stimuloivat vaikutukset voivat joh- 30 tua mAb:n käynnistämästä sytokiinien muodostumisesta [Thompson, et ai., Proc. Natl. Acad. Sei 86 (1989) 1 333 - • * » 1337; ja Lindsten, et ai., Science 244 (1989) 339 - 343], ;*·,· mikä johtuu mRNA:n pysyvyyden parantumisesta [Lindsten, et ai., (1989), edellä]. Anti-CD28-mAb-molekyyleillä voi myös 35 olla inhiboivia vaikutuksia, ne voivat toisin sanoen eh- I I t 5 115057 käistä autologisia lymfosyyttityyppien yhteisreaktioita (mixed lymphocyte reaction) [Damle, et ai., Proc. Natl. Acad. Sei. 78 (1981) 5 096 - 6 001] ja antigeenispesifis-ten T-solukloonien aktivoitumista [Lesslauer, et ai., Eur.
5 J. Immunol. 16 (1986) 1 289 - 1 296].
Tutkimuksissa on osoitettu, että CD28 on B-solun aktivaatioantigeenin, B7/BB-l:n, vastinreseptori [Linsley, et ai., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 87 (1990) 5 031 - 5 035]. Käytännöllisyyssyistä käytetään B7/BB-l-antigee-10 nista tuonnempana nimitystä "B7-antigeeni". CD28:n ja B7-antigeenin välisiä vuorovaikutuksia on luonnehdittu B7-antigeenin ja CD28-reseptorin solunulkoisten osien sekä immunoglobuliinin (Ig) Cyl:n (muuttumattoman alueen raskaat ketjut) geneettisiä fuusioita käyttäen [Linsley, et 15 ai., J. Exp. Med. 173 (1991) 721 - 730]. Immobilisoidun B7Ig-fuusioproteiinin sekä B7-positiivisten CHO-solujen on osoitettu toimivan T-solujen lisääntymisen rinnakkaisina stimuloijina. T-solun stimuloiminen B7-positiivisilla CHO-soluilla stimuloi myös spesifisesti IL-2:n transkriptio-20 tuotteiden määrän lisääntymistä. Muut tutkimukset ovat osoittaneet, että anti-CD28-mAb inhiboi sellaista IL-2:n muodostumista, joka oli käynnistynyt tietyissä T-solu-l i : leukemiasolulinjoissa solujen välisistä vuorovaikutuksista :Y; B-soluleukemia-solulinjan kanssa [Kohno, et ai., Cell.
* 1 25 Immunol. 131 (1990) 1 - 10].
: CD28:lla on yksi solunulkoista vaihtelevaa aluetta • · .·, ; (V) muistuttava domeeni (Aruffo ja Seed, edellä) . Homolo- ginen molekyyli, CTLA4, on tunnistettu sytolyyttisen mu- • · riini-T-solu-cDNA-kirjaston erotteluseulonnan avulla 30 (Brunet, et ai., Nature 328 (1987) 267 - 270]. Tämän mole- ··2 kyylin transkriptiotuotteita on havaittu T-solupopulaati- # » · *...· oissa, joilla on sytotoksista aktiivisuutta, mikä viittaa siihen, että CTLA4 saattaisi toimia sytolyyttisessä reak-tiossa (Brunet, et ai., edellä; ja Brunet, et ai., Immu- • · 35 nol. Rev. 103 (1988) 21 - 36]. Tutkijat ovat julkaisseet 1 · i » 2 ♦ · 6 115057 tutkimusraportteja CTLA4:ää vastaavan ihmisen geenin kloonauksesta ja kartoittamisesta [Dariavach, et ai., Eur. J. Immunol. 18 (1988) 1 901 - 1 905] samaan kromosomi- alueeseen (2q33 - 34) kuin CD28 [Lafage-Pochitaloff, et 5 ai., Immunogenetics 31 (1990) 198 - 201]. Tämän humaani- CTLA4-DNA:n ja CD28-proteiineja kodaavan DNA:n jaksojen vertaaminen keskenään on paljastanut merkittävää jaksojen homologiaa, jossa homologisuusaste on suurin jukstamem-braanisilla ja sytoplasmisilla alueilla (Brunet, et ai., 10 1986, edellä; Dariavach, et ai., 1988, edellä).
CD28:n ja CTLA4:n välinen korkeanasteinen homologia sekä niiden geenien paikantuminen samaan paikkaan nostaa esiin kysymyksen siitä, muistuttavatko nämä molekyylit myös toiminnallisesti toisiaan. Koska 15 CTLA4:n proteiinituotetta ei ole vielä onnistuttu ilmentämään, niin nämä kysymykset jäävät kuitenkin vastausta vaille.
Immunoglobuliinien yläryhmään kuuluvien solun pinnan glykoproteiinien liukoisia johdannaisia, jotka ovat 20 HIV-l:n reseptorina toimiva CD4-reseptori ja CD28- ja B7-reseptorit, on ilmennetty käyttäen sellaisista DNA-jaksoista koostuvia hybridifuusiomolekyylejä, jotka koodaavat • « : CD4-reseptorin solunulkoisen domeenin osia vastaavia aminohappoja ja jotka on yhdistettu vasta-aineen domee- ;\j 25 neihin {immunoglobuliinin γΐ [Capon, et ai., Nature 337 .·. .1 (1989) 525 - 531] (CD4) ja Linsley, et ai., J. Exp. Med., • < · .·, j edellä (CD28 ja B7) } .
* t e
Olisi käyttökelpoista kyetä ilmentämään CTLA4-gee- • · nin liukoista proteiinituotetta, jota ei ole vielä kyetty 30 ilmentämään, ja tunnistaa CTLA4:n luonnollinen ligandi, » 1 · ··· joka osallistuu toiminnallisiin T-soluvasteisiin.
* » · * » • ·
• I
» t 0 * · · • mm * · • · 1 > ♦ » » I t | 1 7 115057
Keksinnön yhteenveto
Edellä sanotun perusteella tästä keksinnöstä, joka on esitetty tässä hakemuksessa ja tämän hakemuksen kanta-hakemuksessa FI 935795, saadaan käyttöön täydellinen ja 5 virheetön DNA-jakso, joka koodaa CTLA4-reseptoriproteiinia vastaavaa aminohappojaksoa, ja B7-antigeenin on tässä keksinnössä määritetty olevan CTLA4:n luonnollinen ligandi. Tästä keksinnöstä saadaan myös käyttöön menetelmä tämän DNA:n ilmentämiseksi CTLA4:n ja immunoglobuliinin 10 (Ig) fuusioproteiini tuotteena. Tämän keksinnön mukaisiin sovellutusmuotoihin kuuluvat CTLA4lg-fuusioproteiini ja hybridifuusioproteiinit, joihin kuuluvat CD28Ig/CTLA4Ig-fuusioproteiinit. Siitä saadaan myös käyttöön menetelmiä CTLA4-fuusioproteiinin, B7Ig-fuusioproteiinin, hybridifuu-15 sioproteiinien ja näiden fragmenttien ja/tai johdannaisten, kuten CTLA4:n ja B7-antigeenin kanssa reaktioky-kyisten monoklonaalisten vasta-aineiden, käyttämiseksi sään-nöstelemään solujen vuorovaikutuksia ja immuunivasteita.
Esillä olevan keksinnön kohteena on se, mitä 20 esitetään patenttivaatimuksissa.
Tämän keksinnön mukaista humaani-CTLA-reseptori- proteiinia koodaa 187 aminohappoa ja siihen sisältyy : äskettäin tunnistettu N-välitteisen glykosylaation kohta.
;V: Tämän keksinnön mukainen CTLA4Ig-fuusioproteiini * · : 25 sitoo B7-antigeenia, joka ilmentyy aktivoitujen B-solujen • » .·. : ja muiden kehityslinjojen solujen pinnalla ja joka on T- ^ | solujen pinnalla olevan CD28-reseptorin ligandi. CTLA4Ig • 1 · sitoo B7-antigeenia merkittävästi suuremmalla affinitee- • · ·** tiliä kuin millä B7:n sitoutuminen CD28-reseptoriin tapah- 30 tuu. CTLA4Ig-konstruktio sisältää ensimmäisen aminohappo-jakson, joka vastaa CTLA4:n reseptorin solunulkoista do- • s · ·...· meenia ja joka on fuusioitu toiseen aminohappo jaksoon, .·. : joka vastaa humaani-Ig:n Cyl-domeenia. Ensimmäinen amino- • · happo jakso sisältää aminohapporyhmät, jotka ulottuvat • » • · 35 CTLA4:n solunulkoista domeenia vastaavan aminohappojakson 8 115057 aseman 1 kohdalta aseman 125 kohdalle ja jotka on liitetty toiseen aminohappojaksoon, joka sisältää humaani-Ig:n
Cyl:n sarana-, CH2- ja CH3-alueita vastaavat aminohappo-ryhmät. Fuusioproteiinia tuotetaan edullisesti dimeerises-5 sä muodossa. Liukoinen CTLA4Ig on voimakas T- ja B-lymfo-syyttivasteiden inhibiittori in vitro -olosuhteissa.
Tähän keksintöön ajatellaan myös kuuluvan hybridi-fuusioproteiinit, kuten CD28Ig/CTLA4Ig-fuusioproteiinit, jotka sitoutuvat B7-antigeeniin ja joissa on ensimmäinen 10 aminohappojakso, joka vastaa CD28:n solunulkoisen domeenin fragmentteja ja joka on liitetty toiseen aminohappojaksoon, joka vastaa CTLA4Ig:n solunulkoista domeenia vastaavia fragmentteja, ja kolmas aminohappojakso, joka vastaa humaani-IgCyl:n sarana-, CH2- ja CH3-alueita. Hybridi-15 fuusioproteiinien yksi sovellutusmuoto on CD28Ig/CTLA4Ig-fuusiokonstruktio, jossa on ensimmäinen aminohappojakso, joka sisältää CD28:n solunulkoista domeenia vastaavan aminohappojakson aminohapporyhmät aseman 1 kohdalta aseman 94 kohdalle ja joka on liitetty toiseen aminohappojaksoon, 20 joka sisältää CTLA4:n solunulkoista domeenia vastaavan aminohappojakson aminohapporyhmät aseman 94 kohdalta aseman 125 kohdalle, jotka jaksot on liitetty kolmanteen .1.· : aminohappojaksoon, joka sisältää sarana-, CH2- ja CH3- :V: alueita vastaavat humaani-Ig:n Cyl:n aminohapporyhmät.
: 25 Keksintöön sisältyy myös in vitro -menetelmä T-so- .·. : lujen ja muiden solujen vuorovaikutusten säännöstelemi- j seksi inhiboimalla CTLA4-positiivisten T-solujen ja B7- * 1 · positiivisten solujen välistä vuorovaikutusta siten, että • · • 1 ’·1 T-solut saatetaan reagoimaan CTLA4-reseptorin ligandien 30 kanssa. Näihin ligandeihin kuuluvat CTLA4-reseptorin
I M
kanssa reagoimaan kykenevä monoklonaalinen vasta-aine ja *...· vasta-ainefragmentit.
: Tässä keksinnössä on kuvattu CTLA4Ig-fuusio- • · proteiinin kanssa reagoimaan kykenevä monoklonaalinen vas- • · 35 ta-aine ja CD28Ig/CTLA4Ig-fuusioproteiinin kanssa reagoi- • 1 » i · • · 1 »tl · 9 115057 maan kykenevä monoklonaalinen vasta-aine, joita käytetään solujen vuorovaikutusten säännöstelemiseen in vitro.
Keksinnössä on myös kuvattu uusi kiinanhamsterin munasarjasolulinja, joka ilmentää pysyvästi CTLA4Ig- 5 fuusioproteiinia.
Piirustusten kuvaus
Kuvio 1 on kaavio CTLA4Ig-fuusiokonstruktioista, jotka on kuvattu tuonnempana esimerkissä 2.
Kuvio 2 on valokuva geelistä, joka on saatu 10 CTLA4lg:n kromatografisesta puhdistuksesta SDS-PAGE:lla tuonnempana esimerkissä 2 kuvatulla tavalla.
Kuvio 3 on humaani-CTLA4-reseptoria koodaava täydellinen aminohappojakso (jaksotunnisteet nro 13 ja 14), joka on fuusioitu onkostatiini M:n signaalipeptidiin (ase-15 masta -25 asemaan -1) ja johon sisältyy äskettäin tunnistettu N-välitteisen glykosylaation kohta (asemat 109 -111), tuonnempana esimerkissä 3 kuvatulla tavalla.
Kuvio 4 esittää FACSR-analyysituloksia, jotka on saatu B7Ig-fuusioproteiinin sitoutumisesta CD28:lla ja 20 CTLA4:llä transfektoituihin COS-soluihin tuonnempana esi merkissä 4 kuvatulla tavalla.
Kuvio 5 esittää FACSR-analyysituloksia, jotka on : : : saatu puhdistetun CTLA4Ig:n sitoutumisesta B7-antigeeni- :V: positiivisten (B7+) CHO-solujen pintaan ja lymfoblastoidi- ;: 25 sen solulinjan (PM LCL) pintaan tuonnempana esimerkissä 4 • · .·. : kuvatulla tavalla.
#·# _1 Kuvio 6 on graafinen esitys, joka kuvaa kompetitii- * · "1 125 vista sitoutumisanalyysia, jossa on tutkittu I-leimalla
• I
·" varustetun B7Ig:n sitoutumista immobilisoituun CTLA4Ig:hen 30 tuonnempana esimerkissä 4 kuvatulla tavalla.
·.: Kuvio 7 on graafinen esitys, jossa on esitetty of
Scatchard-analyysin tulokset 125I-leimalla varustetun : B7Ig.1n sitoutumisesta immobilisoituun CTLA4Ig:hen tuonnempana esimerkissä 4 kuvatulla tavalla.
35 t
1 » 1 I
10 115057
Kuvio 8 on valokuva, joka esittää geeliä B7-posi- 1 o e tiivisten CHO-solujen ja pinnastaan I-leimalla varustettujen PM LCL -solujen immunosaostusanalyysin SDS-PAGE-kromatografiästä, joka suoritettiin tuonnempana esimerkis-5 sä 4 kuvatulla tavalla.
Kuvio 9 on graafinen esitys CTLA4Ig:n vaikutuksista T-solujen lisääntymiseen määritettynä [3H]-tymidiinin kerääntymisestä soluihin tuonnempana esimerkissä 4 kuvatulla tavalla.
10 Kuvio 10 on pylväskaavio, joka kuvaa CTLA4Ig:n vai kutuksia auttaja-T-solujen (Th-solut) käynnistämään humaa-ni-B-solujen immunoglobuliinien eritykseen määritettynä entsyymi-immunomäärityksellä (ELISA) tuonnempana esimerkissä 4 kuvatulla tavalla.
15 Keksinnön yksityiskohtainen kuvaus
Seuraava selitys on esitetty syventämään kuvatun keksinnön ymmärtämistä.
Keksintö käsittää sellaisen T-solujen pinnalla esiintyvän humaani-CTLA4-reseptorin eristämisen ja ilmen- 20 tämisen, joka sitoutuu aktivoitujen B-solujen ja muiden kehityslinjojen solujen pinnalla ilmentyvään B7-antigee- niin, sekä CTLA4-reseptorigeenin liukoisten fuusioproteii- : nituotteiden ilmentämisen. Keksinnöstä saadaan myös käyt- ♦ * · · töön menetelmiä ilmennetyn CTLA4-reseptorin käyttöön solu- • * .·. : 25 jen vuorovaikutusten säännöstelemiseksi, mukaan lukien T- • * · .·. J solujen ja B7-positiivisten solujen vuorovaikutukset.
« · · I Edullisessa sovellutusmuodossa humaani-CTLA4- • * · • *« reseptoriproteiinia vastaavaa aminohappo jaksoa koodaava • · *···’ täydellinen ja virheetön DNA-jakso kloonataan PCR:ää 30 käyttäen. CTLA4:n täydellisen ennustetun koodaavan jakson sisältävä cDNA koottiin kahdesta PCR-fragmentista, jotka » f | !it>: oli amplifioitu H38-RNA:sta, ja se liitettiin CDM8- ,·. ,· ilmentämisvektoriin tuonnempana esimerkeissä yksityis- 1 » · ! kohtaisesti kuvatulla tavalla. Isolaatiot transfektoitiin » > * « · • · . 35 COS-soluihin ja niistä tutkittiin kyky sitoa B7Ig:tä, joka * » · * * * » i » »
i M I I
11 115057 on liukoinen fuusioproteiini, jonka aminohappojakso vastaa B7:n solunulkoista domeenia ja humaani-immunoglobuliinin (Ig) Cyl-aluetta, ja joka on kuvattu julkaisussa Linsley, et ai., J. Exp. Med. 173 (1991) 721 - 730.
5 Tämän jälkeen määritettiin yhden isolaation, jolle annettiin nimitys OMCTLA4, DNA-jakso ja sen havaittiin vastaavan tarkalleen humaani-CTLA4:n ennustettua jaksoa, joka oli fuusioitu onkostatiini M:stä peräisin olevan signaalipeptidin N-terminaaliseen päähän. CTLA4:n resepto-10 ria koodaa 187 aminohappoa (signaalipeptidiä ja lopetus-kodoneja lukuunottamatta) ja se sisältää äskettäin tunnistetun N-välitteisen glykosylaation kohdan aminohappoase-missa 109 - 111 (katso tuonnempana oleva kuvio 3). CTLA4-reseptoria ilmennetään käyttäen onkostatiini M:n signaali-15 peptidiä.
Toisessa edullisessa sovellutusmuodossa valmistetaan CTLA4-reseptorigeenin proteiinituotteen (CTLA4Ig) liukoisia muotoja käyttäen fuusioproteiineja, joissa on ensimmäinen aminohappojakso, joka vastaa CTLA4:n solun-20 ulkoista domeenia ja toinen aminohappojakso, joka vastaa humaani-Ig:n Cyl-domeenia. Konstruoitiin kloonaus- ja ilrnentämisplasmidit (CDM8 ja nLN), jotka sisälsivät cDNA-.· .·, molekyylejä, jotka koodasivat tässä keksinnössä kuvattuun S.,·' cDNA:han perustuvaa humaani-CTLA4-reseptoria vastaavan * · 25 aminohappo jakson osia, jossa CTLA4-reseptorigeenin solun- ’ ] ulkoisen domeenin fragmenttia vastaavaa ensimmäistä amino- • * · ’· ’· happo jaksoa koodaava cDNA on liitetty DNA: hän, joka koodaa * · · ’· ‘ί toista aminohappojaksoa, joka vastaa Ig:n C-aluetta, joka mahdollistaa CTLA4-reseptorigeenin ilmentymisen muuttamal-30 la ilmennetyn CTLA4-proteiinin liukoisuutta. Liukoista :· CTLA4Ig-fuusioproteiinia koodaa siten ensimmäinen amino- happojakso, joka sisältää CTLA4:n solunulkoisen domeenin , aminohappojaksoa vastaavat aminohapporyhmät aseman 1 koh- » * i • j dalta aseman 125 kohdalle ja joka on liitetty toiseen 35 aminohappojaksoon, joka sisältää humaani-Ig:n Cyl:n sara- 12 115057 na-, CH2- ja CH3-alueita vastaavat aminohapporyhmät. Fuu-sioproteiinia tuotetaan edullisesti dimeerisessä muodossa. Konstruktio transfektoitiin sitten COS- tai CHO-soluihin ja CTLA41g puhdistettiin ja sen tunnistettiin olevan di-5 meeri.
CTLA4Ig-fuusioproteiinia vastaavaa aminohappojaksoa koodaava DNA on talletettu 31.5.1991 Budapestin sopimuksen ehtojen mukaisesti talletuslaitokseen American Type Culture Collection (ATCC), Rockville, Maryland, ja sille 10 on annettu ATCC:n hakunumero 68 629.
Tästä keksinnöstä saadaan ensimmäistä kertaa käyttöön liukoisen fuusioproteiinin muodossa oleva CTLA4-transkriptiotuotteiden tuottama proteiini. CTLA4lg-pro-teiini muodostaa disulfidin yhdistämän dimeerin, jonka 15 alayksikköjen Mr on noin 50 000, mikä viittaa siihen, että natiivi CTLA4 on todennäköisesti T-solun pinnalla di-sul-fidin yhdistämänä homodimeerinä.
B7-antigeenin on osoitettu olevan T solujen pinnalla olevan CD28-reseptorin ligandi (Linsley, et ai., Proc.
20 Natl. Acad. Sei. USA, edellä). CTLA4-reseptorimolekyyli näyttää muistuttavan toiminnallisesti ja rakenteellisesti CD28- reseptoria; kummatkin ovat B-solun aktivaatioanti-·,· | geenin, B7:n, reseptoreita, samalla kun CTLA4:n affini- : : i teetti B7:ää kohtaan vaikuttaa olevan suurempi, ja se on 25 lymfoidisten adheesio jär jestelmien joukossa suurin tähän • » .*· : mennessä raportoitu affiniteetti. CTLA4Ig:n onkin osoi- • * + .·. : tettu sitoutuvan B7-positiivisiin (B7 ) solulinjoihin • » · .·.·] CD28lg:tä voimakkaammin. Muut kokeet ovat osoittaneet, että CTLA4 on B7-antigeenin reseptori, jonka affiniteetti 30 CD28-reseptorin affiniteettia suurempi. CTLA4Ig:n on osoi-tettu lisäksi sitoutuvan lymfoblastoidisten solujen pin- • * nalla olevaan yhteen proteiiniin, joka on kooltaan saman-:*·,· lainen kuin B7-antigeeni. CTLA4Ig inhiboi T-solujen li- sääntymistä ja se inhiboi Th:n käynnistämää IgM:n muodos-35 tumista.
( · > 13 115057
Toisessa edullisessa sovellutusmuodossa konstruoitiin hybridifuusioproteiineja, joissa oli erilaisten re-septoriproteiinien fragmentteja vastaavia aminohappo-jaksoja. Esimerkiksi CD28:n ja CTLA4:n solunulkoisten do-5 meenien valikoituja fragmentteja vastaavat aminohappo-jaksot liitettiin yhteen CD28Ig/CTLA4Ig-hybridifuusio-proteiinien valmistamiseksi. Siten saatiin CD28Ig:n ja CTLA4Ig:n fuusioproteiini, jossa oli ensimmäinen amino-happojakso, joka sisälsi CD28:n solunulkoisen domeenin 10 fragmenttia vastaavat aminohapporyhmät ja joka oli liitetty toiseen aminohappojaksoon, joka vastasi CTLA4Ig:n solunulkoisen domeenin fragmenttia ja jotka jaksot oli liitetty kolmanteen aminohappojaksoon, joka vastasi humaani-Ig:n Cyl:n sarana-, CH2- ja CH3-alueita. Hybridifuusio-15 proteiinien yksi sovellutusmuoto on CD28lg:n ja CTLA4Ig:n fuusiokonstruktio, jossa on ensimmäinen aminohappojakso, joka sisältää CD28:n solunulkoista domeenia vastaavassa aminohappojaksossa olevat aminohapporyhmät aseman 1 kohdalta aseman 94 kohdalle ja joka on liitetty toiseen 20 aminohappojaksoon, joka sisältää CTLA4:nsolunulkoista domeenia vastaavassa aminohappojaksossa olevat aminohappo-ryhmät aseman 94 kohdalta aseman 125 kohdalle, jotka jak- • sot on liitetty kolmanteen aminohappo jaksoon, joka vastaa humaani-IgCyl: n sarana-, CH2- ja CH3-alueita.
.·.: 25 CTLA4-reseptoriproteiinia, liukoisia fuusioproteii- · neja ja hybridifuusioproteiine ja vastaavia aminohappo jak- .* ! so ja koodaavien DNA-jaksojen kloonaamiseen ja ilmentämi- • * · I.,* seen käytetyt menetelmät, esimerkiksi oligonukleotidien synteesi, PCR, solujen transformointi, vektorien, ilmentä-30 misjärjestelmien ja muiden näitä vastaavien järjestelmien » konstruktiot ovat tällä alalla tunnettuja ja useimmat nii- i * t den käyttäjät tuntevat ne tavalliset lähtömateriaalit, : jotka vastaavat tiettyjä olosuhteita ja menetelmiä. Seu- * I · | raavat kappaleet on kuitenkin esitetty helpottamaan käsi- * * . 35 teltävien asioiden seuraamista ja selvittämään tarpeelli- 14 115057 set muutokset minkä lisäksi ne voivat toimia suuntaviivana .
Reseptoreja ja fuusioproteiineja koodaavien jaksojen kloonaus ja ilmentäminen 5 CD28IgCyl:tä ja B7IgCYl:tä vastaavat fuusio- proteiinikonstruktiot tämän keksinnön mukaisen CTLA4Ig:n luonnehtimiseksi ja CD28lg:n ja CTLA4Ig:n fuusiohybridien muodostaamiseksi valmistettiin julkaisussa Linsley, et ai., J. Exp. Med. 173 (1991) 721 - 730, esitetyllä taval-10 la, joka julkaisu on liitetty tähän keksintöön siihen oikeuttavien säädösten nojalla. cDNA-kloonit voidaan vaihtoehtoisesti valmistaa vakiomenetelmiä käyttäen RNA:sta, joka on saatu B7-antigeenia ja CD28-reseptoria ilmentävistä soluista, näiden proteiinien julkaistuja jaksoja kos-15 kevan tiedon perusteella (Aruffo ja Seed, sekä Freeman, edellä).
CTLA4Ig-fuusiot, jotka koostuivat CTLA4:n solun-ulkoista domeenia vastaavia aminohappojaksoja koodaavasta DNA:sta ja humaani-IgCyl:n sarana-, CH2- ja CH3-alueita 20 koodaavasta DNA:sta, konstruoitiin ligatoimalla PCR-frag-mentteja. Aminohappojaksoja koodaava cDNA amplifioitiin käyttäen polymeraasiketjureaktio ("PCR") -menetelmää [tätä « · jj j on käsitelty julkaisuissa US-patentti nro 4 683 195 ja US- :Y: patentti nro 4 683 202, Mullis, et ai.; ja Mullis & • · :**,· 25 Faloona, Methods Enzymol. 154 (1987) 335 - 350] . Hankit- : tiin käyttöön CTLA4lg-fuusiopolypeptidejä menetellen niin, • · .·, ; että hankittiin DNA:ta, joka koodasi aminohappojaksoja, • ► · jotka sisälsivät aminohapporyhmät CTLA4:n solunulkoista t · domeenia vastaavan aminohappojakson aseman 1 kohdalta ase-30 man 125 kohdalle, ja DNA:ta, joka koodasi Ig:n Cyl:n sara- « » 1 ··.·' na-, CH2- ja CH3-alueita vastaavia aminohappojaksoja.
• 1 1 *...· Koska CTLA4-reseptoriproteiinin ilmentämistä .·. : humaanilymfoidisoluissa ei ole aiemmin raportoitu, oli tarpeellista paikantaa CTLA4-mRNA:n lähtömateriaali. Seu- • . 35 lottiin PCR cDNA:ta, joka oli valmistettu useiden humaani- • · · * · > * · · » · 15 115057 leukemiasolulinjojen solujen kokonais-RNA:sta käyttäen alukkeina CTLA4-geenin julkaistusta jaksosta peräisin olevia oligonukleotideja (Dariavach, et ai., edellä). Paras odotettua kokoa olevien PCR-tuotteiden saanto tutkituista 5 cDNA-molekyyleistä saatiin H38-soluista (HTLV II:een liittyvä leukemiasolulinja). Koska CTLA4-geenistä ei tunnistettu CTLA4:n signaalipeptidiä, fuusioitiin CTLA4:n ennustetun jakson N-terminaalinen pää kahdessa vaiheessa onko-statiini M:n signaalipeptidiin [Malik, et ai., Molec. and 10 Cell. Biol. 9 (1989) 2847] käyttäen tuonnempana esimer keissä kuvattuja oligonukleotidejä. PCR-reaktion tuote ligatoitiin yhdessä Ig:n Cyl:n sarana-, CH2- ja CH3-aluei-ta vastaavia aminohappojaksoja koodaavan cDNA:n kanssa ilmentämisvektoriin, kuten CDMS:ään tai nLNrään.
15 Täysimittaista humaani-CTLA4:ää koodaavan DNA: n aikaansaamiseksi hankittiin H38-soluista käyttöön PCR:n avulla tuonnempana esimerkeissä kuvattuja oligonukleotidi-alukkeita käyttäen CTLA4:n transmembraani- ja sytoplasmi-sia domeeneja koodaava cDNA-molekyyli, joka liitettiin 20 CTLA4lg:stä peräisin olevaan fragmenttiin, joka oli saatu edellä kuvatulla tavalla ja joka koodasi CTLA4:n N-termi-naaliseen päähän fuusioitua onkostatiini M:n signaalipep-: tidiä. PCR-fragmentit ligatoitiin plasmidiin CDM8, josta saatiin tulokseksi täysimittaista CTLA4-geeniä koodaava .\ j 25 ilmentämisplasmidi, jolle annettiin nimitys OMCTLA4.
.·. : Hybridifuusioproteiineja vastaavaa aminohappojaksoa | koodaavan DNA:n konstruoimiseksi liitetään DNA, joka koo- daa yhden reseptorigeenin solunulkoisen domeenin osia vas- * · ··· taavia aminohappoja, DNA:hän, joka koodaa toisen resepto- 30 rigeenin solunulkoisen domeenin osia vastaavia aminohappo-ja sekä DNA:han, joka koodaa humaani-IgCyl:n sarana-, CH2- • · 1 ja CH3-alueita vastaavia aminohappojaksoja käyttäen edellä : B7Ig:n, CD28lg:n ja CTLA4Ig:n konstruktioita koskevia edellä kuvattuja valmistusmenetelmiä. Siten esimerkiksi . 35 DNA, joka koodaa aminohapporyhmiä, jotka vastaavat CD28- ♦ · » » · · · 16 115057 reseptorin solunulkoisen domeenin aminohappojaksoa aseman 1 kohdalta aseman 94 kohdalle, liitetään DNA:hän, joka koodaa aminohapporyhmiä, jotka vastaavat CTLA4-reseptorin solunulkoisen domeenin aminohappojaksoa aseman 94 kohdalta 5 aseman 125 kohdalle, sekä DNA:hän, joka koodaa humaani-Ig:n Cyl:n sarana-, CH2- ja CH3-alueita vastaavia amino-happojaksoja.
Jotta saataisiin valmistettua suuria määriä kloonattua DNA:ta, transformoidaan tämän keksinnön mukaisia 10 fuusiokonstruktioita koodaavan DNA:n sisältävät vektorit sopiviin isäntäsoluihin, kuten E. coli -bakteerisolulinjan MC1061/p3-kantaan (Invitrogen Corp., San Diego, CA) käyttäen vakiomenetelmiä ja pesäkkeistä seulotaan asianmukaiset plasmidit.
15 Kloonit, jotka sisältävät fuusiokonstruktioita koo- daavaa DNA:ta ja jotka on saatu edellä kuvatulla tavalla, transfektoidaan sitten sopiviin isäntäsoluihin niiden ilmentämistä varten. Transfektio suoritetaan käytetyn isäntäsolun mukaan näille soluille soveltuvia vakiomene-20 telmiä käyttäen. Esimerkiksi transfektio nisäkässoluihin suoritetaan käyttäen DEAE-dekstraanin avulla suoritettua transfektiota, saostamista yhdessä CaPCuin kanssa, lipofek-: tiota, elektroporaatiota tai protoplastifuusiota ja muita tällä alalla tunnettuja menetelmiä, joihin kuuluvat lysot- j 25 syymifuusio tai erytrosyyttifuusio, kaapiminen (scraping), • · .·, : suora soluihin kerääntyminen, osmoottinen tai sakkaroosi- » * · S' | sokki, suora mikroinjektio, epäsuora mikroinjektio, kuten • · · erytrosyytin välityksellä käytettävät menetelmät ja/tai • · ”* isäntäsolujen käsittely sähkövirralla. Edellä olevan luet- 30 telon transfektiomenetelmistä ei katsota olevan tyhjentä- ··.: vä, koska muita menetelmiä geneettisen informaation tuomi- * · · *...· seksi soluihin tullaan epäilemättä kehittämään.
: Ilmentäminen on edullista suorittaa monisoluisista organismeista peräisin olevissa eukaryoottisissa isäntä- • 35 soluviljelmissä [näitä on käsitelty teoksessa Tissue * · · » · · • · · a • i 115057 π
Cultures, Academic Press, Cruz ja Patterson, toim. (1973)]. Näillä järjestelmillä on lisäksi se etu, että ne kykenevät irrottamaan introneja ja niitä voidaan siten käyttää suoraan genomista peräisin olevien fragmenttien 5 ilmentämiseen. Käyttökelpoisiin isäntäsolulinjoihin kuuluvat kiinanhamsterin munasarja- (CHO), apinan munuais-(COS) , VERO- ja HeLa-solut. Tässä keksinnössä ovat edullisia solulinjat, joissa fuusiokonstruktioiden ilmentyminen on pysyvää.
10 Näille soluille soveltuviin ilmentämisvektoreihin sisältyy tavallisesti nisäkässolujen suhteen yhteensopivia promoottoreita ja ilmentymistä ohjaavia jaksoja, kuten esimerkiksi CMV:n promoottori (CDM8-vektori) ja avian sarcoma -virus (ASV) (nLN-vektori). Muihin tavallisesti 15 käytettyihin varhaisiin ja myöhäisiin promoottoreihin kuuluvat Simian Virus 40:stä (SV 40) peräisin olevat promoottorit [Fiers, et ai., Nature 273 (1973) 113] tai muista viruksista, kuten polyomasta, adenovirus 2:sta ja bovine papilloma -viruksesta peräisin olevat promoottorit. Voi-20 daan myös käyttää säännösteltävissä olevaa promoottoria, hMTIIrtä [Karin, et ai., Nature 299 (1982) 797 - 802].
Nisäkässoluisäntäjärjestelmien transformaatioiden yleisiä : :': näkökohtia on kuvannut Axel (julkaisu US-patentti nro • » * 1 4 399 216, joka on myönnetty 16.8.1983). Vaikuttaa nykyi-.·. ; 25 sin siltä, että "enhancer"-alueet ovat tärkeitä ilmentymi- t · .·. ; sen optimoimisessa; nämä ovat tavallisesti jaksoja, jotka * · * ! esiintyvät koodaamattomilla DNA-alueilla promoottorialuee- • · · seen nähden vastasuunnassa tai myötäsuunnassa. Replikaati- ·** on alkukohdat voidaan tarvittaessa saada käyttöön viruk- 30 sista. Liittyminen kromosomiin on kuitenkin yleinen meka- ...i nismi DNA-replikaation aikaansaamiseksi eukaryooteissa.
Vaikka fuusiokonstruktioiden ilmentämiseen soveltu- : viin edullisiin isäntäsoluihin kuuluvatkin eukaryoottiset • * · #>ti; solut, kuten COS- tai CHO-solut, voidaan isäntinä käyttää . 35 muitakin eukaryoottisia mikrobeja. Useimmin käytettyjä • * · ♦ » » » # # · » » 18 115057 ovat Saccharomyces cerevisiaen, leivontahiivan, laborato-riokannat, vaikka muidenkin kantojen, kuten Schizosacchar-omyces pomben, käyttö on mahdollista. Voidaan käyttää vektoreita, joissa käytetään esimerkiksi 2p-plasmidin repli-5 kaation alkukohtaa, Broach, Meth. Enz. 101 (1983) 307, tai muita hiivan suhteen yhteensopivia replikaation alkukohtia [tätä kysymystä on käsitelty esimerkiksi julkaisuissa Stinchcomb, et ai., Nature 282 (1979) 39; Tschempe, et ai., Gene 10 (1980) 157; ja Clarke, et ai., Meth. Enz. 101 10 (1983) 300] . Hiivavektoreiden transkriptiota ohjaaviin jaksoihin kuuluvat glykolyyttisten entsyymien synteesin promoottorit [Hess, et ai., J. Adv. Enzyme Reg. 7 (1968) 149; ja Holland, et ai., Biochemistry 17 (1978) 4900].
Muihin tällä alalla tunnettuihin promoottoreihin kuuluvat 15 CMV:n promoottori, joka saadaan käyttöön CDM8-vektorissa (Toyama ja Okayama, FEBS 268 (1990) 217 - 221; 3-fosfogly-seraattikinaasin promoottori [Hitzeman, et ai., J. Biol. Chem. 255 (1980) 2073] ja muiden glykolyyttisten entsyymien promoottorit. Muita promoottoreja, joilla on lisäksi se 20 etu, että transkriptio tapahtuu kasvuolosuhteiden säännös-telemänä, ovat alkoholidehydrogenaasi 2: n, isosytokromi C:n, happamen fosfataasin, typpimetaboliaan liittyvien * hajottavien entsyymien ja maltoosin ja galaktoosin hyväksy · sikäytöstä vastaavien entsyymien promoottorialueet. Arvel- .·. : 25 laan myös, että koodaavien jaksojen 3'-päässä olevat ter- .·, ; minaattorijaksot ovat haluttuja. Tällaisia terminaattori- • 1 · ! ! jaksoja esiintyy translaatioon osallistumattomalla 3'-puo- t t · leisella alueella, joka sijaitsee hiivasta peräisin ole- • 1 '···' vien geenien koodaavien jaksojen jälkeen.
30 Ilmentämiseen soveltuvina isäntinä voidaan vaihto- ehtoisesti käyttää prokaryoottisia soluja. Prokaryootteja • > » y·’ edustavat useimmin useat erilaiset E. coli -kannat; voi- .·, ; daan kuitenkin myös käyttää muita mikrobikantoja. Tavalli- ! sesti käytettyihin prokaryoottisiin transkriptiota ohjaa- . 35 viin jaksoihin, jotka tässä keksinnössä rajoitetaan niihin > i 1 > 19 115057 jaksoihin, joihin sisältyvät transkription aloittamiseen soveltuvat promoottorit, joissa on vaihtoehtoisesti operaattori sekä ribosomin sitoutumiskohdan jakso, kuuluvat sellaiset tavallisesti käytetyt promoottorit, kuten 5 beeta-laktamaasi- (penisillinaasi-) ja laktoosi- (lac) promoottorijärjestelmät [Chang, et ai., Nature 198 (1977) 1056], tryptofaani (trp) -promoottorijärjestelmä [Goeddel, et ai., Nucleic Acids Res. 8 (1980) 4057] ja lambdasta peräisin oleva PL-promoottori ja N-geenin ribosomin-10 sitoutumiskohta [Shimatake, et ai., Nature 292 (1981) 128] .
Nukleotidijaksoja, jotka koodaavat CD28Ig- ja CTLA4lg-proteiineja ja fuusiohybridiproteiineja, kuten CD28Ig:n ja CTLA4Ig:n yhdistelmää, voidaan ilmentää useis-15 sa erilaisissa edellä kuvatun tyyppisissä järjestelmissä. cDNA voidaan irrottaa sopivilla restriktioentsyymeillä ja ligatoida sopiviin prokaryoottisiin tai eukaryoottisiin ilmentämisvektoreihin tällaista ilmentämistä varten. Koska CD28- ja CTLA4-reseptoriproteiinit esiintyvät luonnossa 20 dimeereinä, arvellaan, että näiden proteiinien ilmentäminen vaatii ilmentämisjärjestelmää, jossa näiden proteiinien on mahdollista muodostua dimeereinä, ennen kuin on ; mahdollista saavuttaa suotuisa lopputulos. Näiden proteii- nien typistetyt muodot (toisin sanoen muodot, jotka ovat « · .·. : 25 muodostuneet lopetuskodonin lisäämisestä proteiinin trans- • « » #·# | membraanialuetta edeltävässä jaksossa olevaan asemaan) ‘ ! eivät näytä ilmentyvän. CD28:n ja CTLA4:n reseptorien il-
» I I
mentäminen fuusioproteiineina mahdollistaa näiden proteii-’···* nien dimeerien muodostumisen. CTLA4-proteiinin ilmentämä- 30 nen fuusiotuotteena on edullista tässä keksinnössä.
Tämän keksinnön mukainen pysyvä CHO-solulinja, joi-
I | I
le annettiin nimitys kiinanhamsterin munasar jasolulinja ,·’ : CTLA4Ig-24, on edullinen CTLA4Ig:n ilmentämiseen ja se on • · * talletettu 31.5.1991 Budapestin sopimuksen mukaisesti . 35 ATCC:hen ja sille on annettu ATCC:n hakunumero 10 762.
* i * t I « • I I · 20 115057 Tämän keksinnön mukaista CTLA4-reseptoria ilmennetään transfektoimalla solulinja, kuten COS-solut, ja ilmentyminen havaitaan sillä perusteella, että CTLA4:llä transfektoidut solut sitoutuvat CTLA4-reseptorin ligan-5 diin, esimerkiksi tutkimalla soluista niiden sitoutuminen B7Ig-fuusioproteiiniin.
Tulokseksi saatujen konstruktioiden jaksot varmistetaan DNA:n sekvenssoinnilla käyttäen tunnettuja menetelmiä, esimerkiksi julkaisussa Sanger, et ai., Proc. Natl. 10 Acad. Sei. USA 74 (1977) 5463, kuvattua menetelmää, jota on kuvattu tarkemmin vielä julkaisussa Messing, et ai., Nucleic Acids Res. 9 (1981) 309, tai käyttäen Maxam, et al.':n menetelmää, Methods Enzymol. 65 (1980) 499.
Proteiinituotteiden talteenotto 15 Kuten edellä mainittiin, CD28- ja CTLA4-reseptori- geenit eivät ilmenny helposti kypsinä proteiineina ilmentämällä suoraan typistettyä proteiinia koodaavaa DNA:ta. Jotta olisi mahdollista muodostaa homodimeeri, yhdistettiin asianmukaisella tavalla proteiineja muokkaamaan kyke-20 nevissä soluissa CD28:n ja CTLA4:n solunulkoisia domeeneja vastaavaa aminohappojaksoa koodaava DNA, joka sisältää signaalijakson kodonit, kuten onkostatiini M:n signaali- : jakson kodonit, luontaisesti dimeerisen proteiinin Fc-do- meenia vastaavaa aminohappo jaksoa koodaavaan DNA: hän. Näi-: 25 den fuusioproteiinituotteiden puhdistuksessa niiden eri- * · t .·, ; tyttyä soluista ovat avuksi vasta-aineet, jotka reagoivat f.‘ ! fuusioproteiinien anti-immunoglobuliiniosan kanssa. Kun fuusioproteiinituote on erittynyt mediumiin, se otetaan talteen tavallisten proteiinien puhdistusmenetelmien avul-30 la, esimerkiksi käsittelemällä se proteiini A -pylväissä.
Käyttö * t » CTLA4Ig:n on tässä keksinnössä osoitettu olevan in .*. : vitro -olosuhteissa sellaisten lymfosyyttien toimintojen * » · ,)1(; voimakas inhibiittori, joissa tarvitaan T- ja B-solujen . 35 vuorovaikutusta. Tämä viittaa B7-antigeenin ja sen vastin- * · » * t 21 115057 reseptorien, CTLA4:n ja/tai CD28:n välisten vuorovaikutusten tärkeyteen. Muriini- ja humaani-CTLA4-molekyylien sytoplasmiset domeenit ovat samanlaiset (Dariavach, et ai., edellä, 1988), mikä viittaa siihen, että tällä 5 alueella on tärkeitä toiminnallisia ominaisuuksia. CD28:n ja CTLA4:n sytoplasmisilla domeeneilla on myös homologiaa keskenään.
CTLA4 on in vitro -olosuhteissa voimakkaampi lymfo-syyttivasteiden inhibiittori kuin kumpikaan anti-BBl- tai 10 anti-CD28-mAb-molekyyleistä. CTLA4Ig:llä ei ole sellaisia suoria stimuloivia vaikutuksia T-solujen lisääntymiseen, joiden vaikutukset olisivat vastakkaisia sen inhibitori-sille vaikutuksille.
Tämän keksinnön mukaisessa sovellutusmuodossa käy-15 tetään T-solujen vuorovaikutusten säännöstelemiseksi muita reagensseja, joihin kuuluvat CTLA4Ig-fuusioproteiinin tai CTLA4-reseptorin kanssa reagoimaan kykenevät johdannaiset. Voidaan esimerkiksi seuloa esiin vasta-aineita ja/tai vasta-ainefragmentteja, jotka kykenevät reagoimaan CTLA4-20 reseptorin kanssa, sellaisten muotojen tunnistamiseksi, jotka kykenevät inhiboimaan CTLA4Ig-fuusioproteiinin sitoutumista B7-antigeeniin.
: Keksinnön mukaisia monoklonaalisia vasta-aineita, * » » * jotka kykenevät reagoimaan CTLA4-reseptorin kanssa, voi-: 25 daan valmistaa hybridoomien avulla, jotka on tehty tunne- ; tuilla menetelmillä, kuten Kohler'in ja Milstein'in * tm I käyttöön tuomilla menetelmillä [tätä on käsitelty julkai- h.· sussa Kohler ja Milstein, Nature, 256 (1975) 495 - 97], ja • · *···* näiden modifikaatioilla solujen vuorovaikutusten säännös- 30 telemiseksi.
...*·* Näihin menetelmiin liittyy sellaisen eläimen käyt-
* * I
ί,,,·’ tö, joka on herkistetty (primed) valmistamaan tiettyä .·, ; nimenomaista vasta-ainetta. Eläin voidaan herkistää ruis- • s · I kuttamalla siihen immunogeeniä (esimerkiksi B7Ig-fuusio- . 35 proteiinia, CTLA4Ig-fuusioproteiinia tai CD28lg/CTLA4Ig- * » · • » · · 22 115057 hybridifuusioproteiinia) halutun immuunivasteen aikaansaamiseksi, toisin sanoen vasta-aineiden tuottamiseksi herkistetystä eläimestä. Herkistetty eläin on myös sellainen, jossa sairaus ilmenee. Tiettyä nimenomaista vasta-5 ainetta voidaan hakea käyttäen lymfosyyttejä, jotka ovat peräisin herkistettyjen sairaiden eläinten imusolmukkeista, pernoista tai periferaalisesta verestä. Haluttuja immunoglobuliineja koodaavien lymfosyyttien kromosomit tehdään kuolemattomiksi fuusioimalla lymfosyytit myelooma-10 soluihin tavallisesti fuusioitumisen aikaansaavan aineen, kuten polyetyleeniglykolin (PEG) läsnä ollessa. Fuusio-partnerina voidaan vakiomenetelmiä noudattaen käyttää mitä tahansa useista myeloomasolulinjoista, esimerkiksi P3-NSl/l-Ag4-l-, P3-x63- Ag8.653-, Sp2/0-Agl4- tai HL1-653- 15 myeloomasolulinjoja. Nämä myeloomalinjat ovat saatavilla talletuslaitoksesta ATCC, Rockville, Maryland.
Tulokseksi saatuja soluja, joihin halutut hybri-doomat sisältyvät, kasvatetaan sitten selektiomediumissa, kuten HAT-mediumissa, jossa fuusioitumattomat parentaali-20 set myelooma- tai lymfosyyttisolut lopulta kuolevat. Ainoastaan hybridoomasolut jäävät eloon ja niitä voidaan kasvattaa rajalaimennusolosuhteissa erillisten kloonien ai-: kaansaamiseksi. Näiden hybridoomien supernatanteista seu- lotaan esiin ne, joiden spesifisyys on halutunlaista, esi- ; 25 merkiksi immunisointiin käytetyn CTLA4Ig-proteiinin avulla • » * tehtävillä immunomääritysmenetelmillä. Positiiviset kloo- » · · ; j nit voidaan sitten jatkokloonata rajalaimennusolosuhteissa • · » ’· ” ja eristää niiden tuottama monoklonaalinen vasta-aine.
Monoklonaalisten vasta-aineiden eristämiseen ja 30 puhdistamiseen voidaan käyttää useita erilaisia tavanomai-siä menetelmiä, joilla ne on tarkoitus puhdistaa muista proteiineista ja kontaminanteista. Monoklonaalisten vasta- * t # .* . aineiden puhdistamiseen tavallisesti käytettyihin menetel- • · · ; miin kuuluvat ammoniumsulfaattisaostus, ioninvaihtokroma- • ft·» 35 tografia ja affiniteettikromatografia [tätä on käsitelty * t · • · # » 23 115057 julkaisussa Zola, et ai., teoksessa Monoclonal Hybridoma Antibodies: Techniques and Applications, Hurell, toim., s.
51 - 52 (CRC Press, 1982)]. Näiden menetelmien mukaisesti valmistettuja hybridoomia voidaan kasvattaa in vitro- tai 5 in vivo -olosuhteissa (askites-nesteessä) käyttäen tällä alalla tunnettuja menetelmiä [näitä on käsitelty yleisesti julkaisussa Fink, et ai., Prog. Clin. Pathol., 9 (1984) 121 - 33, kuva 6-1 sivulla 123].
Yhtä yksittäistä solulinjaa voidaan tavallisesti 10 kasvattaa in vitro -olosuhteissa esimerkiksi laboratorio-kudosviljelypulloissa ja kudosviljelymedium, joka sisältää suuria konsentraatioita yhtä spesifistä monoklonaalista vasta-ainetta, voidaan ottaa talteen dekantoimalla, suodattamalla tai sentrifugoimalla.
15 Voidaan lisäksi valmistaa näiden vasta-aineiden aktiivisen sitovan alueen sisältäviä fragmentteja, kuten Fab-, F(ab')2_ ja Fv-fragmentteja, jotka sisältävät aktiivisen sitovan alueen, jotka kykenevät reagoimaan CTLA4-reseptorin solunulkoisen domeenin kanssa. Näitä fragment-20 teja voidaan valmistaa käyttäen tällä alalla hyväksyttyjä menetelmiä (näitä on käsitelty esimerkiksi julkaisussa Rousseaux, et ai., teoksessa Methods Enzymol. 121 (1986) ; 663 - 69, Academic Press) .
Monoklonaalisia anti-CTLA4-vasta-aineita voidaan » · ,: 25 käyttää in vitro niin, että ne saatetaan sitoutumaan ^ CTLA4-reseptoriin CTLA4-positiivisten T-solujen ja muiden ! [ solujen kesken tapahtuvien vuorovaikutusten inhiboimisek- * 0 | • » · si.
* ·
Toisessa sovellutusmuodossa voidaan CTLA4Ig- 30 fuusioproteiinia käyttää muiden sellaisten yhdisteiden » tunnistamiseen, joilla CTLA4:n ja B7-antigeenin välistä
I I I
vuorovaikutusta kyetään säännöstelemään. Näihin ,·’ : yhdisteisiin voi kuulua pieniä luonnossa esiintyviä * t · ! molekyylejä, joita voidaan käyttää siten, että ne . 35 saatetaan reagoimaan B-solujen ja/tai T-solujen kanssa.
I | * » · 24 115057
Fermentaatioliuoksista voidaan esimerkiksi tutkia niiden kykyä inhiboida CTLA4:n ja B7:n välisiä vuorovaikutuksia.
Seuraavat esimerkit on esitetty tämän keksinnön kuvaamiseksi ja olemaan alan ammattimiehen tukena sen so-5 veltamisessa ja käytössä. Esimerkkien tarkoituksena ei ole millään muulla tavoin rajoittaa tämän keksinnön suojapii-riä.
Esimerkki 1 B7Ig- ja CD28Ig-fuusioprote±±n±en valmistus 10 Reseptorin ja immunoglobuliinin C-gamma (Ig:n Cy) fuusioproteiinit B7Ig ja CD28Ig valmistettiin julkaisussa Linsley, et ai., J. Exp. Med. 173 (1991) 721 - 730, kuvatulla tavalla, joka julkaisu on liitetty tähän keksintöön siihen oikeuttavien säädösten nojalla. Valmistus tapahtui 15 pääpiirteittäin siten, että reseptoriproteiinia (esimerkiksi B7:ää) vastaavia aminohappojaksoja koodaava DNA liitettiin humaani-Ig:n Cyl:n sarana-, CH2- ja CH3-alueita vastaavia aminohappojaksoja koodaavaan DNA:han. Suoritukseen käytetyt vaiheet olivat seuraavat.
20 Polymeraasiketjureaktio (PCR) PCR:n ollessa kyseessä amplifioitiin DNA-fragmentit tuonnempana kuvattuja kullekin fuusioproteiinille soveltu-·,· · via alukepareja käyttäen. PCR-reaktiot (lopullinen tila- :: : vuus 0,1 ml) suoritettiin julkaisussa Kawasaki, teoksessa 25 PCR Protocols, Academic Press, s. 21 - 27 (1990) kuvatulla • · tavalla, joka julkaisu on liitetty tähän keksintöön siihen • · .·. : oikeuttavien säädösten nojalla), Taq-polymeraasipuskurissa • * · .···[ (Stratagene, La Jolla, CA) , joka sisälsi 20 mikromoolia • » kutakin dNTP-molekyyliä; 50 - 100 pikomoolia mainittuja 30 alukkeita; templaatin (1 ng plasmidia tai cDNArta, joka I I » ··;· oli syntetisoitu < 1 pg:sta kokonais-RNA: ta käyttäen sa- • » tunnaista heksameeristä aluketta ja Taq-polymeraasia :*·,» (Stratagene) . Reaktiot suoritettiin lämpökäsittelyn ....: jaksotuslaitteessa (thermocycler) (Perkin Elmer Corp., 35 Norwalk, CT) 16 - 30 syklin ajan (tyypillinen sykli koos- 25 115057 tui vaiheista, jotka olivat 1 min 94 °C:ssa, 1-2 min 50 °C:ssa ja 1 - 3 min 72 °C:ssa).
Plasmidien konstruktio
Ilmentämisplasmidit, jotka sisälsivät CD28:aa koo-5 daavaa cDNA:ta ja jotka on kuvattu julkaisussa Aruffo ja Seed, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 84 (1987) 8573, saatiin
Dr. Aruffolta ja Dr. Seed'iltä (Mass General Hospital, Boston, MA) . Plasmidit, jotka sisälsivät CD5:ttä koodaavaa cDNArta ja jotka on kuvattu julkaisussa Aruffo, Cell 61 10 (1990) 1303, saatiin Dr. Aruffolta. Plasmidit, jotka si sältävät B7:ää koodaavaa cDNArta ja jotka on kuvattu julkaisussa Freeman, et ai., J. Immunol. 143 (1989) 2 714, saatiin Dr. Freeman'ilta (Dana Farber Cancer Institute, Boston, MA). Ensimmäisiin yrityksiin CD28:n ja B7:n liu-15 koisten muotojen ilmentämiseksi tehtiin julkaisussa
Linsley, et ai., J. Exp. Med., edellä, kuvatulla tavalla konstruktiot (OMCD28 ja 0MB7), joihin lisättiin transmem-braanisten domeenien suhteen vastasuuntaan sijaitsevat lopetuskodonit ja joissa natiivit signaalipeptidit kor-20 vattiin onkostatiini Mrstä saadulla signaalipeptidillä [Malik, et ai., Mol. Cell Biol. 9 (1989) 2847]. Nämä valmistettiin käyttäen synteettisiä oligonukleotidejä uudel-: i i leenkonstruktiota varten (OMCD28) tai alukkeina (OMB7) » ♦ f ! PCRrää varten. OMCD28 on CD28-cDNA, jota on sen tehokkaam-25 man ilmentymisen aikaansaamiseksi modifioitu korvaamalla • .·. : signaalipeptidi onkostatiini Mrstä peräisin olevalla ana- | logisella alueella. CD28Ig- ja B7Ig-fuusiokonstruktiot valmistettiin kahdessa osassa. 5'-puoleiset osat valmis-·* tettiin käyttäen templaatteina OMCD28raa ja OMB7rää ja 30 eteenpäin suuntautuvana alukkeena oligonukleotidiä
:: CTAGCCACTGAAGCTTCACCATGGGTGTACTGCTCACAC
• · (jaksotunniste nro 1) (tämä koodaa aminohappojaksoa, joka . 35 vastaa onkostatiini Mm signaalipeptidiä) ja näitä vas- • · • » « » · · * 26 115057 taavina käänteisiä alukkeina joko oligonukloetidiä
TGGCATGGGCTCCTGATCAGGCTTAGAAGGTCCGGGAAA
5 (jaksotunniste nro 2) tai oligonukleotidiä
TTTGGGCTCCTGATCAGGAAAATGCTCTTGCTTGGTTGT
(jaksotunniste nro 3). PCR-reaktioiden tuotteet pilkottiin 10 restriktioendonukleaaseilla (Hind III ja Bel I), katkaisukohtien kohdalta, jotka oli valmistettu PCR-alukkeisiin, ja ne puhdistettiin geelissä.
Fuusiokonstruktioiden humaani-Ig:n Cyl-jaksoja vastaava 3'-puoleinen osa valmistettiin yhdistetyllä kään-15 teistranskriptaasi (peräisin avian myeloblastosis -viruksesta; Life Sciences Associates, Bayport, NY) -PCR-reak-tiolla käyttäen templaattina RNA:ta, jota oli peräisin myeloomasolulinjasta, joka tuotti kimeeristä humaani-mu-riini-mAb-L6:tta (tämä saatiin Dr. P. Fell'iltä ja M.
20 Gaylelta, Bristol-Myers Squibb Company, Pharmaceutical Research Institute, Seattle, WA) . Eteenpäin suuntautuvana alukkeena käytettiin oligonukleotidiä
: V. AAGCAAGAGCATTTTCCTGATCAGGAGCCCAAATCTTCTGACAAAACTCACACATCCC
: 25 CACCGTCCCCAGCACCTGAACTCCTG
» · · • · • · • · * • i » ! (jaksotunniste nro 4) ja käänteisenä alukkeena • ti oligonukleotidiä
30 CTTCGACCAGTCTAGAAGCATCCTCGTGCGACCGCGAGAGC
Ml (jaksotunniste nro 5). Reaktiotuotteet pilkottiin Bcllrllä : ja Xbalrllä ja ne puhdistettiin geelissä. Lopulliset » · konstruktiot koottiin ligatoimalla Hindlllrlla ja Bell:11a . 35 pilkotut fragmentit, jotka sisälsivät CD28- tai B7-jakso-
I I I
11 5057 27 ja, sekä Bcllrllä ja Xbalrllä pilkottu fragmentti, joka sisälsi IgCyl-jaksot, HindIII:lla ja Xbalrllä pilkottuun CDM8:aan. Ligaatiotuotteet transformoitiin MC1061/p3-E. coli -soluihin ja pesäkkeistä seulottiin esiin asianmu-5 kaisia plasmideja sisältävät pesäkkeet. Tulokseksi saatujen konstruktioiden jaksot varmistettiin sekvenssoimalla niiden DNA.
B7:ää koodaava konstruktio sisälsi sellaisia aminohappoja koodaavaa DNA:ta, jotka vastaavat B7:n solunulkoi- 10 sen domeenin aseman 1 kohdalta aseman 215 kohdalle ulottuvia aminohapporyhmiä. CD28:aa koodaava konstruktio sisälsi sellaisia aminohappoja koodaavaa DNA:ta, jotka vastaavat CD28:n solunulkoisen domeenin aseman 1 kohdalta aseman 134 kohdalle ulottuvia aminohapporyhmiä.
15 CD5Ig konstruoitiin samalla tavalla käyttäen eteenpäin suuntautuvana alukkeena oligonukleotidia
CATTGCACAGTCAAGCTTCCATGCCCATGGGTTCTCTGGCCACCTTG
20 (jaksotunniste nro 6) , ja käänteisenä alukkeena oligo nukleotidia
ATCCACAGTGCAGTGATCATTTGGATCCTGGCATGTGAC
25 (jaksotunniste nro 7) . PCR-tuote pilkottiin restriktio- .·. : endonukleaaseilla ja ligatoitiin Ig:n Cylrn fragmenttiin ,·, ; edellä kuvatulla tavalla. Tulokseksi saatu konstruktio !..* (CD5lg) koodasi kypsää proteiinia, jonka aminohappo jakso oli sellainen, että se sisälsi CD5:ttä vastaavan jakson 30 aminohapporyhmät asemasta 1 asemaan 347, kaksi amino- · happoa, jotka olivat syntyneet konstruktion suoritukseen käytetyistä vaiheista (aminohapot DQ), joiden jälkeen tulee Igrn Cylrn sarana-aluetta vastaavia aminohappoja koodaava DNA.
35 28 115057
Soluviljely ja transfektiot COS-solut (apinan munuaissolut) transfektoitiin CD28:aa ja B7:ää ilmentävillä ilmentämisplasmideilla käyttäen Seed'in ja Aruffo'n [Proc. Natl. Acad. Sei. 84 (1987) 5 3365] menetelmän muunnosta, joka julkaisu on liitetty tä hän keksintöön siihen oikeuttavien säädösten nojalla. Soluja lisättiin 18 - 24 h ennen transfektiota niiden kasvattamiseksi käyttäen solumääränä 106 solua halkaisijaltaan 10 cm:n suuruista solunviljelymaljaa kohti. Plasmidi-DNA 10 lisättiin (noin 15 pg/malja) 5 ml:n tilavuudessa seerumi-tonta DMEMrää, joka sisälsi 0,1 mM klorokiiniä ja 600 pg/ ml DEAE-Dextrania, ja soluja inkuboitiin 3 - 3,5 h 37 °C:ssa. Transfektoidut solut käsiteltiin sitten lyhyen aikaa (noin 2 minuuttia) 10-prosenttisella dimetyylisulf-15 oksidilla PBS:ssä ja niitä inkuboitiin 37 °C:ssa 16 - 24 h DMEMissä, jotka sisälsi 10 % FCS:ää. 24 h transfektion jälkeen viljelymedium poistettiin ja korvattiin seerumit-tomalla DMEMrllä (6 ml/malja). Inkubointia jatkettiin 3 päivää 37 °C:ssa, jona ajankohtana kasvatukseen käytetty 20 medium koottiin talteen ja maljoihin lisättiin tuoretta seerumitonta mediumia. 3 päivän jatkoikuboinnin jälkeen 37 °C:ssa solujen kasvatukseen käytetty medium koottiin * : : uudelleen talteen ja solut heitettiin pois.
CD28:aa, CD5:ttä tai B7: ää ilmentävät CHO-solut 25 eristettiin julkaisussa Linsley, et ai., (1991), edellä, • · .·. : kuvatulla tavalla seuraavasti: suoritus tapahtui pääpiir- • · · ,·, . teittäin siten, että CD28:aa, CD5:ttä tai B7:ää ilmentävät • < · transfektantit eristettiin sellaisen yhteistransfektion • «
• I
“* jälkeen, jossa dihydrofolaattireduktaasin suhteen vailli- 30 naiset kiinanhamsterin munasarja (dhfr- CHO) -solut oli * · · ····’ transfektoitu asiaankuuluvan ilmentämisplasmidin ja selek- • « · ·...* tiomarkkerin, pSV2dhfr:n, yhdistelmällä [Linsley, et ai.,
Proc. Natl. Acad. Sei. USA 87 (1990) 5031], joka julkaisu on liitetty tähän keksintöön siihen oikeuttavien säädösten 35 nojalla. Transfektantit kasvatettiin sitten nousevien me- 29 115057 totreksaattikonsentraatioiden läsnä ollessa siten, että lopulliseksi pitoisuudeksi tuli 1 μΜ, ja niitä kasvatettiin DMEMrssä, jota oli täydennetty 10-prosenttisella fet-aalisella naudanseerumilla (FBS), 0,2-millimolaarisella 5 proliinilla ja 1-mikromolaarisella metotreksaatilla. CHO- solulinjat, jotka ilmensivät suuria CD28- (CD28+ CHO) tai B7- (B7+ CHO) pitoisuuksia, eristettiin käyttäen useita kierroksia fluoresenssilla aktivoituvaa solulajittelua (FACSR) , jonka jälkeen käytettiin 9.3- tai BB-l-mAb-mole-10 kyyleillä tehtyä epäsuoraa immunovärjäystä. CD28:lla transfektoiduista populaatioista eristettiin FACSR:llä myös amplifioituja CHO-soluja, jotka olivat negatiivisia solujen pinnalla ilmentyvien CD28:n tai B7:n (dhfr+ CHO) suhteen.
15 Immunovärjäys ja EACSR-analyysi
Transfektoidut CHO- tai COS-solut tai aktivoidut T-solut analysoitiin epäsuoralla immunovärjäyksellä. CHO-solut poistettiin viljelypulloistaan ennen värjäystä inku-boimalla niitä PBSrssä, joka sisälsi 10 mM EDTAra. Soluja 20 inkuboitiin ensin muriini-mAb-molekyylien 9.3 [Hansen, et ai., Immunogenetics 10 (1980) 247) tai BB-1 (Yokochi, et ai., J. Immunol. 128 (1981) 823] kanssa tai Ig-fuusio- :: : proteiinien kanssa (näiden kaikkien konsentraatio oli :Y; 10 pg/ml DMEMrssä, joka sisälsi 10-prosenttista FCS:ää) 25 1 - 2 h 4 °C:ssa. Tämän jälkeen solut pestiin ja niitä • » .·. ; inkuboitiin vielä 0,5 - 2 h 4 °C:ssa FITCrllä konjugoidun • * 1 t’t l toisen vaiheen reagenssin kanssa [vuohessa tehty anti-mu- riini-Ig-seerumi muriini-mAb-molekyylien kyseessä ollessa • » • t *·· tai vuohessa tehty anti-humaani-Ig Cy -seerumi fuusio- 30 proteiinien kyseessä ollessa (Tago, Inc., Burlingame, CA) ] . Fluoresenssi analysoitiin FACS IVR -solulajittelijal- * « « ·...· la (Becton Dickinson and Co., Mountain View, CA), joka oli .·. : varustettu neljän dekadin logaritmisella vahvistimella.
• · » » * » i * · t · · 30 115057
Ig-fuusioproteiinien puhdistus
Ensimmäistä, toista ja kolmatta koottua erää solujen kasvatukseen käytetystä seerumittomasta kasvatusmedi-umista, joka oli peräisin transfektoiduista COS-soluista, 5 käytettiin lähtömateriaalina Ig-fuusioproteiinien puhdistamiseen. Pienellä nopeudella sentrifugoimalla suoritetun solujätteiden poiston jälkeen medium johdettiin immobili-soitua proteiini A:ta sisältävään pylvääseen (Repligen Corp., Cambridge, MA) (noin 200 - 400 ml mediumia kutakin 10 pakatun geelitilavuuden millilitraa kohti), joka oli tasapainotettu 0,05 M natriumsitraatilla, jonka pH oli 8,0. Mediumin pylvääseen lisäämisen jälkeen pylväs pestiin 1 M kalieumfosfaatilla, jonka pH oli 8, ja sitoutunut proteiini eluoitiin 0,05 M natriumsitraatilla, jonka pH oli 3.
15 Pylväästä koottiin fraktioita, jotka neutraloitiin välittömästi lisäämällä 1/10 niiden tilavuudesta 2 M Tris'iä, jonka pH oli 8. A28o:ssa absorboivan materiaalin huipun sisältävät fraktiot yhdistettiin ja dialysoitiin PBSrää vastaan ennen käyttöä. CD28Ig:n ja B7Ig:n molaariset absorp-20 tiokertoimet olivat 2,4 ja 2,8 ml/mg, vastaavassa järjestyksessä mainittuna, määritettynä absorbanssiltaan tunnettujen liuosten aminohappoanalyysin perusteella. Puhdiste-i tun CD28lg:n ja B7Ig:n sitoutumisaktiivisuuksien saannot i » · * olivat lähes kvantitatiiviset arvioituna B7+- ja CD28+- • · : 25 CHO-solujen epäsuoran fluoresenssivärjäyksen jälkeen tehdyn • * o .·. : FACS -analyysin perusteella.
* · *
Esimerkki 2 • # · • · * !.. ‘ CTLA4Ig-fuusioproteiinin valmistus • * ·"' CTLA4lg:tä koodaava liukoinen geneettinen fuusio 30 CTLA4:n solunulkoisen domeenin ja IgCyl-domeenin välillä
« t I
konstruoitiin samoin kuin edellä kuvattu CD28Ig:n konst- i « » ·,,,· ruktio. CTLA4-geenin solunulkoinen domeeni kloonattiin .·. : PCR:llä käyttäen synteettisiä oligonukleotideja, jotka • * · • | vastasivat julkaistua jaksoa [Dariavach, et ai., Eur.
• · . 35 Jour. Immunol. 18 (1988) 1 901 - 1 905].
i · I · · I · I · · · » * * 31 115057
Koska CTLA4-geenistä ei tunnistettu CTLA4:n signaalipeptidiä, liitettiin CTLA4:n ennustetun jakson N-terminaalinen pää onkostatiini M:n signaalipeptidiin [Malik, et ai., Mol. and Cell. Biol. 9 (1989) 2847] kah-5 dessa vaiheessa käyttäen limittäisiä oligonukleotideja.
Ensimmäisen vaiheen ollessa kyseessä käytettiin eteenpäin suuntautuvana alukkeena oligonukleotidia
CTCAGTCTGGTCCTTGCACTCCTGTTTCCAACCATGGCGAGCATGGCAATGCACGTG-10 GCCCAGCC
(jaksotunniste nro 8) (joka koodasi CTLA4:n 7 N-terminaa-liseen aminohappoon liitettyjä onkostatiini M:stä peräsin olevan signaalipeptidin 15 C-terminaalista aminohappoa), 15 ja käänteisenä alukkeena oligonukleotidia
TTTGGGCTCCTGATCAGAATCTGGGCACGGTTG
(jaksotunniste nro 9) (joka koodasi aminohapporyhmiä 119 - 125 20 CTLA4-reseptoria koodaavasta aminohappojaksosta ja joka sisältää Bel I -restriktioentsyymikohdan). Tämän vaiheen templaatti oli cDNA, joka oli syntetisoitu 1 pg:sta H38 ' ; soluista peräisin olevaa kokonais-RNA:ta (HTLV-II:lla ;Y; infektoitu T-soluleukemiasolulinja, joka oli saatu Dr.
*.J 25 Salahudin'ilta ja Dr. Gallo'lta, NCI, Bethesda, MD). Osa ·.: ensimmäisestä vaiheesta peräisin olevasta PCR-tuotteesta ·.; amplifioitiin uudelleen käyttäen limittäistä eteenpäin suuntautuvaa aluketta, joka koodaa onkostatiini M: n *’* signaalipeptidin N-terminaalista osaa ja joka sisältää 30 Hind III -restriktioendonukleaasikohdan, > · · »
:: CTAGCCACTGAAGCTTCACCAATGGGTGTACTGCTCACACAGAGGACGCTGCTCAGTC
: TGGTCCTTGCACTC
» · ·
t I t * I
32 115057 (jaksotunniste nro 10) ja samaa käänteistä aluketta. PCR-reaktiotuote pilkottiin Hind 111:11a ja Bcl I:llä ja ligatoitiin yhdessä Bcl Irllä ja Xba I:llä pilkotun ja Ig:n Cyl:n sarana-, CH2- ja CH3-alueita vastaavia amino-5 happojaksoja koodaavan cDNA-fragmentin kanssa Hind 111:11a ja Xba I:llä pilkottuun CDM8-ilmentämisvektoriin tai Hind III :11a ja Xba I:llä pilkottuun nLN-ilmentämisvektoriin (tämä oli saatu Dr. Aruffo'lta).
Tulokseksi saadun CTLA4Ig-fuusiokonstruktion kartta 10 on esitetty kuviossa 1. Tässä kuviossa olevat jaksot esittävät CTLA4:n (isot kirjaimet, varjostamattomat alueet) ja onkostatiini M:n signaalipeptidin, SP, (tummat varjostetut alueet) sekä Ig:n Cyl:n sarana-alueen (H) (pilkutetut alueet) toisiinsa liitettyjä jaksoja. Suluissa oleva amino-15 happo muodostu konstruktiota tehtäessä. Asteriskit (*) osoittavat mutaatioita kysteiinistä seriiniksi, jotka muodostettiin Ig:n Cy:n sarana-alueeseen. Kuvioon on merkitty CTLA4:ssä oleva immunoglobuliiniyläryhmän V:tä muistuttava domeeni, sekä Ig:n Cyl:n CH2- ja CH3-domeenit.
20 CTLA4Ig:n sisältävät CDM8-ilmentämisplasmidit transfektoitiin sitten COS-soluihin DEAE/dekstraani-transfektiolla, joka oli suoritettu Seed'in ja Aruffo'n, • 1987, edellä, kuvaaman suoritusohjeen modifikaatiota : (Linsley, et ai., 1991, edellä) käyttäen.
,· 25 Ilmentämisplasmidikonstruktiot (nLN tai CDMS) , jot- : ka sisälsivät CTLA4Ig:n aminohappo jaksoa koodaavan cDNA:n, .·. : transfektoitiin lipofektiolla vakiomenetelmiä käyttäen • t · dhfr~ CHO-solulinjoihin sellaisten uusien solulinjojen aikaansaamiseksi, jotka ilmensivät pysyvästi CTLA4Ig:tä.
30 CTLA4Ig:tä vastaavaa aminohappojaksoa koodaava DNA
on talletettiin 31.5.1991 Budapestin sopimuksen mukaisesti ATCC:hen ja sille annettiin ATCC:n hakunumero 68 629.
Edullinen CTLA4Ig:tä ilmentävä pysyvä transfektant-ti, jolle annettiin nimitys kiinanhamsterin munasarjasolu-35 linja CTLA4Ig-24, tehtiin seulomalla immunovärjäyksen I I t I | 33 115057 avulla B7-positiivisista CHO-solulinjoista mediumissa olevaa B7:ää sitovaa aktiivisuutta. Transfektantteja kasvatettiin DMEMtssä, jota oli täydennetty 10-prosenttisella fetaalisella naudanseerumilla (FBS), 0,2-millimolaarisella 5 proliinilla ja 1-mikromolaarisella metotreksaatilla.
CHO-solulinja CTLA4Ig-24 talletettiin 31.5.1991 Budapestin sopimuksen mukaisesti ATCC:hen ja sille on annettiin ATCC:n hakunumero 10 762.
CTLA4Ig puhdistettiin proteiini A -kromatografiällä 10 seerumittomista solujen kasvatukseen käytetyistä superna-tanteista (kuvio 2). CTLA4Ig:n konsentraatiot määritettiin olettaen molaarisen aabsorptiokertoimen 280 nm:n kohdalla olevan 1,6 (määritetty kokeellisesti absorbanssiltaan tunnetun liuoksen aminohappoanalyysillä). Moolimassastandar-15 deille (kanavat 1 ja 3, kuvio 2) ja CTLA4Ig-näytteille (1 pg) (kanavat 2 ja 4) tehtiin SDS-PAGE (4 - 12 % akryy-liamidigradientti) pelkistämättömissä olosuhteissa (-βΜΕ, kanavat 1 ja 2) tai pelkistävissä olosuhteissa (+βΜΕ, kanavat 3 ja 4) . Proteiinit visualisoitiin värjäämällä ne 20 Coomassie Brilliant Blue -väriaaineella.
CTLA4Ig liikkui pelkistämättömissä olosuhteissa molekyylityyppinä, jonka Mr oli noin 100 000 ja pelkistä-vissä olosuhteissa molekyylityyppinä, jonka Mr oli noin Y: 50 000 (kuvio 2). Koska Ig:n Cy:n saranan disulfidit pois- γ: 25 tettiin konstruktioiden aikana, on CTLA4Ig CD28Ig:n tavoin ·. : dimeeri, joka otaksuttavasti on liittynyt yhteen natiivin | disulfidisidoksen välityksellä.
Esimerkki 3 CTLA4-reseptori 30 Täysimittaista humaani-CTLA4-geeniä vastaavaa ami- nohappojaksoa koodaavan DNA:n uudelleenkonstruoimiseksi » · · ·...· kloonattiin PCR:n avulla cDNA, joka koodaa CTLA4:n trans- .·. : membraanisen ja sytoplasmisen domeenin fragmenttia vastaa- • · via aminohappoja, joka sitten yhdistettiin cDNA:han, joka . 35 koodasi aminohappoja, jotka vastasivat CTLA4Ig:stä peräi- 34 115057 sin olevaa fragmenttia, joka vastasi CTLA4:n N-terminaali-seen päähän liitetyn onkostatiini M: n signaalipeptidiä. Menetelmät PCR:n, solujen viljelyn ja transfektioiden suorittamiseksi olivat samoja kuin mitä oli kuvattu edellä 5 olevassa esimerkissä 1 ja niissä käytettiin COS-soluja ja DEAE-dekstraanitransfektiota.
Koska CTLA4-reseptoriproteiinin ilmentämistä lym-foidisissa humaanisoluissa ei ole aiemmin raportoitu, oli tarpeellista paikallistaa lähtömateriaali, josta CTLA4-10 mRNArta saataisiin. PCR-kloonaukseen käytettiin edellä mainittua H38-solujen kokonais-RNA:sta käänteistranskrip-toitua PCR-cDNA:ta. Tähän tarkoitukseen käytettiin eteenpäin suuntautuvana alukkeena oligonukleotidia
15 GCAATGCACGTGGCCCAGCCTGCTGTGGTAGTG
(jaksotunniste nro 11) (tämä koodaa ennustetussa koodaa-vassa jaksossa olevaa 11 ensimmäistä aminohappoa) ja käänteisenä alukkeena oligonukleotidia 20
TGATGTAACATGTCTAGATCAATTGATGGGAATAAAATAAGGCTG
• I
·_ j (jaksotunniste nro 12) (tämä on homologinen CTLA4:ssä :V: olevien viimeisten 8 aminohapon suhteen ja se sisältää Xba • · 25 I -kohdan) . Templaattina oli edelleen cDNA, joka oli • « : syntetisoitu 1 pg:sta H38-soluista peräisin olevaa RNA:ta.
• · ,·, : PCR-reaktion tuotteet pilkottiin restriktioendonukle- • * · !..* aaseilla Neo I ja Xba I ja tulokseksi saatu 316 ep:n • · ”* suuruinen tuote puhdistettiin geelissä. Edellä kuvatusta 30 CTLAIg-fuusiosta peräisin oleva 340 ep:n suuruinen Hind
• I I
···! III/Nco I -fragmentti puhdistettiin myös geelissä ja molemmat restriktiofragmentit ligatoitiin Hind 111:11a ja ;\j Xba I:llä pilkottuun CDM8:aan OMCTLA:n muodostamiseksi.
» I
Tulokseksi saatu konstruktio vastasi täysimittais- • · 35 ta CTLA4:ää (jaksotunnisteet nro 13 ja 14) ja onkostatiini * ♦ » » » » t $ 35 115057 M:n signaalipeptidiä. Konstruktio on esitetty kuviossa 3 ja sille annettiin nimitys OMCTLA4. Kuviossa 3 esitetty CTLA4:n jakso eroaa ennustetusta humaani-CTLA4-DNA-jaksosta (Dariavach, et ai., edellä) sellaisella emäsmuutoksel-5 la, ettäesitetyn aminohappojakson aminohappoasemassa 111 aiemmin raportoitu alaniini koodaa treoniinia. Tämä treo-niini on osa äskettäin tunnistettua N-välitteisen glyko-sylaation kohtaa, jolla saattaa olla tärkeä merkitys sille, että fuusioproteiinin ilmentämisessä päästään suotui-10 saan lopputulokseen.
Ligaatiotuotteet transformoitiin E. coli MC1061/ p3-soluihin ja pesäkkeistä seulottiin esiin asianmukaisia plasmideja sisältävät pesäkkeet. Tulokseksi saatujen konstruktioiden jaksot varmistettiin DNA-jakson analyysillä.
15 Esimerkki 4 CTLA4Ig:n luonnehtiminen CTLA4Ig-konstruktioiden luonnehtimiseksi valmistettiin edellä kuvatulla tavalla useita isolaatioita, isolaa-tiot CD28Ig, B7Ig ja CD5Ig, ja ne transfektoitiin COS-so-20 luihin esimerkeissä 2 ja 3 kuvatulla tavalla ja niiden kyky sitoa B7Ig:tä tutkittiin FACSR-analyysillä. Edellä mainittujen konstruktioiden lisäksi käytettiin myös CDM8- ; plasmideja, jotka sisälsivät CD7: ää koodaavia cDNA-mole- • · · * .V. kyylejä ja jotka on kuvattu julkaisussa Aruffo ja Seed, .·. : 25 [EMBO Jour. 6 (1987) 3 313 - 3 316], joka julkaisu on lii- ,·, ; tetty tähän keksintöön siihen oikeuttavien säädösten no- \ ", jalla.
’.. mAb-molekyylit ’·*·’ Monoklonaaliset muriinivasta-aineet (mAb-molekyy- 30 lit) 9.3 (anti-CD28) ja G19-4 (anti-CD3), G3-7 (anti-CD7), » BB-l (anti-B7-antigeeni) ja rotan mAb 187.1 (hiiren κ-ket- i * · ί,,,ί jua vastaan suunnattu mAb) on kuvattu aiemmin [Ledbetter, .·. : et ai., Proc. Natl. Acad. Sei. 84 (1987) 1384 - 1388; Led- » i · >[i<j better, et ai., Blood 75 (1990) 1531; Yokochi, et ai., . 35 edellä] ja ne puhdistettiin askites-nesteestä ennen käyt- » > i · · 1 1 5057 36 töä. OKT8-mAb:tä tuottava hybridooma hankittiin ATCC:stä, Rockville, MD, ja mAb puhdistettiin samoin askites-nes-teestä ennen käyttöä. mAb 4G9 (anti-CD19) saatiin Dr. E. Engleman'ilta, Stanford University, Palo Alto, CA) . Puh-5 distettu kimeerinen humaani-muriini-mAb LG (tällä on hu-maani-Cylrn Fc-osa) oli saatu lahjaksi Dr. P. Fell'iltä ja M. Gayle'lta (Bristol-Myers Squibb Pharmaceutical Research Institute, Seattle, WA).
Immunovärjäys ja FACSR-analyysi 10 Ennen värjäystä COS- tai CHO-solut poistettiin kasvatuspulloistaan inkuboimalla niitä PBSrssä, joka sisälsi 10 mM EDTA:aa. Soluja inkuboitiin ensin 1 - 2 h 4 °C:ssa mAb-molekyylien tai Ig-fuusioproteiinien kanssa, joiden konsentraatio oli 10 pg/ml, DMEM:ssä, joka sisälsi 15 10-prosenttista FBSrää. Tämän jälkeen solut pestiin ja niitä inkuboitiin vielä 0,5 - 2 h 4 °C:ssa FITC:llä konju-goidun vuohessa tehdyn anti-hiiri-immunoglobuliinin tai FITCrllä konjugoidun vuohessa tehdyn anti-humaani Ig-Cy-seerumin kanssa (molemmat yhtiöstä Tago, Burlingame, CA).
20 Kun samassa kokeessa määritettiin sekä mAb-molekyylien että Ig-fuusioproteiinien sitoutuminen, sekoitettiin toisen vaiheen FITC:llä konjugoidut anti-hiiri- ja anti-hu-: maanireagenssit keskenään ennen käyttöä. Yhteensä 10 000 solun fluoresenssi tutkittiin sitten FACSR:llä.
» 25 Periferaalisen veren lymfosyyttien erottaminen ja • · : stimulointi • I · .·, ; Periferaalisen veren lymfosyytit (PBL-solut) eris- • i t tettiin sentrifugoimalla käyttäen Lymphocyte Separation • ·
Medium'ia (Litton Bionetics, Kensington, MD). Alloreagoi-30 vat T-solut eristettiin PBL-solujen stimuloinnilla primaa- • · ··· risessa lymfosyyttityyppien yhteisreaktiossa (MLR) . PBL- i « * soluja viljeltiin käyttäen säteilytettyjä (5 000 radia) :\j T51 LCL-soluja, joiden solutiheys oli 106/ml. EBVtllä • · transformoituja lymfoblastoidisolulinjoja (LCL) PM (Bris- a a 35 tol-Myers Squibb Co.) ja T51 (Bristol-Myers Squibb Co.) » » · * * · * » * » » i • » 37 115057 kasvatettiin RPMI:ssä, jota oli täydennetty 10-prosentti-sella FBS:llä. Alloreagoivat "blasti"solut pakastettiin kuuden päivän kuluttua niiden säilyttämiseksi. Sekundaariset MLR:t suoritettiin viljelemällä sulatettuja allorea-5 goivia blasteja ja tuoreita säteilytettyjä T51 LCL-soluja mAb-molekyylien ja Ig-fuusioproteiinien läsnä ollessa ja ilman näiden lisäystä. Soluja viljeltiin 96-kuoppaisissa tasapohjaisissa levyissä (4 X 104 alloreagoivaa blastia ja 1 X 104 säteilytettyä T51 LCL solua kuoppaa kohti 0,2 ml:n 10 tilavuudessa) RPMI:ssä, joka sisälsi 10-prosenttista FBS:ää. Solujen lisääntyminen neljästä rinnakkaisesta viljelmästä määritettiin [3H]-tymidiinin kerääntymisestä soluihin 6 viimeisen tunnin aikana 2-3 päivän ikäisessä viljelmässä.
15 PHA:lla aktivoidut T-solut valmistettiin viljele mällä PBL-soluja, joihin oli lisätty 1 pg/ml PHA:ta (Wellcome, Charlotte, NC) , viiden päivän ajan ja viljelemällä niitä yhden päivän aajan mediumissa, josta PHA oli jätetty pois. Elinkykyiset solut koottiin talteen sedimentoimalla 20 ne Lymphocyte Separation Mediumin läpi ennen käyttöä. Soluja stimuloitiin mAb-molekyyleillä tai transfektoiduilla CHO-soluilla 4 - 6 h 37 °C:ssa, ne koottiin talteen sent- • ; rifugoimalla ja niistä valmistettiin RNA.
• · · = CD4+-T-solut eristettiin PBL-soluista erotelemalla • 1
.·, ; 25 terveiltä verenluovuttajilta saadut PBL-solut T- ja ei-T
# 1 ; \ l soluihin käyttäen lampaan erytrosyyttien rosetinmuodostus- ! ) menetelmää ja erottelemalla T-solut edelleen maljakäsitte- * · « lyllä CD4+-soluihin julkaisussa Damle, et ai., J. Immunol.
*···’ 139 (1987) 1501 kuvatulla tavalla, joka julkaisu on lii- 30 tetty tähän keksintöön siihen oikeuttavien säädösten no-jalla.
ϊ>(>: B-soluja puhdistettiin myös periferaalisesta veres- .·, : tä maljakäsittelyllä, joka on kuvattu julkaisussa Wysocki
» « I
ja Sato, Proc. Natl. Acad. Sei. 75 (1978) 2 844, joka jul- » » . 35 kaisu on liitetty tähän keksintöön siihen oikeuttavien • · ti» I » 1 1 • > 38 115057 säädösten nojalla, käyttäen anti-CD19-mAb-4G9:ää. Th:n aikaansaaman Ig:n muodostumisen määrittämiseksi sekoitettiin keskenään 106 CD4+ T-solua ja 106 CD19+ B-solua 1 ml:ssa RPMIrtä, joka sisälsi 10-prosenttista FBS:ää.
5 Kuuden päivän mittaisen viljelyn jälkeen 37 °C:ssa määritettiin humaani-IgM:n muodostuminen viljelmäsupernatan-teissa käyttäen kiinteän faasin ELISA:aa julkaisussa Volk-man, et ai., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 78 (1981) 2 528 kuvatulla tavalla, joka julkaisu on liitetty tähän keksin-10 töön siihen oikeuttavien säädösten nojalla. Suoritus tapahtui pääpiirteittäin siten, että 96-kuoppaiset tasapohjaiset mikrotiitteri-ELISA-levyt (Corning, Corning, NY) päällystettiin käyttäen kuoppa kohti 200 μΐ natriumkarbo-naattipuskuria (pH 9,6), joka sisälsi 10 pg/ml vuohessa 15 tehtyä affinitettipuhdistettua anti-humaani IgG- tai IgM-vasta-ainetta (Tago, Burlingame, CA), inkuboitiin yön yli 4 °C:ssa, ja pestiin sitten PBS:llä ja kuopat tehtiin vielä reagoimattomiksi 2-prosenttisella BSArlla PBSrssä (BSA-PBS) . Määritettävät näytteet lisättiin näihin kuoppiin 20 sopivana laimennoksena ja niitä inkuboitiin käyttäen kuoppaa kohti 200 μΐ vuohessa tehdyn affiniteettipuhdistetun anti-humaani IgG- tai IgM-vasta-aineen (Tago) pipar-| ( : juuriperoksidaasilla (HRP) konjugoidun F (ab')2-fraktion :V: suhteessa 1:1 000 tehtyä laimennosta. Tämän jälkeen levyt 25 pestiin ja niihin lisättiin kuoppaa kohti 100 μΐ o-fenyy- • · .·, : leenidiamiinin (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) -liuos- • I · • » ,·, ; ta (liuos sisälsi tätä 0,6 mg/ml sitraatti-fosfaattipusku- • < · rissa, jonka pH oli 5,5 ja jossa oli 0,045 % vetyperoksi- • · "* dia) . Värin kehittyminen pysäytettiin 2 N rikkihapolla.
30 Absorbanssi 490 nm:n kohdalta määritettiin automaattisella t i « ••G ELISA-levyjen lukulaitteella. Tutkittavat ja kontrolli-
• I I
näytteet tutkittiin kolmena rinnakkaisena näytteenä ja : absorbanssiarvoja verrattiin sellaisiin absorbanssiarvoi- • · hin, jotka oli saatu tunnettuja IgG- tai IgM-standardeja • » • 35 käyttäen ja jotka oli tutkittu samanaikaisesti superna- i i t 4 I » I I • · 39 115057 tanttinäytteiden kanssa sellaisen standardikäyrän valmistamiseksi, jota käyttäen viljelmäsupernatanteissa olevat Ig-konsentraatiot kvantitoitiin. Koetulokset on ilmoitettu yksiköissä ng/ml Ig:tä ± SEM joko kolmesta tai neljästä 5 rinnakkaisesta viljelmästä määritettynä.
Immunosaostusanalyysi ja SDS PAGE
Solut varustettiin pinnastaan 125I-leimalla ja niille suoritettiin immunosaostusanalyysi. Suoritus tapahtui pääpiirteittäin siten, että PHA:lla aktivoitujen T-solujen 10 pinta varustettiin I-leimalla käyttäen laktoperoksidaasia ja foC^ita julkaisussa Vitetta, et ai., J. Exp. Med. 134 (1971) 242, kuvatulla tavalla, joka julkaisu on liitetty tähän keksintöön siihen oikeuttavien säädösten nojalla. SDS-PAGE-kromatografia suoritettiin lineaarisissa akryyli-15 amidigradienttigeeleissä, joissa pinoutumisgeelinä oli 5- prosenttinen akryyliamidi. Geelit värjättiin Coomassie Blue -väriaineella, niistä poistettiin ylimääräinen väri ja ne valokuvattiin tai kuivattiin ja valotettiin röntgenfilmillä (Kodak XAR-5).
2 0 Sitoutumismääritykset B7Ig varustettiin 125I-leimalla ominaisaktiivisuu-teen, joka oli suuruudeltaan noin 2 X 106 cpm pikomoolia • kohti. 96-kuoppaiset muovilevyt päällystettiin 16 - 24 h • V. ajan liuoksella, joka sisälsi CTLA4Ig:tä (0,5 pg 0,05 ml:n .·.: 25 tilavuudessa 10-millimolaarista Tris'iä, jonka pH oli 8).
• · ,·, : Kuopat tehtiin reagoimattomiksi sitoutumispuskurilla (DMEM, ! ! joka sisälsi 50-millimolaarista BES:ää (Sigma Chemical Co.), • t · I,,1 jonka pH oli 6,8, 0,1-prosenttista BAS:ää ja 10-pro- • t senttistä FCS:ää), jonka jälkeen niihin lisättiin kilpai-30 levän yhdisteen läsnä ollessa tai tämän puuttuessa liuos » (0,09 ml), joka sisälsi 125I-B7Ig:tä (noin 5 x 105 cpm).
i » « :i>t· 2 - 3 h pituisen inkuboinnin jälkeen 23 °C:ssa kuopat .·. : pestiin kerran sitoutumispuskurilla ja neljä kertaa [.j PBSrllä. Tämään jälkeen sitoutunut radioaktiivisuus solu- 35 ♦ » > » 40 115057 bilisoitiin lisäämällä kuoppiin 0,5-normaalista NaOHrta ja se kvantitoitiin gammalaskennalla.
Sitoutuminen B7lg:hen
Kuviossa 4 esitetty koe osoittaa, että täydellistä 5 humaani-CTLA4-DNA-geeniä koodaava OMCTLA4-konstruktio on toiminnallisesti aktiivinen. COS-solut transfektoitiin ilmentämisplasmideilla CD7, OMCD28 ja OMCTLA4 edellä kuvatulla tavalla. 48 tuntia transfektion jälkeen solut koottiin talteen ja niitä inkuboitiin pelkällä mediumilla (ei 10 lisäyksiä) tai käyttäen 9.3-, B7Ig-, CD5Ig- tai G3-7-mAb-molekyylejä. Tämän jälkeen solut pestiin ja sitoutuminen havaittiin seoksella, joka sisälsi toisen vaiheen reagens-sit, jotka olivat vuohessa tehty FITC:llä konjugoitu anti-muriini Ig ja vuohessa tehty FITC:llä konjugoitu 15 anti-humaani Ig. Transfektoiduista soluista tutkittiin asianmukaisten solun pinnan markkerien ilmentyminen epäsuoralla immunovärjäyksellä ja fluoresenssi määritettiin käyttäen FACSR-analyysiä edellä kuvatulla tavalla.
Kuten kuviossa 4 on esitetty, sitoutui mAb 9.3 20 CD28:lla transfektoituihin COS-soluihin mutta ei CTLA4:llä transfektoituihin soluihin. B7Ig-fuusioproteiini sitoutui sekä CD28:lla että CTLA4:llä transfektoituihin soluihin · (mutta näin ei käynyt kontrollina ollutta CD5Ig-fuusiopro- teiinia käytettäessä). CD7:llä transfektoidut COS-solut 25 eivät sitoneet mAb 9.3 eivätkä kumpaakaan fuusioproteii- .·, : neista. Tämä viittaa siihen, että CD28 ja CTLA4 sitoutuvat • i · • · : kumpikin B-solujen aktivaatioantigeeniin, B7:ään. Lisäksi • * · mAb 9.3 ei havaittavissa määrin sitonut CTLA4:ää.
• · • · CTLA4Ig:n sitoutuminen B7-positiivisiin CHO-solui- 30 hin ···* CTLA4Ig ja B7:n sitoutumisen tarkempaa luonnehti- ·...· mistä varten määritettiin puhdistetun CTLA4Ig:n sitoutu- : misaktiivisuus B7+-CHO-soluilla ja lymfoblastoidisolulin- jalla (PM LCL) kuviossa 5 esitetyssä kokeessa. Amplifioi- • · • 35 tuja transfektoituja CHO-solulinjoja ja PM LCL -soluja » · · » » * » 41 115057 inkuboitiin käyttäen pelkkää mediumia (ei lisäyksiä) tai vastaavaa konsentraatiota humaani-Ig:n Cyl:tä sisältäviä CD5Ig-, CD28Ig- tai CTLA4Ig-proteiineja (10 pg/ml). Sitoutuminen havaittiin FACSR:llä sen jälkeen, kun näytteisiin 5 oli lisätty vuohessa tehtyjä FITCrllä konjugoituja toisen vaiheen anti-humaani Ig-reagensseja. Yhteensä 10 000 värjättyä solua analysoitiin FACSR:llä.
Kuten kuviossa 5 on esitetty, sitoutui CD28lg B7+-CHO-soluihin mutta ei PM LCL -soluihin, joka solulinja on 10 suhteellisen pieniä B7-antigeenimääriä ilmentävä solulinja (Linsley, et ai., edellä, 1990). CTLA4Ig sitoutui molempiin solulinjoihin voimakkaammin kuin CD28lg, mikä viittaa siihen, että se sitoutuu suuremmalla affiniteetillä. Ei CD28Ig eikä CTLA4Ig sitoutunut CD28+-CHO-soluihin.
15 CTLA4Ig:n ja B7Ig:n sitoutumisaffinifceetti CTLA4Ig:n ja B7Ig:n välisen vuorovaikutuksen näennäinen affiniteetti määritettiin tämän jälkeen käyttäen kiinteän faasin kompetitiivista sitoutumismääritystä. 96- kuoppaiset muovilevyt päällystettiin CTLA4Ig:llä edellä 20 kuvatulla tavalla. B7Ig varustettiin radioaktiivisella 125I-leimalla (5 X 105 cpm, 2 X 106 cpm pikomoolia kohti) , ja sitä lisättiin 4-nanomolaarisessa konsentraatiossa • seokseen, jossa oli osoitetut konsentraatiot (katso kuvio 6) • · · · leimalla varustamatonta kimeeristä mAb L6:tta, mAb 9.3, .·. ; 25 mAb BB-l:tä tai B7Ig:tä. Levyihin sitoutuneen radioaktii- • * · t«> . visuuden määrä määritettiin ja se ilmoitettiin prosenttei- i na sellaisiin kuoppiin sitoutuneen radioaktiivisuuden mää- |tt’ rästä, jotka oli käsitelty ilman kompetitiivista molekyy- '···' liä (28 300 cpm) . Kukin piste edustaa kahden rinnakkaisen 30 määrityksen keskiarvoa, rinnakkaisten määritysten poikkea-ma keskiarvosta oli tavallisesti < 20 %. Konsentraatiot laskettiin sillä perusteella, että Mr yhden mAb-molekyylin .·, ; sitoutumiskohdan osalta oli 75 000 ja yhden B7Ig:n sitou- [ ! tumiskohdan osalta 51 000.
35 > ♦ » f i · > 42 115057
Kuten kuviossa 6 on esitetty ainoastaan mAb BB-1 ja leimalla varustamaton B7Ig kilpailivat merkittävästi 125IB7Ig:n sitoutumisesta (näiden kummankin puolimaksimaa-liset vaikutukset tapahtuivat arvojen noin 22 nM ja noin 5 175 nM kohdalla). Tutkituissa konsentraatioissa ei kimee- risellä mAb L6:lla eikä mAb 9.3:11a ollut tehokasta kom-petitiota. Muissa kokeissa käytetyt mAb 9.3:n konsentraa-tiot olivat riittävän suuria estämään I-B7Ig:n sitoutumisen immobilisoituun CD28Ig:hen tai solun pinnalla il-10 mentyneeseen CD28:aan > 90 %.
Kun kompetitiokoetulokset kuviosta 6 esitettiin Scatchardin kuvaajassa, laskettiin 125I-B7:n sitoutumista immobilisoituun CTLA4Ig:hen kuvaavan dissosiaatiovakion, Kd:n, arvoksi noin 12 nM (kuvio 7). Tämä arvo on noin 15 20 kertaa pienempi kuin 125I-B7Ig:n ja CD28:n väliselle sitoutumiselle aikaisemmin määritetty Kd (noin 200 nM) [Linsley, et ai, (1991), edellä] mikä viittaa siihen, että CTLA4 on B7-antigeenille CD28-reseptoria suurempi affini-teettinen reseptori.
20 CTLA4Ig:tä sitovien lymfoblastoidisten solujen pin nalla olevan(ien) molekyyli(e)n tunnistamiseksi (kuvio 7) analysoitiin pinnastaan 125I-leimalla varustetut solut : immunosaostusta käyttäen (kuvio 8) . B7+-CHO ja PM LCL -so- : : : lut varustettiin pinnastaan I:llä ja ne uutettiin ionit- ;1.J 25 tumattomalla detergenttiliuoksella edellä kuvatulla taval- • ·
.·. : la. Uutteista otetut näytteet, jotka sisälsivät noin 1,5 X
• · » ,·. · 107 cpm:ää 0,1 ml:n tilavuudessa, analysoitiin immunosaos- • 1 · tusanalyysilla edellä kuvatulla tavalla ilman mitään lisä- • · yksiä tai käyttämällä 2 pg kutakin molekyyleistä CD28Ig, 30 CTLA4Ig tai CD5Ig. Pestyt immunosaostumat analysoitiin >1d sitten SDS-PAGE:lla (10 - 20 % akryyliamidigradientti) ...· pelkistävissä olosuhteissa. Tämä jälkeen geeli kuivattiin j ja sille suoritettiin autoradiografia. Kuvion 8 vasen osa- kuvio esittää autoradiogrammia, joka saatiin 1 päivän va-35 lotuksen jälkeen. Kuvion 8 oikeanpuoleinen osakuvio esit- 1 · » 1 • · 43 115057 tää samasta geelistä valmistettua autoradiogrammia 10 päivän valotuksen jälkeen. Kuvion 8 keskellä olevassa osaku-viossa olevaa autoradiogrammia valotettiin myös 10 päivää. Tässä kuvassa on myös esitetty moolimassastandardien pai-5 kat.
Kuten kuviossa 8 on esitetty, CTLA4Ig:llä suoritetussa immunosaostuksessa saostui radioaktiivisella leimalla varustettu diffuusisti liikkuva proteiini (Mr noin 50 000 - 75 000; keskiosa noin 60 000:n kohdalla), joka ei 10 saostunut CD28Ig:llä eikä CD5Ig:llä. Tämä molekyyli liikkui samalla tavoin kuin B7, joka oli immunosaostettu B7+-CHO-soluista CTLA4Ig:llä ja jota saostui paljon heikommin CD28lg:lla. Nämä havainnot viittaavat siihen, että CTLA4Ig sitoo yhden proteiinin lymfoblastoidisissa soluissa, joka 15 on kooltaan samansuuruinen kuin B7-antigeeni.
Immuunivasteiden inhibitio in vitro -olosuhteissa CTLA4Ig:llä
Solujen lisääntymisen inhibitio
Aikaisemmat tutkimukset ovat osoittaneet, että 20 anti-CD28-mAb, 9.3, ja anti-B7-mAb, BB-1, inhiboivat allo-antigeenispesifisten Th- solujen lisääntymistä, sekä allo-antigeenia esittävien B-solujen immunoglobuliinin eritystä • (Damle, et ai., Proc. Natl. Acad. Sei. 78 (1981) 5096; • · · ·
Lesslauer, et ai., Eur. J. Immunol. 16 (1986) 1 289]. Kos- .·, : 25 ka CTLA4 on B7-antigeenin korkea-affiniteettinen resepto- ,·, ; ri, kuten tässä keksinnössä on osoitettu olevan asian- • · » ! laita, tutkittiin liukoisesta CTLA4Ig:stä sen kyky inhi- boida näitä vasteita. CTLA4Ig:n vaikutuksia T-solujen li-*··* sääntymiseen tutkittiin kuviossa 9 esitetyssä kokeessa.
30 Primaarisesta lymfosyyttityypien yhteisreaktiosta (MLR) saatuja blastisoluja stimuloitiin säteilytetyillä I ♦ · T51-lymfoblastoidisoluilla (LC) siten, että seoksessa oli .*. : samanaikaisesti, tai siihen ei lisätty, muriini-mAb-9.3 :n iiit; Fab-fragmentteja tai B7Ig-, CD28Ig- tai CTLA4Ig-immuno- . 35 globuliini-Cy-fuusioproteiineja. Solujen lisääntyminen i » » » 1 1 5057 44 määritettiin [3H]-tymidiinin kerääntymisestä soluihin 4 päivän kuluttua ja se on ilmoitettu prosentteina radioaktiivisuuden kerääntymisestä käsittelemättömiin viljelmiin (21 000 cpm). Kuviossa 9 on esitetty keskiarvo neljä-5 nä rinnakkaiskokeena suoritetuista määrityksistä. (SEM < 10 %) .
Kuten kuviosta 9 käy ilmi, CTLA4Ig inhiboi MLR-reaktiota annoksesta riippuvaisella tavalla enimmillään > 90 % ja puolimaksimaalinen vaste saatiin konsentraatiossa 10 noin 30 ng/ml (noin 0,8 nM) . mAb 9.3:n Fab-fragmentti, jonka on aiemmin osoitettu olevan voimakkaampi MRL:n inhibiittori kuin kokonainen mAb 9.3 [Damle, et ai., J. Immunol. 140 (1988) 1 753 - 1 761], inhiboi myös MLR:ää, mutta tämä tapahtui korkeammissa konsentraatioissa (noin 15 800 ng/ml tai noin 30 nM puolimaksimaalisen vasteen olles sa kyseessä) . B7Ig ja CD28Ig eivät merkittävästi inhiboineet MLR:ää edes korkeammissa konsentraatioissa. Toisessa kokeessa B7Ig:n lisäys yhdessä CTLA4Ig:n kanssa esti osittain MLR:n inhiboitumisen CTLA4Ig:llä, mikä viittaa sii-20 hen, että inhibitio johtui spesifisesti vuorovaikutuksista B7-antigeenin kanssa.
Immunoglobuliinin erittymisen inhibitio ; Tutkittiin myös CTLA4Ig:n vaikutuksia auttaja-T- , solun (Th) aikaansaamaan immunoglobuliinin erittymiseen 25 (kuvio 10) . CD4+-T-soluja ja allogeenisiä CD19+-B-soluja | yhdistettiin keskenään mainittujen edellä kuvattujen ; ! immunoglobuliinimolekyylien läsnä ollessa ja niiden puutie' tuessa. Muriini-mAb-molekyylit OKT8, 9.3 ja BB-1 lisättiin '··* pitoisuuteen 20 pg/ml ja Ig-fuusioproteiinit pitoisuuteen 30 10 pg/ml. Kuusi päivää kestäneen viljelyn jälkeen määri- tettiin humaani-IgM:n (SEM < 5%) konsentraatio viljelmä- • · · supernatanteissa entsyymi-immunomäärityksellä (ELISA) ,·, ; edellä kuvatulla tavalla. CD4+-T-solujen puuttuessa oli
I « I
* j viljeltyjen B-solujen tuottaman IgM:n konsentraatio . 35 11 ng/ml.
• · > » 45 115057
Kuten kuviossa 10 on esitetty, CD4+-T-solut stimuloivat allogeenisten CD19+-B-solujen IgM:n tuottoa (CD4+-T-solujen puuttuessa IgM-pitoisuudet pienenivät 93 %). mAb-molekyylit 9.3 ja BB-1 inhiboivat merkittävästi Th:n ai-5 kaansaamaa IgM:n tuottoa (nämä saivat aikaan vastaavasti 63-prosenttisen ja 65-prosenttisen inhibition). CTLA4Ig oli inhibiittorina jopa näitä mAb-molekyylejä tehokkaampi (89-prosenttinen inhibitio). Kontrolli-Ig-molekyylien, mAb OKT8:n ja CD5Ig:n, inhibitio oli paljon pienempi (< 30-10 prosenttinen inhibitio). Mikään näistä molekyyleistä ei inhiboinut merkittävästi Ig:n muodostumista Staphylococcus aureuksen enterotoksiini B:n läsnä ollessa määritettynä. Samanlaisia tuloksia saatiin CD4+-T-soluilla ja B-soluilla, jotka olivat peräisin muilta verenluovuttajilta. Nämä tu-15 lokset viittaavat siihen, että CTLA4Ig:n inhibitio on spesifinen.
Edellä olevat koetulokset osoittavat myös, että CTLA4- ja CD28-reseptorit muistuttavat toisiaan sekä toiminnallisesti että rakenteellisesti. CD28:n tavoin on 20 CTLA4 myös B-solujen aktivaatioantigeenin, B7:n reseptori. CTLA4Ig sitoi i25I-B7:ää ja sitoutumisen affiniteeettivakio,
Kd, oli noin 12 nM, joka arvo on noin 20 kertaa suurempi t · ·.· · kuin CD28:n ja B7Ig:n välinen affiniteetti (noin 200 nM) .
CTLA4:n ja CD28:n voidaan siten ajatella olevan saman li-: 25 gandin, B7-antigeenin suuri- ja pieniaffiniteettisia re- '.j septoreja.
,·, ; CD28:n ja B7:n välinen näennäinen affiniteetti on « » * · *··. samanlainen kuin affiniteetti, joka on raportoitu liukoi sen alloantigeenin sitoutumiselle muriini-T-soluhybridoo-. 30 man T-solureseptoriin [noin 100 nM; Schnek, et ai., Cell ;;· 56 (1989) 47], ja se on suurempi affiniteetti kuin CD2:n ja LFA3:n välisissä vuorovaikutuksissa [Recny, et ai., J.
Biol. Chem. 265 (1990) 8542] tai CD4:n ja MHC class II
» t -molekyylien välisissä vuorovaikutuksissa [Clayton, et . ·, 35 ai., Nature 339 (1989) 548] esiintyvä affiniteetti.
* * * ♦ » » ♦ » » » I » » · 46 115057 CTLA4:n ja B7:n välinen näennäinen affiniteettivakio, Kd, on vielä suurempi ja se on verrattavissa odotuksiin sopivalla tavalla affiniteetiltaan suurempiin mAb-molekyyleihin [Kd-arvo 2-10 000 nM; Alzari, et ai., Ann. Rev. Immu-5 no. 6 (1988) 555]. CTLA4:n ja B7:n välinen Kd on samansuuruinen tai suurempi kuin integriinireseptorien ja niiden ligandien väliset Kd-arvot (10 - 2 000 nM; Hautanen, et ai., J. Biol. Chem. 264 (1989) 1 437 - 1 442; Di Minno, et ai., Blood 61 (1983) 140 - 148; Thiagarajan ja Kelley, J.
10 Biol. Chem. 263 (1988) 035 - 3 038]. CTLA4:n ja B7:n vuorovaikutusten affiniteetti on siten suurimpia lymfoidisil-le adheesiojärjestelmille tähän mennessä raportoiduista affiniteeteista.
Nämä tulokset ovat osoituksena ensimmäistä kertaa 15 suoritetusta CTLA4:n transkriptiotuotteen toiminnallisen proteiinituotteen ilmentämisestä. CTLA4Ig, fuusiokonstruk-tio, joka sisältää IgCyl-domeeniin fuusioidun CTLA4:n solunulkoisen domeenin, muodostaa disulfidin välityksellä liittyvän dimeerin, joka sisältää alayksiköt, joiden Mr on 20 noin 50 000 (kuvio 1). Koska tämän fuusion Ig-osassa ei voida ennustaa muodostuvan ketjujen välisiä disulfideja, vaikuttaa todennäköiseltä, että CTLA4:stä peräisin olevat » · f kysteiinit liittyvät disulfidisidoksen muodostumiseen.
• ·
Analoginen CD28lg-fuusioproteiini (Linsley, et ai, edellä, :*·,.· 25 1991) sisältää myös ketjujen välisen (iä) disulfidisidok- sen (ia). Nämä tulokset viittaavat siihen, että CTLA4-re- • · : septori esiintyy CD28:n [Hansen, et ai., Immunogenetics .·*·, 10 (1980) 247 - 260], tavoin T-solujen pinnalla disulfidi sidoksen yhdistämänä homodimeerinä. Vaikka CD28 ja CTLA4 , 30 ovat erittäin homologisia proteiineja, ne poikkeavat toi- ♦ * · •;*j sistaan immunologisesti, koska anti-CD28-mAb, 9.3, ei tun- nista CTLA4:ää (kuviot 4 ja 5) .
Ei tiedetä, voiko CTLA4 aktivoida T-soluja signaa- • · lireaktiotiellä, joka on analoginen CD28:n suhteen. Murii- , f 35 ni- ja humaani-CTLA4:n sytoplasmiset domeenit ovat ident- ► * | • * t · » · 47 115057 tisiä (Dariavach, et ai., edellä 1988), mikä viittaa siihen, että tällä alueella on tärkeitä toiminnallisia ominaisuuksia. CD28:n ja CTLA4:n sytoplasmisilla domeeneilla on myös homologiaa keskenään, vaikka onkin epäselvää, 5 riittääkö tämä tekemään näiden kahden molekyylin signaalia muodostavat ominaisuudet samanlaisiksi.
CTLA4Ig on in vitro -olosuhteissa sellaisten lymfosyyttien toimintojen voimakas inhibiittori, joissa tarvitaan T-solujen ja B-solujen yhteistoimintaa (kuviot 9 ja 10).
10 Nämä havainnot yhdessä aikaisempien tutkimusten kanssa viittaavat B7-antigeenin ja sen vastinreseptorien, CD28:n ja/tai CTLA4:n, välisten vuorovaikutusten perimmäiseen tärkeyteen sekä T- että B-lymfosyyttien vasteiden säännöstelyssä. CTLA4Ig tulisi olemaan käyttökelpoinen reagenssi tule-15 via tutkimuksia varten, jotka koskevat näiden vuorovaikutusten osuutta immuunivasteiden aikana. CTLA4Ig on voimakkaampi lym-fosyyttivasteiden inhibiittori in vitro -olosuhteissa kuin joko mAb BB-1 tai mAb 9.3 (kuviot 9 ja 10). CTLA4Ig:n suurempi tehokkuus mAb BB-l:een verrattuna johtuu todennäköisimmin 20 näiden molekyylien affiniteettieroista B7:ää kohtaan (kuvio 6). CTLA4Ig on myös mAb 9.3:a voimakkaampi todennäköisesti siksi, että sillä ei mAb:stä poiketen myöskään ole T-solujen :.·- lisääntymiseen kohdistuvia suoria stimuloivia vaikutuksia (June, et ai., Immunology Today 11 (1989) 211), joilla olisi 25 sen sen inhibitorisia vaikutuksia kumoavaa vaikutusta, j Kuten sen alan ammattimiehille on selvää, johon .·. : tämä keksintö liittyy, voi tällä keksinnöllä olla muita • I 1 t.’./ sovellutusmuotoja kuin edellä nimenomaisesti tarkastellut t · muodot tämän keksinnön hengestä tai sen olennaisista piir-30 teistä poikkeamatta. Niiden tämän keksinnön nimenomaisten ··>·’ sovellutusmuotojen, joita edellä on kuvattu, on siten kat- • r · » · sottava olevan kuvaavia eikä rajoittavia. Tämän keksinnön ;\j suojapiiri on sellainen, millaisena se on esitetty oheen » · liitetyissä patenttivaatimuksissa eikä se siten rajoitu 35 edellä olevan patenttiselityksen sisältämiin esimerkkeihin.
· ! 48 115057
SEQUENCE LISTING
(1) GENERAL INFORMATION: 5
(i) APPLICANT: Linsley, Peter S
Ledbetter, Jeffrey A Damle, Nitin K Brady, William 10
(ii) TITLE OF INVENTION: CTLA4 RECEPTOR AND METHODS FOR ITS USE
(iii) NUMBER OF SEQUENCES: 14 15 (iv) CORRESPONDENCE ADDRESS: (A) ADDRESSEE: Sheldon & Mak (B) STREET: 201 South Lake Avenue, Suite 800 (C) CITY: Pasadena 20 (D) STATE: California (E) COUNTRY: United States f.f’f (F) ZIP: 91101 • · » (V) COMPUTER READABLE FORM: j 25 (A) MEDIUM TYPE: Floppy disk (B) COMPUTER: IBM PC compatible
(C) OPERATING SYSTEM: PC-DOS/MS-DOS
(D) SOFTWARE: Patentin Release #1.0, Version #1.25 30
) t I
' (Vi) CURRENT APPLICATION DATA: (A) APPLICATION NUMBER: ·:··; (B) FILING DATE: (C) CLASSIFICATION: :.: : 35 (viii) ATTORNEY/AGENT INFORMATION: (A) NAME: Mandel, SaraLynn (B) REGISTRATION NUMBER: 31,853 (C) REFERENCE/DOCKET NUMBER: 7848 49 115057 (ix) TELECOMMUNICATION INFORMATION: (A) TELEPHONE: (818) 796-4000 (B) TELEFAX: (818) 795-6321 5 (2) INFORMATION FOR SEQ ID NOil: (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTH: 39 base pairs (B) TYPE: nucleic acid (C) STRANDEDNESS: single (D) TOPOLOGY: linear (ii) MOLECULE TYPE: DNA (genomic) 15
(iii) HYPOTHETICAL: NO
(iv) ANTI-SENSE: NO
20 (vi) ORIGINAL SOURCE: (A) ORGANISM: Homo sapiens V (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:l: 25 :/,: CTAGCCACTG AAGCTTCACC ATGGGTGTAC TGCTCACAC 39 /·*; (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:2: .:. 3Q (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: '·* (A) LENGTH: 39 base pairs (B) TYPE: nucleic acid * · (C) STRANDEDNESS: single (D) TOPOLOGY: linear .·. 35 (ii) MOLECULE TYPE: DNA (genomic)
(iii) HYPOTHETICAL: NO
(iv) ANTI-SENSE: NO
50 115057 (vi) ORIGINAL SOURCE: (A) ORGANISM: Homo sapiens (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:2:
5 TGGCATGGGC TCCTGATCAG GCTTAGAAGG TCCGGGAAA
39 (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:3: (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: 10 (A) LENGTH: 39 base pairs (B) TYPE: nucleic acid (C) STRANDEDNESS: single (D) TOPOLOGY: linear 15 (ii) MOLECULE TYPE: DNA (genomic)
(iii) HYPOTHETICAL: NO (iv) ANTI-SENSE: NO
20 (Vi) ORIGINAL SOURCE: :.: : (A) ORGANISM: Homo sapiens * * · ' * 25 : ·.· (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:3:
.*··.’ TTTGGGCTCC TGATCAGGAA AATGCTCTTG CTTGGTTGT
39 (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:4: 30 (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: .: (A) LENGTH: 84 base pairs ;·· (B) TYPE: nucleic acid (C) STRANDEDNESS: single : ; 1 (D) TOPOLOGY: linear (ii) MOLECULE TYPE: DNA (genomic)
(iii) HYPOTHETICAL: NO
51 115057
(iv) ANTI-SENSE: NO
(vi) ORIGINAL SOURCE: 5 (A) ORGANISM: Homo sapiens (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:4: AAGCAAGAGC ATTTTCCTGA TCAGGAGCCC AAATCTTCTG ACAAAACTCA CACATCCCCA 60 CCGTCCCCAG CACCTGAACT CCTG 84 (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:5: 15 (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTH: 41 base pairs (B) TYPE: nucleic acid (C) STRANDEDNESS: single (D) TOPOLOGY: linear 20 (ii) MOLECULE TYPE: DNA (genomic)
(iii) HYPOTHETICAL: NO ; 25 (iv) ANTI-SENSE: NO
.’·· (vi) ORIGINAL SOURCE: i i * (A) ORGANISM: Homo sapiens (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:5: ,, 30 CTTCGACCAG TCTAGAAGCA TCCTCGTGCG ACCGCGAGAG C 41 ’ (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:6: • * » * * 1 (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: •j (A) LENGTH: 47 base pairs (B) TYPE: nucleic acid (C) STRANDEDNESS: single (D) TOPOLOGY: linear 52 115057 (ii) MOLECULE TYPE: DNA (genomic)
(iii) HYPOTHETICAL: NO
5 (iv) ANTI-SENSE: NO
(Vi) ORIGINAL SOURCE: (A) ORGANISM: Homo sapiens 10 (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:6: CATTGCACAG TCAAGCTTCC ATGCCCATGG GTTCTCTGGC CACCTTG 47 15 (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:7: (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTH: 39 base pairs (B) TYPE: nucleic acid 20 (C) STRANDEDNESS: single (D) TOPOLOGY: linear (ii) MOLECULE TYPE: DNA (genomic)
Ί 25 (iii) HYPOTHETICAL: NO
: (iv) ANTI-SENSE: NO
:···: (vi) ORIGINAL SOURCE: (A) ORGANISM: Homo sapiens ..'S 30 (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:7: * * ’ I ATCCACAGTG CAGTGATCAT TTGGATCCTG GCATGTGAC 39 • 35 (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:8: (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTH: 65 base pairs (B) TYPE: nucleic acid (C) STRANDEDNESS: single 53 115057 (D) TOPOLOGY: linear (ii) MOLECULE TYPE: DNA (genomic)
(iii) HYPOTHETICAL: NO (XV) ANTI-SENSE: NO
(vi) ORIGINAL SOURCE: (A) ORGANISM: Homo sapiens (XX) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:8: CTCAGTCTGG TCCTTGCACT CCTGTTTCCA AGCATGGCGA GCATGGCAAT GCACGTGGCC 60 CAGCC 65 (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:9: (X) SEQUENCE CHARACTERISTICS: 2Q (A) LENGTH: 33 base pairs (B) TYPE: nucleic acid (C) STRANDEDNESS: single · (D) TOPOLOGY: linear • f · * · 25 (ii) MOLECULE TYPE: DNA (genomic) * * · » ·
(iii) HYPOTHETICAL: NO
(iv) ANTI-SENSE: NO
·:· 30 ··'. (vi) ORIGINAL SOURCE: (A) ORGANISM: Homo sapiens 4 * * t (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:9: : ! 35 TTTGGGCTCC TGATCAGAAT CTGGGCACGG TTG 33 (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:10: (X) SEQUENCE CHARACTERISTICS: 54 115057 (A) LENGTH: 72 base pairs (B) TYPE: nucleic acid (C) STRANDEDNESS: single (D) TOPOLOGY: linear 5 (ii) MOLECULE TYPE: DNA (genomic)
(iii) HYPOTHETICAL: NO
10 (iv) ANTI-SENSE: NO
(vi) ORIGINAL SOURCE: (A) ORGANISM: Homo sapiens 15 (Xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:10: CTAGCCACTG AAGCTTCACC AATGGGTGTA CTGCTCACAC AGAGGACGCT GCTCAGTCTG 60 GTCCTTGCAC TC 72 20 (.2) INFORMATION FOR SEQ ID NO: 11: : (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTH: 33 base pairs (B) TYPE: nucleic acid *; 25 (C) STRANDEDNESS: single (D) TOPOLOGY: linear (ii) MOLECULE TYPE: DNA (genomic)
:j* 30 (iii) HYPOTHETICAL: NO
; . (iv) ANTI-SENSE: NO
* * (Vi) ORIGINAL SOURCE: ; · 35 (A) ORGANISM: Homo sapiens (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:11: 55 115057 GCAATGCACG TGGCCCAGCC TGCTGTGGTA GTG 33 (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:12: 5 (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTH: 45 base pairs (B) TYPE: nucleic acid (C) STRANDEDNESS: single (D) TOPOLOGY: linear 10 (ii) MOLECULE TYPE: DNA (genomic)
(iii) HYPOTHETICAL: NO 15 (iv) ANTI-SENSE: NO
(Vi) ORIGINAL SOURCE: (A) ORGANISM: Homo sapiens 20 (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO: 12: . TGATGTAACA TGTCTAGATC AATTGATGGG AATAAAATAA GGCTG 45 i » · (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:13: : ! 25 .*·: (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: • « ,'·* (A) LENGTH: 561 base pairs (B) TYPE: nucleic acid (C) STRANDEDNESS: single 30 (D) TOPOLOGY: linear (ii) MOLECULE TYPE: DNA (genomic) I * IT *
(iii) HYPOTHETICAL: NO
; : 35
; (iv) ANTI-SENSE: NO
(Vi) ORIGINAL SOURCE: (A) ORGANISM: Homo sapiens (ix) FEATURE: 56 115057 (λ) ΝΑΜΕ/ΚΕΥ: CDS (Β) LOCATIONS 1..561 5 (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO: 13: GCA ATG CAC GTG GCC CAG CCT GCT GTG GTA CTG GCC AGC AGC CGA GGC 48
Ala Net His Val Ala Gin Pro Ala Vai Val Leu Ala Ser Ser Arg Gly 15 10 15 10 ATC GCC AGC TTT GTG TGT GAG TAT GCA TCT CCA GGC AAA GCC ACT GAG 96
He Ala Ser Phe Val Cys Glu Tyr Ala Ser Pro Gly Lys Ala Thr Glu 20 25 30 GTC CGG GTG ACA GTG CTT CGG CAG GCT GAC AGC CAG GTG ACT GAA GTC 144 15 Val Arg Val Thr Val Leu Arg Gin Ala Asp Ser Gin Val Thr Glu Val 35 40 45 TGT GCG GCA ACC TAC ATG ATG GGG AAT GAG TTG ACC TTC CTA GAT GAT 192
Cys Ala Ala Thr Tyr Met Met Gly Asn Glu Leu Thr Phe Leu Asp Asp 50 55 60 20 TCC ATC TGC ACG GGC ACC TCC AGT GGA AAT CAA GTG AAC CTC ACT ATC 240 : .·. Ser He Cys Thr Gly Thr Ser Ser Gly Asn Gin Val Asn Leu Thr He 65 70 75 60 * * ♦ * · » · · • # · ,·. · 25 CAA GGA CTG AGG GCC ATG GAC ACG GGA CTC TAC ATC TGC AAG GTG GAG 288 ; j Gin Gly Leu Arg Ala Met Asp Thr Gly Leu Tyr He Cys Lys Val Glu 85 90 95 CTC ATG TAC CCA CCG CCA TAC TAC CTG GGC ATA GGC AAC GGA ACC CAG 336
Leu Met Tyr Pro Pro Pro Tyr Tyr Leu Gly He Gly Asn Gly Thr Gin 30 100 105 110 * » I » · ” ‘ ATT TAT GTA ATT GAT CCA GAA CCG TGC CCA GAT TCT GAC TTC CTC CTC 38 4 : He Tyr Val He Asp Pro Glu Pro Cys Pro Asp Ser Asp Phe Leu Leu ....: 115 120 125 35 57 115057 TGG ATC CTT GCA GCA GTT AGT TCG GGG TTG TTT TTT TAT AGC TTT CTC 432
Trp lie Leu Ala Alt Val Ser Ser Gly Leu Phe Phe Tyr Ser Phe Leu 5 130 135 140 CTC ACA GCT GTT TCT TTG AGC AAA ATG CTA AAG AAA AGA AGC CCT CTT 480
Leu Thr Ala Val Ser Leu Ser Lys Met Leu Lye Lye Arg Ser Pro Leu 145 150 155 160 20 ACA ACA GGG GTC TAT GTG AAA ATG CCC CCA ACA GAG CCA GAA TGT GAA 528
Thr Thr Gly Val Tyr Val Lys Met Pro Pro Thr Glu Pro Glu Cys Glu 165 170 175 AAG CAA TTT CAG CCT TAT TTT ATT CCC ATC AAT 561
Lys Gin Phe Gin Pro Tyr Phe He Pro He Asn 15 180 185 (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:14: (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTH: 187 amino acids (B) TYPE: amino acid 2q (D) TOPOLOGY: linear (ii) MOLECULE TYPE: protein > (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:14:
Ala Met His Val Ala Gin Pro Ala Val Val Leu Ala Ser Ser Arg Gly '· «' 1 5 10 15 ' : 25 ; · · He Ala Ser Phe Val Cys Glu Tyr Ala Ser Pro Gly Lys Ala Thr Glu ! 20 25 30 1 I ·
Val Arg Val Thr Val Leu Arg Gin Ala Asp Ser Gin Val Thr Glu Val 35 40 45 >>·: 30 Cys Ala Ala Thr Tyr Met Met Gly Asn Glu Leu Thr Phe Leu Asp Asp I .* 50 55 60 » » * ♦ t
Ser He Cys Thr Gly Thr Ser Ser Gly Asn Gin Val Asn Leu Thr He 65 70 75 80 t 3Ϊ) Gin g 1 y Leu Arg Ala Met Asp Thr Gly Leu Tyr He Cys Lys Val Glu 58 115057 85 90 95
Leu Met Tyr Pro Pro Pro Tyr Tyr Leu Giy He Gly Asn Gly Thr Gin
5 100 105 HO
Ile Tyr Val lie Asp Pro Glu Pro Cys Pro Asp Ser Asp Phe Leu Leu 115 120 125
Trp lie Leu Ala Ala Val Ser Ser Gly Leu Phe Phe Tyr Ser Phe Leu 130 135 140 10
Leu Thr Ala Val Ser Leu Ser Lys Met Leu Lys Lys Arg Ser Pro Leu 145 150 155 160
Thr Thr Gly Val Tyr Val Lys Met Pro Pro Thr Glu Pro Glu Cys Glu 165 170 175 15 Lys Gin Phe Gin Pro Tyr Phe lie Pro lie ASn 180 185 • > I · * I ·
* ' * I
» · » » ·
It· > · • · * · I * I I « » t · * · · 4 t · • It » · » * · III* I » I ♦ » * » *
lilt « I

Claims (27)

59 115057
1. Monoklonaalinen vasta-aine tai sen fragmentti tai johdannainen, tunnettu siitä, että se tunnis- 5 taa sekvenssillä tunnusnumero 14 esitetyn CTLA4:n solunul-koisen domeenin tai sen fragmentin tai johdannaisen ja sitoutuu siihen, jolloin mainittu sitoutuminen estää CTLA4:n sitoutumisen B7-antigeeniin.
2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen monoklonaalinen 10 vasta-aine, tunnettu siitä, että CTLA4 käsittää sek venssissä tunnusnumero 14 esitetyt aminohapot alkaen ala-niinista asemassa 1 ja päättyen asparagiinin asemassa 187.
3. Patenttivaatimuksen 1 mukainen monoklonaalinen vasta-aine, tunnettu siitä, että CTLA4:n solunulkoinen 15 domeeni käsittää sekvenssissä tunnusnumero 14 esitetyt aminohapot alkaen alaniinista asemassa 1 ja päättyen aspa-ragiinihappoon asemassa 125.
4 I CD28-reseptorin solunulkoisesta domeenista tai sen frag- i · mentista tai johdannaisesta, fuusioituna toiseen aminohap-: 35 posekvenssiin, joka vastaa osaa sekvenssillä tunnusnumero * * f t I • » 63 115057 14 esitetyn CTLA4-reseptorin solunulkoisesta domeenista tai sen fragmentista tai johdannaisesta, ja kolmannen aminohapposekvenssin, joka vastaa ihmisen immunoglobuliini Cyl sarana-aluetta sekä CH2- ja CH3-alueita.
4. Patenttivaatimuksen 1 mukainen monoklonaalinen vasta-aine, tunnettu siitä, että mainittu vasta-aine 20 tunnistaa CTLA4:n solunulkoisen domeenin ja sitoutuu siihen, joka domeeni on eristetyssä CTLA4-reseptoripro-; | teiinissa, jolla on kuviossa 3 esitetty aminohappo- , sekvenssi (sekvenssi tunnusnumero 14), tai sen osassa tai : ,· fragmentissa, joista kukin sitoo B7-antigeeniä. : 25
5. Patenttivaatimuksen 1 mukainen monoklonaalinen .·, ; vasta-aine, tunnettu siitä, että mainittu vasta-aine tunnistaa CTLA4:n solunulkoisen domeenin ja sitoutuu six- » · ’ * hen, joka domeeni on puhdistettussa, liukoisessa CTLA4- proteiinissa, joka käsittää sekvenssissä tunnusnumero 14 * i · ··· 30 esitetyt 125 aminohappoa alkaen CTLA4-proteiinin solunul- koisen domeenin aminohapposekvenssin alaniinista asemassa .j 1 ja päättyen asparagiinihappoon asemassa 125.
6. Patenttivaatimuksen 1 mukainen monoklonaalinen • vasta-aine, tunnettu siitä, että mainittu vasta- 60 115057 aine tunnistaa CTLA4:n solunulkoisen domeenin, joka sisältää muutoksen aminohapoissa 1-94.
7. Patenttivaatimuksen 1 mukainen monoklonaalinen vasta-aine, tunnettu siitä, että mainittu vasta-aine 5 tunnistaa CTLA4:n solunulkoisen domeenin ja sitoutuu siihen, joka domeeni on CTLA4-molekyylissä, joka on liitettynä ei-CTLA4-proteiinisekvenssiin.
8. Patenttivaatimuksen 7 mukainen monoklonaalinen vasta-aine, tunnettu siitä, että mainittu ei-CTLA4- 10 proteiini on vähintään osa immunoglobuliinimolekyyliä.
9. Patenttivaatimuksen 1 mukainen monoklonaalinen vasta-aine, tunnettu siitä, että mainittu vasta-aine tunnistaa CTLA4:n solunulkoisen domeenin ja sitoutuu siihen, joka domeeni on CTLA4-fuusioproteiinissa, joka käsit- 15 tää aminohapposekvenssin, joka käsittää CTLA4-fuusioprote-iinin solunulkoisen domeenin fragmentin, joka estää Τ'-solujen jakaantumista.
10. Patenttivaatimuksen 9 mukainen monoklonaalinen vasta-aine, tunnettu siitä, että mainittu CTLA4-fuu- 20 sioproteiini on CTLA4lg-fuusioproteiini tai CD28Ig/CTLA4Ig-fuusioproteiinihybridi.
11. Patenttivaatimuksen 9 mukainen monoklonaalinen • · r*: vasta-aine, tunnettu siitä, että mainittu CTLA4- fuusioproteiini on CTLA4Ig-fuusioproteiini, joka sitoutuu . : 25 B7-antigeeniin ja jonka ensimmäinen aminohapposekvenssi koostuu sekvenssillä tunnusnumero 14 esitetystä CTLA4:n • · solunulkoisesta domeenista tai sen osasta tai fragmentista "* ja toinen aminohapposekvenssi koostuu ihmisen immunoglobu- liinimolekyylin sarana-alueesta sekä CH2- ja CH3-alueista.
12. Patenttivaatimuksen 10 mukainen monoklonaali- '...· nen vasta-aine, tunnettu siitä, että mainitulla CTLA4Ig-fuusioproteiinilla on (a) ensimmäinen aminohapposekvenssi alkaen CTLA4:n > » solunulkoista domeenia esittävän sekvenssin tunnusnumero » · 61 115057 14 alaniinista aminohappoasemassa 1 ja päättyen aspara-giinihappoon aminohappoasemassa 125, ja (b) toinen aminohapposekvenssi, joka koostuu ihmisen immunoglobuliinimolekyylin sarana-alueesta sekä CH2-5 ja CH3-alueista.
13. Patenttivaatimuksen 10 mukainen monoklonaali-nen vasta-aine, tunnettu siitä, että mainittu CTLA4-fuusioproteiini on CD28Ig/CTLA4Ig-fuusioproteiinihybridi, joka sitoutuu B7-antigeeniin ja käsittää ensimmäisen ami- 10 nohapposekvenssin, joka vastaa osaa CD28-reseptorin so-lunulkoisesta domeenista tai sen fragmentista tai johdannaisesta fuusioituna toiseen aminohapposekvenssiin, joka vastaa osaa sekvenssillä tunnusnumero 14 esitetyn CTLA4-re-septorin solunulkoisesta domeenista tai sen fragmentista 15 tai johdannaisesta ja kolmannen aminohapposekvenssin, joka vastaa ihmisen immunoglobuliini Cyl sarana-aluetta sekä CH2- ja CH3-alueita.
14. Patenttivaatimuksen 13 mukainen monoklonaali-nen vasta-aine, tunnettu siitä, että mainitun fuusio- 20 proteiinin ensimmäinen aminohapposekvenssi vastaa osaa CD28-reseptorin solunulkoisesta domeenista ja toinen ami-ll nohapposekvenssi vastaa CTLA4:n solunulkoisen domeenin aminohappoja 94 - 125.
15. Patenttivaatimuksen 13 mukainen monoklonaali- : 25 nen vasta-aine, tunnettu siitä, että mainitun fuusio- : proteiinin ensimmäinen aminohapposekvenssi vastaa CD28- reseptorin solunulkoisen domeenin aminohappoja 1-94 ja toinen aminohapposekvenssi vastaa CTLA4:n solunulkoisen domeenin aminohappoja 94 - 125.
16. Patenttivaatimuksen 1 mukainen monoklonaalisen '··.* vasta-aineen fragmentti, tunnettu siitä, että se on :’·· Fab- tai F(ab)2~ tai Fv-fragmentti. ► ·
17. Eristetty CTLA4-reseptoriproteiini tai sen osa \ tai fragmentti, joista kukin sitoutuu B7-antigeeniin, 62 115057 tunnettu siitä, että sillä on kuviossa 3 esitetty aminohapposekvenssi (sekvenssi tunnusnumero 14).
18. Puhdistettu, liukoinen CTLA4-proteiini, tunnettu siitä, että se käsittää sekvenssissä tunnusnumero 5 14 esitetyt 125 aminohappoa alkaen CTLA4-proteiinin so- lunulkoisen domeenin aminohapposekvenssin alaniinista asemassa 1 ja päättyen asparagiinihappoon asemassa 125.
19. Puhdistettu liukoinen CTLA4-proteiini, joka sitoutuu aktivoiduilla B-soluilla ilmentyvään B7-antigee- 10 niin, tunnettu siitä, että se käsittää sekvenssissä tunnusnumero 14 esitetyt 187 aminohappoa alkaen alaniinista asemassa 1 ja päättyen asparagiiniin asemassa 187.
20. CTLA4Ig-fuusioproteiini, joka sitoutuu B7-an-tigeeniin, tunnettu siitä, että sillä on ensimmäinen amino- 15 happosekvenssi, joka koostuu sekvenssillä tunnusnumero 14 esitetystä CTLA4:n solunulkoisesta domeenista tai sen osasta tai fragmentista, ja toinen aminohapposekvenssi, joka koostuu ihmisen immunoglobuliinimolekyylin sarana-alueesta sekä CH2- ja CH3-alueista.
21. Patenttivaatimuksen 20 mukainen CTLA4Ig-fuu- sioproteiini, joka sitoutuu B7-antigeeniin, tunnettu : : siitä, että sillä on (a) ensimmäinen aminohapposekvenssi alkaen CTLA4:n ·*. j solunulkoista domeenia esittävän sekvenssin tunnusnumero .·. : 25 14 alaniinista aminohappoasemassa 1 ja päättyen aspara- * « * ,·. | giinihappoon aminohappoasemassa 125, ja * t · (b) toinen aminohapposekvenssi, joka koostuu ihmi- '*· sen immunoglobuliinimolekyylin sarana-alueesta sekä CH2- ja CH3-alueista. ··.: 30
22. CD28Ig/CTLA4Ig-fuusioproteiinihybridi, joka ’...· sitoutuu B7-antigeeniin, tunnettu siitä, että se kä- sittää ensimmäisen aminohapposekvenssin, joka vastaa osaa
23. Patenttivaatimuksen 22 mukainen CD28Ig/ CTLA4Ig-fuusioproteiinihybridi, tunnettu siitä, että ensimmäinen aminohapposekvenssi vastaa osaa CD28-resepto-rin solunulkoisesta domeenista ja toinen aminohapposekvenssi vastaa CTLA4:n solunulkoisen domeenin aminohappoja 10 94 - 125.
24. Patenttivaatimuksen 23 mukainen CD28Ig/ CTLA4Ig-fuusioproteiinihybridi, tunnettu siitä, että ensimmäinen aminohapposekvenssi vastaa CD28-reseptorin solunulkoisen domeenin aminohappoja 1-94 ja toinen amino- 15 happosekvenssi vastaa CTLA4:n solunulkoisen domeenin aminohappoja 94 - 125.
25. In vitro -menetelmä CTLA4-positiivisten T-solujen vuorovaikutusten B7-positiivisten solujen kanssa säätelemiseksi, tunnettu siitä, että CTLA4- 20 positiiviset T-solut saatetaan kosketukseen ligandin kanssa, joka reagoi CTLA4:n kanssa, jolloin ligandi on jonkin ; j patenttivaatimuksen 1-13 mukainen monoklonaalinen vasta- aine.
·,· 26. Patenttivaatimuksen 25 mukainen menetelmä, 25 tunnettu siitä, että B7-positiiviset solut ovat B- , ; soluja.
27. Patenttivaatimuksen 26 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että CTLA4-positiivisten T-solujen vuorovaikutus B7-positiivisten B-solujen kanssa estetään, t · · -d 30 jolloin CTLA4-positiivisten T-solujen vuorovaikutusta B7- ...· positiivisten B-solujen kanssa säädellään. » · • · 64 115057
FI20022285A 1991-06-27 2002-12-30 Eristetty liukoinen CTL4A-proteiini, sitä sisältäviä fuusioproteiineja, sen ligandeja, sen tunnistavia monoklonaalisia vasta-aineita ja käyttötapoja FI115057B (fi)

Applications Claiming Priority (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US72361791A 1991-06-27 1991-06-27
US72361791 1991-06-27
US9205202 1992-06-16
PCT/US1992/005202 WO1993000431A1 (en) 1991-06-27 1992-06-16 Ctl4a receptor, fusion proteins containing it and uses thereof

Publications (2)

Publication Number Publication Date
FI20022285A FI20022285A (fi) 2002-12-30
FI115057B true FI115057B (fi) 2005-02-28

Family

ID=24907003

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
FI935795A FI112082B (fi) 1991-06-27 1993-12-22 Menetelmiä eristetyn CTLA4-reseptorin ja sen johdannaisten, niitä sisältävien tuotteiden ja CTLA-reseptorin tunnistavien vasta-aineiden valmistamiseksi, menetelmissä käyttökelpoisia nukleiinihapposekvenssejä, plasmideja ja isäntäsoluja sekä niiden käyttötapoja
FI20022285A FI115057B (fi) 1991-06-27 2002-12-30 Eristetty liukoinen CTL4A-proteiini, sitä sisältäviä fuusioproteiineja, sen ligandeja, sen tunnistavia monoklonaalisia vasta-aineita ja käyttötapoja

Family Applications Before (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
FI935795A FI112082B (fi) 1991-06-27 1993-12-22 Menetelmiä eristetyn CTLA4-reseptorin ja sen johdannaisten, niitä sisältävien tuotteiden ja CTLA-reseptorin tunnistavien vasta-aineiden valmistamiseksi, menetelmissä käyttökelpoisia nukleiinihapposekvenssejä, plasmideja ja isäntäsoluja sekä niiden käyttötapoja

Country Status (21)

Country Link
US (1) US5434131A (fi)
EP (1) EP0606217B2 (fi)
JP (6) JP3722375B2 (fi)
KR (1) KR100238712B1 (fi)
AT (1) ATE170562T1 (fi)
AU (1) AU661854B2 (fi)
CA (2) CA2110518C (fi)
DE (2) DE122007000078I2 (fi)
DK (1) DK0606217T4 (fi)
ES (1) ES2123001T5 (fi)
FI (2) FI112082B (fi)
IE (2) IE922111A1 (fi)
IL (4) IL159364A (fi)
LU (1) LU91375I2 (fi)
MX (1) MX9203605A (fi)
NL (1) NL300303I2 (fi)
NO (4) NO312465B1 (fi)
NZ (2) NZ243286A (fi)
PT (1) PT100637B (fi)
WO (1) WO1993000431A1 (fi)
ZA (1) ZA924782B (fi)

Families Citing this family (193)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA2003455C (en) * 1988-11-23 2000-02-22 Craig B. Thompson Immunotherapy involving cd28 stimulation
US6685941B1 (en) * 1988-11-23 2004-02-03 The Regents Of The University Of Michigan Methods of treating autoimmune disease via CTLA-4Ig
CA2071478A1 (en) * 1989-10-27 1991-04-28 Jeffery A. Bluestone Methods and compositions for promoting immunopotentiation
US6406696B1 (en) 1989-10-27 2002-06-18 Tolerance Therapeutics, Inc. Methods of stimulating the immune system with anti-CD3 antibodies
US5851795A (en) * 1991-06-27 1998-12-22 Bristol-Myers Squibb Company Soluble CTLA4 molecules and uses thereof
US6090914A (en) * 1991-06-27 2000-07-18 Bristol-Myers Squibb Company CTLA4/CD28Ig hybrid fusion proteins and uses thereof
US5770197A (en) * 1991-06-27 1998-06-23 Bristol-Myers Squibb Company Methods for regulating the immune response using B7 binding molecules and IL4-binding molecules
US5637481A (en) * 1993-02-01 1997-06-10 Bristol-Myers Squibb Company Expression vectors encoding bispecific fusion proteins and methods of producing biologically active bispecific fusion proteins in a mammalian cell
US6887471B1 (en) 1991-06-27 2005-05-03 Bristol-Myers Squibb Company Method to inhibit T cell interactions with soluble B7
US5962406A (en) * 1991-10-25 1999-10-05 Immunex Corporation Recombinant soluble CD40 ligand polypeptide and pharmaceutical composition containing the same
US6472510B1 (en) * 1992-02-14 2002-10-29 Bristol-Myers Squibb Company CD40 receptor ligands
CA2089229C (en) * 1992-02-14 2010-04-13 Alejandro A. Aruffo Cd40cr receptor and ligands therefor
CA2133075A1 (en) * 1992-04-07 1993-10-14 Craig B. Thompson CD28 Pathway Immunoregulation
US5397703A (en) * 1992-07-09 1995-03-14 Cetus Oncology Corporation Method for generation of antibodies to cell surface molecules
US5747034A (en) * 1992-07-09 1998-05-05 Chiron Corporation Methods and materials for the induction of T cell anergy
US5773253A (en) * 1993-01-22 1998-06-30 Bristol-Myers Squibb Company MYPPPY variants of CTL A4 and uses thereof
US6491916B1 (en) 1994-06-01 2002-12-10 Tolerance Therapeutics, Inc. Methods and materials for modulation of the immunosuppresive activity and toxicity of monoclonal antibodies
US6024957A (en) * 1993-06-02 2000-02-15 Research Corporation Technologies, Inc. Immunomodulators and methods for the prevention and reversal of organ transplant rejection using same
US6106834A (en) 1993-06-02 2000-08-22 Research Corporation Technologies, Inc. Use of anti-CD45 leukocyte antigen antibodies for immunomodulation
EP0665852A1 (en) * 1993-07-09 1995-08-09 Amgen Boulder Inc. Recombinant ctla4 polypeptides and methods for making the same
US5861310A (en) * 1993-11-03 1999-01-19 Dana-Farber Cancer Institute Tumor cells modified to express B7-2 with increased immunogenicity and uses therefor
JPH09500788A (ja) 1993-07-26 1997-01-28 ダナ・ファーバー・キャンサー・インスティテュート・インコーポレイテッド Ｂ７−２：ｃｔｌａ４／ｃｄ２８カウンターレセプター
US6723705B1 (en) 1993-08-19 2004-04-20 Gentics Institute, Inc. Tumor cells modified to express B7-2 with increased immunogenicity and uses therefor
US6084067A (en) * 1993-07-26 2000-07-04 Dana-Farber Cancer Institute CTLA4/CD28 ligands and uses therefor
US6824779B1 (en) 1993-07-26 2004-11-30 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. Methods for inhibiting the interaction of B7-2 with its natural ligand
US6130316A (en) * 1993-07-26 2000-10-10 Dana Farber Cancer Institute Fusion proteins of novel CTLA4/CD28 ligands and uses therefore
US20050129670A1 (en) * 1993-07-26 2005-06-16 Genetics Institute, Llc. Tumor cells modified to express B7-2 with increased immunogenicity and uses therefor
AU7526894A (en) * 1993-08-16 1995-03-14 Arch Development Corporation B7-2: ctla4/cd28 counter receptor
WO1995006738A1 (en) * 1993-09-03 1995-03-09 Schering Corporation B70(b7-2):ctla-4 bonding protein
CA2185027A1 (en) * 1994-03-08 1995-09-14 Vassiliki A. Boussiotis Methods for modulating t cell unresponsiveness
AU784510B2 (en) * 1994-03-08 2006-04-13 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. Methods for modulating T cell unresponsiveness
US6719972B1 (en) * 1994-06-03 2004-04-13 Repligen Corporation Methods of inhibiting T cell proliferation or IL-2 accumulation with CTLA4- specific antibodies
WO1996013584A1 (en) * 1994-11-01 1996-05-09 Targeted Genetics Corporation Chimeric receptors for the generation of selectively-activatable th-independent cytotoxic t cells
ATE384127T1 (de) * 1994-12-02 2008-02-15 Schering Corp Kostimulatorisches t-zell-oberflächen-antigen slam
US5576423A (en) 1994-12-02 1996-11-19 Schering Corporation Antibodies to the slam protein expressed on activated T cells
US6251957B1 (en) 1995-02-24 2001-06-26 Trustees Of The University Of Pennsylvania Method of reducing an immune response to a recombinant virus
US6372208B1 (en) 1999-09-28 2002-04-16 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Method of reducing an immune response to a recombinant virus
US5652224A (en) 1995-02-24 1997-07-29 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Methods and compositions for gene therapy for the treatment of defects in lipoprotein metabolism
US5872154A (en) * 1995-02-24 1999-02-16 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Method of reducing an immune response to a recombinant adenovirus
WO1996031229A1 (en) * 1995-04-05 1996-10-10 Beth Israel Hospital Association Inhibiting rejection of a graft
US6113898A (en) * 1995-06-07 2000-09-05 Idec Pharmaceuticals Corporation Human B7.1-specific primatized antibodies and transfectomas expressing said antibodies
US7175847B1 (en) * 1995-06-07 2007-02-13 Biogen Idec Inc. Treating intestinal inflammation with anti-CD80 antibodies that do not inhibit CD80 binding to CTLA-4
US7153508B2 (en) * 1995-06-07 2006-12-26 Biogen Idec Inc. Treatment of B cell lymphoma using anti-CD80 antibodies that do not inhibit the binding of CD80 to CTLA-4
US5855887A (en) * 1995-07-25 1999-01-05 The Regents Of The University Of California Blockade of lymphocyte down-regulation associated with CTLA-4 signaling
US6051227A (en) 1995-07-25 2000-04-18 The Regents Of The University Of California, Office Of Technology Transfer Blockade of T lymphocyte down-regulation associated with CTLA-4 signaling
US5811097A (en) * 1995-07-25 1998-09-22 The Regents Of The University Of California Blockade of T lymphocyte down-regulation associated with CTLA-4 signaling
US7041634B2 (en) 1995-09-27 2006-05-09 Emory University Method of inhibiting immune system destruction of transplanted viable cells
US6750334B1 (en) 1996-02-02 2004-06-15 Repligen Corporation CTLA4-immunoglobulin fusion proteins having modified effector functions and uses therefor
US6107056A (en) * 1996-02-22 2000-08-22 Oaks; Martin K. SCTLA-4 gene and product
PT892643E (pt) * 1996-03-20 2002-09-30 Univ Emory Metodos para inibir uma resposta imunitaria bloqueando os circuitos de gp39/cd40 e ctla4/cd28/b7 e composicoes utilizaveis para o efeito
US5786152A (en) * 1996-04-26 1998-07-28 Amgen Inc. Methods of inhibiting syp binding to a CTLA-4 receptor
ID21676A (id) * 1996-11-08 1999-07-08 Idec Pharma Corp Identifikasi interaksi-interaksi ikatan yang khas antara antibodi-antibodi dan antigen-antigen pembantu rangsangan b7.1 dan b7.2 manusia tertentu
US20060034844A1 (en) * 1996-12-04 2006-02-16 The Regents Of The University Of California Stimulation of T cells against self antigens using CTLA-4 blocking agents
US20040023917A1 (en) * 1996-12-31 2004-02-05 Bennett C. Frank Oligonucleotide compositions and methods for the modulation of the expression of B7 protein
US6319906B1 (en) 1996-12-31 2001-11-20 Isis Pharmaceuticals Oligonucleotide compositions and methods for the modulation of the expression of B7 protein
US6077833A (en) * 1996-12-31 2000-06-20 Isis Pharmaceuticals, Inc. Oligonucleotide compositions and methods for the modulation of the expression of B7 protein
US7235653B2 (en) * 1996-12-31 2007-06-26 Isis Pharmaceuticals, Inc. Oligonucleotide compositions and methods for the modulation of the expression of B7 protein
KR19980066046A (ko) * 1997-01-18 1998-10-15 정용훈 고역가의 CTLA4-Ig 융합단백질
US20030219863A1 (en) * 1997-01-31 2003-11-27 Bristol-Myers Squibb Company Soluble CTLA4 mutant molecules and uses thereof
ZA98533B (en) * 1997-01-31 1999-07-22 Bristol Myers Squibb Co Soluble CTLA4 mutant molecules and uses thereof.
JP2001523958A (ja) 1997-03-21 2001-11-27 ブライハム アンド ウィミンズ ホスピタル，インコーポレイテッド 免疫療法のｃｔｌａ−４結合ペプチド
SE9701127D0 (sv) * 1997-03-26 1997-03-26 Karolinska Innovations Ab Antigenic fusionprotein carrying GALal, 3GAL epitopes
EP0972054B1 (en) * 1997-03-27 2008-12-10 Csl Limited Enhancement of immune response using targeting molecules
DK0975755T3 (da) 1997-04-16 2007-06-11 Millennium Pharm Inc CRSP-protein (cysteinrige udskilte proteiner), nukleinsyremolekyler der koder herfor samt anvendelser deraf
ATE264688T1 (de) 1997-06-12 2004-05-15 Applied Research Systems Cd28/ctla-4 inhibierende peptidomimetika und diese enthaltende pharmazeutische zusammensetzungen
AU9095498A (en) * 1997-09-19 1999-04-12 Yoshitomi Pharmaceutical Industries, Ltd. Oligopeptide compounds
US7223729B2 (en) * 1997-11-07 2007-05-29 Trillium Therapeutics Inc. Methods of treating allergy by administering a CD200 protein
US6955811B2 (en) * 1997-11-07 2005-10-18 Trillium Therapeutics Inc. Methods of inhibiting immune response suppression by administering antibodies to OX-2
CA2308765C (en) 1997-11-07 2010-10-12 Transplantation Technologies Inc. The use of an ox-2 protein or nucleic acid in immunomodulation
AUPP221098A0 (en) 1998-03-06 1998-04-02 Diatech Pty Ltd V-like domain binding molecules
ATE298248T1 (de) * 1998-04-15 2005-07-15 Brigham & Womens Hospital T-zell inhibierende rezeptorzusammensetzungen sowie deren verwendung
US7078512B2 (en) 1998-05-01 2006-07-18 Schering-Plough Animal Health Corporation Nucleic acid encoding feline CD86
US7279168B2 (en) 1998-05-01 2007-10-09 Texas A & M University System Recombinant virus expressing foreign DNA encoding feline CD86 and uses thereof
US20050031611A1 (en) * 1998-05-08 2005-02-10 Beth Israel Deaconess Medical Center Transplant tolerance by costimulation blockade and T-cell activation-induced apoptosis
US6682741B1 (en) 1998-06-10 2004-01-27 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services β2 microglobulin fusion proteins and high affinity variants
JP4087563B2 (ja) * 1998-06-15 2008-05-21 ジーティーシー バイオセラピューティックス インコーポレイテッド エリスロポエチン類似体−ヒト血清アルブミン融合物
US20050181482A1 (en) * 2004-02-12 2005-08-18 Meade Harry M. Method for the production of an erythropoietin analog-human IgG fusion proteins in transgenic mammal milk
US6593133B1 (en) 1998-07-06 2003-07-15 Nsgene A/S Neurotrophic factors
CZ20011021A3 (cs) 1998-09-21 2001-10-17 Genetics Institute, Inc. Způsoby tlumení imunitní odpovědi na terapeutické proteiny
US6521419B1 (en) 1998-09-22 2003-02-18 Kanakaraju Koduri Expression vectors containing hot spot for increased recombinant protein expression in transfected cells
US6800457B2 (en) 1998-09-22 2004-10-05 Bristol-Myers Squibb Company Expression vectors containing hot spot for increased recombinant protein expression in transfected cells
US7109003B2 (en) 1998-12-23 2006-09-19 Abgenix, Inc. Methods for expressing and recovering human monoclonal antibodies to CTLA-4
US6682736B1 (en) 1998-12-23 2004-01-27 Abgenix, Inc. Human monoclonal antibodies to CTLA-4
EA006972B1 (ru) 1998-12-23 2006-06-30 Пфайзер Инк. Моноклональное антитело человека к ctla-4 и способы его применения
US7011833B1 (en) 1999-05-06 2006-03-14 Genetics Institute, Inc. Enhancing immune responses with B7-1 or B7-2 in the absence of a crosslinking agent
AU6615500A (en) * 1999-07-28 2001-02-19 Genetics Institute Inc. Preventing immune-mediated abortion by inhibiting costimulation
US7605238B2 (en) 1999-08-24 2009-10-20 Medarex, Inc. Human CTLA-4 antibodies and their uses
EP1792991A1 (en) 1999-08-24 2007-06-06 Medarex, Inc. Human CTLA-4 antibodies and their uses
EP1248645B1 (en) * 2000-01-03 2007-04-18 Tr Associates, L.L.C. Novel chimeric proteins and their use
US7572631B2 (en) * 2000-02-24 2009-08-11 Invitrogen Corporation Activation and expansion of T cells
US7541184B2 (en) 2000-02-24 2009-06-02 Invitrogen Corporation Activation and expansion of cells
AR031699A1 (es) * 2000-05-26 2003-10-01 Bristol Myers Squibb Co Molecula mutante de ctla4 soluble que se enlaza a cd80 y/o cd86, molecula de acido nucleico que la codifica, vector y sistema vector que comprende a esta ultima, celula huesped que lo posee, metodo para producir una proteina mutante y dicha proteina, uso de la molecula mutante para preparar un medic
US7094874B2 (en) 2000-05-26 2006-08-22 Bristol-Myers Squibb Co. Soluble CTLA4 mutant molecules
WO2001095928A2 (en) * 2000-06-09 2001-12-20 Bristol-Myers Squibb Company Methods for regulating a cell-mediated immune response by blocking lymphocytic signals and by blocking lfa-1 mediated adhesion
US20050048614A1 (en) * 2000-06-13 2005-03-03 Children's Medical Center Corporation Biosynthetic oncolytic molecules and uses therefor
US20040034193A1 (en) * 2001-06-13 2004-02-19 Samy Ashkar Biosynthetic oncolytic molecules and uses therefor
KR100864120B1 (ko) 2000-07-03 2008-10-16 브리스톨-마이어스스퀴브컴파니 가용성 ｃｔｌａ4 분자를 사용한 류마티스성 질환의 치료법
US20040022787A1 (en) 2000-07-03 2004-02-05 Robert Cohen Methods for treating an autoimmune disease using a soluble CTLA4 molecule and a DMARD or NSAID
US6875904B2 (en) * 2000-09-20 2005-04-05 The Ohio State University Research Foundation Animal model for identifying agents that inhibit or enhance CTLA4 signaling
US7014998B2 (en) * 2000-09-30 2006-03-21 Yale University Screening immunomodulatory agents by CTLA-4 upregulation
US9249229B2 (en) * 2000-12-08 2016-02-02 Alexion Pharmaceuticals, Inc. Polypeptides and antibodies derived from chronic lymphocytic leukemia cells and uses thereof
US20060057651A1 (en) * 2000-12-08 2006-03-16 Bowdish Katherine S Polypeptides and antibodies derived from chronic lymphocytic leukemia cells and uses thereof
US20040198661A1 (en) * 2000-12-08 2004-10-07 Bowdish Katherine S. Polypeptides and antibodies derived from chronic lymphocytic leukemia cells and uses thereof
EP1341902A2 (en) * 2000-12-08 2003-09-10 Alexion Pharmaceuticals, Inc. Chronic lymphocytic leukemia cell line and its use for producing an antibody
US7408041B2 (en) * 2000-12-08 2008-08-05 Alexion Pharmaceuticals, Inc. Polypeptides and antibodies derived from chronic lymphocytic leukemia cells and uses thereof
US7754208B2 (en) * 2001-01-17 2010-07-13 Trubion Pharmaceuticals, Inc. Binding domain-immunoglobulin fusion proteins
US20030133939A1 (en) * 2001-01-17 2003-07-17 Genecraft, Inc. Binding domain-immunoglobulin fusion proteins
US7829084B2 (en) 2001-01-17 2010-11-09 Trubion Pharmaceuticals, Inc. Binding constructs and methods for use thereof
HUP0303930A3 (en) * 2001-01-26 2012-09-28 Univ Emory Methods of inducing organ transplant tolerance and correcting hemoglobinopathies
TW200526779A (en) * 2001-02-08 2005-08-16 Wyeth Corp Modified and stabilized GDF propeptides and uses thereof
NZ529126A (en) 2001-03-28 2010-07-30 Biogen Idec Inc Use of neublastin polypeptides for treating allodynia, hyperalgesic pain and phantom pain
US20040058445A1 (en) * 2001-04-26 2004-03-25 Ledbetter Jeffrey Alan Activation of tumor-reactive lymphocytes via antibodies or genes recognizing CD3 or 4-1BB
DK1397153T3 (da) 2001-05-23 2008-05-26 Bristol Myers Squibb Co Fremgangsmåde til beskyttelse af allogent ö-celle-transplantat ved anvendelse af oplöselige CTLA4-mutantmolekyler
KR100453877B1 (ko) 2001-07-26 2004-10-20 메덱스젠 주식회사 연쇄체화에 의한 면역 글로블린 융합 단백질의 제조 방법 및 이 방법에 의해 제조된 ＴＮＦＲ/Ｆｃ 융합 단백질, 상기 단백질을 코딩하는 ＤＮＡ, 상기 ＤＮＡ를 포함하는벡터, 및 상기 벡터에 의한 형질전환체
US20030086940A1 (en) * 2001-08-10 2003-05-08 Cristina Costa Engineered recombinant molecule that regulates humoral and cellular effector functions of the immune system
US20040116675A1 (en) * 2001-12-14 2004-06-17 Tso J. Jun Silenced anti-cd28 antibodies and use thereof
ATE451387T1 (de) * 2001-12-18 2009-12-15 Endocube Sas Neue mit dem zelltod assoziierte proteine aus der thap familie und par4 verwandte signalwege, die bei der kontrolle von apoptosis involviert sind
US7858297B2 (en) 2001-12-18 2010-12-28 Centre National De La Recherche Scientifique Cnrs Chemokine-binding protein and methods of use
US6578724B1 (en) * 2001-12-29 2003-06-17 United States Can Company Connector for use in packaging aerosol containers
EP1585817B1 (en) 2002-02-20 2009-09-02 The General Hospital Corporation Conjugates comprising a biodegradable polymer and uses therefor
US20030219436A1 (en) * 2002-03-15 2003-11-27 Ledbetter Jeffrey A. Compositions and methods to regulate an immune response using CD83 gene expressed in tumors and using soluble CD83-Ig fusion protein
NZ536420A (en) * 2002-04-12 2008-04-30 Medarex Inc Methods of treatment using CTLA-4 antibodies
WO2003092624A2 (en) * 2002-05-02 2003-11-13 University Of Connecticut Health Center Use of heat shock proteins to enhance efficacy of antibody therapeutics
WO2004034995A2 (en) * 2002-10-15 2004-04-29 University Of Pittsburgh Of The Commonwealth System Of Higher Education Methods and reagents for inducing immunity
MXPA05006522A (es) * 2002-12-23 2006-02-17 Bristol Myers Squibb Co Mejora en la calidad de producto en procesos de cultivo en celulas de mamiferos para la produccion de proteina.
EP1575998A4 (en) * 2002-12-23 2007-07-25 Bristol Myers Squibb Co PROCESS FOR CULTIVATING MAMMALIAN CELLS FOR PROTEIN PRODUCTION
UA91178C2 (ru) 2003-01-31 2010-07-12 Байоджен Айдек Ма Інк. Мутантный неубластин
GB0303663D0 (en) * 2003-02-18 2003-03-19 Lorantis Ltd Assays and medical treatments
US7897582B2 (en) * 2003-05-23 2011-03-01 Isis Pharmaceuticals, Inc. Oligonucleotide compositions and methods for the modulation of the expression of B7 protein
US7960355B2 (en) * 2003-05-23 2011-06-14 Isis Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for the modulation of the expression of B7 protein
US6971600B2 (en) * 2003-06-30 2005-12-06 Heligear Engineering (H.K.) Co., Ltd. Oscillation mechanism for fishing reel
US7754209B2 (en) 2003-07-26 2010-07-13 Trubion Pharmaceuticals Binding constructs and methods for use thereof
MXPA06001225A (es) * 2003-08-04 2006-04-11 Bristol Myers Squibb Co Metodos de tratamiento de enfermedad cardiovascular usando una molecula soluble de ctla4.
WO2005044188A2 (en) * 2003-10-27 2005-05-19 Amgen Inc. Compositions and methods to modulate an immune response to an immunogenic therapeutic agent
US20080152655A1 (en) * 2004-09-08 2008-06-26 The Ohio State University Research Foundation Combination Therapy With Anti-Ctla4 and Anti-4-1BB Antibodies
WO2006029219A2 (en) * 2004-09-08 2006-03-16 Ohio State University Research Foundation Human monoclonal anti-ctla4 antibodies in cancer treatment
GB0421465D0 (en) * 2004-09-27 2004-10-27 Chiron Srl Group A streptococcus protein
CN101198347A (zh) * 2005-04-06 2008-06-11 布里斯托尔-迈尔斯斯奎布公司 使用可溶性ctla4突变型分子治疗与移植物移植有关的免疫病症的方法
CA2614640A1 (en) 2005-07-11 2007-01-18 Macrogenics, Inc. Methods for the treatment of autoimmune disorders using immunosuppressive monoclonal antibodies with reduced toxicity
PT2298815E (pt) 2005-07-25 2015-07-16 Emergent Product Dev Seattle Moléculas de ligaçao especificas para cd37 e especificas para cd20
JP4899083B2 (ja) * 2005-08-29 2012-03-21 Ｓｍｃ株式会社 減速比自動切換装置
US8501704B2 (en) 2005-11-08 2013-08-06 Sarepta Therapeutics, Inc. Immunosuppression compound and treatment method
AU2013202533B2 (en) * 2005-11-08 2015-11-12 Sarepta Therapeutics, Inc. Immunosuppression Compound and Treatment Method
CA2628093A1 (en) * 2005-11-08 2007-05-18 Avi Biopharma, Inc. Antisense oligonucleotide analog compounds targeting proprocessed ctla-4 mrna
EP1954311A4 (en) 2005-12-07 2009-12-23 Medarex Inc CTLA-4 ANTIBODY DOSAGE ESCALATION THERAPY
KR101398713B1 (ko) 2005-12-20 2014-06-12 브리스톨-마이어스 스큅 컴퍼니 조성물 및 조성물의 제조 방법
DK2463305T3 (en) 2006-01-12 2016-08-29 Alexion Pharma Inc Antibodies to OX-2 / CD200 and uses thereof
US8940871B2 (en) 2006-03-20 2015-01-27 The Regents Of The University Of California Engineered anti-prostate stem cell antigen (PSCA) antibodies for cancer targeting
US7528111B2 (en) * 2006-05-12 2009-05-05 Bristol-Myers Squibb Company Method of vaccinating subjects receiving immune modulating therapy
MX2008015524A (es) 2006-06-12 2009-01-13 Trubion Pharmaceuticals Inc Proteinas de union multivalentes monocatenarias con funcion efectora.
SG177907A1 (en) 2006-06-14 2012-02-28 Macrogenics Inc Methods for the treatment of autoimmune disorders using immunosuppressive monoclonal antibodies with reduced toxicity
BRPI0814645A2 (pt) * 2007-07-25 2015-01-27 Alexion Pharma Inc Métodos e composições para tratar de doença autoimune.
JP6126773B2 (ja) 2007-09-04 2017-05-10 ザ リージェンツ オブ ザ ユニバーシティ オブ カリフォルニア 癌のターゲッティングおよび検出のための高親和性抗前立腺幹細胞抗原（ｐｓｃａ）抗体
WO2009058564A2 (en) 2007-11-01 2009-05-07 Maxygen, Inc. Immunosuppressive polypeptides and nucleic acids
WO2009126944A1 (en) 2008-04-11 2009-10-15 Trubion Pharmaceuticals, Inc. Cd37 immunotherapeutic and combination with bifunctional chemotherapeutic thereof
US7915222B2 (en) * 2008-05-05 2011-03-29 Bristol-Myers Squibb Company Method of preventing the development of rheumatoid arthritis in subjects with undifferentiated arthritis
ES2657220T3 (es) 2008-10-02 2018-03-02 Aptevo Research And Development Llc Proteínas de unión multi-diana antagonistas de CD86
JP2012508774A (ja) * 2008-11-13 2012-04-12 エマージェント プロダクト デベロップメント シアトル， エルエルシー Ｃｄ３７免疫治療薬併用療法およびその使用
US8840889B2 (en) * 2009-08-13 2014-09-23 The Johns Hopkins University Methods of modulating immune function
US9540426B2 (en) * 2009-10-06 2017-01-10 Bristol-Myers Squibb Company Mammalian cell culture processes for protein production
US8435516B2 (en) 2009-10-12 2013-05-07 Pfizer Inc. Cancer treatment
CN102822198B (zh) 2010-03-12 2016-08-31 艾伯维生物医疗股份有限公司 Ctla4蛋白和其用途
WO2012042480A1 (en) 2010-09-28 2012-04-05 Kahr Medical Ltd. Compositions and methods for treatment of hematological malignancies
WO2013010537A1 (en) 2011-07-20 2013-01-24 Aarhus Universitet Method of treating morphea
WO2013148049A1 (en) 2012-03-29 2013-10-03 The General Hospital Corporation Recombinant cytotoxic t-lymphocyte-associated protein 4 (ctla4)
US20150118244A1 (en) 2012-05-10 2015-04-30 Bristol-Myers Squibb Company Anti-tumor antibodies as predictive or prognostic biomarkers of efficacy and survival in ipilimumab-treated patients
JP6228971B2 (ja) 2012-05-11 2017-11-08 メディミューン，エルエルシー Ｃｔｌａ−４バリアント
US8735359B2 (en) 2012-05-24 2014-05-27 Orban Biotech Llc Combinations of modalities for the treatment of diabetes
AU2013284460A1 (en) 2012-06-27 2015-01-29 Dmnomore CTLA4 fusion proteins for the treatment of diabetes
US20140112958A1 (en) 2012-10-24 2014-04-24 Mwm Biomodels Gmbh Pancreatic islets of transgenic LEA29Y animals for treating diabetes
WO2014138188A1 (en) 2013-03-07 2014-09-12 The General Hospital Corporation Human ctla4 mutants and use thereof
EP3049442A4 (en) 2013-09-26 2017-06-28 Costim Pharmaceuticals Inc. Methods for treating hematologic cancers
EP2883883A1 (en) 2013-12-16 2015-06-17 Cardio3 Biosciences S.A. Therapeutic targets and agents useful in treating ischemia reperfusion injury
JOP20200094A1 (ar) 2014-01-24 2017-06-16 Dana Farber Cancer Inst Inc جزيئات جسم مضاد لـ pd-1 واستخداماتها
JOP20200096A1 (ar) 2014-01-31 2017-06-16 Children’S Medical Center Corp جزيئات جسم مضاد لـ tim-3 واستخداماتها
GB2523399B (en) 2014-02-25 2019-03-13 Orban Tihamer A composition comprising ten overlapping peptide fragments of the entire preproinsulin sequence
WO2016040882A1 (en) 2014-09-13 2016-03-17 Novartis Ag Combination therapies of egfr inhibitors
ES2856844T3 (es) 2014-12-31 2021-09-28 Checkmate Pharmaceuticals Inc Inmunoterapia antitumoral combinada
JP2018512856A (ja) 2015-04-17 2018-05-24 アルパイン イミューン サイエンシズ インコーポレイテッド 調整可能な親和性を有する免疫調節タンパク質
MY197562A (en) 2015-09-21 2023-06-23 Aptevo Res & Development Llc Cd3 binding polypeptides
EP3192805A1 (en) 2016-01-15 2017-07-19 Humanitas Mirasole S.p.A. Inhibitors of t cell activation or stimulation and uses thereof
MX2019009660A (es) 2017-02-28 2019-10-02 Bristol Myers Squibb Co Uso de anticuerpos antigeno 4 del linfocito t (ctla-4) con citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (adcc) mejorada para mejorar la respuesta inmune a una vacuna.
CA3055769A1 (en) 2017-04-03 2018-10-11 Oncologie, Inc. Methods for treating cancer using ps-targeting antibodies with immuno-oncology agents
WO2019067499A1 (en) 2017-09-27 2019-04-04 Alexion Pharmaceuticals, Inc. BIOMARKER SIGNATURE FOR PREDICTING A TUMOR RESPONSE TO ANTI-CD200 THERAPY
MA50360A (fr) 2017-10-10 2020-08-19 Alpine Immune Sciences Inc Protéines immunomodulatrices de variants de ctla-4 et leurs utilisations
EP3617230A1 (en) 2018-09-03 2020-03-04 BioInvent International AB Novel antibodies and nucleotide sequences, and uses thereof
AU2019387218A1 (en) 2018-11-26 2021-06-03 Massachusetts Institute Of Technology Compositions and methods for immune tolerance
US20230025648A1 (en) 2019-11-21 2023-01-26 Bristol-Myers Squibb Company Label-free n-glycan quantification methods
WO2022178078A1 (en) 2021-02-19 2022-08-25 Theripion, Inc. Paraoxonase fusion polypeptides and related compositions and methods
GB202115803D0 (en) 2021-11-03 2021-12-15 Ducentis Biotherapeutics Ltd Novel proteins
WO2023214387A1 (en) 2022-05-06 2023-11-09 Ducentis Biotherapeutics Limited Novel cd200 fusion proteins
WO2023214388A1 (en) 2022-05-06 2023-11-09 Ducentis Biotherapeutics Limited Novel cd200 fusion proteins
CN114686427B (zh) * 2022-05-23 2022-07-29 中国人民解放军总医院第一医学中心 一种脾脏调节型b淋巴细胞及其制备方法与应用

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4399216A (en) * 1980-02-25 1983-08-16 The Trustees Of Columbia University Processes for inserting DNA into eucaryotic cells and for producing proteinaceous materials
US4683202A (en) * 1985-03-28 1987-07-28 Cetus Corporation Process for amplifying nucleic acid sequences
US4683195A (en) * 1986-01-30 1987-07-28 Cetus Corporation Process for amplifying, detecting, and/or-cloning nucleic acid sequences

Also Published As

Publication number Publication date
IL102294A (en) 2004-09-27
LU91375I2 (fr) 2008-01-07
JPH06508989A (ja) 1994-10-13
NO934801D0 (no) 1993-12-23
NO20020491L (no) 1994-02-21
WO1993000431A1 (en) 1993-01-07
IL102294A0 (en) 1993-01-14
JP2002017349A (ja) 2002-01-22
AU2240092A (en) 1993-01-25
NO2007013I1 (no) 2007-11-26
CA2580812A1 (en) 1993-01-07
DE122007000078I2 (de) 2011-01-13
KR940701445A (ko) 1994-05-28
DE122007000078I1 (de) 2008-02-14
ES2123001T3 (es) 1999-01-01
DE69226871T3 (de) 2009-09-24
EP0606217B2 (en) 2008-12-03
NO934801L (no) 1994-02-21
US5434131A (en) 1995-07-18
CA2110518C (en) 2007-05-22
ZA924782B (en) 1993-12-27
NZ243286A (en) 1996-03-26
JP4159266B2 (ja) 2008-10-01
CA2110518A1 (en) 1993-01-07
JP3722375B2 (ja) 2005-11-30
ATE170562T1 (de) 1998-09-15
IE20010097A1 (en) 2002-03-20
PT100637A (pt) 1994-05-31
MX9203605A (es) 1993-11-01
NL300303I1 (nl) 2008-01-02
FI20022285A (fi) 2002-12-30
NZ264712A (en) 1996-03-26
EP0606217A1 (en) 1994-07-20
IE922111A1 (en) 1992-12-30
IL159364A (en) 2005-08-31
FI935795A0 (fi) 1993-12-22
DK0606217T4 (da) 2009-03-30
NO2012001I2 (no) 2016-02-29
JP2003174872A (ja) 2003-06-24
IL162430A0 (en) 2005-11-20
FI112082B (fi) 2003-10-31
NO2007013I2 (no) 2011-02-21
NO20020491D0 (no) 2002-01-30
NL300303I2 (nl) 2008-01-02
NO318806B1 (no) 2005-05-09
DE69226871T2 (de) 1999-05-12
JP2002003399A (ja) 2002-01-09
KR100238712B1 (ko) 2000-01-15
JP2003096097A (ja) 2003-04-03
NO2012001I1 (no) 2012-01-09
JP2003012546A (ja) 2003-01-15
PT100637B (pt) 1999-06-30
EP0606217B1 (en) 1998-09-02
FI935795A (fi) 1993-12-22
ES2123001T5 (es) 2009-04-16
AU661854B2 (en) 1995-08-10
DK0606217T3 (da) 1998-11-09
DE69226871D1 (de) 1998-10-08
NO312465B1 (no) 2002-05-13
IL159364A0 (en) 2004-06-01

Similar Documents

Publication Publication Date Title
FI115057B (fi) Eristetty liukoinen CTL4A-proteiini, sitä sisältäviä fuusioproteiineja, sen ligandeja, sen tunnistavia monoklonaalisia vasta-aineita ja käyttötapoja
AU701310B2 (en) CTLA4 molecules and IL4-binding molecules and uses thereof
CA2113744C (en) Methods for regulating the immune response using ctla4-binding molecules and il4-binding molecules
US5977318A (en) CTLA4 receptor and uses thereof
US5844095A (en) CTLA4 Ig fusion proteins
US7311910B2 (en) Methods for treating cancer and infectious disease by blocking CTLA4-B7 interactions
MXPA95001794A (en) Ctla4 molecules and il-4 link molecules and uses of mis

Legal Events

Date Code Title Description
FG Patent granted

Ref document number: 115057

Country of ref document: FI

MA Patent expired